KR20210031699A - Rna로부터의 핵산 증폭반응에 적합한 dna 폴리머라아제 돌연변이체 - Google Patents
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Abstract
특정한 A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체로서, 상기 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체, 당해 DNA 폴리머라아제를 포함하는 키트 및 조성물, 당해 DNA 폴리머라아제의 제조방법 및 기존의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 개량 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 RNA로부터의 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 관한 것이다. 추가로, 기존의 DNA 폴리머라아제에 대해서 RNA로부터의 핵산 증폭 활성을 향상시키기 위한 방법, 및 당해 RNA로부터의 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.
DNA 폴리머라아제는 게놈의 복제나 보유라는 세대에서 세대로 유전정보를 정확하게 전달하기 위한 중심적인 역할을 담당하고 있다. DNA 폴리머라아제는 DNA의 합성을 담당하는 효소로서 세포 내에서 기능하고 있으며, 주형 DNA 또는 주형 폴리뉴클레오타이드의 복제에 필요한 오더의 Mg2+와 같은 금속활성화 인자의 존재 하, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산을 중합 부가하고 있다. In vivo에서, DNA 폴리머라아제는 DNA 복제, DNA 수복, 재조합 및 유전자 증폭을 포함하는 일련의 DNA 합성과정에 관여하고 있다. 각각의 DNA 합성과정 사이에, 주형 DNA는 한번 또는 수회 복제되고, 동일한 복제물을 생성한다. 이에 대하여 in vitro에서는 예를 들면 폴리머라아제 연쇄반응 시와 같이 DNA 복제는 몇 번이고 반복할 수 있다.
전사 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR)은 증폭에 의해서 RNA 표적을 검출 또는 정량하기 위해서 많은 용도에 사용되는 기술이다. PCR에 의해 RNA표적을 증폭하기 위해서, 최초에 RNA 주형을 cDNA에 역전사하는 것이 필요하다. 전형적인 RT-PCR법은 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하는 역전사 효소와, 생성된 cDNA를 주형으로서 핵산 증폭을 실시하는 내열성 DNA 폴리머라아제에 의해 수행된다. 이 경우, 사용하는 역전사 효소와 내열성 DNA 폴리머라아제의 각각에 적합한 반응액 조성을 설정할 필요가 있다. 경우에 따라서는, 역전사 반응과 이어지는 핵산 증폭반응 사이에 반응 튜브의 뚜껑을 여는 경우도 있고, 교차 오염의 위험성을 무시할 수 없다. 그 때문에 반응용기를 열지 않고, 역전사 반응과 PCR을 연속 실시하는 one step RT-PCR법이 개발되었다. 이 방법에서는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제가 사용되는 경우가 있다. 그렇지만, 역전사 반응과 PCR을 동일 반응액 조성으로 실시하고 있기 때문에, 역전사 반응과 PCR의 밸런스를 취하는 것이 필수적이었다. 또, 역전사 반응과 PCR을 동일 반응액 조성일 경우의 역전사 효율을 향상시키기 위한 기술이 보고되어 왔다(특허문헌 1∼3 참조).
또 최근에는, 여러 가지의 등온 핵산 증폭반응 방법이 제안되고, 실용화되어 오고 있다. 이 등온 핵산 증폭방법에 있어서도, RNA를 주형으로 한 역전사 반응과 조합시키는 것이 많아지게 되었지만, 상기 RT-PCR법과 동일한 문제가 발생해 오고 있다. 즉, RT-등온 핵산 증폭방법에서도 역전사 반응과 등온 핵산 증폭을 동일 반응액 조성으로 실시하는 것, 역전사 반응과 등온 핵산 증폭의 밸런스를 취하는 것이 요구되고 있었다.
동일 용기 내에서 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제를 제조하는 유전자 공학적 개량방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 놀랍게도, 특정한 아미노산 서열 부위에 돌연변이를 도입하는 것에 의해서, 종래 기술보다 뛰어난 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 제작하는 방법을 찾아내는 것에 성공하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 제1발명은, A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체로서,
여기에서
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
상기의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명의 제1 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 돌연변이 도입 전의 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열의, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 것이 호적하다. 또, 본 발명의 제1발명 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 있어서, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 것이 호적하다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 아르기닌으로의 치환이 바람직하다.
본 발명의 제1 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 동일용기 내에서 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 유래라면 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 테르무스 테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제, 테르무스 아쿠아티쿠스 유래 DNA 폴리머라아제, 바실루스 카르테낙스 유래 DNA 폴리머라아제, 바실루스 스테아로테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제 혹은 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 유래 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체가 호적하다.
본 발명의 제2 발명은 본 발명의 제1 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 당해 키트는 후술하는 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 반응 용액을 조제하는 키트로서 각종 성분을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 제3 발명은 본 발명의 제1 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 당해 조성물은 후술하는 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 조성물로서 각종 성분을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 제4 발명은 RNA로부터의 핵산 증폭에 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 제조방법으로서,
(1) 이하의 A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 DNA 폴리머라아제를 선택하는 공정;
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A7 은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
(2) 공정(1)에서 선택된 DNA 폴리머라아제의, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열에서의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4 발명의 제조방법은 공정(1)이 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열에서, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 DNA 폴리머라아제를 선택하는 공정일 수도 있다. 추가로 공정(2)는 A3 및/또는 A10이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되는 공정일 수도 있다.
본 발명의 제4 발명의 제조방법은 당해 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 작성하고, 적절한 숙주에 도입해서 돌연변이체를 발현시키는 방법을 조합시킬 수도 있다.
본 발명의 제5 발명은 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 개량 방법으로서, 이하의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 있어서, A3 및/또는 A10의 아미노산을 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 특징으로 하는 방법이다:
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기인 것에 관한 것이다.
본 발명의 제5 발명의 개량방법에 있어서, 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제는 예를 들면, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열의, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 DNA 폴리머라아제를 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 제5 발명 개량 방법에 있어서, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열의 A3 및/또는 A10을 예를 들면, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환할 수 있다.
본 발명의 제1 발명 내지 제5 발명에서, A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제는,
A1은 로이신;
A2는 세린 혹은 알라닌;
A3은 글루타민;
A4는 글루탐산 혹은 아스파라긴;
A5는 로이신;
A6은 알라닌 혹은 아스파라긴;
A7은 이소로이신;
A8은 프롤린, 세린 혹은 트레오닌;
A9는 타이로신, 아르기닌 혹은 글루타민;
A10은 글루탐산 혹은 리신;
A11은 글루탐산;
A12는 알라닌; 및
상기의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이체가 바람직하고, 예를 들면, A3 및/또는 A10의 아미노산이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환된 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체일 수도 있다.
본 발명에 의해, 동일용기 내에서 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체 및 그 제조방법이 제공된다. 본 발명에 의하면, 상기 A1∼A12로 나타내는 특정한 아미노산 서열 부위를 가지는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제라면, 본 발명의 돌연변이 도입을 실시할 수 있고, 그 결과적로서 종래보다도 역전사 반응시간을 단축시킬 수 있고, 추가로 이어지는 핵산 증폭반응용의 초기 주형량으로서 충분한 수량을 생성시킬 수 있고, 역전사 효소반응과 핵산 증폭반응을 종래 이상의 검출감도를 단시간에 달성할 수 있다.
1. 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체
본 발명의 제1 형태는, 역전사 효소반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이체는 A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체로서, 여기에서
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고, 그리고 전술한 A3 및/또는 A10의 아미노산이 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이체이다.
상기 구성의 돌연변이체는 1용기에서 실시되는 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체이다.
본 명세서에서 「분지쇄 아미노산 잔기」는 발린 잔기, 이소로이신 잔기 혹은 로이신 잔기가 예시된다. 동일하게 「친수성의 중성 아미노산 잔기」는 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 아스파라긴 잔기 혹은 글루타민 잔기가 예시된다. 「소수성의 지방족 아미노산 잔기」는 글리신 잔기 혹은 알라닌잔기가 예시된다. 「산성 아미노산 잔기」는 아스파라긴산 잔기 혹은 글루타민산 잔기가 예시된다. 「소수성의 방향족 아미노산 잔기」는 페닐알라닌 잔기, 티로신 잔기 혹은 트립토판 잔기가 예시된다. 「염기성 아미노산 잔기」는 리신 잔기, 아르기닌 잔기 혹은 히스티딘 잔기가 예시된다.
본 발명이 구체적인 형태로서는 예를 들면 상기 A1∼A12로 이루어지는 12 아미노산 서열 가운데, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인, 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제가 돌연변이체의 재료로서 사용할 수 있다.
본 발명의 돌연변이체 바람직한 예는, 상기의 A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하고, 동시에 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 있어서, A3 및/또는 A10의 아미노산이, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 돌연변이체이다. 특히 바람직하게는 아르기닌으로 치환된 돌연변이체이다.
