JP7067737B2 - Dnaポリメラーゼ変異体 - Google Patents
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
[1]N末側からC末側の方向に、
a)PCNAと結合する1又は複数のペプチド
および、
b)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含む融合ポリペプチド、
[2]PCNAと結合するペプチドがPIPボックスを有するペプチドであることを特徴とする、[1]に記載の融合ポリペプチド、
[3]PIPボックスが、配列表の配列番号52~91のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする、[2]に記載の融合ポリペプチド、
[4]PCNAと結合するペプチドがDNAポリメラーゼ関連因子由来のPIPボックスを有するペプチドであることを特徴とする、[1]または[2]に記載の融合ポリペプチド、
[5]PCNAと結合するペプチドが複製因子Cラージサブユニット由来のPIPボックスを有するペプチドであることを特徴とする、[1]、[2]及び[4]のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
[6]PCNAと結合するペプチドが配列表の配列番号3で示されるアミノ酸配列、もしくは前記アミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする、[1]、[2]、[4]及び[5]のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
[7]PCNAと結合するペプチドとDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの間に5~50アミノ酸のリンカーペプチドを有することを特徴とする、[1]~[6]のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
[8]リンカーペプチドがセリンとグリシンから成るアミノ酸配列であることを特徴とする、[7]に記載の融合ポリペプチド、
[9]DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがPolI型DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、[1]~[8]のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
[10]DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがTaq DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、[1]~[9]のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
[11][1]~[10]のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする核酸、
[12][1]~[10]のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物、
[13]さらに、PCNAを含有する、[12]に記載の核酸増幅用組成物、
[14][1]~[10]のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含有するキット、
[15]さらに、PCNAを含有する、[14]に記載のキット、
[16][1]~[10]のいずれかに記載の融合ポリペプチドならびにPCNAを含有する組成物を使用することを特徴とする、鋳型DNAに相補的なDNAの製造方法、
に関する。
本明細書において「ペプチド」とは、2個以上のアミノ酸分子が、一方のアミノ基と他方のカルボキシル基とから1分子の水がとれて結合した化合物をいう。一般的には、約10個以下のアミノ酸から成るものをオリゴペプチド、それ以上のアミノ酸から成るものをポリペプチドというが、厳密な境界はない。
本発明の融合ポリペプチドは、N末側からC末側の方向に、a)PCNAと結合する1又は複数のペプチドおよび、b)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含んでいる。よって、本発明の融合ポリペプチドはDNAポリメラーゼ変異体であると言うことができる。
また、これらのPIPボックスは、本発明の融合ポリペプチド内に複数個存在してもよい。融合ポリペプチドに含まれるPIPボックスの数は、特に限定はないが、1~6個、好ましくは2~4個が例示される。これら複数のPIPボックスは、その機能を果たす限りにおいては、それぞれのアミノ酸配列が異なっていてもよい。また、複数のPIPボックス同士の間には、例えば後述のリンカーペプチドなど、別のアミノ酸配列が挟まっていてもよい。
本発明の融合ポリペプチドは、PCNAと組み合わせることにより長鎖長の核酸の増幅や反応時間を短縮した核酸増幅に使用することができる。本発明の核酸増幅法は、等温核酸増幅法や変温核酸増幅方法のいずれにも使用できる。特に限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction:PCR)、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)、MALBAC法 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)、MDA法(Multiple Displacement Amplification)、鎖置換型DNA伸長反応(strand displacement amplification:SDA)、ローリングサークル増幅法(rolling circle amplification:RCA)、交差プライミング増幅法(cross priming amplification)、ループ介在等温増幅法(loop-mediated isothermal amplification:LAMP)、ICAN法(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)等のいずれにも好適に使用できる。例えば、本発明の融合ポリペプチドとPCNAの組み合わせは高い伸長性が期待できることからゲノム解析やゲノム編集用の長鎖長のDNA調製において有効であり、等温核酸増幅法に利用できる。また、本発明の融合ポリペプチドとPCNAの組み合わせは、DNA合成速度を向上させる高速反応性に優れていることから反応時間を短縮させた高速PCRに使用できる。特に本発明を限定するものではないが、環状構造の安定性が低下するような変異を導入されたPCNAは本発明の融合ポリペプチドと組み合わせるのに好適である。
本発明により得られる融合ポリペプチドは、上記(3)の核酸増幅法に使用可能な核酸増幅用組成物のコンポーネントとして使用する事ができる。さらに、核酸増幅用組成物はDNAポリメラーゼの活性に必要な要素、例えば二価金属塩(マグネシウム塩等)、dNTP、pH維持のための緩衝成分等を含んでいてもよい。
