JP5324083B2 - 高反応性耐熱性dnaリガーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性DNAリガーゼのC末端ヘリックス部分に存在する荷電性アミノ酸のうち少なくとも2つをアラニン、トレオニン、またはセリンに置換して得られる、天然型(ネイティブな)酵素よりもDNA結合能と反応性(安定性)に優れた改変型耐熱性DNAリガーゼに関する。
2.1 改変型耐熱性DNAリガーゼをコードするDNA
本発明にかかる改変型耐熱性DNAリガーゼをコードするDNAは、公知の天然型耐熱性DNAリガーゼ遺伝子に、部位特異的変異あるいは部位特異的変異とストップコドンの導入によるC末端部分欠失を導入して得られる。部位特的変異導入は、市販のキット(例えば、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit(STRATAGENE)、TransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit(CLONTECH)等)を用いて容易に行うことができる。
次いで、前記改変型耐熱性DNAリガーゼをコードするDNAをプラスミド等の公知のベクターに連結(挿入)して発現ベクターを作製する。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
次いで、前記ベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入し、改変型耐熱性DNAリガーゼ発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cervisiae)、チゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces. pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
本発明の改変型耐熱性DNAリガーゼは、前記形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物からDNAリガーゼ活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、適宜決定される。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
本発明は、さらなる態様において、本発明の改変型耐熱性DNAリガーゼを用いることを特徴とするLCR法、および本発明の改変型耐熱性リガーゼを含むLCR用キットを提供する。上述のごとく、本発明の改変型耐熱性DNAリガーゼは高温でも高い酵素活性を維持し、熱サイクルを必要とするLCR法においてその威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにDNAとの結合能および反応性が優れた本発明の改変型耐熱性リガーゼを用いれば、より特異的かつ迅速なLCR法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。
C末端ヘリックス変異導入リガーゼの調製
(1)ピロコッカス・フリオサス(P. furiosus)ゲノムDNAの調製
P. furiosus DSM3638はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbHより入手し、文献(ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),第21巻、259-265ページ)の方法に従って培養した。500mlの培養液から約1.2gの菌体を得た。これを緩衝液L(10mMトリス−塩酸(pH8.0),1mM EDTA,100mM NaCl)10mlに懸濁し、10% SDSを1ml加えた。撹拌の後、プロテイナーゼK(20mg/ml)を50ml加えて、55℃で60分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてDNAを不溶化した。回収したDNAを1mlのTE液(10mMトリス−塩酸(pH8.0),1mM EDTA)に溶解し、0.75mgのRNase Aを加えて37℃で60分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。0.75mgのDNAが得られた。
P.furiosusのゲノムDNAからlig遺伝子と予想される領域をPCRで増幅するためのプライマーを設計した。1st PCRに用いるプライマーとして5'-CTAGTGGATCTGATGCGTTATCTGG-3'(配列番号11)、5'-TCGGGACTATTGTTAGACCTTAGC-3'(配列番号12)を合成した。また、2nd PCRに用いるプライマーとしてそれぞれの1stプライマーの内側にアニ−リングするように5'-GGCCATGGGTTATCTGGAGCTTGCTCAAC-3'(配列番号13)、5'-GCGGATCCTTAGCTTTCCACTTTTCTTTCATC-3'(配列番号14)を作成した。lig遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるATGに合わせてNcoI認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にBamHI認識配列を導入した。PyroBEST DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いて、熱変性95℃、アニーリング55℃、伸長反応72℃を30サイクル行なうPCR条件で目的の遺伝子を増幅した。1st PCR産物を鋳型として、同じ条件で2nd PCRを行ない、その産物をpGEM-T easyベクター(プロメガ社)に組み込み、DNAシークエンサー(Beckman Coultar社)を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、NcoI-BamHIで切断してpGEM-T easyベクターから切り出したlig遺伝子をpET21dベクター(EMD Bioscience社)に挿入し、プラスミドpET21d-ligを得た。この発現系構築のために、開始コドン部位にNcoI配列を導入したために、配列番号1に示す2番目のコドンAGGがGGTに変わり、得られる翻訳産物の2番目のアミノ酸は本来アルギニンであるところがグリシンになっている(配列番号3および4参照)。
以下、無処理(野生型)リガーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、540番目のアスパラギン酸に変異を導入したリガーゼ(D540A、D540S、D540R)についても、最初に用いるプラスミドがpET21d-ligD540A、pET21d-ligD540SおよびpET21d-ligD540Rになるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、精製することができた。
540番目のアスパラギン酸に変異導入したDNAリガーゼ変異体の反応活性の野生型との比較
