JP6699560B2 - Ｐｃｎａ単量体 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ複製因子に関する。より詳しくは、ＤＮＡ複製を補助する機能に優れたＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖細胞核抗原；以下、「ＰＣＮＡ」と記載する。）に関する。

ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に、複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃ（以下、「ＲＦＣ」とも記載する。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。

ここで挙げたＰＣＮＡは生体内における重要な複製因子であり、ＤＮＡ合成系においてもＰＣＮＡの添加は、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長活性（プライマー伸長活性）及び増幅増強活性を促進することが知られている。ＤＮＡ合成系で用いられるＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（以下、「Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ」とも表記する）、及び、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ−１株由来のもの（以下、「ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１」とも記載する。）が知られている。

真核細胞及び古細菌において、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。特許文献１によれば、ＰＣＮＡの多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し形成される。野生型Ｐｆｕ−ＰＣＮＡでは、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目及び第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。

また特許文献１においては、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの変異体についても検討されている。野生型のＰｆｕ−ＰＣＮＡにおいては、多量体形成に寄与する界面領域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に電荷的に引き合うようなアミノ酸残基で構成されている。これに対し、変異体では分子間相互作用を形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構成されており、単量体のまま又は多量体を形成して、野生型より優れた増幅増強活性を備えているとされている。これは変異を加えることで多量体形成能が弱まり、ＲＦＣなどのクランプローダーがなくても核酸にロードしやすくなったためと考えられる。

しかしながら、これらのＰＣＮＡを用いても、ＰＣＲで効率よく増幅しないことが散見される。特に特異性が重要なＰＣＲにおいては、ＰＣＮＡが非特異的な増幅を促進し、目的産物が得られないことがあった。また、ＧＣリッチな配列を増幅する系では、これらのＰＣＮＡがうまく作用しないことが知られていた。

国際公開第２００７／００４６５４号パンフレット

Ｃａｒｏｌ Ｊ．Ｂｕｌｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７３巻、１９９６年、第１０５８−１０７３頁

本発明者らは、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１についても変異体を評価し、界面領域への変異が増幅増強活性に大きく関わることを示した。特許文献１のＰＣＮＡ変異体を用いればＤＮＡ合成における増幅量の改善につながることが示されているが、本発明が解決しようとする課題は、ＤＮＡ複製において、さらにＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性に優れたＰＣＮＡ変異体を得ることである。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、メタノカルドコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ；Ｍｊａ）―ＰＣＮＡ（非特許文献１）の多量体形成に関わるアミノ酸配列（配列番号１）のうちの、第１４２番目に相当するアミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に改変した変異型ＰＣＮＡを作製することにより、ＤＮＡ複製において、特に特異性を必要とする長鎖の増幅やＧＣ率が高い配列の増幅において、従来よりも優れたＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。代表的な本発明は、以下の通りである。

［項１］
配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とするＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）単量体。
［項２］
配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、以下の（１）から（５）のいずれかの変異を含んでなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とする請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体。
（１）８０番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（２）８２番目のアミノ酸残基をアルギニン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（３）１０８番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（４）１３８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
（５）１４６番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
［項３］
配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、８０番目、８２番目、１０８番目、１３８番目、１４２番目及び第１４６番目に相当するアミノ酸残基以外の、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とする項１に記載のＰＣＮＡ単量体。
［項４］
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸残基のみを、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなることを特徴とする項１に記載のＰＣＮＡ単量体。
［項５］
配列番号１で示されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とする項１に記載のＰＣＮＡ単量体。
［項６］
項１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項７］
配列番号５に記載の塩基配列において、第４２４番目から４２６番目の塩基が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸をコードするトリプレットで置換された塩基配列からなり、かつ、項１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項８］
項６に記載の塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、項１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項９］
項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
［項１０］
配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、項１から５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項１１］
項６から９のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項１２］
項１０に記載のベクターを含む形質転換体。
［項１３］
項１１に記載の形質転換体を培地で培養し、該形質転換体中又は培地中に、ＰＣＮＡ単量体及び／又は該ＰＣＮＡ単量体で構成されたＰＣＮＡ多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体又は多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
［項１４］
項１から４のいずれかに記載のＰＣＮＡ単量体及び／又は該単量体で構成された多量体、並びにＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、及びマグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含む緩衝液溶液を含むことを特徴とするＤＮＡ複製用試薬。
［項１５］
ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項１２に記載のＤＮＡ複製用試薬。