더욱 바람직하게는, A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제로서,
A1은 로이신;
A2는 세린 혹은 알라닌;
A3은 글루타민;
A4는 글루탐산 혹은 아스파라긴;
A5는 로이신;
A6은 알라닌 혹은 아스파라긴;
A7은 이소로이신;
A8은 프롤린, 세린 혹은 트레오닌;
A9는 타이로신, 아르기닌 혹은 글루타민;
A10은 글루탐산 혹은 리신;
A11은 글루탐산;
A12는 알라닌; 및
상기의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이체가 예시되고, 예를 들면, A3 및/또는 A10의 아미노산이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택된 아미노산으로 치환된 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체일 수도 있다.
특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 테르무스 테르모필루스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 경우, 당해 폴리머라아제의 서열번호 1에서, 680위치에서 691위치까지의 아미노산 서열이 상기 A1에서 A12에 상당하고, 구체적으로는 「LSQELAIPYEEA」 (서열번호 18)의 아미노산 서열이다. 따라서 테르무스 테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제의 A3(682위치)의 글루타민잔기 및/또는 A10(689위치)의 글루타민산 잔기를, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산, 바람직하게는 아르기닌으로 치환 돌연변이시킨 돌연변이체가 본 발명의 돌연변이체로서 예시된다. 「LSRELAIPYREA」 (서열번호 19)을 가지는 테르무스 테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체를 역전사 효소반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체로서 호적하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 본원 명세서 실시예 1에서 조제한 테르무스 테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체 b13b46은 상기 Q682R 및 E689R을 가지는 돌연변이체이다.
동일한 돌연변이체는 테르무스 아쿠아티쿠스 유래, 바실루스 카르테낙스 유래, 바실루스 스테아로테르모필루스 유래혹은 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제로도 제작할 수 있다.
본 발명이 구체적인 형태로서는, 예를 들면 바실루스 카르테낙스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제는 상기 A1∼A12로 이루어지는 12 아미노산 서열로서 「LAQNLNISRKEA」 (서열번호 20)의 서열을 가지고 있다. 동일하게 바실루스 스테아로테르모필루스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 12 아미노산 서열은 「LAQNLNITRKEA」 (서열번호 21)이다. 또한 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 12 아미노산 서열은 「LAQNLNIPQKEA」 (서열번호 22)이다. 또한, 테르무스 아쿠아티쿠스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 12 아미노산 서열은 「LSQELAIPYEEA」 (서열번호 25의 678위치∼689위치)이다. 이것들의 아미노산 서열 중의 A3 및/또는 A10이 염기성 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것이 본 발명의 돌연변이체로서 예시된다. 특별하게 한정되지 않지만 예를 들면, A3 및/또는 A10의 아미노산이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 돌연변이체다. 특히 바람직하게는 아르기닌으로 치환된 돌연변이체다. 이것들의 돌연변이체 이외에, 호열성 세균 유래의 내열성 폴리머라아제, 등온 핵산 증폭법에 적합한 중온성 DNA 폴리머라아제에 동일한 돌연변이를 도입한 것도 본 발명의 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 포함된다. 즉, 폴 I형, 혹은 패밀리 A형의 DNA 폴리머라아제도 본 발명의 돌연변이 도입의 타깃으로서 호적하게 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 역전사 효소활성과 핵산 증폭 활성을 손상시키지 않는 한은, 추가로 상기 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산 서열 이외의 부위로의 돌연변이의 도입을 조합시킨 것일 수도 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 돌연변이 도입 전의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열, 예를 들면, 테르무스 테르모필루스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제(NCBI Reference Sequence WP_011228405.1) 혹은 테르무스 아쿠아티쿠스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제(Genbank Acc. No. BAA06775.1)의 아미노산 서열에 대해서, 상기 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산 서열 부위 이외의 부분에서는 적어도 80%, 81, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 기능적 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다. 이것들의 DNA 폴리머라아제는 RT-PCR법에서 호적하게 사용할 수 있다. 동일하게 RT-등온 핵산 증폭법의 경우에서는 바실루스 카르테낙스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제(NCBI Reference Sequence WP_047758145.1), 바실루스 스테아로테르모필루스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제(Genbank Acc. No. AAA85558.1) 혹은 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제(Genbank Acc. No. BAF33373.1)에 있어서, 상기 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산 서열 부위 이외의 부분에서는 적어도 80%, 81, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 기능적 DNA 폴리머라아제를 들 수 있다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 추가로 엑소뉴클레아제 활성을 결실한 돌연변이체일 수도 있다. 예를 들면, 테르무스 테르모필루스, 테르무스 아쿠아티쿠스, 바실루스 카르테낙스, 바실루스 스테아로테르모필루스, 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 등에 유래하는 DNA 폴리머라아제에 대해서는 5→3엑소뉴클레아제 활성을 결실한 돌연변이체가 알려져 있다. 상기 엑소뉴클레아제 활성을 결실한 돌연변이체는 DNA 폴리머라아제의 N말단측에 위치하는 5→3엑소뉴클레아제 도메인을 결실하고 있다. 본 발명의 돌연변이체에 대해서도 동일하게 5→3엑소뉴클레아제 도메인을 결실시키고, 5→3엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 돌연변이체로 할 수 있다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 돌연변이 도입 전의 당해 DNA 폴리머라아제가 역전사를 달성할 수 없는 역전사 반응조건하에서도 소망하는 cDNA를 만들 수 있다. 상기 역전사 반응조건으로서는 반응시간의 단축, 반응온도의 고온화 등을 들 수 있다. 혹은, 동일 조건에서 역전사를 실시했을 경우에 돌연변이 도입 전의 DNA 폴리머라아제보다도 역전사 반응 산물의 양이 증가하는 것 등을 들 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만 예를 들면, 테르무스 테르모필루스 유래의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제를 사용한 60℃ 반응으로 30분 정도가 필요하는 역전사 반응을, 당해 DNA 폴리머라아제로부터 작성된 본 발명의 돌연변이체를 사용하는 것에 의해 60℃, 1∼5분이라고 하는 단시간에 완료하는 것이 가능하게 된다. 또, 일본특허 제3844975호에서 개시되어 있는 기술로 조제한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체와 비교해도 역전사 반응에 있어서 뛰어난다. 추가로 본 발명의 돌연변이체는 기존의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 비해 반응 시의 저해물질 내성이나 주형핵산에 대한 친화성이라는 점에서 새로운 개선을 기대할 수 있다. 본 발명에서는 본래의 역전사 효소활성이 낮은 폴 I형, 혹은 패밀리 A형의 DNA 폴리머라아제에 대해서, 그 역전사 효소활성을 현저하게 개선할 수 있기 때문에, 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 제작할 수 있다.
또, 본 발명의 돌연변이체는 PIP 박스(PIP box: PCNA interaction protein box)과의 융합 단백질일 수도 있다. DNA 폴리머라아제 활성을 촉진하는 단백질인 PCNA는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 역전사 효소활성도 촉진할 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 국제공개 WO2017/090685호 팸플릿 기재된 기술과 조합시켜서 PIP 박스가 융합된 본 발명의 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 제작할 수 있다.
2. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 조성물 또는 키트
본 발명의 조성물은 상기의 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 조성물을 의미한다. 본 발명의 조성물의 1형태로서는 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 조성물이고, 상기 1.에서 기술한 본 발명의 역전사 효소반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 첨가하고, 예를 들면 역전사 반응과 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR)에 필요한 성분, 예를 들면, 2가 금속염, dNTPs, 완충 성분, 환원제, 멸균수 등을 함유한다. 또 본 발명의 조성물은 증폭/검출해야 하는 RNA가 분명한 경우에는 적절한 프라이머를 포함하고 있을 수도 있다. 한편, 역전사 반응과 등온 핵산 증폭반응에 적합한 조성물의 경우도 역전사 반응과 등온 핵산 증폭반응에 필요한 성분을 포함하는 한, 상기와 동일한 성분을 포함하는 조성물이 호적하다.
상기 2가 금속염을 구성하는 2가 금속 이온으로서는 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 망간 이온, 마그네슘 이온이 예시된다. 역전사 효소에 적합하는 2가 금속 이온과 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다. 2가 금속 이온은 염화물, 황산염, 또는 아세트산염 등의 염 형태로 공급될 수 있다. 본 발명을 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 본 발명의 조성물 중의 2가 금속 이온의 농도로서는 예를 들면 0.5∼20mM이 바람직하게 예시된다. 상기 dNTP으로서는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 또는 그것들의 유도체의 적어도 1종이 사용된다. 적합하게는dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP의 4종류의 혼합물이 사용된다.
pH 유지를 위한 완충 성분으로서는 특별하게 한정하나 것은 아니지만, 트리스(Tris) 완충액, 트리신 완충액, 비신 완충액, 헤페스(HEPES) 완충액, 초산 완충액 혹은 인산 완충액이 예시된다. 예를 들면, 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 완충 성분과 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다. 역전사 반응용의 환원제로서는 특별하게 한정하나 것은 아니지만, DTT(디티오트레이톨), 2-메르캅토에탄올이 예시된다. 역전사 반응에 적합하는 환원제와 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다.