本発明の融合ポリペプチドを含有するキットは、本発明の一態様である。好適には、上記(1)に記載の融合ポリペプチドに加え、さらにPCNAを含有するキットが例示される。キットに含有されるPCNAとして、特に好適には上述の環状構造をより不安定化させた変異型PCNAが挙げられる。本発明のキットは、さらに二価金属塩(マグネシウム塩等)、dNTP、pH維持のための緩衝成分等、本発明の核酸増幅用組成物の調製に使用される成分を個別のコンポーネントとして含有してもよく、これらのうちの複数を組み合わせて作製されたコンポーネントを含有してもよい。
本発明の融合ポリペプチドならびにPCNAを含有する組成物は、鋳型DNAに相補的なDNAの製造方法に使用することができる。DNAの製造方法には、上記(3)の核酸増幅方法が利用できる。これらの核酸増幅方法で製造したDNAを利用することにより、標的核酸の塩基配列を決定したり、標的核酸を標識化したり、標的核酸に部位特異的変異を導入することも可能である。
配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列を有するTaq DNAポリメラーゼのN末端またはC末端に、配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列を有するPyrococcus furiosisの複製因子Cラージサブユニット(以下、PfuRFCLとする)のPIPボックスを、リンカーペプチドを介して付加した。N末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼはTaq81~Taq85(PIP-L5-Taq、PIP-L10-Taq、PIP-L15-Taq、PIP-L35-Taq、PIP-L47-Taq)の5種類であり、C末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼはTaq92~Taq94(Taq-L5-PIP、Taq-L10-PIP、Taq-L15-PIP)の3種類である。さらに、N末端にPIPボックスが2~5個付加されたTaq DNAポリメラーゼを作成した。すなわち、Taq95(PIP-L14-PIP-L15-Taq)、Taq96(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)、Taq97(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)、Taq98(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)の4種類である。本明細書におけるPIPボックス付きTaq DNAポリメラーゼの名称及び構造を表2に示す。表2の「構造」欄の「L」の後ろに付された数字は、セリン残基とグリシン残基の繰り返しから成るリンカーペプチドの長さ(アミノ酸残基数)を示す。
配列表の配列番号2記載の塩基配列を有するTaq DNAポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号28記載の塩基配列を有するTaqNPIP-5プライマーおよび配列表の配列番号29記載の塩基配列を有するTaq-3プライマーでPCRを行った。
PCR酵素はKOD Plus Neo DNA polymerase(東洋紡社製)を用い、PCRの条件は、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で3分を1サイクルとした30サイクル反応で行った。増幅した断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、制限酵素NdeI(タカラバイオ社製)およびNotI(タカラバイオ社製)で切断した。この断片を同制限酵素で切断されたpET21a(ノバジェン社製)にライゲーションした。大腸菌JM109株(タカラバイオ社製)をライゲーション産物で形質転換した後、LB-アンピシリンプレートに撒いた。生じたコロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を読み、配列番号5の塩基配列が含まれていることを確認した。このプラスミドをpTaq81と命名した。
QuickChange site-directed mutagenesis kit(Agilent Technologies社製)を用いた部位特異的変異法によって、Taq81のPIPボックスとリンカーペプチドの間に5アミノ酸が挿入されたポリペプチドをコードするDNA(配列番号7)を作製した。
鋳型としてpTaq81、プライマーに、配列表の配列番号30及び31記載の塩基配列をそれぞれ有するtaqN10-5およびtaqN10-3を用いて、95℃で30秒、55℃で60秒、68℃で8分を1サイクルとした14サイクルのPCRを行った。続いて、DpnIで消化した反応液1μLで大腸菌JM109株を形質転換した後、LB-アンピシリンプレートに撒いた。生じたコロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を読み、配列番号7の塩基配列が含まれていることを確認した。このプラスミドをpTaq82と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq81のPIPボックスとリンカーペプチドの間に10アミノ酸に該当する配列を挿入したTaq83(PIP-L15-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq81を鋳型とし、使用するプライマーを配列表の配列番号32及び33記載の塩基配列をそれぞれ有するtaqN15-5およびtaqN15-3に変更してPCRを行い、配列番号9の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq83と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq83のPIPボックスとリンカーペプチドの間に20アミノ酸に該当する配列を挿入したTaq84(PIP-L35-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq83を鋳型とし、配列表の配列番号34及び35記載の塩基配列をそれぞれ有するtaq-plus20-5およびtaq-plus20-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号11の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq84と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq84のリンカーペプチドの14番目と15番目のアミノ酸の間に12アミノ酸に該当する配列を挿入したTaq85(PIP-L47-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq84を鋳型とし、配列表の配列番号36及び37記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq-plus12-5およびTaq-plus12-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号13の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq85と命名した。
