JPWO2006043555A1 - 生体高分子生成のための還元酵素変異体 - Google Patents

Abstract

ＰｈｂＢ酵素の補酵素利用能力と触媒活性を改良する方法、該方法により改良されたＰｈｂＢ酵素変異体、該変異体を用いることによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供する。ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の野生型ＰｈｂＢ酵素および該酵素と３０％以上の配列相同性を持つ酵素に対して、該野生型ＰｈｂＢ酵素のアミノ酸残基部位、Ｍｅｔ−１２、Ｇｌｙ−１３、Ａｌａ−３２、Ｃｙｓ−３４、Ｇｌｙ−３５、Ｐｒｏ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｓｅｒ−３８、Ｐｒｏ−３９、Ａｒｇ−４０、Ａｒｇ−４１、Ａｌａ−５７と立体構造上同等な位置を占めるアミノ酸残基に対して変異処理を行うことにより、該酵素の補酵素利用能力と触媒活性を改良する方法。該方法により得られるＰｈｂＢ酵素変異体。該酵素変異体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを有するベクター、そのベクターにより形質転換された形質転換細胞。該酵素変異体を触媒として用いることによる３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡおよび光学活性アルコールの製造方法。上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程もしくは上記酵素変異体と３−ケトアシル−ＣｏＡとを反応させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

Description

本発明は、種々の３−ケトアルカン酸−補酵素Ａ複合体（以下、３−ケトアシル−ＣｏＡと称する）を還元することにより、生体高分子であるポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以下、ポリヒドロキシアルカン酸と称する）を構成するモノマーである種々の３−ヒドロキシアルカン酸−補酵素Ａ複合体（以下、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡと称する）を与えることのできる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素の補酵素利用能力を改変して、該還元酵素の触媒活性を制御するための酵素改変方法に関する。また、本発明は、該改変方法により得られる、野生型酵素に比して優れた酵素活性を有する３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体、該酵素変異体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換細胞、該酵素変異体の製造方法、ならびに、該酵素変異体または該形質転換細胞を用いるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。

ポリヒドロキシアルカン酸は、微生物が生成するポリエステル型有機分子ポリマーとして発見され、近年では生分解性を有する環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産され、かつ多様な産業へ利用する試みが行われている。そのポリヒドロキシアルカン酸を構成するモノマー単位は、一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が、単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。ポリヒドロキシアルカン酸のポリマーとしての特性、すなわち融点、ガラス転移点、結晶化率、伸び強度といった物理化学的特性は、ポリマーを構成するモノマー種含有率の違いにより異なることが知られている（非特許文献１）。

微生物中においてポリヒドロキシアルカン酸が生合成される反応経路の一部はすでに解明されている。ポリヒドロキシアルカン酸生合成に特に関与する酵素の一群は、多様なヒドロキシアルカン酸モノマーを基質とするＰｈａ酵素群、および主としてヒドロキシ酪酸モノマーを基質とするＰｈｂ酵素群、の２群からなる。これら酵素群を構成する個々の酵素は、微生物種ごとに似通ったアミノ酸配列を持つ酵素ファミリーであるが、細部のアミノ酸配列は異なっている（非特許文献１）。

ポリヒドロキシアルカン酸を工業的に生産し活用するためには、微生物による生産量を増加させることについて、技術開発を行う必要がある。この要件においては、先述したポリエステル生合成経路を構成する酵素群を、他種微生物の対応する酵素と置換したり、あるいは野生型酵素に突然変異を加えることにより、ポリエステルの産生量を増加させる試みが行われ、一定の成果が得られている（特許文献１、非特許文献２、３）。
しかしながら、ポリヒドロキシアルカン酸の実用的な工業的生産を行うには、それら酵素群のさらなる改良による、微生物による生産量の向上と効率化が必要である。特にポリヒドロキシアルカン酸を構成するモノマー原料である３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを触媒的に生産する３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素（以下、ＰｈｂＢ酵素と称する）の改良により、生体内でのモノマー原料の生産量を向上させ、もってポリマー生産量を向上させることが必要である。
特開２００２−１９９８９０号公報 日本油化学会誌、１９９９年、４８巻、１３５３−１３６４頁 発酵ハンドブック（共立出版）、２００１年、３７４−３７８頁 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９８年、１８０巻、６４５９−６４６７頁

