JP6658796B2 - 核酸増幅方法 - Google Patents
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Description
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
そこで、dUTPが存在していても、また鋳型DNAにウラシルが含まれていても、通常のdTTPを用いたときや通常のアデニン、シトシン、グアニン、チミンからなる鋳型を増幅するときのように十分な増幅量を示す核酸増幅法が求められていた。
[1]
塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体、および
(b)PCNA
を含む、前記核酸増幅方法。
[2]
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、以下の(a1)から(a3)のいずれかで示されるものである、[1]に記載の核酸増幅方法。
(a1)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97および112〜119番目のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(a2)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、7、36、37、90〜97および112〜119番目以外の部位において少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号1との同一性が80%以上またはそのアミノ酸配列と配列番号2との同一性が80%以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
(a3)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、7、36、37、90〜97および112〜119番目以外の部位において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
[3]
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、93番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[2]に記載の核酸増幅法。
[4]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[5]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列のD141、I142、E143、H147、N210及びY311に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変である、[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[6]
PCNAが、以下の(b1)から(b3)のいずれかで示されるものである、[1]〜[5]のいずれかに記載の核酸増幅方法。
(b1)配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、下記(x)および(y)で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
(x)82、84、109番目のアミノ酸残基群
(y)139、143、147番目のアミノ酸残基群
(b2)(b1)で示されるPCNAにおいて、さらに、(x)および(y)で示される群以外の部位において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
(b3)配列番号11で示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上、または、配列番号12で示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
[7]
PCNAが配列番号11または配列番号12の、143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、82番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、109番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、[1]〜[6]のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[8]
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[9]
生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[10]
以下の(a)から(e)を含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体
(b)PCNA(c)プライマー対
(d)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(e)Mgイオンを含むバッファー溶液
[11]
[10]に記載の試薬を含むキット。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「D143A」などの表記を用いる。「D143A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「/」でつなげて表す。たとえば「D143A/D147A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第147番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「/」の記号のあとに「P36H」などの変異箇所についての情報を追記する。
また、本明細書において「変異型PCNA」などという場合の「変異型」とは、従来知られたPCNAとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
本発明の実施形態の一つは、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体、および
(b)PCNA
を含む、前記核酸増幅方法である。
前記核酸は、典型的には、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)で構成されるDNAであるが、本発明の核酸増幅方法ではDNAポリメラーゼとして「減少した塩基類似体(本明細書では、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を塩基類似体と称する。)検出活性」を有する変異体を用いるので、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。
以下、本明細書では特に断りのない限り、DNAを構成する塩基には、上記のA、C、G、Tおよび塩基類似体のいずれを含んでも良いものとする。
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記生体試料には、食品などの加工製品、土壌などの自然環境や、事業所、住居などの生活環境の中に存在するものであって、生体に由来するものも含まれる。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為(物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など)は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。
DNAのメチル化を解析する手法として、バイサルファイト処理後のDNAをシークエンスする方法が取られている。バイサルファイト処理は非メチル化シトシンをウラシルに変換し、一方、メチル化シトシンは変換されないことから、シークエンスを確認することでメチル化シトシン、非メチル化シトシンを区別することができる。