配列表の配列番号2記載の塩基配列を有するTaq DNAポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号38及び39記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq-5およびTq-L5-PIP-3の2つのプライマーを使用し、実施例1(1)記載の操作でPCR、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号15の塩基配列が含まれているプラスミドをpTaq92と命名した。
配列表の配列番号2記載の塩基配列を有するTaq DNAポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号38及び40記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq-5およびTq-L10-PIP-3の2つのプライマーを使用し、実施例1(1)記載の条件でPCR、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号17の塩基配列が含まれているプラスミドをpTaq93と命名した。
配列表の配列番号2記載の塩基配列を有するTaq DNAポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号38及び41記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq-5およびTq-L15-PIP-3を使用して実施例1(1)記載の条件でPCR、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号19の塩基配列が含まれているプラスミドをpTaq94と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq83のPIPボックスとリンカーペプチドの間にPIPボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したTaq95(PIP-L14-PIP-L15-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq83を鋳型とし、配列表の配列番号48及び29記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq95-5およびTaq-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号21の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq95と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq95のPIPボックスとリンカーペプチドの間にPIPボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したTaq96(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq95を鋳型とし、配列表の配列番号49及び29記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq96-5およびTaq-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号23の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq96と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq96のPIPボックスとリンカーペプチドの間にPIPボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したTaq97(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq96を鋳型とし、配列表の配列番号50及び29記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq97-5およびTaq-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号25の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq97と命名した。
実施例1(2)記載の変異導入方法で、Taq97のPIPボックスとリンカーペプチドの間にPIPボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したTaq98(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、pTaq97を鋳型とし、配列表の配列番号51及び29記載の塩基配列をそれぞれ有するTaq98-5およびTaq-3の2つのプライマーを用いてPCRを行い、配列番号27の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをpTaq98と命名した。
大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(アジレント社製)を前記それぞれの発現プラスミド(pTaq81~pTaq85及びpTaq92~pTaq94)で形質転換し、得られた形質転換体を50μg/mLアンピシリン及び34μg/mLクロラムフェニコールを含むLB培地1Lで振盪培養した。OD600が0.2-0.3に達したところでIPTGを終濃度1mMになるように加えてTaq DNAポリメラーゼを発現誘導した後、さらに25℃で約18時間振盪培養した。培養後に菌体を回収し、PBS溶液(150mM NaCl、20mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4、pH7.5)を用いて菌体を洗浄した後、再び菌体を回収し、-80℃で保存した。
(1)方法
表面プラズモン共鳴(SPR)解析は、BIAcore J(BIACORE社製)を用いた。Pyrococcus furiosusのPCNA(J. Bacteriology、第181巻、第6591~6599頁、1999年:以下PfuPCNAと記載する)をアミンカップリングによりCM5センサーチップ(GE Healthcare社製)上に固定し、25℃、流速30μL/分、溶液E(10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、pH8.3)の条件下で測定を行った。10、20、40、80、160、320nMに希釈したTaq81~Taq85の試料溶液、もしくは125nM、250nM、500nM、1μM、2μMに希釈したTaq94の試料溶液をそれぞれ2分間添加した。得られたセンサーグラムをBIAevaluation programにより解析し、Taq81~Taq85とPfuPCNAおよびTaq94とPfuPCNAの解離定数(Kd)を算出した。