本発明は、ＰｈｂＢ酵素の補酵素利用能力と触媒活性を改良し、ポリヒドロキシアルカン酸の原料である３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの生産量を向上させるための合理的な酵素改変方法の提供を目的とする。また、本発明は、該改変方法により野生型酵素の触媒活性を改良したＰｈｂＢ酵素変異体、該ＰｈｂＢ酵素変異体をコードするＤＮＡおよびそれを導入した形質転換細胞を提供し、それら酵素変異体または形質転換細胞を用いた３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡおよびポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＰｈｂＢ酵素の触媒活性を向上させうる酵素改変方法を新たに開発し、該改変方法によってポリヒドロキシアルカン酸の生体内原料である３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの生産を効率的に行いうるＰｈｂＢ酵素変異体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、酵素の触媒活性を変換させるための酵素改変方法であって、ＰｈｂＢ酵素のあらかじめ選択された部位の単数または複数の任意のアミノ酸残基を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、ニコチンアミド補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御し、かつ該酵素が触媒する還元反応活性を制御することを特徴とする酵素改変方法に関する。
ここでニコチンアミド補酵素分子とは、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびそれらの酸化体である（以下、特記の無い場合は、補酵素と称する）。

また、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ酵素）および該酵素と３０％以上の配列相同性を持つ酵素の酵素改変方法、該方法により改変された酵素変異体、該酵素変異体の利用法に関する。

さらに本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素に対して３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の配列相同性を有するＰｈｂＢ酵素であって、かつ前記補酵素分子結合部位が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素のアミノ酸残基部位のうち、Ｍｅｔ−１２、Ｇｌｙ−１３、Ａｌａ−３２、Ｃｙｓ−３４、Ｇｌｙ−３５、Ｐｒｏ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｓｅｒ−３８、Ｐｒｏ−３９、Ａｒｇ−４０、Ａｒｇ−４１、Ａｌａ−５７と立体構造上同等な位置を占めるアミノ酸残基に対して変異処理を行う、上記酵素改変方法に関する。

また本発明は、上記ＰｈｂＢ酵素が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の野生型ＰｈｂＢ酵素である上記酵素改変方法に関する。
さらに本発明は、野生型ＰｈｂＢ酵素から、アミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失またはそれらの組合せによって得られ、該野生型酵素が示す酵素活性よりも優れた酵素活性を持つＰｈｂＢ酵素変異体に関し、さらに好ましくは、上記野生型ＰｈｂＢ酵素が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のＰｈｂＢ酵素であるＰｈｂＢ酵素変異体に関する。

さらに本発明は、上記酵素改変方法により得られたＰｈｂＢ酵素変異体、その酵素変異体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを有するベクター、そのベクターにより形質転換された形質転換細胞に関する。

さらに本発明は、上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程を含むＰｈｂＢ酵素変異体の製造方法に関する。
さらに本発明は、上記酵素変異体と種々のケトンとを反応させる工程を含む光学活性アルコールの製造方法に関する。
さらに本発明は、上記酵素変異体または上記形質転換細胞と３−ケトアシル−ＣｏＡとを反応させる工程を含む３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの製造方法に関する。
さらに本発明は、上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程もしくは上記酵素変異体と３−ケトアシル−ＣｏＡとを反応させる工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。

以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本明細書において、「３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素（３−Ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）」とは、３−ケトアシル−ＣｏＡを反応基質とし、かつニコチンアミド補酵素を還元剤として、３−ケトアシル−ＣｏＡを対応する３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへと不斉還元する反応を触媒する酵素であって、一般にＰｈｂＢ酵素と略称される酵素である。

また、３−ケトアシル−ＣｏＡとは、３−ケトブタノイル−ＣｏＡ、３−ケトペンタノイル−ＣｏＡ、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ケト脂肪酸−ＣｏＡ、おのおの単独の化合物もしくはそれら化合物の混合物である。
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとは、３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシ脂肪酸−ＣｏＡ、おのおの単独の化合物もしくはそれら化合物の混合物である。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。アミノ酸残基のつながりは“−”により表される。例えば、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのように示される。同じアミノ酸残基が連続する場合には、例えば（Ａｌａ）３と表され、これはＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａと同義である。

Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。

本明細書において、ＰｈｂＢ酵素変異体を記述するに際して、参照を容易にするため、（もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸）の命名法を適用する。従って、例えば、位置６４におけるチロシンのアスパラギン酸への置換は、Ｔｙｒ６４ＡｓｐまたはＹ６４Ｄと示される。多重変異については、スラッシュ記号（“／”）により分けることで表記する。例えば、Ｓ４１Ａ／Ｙ６４Ｄとは、位置４１のセリンをアラニンへ、かつ、位置６４のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。

本明細書において、酵素の「変異体」とは、酵素のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、挿入もしくは欠失されたアミノ酸配列を有し、酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変された酵素をいう。

変異体の設計に利用されるアミノ酸変異としては、アミノ酸の置換の他に、アミノ酸の挿入または欠失もまた挙げられる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の挿入とは、もとのペプチド鎖に１つ以上のアミノ酸を挿入することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上のアミノ酸を欠失させることをいう。

以下、所望の変異体を取得するための、タンパク質のアミノ酸の変異について説明する。
なお、アミノ酸の置換等を実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。

本発明者らは、ＰｈｂＢ酵素の触媒活性向上を図るために、該酵素と補酵素との結合能を増強しうるアミノ酸変異の設計を行った。この設計は、ＰｈｂＢ酵素の補酵素分子結合部位を特定する工程と、該結合部位近傍において補酵素分子と相互作用するアミノ酸残基を決定する工程と、該決定残基に対して補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御するための変異設計を行う工程を含む。

ＰｈｂＢ酵素の補酵素分子結合部位を特定する工程は、該酵素のアミノ酸配列と相同性が高く、かつ立体構造が既知である類縁酵素群のアミノ酸配列とをマルチプル・アラインメントした結果を分析することにより、また、該酵素の三次元構造をモデリングした結果を分析することにより、実施した。
ＰｈｂＢ酵素の補酵素分子と相互作用するアミノ酸残基を決定する工程は、該酵素の三次元構造をモデリングし、その立体構造を分析することにより実施した。
該決定残基に対して補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御するための変異設計を行う工程は、多重変異蛋白質アミノ酸配列の最適化解を算出する方法（特開２００１−１８４３８１号公報）等の計算化学的分析により実施した。

これらの設計作業の結果として、野生型ＰｈｂＢ酵素の補酵素結合能を向上させ、もって酵素触媒活性が向上しうる、種々のＰｈｂＢ酵素変異体のアミノ酸配列を決定した。当該アミノ酸配列を持つ種々のＰｈｂＢ酵素変異体を遺伝子工学的手法により取得し、それら変異体の酵素活性を検証したところ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの生産を効率的に行いうるＰｈｂＢ酵素変異体を得ることに成功した。

本発明の実施態様を具体的に以下に示す。
すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素のアミノ酸残基部位のうち、Ｍｅｔ−１２、Ｇｌｙ−１３、Ａｌａ−３２、Ｃｙｓ−３４、Ｇｌｙ−３５、Ｐｒｏ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｓｅｒ−３８、Ｐｒｏ−３９、Ａｒｇ−４０、Ａｒｇ−４１、Ａｌａ−５７において、単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、該酵素と補酵素との結合能を向上させ、触媒活性が向上したＰｈｂＢ酵素変異体を得ることを特徴とする酵素改変方法である。
また、当該改変方法により得られてなるＰｈｂＢ酵素変異体である。

なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の野生型ＰｈｂＢ酵素である。
また、酵素の触媒活性は、例えば、アセトアセチルＣｏＡを基質、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを補酵素としてそれぞれ用いて酵素触媒反応を行い、反応過程での補酵素濃度変化を吸光度分析法により測定し、得られた測定実験データをミカエリス・メンテン式に当てはめることにより、求めることができる。

好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素のアミノ酸残基部位において、Ｍｅｔ−１２をＳｅｒに、Ｇｌｙ−１３をＡｒｇに、Ａｌａ−３２をＶａｌに、Ｃｙｓ−３４をＡｓｐに、Ｇｌｙ−３５をＩｌｅまたはＡｒｇに、Ｐｒｏ−３６をＳｅｒに、Ａｓｎ−３７をＬｙｓに、Ｓｅｒ−３８をＧｌｕに、Ｐｒｏ−３９をＡｓｐに、Ａｒｇ−４０をＡｌａまたはＧｌｕに、Ａｒｇ−４１をＡｌａに、およびＡｌａ−５７をＴｙｒに、から選ばれるアミノ酸の置換を少なくとも１つ行うことにより、該酵素と補酵素との結合能を向上させ、触媒活性が向上したＰｈｂＢ酵素変異体である。