増幅対象DNAに、
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体
(b)PCNA
のほか、
(c)一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
(d)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))、および、
(e)マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び/又はカリウムイオンを含むバッファー溶液を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、(1)DNA変性、(2)プライマーのアニーリング、(3)プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のDNA断片を増幅させる。
上記PCR方法においては、必要に応じて、さらに、BSA、非イオン界面活性剤を用いてもよい。
本発明の方法に用いるファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体は、「減少した塩基類似体検出活性」を有する。
(1.1.1)塩基類似体検出活性
塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。(塩基類似体検出活性の評価方法については、後述する。)
通常、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能がほぼ完全に阻害されるが、本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの塩基類似体検出活性を減少させるよう、野生型のアミノ酸配列に改変を施した変異体である。したがって、ウラシルやイノシンなどの塩基類似体が存在していても、ポリメラーゼ機能が完全に阻害されることなくDNA合成(DNAポリメラーゼの伸長反応)が進む。
塩基類似体検出活性はPCRによって評価できる。例えば、鋳型となるDNA、緩衝材、マグネシウム、dNTPs、プライマー、および評価対象のDNAポリメラーゼを含む通常のPCR反応液に、dUTP溶液を、終濃度0.5μM〜200μMで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でPCR産物の有無を確認し、許容できたdUTP濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いDNAポリメラーゼは少しのdUTPの添加で伸長反応が阻害され、PCR産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いDNAポリメラーゼは高濃度のdUTPを添加しても問題なくPCRによる遺伝子増幅が確認できる。
(反応液の調製)
活性測定対象のDNAポリメラーゼ 1U(DNAポリメラーゼの活性測定法については、(1.1.3)で後述。)と、ベースとなる緩衝液(活性測定対象がThermococcus kodakaraensis(配列番号1)またはその変異体の場合、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付の10×PCR Bufferを、活性測定対象がPryrococcus furiosus(配列番号2)またはその変異体の場合、Pfu DNA Polymerase(Agilent社製)添付の10×PCR Bufferを用いる。その他のDNAポリメラーゼまたはその変異体の場合は至適の反応BufferもしくはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付の10×PCR Bufferを代用して用いる。ここで10×とは反応に用いる濃度の10倍に濃縮されていることを示す。
PCRの反応には1×PCR Bufferに1.5mM MgSO4と、
0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)と、
約1.3kbを増幅する15pmolの配列番号13及び14に記載のプライマー対と、10ngのヒトゲノムDNA(Roche製)と、
を含む50μlの反応液を調製する。
(PCR)
前記反応液中に、dUTP(Roche製)を終濃度0.5、5、50、100、200μMになるよう添加する。94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1分30秒を30サイクル繰り返すスケジュールでPCRを行う。
(増幅産物の検出)
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約1.3kbの増幅DNA断片を確認する。
変異型DNAポリメラーゼの塩基類似体検出活性が「減少した」とは、変異型DNAポリメラーゼの塩基類似体検出活性が野生型のそれと比較して減少していることを言う。
本明細書では、(1.1.1)に記載の<塩基類似体検出活性の測定方法>により変異型と変異がない野生型との塩基類似体検出活性を比較し、変異型の方が野生型より多くのPCR産物を得たことが確認できれば、その変異型DNAポリメラーゼは「減少した塩基類似体検出活性」を有すると判断する。
ただし、前記方法によっても野生型との比較が困難な場合は、dUTPを0.5μMの濃度で添加してもPCRの増幅ができるファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼは以下のように活性を測定する。
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。
(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて75℃にて10分間反応する。
(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。
(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/mL BSA(牛血清アルブミン)
B:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D:20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E:1mg/mL 仔牛胸腺DNA
(1.2.1)
本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、好ましくは古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼに、塩基類似体検出活性を減少させるよう改変を施した変異体である。
なかでもPCR効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたKOD DNAポリメラーゼが好ましい。
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97および112〜119番目のうち少なくとも1つに改変を加えたファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体、すなわち、
(a1)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97および112〜119番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。
(a2)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、7、36、37、90〜97および112〜119番目以外の部位において少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号1との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号2との同一性が80%以上(好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上)であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