SPR解析の結果を図3に示す。リンカーペプチドの長さが違う、N末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼ5種(Taq81、Taq82、Taq83、Taq84およびTaq85)とPfuPCNAの結合に関する解離定数(Kd)を算出したところ、それぞれ7.1×10-7M、4.4×10-7M、2.4×10-7M、2.5×10-7M、2.0×10-7Mであり、リンカーペプチドの長さに関わらずほぼ同等の値となった。この結果は、リンカーペプチドの長さに関わらず、N末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼとPfuPCNAとの相互作用の強さがほぼ一定であることを示す。
(1)1kbのDNA増幅
実施例1(13)で調製したTaq81~Taq85を用いてラムダDNAを鋳型としてPCRを行った。反応液組成は、1nMのTaq81~Taq85、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、1ng lambda DNA、各0.4μM プライマーとし、反応液の最終容量は50μLとした。反応は95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で60秒を1サイクルとして30サイクル行った。
本PCRでは、配列表の配列番号42及び43記載の塩基配列をそれぞれ有するF1およびR2-2の2つのプライマーを用いた。得られた生成物を1%アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、図4に示したように、市販のTaq DNAポリメラーゼ(レーン1)、野生型のTaq DNAポリメラーゼ(レーン2)およびTaq81~Taq85(レーン3~7)とも1kbの位置にバンドが見られた。この結果から、N末端に付加したPIPボックスおよびリンカーペプチドがPCRに影響しないことが確認できた。
次に、PCNA非存在下および存在下でPCRを行った。反応液組成は、1nMの野生型Taq DNAポリメラーゼ又はTaq81~Taq85、国際公開WO2007/004654号パンフレット 実施例記載の方法で調製した40nMのPfuPCNA D143R変異体(PCNA13)、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、1ng lambda DNA、各0.4μM プライマーとし、反応液の最終容量は50μLとした。最初に反応液を95℃で1分インキュベートした後、99℃で5秒、66℃で4分のシャトルPCRを30サイクル行った。本PCRでは、配列表の配列番号44及び45記載の塩基配列をそれぞれ有するLF-35およびLR8-35の2つのプライマーを用いた。得られた生成物を1%アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、図5に示したように、野生型のTaq DNAポリメラーゼでは、PCNA非存在下(レーン1)でもPCNA存在下(レーン2)でも、8kbの位置にバンドはほとんど見られなかったのに対し、Taq81~Taq85では、PCNA非存在下ではバンドはほとんど見られなかった(レーン3、5、7、9、11)が、PCNA存在下で、8kbの位置に濃いバンドが見られた(レーン4、6、8、10、12)。
このことは、N末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼであるTaq81~Taq85がPCNA存在下で8kbのDNA増幅が可能であることを示す。
一方、図6に示したように、C末端にPIPボックスが付加されたTaq DNAポリメラーゼであるTaq92~Taq93は、PCNA存在下でも8kbのDNA増幅はできなかった。
12kb及び15kbのDNA増幅について検討した。12kb増幅においては、配列表の配列番号44及び46記載の塩基配列をそれぞれ有するLF-35およびLR12-35の2つのプライマー、15kbのDNA増幅においては、配列表の配列番号44及び47記載の塩基配列をそれぞれ有するLF-35およびLR15-35の2つのプライマー、を使用した点を除き、実施例3-(2)同様に反応液を調製した。
このことは、Taq81~Taq85がPCNA存在下で12kbおよび15kbのDNA増幅が可能であることを示す。
また、本実施例で採用したシャトルPCRの条件は、従来のシャトルPCRの条件に比べてプライマーのアニーリングと相補鎖DNAの伸長にかかる時間が短い。それにもかかわらず従来と同じ長鎖長のDNAを増幅できたことから迅速性においても優れていることが確認できた。
実施例1(13)で調製したTaq95(PIP-L14-PIP-L15-Taq)、Taq96(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)、Taq97(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)およびTaq98(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Taq)を用いて、実施例3(3)と同様にして、PCNA存在下で12kbのPCRを行った。その結果を図9に示す。さらに、LAS-3000mini(GEヘルスケア社製)を用いて増幅産物の定量を行った。上記PCRから定量までを3回繰り返し、Taq83(PIP-L15-Taq)の増幅産物を1とした時の相対値をグラフ化した。その結果を図10に示す。
このことは、Taq DNAポリメラーゼのN末端にPIPボックスを複数個付加することにより、効率的なDNA増幅が可能となることを示す。
実施例1で使用した配列表の配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するPIPボックスに代えて、表1に記載の配列表の配列番号52~91に記載のアミノ酸配列を有するいずれかのペプチド(即ち、PIPボックス)を使用して、実施例1に記載された方法に準じて、いずれかのPIPボックスがN末端に付加されたTaq DNAポリメラーゼを精製する。かかるTaq DNAポリメラーゼを用いて、実施例3に記載された方法に準じて、PCNA存在下でDNA増幅を実施する。
配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するPIPボックスに代えて、表1に記載のいずれかのペプチドを使用する場合、前者と同様の効果が期待できる。
配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するPIPボックスに代えて、表1に記載のいずれかのペプチドを使用する場合、前者と同様の効果が期待できる。
SEQ ID NO: 2: Taq DNA polymerase nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 3: Pyrococcus furiosus RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 4: DNA polymerase variant Taq81 amino acid sequence