(4)鋳型の40merオリゴDNA(配列番号21)、5'末端にリン酸化修飾された30merオリゴDNA(配列番号22)、5'末端に蛍光体TETが標識された20merオリゴDNA(配列番号23)を0.5mMに調製し、5μlずつ混合してオリゴDNAミックスを作製した。用いたオリゴDNAの配列を表2に示す。次に、作製したオリゴDNAミックスを95℃で5分熱変性し、94℃から5分につき1℃ずつ2℃まで降下させて3つのオリゴDNAをハイブリダイズさせて、アニーリング産物を作製した。得られたアニーリング産物を鋳型としてライゲーション反応を行った(13)。反応産物を、15%アクリルアミド/8M Ureaゲルで泳動した。泳動後、フルオロイメージャー595(GE社)でライゲーション産物である50merとTET標識オリゴDNAの20merの位置にあるバンドのTETの蛍光強度を、イメージ解析用ソフトウェアImageQuant(Molecular Dynamics社)により測定した。50merと20merの位置で検出した蛍光強度数値の和を100%としたときの、50merの数値の割合をライゲーション効率と定義した。各種変異体リガーゼのライゲーション効率は、各温度で得られた野生型PfuDNAリガーゼのライゲーション効率を1としたときの、各ライゲーション効率の規格値(ライゲーション効率比)を算出して比較した。
本発明のDNAリガーゼ変異体の耐熱性
実施例2で使用したDNAリガーゼは、野生型、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性タンパク質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、85℃、20分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体はネイティブに遜色のない耐熱性を示した。
配列番号2:野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ
配列番号3:実施例1で得られた野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ
配列番号4:実施例1で得られた野生型のPyrococcus furiosusのDNAリガーゼ
配列番号5:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540A)
配列番号6:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540A)
配列番号7:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540S)
配列番号8:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540S)
配列番号9:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540R)
配列番号10:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540R)
配列番号11:野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号12:野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼの1st PCR用プライマー
配列番号13:野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号14:野生型Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼの2nd PCR用プライマー
配列番号15:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540A)増幅用プライマー
配列番号16:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540A)増幅用プライマー
配列番号17:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540S)増幅用プライマー
配列番号18:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540S)増幅用プライマー
配列番号19:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540R)増幅用プライマー
配列番号20:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼ変異体(D540R)増幅用プライマー
配列番号21:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼおよびその変異体の60mer基質
配列番号22:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼおよびその変異体の30mer基質
配列番号23:Pyrococcus furiosusのDNAリガーゼおよびその変異体の20mer基質
Claims (10)
- 好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の耐熱性DNAリガーゼのアミノ酸配列を、配列番号2に示されるピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性DNAリガーゼのアミノ酸配列とアライメントしたとき、前記配列番号2に示されるアミノ酸配列の540番目のアスパラギン酸に対応する負の荷電性アミノ酸を負の電荷を持たないアミノ酸に置換して得られる改変型耐熱性DNAリガーゼであって、好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の前記耐熱性DNAリガーゼは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、且つ70℃以上で酵素活性を維持するものである、前記改変型耐熱性DNAリガーゼ。
- 前記負の電荷をもたないアミノ酸がアラニン、セリン、アルギニン、およびリジンのいずれかである、請求項1に記載の改変型耐熱性DNAリガーゼ。
- 配列番号2に示されるピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性DNAリガーゼの540番目のアスパラギン酸を負の電荷を持たないアミノ酸に置換して得られる改変型耐熱性DNAリガーゼ。
- 前記負の電荷をもたないアミノ酸がアラニン、セリン、アルギニン、およびリジンのいずれかである、請求項3記載の改変型耐熱性DNAリガーゼ。
- 野生型よりもDNA結合性が向上していることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の改変型耐熱性DNAリガーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型耐熱性DNAリガーゼをコードするDNA。
- 請求項6に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを導入された宿主細胞を培養し、得られる培養物からDNAリガーゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、改変型耐熱性DNAリガーゼの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型耐熱性DNAリガーゼを用いることを特徴とするLCR法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型耐熱性DNAリガーゼを含むLCR用キット。
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