本発明により、ＤＮＡ複製におけるＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性に優れた、汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子が提供される。

ＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の比較 伸長時間が短い反応条件によるＰＣＮＡ添加による合成速度の比較 長鎖ターゲットＤＮＡ増幅におけるＰＣＮＡ添加による合成速度の比較 ＧＣ率の高い領域を持つターゲットＤＮＡ増幅でのＰＣＮＡ添加による合成速度の比較 植物ライセートからの増幅でのＰＣＮＡ添加

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列及びその個々の構成因子については、アルファベット一文字表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。欠損はΔで表記する。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。例えば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号の後に「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。

（１）本発明のＰＣＮＡ
本発明の実施形態の一つは、以下の（Ａ）から（Ｅ）のうちいずれかに示されるＰＣＮＡ単量体である。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（Ｂ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかの置換、欠失、挿入及び／又は付加（これらを纏めて「変異」とも表す。）を含んでなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ａ）８０番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｂ）８２番目のアミノ酸残基をアルギニン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｃ）１０８番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｄ）１３８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
（ｅ）１４６番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
（Ｃ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、、８０番目、８２番目、１０８番目、１３８番目、１４２番目及び第１４６番目に相当するアミノ酸残基以外の、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（Ｄ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸残基のみを、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｅ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。

（１．１）アミノ酸配列
配列番号１は、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（以下、「Ｍｊａ」とも記載する。）由来のＰＣＮＡのアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は非特許文献１などにおいて報告されている。

配列番号１において、１４２番目のアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの１つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、各単量体のＮ末端側領域とＣ末端側領域とに存在する。ＰＣＮＡ多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合することにより形成される。真核細胞及び古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。配列番号１で示されるアミノ酸配列においては、Ｎ末端領域が下記の（ａ）で示される群の位置に該当し、Ｃ末端領域が下記の（ｂ）で示される群の位置に該当する。
（ａ）８０、８２、１０８番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３８、１４２、１４６番目のアミノ酸残基群

上記（２）のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。

上記（３）のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

上記の（２）又は（３）に記載したようなＰＣＮＡとして、好ましくはＰＣＮＡの精製を簡便にすべく、Ｎ末端に挿入したＨｉｓタグなどのアフィニティタグを付加するものが挙げられるが、これに限定されない。

（１．２）塩基性アミノ酸残基
本発明のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号１における１４２番目のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基に置換されるが、置換する塩基性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、トリプトファンが挙げられる。好ましくはアルギニン又はリジンである。

（１．３）ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性
ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性はＰＣＲによって評価することができる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝剤、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、及びファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を確認することができる。好ましくは増幅量が少ないＰＣＲ反応系でＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性は評価しやすく、さらに好ましくはｄＵＴＰを含む反応系や伸長時間が短い反応条件などでＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を評価することが望ましい。本発明においてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼをいう。好ましくは古細菌（アーキア、Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。

（１．３．１）ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の測定方法
ＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を評価しやすくするため、伸長時間を短くし、増幅量を少なくした反応系でＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を比較する。本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性は、以下の方法に基づいて評価するものとする。
（ｉ）ＰＣＲ
ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている。）を用いて、
１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
１ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３及び４）、
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、
１Ｕの ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ
を含むよう反応液を調製する。５０μｌの前記反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することでＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を評価することができる。ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の高いＰＣＮＡを添加することによってＤＮＡ増幅量が増加する。

本発明において、ＤＮＡ増幅量の増加を定量的に評価する方法としては、電気泳動パターン解析用ソフトウェアであるＧｅｌ Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を利用することにより、ＤＮＡ増幅量を数値化するものとする。このような方法でＤＮＡ増幅量を比較したとき、ＰＣＮＡを添加した場合のＤＮＡ増幅量が、ＰＣＮＡを添加しなかった場合のＤＮＡ増幅量の１．０倍（好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、さらに好ましくは２倍、３倍）を超える。もしくは増幅していなかったターゲットが増幅すれば、そのＰＣＮＡが「ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有する」と判断する。