역전사 반응에는, 예를 들면 random 6mers, oligod Tprimer 및 유전자 특이적 프라이머를 프라이머로서 사용할 수 있다. 당해 프라이머의 쇄 길이는 하이브리다이제이션의 특이성 관점으로부터, 바람직하게는 6 뉴클레오타이드 이상이고, 더 바람직하게는 10 뉴클레오타이드 이상이고, 올리고뉴클레오타이드의 합성 관점으로부터, 바람직하게는 100 뉴클레오타이드 이하이고, 더 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이하이다. 또, 비특이적인 cDNA 합성을 목적으로 한 랜덤 프라이머로서는 쇄 길이 6∼8 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 공지의 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 또, 생물시료 유래의 올리고뉴클레오타이드일 수도 있고, 예를 들면 천연의 시료에서 조제한 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화물로부터 단리해서 제작할 수도 있다. 핵산 증폭반응을 위해서는 증폭해야 하는 핵산의 서열에 따라서 설계된 프라이머 페어를 포함하고 있을 수도 있다. 역전사 반응용의 프라이머가 핵산 증폭용의 프라이머의 한쪽을 겸비하고 있을 수도 있다.
본 발명의 키트는 역전사 반응과 핵산 증폭반응법에 적합한 RT-PCR용 키트 혹은 RT-등온 핵산 증폭용 키트이다. 본 발명의 키트로서는 상기 1.에서 기술한 본 발명의 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체, 2가 금속염, dNTP, 완충 성분, 환원제나 기타의 역전사 반응과 핵산 증폭반응에 적합한 성분을 함유하고, 사용 시에 이들을 혼합해서 역전사 반응/핵산 증폭반응 용액을 조제하기 위한 키트, 상기의 본 발명의 조성물을 함유하고, 사용 시에 주형 DNA와 물(멸균수 등)을 첨가하는 것만으로 사용 가능한 키트, 추가로 상기의 본 발명의 조성물이 건조 상태에서 함유된 키트, 등이 예시된다. 특정한 RNA의 검출을 목적으로 한, 표적 RNA에 특이적인 프라이머나 양성 컨트롤용의 RNA를 함유하는 키트도 본 발명에 포함된다. 또, 상기 2가 금속염, dNTPs, 완충 성분, 및 환원제는 상기에서 설명한 바와 같다.
또, 본 발명의 조성물 혹은 키트는 증폭된 더블-스트랜드 핵산의 검출에 필요한 성분, 예를 들면, Intercalator나 형광 표지 프로브 등을 함유할 수도 있다. Intercalator로서는 SYBR(등록상표) GreenI, TB Green(등록상표)이나 기타의 핵산결합성 색소가, 형광표지 프로브로서는 TaqMan(등록상표) 프로브, Cycleave(등록상표) 프로브 혹은 분자 비콘 프로브 등을 각각 들 수 있다.
3. 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조방법
본 발명의 역전사 효소반응과 핵산 증폭반응에 적합한 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조방법은 상기 1.에 기재된 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법 구체적인 형태로서는 RNA로부터의 핵산 증폭에 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 제조방법으로서,
(1) 이하의 A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함한, DNA 폴리머라아제를 선택하는 공정;
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
(2) 공정(1)에서 선택된 DNA 폴리머라아제의, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열에서의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 공정을 포함하는 방법이 예시된다.
상기 형태에서는 12 아미노산으로 이루어지는 서열이, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 아미노산 서열을 포함하는 DNA 폴리머라아제를 돌연변이도입용이 재료로 해서 선택할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서는 공정(2)에 있어서, 상기 선택된 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 대해서, A3 및/또는 A10이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 아르기닌으로 치환된다.
공정(1)은 상기 A1∼A12로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 DNA 폴리머라아제를 통상의 방법에 의해, 예를 들면 컴퓨터를 사용한 상동성 검색으로 추출하고, 실시할 수 있다. 검색에는 공지의 아미노산 서열 데이터베이스를 사용할 수 있다.
공정(2)에서는 공정(1)에서 선택된 DNA 폴리머라아제를 코딩하는 핵산을 조제하고, 당해 핵산의 A3 및/또는 A10에 상당하는 코돈을 염기성 아미노산 잔기의 코돈으로 변환함으로써 실시된다. 이러한 염기 치환은 공지의 방법으로 실시할 수 있고, 예를 들면 시판하고 있는 돌연변이 도입 키트를 사용할 수 있다. 돌연변이 도입 후의 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 전장을 화학 합성할 수도 있다. 추가로, 상기 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산 서열 이외의 부위로의 돌연변이의 도입을 조합킬 수도 있다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 제조하는 경우, 당해 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 작성하고, 적절한 숙주에 도입해서 돌연변이체를 발현시킬 수 있다. 사용하는 숙주에 있어서 소망하는 돌연변이체를 발현 가능하게 하기 위해서, 또는 발현량을 증가시키기 위해서, 코돈의 최적화를 실시할 수 있다. 해당 코돈 최적화는 본 분야에서 통상 사용되고 있는 방법에 의해 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조에서는 당해 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 적당한 발현벡터에 편입해서 상기 돌연변이체를 제조할 수 있다. 그 때 발현벡터는 본 발명의 돌연변이체 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 및 해당 핵산과 작동 가능으로 연결된 발현조절 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 당해 발현조절 서열은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 프로모터 및 프로모터의 제어에 관계하는 유전자, 리보솜 결합 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사종결 서열(전사 터미네이터), 인핸서 등을 들 수 있다. 추가로 형질 전환체의 선별에 사용되는 마커(약제 내성 유전자, 형광 마커, 발광 마커 등)을 코딩하는 유전자를 포함하고 있을 수 있다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 삽입하는 발현벡터로서는 본 분야에서 통상 사용되고 있는 발현벡터라면, 특별하게 한정은 없다. 숙주세포에 있어서 자립 복제가 가능한 벡터나 숙주 염색체에 편입될 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 숙주에 적합하는 벡터를 사용하면 좋다.
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 삽입하는 발현벡터로서 예를 들면, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터로서는 사용하는 숙주에 적합한 플라스미드, 예를 들면 대장균 유래의 플라스미드, 바실루스속 세균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드가 당업자에게 주지이고, 또, 시판되고 있는 것도 많다. 본 발명에는 이들 공지의 플라스미드나 그 개변체를 사용할 수 있다. 파지 벡터로서는 예를 들면, λ파지(예를 들면, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP) 등을 사용할 수 있고, 바이러스 벡터로서는 예를 들면, 레트로바이러스, 백시니아바이러스 등의 동물 바이러스, 바큐로 바이러스 등의 곤충 바이러스를 사용할 수 있다. 또, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포를 숙주로 하는 이종 단백질 발현계도 수많이 구축되어 있고, 또, 이미 시판도 되고 있다. 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 제조에는 이들 발현계를 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 사용하는 발현벡터에 탑재하는 프로모터는 숙주에 따라서 선택할 수 있고, 예를 들면 대장균에서는 trp 프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터나 그것들의 개변체를 사용할 수 있지만, 상기의 것에 한정되는 것은 아니다. 또, 파지 유래의 프로모터와 RNA 폴리머라아제 유전자를 조합시킨 발현계(예를 들면, pET 발현계 등)를 이용할 수도 있다.
또, 발현시킨 폴리펩타이드의 정제를 쉽게 하기 위해서, 본 발명의 발현벡터는 어피니티 태그를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고 있을 수 있다. 어피니티 태그를 코딩하는 핵산은 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체와 당해 어피니티 태그의 융합 단백질이 발현되도록 벡터에 삽입된다. 본 발명을 조금도 한정하는 것은 아니지만, 어피니티 태그로서는 예를 들면, 히스티딘(His) 태그, 글루타티온 S-트랜스페라아제(GST) 태그, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 태그, 8잔기의 아미노산(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)으로 이루어지는 Strep(II) 태그 등을 코딩하는 핵산이 예시된다. 당해 태그를 부가하는 위치는 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 5' 말단 및/또는 3' 말단측의 어느 것일 수도 있고, 발현 및 태그 기능의 장애가 되지 않는 위치에 적당하게 부가할 수도 있다. 또, 해당 태그는 발현시킨 폴리펩타이드의 정제 단계에서 절단할 수 있는 태그가 바람직하다. 본 발명을 조금도 한정하는 것은 아니지만, 걸리는 절단할 수 있는 태그로서는, 예를 들면, Facror Xa, PreScission Protease, 트롬빈(Thrombin), 엔테로키나아제(enterokinase), TEV 프로테아제(Tobacco Etch Virus Protease) 등의 융합 폴리펩타이드 절단용 프로테아제의 인식 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 태그가 예시된다.
4. 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 개량 방법
본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 개량 방법은 아래와 같이 해서 실시할 수 있다. 즉, A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 있어서, A3 및/또는 A10의 아미노산을 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 개량 방법에서는 우선 이하의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제가 돌연변이 도입 전의 후보로서 선택할 수 있다.
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이다.
당해 후보가 되는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제를 선택하는 방법으로서는 상기 A1∼A12로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 DNA 폴리머라아제를 통상의 방법에 의해, 예를 들면 컴퓨터를 사용한 상동성 검색에 의해 추출하는 방법을 들 수 있다. 검색은 공지의 아미노산 서열 데이터베이스를 사용해서 실시할 수 있다.