(a3)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、7、36、37、90〜97および112〜119番目以外の部位において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
本明細書では、DNA Databank of Japan(DDBJ)のClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php/lang=ja)においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体は、より好ましくは、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、または93番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたDNAポリメラーゼは、さらに3’−5’エキソヌクレアーゼ領域の改変を含んでいてもよい。
3’−5’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをDNA重合体の3’末端から除去する能力を指し、上記の3’−5’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号1)、パイロコッカス・フリオサスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号2)、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号3)、サーモコッカス・リトラリスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号4)、パイロコッカス・エスピーGB−Dに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号5)、サーモコッカス・エスピーJDF−3に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号6)、サーモコッカス・エスピー9°N−7に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号7)、サーモコッカス・エスピーKS−1に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号8)、サーモコッカス・セラーに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号9)、又はサーモコッカス・シクリに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号10)においては、137〜147、206〜222、および308〜318番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したDNAポリメラーゼ以外のDNAポリメラーゼにも適用される。また、配列番号1〜10に示されるDNAポリメラーゼ以外のファミリーBに属する古細菌由来DNAポリメラーゼにおいては、配列番号1の137〜147、206〜222、および308〜318番目のアミノ酸からなる3’−5’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
なお、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた(エキソ(−))DNAポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して50%(好ましくは20%、さらに好ましくは10%、さらに好ましくは5%、さらに好ましくは1%、さらに好ましくは0.1%、さらに好ましくは0.05%、さらに好ましくは0.03%)以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する、改変されたDNAポリメラーゼを指す。
例えば、米国特許第6946273号に開示されている。PCR効率を向上させたDNAポリメラーゼとは、PCR産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたDNAポリメラーゼを示す。PCR産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第3891330号等に記載されている。
本発明の核酸増幅方法には、PCNAを用いる。
PCNAとは、Proliferating Cell Nuclear Antigen(増殖核抗原)の略称であり、由来は特に限定されないが、パイロコッカス(Pyrococcus)属およびサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されたPCNAが挙げられる。
パイロコッカス属由来のPCNAとしては、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus sp.GB−D、Pyrococcus Woesei、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshiiから単離されたPCNAを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するPCNAとしては、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.JDF−3、Thermococcus sp.9degrees North−7(Thermococcus sp.9°N−7)、Thermococcus sp.KS−1、Thermococcus celer、又はThermococcus siculiから単離されたPCNAを含むが、これらに限定されない。
アミノ酸配列が知られているものとしては、Pyrococcus・furiosus由来のもの(配列番号12)(以下、Pfu−PCNAとも表記する)、および、Thermococcus kodakaraensis KOD−1株由来のもの(配列番号11)(以下、KOD−PCNAとも表記する)などがある。
増幅増強活性はPCRによって評価できる。鋳型となるDNA、緩衝材、マグネシウム、dNTPs、プライマー、およびファミリーBに属するDNAポリメラーゼを含む通常のPCR反応液に、評価するPCNAを添加し、PCNA添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。これにより、PCNAが単独でDNAにロードできるかどうかを確認することができる。
具体的には以下の方法である。
(i)PCR
KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付の10×PCR Buffer添付を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、dTTPの代わりにdUTPを含んだ0.2mM dNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(1.3kbの増幅には配列番号13及び14、2.8kbの増幅には配列番号15及び16、3.6kbの増幅には配列番号17及び18)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche製)、0.8μgのKOD抗体を混合した1U KOD DNAポリメラーゼ V93K変異体(減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌DNAポリメラーゼ変異体)を含む50μlの反応液中に、評価するPCNAを250ng添加し、94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→60℃、30秒→68℃、1min/kb(1.3kbの増幅には1分30秒、2.8kbの増幅には3分、3.6kbの増幅には4分)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCRを行う。