（１．４）
ＰＣＲにおいては、プライマーと鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡ複製を繰り返し、幾何級数的にＤＮＡを増幅させる。そのため、ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼに対するクランプとしての機能を果たすと共に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で安定した後又は所定領域の増幅後には、鋳型から速やかに外れることが望ましい。本発明のＰＣＮＡ変異体が従来のＰＣＮＡ変異体よりＤＮＡの複製反応を促進し得る作用・機序は必ずしも明確ではないが、多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有することにより、ＤＮＡの複製反応の繰り返しが円滑に行われ、その結果、ＤＮＡ複製反応をより促進するということが推測される。

（１．５）
本発明のＰＣＮＡ単量体は、単離されたもの又は精製されたものであることが好ましい。また、本発明のＰＣＮＡ単量体は、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＰＣＮＡ単量体に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたＰＣＮＡ単量体は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＰＣＮＡ単量体は、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、緩衝液）中に存在してもよい。また、一部又は全部が三量体などの多量体を形成していてもよい。

（２）本発明のＰＣＮＡの製造方法等
（２．１）本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡ
ＰＣＮＡをコードする遺伝子は、ＰＣＮＡをもつ微生物からクローニングすることができる。またアミノ酸の配列情報や核酸の配列情報をもとに人工的に合成することもできる。本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を示すＤＮＡ。
（Ｂ）（Ａ）で示されるＤＮＡにおいて、さらに、配列番号５に記載の塩基配列において、第４２４番目から４２６番目の塩基が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸をコードするトリプレットで置換された塩基配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）項６に記載の塩基配列との相同性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

本発明において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。

本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を備える限り、配列番号５に示される塩基配列との相同性が８０％以上であるＤＮＡが含まれる。好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有するＤＮＡである。

塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出するものとする。

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有する限り、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。

ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。本発明においては、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言うものとする。ハイブリダイゼーション液として５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ；ｐＨ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を用いる。

（２．２）ベクター
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターである。

本発明のベクターは、上記（２．１）で説明する本発明の変異型ＰＣＮＡをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。

大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１．８４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

（２．３）形質転換体
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む形質転換体である。ＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記（２．２）で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現して変異型ＰＣＮＡを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞を使用することができる。

宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｃ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが例として挙げられる。また、この場合のベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。

宿主が酵母の場合は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、キャンデイダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などが例として挙げられる。この場合のベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。

宿主が糸状菌である場合は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、コレトトリカム・ヒエマリス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｅｍａｌｉｓ）等を例示することができる。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とする、いわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。

本発明の形質転換体は、好ましくは、上記（２．２）に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション又はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法等を利用して実施することができる。

形質転換体に生成させた本発明のＰＣＮＡは、必要に応じて、タンパク質精製の定法により、精製、単離することができる。

（２．４）ＰＣＮＡの製造方法
本発明の実施形態の一つは、前記の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中又は培地中に、ＰＣＮＡ単量体又は前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体又は多量体を回収する工程を含む、変異型ＰＣＮＡの製造方法である。

上記改変ＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として、例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法や、リゾチームのような溶菌酵素を用いることが好ましい。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心分離することで宿主由来のタンパク質を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパク質の発現を確認することができる。

上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。すなわち、栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的又は物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーに供することにより、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得る場合は、精製を容易にするため、配列番号１のＮ末端もしくはＣ末端にＨｉｓタグ等のアフィニティタグを付加しても良い。

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得ることにすれば、種々の修飾が可能である。例えば、本ＰＣＮＡをコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本ＰＣＮＡを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出・精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

なお、ＰＣＮＡの単量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し多量体を形成する。その接合は可逆的であるため、ＰＣＮＡ単量体として発現させたものの少なくとも一部が多量体を形成することがある。

（３）本発明の変異型ＰＣＮＡの利用法等
（３．１）ＤＮＡの複製方法
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明のＰＣＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法である。前記方法において、ＰＣＮＡは単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであっても良いし、その両方の形態が混在していても良い。

