WO2015019951A1 - 核酸増幅法 - Google Patents

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WO2015019951A1
WO2015019951A1 PCT/JP2014/070322 JP2014070322W WO2015019951A1 WO 2015019951 A1 WO2015019951 A1 WO 2015019951A1 JP 2014070322 W JP2014070322 W JP 2014070322W WO 2015019951 A1 WO2015019951 A1 WO 2015019951A1
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WO
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amino acid
pcna
seq
amplification
dna polymerase
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PCT/JP2014/070322
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哲大 小林
弘嵩 松本
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東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification method by PCR.
  • the present invention can be used not only for research but also for clinical diagnosis and environmental examination.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA denaturation by heat treatment dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA
  • primer annealing of primer to template single-stranded DNA
  • DNA polymerase This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating the cycle with three steps of extension of the primer using.
  • Target nucleic acids can be amplified hundreds of thousands of times even from a small amount of sample such as several copies. It has come to be used.
  • PCR is a very sensitive detection method, false positives due to carry-over of PCR amplification products performed previously become a problem. Therefore, PCR is performed using a substrate containing a base analog such as dUTP instead of dTTP, uracil base is incorporated into the amplification product, and uracil-N-glycosylase (UNG) treatment is performed in the next PCR.
  • a technique dUTP / UDG contamination removal method for decomposing contaminated (carry over) amplification products has been used (Non-patent Document 1).
  • Patent 4395377 Special table 2006-507012
  • an object of the present invention is to provide an efficient method for amplifying a target nucleic acid in a reaction composition for nucleic acid amplification containing a base analog. Furthermore, the other object of this invention is to provide the reagent kit suitable for said objective. In summary, an object of the present invention is to provide an improved PCR method and a PCR reaction reagent suitable for amplification of a gene in the presence of a base analog.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention comprises a DNA belonging to Family B having a reduced base analog detection activity with respect to a base analog such as uracil in a reaction composition of nucleic acid amplification including a base analog. It is characterized by using a polymerase and PCNA.
  • the present inventor uses a DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity and PCNA in a nucleic acid amplification reaction composition containing a base analog, so that even if the base analog exists. As a result, it has been found that PCR can be performed with the same amount of amplification as in the presence of a normal base, and the present invention has been achieved.
  • the representative invention of the present application is as follows.
  • [1] A method of amplifying a nucleic acid with a reaction composition comprising a base analog, the reaction composition comprising: (A) a variant of a DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity, and (b) PCNA Including the nucleic acid amplification method.
  • [2] The nucleic acid amplification method according to [1], wherein the mutant of DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity is represented by any one of (a1) to (a3) below.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least one amino acid modification among amino acids 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • A2 In the DNA polymerase variant represented by (a1), at least one amino acid is further modified at sites other than the 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 positions.
  • A3 In the DNA polymerase mutant represented by (a1), one or several amino acids are further deleted, substituted or added at sites other than positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119. And a polypeptide having reduced base analog detection activity.
  • a variant of a DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity is at least one amino acid among amino acids corresponding to the 7, 36, and 93rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2
  • the nucleic acid amplification method according to [2], which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having the modification of [4] Any of [1] to [3], wherein the DNA polymerase belonging to Family B is a mutant having at least one amino acid modification in any of the amino acids constituting the 3′-5 ′ exonuclease active region The nucleic acid amplification method described.
  • (B1) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, it has at least one modification among the amino acid residues present at the position of the group represented by (x) and (y) below, and is amplified A polypeptide exhibiting potentiating activity.
  • (X) In the PCNA represented by the 82, 84, 109th amino acid residue group (y), 139, 143, 147th amino acid residue group (b2) (b1), further in (x) and (y) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added at a site other than the group shown and having amplification enhancing activity.
  • (B3) It comprises an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and has amplification enhancing activity Polypeptide.
  • PCNA SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12
  • amino acid corresponding to position 143 was changed to basic amino acid
  • both amino acid 82 and 143 were changed to neutral amino acid
  • position 147 was changed to neutral amino acid
  • nucleic acid amplification method according to any one of [1] to [7], wherein a biological sample that has not undergone a purification step is added to a nucleic acid amplification reaction solution to amplify a target nucleic acid in the biological sample.
  • the biological sample is any of animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, and viruses.
  • a reagent for performing a nucleic acid amplification reaction comprising the following (a) to (e): (A) a variant of a DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity (b) PCNA (C) Primer pair (d) DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)) (E) Buffer solution containing Mg ions [11] [10] A kit comprising the reagent according to [10].
  • the present invention in order to prevent contamination by the dUTP / UDG contamination removal method, not only in the research field, but also in the clinical field or forensic field such as genetic diagnosis in which the same sample is amplified many times, or in the microbial examination in food and the environment Can also be used widely
  • mutant in the case of “mutant PCNA” means that it has an amino acid sequence different from the conventionally known PCNA, and is caused by artificial mutation or natural mutation. It does not distinguish whether or not.
  • Nucleic acid amplification method One of the embodiments of the present invention is a method of amplifying a nucleic acid with a reaction composition containing a base analog, wherein the reaction composition comprises: (A) a variant of a DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity, and (b) PCNA It is the said nucleic acid amplification method containing.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited as long as it can be amplified by a DNA polymerase.
  • PCR is used, but the present invention is not limited to PCR, and a DNA primer extension product is obtained by extending a primer by reacting with one kind of primer, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), using DNA as a template. It is also used in the method of synthesizing.
  • a primer extension method, a sequencing method, a conventional method that does not perform temperature cycling, and a cycle sequence method are included.
  • the base analog in the present invention refers to a base other than adenine (A), cytosine (C), guanine (G), and thymine (T), and examples thereof include uracil (U) and inosine (I). However, it is not limited to these.
  • the reaction composition including a base analog in the present invention includes a base analog in the composition for nucleic acid amplification, and the base analog reacts as a substrate for DNA synthesis (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)). It may be included in the composition, may be included in a primer used for nucleic acid amplification, or may be included in DNA to be amplified.
  • dNTP deoxynucleotide triphosphate
  • the nucleic acid applied to the nucleic acid amplification method of the present invention is not particularly limited as long as it can be amplified by DNA polymerase, and is not limited by its length, sequence, GC content, or the like.
  • the nucleic acid is typically DNA composed of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), and thymine (T).
  • A adenine
  • C cytosine
  • G guanine
  • T thymine
  • the nucleic acid is “reduced”.
  • a mutant having a base analog in this specification, a base other than adenine, cytosine, guanine, and thymine is referred to as a base analog
  • a base other than adenine, cytosine, guanine, and thymine for example, It may contain uracil or inosine.
  • the base constituting the DNA may include any of the above A, C, G, T, and base analogs.
  • the nucleic acid applied to the nucleic acid amplification method of the present invention needs to contain T in the case where dUTP is incorporated, and preferably contains 10 or more Ts.
  • the biological sample applied to the nucleic acid amplification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample collected from a living body.
  • a sample collected from a living body refers to animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, viruses and the like.
  • Body fluid includes blood and saliva, and cells include, but are not limited to, leukocytes separated from blood.
  • the biological sample includes a processed product such as food, a natural environment such as soil, and a living environment such as a business establishment and a residence, and those derived from a living body.
  • the biological sample applied to the nucleic acid amplification method of the present invention may not be subjected to a purification step. That is, the nucleic acid amplification method in the present invention may be a method in which a biological sample that has not undergone a purification step is added to a nucleic acid amplification reaction solution to amplify a target nucleic acid in the biological sample.
  • Purification is a method for separating contaminants such as tissues and cell walls of biological samples from DNA in biological samples. Methods for separating DNA using phenol or phenol / chloroform, ion exchange resins, glass filters, etc. Alternatively, there is a method of separating DNA with a reagent having a protein aggregation action.
  • a biological sample may be added to a nucleic acid amplification reaction solution and amplified without taking these purification methods.
  • a biological sample that has not undergone a purification process refers to a biological sample itself, or a liquid biological sample diluted with a solvent such as water, or a solid biological sample added to a solvent such as water and crushed by heat. And the like.
  • nucleic acids to be amplified such as organs and cells are present in the tissue of the sample
  • an act of destroying the tissue to extract the nucleic acid Does not correspond to the purification referred to in the present invention.