より好ましくは、配列番号２、３、４、５および６それぞれで示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素またはＰｈｂＢ酵素変異体が挙げられる。
なお、これら変異体において変異設計を行った部分のアミノ酸配列と、野生型ＰｈｂＢ酵素のアミノ酸配列の比較を表１に示す。

また、本発明においては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素に対して３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の配列相同性を有する３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素の、Ｍｅｔ−１２、Ｇｌｙ−１３、Ａｌａ−３２、Ｃｙｓ−３４、Ｇｌｙ−３５、Ｐｒｏ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｓｅｒ−３８、Ｐｒｏ−３９、Ａｒｇ−４０、Ａｒｇ−４１、Ａｌａ−５７のアミノ酸残基部位と立体構造上同等な位置を占めるアミノ酸残基において、単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、触媒活性が向上した３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体を得ることを特徴とする酵素改変方法も挙げられる。
また、当該酵素改変方法により得られてなるＰｈｂＢ酵素変異体も挙げられる。

配列相同性は、プログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒａｓｏｎ Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＰｈｂＢ酵素に対して十分な配列相同性を有する酵素に対しても、本発明による触媒活性向上のためのアミノ酸変異は有効である。

さらに本発明の実施態様としては、前記酵素改変方法により得られたＰｈｂＢ酵素変異体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを有するベクター、そのベクターにより形質転換された形質転換細胞が挙げられる。

本発明のＰｈｂＢ酵素変異体をコードするＤＮＡを取得するための、野生型ＰｈｂＢ酵素をコードするＤＮＡへの部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、野生型ＰｈｂＢ酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、野生型ＰｈｂＢ酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異用プライマーと、前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで、前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと、前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーで、もう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニーリング操作後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲ操作することにより行うことができる。

本発明のベクターは、前述したＰｈｂＢ酵素変異体をコードするＤＮＡを適当なベクターに連結（挿入）することにより得ることができる。
また、本発明の形質転換細胞は、本発明の組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を；酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を；植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を；動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ等をベクターとして用いることができる。

宿主としては、特に限定されないが、例えば、大腸菌等の細菌、酵母、植物細胞、動物細胞等が挙げられる。

本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ前記ベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
より具体的には、大腸菌を形質転換する方法（特開２００２−１９９８９０号公報）、酵母を形質転換する方法（ＷＯ０３／０３３７０７）に記載された方法により、ポリヒドロキシアルカン酸を生産する形質転換細胞を得ることができる。

次に、本発明のＰｈｂＢ酵素変異体の製造方法は、上記形質転換細胞を用いる、つまり、上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程を含むものである。
具体的には、上記形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明の酵素変異体を生成蓄積させ、該培養物から前記酵素変異体を採取することにより、本発明のＰｈｂＢ酵素変異体を製造することができる。

本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地または合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度２０〜４０℃で、好気的に６〜２４時間培養することにより、本発明の酵素変異体を菌体内に蓄積させることができる。
次いで、前述した培養法により得られた培養物を遠心する（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）等により、酵素変異体を回収することができる。

本発明の酵素変異体の精製は、上記回収した酵素変異体を、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を、単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。

次に、本発明の光学活性アルコールの製造方法は、上記酵素変異体を用いるものであり、具体的には、上記酵素変異体と種々の非対称ケトンを適切な条件下にて反応させる工程を含む方法である。
なお、適切な反応条件としては、例えば、酵素改変方法および酸化還元酵素変異体（特開２００３−８０４６５３号公報）に記載された反応条件等が挙げられる。

また、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの製造方法は、上記酵素変異体または形質転換細胞を用いるものであり、具体的には、上記酵素変異体または形質転換細胞と、３−ケトアシル−ＣｏＡとを適切な条件下にて反応させる工程を含む方法である。当該方法においては、酵素反応生成物として３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを製造しうる。
なお、適切な反応条件としては、例えば、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素に関する文献（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．５２ （１９８８） ｐｐ．２５９−２６４）に記載された反応条件等が挙げられる。