본 발명이 구체적인 형태에 있어서는 12 아미노산으로 이루어지는 서열은 A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 아미노산 서열을 가지는 DNA 폴리머라아제가 돌연변이 도입용 재료로서 호적하게 사용할 수 있다. 이 선택된 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 대해서, A3 및/또는 A10의 아미노산을 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것에 의해, DNA 폴리머라아제의 개량이 달성된다. 구체적으로는, DNA 폴리머라아제가 가지는 역전사 활성이 향상하고, 반응시간당의 역전사 산물(cDNA) 생성량이 증가한다.
상기 아미노산 치환에 대해서는 A3 및/또는 A10을 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 아르기닌 잔기로의 치환이다. 본 발명의 개량 방법에 대해서는 역전사 효소활성과 핵산 증폭 활성을 손상되지 않는 한은, 상기 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산 서열 이외의 부위에 추가로 돌연변이를 도입할 수도 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 개량하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 특별하게 한정은 없고, 예를 들면, 테르무스 테르모필루스, 테르무스 아쿠아티쿠스, 바실루스 카르테낙스, 바실루스 스테아로테르모필루스, 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 등에 유래하는 DNA 폴리머라아제 이외에, 호열성 세균 유래의 내열성 폴리머라아제, 등온 핵산 증폭법에 적합한 중온성 DNA 폴리머라아제 및 그 아미노산 치환, 삽입 혹은 결실, 또는 다른 개변체의 모두가 포함된다. 바꿔 말하면, 본래의 역전사 효소활성이 낮은 폴 I형, 혹은 패밀리 A형의 DNA 폴리머라아제일 수도 있다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
(1) Tth DNA폴리머라아제 돌연변이체의 조제 방법
Thermus thermophilus(Tth) HB8주 유래의 야생형 DNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 염기서열은, NCBI Reference Sequence No. WP_011228405.1에 개시되어 있다. 당해 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 1에 나타낸다. 당해 아미노산 서열 중의 특정한 부위(본 발명의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열부분)에 돌연변이를 도입한 서열의 인공 유전자를, 각각 화학적으로 합성했다. 수득된 인공 유전자는, In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit(TAKARA BIO USA사)을 사용하고, 플라스미드 pET6xHN-N(TAKARA BIO USA사)에 도입했다. 수득된 플라스미드는 N말단측에 히스티딘 태그가 부가된 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 염기서열을 가지고 있다.
다음에, 당해 플라스미드로 대장균 BL21 DE3주(TAKARA BIO INC.)를 형질 전환하고, 100㎍/m L농도의 암피실린을 포함하는 1.5% 아가로오스 LB 플레이트 상에서 37℃에서 철야 배양을 실시했다. 이 플레이트로부터 3개의 싱글 콜로니를 선택해서 100㎍/㎖ 농도의 암피실린을 포함하는 LB배지(이하, 'LB-AP배지'라고 한다)에 접종하고, 37℃에서 철야 진탕배양을 실시했다. 추가로 상기 배양액 300㎕을 LB-AP배지 25㎖에 접종하고, 37℃에서 철야 진탕배양했다. OD600값이 0.6이 되었을 때에, 배양액에 최종농도 1mM의 IPTG을 첨가해서 추가로 37℃에서 21시간 유도 배양을 실시하고, 균체를 채취했다.
상기에서 수득된 균체를 2㎖의 50mM Tris·HClp H8.0(4℃), 100mM NaCl, 1mM EDTA(pH8.0), 5% 글리세롤을 포함하는 용액(이하, 'Buffer S' 라고 부른다)에 현탁하고, 최종농도 0.1mg/㎖가 되도록 리소자임(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd사제)을 첨가하고, 4℃에서 1시간 진탕했다. 진탕 후, 4℃ 15,000×g으로 30분간 원심하고, 상청액을 회수했다. 회수한 상청액은 85℃에서 15분 유지한 후, 4℃ 15, 000×g으로 30분간 원심했다. 가열 후의 상청액은 Amicon Ultra-0.5㎖ 칼럼을 사용해서 원심에 의해 약 20배 농축했다.
수득된 농축액을 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 조정제 용액으로 해서, 이하의 시험에 사용했다. 또 사용 효소의 유닛수는 DNA 폴리머라아제 활성에 대해서는 활성화 연어 정자 DNA를 주형/프라이머로서 사용하고, pH9.3의 반응액 중에서 74℃에서, 30분간에 10nmol의 전체 뉴클레오타이드를 산불용성 침전물에 편입하는 활성을 1U로서 산출했다.
(2) Tth DNA폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 방법
상기 (1)에서 수득된 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서, 이하의 방법으로 역전사 반응을 시험했다. 즉, 당해 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 조추출 용액에 대해서, 5×RT-PCR 완충액(최종농도 50mM 비신 완충액(pH8.2), 최종농도 115mM 아세트산 칼륨, 최종농도 8% 글리세롤), 최종농도 2.5mM 초산 망간, 최종농도 0.1% BSA, 서열목록의 서열번호 2 및 3에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 프라이머 페어, 서열목록의 서열번호 4에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 프로브, 최종농도 0.3mM dNTP, 주형이 되는 쇄길이 4.4kb의 RNA(λDNA(GenBank ACC. No. J02459.1)의 핵산번호 12697로부터 17090의 영역에 상당하는 RNA. 1×107 카피 상당), 실험 방법(1)에서 조제한 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 5U 및 2.5U의 Taq 항체(TAKARA BIO INC.)를 포함하는 최종용량 50㎕의 반응액을 조제했다. 대조로서, 야생형 Tth DNA 폴리머라아제를 포함하는 반응액도 조제했다.
RT-PCR 조건은 90℃ 30초, 60℃ 1분, 95℃ 1분간 처리한 후, 95℃ 15초, 56℃ 45초를 1사이클로 하는 45사이클 반응에 설정했다. Thermal cycler는 TP-990 Thermal Cycler Dice(등록상표) Real Time System III(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 리얼타임 PCR을 실시하고, Ct값을 측정했다.
실시예 1: Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 조제
실험방법(1)에 따라서, Tth DNA 폴리머라아제의 야생형 아미노산 서열에서, 682위치의 글루타민을 아르기닌으로 치환된 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자를 보유하는 재조합 플라스미드를 제작하고, 실험 방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 발현된 단백질의 정제를 실시했다. 이렇게 해서 수득된, 682위치의 글루타민으로부터 아르기닌으로의 치환 돌연변이(Q682R)를 가지는 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 b13으로 명명했다. 동일하게 해서, Tth DNA 폴리머라아제의 야생형 아미노산 서열에 689위치의 글루탐산을 아르기닌으로 치환했다(E689R)Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체(b46르호 명명했다), 682위치의 글루타민을 아르기닌에 의해, 689위치의 글루탐산을 아르기닌에 의해 각각 치환한(Q682R+E689R) Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체(b13b46으로 명명했다)?? 조제했다. 상기 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 5∼10에 나타낸다.
실시예 2: Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 시험 1
실시예 1에서 조제한 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 및 야생형Tth DNA 폴리머라아제에 대해서, 실험 방법(2)에 따라서, 역전사 활성평가 시험을 실시했다. 통상 야생형 Tth DNA 폴리머라아제를 사용하는 경우, 역전사 반응은 60℃ 30분이 표준이지만, 본 실시예에서는 60℃ 1분이라는 짧은 역전사 반응시간으로 그 성능을 비교했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. Ct값은 타깃의 초기량에 반비례하기 때문에, DNA의 초기 카피수의 산출에 사용할 수 있다. 예를 들면, Ct값이 1 작으면(마이너스), PCR의 주형이 되는 DNA량이 2배 많게 된다.
표 1에 나타내는 바와 같이, 돌연변이체 b13, b46 및 b13b46의 어느 것에 있어서도, PCR 시의 초기 주형 DNA량이 야생형 효소와 비교해서 100배∼1000배 이상이 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 주형 DNA량의 증가는 PCR 전의 역전사 반응에 의한 cDNA량의 증가가 있었던 것을 의미하고 있고, 당해 돌연변이체가 역전사 반응에서 야생형의 100배∼1000배 이상의 능력향상이 있었던 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: PIP 박스와 Tth 돌연변이체의 융합 단백질
실시예 1에 기재된 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체와 PCNA 결합 도메인의 융합 단백질에 대해서 검토했다. 우선 국제공개 WO2017/090685호 팸플릿 실시예 4에 기재된 방법에 따라서, 각 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 N말단측에 서열목록의 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가지는 PIP 박스가 3개 종렬한 3PIP와 야생형 Tth DNA 폴리머라아제의 융합 단백질(PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Tth DNA 폴리머라아제)을 제작했다. 당해 융합 단백질은 3PIP-야생형으로 명명했다. 동일하게 3PIP와 실시예 1에서 설명한 b13, b46 및 b13b46 돌연변이체와의 융합 단백질도 제작한 이것들은, 3PIP-b13, 3PIP-b46및 3PIP-b13b46으로 명명했다. 또, PIP 박스를 인식하는 폴리머라아제 관련 인자인 Puf PCNA D143R 돌연변이체(PCNA13)는 국제공개 WO2007/004654호 팸플릿 실시예 기재된 방법으로 조제했다.