(ii)PCR産物の分析
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅DNA断片を、PCNAを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いPCNAは添加によって増幅量が増加する。
(1.4.1)
本発明の核酸増幅法に用いるPCNAは、増幅増強活性を示す変異体であってもよい。そのような変異体として、以下の(b1)から(b3)のいずれかで示される変異型が例示できる。
(b1)配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、下記(x)および(y)で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
(x)82、84、109番目のアミノ酸残基群
(y)139、143、147番目のアミノ酸残基群
(b2)(b1)で示されるPCNAにおいて、さらに、(x)および(y)で示される群以外の部位において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
(b3)配列番号11で示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上、または、配列番号12で示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)など公知の手法を利用して、後述する本発明のPCNAをコードするDNAに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントPCNAを得ることができる。バリアントPCNAには、PCNAを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント(例えば、一塩基多型)も含まれる。
本発明の核酸増幅方法に用いるPCNAとして、より好ましいのは、配列番号11または12の、143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、82番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、109番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。
本発明の核酸増幅方法に用いるPCNAは、本明細書で具体的に配列を提示したPCNA以外のPCNAにも適用される。例えば、図13で示したように配列番号11および12に示されるPCNA以外のPCNAにおいては、配列番号11の82、84、109、139、143、147番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。
(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、または
(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域に少なくともひとつの改変を有し、RFCがなくともDNAにロードし、DNAポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
本発明の核酸増幅方法に用いるDNAポリメラーゼおよび/またはPCNAを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
KOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)は、(1)目的とする遺伝子(野生型のDNAポリメラーゼ遺伝子)を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてKOD DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、(2)(1)のサイクルを15回繰り返す、(3)制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、(4)新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ligationを実施し環化させる、(5)環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
なお、上記方法において、野生型のDNAポリメラーゼ遺伝子は、そのアミノ酸配列が明らかになっている場合は、そのアミノ酸配列に対応するDNAを合成して作製することができる。あるいは、前記DNAポリメラーゼおよび/またはPCNAの由来となる生物種よりクローニングして取得することができる。
本発明の実施形態の一つは、以下の(a)から(e)を含む、核酸増幅反応を行うための試薬である。本明細書において、試薬とはその態様は特に限定されず、キットの形態であっても良い。
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体
(b)PCNA
(c)プライマー対
(d)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(e)Mgイオンを含むバッファー溶液
必要に応じさらにその他の試薬類を含んでも良い。
この試薬を用いて、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させることができる。
dUTP/UDGコンタミネーション除去法においてはDNA合成基質にdUTP(デオキシウリジン)が用いられる。dUTPの入手経路は特に限定されないが、市販のものを使用することができる。反応液中のdUTPの濃度は特に限定されないが、コンタミネーション除去の効率の観点から、好ましい下限は0.5μM以上、より好ましくは50μM以上、より好ましくは0.1mM以上である。またPCR効率の観点から、dUTPは高濃度で含まれていてもよい。好ましい上限は1mM以下、より好ましくは0.6mM以下である。
また、PCR効率の観点からdTTPとdUTPが混在していてもよい。dTTPとdUTPの比率は100:1〜1:100が好ましい。より好ましくは10:1〜1:10であり、さらに好ましくは1:1であるが、これらに限定されない。
(実施例1)
KOD変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号25)(pKOD)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
Pfu変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号26)(pPfu)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis
Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
(実施例3−1)
改変型耐熱性DNAポリメラーゼの作製
実施例1および2で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性DNAポリメラーゼを得た。
改変された耐熱性DNAポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価
ウラシルの検出活性は、前述の(1.1.1)に記載の<塩基類似体検出活性の測定方法>に従い測定した。
野生型ではdUTPを添加した場合はPCR産物が確認できず(レーン2−6)、dUTP無添加の場合(レーン1)のみ増幅産物が確認された。これに対し、7種の変異型では、終濃度0.5μMのdUTPを添加した際にも増幅産物が確認された。中でも、P36K、P36R、Y7A/P36K、Y7A/P36R、P36H、V93Q、Y7A/P36Hの6種については、dUTP終濃度0.5−200μMのすべての範囲で増幅産物が確認された。