  • the act of diluting the sample obtained by the above method or the biological sample with a buffer solution does not correspond to the purification referred to in the present invention.
  • the biological sample applied to the nucleic acid amplification method of the present invention may have undergone bisulfite treatment. That is, the nucleic acid amplification method in the present invention may be a method of amplifying DNA after bisulfite treatment.
  • a technique for analyzing DNA methylation a method of sequencing DNA after bisulfite treatment has been adopted. Bisulfite treatment converts unmethylated cytosine into uracil, while methylated cytosine is not converted. Therefore, methylated cytosine and unmethylated cytosine can be distinguished by confirming the sequence.
  • amplification target DNA (A) a variant of a DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity (b) PCNA Besides, (C) a pair of primers in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer (d) a DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)), and (E) mixing a buffer solution containing magnesium ions, ammonium ions and / or potassium ions; By raising or lowering the temperature of the reaction solution using a thermal cycler or the like, a specific DNA fragment is amplified by repeating thermal cycles of (1) DNA denaturation, (2) primer annealing, and (3) primer extension.
  • BSA and a nonionic surfactant may be further used as necessary.
  • an antibody having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3'-5 'exonuclease activity of the thermostable DNA polymerase may be used.
  • the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. This reaction composition is particularly effective for increasing the sensitivity of PCR and reducing nonspecific amplification.
  • (1.1) Variant of DNA polymerase belonging to family B The mutant of DNA polymerase belonging to family B used in the method of the present invention has “reduced base analog detection activity”.
  • (1.1.1) Base analog detection activity The base analog detection activity is an activity that strongly binds to a base analog and inhibits the polymerase function. (The method for evaluating the base analog detection activity will be described later.)
  • a DNA polymerase belonging to Family B binds strongly when a base analog such as uracil or inosine is detected, and the polymerase function is almost completely inhibited.
  • Base analog detection activity can be assessed by PCR.
  • a dUTP solution is added at a final concentration of 0.5 ⁇ M to 200 ⁇ M to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and a DNA polymerase to be evaluated, and thermal cycling is performed.
  • the presence or absence of a PCR product can be confirmed by ethidium bromide-stained agarose electrophoresis, and the detection activity of uracil can be evaluated by the allowable dUTP concentration.
  • a DNA polymerase having a high uracil detection activity inhibits the extension reaction by adding a little dUTP, and the PCR product cannot be confirmed.
  • DNA polymerase with low uracil detection activity can confirm gene amplification by PCR without problems even when a high concentration of dUTP is added.
  • the measurement of the base analog detection activity follows the following method.
  • DNA polymerase 1U to be measured for activity a method for measuring the activity of DNA polymerase will be described later in (1.1.3)
  • a base buffer the activity to be measured is Thermococcus kodakaraensis (SEQ ID NO: 1) or a mutation thereof)
  • PCR Buffer 1 ⁇ PCR Buffer is added with 1.5 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 pmol of the primer pair set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14 for amplifying about 1.3 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche), Prepare 50 ⁇ l of the reaction solution.
  • PCR DUTP (Roche) is added to the reaction solution to a final concentration of 0.5, 5, 50, 100, and 200 ⁇ M. After the pre-reaction at 94 ° C.
  • PCR is performed with a schedule of repeating 30 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds. (Detection of amplification products) After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution is subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and an amplified DNA fragment of about 1.3 kb is confirmed under ultraviolet irradiation.
  • the base analog detection activity of the mutant DNA polymerase is “decreased”. Says that it is reduced compared to that of the wild type.
  • the base analog detection activity is compared between the mutant type and the wild type without mutation according to ⁇ Method for measuring base analog detection activity> described in (1.1.1). If it can be confirmed that more PCR products were obtained than the wild type, it is determined that the mutant DNA polymerase has “reduced base analog detection activity”.
  • DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention measures the activity as follows. If the enzyme activity is strong, samples should be stored in storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) 25 ⁇ l of the following solution A, 5 ⁇ l of solution B, 5 ⁇ l of solution C, 10 ⁇ l of sterilized water, and 5 ⁇ l of enzyme solution are added to a microtube and reacted at 75 ° C. for 10 minutes.
  • storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • A 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 ⁇ g / mL BSA (bovine serum albumin) B: 1.5 ⁇ g / ⁇ l activated calf thymus DNA C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP) D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate) E: 1 mg / mL calf thymus DNA
  • DNA polymerase modification site (1.2)
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention is a mutant in which a DNA polymerase belonging to Family B, preferably a DNA polymerase derived from Archaea, has been modified to reduce the base analog detection activity.
  • DNA polymerases derived from archaea belonging to family B include DNA polymerases isolated from bacteria of the genera Pyrococcus and Thermococcus.
  • DNA polymerase derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 2), Pyrococcus sp. Including, but not limited to, DNA polymerases isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • Thermococcus kodakaaraensis SEQ ID NO: 1
  • Thermococcus gonorarius Thermococcus litoralis
  • Thermococcus sp. JDF-3 Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp.
  • KS-1 Thermococcus celler
  • Thermococcus sicili Thermococcus kodakaaraensis
  • PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, Pfu (Staragene), KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England) , Tgo (Roche), Pwo (Roche). Of these, from the viewpoint of PCR efficiency, KOD DNA polymerase having excellent extensibility and thermal stability is preferable.
  • an archaeal DNA polymerase variant belonging to family B include the 1st to 40th amino acid sequences of the DNA polymerase (SEQ ID NO: 1) derived from Thermococcus kodakaraensis strain KOD1, and the 78th to 130th positions.
  • SEQ ID NO: 1 Thermococcus kodakaraensis strain KOD1, and the 78th to 130th positions.
  • the amino acid sequence relating to the binding of uracil is highly conserved in DNA polymerase derived from Pyrococcus and DNA polymerase derived from Thermococcus.
  • the DNA polymerase (SEQ ID NO: 1) derived from Thermococcus kodakaraensis is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • SEQ ID NO: 2 In Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 2), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • SEQ ID NO: 3 Thermococcus gorgonarius (SEQ ID NO: 3), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 5), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp. JDF-3 (SEQ ID NO: 6), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • KS-1 (SEQ ID NO: 8), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 9), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130.
  • Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 10), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • the mutant of the DNA polymerase belonging to the above family B may be one represented by the following amino acid sequence (a2).
  • A2 In the DNA polymerase variant represented by (a1), at least one amino acid is further modified at sites other than the 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 positions. 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more). More preferably, it is 99% or more) and has a reduced base analog detection activity.
  • BLAST Basic local alignment search tool
  • NCBI National Institute of Biotechnology Information
  • ncbi. nlm. nih The amino acid sequence identity is calculated by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /.
  • the mutant of the DNA polymerase belonging to the above family B may be one represented by the following amino acid sequence (a3).
  • A3 In the DNA polymerase mutant represented by (a1), one or several amino acids are further deleted, substituted or added at sites other than positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119. And a polypeptide having reduced base analog detection activity.
  • “several” is not limited as long as “decreased base analog detection activity” is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably less than about 15%. It is a corresponding number, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 160, preferably 2 to 120, more preferably 2 to 80, still more preferably 2 to 40, and even more. The number is preferably 2-5.
  • amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are amino acid sequences that are not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the expression includes amino acids assumed to be related to uracil binding, corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 of SEQ ID NO: 1.
  • a position (order) on SEQ ID NO: 1 in an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to a position corresponding to the position corresponding to the primary structure of the sequence (alignment).
  • Patent Document 1 or 2 any of the amino acids 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 assumed to be directly related to the interaction with uracil is modified.
  • Several variants of DNA polymerase belonging to family B are exemplified, but not all of the variants have good properties that meet the subject of the present application, some of which have lost activity Can also be seen.
  • the variant of DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention is 7, 36 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or It is a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least one amino acid modification among amino acids corresponding to the 93rd amino acid.
  • tyrosine (Y) as the seventh amino acid is substituted with a nonpolar amino acid, specifically, Y7A, Y7G, Y7V, Y7L.
  • Y7A, Y7G, Y7V, Y7L An amino acid substitution selected from the group consisting of Y7I, Y7P, Y7F, Y7M, Y7W, and Y7C is exemplified.