SEQ ID NO: 5: DNA polymerase variant Taq81 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 6: DNA polymerase variant Taq82 amino acid sequence
SEQ ID NO: 7: DNA polymerase variant Taq82 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 8: DNA polymerase variant Taq83 amino acid sequence
SEQ ID NO: 9: DNA polymerase variant Taq83 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 10: DNA polymerase variant Taq84 amino acid sequence
SEQ ID NO: 11: DNA polymerase variant Taq84 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 12: DNA polymerase variant Taq85 amino acid sequence
SEQ ID NO: 13: DNA polymerase variant Taq85 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 14: DNA polymerase variant Taq92 amino acid sequence
SEQ ID NO: 15: DNA polymerase variant Taq92 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 16: DNA polymerase variant Taq93 amino acid sequence
SEQ ID NO: 17: DNA polymerase variant Taq93 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 18: DNA polymerase variant Taq94 amino acid sequence
SEQ ID NO: 19: DNA polymerase variant Taq94 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 20: DNA polymerase variant Taq95 amino acid sequence
SEQ ID NO: 21: DNA polymerase variant Taq95 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 22: DNA polymerase variant Taq96 amino acid sequence
SEQ ID NO: 23: DNA polymerase variant Taq96 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 24: DNA polymerase variant Taq97 amino acid sequence
SEQ ID NO: 25: DNA polymerase variant Taq97 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 26: DNA polymerase variant Taq98 amino acid sequence
SEQ ID NO: 27: DNA polymerase variant Taq98 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 28: TaqNPIP-5 primer
SEQ ID NO: 29: Taq-3 primer
SEQ ID NO: 30: taqN10-5 primer
SEQ ID NO: 31: taqN10-3 primer
SEQ ID NO: 32: taqN15-5 primer
SEQ ID NO: 33: taqN15-3 primer
SEQ ID NO: 34: taq-plus20-5 primer
SEQ ID NO: 35: taq-plus20-3 primer
SEQ ID NO: 36: Taq-plus12-5 primer
SEQ ID NO: 37: Taq-plus12-3 primer
SEQ ID NO: 38: Taq-5 primer
SEQ ID NO: 39: Tq-L5-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 40: Tq-L10-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 41: Tq-L15-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 42: F1 primer
SEQ ID NO: 43: R2-2 primer
SEQ ID NO: 44: LF-35 primer
SEQ ID NO: 45: LR8-35 primer
SEQ ID NO: 46: LR12-35 primer
SEQ ID NO: 47: LR15-35 primer
SEQ ID NO: 48: Taq95-5 primer
SEQ ID NO: 49: Taq96-5 primer
SEQ ID NO: 50: Taq97-5 primer
SEQ ID NO: 51: Taq98-5 primer
SEQ ID NO: 52: P. furiosus RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: M.jannaschii RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 54: P. furiosus PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 55: T.litoralis PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: A.fulgidus PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: P.occultum PolBII PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: M.jannaschii DP2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: M.thermoautotrophicum