ＤＮＡの複製方法は特に限定されない。ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成、などが挙げられるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が好適な形態として挙げられる。

ＤＮＡの複製方法の条件も特に限定されない。例えばＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示す。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、及び、
（ｅ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含む緩衝液溶液
を、混合し、サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を以下の（Ｉ）から（ＩＶ）で示されるサイクルで上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
（Ｉ）反応液を９４℃程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分かれさせる。
（ＩＩ）６０℃程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その１本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせる。
（ＩＩＩ）プライマーの分離が起きずＤＮＡポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は６０から７２℃程度に設定される。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常１分から２分、この温度を保つ。
（ＩＶ）ここまでが１つのサイクルで、以後、（Ｉ）から（ＩＩＩ）までの手順を繰り返していく事で特定のＤＮＡ断片を増幅させる。

上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらにＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。また、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的な増幅の軽減に特に有効である。

本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高いことを特徴とする。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性又は忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつ、ＤＮＡ複製活性が増強され得る。

（３．１．１）α型ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせ
本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが伸長性に劣るタイプのα型ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。典型的なα型ＤＮＡポリメラーゼとしては、ファミリーＢに属するものが挙げられる。なかでも、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓやＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓなど古細菌に由来するものが好ましい。例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ）、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン）、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）、及びＰｗｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどのものに適用し得るが、これらに特に限定されるものではない。

（３．１．２）
上記のα型ＤＮＡポリメラーゼは、さらに、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体であっても良い。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）の１〜４０番目、及び７８〜１３０番目によって形成されるウラシル結合ポケットの少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列は、パイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）においては、上述の通り、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号１１）のおいては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号１２）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号１３）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号１４）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１５）においては、アミノ酸１〜４０、及びアミノ酸７８〜１３０によって形成される。

（３．１．３）
本発明の核酸増幅試薬に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、７、３６、３７、９０〜９７及び１１２〜１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、例えば、
（ａ１）配列番号６又は配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７及び１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

（３．１．４）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ２）で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７及び１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号６との同一性又はそのアミノ酸配列と配列番号７との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

（３．１．５）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ３）で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７及び１１２〜１１９番目以外の部位において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜５個である。

なお、「配列番号６に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、及び１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の７、３６、３７、９０〜９７、及び１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。

本願明細書において、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号６上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号６の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

なお、特許第４３９５３７７号公報又は特表２００６−５０７０１２号公報には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、及び１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本発明の課題を解決することができるレベルの良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。

（３．１．６）
本発明の核酸増幅試薬に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号６又は配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、又は９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変箇所が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、又はＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、又はＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。

より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ又はＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ又はＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ又はＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、及び１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１１及び１２に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下で約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで、塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。

（３．１．７）
本発明の核酸増幅試薬に用いられる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３’−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１２）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１３）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１４）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１５）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、及び３０８〜３１８番目のアミノ酸である。

本発明は、具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号６〜１５に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、及び３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３’−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

なお、「配列番号６に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、及び３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、及び３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。

上記の３’−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、又は付加からなり得る。配列番号６における１３７〜１４７、２０６〜２２２、及び３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号６又は配列番号７における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、又はＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。なお、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、又は最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号６又は配列番号７における１４７番目に対応するアミノ酸を改変したものである。より好ましくは、Ｈ１４７Ｅ、又はＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。

（３．１．８）
本発明のＤＮＡ複製用試薬においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから、反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。ＲＦＣ標品は一般には市販されておらず、その調製は手間を要する。ＲＦＣ標品が利用できるとしても、添加して使用する場合には、ＲＦＣ以外のＤＮＡ複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であるが、本発明においてはこれらの要因を考慮しなくてよいというメリットがある。また、特にＰＣＲでの使用の場合には、本発明のＰＣＮＡは、ＲＦＣを併用しなくとも、野生型ＰＣＮＡとＲＦＣの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。

また、ＰＣＲの具体的な条件に関しては、既に多くの報告がされており、本発明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。ＰＣＲの条件としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量、ＰＣＲの反応時間、反応溶液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液のｐＨ、投入する鋳型ポリヌクレオチドの量などの種々の条件が調整される。