さらに、本発明のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、上記形質転換細胞を用いる、つまり、上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程を含むものである。
具体的には、当該ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法においては、前述した方法によって得られた形質転換細胞を、適切な培地、すなわちグルコース等の糖や飽和脂肪酸グリセリド等を十分な量だけ含む培地にて、培養することによって、ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸を製造することができる。
より具体的には、例えば、形質転換した大腸菌を用いる方法（特開平１１−２４３９５６号公報）、形質転換した酵母を用いる方法（特開２００３−８３３７０７号公報）に記載された方法等により、ポリヒドロキシアルカン酸を製造することができる。

なお、当該ポリヒドロキシアルカン酸が、下記一般式（１）：

（式中、Ｒは炭素数１〜２０のアルキル基を表し、ｎは該ポリマーのモノマー単位数を表す。なお、アルキル基の炭素数は該ポリマー中で同一であっても異なっていてもよい。）で表される化合物であることが好ましい。

Ｒの炭素数１〜２０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、テトラデシル基、オクタデシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基またはｎ−プロピル基である。

細胞内に蓄積されたポリエステルの細胞内含量およびポリエステルの組成は、加藤らの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５巻、３６３ページ（１９９６）；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６９巻、５１５ページ（１９９６））に従い、培養細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー、ＮＭＲ等に供試することにより測定分析することができる。

本発明の酵素変異体を触媒として用いることにより、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡおよび光学活性アルコールを高い効率で製造することが可能となる。また、本発明の酵素変異体または形質転換細胞を用いることにより、ポリヒドロキシアルカン酸を高い効率で製造することが可能となる。

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。

（実施例１）ＰｈｂＢ酵素立体構造のモデリングと、補酵素結合部位の解析
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の野生型ＰｈｂＢ酵素のアミノ酸配列をクエリーとして、プログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いて、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ）に収載の蛋白質一次構造データから、相同性の高いアミノ酸配列を検索抽出した。得られたアミノ酸配列のうち、野生型ＰｈｂＢ酵素と最も相同性の高い配列としてグルコース脱水素酵素（ＰＤＢコード：１ＧＣＯ）を選択し、ＰＤＢに収載されている該酵素（１ＧＣＯ）の原子座標データを雛型として、プログラムＳｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、ＥｘＰＡＳｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／より入手可能））を用いて、アミノ酸残基の置換、挿入、および欠失の各操作を行い、野生型ＰｈｂＢ酵素の立体構造モデル（原子座標データと同義）を得た。次に、補酵素であるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを前記の立体構造モデルに埋め込む操作を行い、野生型ＰｈｂＢ酵素と補酵素（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）との複合体の立体構造モデルを得た。得られたＰｈｂＢ酵素−補酵素複合体立体構造モデル（原子座標データ）を用いて、ＮＡＤＨのリボース２’−ＯＨまたはＮＡＤＰＨのリボース２’−リン酸エステルの近傍に存在するアミノ酸残基が、残基番号１１〜１７、残基番号３２〜４４、および残基番号５７であることを特定した。多重変異蛋白質アミノ酸配列の最適化解を算出する方法（特開２００１−１８４３８１号公報）を用いて、それら特定されたアミノ酸残基位置の中から、ＮＡＤＨ結合能が向上すると見込めるアミノ酸残基位置と残基種、およびＮＡＤＰＨ結合能が向上すると見込めるアミノ酸残基位置と残基種をそれぞれ選出し、ＰｈｂＢ酵素変異体のアミノ酸配列とした。当該ＰｈｂＢ酵素変異アミノ酸配列は、配列番号２〜６に示したとおりであり、該変異アミノ酸配列群と野生型アミノ酸配列の比較は、前述の表１に示したとおりである。

（実施例２）野生型ＰｈｂＢ酵素（配列番号１）をコードする遺伝子
配列番号７に記載の塩基配列からなる野生型ｐｈｂＢ遺伝子を全合成し、配列番号８および９に記載の塩基配列からなるプライマーで増幅した。プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）のマルチクーニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩサイトをブラントエンド法で破壊したプラスミドｐＵＣＮＴ−２のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに、野生型ｐｈｂＢ遺伝子をクローニングした。

（実施例３）変異体Ｍ−３（配列番号２）をコードする遺伝子
配列番号１０および１１に記載の塩基配列からなる合成遺伝子１５０ピコモルを混合し、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼにはＴａｋａｒａ社製ｐｙｒｏｂｅｓｔを用い、添付のバッファーとｄＮＴＰを用いた。反応液量は０．０３ｍｌとした。反応条件は９６℃×５分１回、９６℃×２分・６０℃×３０秒・７２℃×３０秒のサイクルを１２回とした。約１５０ｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動より切り出し、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断した。この遺伝子断片を、同酵素で切断処理した野生型遺伝子を含むｐＵＣＮＴ−２にクローニングして変異体Ｍ−３遺伝子を作成した。