野生型ではdUTPを添加した場合はPCR産物が確認できず(レーン2−6)、dUTP無添加の場合(レーン1)のみ増幅産物が確認された。これに対し、変異型では、終濃度0.5μMのdUTPを添加した際にも増幅産物が確認された。野生型と3‘−5’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異型(N210D、I142R)では、3‘−5’エキソヌクレアーゼ欠損の変異型の方がdUTP耐性濃度が高いことが示された。また同じY7Aの変異をもつ変異型でも3‘−5’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異(N210D、I142R)と組み合わせることでより高いdUTP濃度まで耐性が示された。同様にV93QとV93Q/N210Dについても、3‘−5’エキソヌクレアーゼを欠損させたV93Q/N210Dの方が高いdUTP濃度まで耐性が示された。これらのことから、ウラシル結合ポケットへの変異に加え、3‘−5’エキソヌクレアーゼに欠損を与える変異を加えるとdUTPの耐性能が向上することがわかる。
結果、Y7、P36、V93のウラシル結合ポケット変異はdUTP耐性濃度を高くする傾向があり、エキソ(+)に比べ、エキソ(−)の方が、dUTP耐性濃度が高くなる傾向が確認された。
改変された耐熱性DNAポリメラーゼを用いた長鎖DNA増幅の評価
表2に記載のKOD変異体を用いて、dTTPなしのdUTPのみの条件でも、1.3kBを超える長鎖DNAが増幅するかどうか調べた。表2ではエキソ領域のアミノ酸変異と、ウラシル結合に関するアミノ酸変異の両方が示されている。エキソ領域のアミノ酸変異に関して、エキソ(+)とあるのは野生型を含め3‘−5’エキソヌクレアーゼを保持している変異、エキソ(−)とあるのは3‘−5’エキソヌクレアーゼを欠失させた変異であることをそれぞれ示す。
dUTPを含むPCRにおいてHuman β−グロビンの1.3kbpおよび、2.8kbp、3.6kbpの増幅を比較した。この際、各酵素は、1Uあたり1μgのKOD抗体と混合したKOD変異体を用いた。
それぞれ反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅DNA断片の増幅量を確認した。
また、野生型のDNAポリメラーゼにV93K、Y7A/V93K、P36R、Y7A/P36R、P36HおよびY7A/P36Hの各変異を施したものとエキソ(−)の変異体であるN210D、I142R、D141A/E143Aの変異体に、V93K、Y7A/V93K、P36R、Y7A/P36R、P36HおよびY7A/P36Hの各変異を施したものを比較するとエキソ(−)のDNAポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果となった(図3および図4)。
さらに、野生型のDNAポリメラーゼにV93K、Y7A/V93K、P36R、Y7A/P36R、P36HおよびY7A/P36Hの各変異を施したものとPCR効率が向上する変異体であるH147EにV93K、Y7A/V93K、P36R、Y7A/P36R、P36HおよびY7A/P36Hの各変異を施したものを比較すると、H147E変異体の方が多い増幅量を示された。これはH147Eの改変の効果がウラシル結合ポケットへの改変とは独立しており、H147Eの改変による効果により増幅量が増えたことが考えられる。(図3および図4)
(実施例4−1)
KOD−PCNA変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来のPCNA(配列番号27)(pKODPCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
Pfu−PCNA変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のPCNA(配列番号28)(pPfuPCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
改変型耐熱性PCNAの作製
実施例4−2で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリDH5α(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Qセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性PCNAを得た。
PCNAの評価
PCNAの効果を確認するため、KOD−PCNA変異体(M73L、M73L/E143R、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143F、M73L/E143A)を用いてdUTP存在下PCRでの増幅量の違いを、Human β−グロビンの1.3kbを増幅することで比較した。この際、DNAポリメラーゼは、実施例3で作製した変異体のうち、KOD V93K変異体を用いた。PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、およびを0.2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号13及び14)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、30秒→68℃、1分30秒を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
PCNAは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、RFCの働きなしではDNAにロードできず反応が進まない。M73L/E143R、M73L/E143A、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143Fの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、PCNAがDNAにロードでき、PCR増幅量を向上させたことが考えられる(図5)。
変異型PCNAを用いた長鎖ターゲットの増幅評価
dUTPを含むPCR反応系で長鎖ターゲットの増幅(HBg8.5kb)を実施し、変異型PCNAありなしで評価した。
酵素には1Uあたり0.8μgのKOD抗体と混合したKOD Y7A/V93K変異体とKOD Y7A/P36H/N210D変異体を用い、HBgの8.5kbのPCRを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、KODのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mMまたは2.0mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号19および20)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には50ngのヒトゲノム(Roche製)を用いた。また、KOD−PCNA D147A変異体を250ng添加したものも実施した。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、9分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
結果、変異型PCNAなし、KOD N210D Y7A/P36HではMgSO4が1.5mMでも2.0mMでも増幅は見られなかったものの、変異型PCNAを添加することで、8.5kbのしっかりしたバンドを増幅することができた(図6)。
変異型PCNAを用いた血液からの増幅評価
dUTPを含むPCR反応系で血液から様々な長さのターゲットの増幅を実施し、変異型PCNAありなしで評価した。