  • proline (P) which is the 36th amino acid, is preferably substituted with a positively charged polar amino acid, and specific examples include P36H, P36K, or P36R amino acid substitution.
  • valine (V) which is the 93rd amino acid, is preferably substituted with a polar amine acid having a positive charge.
  • amino acid substitution of V93Q, V93K, or V93R is exemplified. .
  • preferred mutants include Y7A / V93K, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, Y7A / V93Q or P36H / V93K.
  • Preferred examples include Y7A / P36H or Y7A / V93K, but are not limited thereto.
  • the modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention may further include modification of the 3′-5 ′ exonuclease region.
  • the 3′-5 ′ exoase activity refers to the ability to remove the incorporated nucleotide from the 3 ′ end of the DNA polymer, and the above 3′-5 ′ exonuclease region is a DNA polymerase belonging to family B and highly DNA polymerase (SEQ ID NO: 1) derived from Thermococcus kodakaraensis, DNA polymerase (SEQ ID NO: 2) derived from Pyrococcus furiosus, DNA derived from Thermococcus gorgonarius Polymerase (SEQ ID NO: 3), DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), DNA polymerase derived from Pyrococcus sp.
  • GB-D (SEQ ID NO: 5), derived from Thermococcus sp. JDF-3 DNA polymerase (SEQ ID NO: 6), Thermoco DNA polymerase derived from Cass SP 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), DNA polymerase derived from Thermococcus sp KS-1 (SEQ ID NO: 8), DNA polymerase derived from Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 10 the amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 are used.
  • the present invention is also applicable to DNA polymerases other than the DNA polymerase specifically presenting the sequence.
  • the 3′- consisting of amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1 The region corresponding to the 5 ′ exonuclease region is shown.
  • amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 shown in SEQ ID NO: 1 are DNA polymerases having an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An expression comprising amino acid sequences corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1.
  • the above modification to the 3'-5 'exonuclease region can consist of substitution, deletion, or addition. Modifications to amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in SEQ ID NO: 1 are shown. More preferably, those obtained by modifying at least one of amino acids corresponding to positions 141, 142, 143, 147, 210, 311 in SEQ ID NO: 1 are included.
  • DNA polymerase deficient in 3′-5 ′ exonuclease activity includes a complete lack of activity, for example, 50% (preferably 20%, more Preferably 10%, more preferably 5%, more preferably 1%, more preferably 0.1%, more preferably 0.05%, more preferably 0.03%) or less exonuclease activity Refers to the DNA polymerase produced.
  • modification includes any one in which the amino acid modification is selected from H147E and H147D.
  • modified forms are DNA polymerases that have improved PCR efficiency while maintaining exonuclease activity by the modification.
  • a DNA polymerase with improved PCR efficiency refers to a modified DNA polymerase in which the amount of PCR product is increased compared to the parent enzyme.
  • a method for analyzing whether the amount of the PCR product is increased as compared with the parent enzyme is described in Japanese Patent No. 3891330.
  • PCNA PCNA is used in the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • PCNA is an abbreviation for Proliferating Cell Nuclear Antigen (Proliferation Nuclear Antigen), and its origin is not particularly limited, and examples include PCNA isolated from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus. As PCNA derived from the genus Pyrococcus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus sp. PCNA isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, but is not limited thereto.
  • PCNA derived from the genus Thermococcus includes Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonaris, Thermococcus literalis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from KS-1, Thermococcus celler, or Thermococcus sicili.
  • Known amino acid sequences include those derived from Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 12) (hereinafter also referred to as Pfu-PCNA), and those derived from Thermococcus kodakaraensis KOD-1 strain (SEQ ID NO: 11) ( Hereinafter, it is also expressed as KOD-PCNA).
  • DNA replication starts when the double-stranded structure of the replication origin is released by DNA helicase.
  • Single-stranded DNA-binding protein binds to the unfolded DNA to stabilize the single strand, and primase for synthesizing a primer on each strand works.
  • replication factor Replication Factor C (abbreviated as RFC) recognizes and binds to the primer, and induces PCNA on the DNA strand.
  • PCNA serves as a clamp to keep the DNA polymerase on the DNA strand, and the DNA polymerase complexed with PCNA synthesizes the nascent strand.
  • PCNA used in the present invention preferably exhibits amplification enhancing activity.
  • PCNA usually forms a multimer and has a ring-like structure. Passing DNA through the ring structure of a PCNA multimer is referred to as “loading DNA”, and usually in conjunction with RFC, PCNA can only be loaded into DNA.
  • a mutant that exhibits amplification enhancing activity refers to a mutant that loads DNA alone, alters the site involved in PCNA multimer formation, and destabilizes multimer formation. Mutants that are easy to pass inside.
  • PCNA The site where PCNA is related to multimer formation is PCNA (SEQ ID NO: 11) derived from Thermococcus kodakaraensis, and PCNA of Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 12) is an N consisting of amino acids 82, 84 and 109. Examples thereof include a terminal region and a C-terminal region consisting of amino acids 139, 143 and 147. The N-terminal region is positively charged, the C-terminal region is negatively charged, and multimers are formed by interaction.
  • the amplification enhancing activity can be evaluated by PCR.
  • PCNA polymerase belonging to Family B
  • the amplification enhancing activity can be confirmed. This makes it possible to confirm whether PCNA can be loaded into DNA alone.
  • the amplification enhancing activity is evaluated using a mutant of a DNA polymerase belonging to Family B having a reduced base analog detection activity in a reaction system containing dUTP. Specifically, the following method is used. (I) PCR KOD -Plus- Ver.
  • PCNA mutation site (1.4.1) PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a mutant exhibiting amplification enhancing activity.
  • mutants include mutants represented by any of the following (b1) to (b3).
  • B1 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, it has at least one modification among the amino acid residues present at the position of the group represented by (x) and (y) below, and is amplified A polypeptide exhibiting potentiating activity.
  • polypeptide (b2) one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 as long as the amplification enhancing activity is retained. (Hereinafter, these are collectively referred to as “mutation”.)
  • One or several mutations include restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., site-directed mutagenesis or random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New (York) can be used by introducing a mutation into the DNA encoding the PCNA of the present invention described later.
  • Variant PCNA can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • Variant PCNA includes naturally occurring variants (for example, single nucleotide polymorphisms) such as cases based on individual differences of microorganisms holding PCNA, differences in species or genera.
  • the polypeptide of (b3) above is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 80% or more compared to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 as long as the amplification enhancing activity is retained.
  • the identity between the amino acid sequence of the PCNA of the present invention and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, and even more.
  • it is 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence having a certain identity or more can be prepared based on the known genetic engineering techniques as described above. For example, in the PCNA represented by the above (b1), those further modified at sites other than the groups represented by (x) and (y) and retaining amplification enhancing activity can be mentioned.
  • More preferred as PCNA for use in the nucleic acid amplification method of the present invention is that the amino acid corresponding to position 143 of SEQ ID NO: 11 or 12 is changed to a basic amino acid, and both positions 82 and 143 are changed to neutral amino acids. Or the 147th modified to a neutral amino acid, or the 109th and 143th modified to a neutral amino acid.
  • neutral amino acids of the present invention include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine.
  • alanine has the least influence on the three-dimensional structure of the peripheral site of the substitution site.
  • Examples of basic amino acids include arginine, histidine and lysine as long as they are natural. Arginine is preferable.
  • PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be modified with methionine corresponding to the 73rd position in order to increase the expression level. More preferably, it is modified to M73L, but is not limited thereto.
  • PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention is also applicable to PCNA other than the PCNA whose sequence is specifically presented herein.
  • a region relating to multimer formation consisting of amino acids 82, 84, 109, 139, 143, and 147 of SEQ ID NO: 11 Indicates the corresponding area.
  • the mutant that exhibits amplification enhancing activity (PCNA mutant that is loaded into DNA alone) is involved in PCNA multimer formation.
  • PCNA mutant that is loaded into DNA alone
  • C-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 139, 143 and 147, having at least one modification and no RFC Both include mutants that load into DNA and promote the elongation reaction of DNA polymerase.
  • the PCNA variant described in WO2007 / 004654 a sequence in which the 147th amino acid residue is changed to alanine (D147A), a sequence in which the 82nd and 143rd amino acid residues are changed to alanine ( R82A / D143A or R82A / E143A), the 109th and 143rd amino acid residues are changed to alanine (R109A / D143A or R109A / E143A), and the like, but are not limited thereto. It is not a thing.
  • PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be either a monomer or a multimer composed of the monomer, and both forms may be mixed.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention is desirably heat-resistant to withstand the thermal cycle of PCR, and preferably remains active even after PCR. More preferably, it is soluble even after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes, and the activity remains at 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more.
  • KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) is (1) denatured a plasmid into which a target gene (wild-type DNA polymerase gene) has been inserted, anneals a mutation primer to the plasmid, and then KOD DNA polymerase.
  • a kit that can transform a cyclized gene into Escherichia coli and obtain a transformant having a plasmid introduced with the target mutation. is there.
  • the wild-type DNA polymerase gene can be prepared by synthesizing DNA corresponding to the amino acid sequence when the amino acid sequence is known. Alternatively, it can be obtained by cloning from a biological species derived from the DNA polymerase and / or PCNA.
  • the modified DNA polymerase gene obtained by the above method or the like is transferred to an expression vector as necessary.
  • Escherichia coli as a host is transformed with the expression vector and then contains a drug such as ampicillin. Apply to agar medium to form colonies. The colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 ⁇ YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
  • a vector derived from pBluescript is preferable. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells.
  • ultrasonic treatment a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • This crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured.
  • any method may be used as a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method, for example, the following method.
  • the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods.
  • the obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the DNA polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by heparin sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation.
  • the purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows almost a single band.
  • the modification of PCNA can be performed in the same manner as the modification of DNA polymerase.
  • nucleic Acid Amplification Reagent for performing a nucleic acid amplification reaction, including the following (a) to (e).
  • the aspect of the reagent is not particularly limited, and may be in the form of a kit.
  • A a variant of a DNA polymerase belonging to family B having reduced base analog detection activity
  • PCNA PCNA
  • C Primer pair
  • d DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP))
  • Buffer solution containing Mg ions If necessary, other reagents may be included.
  • This reagent can be used to amplify nucleic acids with a reaction composition that includes a base analog.
  • the DNA synthesis substrate is typically composed of four types of deoxynucleotide triphosphates, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
  • DCTP, dGTP, and dTTP may also contain deoxynucleotide triphosphates such as dUTP and dITP.
  • the primer is typically composed of nucleotides consisting of four bases of adenine, cytosine, guanine, and thymine.
  • adenine, cytosine, guanine It may contain nucleotides other than thymine, such as uracil and inosine.
  • dUTP deoxyuridine
  • the route for obtaining dUTP is not particularly limited, but commercially available products can be used.
  • the concentration of dUTP in the reaction solution is not particularly limited, but the preferable lower limit is 0.5 ⁇ M or more, more preferably 50 ⁇ M or more, and more preferably 0.1 mM or more from the viewpoint of the removal efficiency of contamination. From the viewpoint of PCR efficiency, dUTP may be contained at a high concentration.
  • a preferable upper limit is 1 mM or less, more preferably 0.6 mM or less.
  • dTTP and dUTP may be mixed from the viewpoint of PCR efficiency.
  • the ratio of dTTP to dUTP is preferably 100: 1 to 1: 100. More preferably, it is 10: 1 to 1:10, and further preferably 1: 1, but is not limited thereto.
  • Example 1 The plasmid containing the modified thermostable DNA polymerase gene from producing Thermococcus-kodakaraensis KOD1 strain KOD mutants were prepared.
  • a DNA template used for mutagenesis a modified thermostable DNA polymerase gene (SEQ ID NO: 25) (pKOD) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 2 Preparation of Pfu mutant A plasmid containing a modified thermostable DNA polymerase gene derived from Pyrococcus furiosus was prepared.
  • a modified thermostable DNA polymerase gene SEQ ID NO: 26
  • pPfu modified thermostable DNA polymerase gene derived from Pyrococcus furiosus cloned in pBluescript was used.
  • KOD-Plus-Mutageness Using Kit manufactured by Toyobo
  • the mutant was confirmed by decoding the base sequence.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Tables 1 and 2 show the plasmids prepared in Example 1 and Example 2.
  • Example 3 Production of modified thermostable DNA polymerase The cells obtained in Examples 1 and 2 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. Coli JM109 (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Further, nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and heparin sepharose chromatography were performed.
  • thermostable DNA polymerase 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • Example 3-2 Evaluation of the reduced base analog detection activity of the modified thermostable DNA polymerase The detection activity of uracil was measured according to ⁇ Method for measuring base analog detection activity> described in (1.1.1) above.
  • FIG. 1 shows a reaction system using a total of 8 types of wild type (KOD) and 7 types of KOD variants of Y7A, P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H.
  • KOD wild type
  • FIG. 1 shows a reaction system using a total of 8 types of wild type (KOD) and 7 types of KOD variants of Y7A, P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H.
  • amplification products were confirmed in the seven mutants when dUTP having a final concentration of 0.5 ⁇ M was added. Among them, amplification products were confirmed in 6 ranges of P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H in the entire dUTP concentration range of 0.5 to 200 ⁇ M.
  • FIG. 2 shows that wild type (KOD), 3′-5 ′ exonuclease was deleted by mutation of K210 (KOD N210D) and I142R in which 3′-5 ′ exonuclease was deleted by mutation of N210D.
  • KOD I142R Three types of KOD (KOD I142R) were prepared, and each of KOD and KOD N210D was added with any of the mutations of V93K, V93R, V93Q, and Y7A (8 types in total), and KOD I142R of V93K and Y7A Those with any mutation were prepared (two types).
  • mutant type an amplification product was also confirmed when dUTP having a final concentration of 0.5 ⁇ M was added. It was shown that the mutant type lacking the 3′-5 ′ exonuclease (N210D, I142R) has a higher dUTP resistance concentration than the mutant type lacking the 3′-5 ′ exonuclease. In addition, even mutants having the same Y7A mutation showed resistance to higher dUTP concentrations in combination with mutations lacking the 3′-5 ′ exonuclease (N210D, I142R).
  • V93Q / N210D from which 3′-5 ′ exonuclease was deleted was more resistant to dUTP concentrations. From these facts, it is understood that the resistance to dUTP is improved by adding a mutation that gives a defect to the 3′-5 ′ exonuclease in addition to the mutation to the uracil-binding pocket.
  • uracil-binding pocket mutations of Y7, P36, and V93 tended to increase the dUTP resistance concentration, and it was confirmed that exo ( ⁇ ) tended to have a higher dUTP resistance concentration than exo (+).
  • Table 3 The evaluation results of KOD mutants are summarized in Table 3.
  • Table 3 the 11-step evaluation for dUTP resistance indicates that the closer to 0, the stronger the base analog detection activity, and the closer to 10, the lower the base analog detection activity.
  • ⁇ indicates that the signal is sufficiently amplified
  • ⁇ indicates that the signal is amplified to some extent
  • ⁇ indicates that the signal is not amplified.
  • Example 3-3 Evaluation of long-chain DNA amplification using a modified thermostable DNA polymerase Whether long-chain DNA exceeding 1.3 kB is amplified even under the condition of dUTP alone without dTTP, using the KOD mutant described in Table 2 Examined.
  • Table 2 shows both amino acid mutations in the exo region and amino acid mutations related to uracil bonds.
  • amino acid mutations in the exo region exo (+) is a mutation that retains 3'-5 'exonuclease, including wild type, and exo (-) is missing 3'-5' exonuclease. It shows that it is a lost mutation.
  • PCR For PCR, KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which 2 mM dTTP is replaced with dUTP, 15 pmol primer (1.3 kbp)
  • dNTPs dATP, dUTP, dCTP, dGTP
  • 15 pmol primer 15 pmol primer
  • PCR was performed with PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem) on a schedule of 35 cycles of 3 minutes for amplification of 3.6 kbp and 4 minutes for amplification.
  • Taq DNA polymerase was manufactured by Toyobo and mixed with Anti-Taq High (manufactured by Toyobo). Reaction is 1 ⁇ BlendTaq with attached Buffer, 2 mM dTTP with dUTP (dATP, dUTP, dCTP, dGTP), 10 pmol primer (same as above), 10 ng human genomic DNA (Roche), mixed with antibody 50 ⁇ l of the reaction solution containing 2.5 U of the enzyme was added at 94 ° C.