（３．２）ＤＮＡ複製用試薬、ＤＮＡ複製用キット
本発明のＤＮＡ複製用試薬は、上述したような本発明のＰＣＮＡ単量体及び／又は該単量体で構成された多量体、並びにＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、及びマグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含む緩衝液溶液を含むことを特徴とする。ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。

本発明のＤＮＡ複製用試薬は、上記本発明のＰＣＮＡ及び必要に応じその他の試薬類を含むＤＮＡ複製用試薬キットの態様であっても良い。本発明のＰＣＮＡは、単量体及び／又は前記単量体で構成された多量体を含む形態で、ＤＮＡ複製用試薬の一成分として好適に用い得る。上記のＤＮＡ複製用幅試薬キットは、本発明のＰＣＮＡがＰＣＲにおいて特に好適に用い得るため、ＰＣＲ用のＤＮＡ複製用試薬キットとして特に好適である。

上記のＤＮＡ複製用試薬キットに備えられるＰＣＮＡはどのような形態であってもよく、精製タンパク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド、あるいはこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説明した通りである。また、本発明のＰＣＮＡと他のＰＣＮＡを組み合わせてもよい。また、本発明のＰＣＮＡが、組換えＤＮＡ又は形質転換体の形態で提供される場合には、本発明のＰＣＮＡを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、本発明のＰＣＮＡを含むＤＮＡ複製用試薬には、必要に応じて、バイオテクノロジー試薬として一般に用いられる他の成分や媒体を配合してもよい。

（４）
（４．１）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、以下のようにして実施するものとする。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて攪拌後、更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー製ＴｒｉＣａｒｂ ２８１０ＴＲ）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に特に限定されるものではない。

（実施例１）
Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体のプラスミド作製
Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来のＰＣＮＡ遺伝子（配列番号５）は非特許文献１に記載の情報を参考にし、人工合成にて作成した。人工合成した核酸を、ｐＥＴ２３ｂにクローニングし、変異導入のＤＮＡ鋳型（ｐＭｊａＰＣＮＡ）として利用した。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、酵素の調製に用いた。実施例１で作製したプラスミドを表１に示す。

（実施例２）
Ｍｊａ−ＰＣＮＡの作製
実施例１で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にてＯＤ６００が０．３〜０．６になるまで通気培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ノニデットＰ４０、５０％ グリセリン）に置換し、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体を得た。

（実施例３）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体のプラスミド作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号１６）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読により行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素の調製に用いた。

（実施例４）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体の作製
実施例３で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ノニデットＰ４０、５０％ グリセリン）に置換し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体を得た。

（実施例５）
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のプラスミド作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１７）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読することにより行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素の調製に用いた。実施例３で作製したプラスミドを表２に示す。

（実施例６）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例５で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ノニデットＰ４０、５０％ グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は（４．１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法に従い行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

（実施例７）
Ｍｊａ−ＰＣＮＡのスクリーニング
ＰＣＲでＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性がある変異体を取得するため、実施例２で作製したＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体を用いて、上記（１．３．１）で示したＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の測定方法に従い、ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＨｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。ＰＣＮＡは２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎｇを反応系に添加した。

表３は、各Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体のＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を調べた結果になる。縦軸は各Ｍｊａ−ＰＣＮＡの変異箇所を示し、横軸が添加したＰＣＮＡ量を示す。増幅増強活性を、以下の０〜２の３段階で示した。
０：増幅なし（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性なし）
１：薄く増幅している（微弱なＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性あり）
２：増幅している（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性あり）

図１は、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性のあったＥ１４２Ｋ、及びＥ１４２Ｒ、またコントロールとして、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性のなかったＲ８０Ａの電気泳動結果である。

今回用いたＰＣＮＡ変異体ではＥ１４２Ｋ、Ｅ１４２ＲでしかＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性が確認できなかった。その他のＰＣＮＡ変異体は、図１のＲ８０Ａと同様、電気泳動ではまったくバンドが得られなかった。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１やＰｆｕ−ＰＣＮＡは多量体の形成部位に変異を入れることで、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性のあるＰＣＮＡが得られているが、Ｍｊａでは１４２番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸に置換したものでしかＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性のあるものは得られなかった。ＭｊａはＰｆｕやＫＯＤとは相同性が低いため、単に多量体の形成部位に変異を入れるだけでは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性が得られなかったことが考えられる。