본 실시예에 있어서, 역전사 반응의 주형이 되는 RNA에 대해서는, 아래와 같이 해서 조제했다. 즉, 후생 노동성 의약식품국 식품안전부 감시 안전과에서 통지된 「노로바이러스(norovirus)의 검출법에 대해서」 (2003년 11월 5일자 식안감 발행 제1105001호 별첨 최종개정: 2013년 10월 22일자 식안감 발행 1022 제1호) (이하 「공정법」이라고 기재한다)에 기재된 것과 동일 염기서열의 GI 검출용 및 GII 검출용 프라이머로 PCR 증폭되는 영역을 포함하는 염기서열의 RNA를 각각 통상의 방법에 의해 조제했다.
상기 방법으로 조제한 주형이 되는 RNA 및 5×RT-PCR 완충액, 최종농도 2.5mM 초산망간, 최종농도 0.1% BSA, 공정법으로 규정된 서열목록의 서열번호 12 및 13에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 GI 프라이머 페어 혹은 서열목록의 서열번호 14 및 15에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 GII 프라이머 페어, 서열목록의 서열번호 16에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 GI 검출용 프로브 혹은 서열목록의 서열번호 17에 기재된 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 GII 검출용 프로브, 최종농도 0.3mM의 dNTP, 최종농도 4%의 폴리(에틸렌글리콜) 4-노닐페닐3-설포프로필에테르, 최종농도 850nM의 PCNA13, 전술한 3PIP-Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 5U를 포함하는 최종용량 25㎕의 반응액을 조제했다. 대조로서, 야생형 및 3PIP가 N말단측에 부가한 야생형 Tth DNA 폴리머라아제를 포함하는 반응액도 조제했다. RT-PCR조건은 58℃ 5분, 95℃ 30초간 처리한 후, 95℃ 5초, 56℃ 1분을 1사이클로 하는 5사이클 반응, 연속해서 90℃ 5초, 56℃ 1분을 1사이클로 하는 40사이클 반응으로 설정했다. Thermal cycler는 실시예 2와 동일하다. GI 검출의 결과를 표 2에 나타낸다. 동일하게 GII 검출의 결과를 표 3에 나타낸다.
표 2 및 표 3에 나타내는 바와 같이, 야생형 및 PIP 박스가 N말단측에 부가한 야생형과 비교해서, PIP 박스가 N말단측에 부가한 본 발명의 b13, b46 및 b13b46의 어느 쪽의 경우에도 초기 주형 DNA량의 증가를 확인할 수 있었다.
실시예 4: Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 시험 2
상기 실시예 2에서 역전사 반응의 능력향상이 인정된 b13및 b13b46 돌연변이체에 대해서, 실검체에서의 노로바이러스(norovirus) 검출에 의해 평가를 실시했다. 즉, 사전동의가 수득된 피험자에서 채취된 노로바이러스(norovirus) 양성의 분변 검체를 약 10% (w/V)가 되도록 PBS에 현탁한 후, 15,000rpm으로 5분간 원심 처리를 실시했다. 이렇게 해서 수득된 상청액 1㎕를 이하의 반응에 사용했다. 즉, 상기 분변 상청액 1㎕, 5×RT-PCR 완충액(최종농도 50mM 트리신 완충액(pH8.15), 최종농도 50mM 아세트산 칼륨, 최종농도 8% 글리세롤, 최종농도 1%의 DMSO, 최종농도 2.5mM 초산망간, 최종농도 0.1% BSA, 공정법으로 규정된 최종농도 0.2㎛의 GI 프라이머 페어, 최종농도 0.2㎛의 GI 검출용 프로브, 최종농도 0.3mM의 dNTP, 전술한 3PIP-Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 5U, 최종농도 4%의 폴리(에틸렌글리콜) 4-노닐페닐3-설포프로필에테르 및 2.5U의 Taq 항체(TAKARA BIO INC.)를 포함하는 최종용량 25㎕의 반응액을 포함하는 조제했다. 대조로서, 야생형 Tth DNA 폴리머라아제를 포함하는 반응액도 조제했다. RT-PCR 조건은 Tth DNA 폴리머라아제의 경우에는, 90℃ 3분, 58℃ 5분 혹은 30분, 95℃ 30초간 처리한 후, 95℃ 5초, 56℃ 30초를 1사이클로 하는 5사이클 반응, 연속해서 90℃ 5초, 56℃ 30초를 1사이클로 하는 40사이클 반응으로 설정했다. Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 경우에는 90℃ 3분, 58℃ 5분, 95℃ 30초간 처리한 후, 95℃ 5초, 56℃ 30초를 1사이클로 하는 5사이클 반응, 연속해서 90℃ 5초, 56℃ 30초를 1사이클로 하는 40사이클 반응으로 설정했다. Thermal cycler는 실시예 2와 동일하다.
상기 검토의 결과, 분변 중의 노로바이러스(norovirus) GI검출에 대해서, Tth DNA 폴리머라아제는 역전사 반응이 58℃ 30분의 경우에만 검출할 수 있었다. 한편, 본 발명의 b13및 b13b46 돌연변이체는 역전사 반응이 58℃ 5분이라고 하는 단시간이더라도 검출할 수 있었다. 이것으로부터, 본 발명의 돌연변이체가 실검체를 사용한 검출에서도 역전사 효소반응의 향상이 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 시험 3
본 발명의 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체와, 이전에 고온, 또한 효율적으로 역전사 반응이 가능하다고 보고된 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체와의 비교를 실시했다. 일본특허 제3844975호의 기재에 따라서, 실험 방법(1)의 방법으로 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 조효소액을 조제했다. 즉, Taq DNA 폴리머라아제(Genbank Acc. No. BAA06775.1) 기재의 아미노산 서열 681위치가 NCBI Reference Sequence No.WP_011228405에 기재된 아미노산 서열에 의거하는 Tth DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열에서는 683위치에 상당하기 때문에 상기 아미노산 서열의 683위치의 글루탐산을 페닐알라닌, 리신, 로이신, 아르기닌 혹은 타이로신으로 치환 돌연변이한 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 조제했다. 이것들의 아미노산 돌연변이체를 각각 E683F, E683K, E683L, E683R, E683Y 돌연변이체로 명명했다.
평가 방법은 역전사 반응시간을 60℃ 1분에서 2분으로 변경한 이외는, 상기 실험 방법(2)에 기재된 방법으로 실시했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
표 4에 나타내는 바와 같이, 683 위치의 글루탐산을 치환한 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체는 주형 유래의 증폭물을 생산할 수 없거나, 혹은 본 발명의 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체와 비교해서 Ct값이 커지고 있다. 바꿔 말하면, PCR 개시 시의 초기 주형 DNA량이 감소하고 있는 것, 즉 PCR전의 역전사 반응에 의한 cDNA량이 약 1/2 이하인 것을 의미하고 있고, 당해 돌연변이체가 역전사 반응에서 종래 기술로 조제한 것보다 역전사 반응 활성에 있어서 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
실험방법
(3) Bca DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 조제 방법
Bacillus caldotenax(Bca) 유래의 야생형 DNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 염기서열은, NCBI Reference Sequence No. NZ_CP025074.1에 개시되어 있다. 당해 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 23에 나타낸다. 당해 아미노산 서열 중의 특정한 부위(본 발명의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열부분)에 돌연변이를 도입한 서열의 인공 유전자를, 각각 화학적으로 합성하고, 실험 방법(1)에 기재된 방법으로 N말단측에 히스티딘 태그가 부가된 Bca DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 조제했다.
다음에, 당해 플라스미드로 대장균 BL21 DE3주(TAKARA BIO INC.)를 형질 전환하고, 100㎍/㎖ 농도의 암피실린을 포함하는 1.5% 아가로오스 LB 플레이트 상, 37℃에서 철야배양을 실시했다. 이 플레이트로부터 3개의 싱글 콜로니를 선택해서 100㎍/㎖ 농도의 암피실린을 포함하는 LB배지(이하, 'LB-AP배지'라고 부른다)에 접종하고, 37℃에서 철야 진탕 배양을 실시했다. 추가로 상기 배양액 30㎖을 LB-AP배지 3L에 접종하고, 37℃에서 철야 진탕 배양했다. OD600값이 0.6이 되었을 때에, 배양액에 최종농도 1mM의 IPTG을 첨가해서 투다오 37℃에서 4시간 유도 배양을 실시하고, 균체를 채취했다.
상기에서 수득된 균체 3g를 12㎖의 버퍼 (50mM Tris·HCl pH7.0(4℃), 4㎛ PMSF, 1mM DTT, 10% 글리세롤)에 현탁하고, Sonic 180W로 10분간 교반했다. 그 후에 10,000rpm으로 30분간 4℃에서 원심분리했다. 해당 상청액을 회수하고, 60℃에서 30분간 열처리했다. 열처리 후의 상청액을 빙상에서 30분 냉각 후에 11,000rpm, 30분(4℃)으로 원심분리를 실시해 상청액을 회수했다.