酵素には1Uあたり0.8μgのKOD抗体と混合したKOD Y7A/V93K変異体とKOD Y7A/P36H/N210D変異体、抗体を混合したTaq DNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ(Toyobo社製)とAnti−Taq High(Toyobo社製)を等量混合したもの)を用い、HBgの482bp、1.3kb、2.8kb、3.6kb、5.7kbのPCRを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、KODのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(482bpの増幅は配列番号21および22、1.3bpの増幅は配列番号13および14、2.8kbの増幅は配列番号15および16、3.6kbの増幅は配列番号17および18、5.7kbの増幅は配列番号23および24)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、通常のdNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)または、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液1μlを用いた。また、KOD−PCNA D147A変異体を250ng添加したものも実施した。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、1分/kb(482bpの増幅は1分、1.3bpの増幅は1.5分、2.8kbの増幅は3分、3.6kbの増幅は4分、5.7kbの増幅は6分)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
Taq DNAポリメラーゼのPCRは、1×BlendTaqに添付のBuffer(Toyobo製品)、10pmolのプライマー(上記と同様)、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液中に、通常のdNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)または、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液1μlを用いた。また、KOD−PCNA M73L/E143R変異体を250ng添加したものも実施した。94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→65℃、30秒→68℃、1分/kb(上記と同様)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR
system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、dTTPとdUTPで増幅量を比べると、dUTPで大きく阻害が見られることがわかる。Taq DNAポリメラーゼでは、dTTPでは482bpが増幅しているところ、dUTPでは482bpの増幅は確認できなかった。KOD Y7A/V93K変異体、KOD Y7A/P36H/N210D変異体では、dTTPではすべてのターゲットで良好な増幅が見られているが、dUTPでは482bp以上のターゲットでほとんど増幅が見られなかった。そこに変異型PCNAを添加した結果は、Taqでは大差はないものの、KOD Y7A/V93K変異体、KOD Y7A/P36H/N210D変異体では、変異型PCNAを添加することで、増幅できなかった2.8kb以上のターゲットを増幅することができた(図7)。PCNA変異体の添加でdUTP存在下、dTTPと同等の増幅ができることが示された。また、PCNAの添加でクルードサンプルから直接PCRも可能であることが示された。
dUTPを含む反応液を用いたPCNA添加による血液からの増幅
dUTPを含むPCR反応系でPCNAの添加でクルード(血液)耐性が向上するかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/V93K変異体を用い、HBgの482bpの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、PCNA添加なしのKOD Y7A/V93Kでは血液を10%添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは血液が10%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図8)。PCNA変異体はdUTP存在下のPCRでも効果があることが示された。
dUTPを含む反応液を用いたPCNA添加による血液からの増幅
図8と同様、dUTPを含むPCR反応系でもPCNAの添加でクルード(血液)耐性が向上するかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/V93K変異体、KOD Y7A/P36H/N210Dを用い、HBgの1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはPfu−PCNA
M73L/D147Aを用いた。
M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1.5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、PCNA添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは血液が10%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図9)。図8と同様、PCNA変異体はdUTP存在下のPCRでも効果があることが示された。
PCNA添加による植物ライセートからの増幅
dUTPを含むPCR反応系でもPCNAの添加でクルード(植物)耐性が向上するかを評価した。
比較には、KOD Y7A/P36H/N210D変異体、Taqポリメラーゼを用い、rbcL 1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
KOD Y7A/P36H/N210DのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号29および30)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP) 、KOD抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃ 30秒→68℃、1.5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×BlendTaqに添付のBuffer、10pmolのプライマー(上記と同様)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→65℃、30秒→68℃、1、5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社製)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
各写真の1、2、8、16は添加された植物ライセートの割合(%)を示し、−はPCNAなし、+はPCNAを添加したことを示す。
結果、PCNA添加なしのKOD Y7A/P36H/N210Dでは植物ライセートを4%以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは植物ライセートが8%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図10)。PCNA変異体はdUTPを含む反応液でも効果があることが示された。
一方、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼではないTaqポリメラーゼではPCNAの添加でクルード(植物)耐性の変化は見られなかった。TaqポリメラーゼにはPCNA変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
体組織(爪、髪、口腔粘膜)からのPCR
爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、PCRができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は1本を、50mM NaOH180μlに添加し、95℃10分の熱処理で破砕を行い、その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μlを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を200μlの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
酵素には1Uあたり0.8μgのKOD抗体と混合したKOD(野生型)とKOD Y7A/V93K変異体とKOD Y7A/P36H/N210D変異体を用い、HBgの482bpのPCRを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、PCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号21および22)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、通常のdNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)を0.2mM添加したものと、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル1μlを用いた。また、各反応液にPCR増強因子であるKOD−PCNA M73L/E143R変異体を250ng添加したものも実施した。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、野生型のKOD DNAポリメラーゼはdUTP存在下で増幅が確認されないところ、減少した塩基類似体検出活性を持つKOD Y7A/V93KやKOD Y7A/P36H/N210D変異体ではdUTP存在下でもバンドが確認された(図11)。そこにPCNAを添加した結果、添加していないものと比べ増幅量が向上していることが確認された。
バイサルファイト処理済みDNAの増幅評価
バイサルファイト処理後、ウラシルが含まれるDNAからの増幅ができるかを検討した。メチル化の影響をなくすため、バイサルファイトに供するDNAは、KOD −Plus− Neo(Toyobo社製)を用い、配列番号31および32のプライマーで増幅した17.5kbのPCR産物を用いた。バイサルファイトはMethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kitを用い、PCR、バイサルファイト処理はそれぞれ添付の取扱い説明書に準じて行った。増幅の検討はKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(574bpの増幅は配列番号33および34、519bpの増幅は配列番号35および36、1004bpの増幅は配列番号35および37、1561bpの増幅は配列番号38および39、1993bpの増幅は配列番号38および40)、0.2mM dNTPs、1Uあたり0.8μgのKOD抗体と混合したKOD Y7A/V93K変異体を含む50μlの反応液中に、上記バイサルファイト処理済みのDNA20ngを添加し、PCR増強因子であるKOD−PCNA M73L/D147A変異体の添加無しと250ng添加したものを比較した。PCRは94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、1分/kb(574bp、519bp、1004bpの増幅は1分、1561bp、1993bpの増幅は2分)を30サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
糞便からの増幅
dUTP、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/P36H/N210D変異体、Taqポリメラーゼを用い、サルモネラのinvA遺伝子約700bpの増幅の違いをSYBR GREEN Iを用いたリアルタイムPCR、および融解曲線で比較した。KOD Y7A/P36H/N210D変異体にはPCR増強因子としてKOD−PCNA M73L/D147Aを添加したものも実施した。
KOD Y7A/P36H/N210DのPCRは、KOD Dash(Toyobo社製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、50コピーのサルモネラゲノム、4pmolのプライマー(配列番号41および42)、 2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP) 、1/30000 SYBR GREEN I、KOD抗体と混合した0.4Uの酵素を含む20μlの反応液中に、糞便を反応液に対して0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%になるように加え、95℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→60℃ 10秒→68℃、30秒を50サイクル繰り返すスケジュールでLightCycler2.0(Roche社)を用いて行った。KOD−PCNA M73L/D147Aは上記反応系に100ng加え、PCNAなしのものと比較した。
Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×Taqに添付のBuffer(Mg別添タイプ)、50コピーのサルモネラゲノム、4pmolのプライマー(上記と同様)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、4mM MgSO4、1/30000 SYBR GREEN I、抗体と混合した1Uの酵素を含む20μlの反応液中に、糞便を反応液に対して0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%になるように加え、95℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→60℃ 10秒→68℃、30秒を50サイクル繰り返すスケジュールでLightCycler2.0(Roche社)を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、80℃後半に出現する目的ピークを確認した。
結果、Taqポリメラーゼでは0.5%の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、KOD Y7A/P36H/N210Dでは2.5%の糞便を添加しても増幅が確認された。また、PCNAありなしを比較すると、PCNAを添加したものの方が、Cq値が小さく、優れたPCR効率を示していることがわかった。
1はKOD Y7A/P36H/N210Dの結果を、2はKOD Y7A/P36H/N210DにKOD−PCNA M73L/D147Aを添加したものの結果を、3はTaqポリメラーゼの結果を示す。
結果、KOD Y7A/P36H/N210DではdUTP、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、2.5%を添加しても、目的ピークを確認することができた。PCNAを添加したものでも同様に、2.5%の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Taqポリメラーゼでは0.25%の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された(図14)。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (14)
- 以下の(a)および(b)を反応組成に含む、塩基類似体を含む反応組成中における核酸増幅方法。