（実施例８）
伸長時間が短い反応条件でのＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体とＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体の比較ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体は、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性があると示された変異体になる。今回、スクリーニングで得られたＭｊａ−ＰＣＮＡ（Ｅ１４２Ｋ）と上記ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体を用いて、ＰＣＲでその効果を比較した。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、約２．８ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１８及び１９に記載のプライマー、５０コピー相当のヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、１μｇのＫＯＤ抗体と混合した１．２５Ｕ ＫＯＤポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡをそれぞれ２００、４００、８００ｎｇ添加し、コントロールとしてＰＣＮＡを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、０秒→６５℃、０秒→６８℃、０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図２は、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体及びＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体を２００、４００、８００ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭｊａ−ＰＣＮＡ Ｅ１４２Ｋ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの２種である。

この評価系は伸長時間が短く、ＰＣＮＡの添加なしでは増幅できない。実際、ＰＣＮＡを添加しなかったレーン１では、それぞれ増幅が確認されていない。一方、ＰＣＮＡの増幅増強活性によって、ＰＣＮＡを添加すれば増幅することを確認することができた。しかしながら、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１については、増幅はするものの、非特異的な増幅も同時に増強してしまう傾向が確認され、特異的にかつ効率的に増幅するにはＭｊａ−ＰＣＮＡの方が向いている結果が得られた。

（実施例９）
長鎖ターゲット増幅でのＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体とＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体の比較
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａと今回、スクリーニングで得られたＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｋ）を用いて、長鎖ターゲットを増幅するＰＣＲでその効果を比較した。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製）に添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、約１７．５ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号２０及び２１に記載のプライマー、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、１μｇのＫＯＤ抗体と混合した１．２５Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡをそれぞれ５００、１０００ｎｇ添加し、コントロールとしてＰＣＮＡを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→７４℃、９分を５サイクル、９８℃、１０秒→７２℃、９分を５サイクル、９８℃、１０秒→７０℃、９分を５サイクル、９８℃、１０秒→６８℃、９分を２０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図３は、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体及びＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体を５００、１０００ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭｊａ−ＰＣＮＡ Ｅ１４２Ｋ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの２種である。

この評価系は増幅するターゲットが長く、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体だけでは増幅できない。実際、ＰＣＮＡを添加しなかったレーン１では増幅が見られていない。一方、ＰＣＮＡのＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性によって、どちらのＰＣＮＡでも１０００ｎｇ添加すれば増幅が確認することができた。しかしながら、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１については、５００ｎｇ添加した条件で非特異的な増幅が生じ、目的産物が得られていない。ＫＯＤ−ＰＣＮＡよりＭｊａ−ＰＣＮＡが特異性に優れていることが示された。

（実施例１０）
ＧＣ率の高い領域をもつターゲットの増幅でのＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体とＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体の比較
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａと今回、スクリーニングで得られたＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｋ）を用いて、１０ｋｂのターゲットＤＮＡ１５種の増幅を比較した。１５種中５種はＧＣ率が７０％を超える５００ｂｐ以上の領域を内部に含んでいる。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、約１０ｋｂを増幅する６ｐｍｏｌのプライマー（ＢＲＣＡ２：配列番号２２及び２３、ＫＲＡＳ：配列番号２４及び２５、ＦＡＮＣＥ：配列番号２６及び２７、ＢＬＭ：配列番号２８及び２９、ＤＤＢ２：配列番号３０及び３１、ＥＲＣＣ４：配列番号３２及び３３、ＷＲＮ：配列番号３４及び３５、ＰＴＥＮ：配列番号３６及び３７、ＸＰＡ：配列番号３８及び３９、ＸＰＣ：配列番号４０及び４１、ＡＴＣＢ：配列番号４２及び４３、ＢＲＡＦ：配列番号４４及び４５、ＴＧＦｂ：配列番号４６及び４７、ＡＣＥ：配列番号４８及び４９、ＣＡＳＰ３：配列番号５０及び５１）、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、０．５μｇのＫＯＤ抗体と混合した０．６Ｕ ＫＯＤポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ）を含む２０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡをそれぞれ４００ｎｇ添加し、コントロールとしてＰＣＮＡを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、２分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。