수득된 상청액은 DEAE Sepharose Fast Flow (GE Healthcare사), CM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare사), Sephadex-G100, Heparin Sepharose(GE Healthcare사), Q Sepharose(GE Healthcare사)의 순서로 사용해서 Bca DNA 폴리머라아제 돌연변이체 단백의 정제액을 조제하고, 이하의 시험에 사용했다. 또 사용 효소의 유닛수는 DNA 폴리머라아제 활성에 대해서는 활성화 연어 정자 DNA를 주형/프라이머로서 사용하고, pH9.3의 반응액 중에서 74℃에서, 30분간에 10nmol의 전체 뉴클레오타이드를 산불용성 침전물에 편입하는 활성을 1U로서 산출했다.
실험방법
(4) Aac DNA폴리머라아제 돌연변이체의 조제 방법
Alicyclobacillus acidocaldarius(Aac) 유래의 야생형 DNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 염기서열은, NCBI Reference Sequence No. AB275481.1에 개시되어 있다. 당해 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 24에 나타낸다. 당해 아미노산 서열 중의 특정한 부위(본 발명의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열부분)에 돌연변이를 도입한 서열의 인공 유전자를, 각각 화학적으로 합성하고, 실험 방법(1)에 기재된 방법으로 N말단측에 히스티딘 태그가 부가된 Aac DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 조제했다.
다음에, 당해 플라스미드로 형질 전환된 대장균 BL21 DE3주의 배양은 실험 방법(3)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시해 균체를 채취했다.
상기에서 수득된 균체 3g를, 실험 방법(3)에 기재된 동일한 정제법으로 Aac DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 정제액을 조제하고, 이하의 시험에 사용했다. 또 사용 효소의 유닛수는 Bca DNA 폴리머라아제의 경우와 동일하다.
실험방법
(5) Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 조제 방법
Thermus aquaticus(Taq) 유래의 야생형 DNA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자의 염기서열은, NCBI Reference Sequence No. D32013.1에 개시되어 있다. 당해 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 25에 나타낸다. 당해 아미노산 서열 중의 특정한 부위(본 발명의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열부분)에 돌연변이를 도입한 서열의 인공 유전자를, 각각 화학적으로 합성하고, 실험 방법(1)에 기재된 방법으로 N말단측에 히스티딘 태그가 부가된 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 조제했다.
다음에, 당해 플라스미드로 형질 전환된 대장균 BL21 DE3주의 배양은 실험 방법(3)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시하고, 균체를 채취했다.
상기에서 수득된 균체 13g를 39㎖의 버퍼(100mM Tris·HCl pH7.5(4℃), 200mM, EDTA pH7.5, 2.4㎛ PMSF)에 현탁하고, Sonic 180W로 10분간 교반 후, 12000rpm(4℃), 30분 원심분리하고, 상청액을 회수 후, 황산 암모늄을 1.34g과 10% PEI를 0.64㎖ 첨가하고, 30분(4℃) 교반하고, 30분간 원심분리(4℃) 후, 상청액을 회수했다. 추가로 해당 상청액을 75℃에서 15분간 열처리하고, 빙상에서 30분간 냉각 후, 35,000rpm(4℃)으로 60분간 원심분리하고, 상청액을 회수했다. 수득된 상청액을 Phenyl Sepharose Cl-4B(GE Healthcare사)을 사용해서 정제했다.
또 사용 효소의 유닛수는 Bca DNA 폴리머라아제의 경우와 동일하다.
실험방법
(6) Bca, Aac, Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 방법
상기 (3), (4), (5)에서 수득된 Bca, Aac, Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서 폴리머라아제(Pol) 활성을 측정했다. 상기 Pol 활성은 반응액으로서 최종농도 25mM TAPS 완충액(pH9.3, 25℃), 최종농도 50mM KCl, 최종농도 2mM MgCl2, 최종농도 0.1mM DTT, 최종농도 각 200㎛ dATP·dGTP·dCTP, 최종농도 100㎛ [3H]-dTTP, 최종농도 0.25mg/㎖ 활성화 연어 정자 DNA를 조제해서 실시했다. 즉, 활성화 연어 정자 DNA를 주형/프라이머로서 사용하고, 상기의 활성 측정용 반응액 중에서 74℃에서, 30분간에 10nmol의 전체 뉴클레오타이드를 산불용성 침전물에 편입하는 활성을 1U로서 측정했다.
다음에 상기 (3), (4), (5)에서 수득된 Bca, Aac, Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서 역전사 활성을 측정했다. 역전사 활성은 반응액으로서 50mM Tris-HCl, pH8.3(37℃), 5mM Tris-HCl pH7.5(37℃), 85m MKCl, 8mM MgCl2, 10mM DTT, 0.1% NP-40, 0.02mg/㎖ Poly(A), 2.5mM dTTP, 100μCi/㎖의 [3H]-dTTP를 조제해서 실시했다. 즉, 상기의 활성 측정용 반응액 중에서, Poly(rA)·oligo(dT) 12-18을 주형/프라이머로 해서, 37℃, 10분간에 1nmol의 [3H]dTTP을 편입하는 효소활성을 1U로서 측정했다.
실험방법
(7) Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 역전사 활성평가 방법
상기 (3), (4), (5)에서 수득된 Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서, 이하의 방법으로 역전사 반응을 시험했다.
당해 시험에서는, Bca BEST(등록상표) RNA PCR Kit(TAKARA BIO INC.)의 구성품의 일부를 이용했다. 즉, 각각의 DNA 폴리머라아제 돌연변이체 정제 용액에 대해서, 해당 키트 부속의 2×Bca 1st Buffer, 25mM MgSO4, RNase Inhibitor(40U/㎕), 10mM dNTP, 서열목록의 서열번호 26의 염기서열을 가지는 최종농도 0.5㎛의 역전사 프라이머, 최종농도 500㎛의 dNTP, 주형이 되는 최종농도 10ng/㎕의 HL60 total RNA(TAKARA BIO INC.)에, 실험 방법 (3), (4), (5)에서 조제한 Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체 정제 용액 0.5㎕ 반응액을 첨가한, 역전사 반응액 10㎕을 각각 조제했다. 대조로서, 야생형의 Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제를 포함하는 반응액도 각각 조제했다.
역전사 조건은 65℃ 60초, 55℃ 5분, 95℃ 2분간 처리했다. Thermal cycler는 TP-990 Thermal Cycler Dice(등록상표) Real Time System III(TAKARA BIO INC.)를 사용했다.
또, 수득된 cDNA 용액을 리얼타임 PCR로 시험했다. RR420A TB Green(등록상표) Premix Ex Taq(상표)(Tli RNase HPlus)(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 리얼타임 PCR을 실시했다. 서열목록의 서열번호 26의 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 포워드 프라이머, 서열목록의 서열번호 27의 염기서열을 가지는 최종농도 0.2㎛의 리버스 프라이머, 상기 역전사 반응에서 수득된 각각의 cDNA 1㎕를 첨가하고, 1반응당 25㎕계의 PCR 반응액으로 해서 리얼타임 PCR반응을 실시했다.
PCR 조건은 90℃ 30초로 초기 변성 후, 95℃ 5초, 60℃ 30초를 1사이클로 하는 40사이클 반응으로 설정했다. Thermal cycler는 TP-990 Thermal Cycler Dice(등록상표) Real Time System III(TAKARA BIO INC.)를 사용하고, 리얼타임 PCR을 실시하고, Ct값을 측정했다.
실시예 6: Bca, Aac 및 Taq 돌연변이체의 역전사 활성 평가 시험 1
평가시험 1은 상기 (3), (4), (5)에서 수득된 Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서, 상기 실험방법 (6)에 기재된 방법으로 실시했다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 또, 각 DNA 폴리머라아제 돌연변이체 b13b46은 Tth DNA 폴리머라아제 돌연변이체 b13b46에서의 「Q682R+E689R」 돌연변이에 대응하는 돌연변이를 가지는 것이다(즉, Tth DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열에서의 682 위치 및 689 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 각각 아르기닌으로 치환한 것).
표 5에서 나타내는 바와 같이, Bca 천연형에 비교해서 제작한 Bca(b13b46) 돌연변이체는 폴리머라아제 활성을 유지하면서, 역전사 활성을 높이고 있어, 천연형과 비교해서 약 2배 역전사 활성이 향상했다. Aac의 경우에는 천연형에 대하여 Aac(b13b46) 돌연변이체는 폴리머라아제 활성을 유지하면서 천연형과 비교해서 약 4배 역전사 활성이 향상했다. Taq의 경우에는 천연형에 대하여 Taq(b13b46) 돌연변이체는 폴리머라아제 활성을 유지하면서 천연형과 비교해서 약 9배 역전사 활성이 향상했다.
실시예 7: Bca, Aac 및 Taq 돌연변이체의 역전사 활성 평가 시험 2
상기 (3), (4), (5)에서 수득된 Bca, Aac 및 Taq DNA 폴리머라아제 돌연변이체에 대해서, cDNA의 합성량을 확인하고 역전사 활성을 평가했다.