  • FIG. 3 shows that the wild type (KOD) and V93K, Y7A / V93K, P36R, Y7A / P36R, P36H, Y7A / P36H, P36R / V93K, Y7A / P36R / V93K, P36H / V93K, Y7A / P36H / V93K
  • PCR reaction was performed on human ⁇ -globin DNAs of different lengths in a reaction system containing 0.2 mM final concentration of dUTP (Roche) instead of dTTP. This is a result of electrophoresis of the obtained product.
  • dUTP dUTP
  • FIG. 4 shows that any of the mutations H147E, N210D, I142R, D141A / E143A was first added to the wild type (KOD) exo region, and V93K, Y7A / V93K, P36R, Y7A / P36R, P36H, Y7A were added to each.
  • / P36H to which any of the mutations (total 24 types) were prepared, and these mutants were used to lengthen the reaction system containing 0.2 mM final concentration of dUTP (Roche) instead of dTTP.
  • the results are obtained by performing a PCR reaction on different human ⁇ -globin DNAs and electrophoresing the obtained products.
  • 1.3 kbp is Lane 1
  • 2.8 kbp is Lane 2
  • 3.6 kbp is Lane 3.
  • the amount of amplification As for the amount of amplification, a comparison between V93K and P36H, a comparison between Y7A / V93K and Y7A / P36H, a comparison between V93K and P36R, and a comparison between Y7A / V93K and Y7A / P36R, respectively, It was confirmed that the mutation to position P36 has a larger amount of amplification and can be amplified up to a long target. In addition, the amount of amplification was higher in the double mutation into the uracil binding pocket than in the single mutation. These mutants were able to amplify long chain lengths that could not be amplified with Taq (FIG. 3).
  • V93K, Y7A / V93K, V93K, Y7A / V93K, P36R, Y7A / P36R, P36H and Y7A / P36H mutants with improved PCR efficiency and V147K, Y7A / V93K
  • the H147E mutant showed a higher amplification amount. This is because the modification effect of H147E is independent of the modification to the uracil-binding pocket, and it is considered that the amount of amplification increased due to the effect of modification of H147E. (FIGS. 3 and 4)
  • Example 4 Preparation of KOD-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain was prepared.
  • the DNA template used for mutagenesis was PCNA (SEQ ID NO: 27) (pKODPCNA) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 4-2 Preparation of Pfu-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Pyrococcus furiosus was prepared.
  • PCNA SEQ ID NO: 28
  • pPfuPCNA derived from Pyrococcus furiosus strain cloned into pBluescript was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Table 4 shows the plasmids prepared in Example 4.
  • Example 4-3 Preparation of modified heat-resistant PCNA
  • the cells obtained in Example 4-2 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. E.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • coli DH5 ⁇ (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours with aeration.
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation.
  • PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem) on a schedule of 35 cycles of 60 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 5 shows the results of electrophoresis of the product obtained by adding 250 ng of various PCNA mutants and performing PCR reaction.
  • the PCNA mutants used were 7 types in total: M73L, M73L / E143R, M73L / E143A, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, and M73L / E143F.
  • PCNA forms a multimer and promotes a nucleic acid synthesis reaction. Usually, however, the reaction cannot proceed without loading into DNA without the action of RFC.
  • M73L / E143R, M73L / E143A, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, and M73L / E143F are changes to sites involved in multimer formation, and multimer formation is moderately weakened. Therefore, it is conceivable that PCNA can be loaded onto DNA and the amount of PCR amplification has been improved (FIG. 5).
  • Example 5 Amplification evaluation of long-chain target using mutant PCNA Long-chain target amplification (HBg 8.5 kb) was performed in a PCR reaction system containing dUTP and evaluated with and without mutant PCNA.
  • As the enzyme KOD Y7A / V93K mutant mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per U and KOD Y7A / P36H / N210D mutant were used, and 8.5B PCR of HBg was performed to compare the difference in amplification.
  • KOD PCR was performed using KOD-Plus-Ver.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 2 minutes, and 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 9 minutes.
  • FIG. 6 shows the result of electrophoresis of a product obtained by amplifying a 8.5 kb long chain target containing dUTP with / without mutant PCNA (KOD-PCNA M73L / D147A).
  • the first and second lanes of each photograph show no PCNA, and the third and fourth lanes show that PCNA was added.
  • the first and third lanes show amplification of 1.5 mM MgSO 4
  • the second and fourth lanes show amplification of 2 mM MgSO 4 .
  • Example 6 Evaluation of amplification from blood using mutant PCNA Amplification of targets of various lengths was performed from blood in a PCR reaction system containing dUTP, and evaluation was performed with and without mutant PCNA.
  • the enzyme includes Taq DNA polymerase (Taq DNA polymerase (manufactured by Toyobo) and Anti-Taq) mixed with KOD Y7A / V93K mutant and KOD Y7A / P36H / N210D mutant mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per U and antibody.
  • Taq DNA polymerase manufactured by Toyobo
  • Anti-Taq mixed with KOD Y7A / V93K mutant
  • KOD Y7A / P36H / N210D mutant mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per U and antibody.
  • HBg 482 bp, 1.3 kb, 2.8 kb, 3.6 kb, and 5.7 kb were used to compare the differences in amplification using High (mixed in equal amounts of Toyobo).
  • KOD PCR was performed using KOD-Plus-Ver.
  • Taq DNA polymerase PCR was performed by adding normal dNTPs (into 50 ⁇ l reaction solution containing Buffer (Toyobo product) attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), 2.5 U enzyme mixed with antibody.
  • dATP, dTTP, dCTP, dGTP) or dNTPs in which dTTP is replaced with dUTP were added to 0.2 mM, and 1 ⁇ l of blood was used as a template.
  • KOD-PCNA M73L / E143R mutant was also implemented.
  • PCR at a schedule of 94 ° C, 2 minutes pre-reaction, followed by 35 cycles of 94 ° C, 30 seconds ⁇ 65 ° C, 30 seconds ⁇ 68 ° C, 1 minute / kb (same as above) PCR was performed using system GeneAmp9700 (Applied Biosystem). After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 7 shows the results of electrophoresis of the products obtained by amplifying targets of various lengths with and without mutant PCNA (KOD-PCNA M73L / D147A) in a reaction solution containing dTTP or dUTP.
  • PCNA mutant PCNA
  • a target of 8 kb or more could be amplified (FIG. 7). It was shown that the addition of the PCNA mutant can achieve the same amplification as dTTP in the presence of dUTP. It was also shown that PCR can be performed directly from a crude sample by adding PCNA.
  • Example 7 Amplification from blood by addition of PCNA using reaction solution containing dUTP. It was evaluated whether crude (blood) resistance was improved by addition of PCNA in a PCR reaction system containing dUTP.
  • the enzyme the KOD Y7A / V93K mutant was used, and the difference in the amount of HBg 482 bp was compared.
  • KOD-PCNA M73L / D147A was used for PCNA.
  • PCR was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), using Buffer, MgSO 4 attached thereto, 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , 15 pmol primer (SEQ ID NOs: 21 and 22), dNTPs in which 2 mM dTTP was replaced with dUTP (dATP, dUTP , DCTP, dGTP), in a 50 ⁇ l reaction solution containing 1 U enzyme mixed with KOD antibody, 0.002%, 0.02%, 0.2%, 2%, 5% A comparison was made between 10% and PCNA-free and KOD-PCNA M73L / D147A added at 250 ng.
  • the reaction was carried out using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of 94 cycles at 94 ° C. for 2 minutes followed by 35 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 8 blood is used as a sample, and blood is added to a reaction solution containing dUTP in a proportion of 0.002%, 0.02%, 0.2%, 2%, 5%, 10%,
  • the result of carrying out PCR reaction with and without addition of KOD-PCNA M73L / D147A and electrophoresis of the obtained product is shown.
  • -indicates no PCNA, and + indicates that PCNA was added.
  • KOD Y7A / V93K without PCNA addition when 10% of blood was added, inhibition was not observed and amplification was not confirmed.
  • PCNA mutant was added, a firm band was confirmed even if 10% of blood was contained.
  • the PCNA mutant was also shown to be effective in PCR in the presence of dUTP.