（実施例４）変異体Ｍ−４（配列番号３）をコードする遺伝子
配列番号１０および１２に記載の塩基配列からなる合成遺伝子を用いて、変異体Ｍ−３遺伝子を作成したときと同一の方法にて、変異体Ｍ−４遺伝子を作成した。

（実施例５）変異体Ｍ−８（配列番号４）をコードする遺伝子
配列番号１３および１２に記載の塩基配列からなる合成遺伝子を用いて、変異体Ｍ−３遺伝子を作成したときと同一の方法にて、変異体Ｍ−８遺伝子を作成した。

（実施例６）変異体Ｍ−９（配列番号５）をコードする遺伝子
配列番号１０および１４に記載の塩基配列からなる合成遺伝子を用いて、変異体Ｍ−３遺伝子を作成したときと同一の方法にて、変異体Ｍ−２遺伝子を作成した。この変異体Ｍ−２遺伝子を含むｐＵＣＮＴ−２に対して、配列番号１５および１６に記載の塩基配列からなるプライマーを用い、クイックチェンジ法で前記変異体Ｍ−２のアミノ酸配列５７番のアラニンをチロシンに変換した変異体Ｍ−９遺伝子を作成した。クイックチェンジ法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコールに従った。

（実施例７）変異体Ｍ−１１（配列番号６）をコードする遺伝子
変異体Ｍ−４遺伝子を含むｐＵＣＮＴ−２に対して、配列番号１５および１６に記載の塩基配列からなるプライマーを用い、クイックチェンジ法で前記変異体Ｍ−４のアミノ酸配列５７番のアラニンがチロシンに変換された変異体Ｍ−１１遺伝子を作成した。

（実施例８）遺伝子の配列確認
前記の変異体遺伝子は、全て配列確認をＰＥＲＩＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。

（実施例９）遺伝子の発現と酵素の精製
上記で作成したプラスミドをそれぞれ用いて、大腸菌ＪＭ−１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社製）の形質転換を行った。得られた上記野生型ｐｈｂＢ遺伝子またはｐｈｂＢ変異体遺伝子のいずれかを含むＪＭ−１０９細胞をそれぞれ、アンピシリンを含むＬＢ培地にて終夜培養した。本培養液１ｍｌを、イソプロピル １−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）を含む２ＹＴ培地（１０ｍｌ、アンピシリン含有）に接種し、３０℃にて８時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（０．５ｍＭ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）（１ｍＭ）を含むリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）０．５ｍｌに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分と不溶性画分に分画した。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、変異体Ｍ−３，４，８，９，１１それぞれの遺伝子を導入した細胞の上清画分すべてに、野生型ＰｈｂＢ酵素とほぼ同一の分子量２万５千の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる蛋白質発現を認めた。発現量は野生型とほぼ同程度であった。不溶性画分への蓄積は、全ての変異体で認められなかった。

（実施例１０）変異体の活性測定
これら変異体の活性について、アセトアセチルＣｏＡ（シグマ社製）の還元反応における活性および補酵素特性を測定した。反応液の組成は、補酵素として０．０２ｍＭから０．５ｍＭ濃度のＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ（いずれもオリエンタル酵母社製）と、基質としてアセトアセチルＣｏＡ（０．０５ｍＭ）とを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）０．５ｍｌとし、適当に希釈された菌体破砕液を０．０１ｍｌ添加し、反応を開始した。菌体破砕液の希釈量は、予備実験により十分に反応の初速度を求められる量として決定した。おおむね２０倍から２５０倍希釈であった。反応は分光光度計を用いて波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少を３分間追跡し、反応の初速度を測定した。分光光度計のセルは光路長約０．４ｃｍのものを用いた。補酵素濃度を４ないし５点変化させたときの反応初速度をプロットし、ミカエリス・メンテン式に最小二乗法によりフィットさせて、各種パラメーターを求めた。結果を表２に示した。