평가시험 2는 상기 실험 방법(7)에 기재된 방법으로 실시했다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6에서 나타내는 바와 같이 어느 것의 돌연변이체에 있어서도, PCR 시의 초기 주형 DNA량이 야생형 효소와 비교해서 510배∼1000배 이상이 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 주형 DNA량의 증가는 PCR 전의 역전사 반응에 의한 cDNA량의 증가가 있었던 것을 의미하고 있고, 당해 돌연변이체가 역전사 반응에 있어서 야생형의 510배∼1000배 이상의 능력향상이 있었던 것을 확인할 수 있었다. 또, 본 발명은 폴 I형, 혹은 패밀리 A형으로 분류되는 DNA 폴리머라아제에 대해서, 그 역전사 효소활성을 개선할 수 있음을 확인했다.
(산업상 이용가능성)
본 발명에 의해 동일용기 내에서 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 실시하는데 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제를 제공할 수 있었다. 당해 DNA 폴리머라아제를 사용하는 것에 의해, 지금까지 역전사 반응이 곤란했던 강고한 2차 구조를 가지는 RNA를 주형으로 했을 경우라 하여도 역전사 효율이 좋은 반응이 가능하게 되었다. 또 당해 역전사 반응의 효율향상에 의해 동일용기 내에서 역전사 반응과 핵산 증폭반응을 연속해서 실시하는 경우, 종래 기술의 효소보다도 단시간에 동일 레벨 이상의 검출이 가능하게 되었다. 이렇게 본 발명의 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제는 유전자 공학, 생물학, 의학, 농업 등 폭넓은 분야에 있어서 유용하다.
SEQ ID NO: 1:
DNA polymerase I Thermus thermophilus
SEQ ID NO: 2:
PCR forward Primer lambda RNA
SEQ ID NO: 3:
PCR Reverse Primer lambda RNA
SEQ ID NO: 4:
Probe lambda RNA. 5’-end is labeled FAM and 3’-end is labeled BHQ1
SEQ ID NO: 5:
DNA polymerase variant Tth b13
SEQ ID NO: 6:
DNA polymerase variant Tth b13
SEQ ID NO: 7:
DNA polymerase variant Tth b46
SEQ ID NO: 8:
DNA polymerase variant Tth b46
SEQ ID NO: 9:
DNA polymerase variant Tth b13 b46
SEQ ID NO: 10:
DNA polymerase variant Tth b13 b46
SEQ ID NO: 11:
PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15 Tth
SEQ ID NO: 12:
PCR forward Primer COG1F
SEQ ID NO: 13:
PCR Reverse Primer COG1R
SEQ ID NO: 14:
PCR forward Primer COG2F
SEQ ID NO: 15:
PCR Reverse Primer COG2R
SEQ ID NO: 16:
Probe RING1-TP(a). 5’-end is labeled Cy5 and 3’-end is labeled BHQ3
SEQ ID NO: 17:
Probe RING2AL-TP. 5’-end is labeled ROX and 3’-end is labeled BHQ2
SEQ ID NO: 18:
A partial sequence (A1-A12) of Tth DNA polymerase
SEQ ID NO: 19:
A partial sequence (A1-A12) of Tth DNA polymerase variant
SEQ ID NO: 20:
A partial sequence (A1-A12) of Bca polymerase
SEQ ID NO: 21:
A partial sequence (A1-A12) of Bst polymerase
SEQ ID NO: 22:
A partial sequence (A1-A12) of Aac polymerase
SEQ ID NO: 23:
DNA polymerase I Bacillus caldotenax
SEQ ID NO: 24:
DNA polymerase I Alicyclobacillus acidocaldarius
SEQ ID NO: 25:
DNA polymerase I Thermus aquaticus
SEQ ID NO: 26:
PCR forward Primer hACTB-F
SEQ ID NO: 27:
PCR Reverse Primer hACTB-533
SEQUENCE LISTING
<110> TAKARA BIO INC.
<120> DNA polymerase variant suitable for nucleic acid amplification
reaction from RNA
<130> 674977
<150> JP 2018-133086
<151> 2018-07-13
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 834
<212> PRT
<213> Thermus thermophilus
<400> 1
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR forward Primer lambda RNA
<400> 2
caggtggcgt attccagatt gtc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Reverse Primer lambda RNA
<400> 3
gcaccatact ggcaccgaga 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe lambda RNA. 5'-end is labeled FAM and 3'-end is labeled
BHQ1
<400> 4
accaccggcc ccaatggc 18
<210> 5
<211> 834
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA polymerase variant Tth b13
<400> 5
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Arg Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 6
<211> 2505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA polymerase variant Tth b13
<400> 6
atggaagcta tgctgccgct gttcgaaccg aaaggtcgtg ttctgctggt tgacggtcac 60
cacctggctt accgtacctt cttcgctctg aaaggtctga ccacctctcg tggtgaaccg 120
gttcaggctg tttacggttt cgctaaatct ctgctgaaag ctctgaaaga agatggttac 180
aaagctgttt tcgttgtatt cgacgcgaaa gctccgtctt tccgtcacga agcttacgaa 240
gcttacaaag ctggtcgtgc tccgaccccg gaagacttcc cgcgtcagct ggctctgatc 300
aaagaactgg ttgacctgct gggtttcacc cgtctggaag ttccgggtta cgaagctgac 360
gacgttctgg ctaccctggc taaaaaagct gaaaaagaag gttacgaagt tcgtatcctg 420
accgctgacc gtgacctgta ccagctggtt tctgaccgtg ttgctgttct gcacccggaa 480
ggtcacctga tcaccccgga atggctgtgg gaaaaatacg gtctgcgtcc ggaacagtgg 540
gttgacttcc gtgctctggt tggtgacccg tctgacaacc tgccgggtgt taaaggtatc 600
ggtgaaaaaa ccgctctgaa actgctgaaa gaatggggtt ctctggaaaa cctgctgaaa 660
aacctggacc gtgttaaacc ggaaaacgtt cgtgaaaaaa tcaaagctca cctggaagac 720
ctgcgtctgt ctctggaact gtctcgtgtt cgtaccgacc tgccgctgga agttgacctg 780
gctcagggtc gtgaaccgga ccgtgaaggt ctgcgtgctt tcctggaacg tctggaattc 840
ggttctctgc tgcacgaatt cggtctgctg gaagctccgg ctccgctgga agaagctccg 900
tggccgcccc cggagggtgc gttcgtcggc ttcgttctgt ctcgtccgga accgatgtgg 960
gctgaactga aagctctggc tgcttgccgt gacggtcgtg ttcaccgtgc tgctgacccg 1020
ctggctggtc tgaaagacct gaaagaagtt cgtggtctgc tggctaaaga cctggctgtt 1080
ctggcttctc gtgaaggtct ggacctggtt ccgggtgacg acccgatgct gctggcttac 1140
ctgctggacc cgtctaacac caccccggaa ggtgttgctc gtcgttacgg tggtgaatgg 1200
accgaagacg ctgctcaccg tgctctgctg tctgaacgtc tgcaccgtaa cctgctgaaa 1260
cgtctggaag gtgaagaaaa actgctgtgg ctgtaccacg aagttgaaaa accgctgtct 1320
cgtgttctgg ctcacatgga agctaccggt gttcgtctgg acgttgctta cctgcaggct 1380
ctgtctctgg aactggctga agaaatccgt cgtctggaag aagaagtttt ccgtctggct 1440
ggtcacccgt tcaacctgaa ctctcgtgac cagctggaac gtgttctgtt cgacgaactg 1500
cgtctgccgg ctctgggtaa aacccagaaa accggtaaac gttctacctc tgctgctgtt 1560
ctggaagctc tgcgtgaagc tcacccgatc gttgaaaaaa tcctgcagca ccgtgaactg 1620
accaaactga aaaacaccta cgttgacccg ctgccgtctc tggttcaccc gcgtaccggt 1680
cgtctgcaca cccgtttcaa ccagaccgct accgctaccg gtcgtctgtc ttcttctgac 1740
ccgaacctgc agaacatccc ggttcgtacc ccgctgggtc agcgtatccg tcgtgctttc 1800
gttgctgaag ctggttgggc tctggttgct ctggactact ctcagatcga actgcgtgtt 1860
ctggctcacc tgtctggtga cgaaaacctg atccgtgttt tccaggaagg taaagacatc 1920
cacacccaga ccgcttcttg gatgttcggt gttccgccgg aagctgttga cccgctgatg 1980
cgtcgtgctg ctaaaaccgt taacttcggt gttctgtacg gtatgtctgc tcaccgtctg 2040
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530 535 540
Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro
545 550 555 560
Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu
565 570 575
Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg Ser
580 585 590
Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val
595 600 605
Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr Tyr
610 615 620
Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His
625 630 635 640
Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser
645 650 655
Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg
660 665 670
Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala Leu
675 680 685
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
690 695 700
Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Gln
705 710 715 720
Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu
725 730 735
Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met
740 745 750
Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala
755 760 765
Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala
770 775 780
Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Val Glu
785 790 795 800
Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val
805 810 815
Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val
820 825 830
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe
835 840 845
Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp
850 855 860
Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala Ala
865 870 875 880
Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu
885 890 895
Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly
900 905 910
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR forward Primer COG1F
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
cgytggatgc gnttycatga 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Reverse Primer COG1R
<400> 13
cttagacgcc atcatcatty ac 22
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR forward Primer COG2F
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Reverse Primer COG2R
<400> 15
tcgacgccat cttcattcac a 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe RING1-TP(a). 5'-end is labeled Cy5 and 3'-end is labeled
BHQ3
<400> 16
agatygcgat cycctgtcca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe RING2AL-TP. 5'end is labeled ROX and 3'-end is labeled
BHQ2
<400> 17
tgggagggsg atcgcratct 20
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial sequence (A1-A12) of Tth DNA polymerase
<400> 18
Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial sequence (A1-A12) of Tth DNA polymerase variant
<400> 19
Leu Ser Arg Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Arg Glu Ala
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial sequence (A1-A12) of Bca polymerase
<400> 20
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial sequence (A1-A12) of Bst polymerase
<400> 21