  • Example 8 Amplification from blood by addition of PCNA using reaction solution containing dUTP
  • the crude (blood) resistance was improved by addition of PCNA in the PCR reaction system containing dUTP.
  • the enzyme KOD Y7A / V93K mutant, KOD Y7A / P36H / N210D was used, and the difference in the amount of 1.3 kb amplification of HBg was compared.
  • PCNA has Pfu-PCNA M73L / D147A was used.
  • PCR was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), attached buffer, MgSO 4 , 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , 15 pmol primer (SEQ ID NOs: 13 and 14), dNTPs in which 2 mM dTTP was replaced with dUTP (dATP, dUTP , DCTP, dGTP), 0.02%, 0.2%, 0.5%, 2%, 5% %, 10%, and PCNA-free and Pfu-PCNA What added 250 ng of M73L / D147A was compared.
  • the reaction was carried out using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles at 94 ° C. for 2 minutes followed by 35 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1.5 minutes. It was. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 9 blood is used as a sample, and the reaction solution is prepared so that the proportion of blood in the reaction solution is 0.02%, 0.2%, 0.5%, 2%, 5%, 10%.
  • 1 shows the result of electrophoresis of the product obtained by adding Pfu-PCNA M73L / D147A to KOD Y7A / V93K mutant and KOD Y7A / P36H / N210D and performing PCR reaction.
  • -indicates no PCNA, and + indicates that PCNA was added.
  • inhibition was not achieved without addition of PCNA, and amplification was not confirmed from blood.
  • a solid band was confirmed even when 10% of blood was added to the PCNA mutant (FIG. 9).
  • the PCNA mutant was shown to be effective in PCR in the presence of dUTP.
  • Example 9 It was also evaluated whether the crude (plant) tolerance was improved by adding PCNA even in a PCR reaction system containing amplified dUTP from plant lysate by adding PCNA. For comparison, KOD Y7A / P36H / N210D mutant and Taq polymerase were used, and the difference in amplification amount of rbcL 1.3 kb was compared. For PCNA, KOD-PCNA M73L / D147A was used.
  • a rice leaf 3 mm square was added to 100 ⁇ l of Buffer A (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA) and heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes, and used as a lysate.
  • Buffer A 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA
  • the PCR of KOD Y7A / P36H / N210D was performed using KOD-Plus-Ver.
  • the reaction was carried out using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of repeating 94 cycles at 94 ° C. for 2 minutes followed by 35 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C. 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1.5 minutes. .
  • Taq DNA polymerase was manufactured by Toyobo and mixed with Anti-Taq High (manufactured by Toyobo).
  • the reaction was performed by adding 50 ⁇ l of Buffer attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which 2 mM dTTP was replaced with dUTP, and 2.5 U enzyme mixed with the antibody.
  • dNTPs dATP, dUTP, dCTP, dGTP
  • 2 mM dTTP was replaced with dUTP
  • 2.5 U enzyme mixed with the antibody In the reaction solution, plant lysate was added at 2%, 4%, 8% and 16% to the reaction solution, and PCNA-free and KOD-PCNA M73L / D147A added 250 ng were compared.
  • the reaction was performed at 94 ° C.
  • plant lysate was used as a sample, and the reaction solution was prepared so that the proportion of lysate in the reaction solution was 2, 4, 8, 16%, and KOD-PCNA M73L / D147A was added to various enzymes.
  • the result of carrying out PCR reaction and electrophoresis of the obtained product is shown.
  • the enzymes used were KOD Y7A / P36H / N210D mutant and Taq polymerase in total.
  • 1, 2, 8, and 16 indicate the percentage of plant lysate added,-indicates no PCNA, and + indicates that PCNA was added.
  • PCR from body tissues we examined whether PCR is possible using nails, hair, and oral mucosa as a template.
  • a piece of nail cut with a nail clipper and one piece of hair were added to 180 ⁇ l of 50 mM NaOH, crushed by heat treatment at 95 ° C. for 10 minutes, and then neutralized by adding 20 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 8.0). The supernatant was used as a template.
  • the oral mucosa was obtained by suspending mucosa collected with a cotton swab in 200 ⁇ l of water as a template.
  • PCR for HBg 482 bp was performed and the difference in amplification was compared. did. As above, PCR was performed using KOD-Plus-Ver.
  • Each reaction solution was also added with 250 ng of KOD-PCNA M73L / E143R mutant, which is a PCR enhancing factor.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 2 minutes and 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute.
  • 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 11 shows results obtained by performing PCR reaction with various DNA polymerases in the presence of KOD-derived PCNA mutant (M73L / E143R) using nail, hair and oral mucus as samples, and electrophoresis of the obtained products. Indicates.
  • the DNA polymerase used was a total of three types: KOD (wild type) and two KOD mutants (Y7A / V93K, Y7A / P36H / N210D). The left side of each photograph uses dTTP, and the right side uses dUTP. When 1 lane is a nail sample, 2 lane is hair, 3 lane is oral mucosa.
  • Each “+” lane is in the presence of KOD-derived PCNA mutant (M73L / E143R), and “ ⁇ ” indicates no PCNA.
  • KOD-derived PCNA mutant M73L / E143R
  • ⁇ indicates no PCNA.
  • wild-type KOD DNA polymerase was not amplified in the presence of dUTP, but a band was confirmed even in the presence of dUTP in the KOD Y7A / V93K and KOD Y7A / P36H / N210D mutants having decreased base analog detection activity. (FIG. 11).
  • As a result of adding PCNA it was confirmed that the amplification amount was improved as compared with the case where PCNA was not added.
  • KOD KOD
  • Example 11 Amplification evaluation of bisulfite- treated DNA After bisulfite treatment, it was examined whether amplification from DNA containing uracil was possible.
  • the DNA used for bisulfite was KOD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo), and a 17.5 kb PCR product amplified with the primers of SEQ ID NOs: 31 and 32 was used.
  • Bisulfite was MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulfite Modification Kit, and PCR and bisulfite treatment were performed according to the attached instruction manual. Amplification studies are described in KOD-Plus-Ver.
  • PCR is 94 ° C., after 2 minutes of pre-reaction, 98 ° C., 10 seconds ⁇ 60 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute / kb (574 bp, 519 bp, 1004 bp amplification is 1 minute, 1561 bp, 1993 bp amplification is 2 minutes) was performed using a PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of repeating 30 cycles. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 12 shows the results of amplifying targets of various lengths using the bisulfite-treated DNA as a template and comparing the amounts of amplification with and without the addition of KOD-PCNA mutant (M73L / D147A).
  • the left side of each photograph shows the reaction without adding KOD-PCNA (M73L / D147A), and the right side shows the reaction with addition of KOD-PCNA (M73L / D147A).
  • 1 lane is 574 bp
  • 2 lane is 519 bp
  • 3 lane is 1004 bp
  • 4 lane is 1561 bp
  • 5 lane is the result of amplifying a 1993 bp target.
  • Example 12 It was evaluated whether amplified dUTP from stool and gene amplification can be performed in the presence of stool.
  • As the enzyme KOD Y7A / P36H / N210D mutant and Taq polymerase were used, and the difference in amplification of about 700 bp of Salmonella invA gene was compared by real-time PCR using SYBR GREEN I and melting curves.
  • the KOD Y7A / P36H / N210D mutant was also added with KOD-PCNA M73L / D147A added as a PCR enhancing factor.
  • a 10% fecal suspension was heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes.
  • a buffer attached to KOD Dash manufactured by Toyobo
  • stool was added to the reaction solution at 0, 0.
  • the reaction is as follows: Buffer attached to 1 ⁇ Taq (Mg attachment type), 50 copies of Salmonella genome, 4 pmol of primer (same as above), 2 mM dTTP substituted with dUTP (dATP, dUTP, dCTP, dGTP), 4 mM In 20 ⁇ l of a reaction solution containing 1 U of enzyme mixed with MgSO 4 , 1/30000 SYBR GREEN I, antibody, feces were added to the reaction solution at 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0. , 1.5, 2.0, 2.5%, 95 ° C., 30 seconds pre-reaction, 98 ° C., 10 seconds ⁇ 60 ° C. 10 seconds ⁇ 68 ° C., 30 seconds repeated 50 cycles
  • the schedule was performed using LightCycler 2.0 (Roche). After completion of the reaction, a target peak appearing in the latter half of 80 ° C. was confirmed by melting curve analysis.