表２において、ＶｍａｘおよびＫｍは、ミカエリス・メンテン式による酵素触媒定数であり、補酵素としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを、基質としてアセトアセチルＣｏＡを用いたときの、野生型ＰｈｂＢ酵素（配列番号１）およびＰｈｂＢ酵素変異体（配列番号２〜６）の最大反応速度と補酵素結合定数をそれぞれ表す。活性の値（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）は、本反応条件における、酵素液１ｍｌ当たりの１分間における吸光度（ＯＤ）３４０ｎｍの変化量から、ミカエリス・メンテン式を用いた上記方法により算出した。
また、Ｎ．Ｓ．は、測定濃度域において飽和に達しなかったことを示す。

野生型酵素と酵素変異体との活性比較：
表２の結果に示されるように、変異体Ｍ−４、Ｍ−８およびＭ−１１は、ＮＡＤＰＨを補酵素としたときの活性が野生型に比べて向上した。また、変異体Ｍ−３、Ｍ−４、Ｍ−９およびＭ−１１は、ＮＡＤＨを補酵素としたときの活性が野生型に比べて向上した。

本発明の酵素変異体を触媒として用いることにより、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡおよび光学活性アルコールを高い効率で製造することが可能となる。また、本発明の酵素変異体または形質転換細胞を用いることにより、ポリヒドロキシアルカン酸を高い効率で製造することが可能となる。

Claims (20)

1. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸残基部位のうち、Ｍｅｔ−１２、Ｇｌｙ−１３、Ａｌａ−３２、Ｃｙｓ−３４、Ｇｌｙ−３５、Ｐｒｏ−３６、Ａｓｎ−３７、Ｓｅｒ−３８、Ｐｒｏ−３９、Ａｒｇ−４０、Ａｒｇ−４１、Ａｌａ−５７において、単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、触媒活性が向上した３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体を得ることを特徴とする酵素改変方法。
2. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素に対して３０％以上の配列相同性を有する３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素の、請求項１に記載のアミノ酸残基部位と立体構造上同等な位置を占めるアミノ酸残基において、単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、触媒活性が向上した３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体を得ることを特徴とする酵素改変方法。
3. 請求項１に記載の改変方法により得られてなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体。
4. 請求項２に記載の改変方法により得られてなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体。
5. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸残基部位において、Ｍｅｔ−１２をＳｅｒに、Ｇｌｙ−１３をＡｒｇに、Ａｌａ−３２をＶａｌに、Ｃｙｓ−３４をＡｓｐに、Ｇｌｙ−３５をＩｌｅまたはＡｒｇに、Ｐｒｏ−３６をＳｅｒに、Ａｓｎ−３７をＬｙｓに、Ｓｅｒ−３８をＧｌｕに、Ｐｒｏ−３９をＡｓｐに、Ａｒｇ−４０をＡｌａまたはＧｌｕに、Ａｒｇ−４１をＡｌａに、およびＡｌａ−５７をＴｙｒに、から選ばれるアミノ酸の置換を少なくとも１つ行うことにより得られてなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体。
6. 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素。
7. 配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素。
8. 配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素。
9. 配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素。
10. 配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素。
11. 請求項３〜５のいずれかに記載の酵素変異体または請求項６〜１０のいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡ。
12. 請求項１１に記載のＤＮＡを有してなるベクター。
13. 請求項１２に記載のベクターにより形質転換されてなる形質転換細胞。
14. 請求項１３に記載の形質転換細胞を用いた、請求項３〜５のいずれかに記載の３−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素変異体または請求項６〜１０のいずれかに記載の酵素の製造方法。
15. 請求項３〜５のいずれかに記載の酵素変異体または請求項６〜１０のいずれかに記載の酵素を用いた、光学活性アルコールの製造方法。
16. 請求項３〜５のいずれかに記載の酵素変異体または請求項６〜１０のいずれかに記載の酵素を用いた、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの製造方法。
17. 請求項１３に記載の形質転換細胞を用いた、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの製造方法。
18. 請求項１３に記載の形質転換細胞を用いた、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
19. 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、下記一般式（１）：
    

    

    （式中、Ｒは炭素数１〜２０のアルキル基を表し、ｎは該ポリマーのモノマー単位数を表す。なお、アルキル基の炭素数は該ポリマー中で同一であっても異なっていてもよい。）で表される化合物である請求項１８に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
20. 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、前記式（１）においてＲがメチル基またはｎ−プロピル基である化合物である請求項１９に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。