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial sequence (A1-A12) of Aac polymerase
<400> 22
Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Pro Gln Lys Glu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA polymerase I Bacillus caldotenax
<400> 23
Met Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala
1 5 10 15
Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala
20 25 30
Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile
35 40 45
Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro
50 55 60
Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu
65 70 75 80
Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu
85 90 95
Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu
100 105 110
Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val
130 135 140
Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala
145 150 155 160
Glu His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro
165 170 175
Phe Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu
180 185 190
Leu Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly
195 200 205
Val Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala
210 215 220
Glu Gln Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln
225 230 235 240
Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu
245 250 255
Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr
260 265 270
Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu
275 280 285
Asn Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile
290 295 300
Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys Lys Val His Thr
305 310 315 320
Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu
325 330 335
Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile
340 345 350
Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala
355 360 365
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp
370 375 380
Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys
385 390 395 400
Thr Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn
405 410 415
Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile
420 425 430
Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala
435 440 445
Ala Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg
450 455 460
Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr
465 470 475 480
Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn
485 490 495
Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile
500 505 510
Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn
515 520 525
Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val
530 535 540
His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu
545 550 555 560
Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val
565 570 575
Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys
580 585 590
<210> 24
<211> 609
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA polymerase I Alicyclobacillus acidocaldarius
<400> 24
Met Glu Leu Asp Phe Arg Ser Leu Val Asp Lys Ile Ser Glu Glu Met
1 5 10 15
Ser His Asp Ser Thr Pro Thr Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ser Ser Glu Trp Ser Ser Phe Ala Tyr Gly Leu Ile Glu Asp Ala Gly
35 40 45
Ala Trp Gln Glu Ala Ile Ser Ser Phe Ser Glu Pro Val Gly Val Met
50 55 60
Met Asp Leu Ala Asp Pro Asp Tyr His Arg Ala Glu Ile Arg Gly Met
65 70 75 80
Ala Val Ala Thr Pro Lys Arg Ala Tyr Tyr Val Arg Phe Gly Glu Arg
85 90 95
Leu Glu Leu Ser Asp Val Arg Pro Trp Leu Val Ser Asp Arg Pro Lys
100 105 110
Val Ala Phe Asp Leu Lys Ser Met Ala Phe Ala Leu Asp Ala His Gly
115 120 125
Ile Gly Leu Thr Ser Glu Cys Gly Trp Gln Asp Val Lys Leu Ala Ala
130 135 140
Tyr Leu Leu Asn Pro Gln Asp Gly Glu Val Glu Leu Ser Asp Val Phe
145 150 155 160
Ala Arg Glu Arg Gly Gln Glu Leu Pro Ala Trp Glu Glu Gly Glu Arg
165 170 175
Glu Lys Trp Leu Ala Tyr Thr Ala Ser Gln Leu Pro Pro Leu Phe Glu
180 185 190
Ser Leu Ala Tyr Thr Ile Arg Met Gln Glu Met Glu Arg Leu Tyr Gln
195 200 205
Glu Val Glu Leu Pro Leu Ala Phe Val Leu Ala Lys Met Glu Ile Thr
210 215 220
Gly Phe Tyr Val Asn Arg Glu Lys Leu Val Ala Phe Gly Gln Glu Leu
225 230 235 240
Thr Glu Arg Ile Lys Arg Ile Thr Gln Glu Ile Tyr Asp Leu Ala Gly
245 250 255
Thr Ser Phe Asn Leu Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Glu Ile Leu Phe
260 265 270
Asp Lys Leu Gly Leu Pro Ala Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser
275 280 285
Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Met His Glu Ile Val
290 295 300
Gln Lys Ile Leu Asp Tyr Arg Leu Leu Ala Lys Leu Gln Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Val Glu Gly Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Glu Thr Gly Arg Val His
325 330 335
Thr Arg Phe His Gln Thr Leu Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser
340 345 350
Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Arg
355 360 365
Leu Arg Gln Val Phe Glu Pro Thr Tyr Lys Asp Trp Val Ile Phe Ala
370 375 380
Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly
385 390 395 400
Asp Glu Ala Leu Ile Asp Ala Phe Arg Arg Asp Met Asp Ile His Thr
405 410 415
Arg Thr Ala Ala Asp Val Phe Glu Val Pro Pro Glu Gln Val Thr Ser
420 425 430
Leu Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly
435 440 445
Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Pro Gln Lys Glu
450 455 460
Ala Lys Arg Phe Ile Glu Ser Tyr Phe Glu Lys Phe Pro Gly Val Lys
465 470 475 480
Arg Tyr Met Asp Glu Ile Val Lys Gln Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Val
485 490 495
Thr Thr Leu Met Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile His Ser Arg
500 505 510
Asn Tyr Gln Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro
515 520 525
Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Leu Ile Lys Leu Ala Met Val Arg Ile
530 535 540
Asp Arg Ala Met Arg Asp Ala Gln Met Asp Ala Arg Met Leu Leu Gln
545 550 555 560
Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Cys Pro Lys Asp Glu Leu Ala Ala
565 570 575
Leu Glu Val Leu Val Arg Asp Asn Met Glu Asn Ala Met Thr Leu Ser
580 585 590
Val Pro Leu Lys Val Asp Thr Ala Tyr Gly Pro Thr Trp Tyr Asp Ala
595 600 605
Lys
<210> 25
<211> 832
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA polymerase I Thermus aquaticus
<400> 25
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Ala Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR forward Primer hACTB-F
<400> 26
tggcacccag cacaatgaa 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Reverse Primer hACTB-533
<400> 27
atcacctccc ctgtgtggac 20
Claims (10)
- A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체로서,
여기에서,
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
상기의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체. - 제1 항에 있어서,
돌연변이 도입 전의 12 아미노산으로 이루어지는 서열의, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체. - 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
12 아미노산으로 이루어지는 서열의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체. - 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
테르무스 테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제, 테르무스 아쿠아티쿠스 유래 DNA 폴리머라아제, 바실루스 카르테낙스 유래 DNA 폴리머라아제, 바실루스 스테아로테르모필루스 유래 DNA 폴리머라아제 혹은 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 유래 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체인 돌연변이체. - 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 키트.
- 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제 돌연변이체를 포함하는 조성물.
- RNA로부터의 핵산 증폭에 적합한 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 제조방법으로서,
(1) A1∼A12의 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 DNA 폴리머라아제를 선택하는 공정;
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
(2) 공정(1)에서 선택된 DNA 폴리머라아제의, 상기 12 아미노산으로 이루어지는 서열에서의 A3 및/또는 A10의 아미노산이 돌연변이 도입 전의 것과는 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 공정을 포함하는 방법. - 제7 항에 있어서,
공정(1)에 있어서, 12 아미노산으로 이루어지는 서열에서, A1이 로이신, A3이 글루타민, A5가 로이신, A7이 이소로이신, A11이 글루탐산 및 A12가 알라닌인 DNA 폴리머라아제를 선택하는 제조방법. - 제7 항 또는 제8 항에 있어서,
공정(2)에 있어서, A3 및/또는 A10이 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제의 개량 방법으로서,
이하의 A1∼A12에 나타내는 12 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 역전사 효소활성을 가지는 DNA 폴리머라아제에 있어서, A3 및/또는 A10의 아미노산을 다른 염기성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 특징으로 하는 방법:
A1은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A2는 친수성의 중성 아미노산 잔기 혹은 소수성의 지방족 아미노산 잔기이고;
A3은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A4는 산성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A5는 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A6은 소수성의 지방족 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이며,
A7은 분지쇄 아미노산 잔기이고;
A8은 프롤린 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A9는 소수성의 방향족 아미노산 잔기, 염기성 아미노산 잔기 혹은 친수성의 중성 아미노산 잔기이고;
A10은 산성 아미노산 잔기 혹은 염기성 아미노산 잔기이고;
A11은 산성 아미노산 잔기이고;
A12는 소수성의 지방족 아미노산 잔기이다.
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