  • Table 5 shows the Cq values of Example 16.
  • Table 5 shows Cq values (default settings of LightCycler 2.0) of real-time PCR performed in the presence of dUTP and feces.
  • N. D. Indicates that no amplification was observed and no Cq value was obtained. As a result, amplification was not observed when 0.5% stool was added to Taq polymerase, but amplification was confirmed even when 2.5% stool was added to KOD Y7A / P36H / N210D. Further, comparing the presence or absence of PCNA, it was found that the one with PCNA added had a smaller Cq value and showed excellent PCR efficiency.
  • FIG. 14 shows the results of melting curve analysis of the amplification product obtained using PCR in the presence of dUTP and feces.
  • the total number of polymerases used was KOD Y7A / P36H / N210D mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant with KOD-PCNA M73L / D147A added, and Taq polymerase.
  • 1 shows the result of KOD Y7A / P36H / N210D
  • 2 shows the result of adding KOD-PCNA M73L / D147A to KOD Y7A / P36H / N210D
  • 3 shows the result of Taq polymerase.
  • KOD Y7A / V93K, P36H, P36K, P36R, V93K, V93R, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, P36H / H147E, P36K / H147E, P36R / H147E, V93K / H147E, V93K / R147E / H147E, Y7A / P36H / H147E, Y7A / P36R / H147E, Y7A / V93K / H147E, Y7A / V93R / H147E, P36H / N210D, P36K / N210D, P36R / N210D, V93K / N210D, V93R7 / N210D, Y7A / V93K / N210D, Y7A / V93R / N210D, P36H / N
  • PCNA is also a variant of KOD-PCNA M73L / E143R, M73L / R82A / E143A, M73L / R109A / E143A, Pfu-PCNA M73L / D143R, M73L / D147A, M73L / R82A / D143A, M73L / R109A / D143A.
  • the same reaction was performed, and it was confirmed that the PCR efficiency was improved as compared with the case where PCNA was not added.
  • the present invention eliminates the risk of loss and carryover during DNA purification, and further reduces time and cost. Also, in order to prevent contamination by the dUTP / UDG contamination removal method, not only in the research field, but also in the clinical field or forensic field such as genetic diagnosis in which the same sample is amplified many times, or in the microbiological examination in foods and the environment, etc. Can also be widely used.

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Abstract

　塩基類似体を含むＰＣＲにおいて、標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および（ｂ）増幅増強活性を示すＰＣＮＡを含む、前記核酸増幅方法。

Description

核酸増幅法
　本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
　ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
　数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
　一方、ＰＣＲは非常に高感度な検出方法であるため、以前に行ったＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性が問題となる。そこで、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰなどの塩基類似体を含む基質を用いてＰＣＲを行い、増幅産物にウラシル塩基を取り込ませ、次のＰＣＲを行う際にＵｒａｃｉｌ－Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理することで、コンタミネーション（キャリーオーバー）した増幅産物を分解する手法（ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法）がとられている（非特許文献１）。
　しかしながら、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法において、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、反応効率が低下し、増幅産物の量が減少することが問題となっていた。また、ウラシルを含んだ鋳型ＤＮＡを増幅する際にも、反応効率が低下し、増幅産物の量が減少することが知られている。
　そこで、ｄＵＴＰが存在していても、また鋳型ＤＮＡにウラシルが含まれていても、通常のｄＴＴＰを用いたときや通常のアデニン、シトシン、グアニン、チミンからなる鋳型を増幅するときのように十分な増幅量を示す核酸増幅法が求められていた。
特許４３９５３７７ 特表２００６－５０７０１２
Ｇｅｎｅ，　Ｖｏｌ．９３（１），　１２５-１２８　（１９９０）
　そこで、本発明は塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、塩基類似体存在下の遺伝子の増幅に適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
　前記目的を達成するための本発明の核酸増幅方法は、塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、ウラシルなどの塩基類似体に対して減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡと、を用いることを特徴とする。
　すなわち、本発明者は塩基類似体を含む核酸増幅の反応組成において、減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡとを用いることで、塩基類似体が存在しても、通常の塩基存在下と同様以上の増幅量を示すＰＣＲが可能になることを見いだし、本発明を成すに至った。
　代表的な本願発明は以下の通りである。
［１］
　塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
（ｂ）ＰＣＮＡ
を含む、前記核酸増幅方法。
［２］
　減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、以下の（ａ１）から（ａ３）のいずれかで示されるものである、［１］に記載の核酸増幅方法。
（ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性が８０％以上またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
［３］
　減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［２］に記載の核酸増幅法。
［４］
　ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、［１］～［３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［５］
　ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変である、［１］～［４］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［６］
　ＰＣＮＡが、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示されるものである、［１］～［５］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
（ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
［７］
　ＰＣＮＡが配列番号１１または配列番号１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、［１］～［６］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［８］
　精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する［１］～［７］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［９］
　生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである［１］～［８］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１０］
　以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）プライマー対
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
［１１］
　［１０］に記載の試薬を含むキット。
　本発明によって、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる
ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼおよびその種々の改変体のウラシルの検出活性の評価 ＰＣＮＡの増幅増強活性の評価 ＰＣＮＡ添加による長鎖ターゲットの増幅比較 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅評価 ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅 ＰＣＮＡ添加による爪、髪、口腔粘膜からの増幅 ＰＣＮＡ添加によるバイサルファイト処理後のＤＮＡからの増幅 ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた糞便存在下からの増幅評価
　以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号のあとに「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。
　また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」などという場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
（１）核酸増幅方法
　本発明の実施形態の一つは、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
（ｂ）ＰＣＮＡ
を含む、前記核酸増幅方法である。
　本発明の方法において、核酸の増幅方法はＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法であれば特に限定されない。典型的にはＰＣＲであるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
　本発明における塩基類似体とは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）以外の塩基を示し、例えば、ウラシル（Ｕ）やイノシン（Ｉ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明における塩基類似体を含む反応組成とは、核酸増幅する組成に、塩基類似体を含むものであって、塩基類似体は、ＤＮＡ合成用基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））として反応組成に含まれてもよく、また核酸増幅に用いられるプライマーに含まれていてもよく、また増幅対象ＤＮＡに含まれていてもよい。
　本発明の核酸増幅法に適用される核酸は、ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能なものであればその長さや配列、ＧＣ含量の違いなどに制約を受けず、特に限定されない。
　前記核酸は、典型的には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）で構成されるＤＮＡであるが、本発明の核酸増幅方法ではＤＮＡポリメラーゼとして「減少した塩基類似体（本明細書では、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を塩基類似体と称する。）検出活性」を有する変異体を用いるので、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。
　以下、本明細書では特に断りのない限り、ＤＮＡを構成する塩基には、上記のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔおよび塩基類似体のいずれを含んでも良いものとする。
　本発明の核酸増幅法に適用される核酸は、ｄＵＴＰを取り込ませる場合は、核酸にＴが含まれることが必要であり、Ｔが１０個以上含まれていることが好ましい。
［生体試料］
　本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記生体試料には、食品などの加工製品、土壌などの自然環境や、事業所、住居などの生活環境の中に存在するものであって、生体に由来するものも含まれる。
　本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、精製工程を経ていないものであってもよい。すなわち、本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であってもよい。
　精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法がある。本発明における核酸増幅法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅してもよい。
　「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。
　臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。
　本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、バイサルファイト処理を経たものであってもよい。すなわち、本発明における核酸増幅法は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを増幅する方法であってもよい。
　ＤＮＡのメチル化を解析する手法として、バイサルファイト処理後のＤＮＡをシークエンスする方法が取られている。バイサルファイト処理は非メチル化シトシンをウラシルに変換し、一方、メチル化シトシンは変換されないことから、シークエンスを確認することでメチル化シトシン、非メチル化シトシンを区別することができる。
　本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
のほか、
（ｃ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（ｅ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。
　上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
（１．１）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
　本発明の方法に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、「減少した塩基類似体検出活性」を有する。
（１．１．１）塩基類似体検出活性
　塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。（塩基類似体検出活性の評価方法については、後述する。）
　通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能がほぼ完全に阻害されるが、本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性を減少させるよう、野生型のアミノ酸配列に改変を施した変異体である。したがって、ウラシルやイノシンなどの塩基類似体が存在していても、ポリメラーゼ機能が完全に阻害されることなくＤＮＡ合成（ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応）が進む。
＜塩基類似体検出活性の測定方法＞
　塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ～２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。
　本明細書において塩基類似体検出活性の測定は、以下の方法に従う。
（反応液の調製）
　活性測定対象のＤＮＡポリメラーゼ　１Ｕ（ＤＮＡポリメラーゼの活性測定法については、（１．１．３）で後述。）と、ベースとなる緩衝液（活性測定対象がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）またはその変異体の場合、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを、活性測定対象がＰｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）またはその変異体の場合、Ｐｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用いる。その他のＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体の場合は至適の反応ＢｕｆｆｅｒもしくはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを代用して用いる。ここで１０×とは反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されていることを示す。
　ＰＣＲの反応には１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒに１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４と、
０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）と、
約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー対と、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）と、