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼ変異体であって、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列において、以下の(a1)から(a3)のいずれかで示される変異体であるポリペプチド:
(a1)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の36番目、93番目において少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該改変が(ii)〜(iii)に示すものであるポリペプチド;
(ii)36番目に相当するアミノ酸の改変がP36H、P36K、又はP36Rのアミノ酸置換である
(iii)93番目に相当するアミノ酸の改変がV93K、又はV93Rのアミノ酸置換である
(a2)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、36番目、93番目以外の部位において少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号1との同一性が98%以上またはそのアミノ酸配列と配列番号2との同一性が98%以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド
(a3)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、36番目、93番目以外の部位において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド
(b)PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)の変異体であって、配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、下記(x)および(y)で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
(x)82、84および109番目のアミノ酸残基群
(y)139、143および147番目のアミノ酸残基群 - ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、さらに配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7番目に相当するアミノ酸において改変を有する変異体であり、該改変が(i)に示すものである、請求項1に記載の核酸増幅方法。
(i)7番目に相当するアミノ酸の改変が、Y7G、Y7V、Y7L、又はY7Iのアミノ酸置換である。 - ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、請求項1又は2に記載の核酸増幅方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列のD141、I142、E143、H147、N210及びY311に相当するアミノ酸のいずれかにおける少なくとも1つのアミノ酸の改変である、請求項3に記載の核酸増幅方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、パイロコッカス(Pyrococcus)属またはサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼである請求項1〜5のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- PCNA変異体が、配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、以下の(b1)から(b4)のいずれかの変異体である、請求項1〜6のいずれかに記載の核酸増幅方法。
(b1)143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に置換された変異体
(b2)82番目と143番目を共に中性アミノ酸に置換された変異体
(b3)147番目を中性アミノ酸に置換された変異体
(b4)109番目と143番目を共に中性アミノ酸に置換された変異体 - PCNA変異体が、配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、以下の(b1)または(b2)のいずれかのアミノ酸に置換された変異体である請求項1〜7のいずれかに記載の核酸増幅方法。
(b1)143番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体
(b2)147番目のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに置換された変異体 - 反応組成中におけるdUTP濃度が0.5μMから200μMである、請求項1〜8のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する、請求項1〜9のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌およびウイルスよりなる群から選択されるいずれかである、請求項10に記載の核酸増幅方法。
- 以下の(a)から(e)を含む、核酸増幅反応試薬。
(a)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列において、以下の(a1)から(a3)のいずれかで示される変異体であるポリペプチド:
(a1)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の36番目、93番目において少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該改変が(ii)〜(iii)に示すものであるポリペプチド;
(ii)36番目に相当するアミノ酸の改変がP36H、P36K、又はP36Rのアミノ酸置換である
(iii)93番目に相当するアミノ酸の改変がV93K、又はV93Rのアミノ酸置換である
(a2)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、36番目、93番目以外の部位において少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号1との同一性が98%以上またはそのアミノ酸配列と配列番号2との同一性が98%以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド
(a3)(a1)で示されるDNAポリメラーゼ変異体において、さらに、36番目、93番目以外の部位において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド
(b)配列番号11または配列番号12で示されるアミノ酸配列において、下記(x)および(y)で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくとも一つの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すPCNA変異体。
(x)82、84および109番目のアミノ酸残基群
(y)139、143および147番目のアミノ酸残基群
(c)プライマー対
(d)デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)
(e)マグネシウムイオンを含むバッファー溶液 - 前記(a)で示されるDNAポリメラーゼの変異体が、さらに配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7番目に相当するアミノ酸において改変を有する変異体であり、該改変が(i)に示すものである、請求項12に記載の核酸増幅反応試薬。
(i)7番目に相当するアミノ酸の改変が、Y7G、Y7V、Y7L、又はY7Iのアミノ酸置換である。 - 請求項12又は13に記載の核酸増幅反応試薬を含むキット。
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