図４は、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体及びＫＯＤ−ＰＣＮＡ１変異体を４００ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体は、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ Ｅ１４２Ｋ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１ Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの２種、及びコントロールとして実施したＰＣＮＡ添加なしのものである。

この評価系は増幅するターゲットＤＮＡが長いため、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体だけでは増幅できない。実際、ＰＣＮＡを添加しなかったゲルでは増幅が見られていない。また図４において右から５つのターゲットＤＮＡ（ＡＴＣＢ、ＢＲＡＦ、ＴＧＦｂ、ＡＣＥ、ＣＡＳＰ３）は、ＧＣ率が７０％を超える５００ｂｐ以上の領域を持つ。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１を添加したゲルでは、左から１０までのターゲットＤＮＡは増幅したものの、右から５つのＧＣ率が７０％を越える領域を持つターゲットでは、ＡＴＣＢとＣＡＳＰ３でしか増幅は見られなかった。一方、Ｍｊａ−ＰＣＮＡについては、１５サンプル全てで増幅が確認された。ＧＣを含むターゲットＤＮＡを増幅するには、ＫＯＤ−ＰＣＮＡよりＭｊａ−ＰＣＮＡが優れていることが示される。

（実施例１１）
Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体を用いた植物ライセートからの増幅
今回、スクリーニングで得られたＭｊａ−ＰＣＮＡ変異体を用いて、植物のライセートから精製を行うことなくＰＣＲができるかを検討した。鋳型にはタバコの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒ Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製）に添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号５２及び５３に記載のプライマー、１μｇのＫＯＤ抗体と混合した１．２５Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを１０００ｎｇ添加し、コントロールとしてＰＣＮＡを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

図５は、Ｍｊａ−ＰＣＮＡ変異体１０００ｎｇ添加してＰＣＲ反応を行い、植物ライセートから精製を経ずにＰＣＲを実施し、電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭｊａ−ＰＣＮＡ Ｅ１４２Ｋであり、比較のためにＰＣＮＡを添加していないものも実施した。

植物ライセートはＰＣＲ阻害物質を多く含み、ＰＣＲに添加すると阻害を生じることが知られている。ＰＣＮＡなしではライセート２μｌを、５０μｌの反応性に添加すると阻害が生じたところ、ＰＣＮＡを添加すれば、２μｌまでは増幅が可能になった。Ｍｊａ−ＰＣＮＡにより増幅が増強し、阻害物質が含まれていても増幅が可能になったことが示唆される。

本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、研究用途、診断用途を問わず、特にＤＮＡ合成に関わる技術において有用である。

Claims (12)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とするＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）単量体。
2. 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列において該１４２番目のアミノ酸残基以外の１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とするＰＣＮＡ単量体。
3. 配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸残基のみを、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなることを特徴とするＰＣＮＡ単量体。
4. 配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列において、１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドからなることを特徴とするＰＣＮＡ単量体。
5. 請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
6. 配列番号５に記載の塩基配列において、第４２４番目から４２６番目の塩基が、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸をコードするトリプレットで置換された塩基配列からなり、かつ、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
7. 請求項５又は６に記載の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、かつ、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
8. 請求項５から７のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
9. 請求項８に記載のベクターを含む形質転換体。
10. 請求項９に記載の形質転換体を培地で培養し、該形質転換体中又は培地中に、ＰＣＮＡ単量体及び／又は該ＰＣＮＡ単量体で構成されたＰＣＮＡ多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体又は多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
11. 請求項１から４のいずれかに記載のＰＣＮＡ単量体及び／又は該単量体で構成された多量体、並びにＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、及びマグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含む緩衝液溶液を含むことを特徴とするＤＮＡ複製用試薬。
12. ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載のＤＮＡ複製用試薬。