DP2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: H.sapiens Polδ p66 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: S.cerevisiae Pol32 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: S.pombe Cdc27 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: S.cerevisiae Pol2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 64: P.furiosus Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 65: M.jannaschii Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 66: A.fulgidus Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 67: H.sapiens Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 68: D.melanogaster Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 69: S.cerevisiae Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 70: S.pombe Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 71: H.sapiens DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 72: X.laevis DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 73: S.cerevisiae DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 74: S.pombe DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 75: H.sapiens MSH3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 76: S.cerevisiae MSH3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 77: H.sapiens MSH6 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 78: S.cerevisiae MSH6 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 79: H.sapiens UNG2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 80: S.cerevisiae UNG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 81: H.sapiens hMYH PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 82: H.sapiens XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 83: C.elegans XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 84: S.cerevisiae XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 85: S.pombe XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 86: S.cerevisiae Cac1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 87: H.sapiens hRECQ5 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 88: S.cerevisiae Rrm3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 89: H.sapiens Cdc25C PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 90: H.sapiens p15 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 91: H.sapiens DNA-dependent protein kinase PIP-box amino acid sequence
Claims (8)
- N末側からC末側の方向に、
a)2~4個のPIPボックスを有するペプチド、ここで、該PIPボックスを有するペプチドは、配列表の配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるペプチドもしくは前記アミノ酸配列を含むペプチドであり、
および、
b)耐熱性のPolI型DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメント、
を含む融合ポリペプチドであって、
複数のPIPボックス同士の間にリンカーペプチドが挟まれ、かつ、PIPボックスを有するペプチドと、耐熱性のPolI型DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメントの間に5~50アミノ酸の、セリンとグリシンから成るリンカーペプチドを有する、融合ポリペプチド。 - 耐熱性のPolI型DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメントがTaq DNAポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1又は2に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項1又は2に記載の融合ポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物。
- さらに、PCNAを含有する、請求項4に記載の核酸増幅用組成物。
- 請求項1又は2に記載の融合ポリペプチドを含有するキット。
- さらに、PCNAを含有する、請求項6に記載のキット。
- 請求項1又は2に記載の融合ポリペプチドならびにPCNAを含有する組成物を使用することを特徴とする、鋳型DNAに相補的なDNAの製造方法。
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