を含む５０μｌの反応液を調製する。
（ＰＣＲ）
　前記反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（増幅産物の検出）
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認する。
（１．１．２）塩基類似体検出活性が「減少した」かどうかの判断
　変異型ＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性が「減少した」とは、変異型ＤＮＡポリメラーゼの塩基類似体検出活性が野生型のそれと比較して減少していることを言う。
　本明細書では、（１．１．１）に記載の＜塩基類似体検出活性の測定方法＞により変異型と変異がない野生型との塩基類似体検出活性を比較し、変異型の方が野生型より多くのＰＣＲ産物を得たことが確認できれば、その変異型ＤＮＡポリメラーゼは「減少した塩基類似体検出活性」を有すると判断する。
ただし、前記方法によっても野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
（１．１．３）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
　本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは以下のように活性を測定する。
　酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ　塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ　塩化マグネシウム１５ｍＭ　ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ　［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％　トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ　仔牛胸腺ＤＮＡ
（１．２）ＤＮＡポリメラーゼの改変箇所
（１．２．１）
　本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼに、塩基類似体検出活性を減少させるよう改変を施した変異体である。
　ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。
　なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
　このようなファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ変異体としては、具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の１～４０番目、および７８～１３０番目によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。
　ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、上述の通り、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７（配列番号７）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ－１（配列番号８）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。
（１．２．２）
　本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、すなわち、
（ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。
　上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ａ２）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
　アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
　本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
　上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、以下の（ａ３）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
　ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１６０個、好ましくは２～１２０個、より好ましくは２～８０個、更に好ましくは２～４０個であり、より更に好ましくは２～５個である。
　なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に対応する、ウラシルの結合に関すると想定されているアミノ酸を含む表現である。
　本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。
　配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
　本明細書では、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
　なお、特許文献１または２には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
（１．２．３）
　本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体は、より好ましくは、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、または９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。
　より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。
　前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１．２．４）３’－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変
　本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変を含んでいてもよい。
　３’－５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３’－５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ－１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１～１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目のアミノ酸からなる３’－５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
　なお、「配列番号１に示される１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。
　上記の３’－５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。より好ましくは、配列番号１における１４１、１４２、１４３、１４７、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが挙げられる。
　前記改変の具体例としては、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つが挙げられる。これらの改変体は、前記改変により３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
　なお、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（－））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して５０％（好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、さらに好ましくは１％、さらに好ましくは０．１％、さらに好ましくは０．０５％、さらに好ましくは０．０３％）以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する、改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。
　前記改変の別の具体例としては、アミノ酸の改変がＨ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つが挙げられる。これらの改変体は、前記改変によりエキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼである。
　３’－５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
　例えば、米国特許第６９４６２７３号に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第３８９１３３０号等に記載されている。
（１．３）ＰＣＮＡ
　本発明の核酸増幅方法には、ＰＣＮＡを用いる。
ＰＣＮＡとは、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖核抗原）の略称であり、由来は特に限定されないが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。
　パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
　サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
　アミノ酸配列が知られているものとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（配列番号１２）（以下、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡとも表記する）、および、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ－１株由来のもの（配列番号１１）（以下、ＫＯＤ－ＰＣＮＡとも表記する）などがある。
　ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｃ（ＲＦＣと略称される。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。
　本発明で用いるＰＣＮＡは増幅増強活性を示すことが好ましい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを「ＤＮＡにロードする」と言い、通常はＲＦＣと共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。増幅増強活性を示す変異体とは単独でＤＮＡにロードする変異体を示し、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。
　ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号１１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号１２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。
（１．３．１）増幅増強活性
　増幅増強活性はＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。これにより、ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードできるかどうかを確認することができる。
　本明細書においては、増幅増強活性はｄＵＴＰを含んだ反応系で、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体を用いて評価する。
　具体的には以下の方法である。
（ｉ）ＰＣＲ
　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ添付を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂの増幅には配列番号１３及び１４、２．８ｋｂの増幅には配列番号１５及び１６、３．６ｋｂの増幅には配列番号１７及び１８）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、０．８μｇのＫＯＤ抗体を混合した１Ｕ　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ　Ｖ９３Ｋ変異体（減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１ｍｉｎ／ｋｂ（１．３ｋｂの増幅には１分３０秒、２．８ｋｂの増幅には３分、３．６ｋｂの増幅には４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。
　野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。
（１．４）ＰＣＮＡの変異箇所
（１．４．１）
　本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは、増幅増強活性を示す変異体であってもよい。そのような変異体として、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示される変異型が例示できる。
（ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
（ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
　上記（ｂ２）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１３　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡを得ることができる。バリアントＰＣＮＡには、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
　上記（ｂ３）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡが有するアミノ酸配列と配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。例えば、前記（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において改変が施されており、かつ、増幅増強活性を保持するものが挙げられる。
（１．４．２）
　本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡとして、より好ましいのは、配列番号１１または１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である。
　本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。
　また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。
（１．４．３）
　本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図１３で示したように配列番号１１および１２に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号１１の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。
　増幅増強活性を示す変異体（単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体）は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
　より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであってもかまわないし、その両方の形態が混在していても良い。
　本発明の核酸増幅方法に用いるＰＣＮＡは、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０%以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。
（１．５）アミノ酸改変の導入方法
　本発明の核酸増幅方法に用いるＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＰＣＮＡを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
　アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。以下、ＤＮＡポリメラーゼの改変を例にとり説明する。
　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子（野生型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
　なお、上記方法において、野生型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、そのアミノ酸配列が明らかになっている場合は、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡを合成して作製することができる。あるいは、前記ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＰＣＮＡの由来となる生物種よりクローニングして取得することができる。
　次に、上記の方法などで得られた改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
　上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
　ＰＣＮＡの改変についても、ＤＮＡポリメラーゼの改変と同様に行うことができる。
（２）核酸増幅試薬
　本発明の実施形態の一つは、以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬である。本明細書において、試薬とはその態様は特に限定されず、キットの形態であっても良い。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）プライマー対
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
必要に応じさらにその他の試薬類を含んでも良い。
この試薬を用いて、塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させることができる。
　上記の本発明の核酸増幅試薬において、ＤＮＡ合成基質は、典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸で構成されるが、本発明の核酸増幅方法ではｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ以外のデオキシヌクレオチド三リン酸、例えばｄＵＴＰやｄＩＴＰなどを含むものであってもよい。
　上記の本発明の核酸増幅試薬において、プライマーは、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、チミンの４塩基からなるヌクレオチドで構成されるが、本発明の核酸増幅方法ではアデニン、シトシン、グアニン、チミン以外のヌクレオチド、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。
（２．１）ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法
　ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法においてはＤＮＡ合成基質にｄＵＴＰ（デオキシウリジン）が用いられる。ｄＵＴＰの入手経路は特に限定されないが、市販のものを使用することができる。反応液中のｄＵＴＰの濃度は特に限定されないが、コンタミネーション除去の効率の観点から、好ましい下限は０．５μＭ以上、より好ましくは５０μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上である。またＰＣＲ効率の観点から、ｄＵＴＰは高濃度で含まれていてもよい。好ましい上限は１ｍＭ以下、より好ましくは０．６ｍＭ以下である。
　また、ＰＣＲ効率の観点からｄＴＴＰとｄＵＴＰが混在していてもよい。ｄＴＴＰとｄＵＴＰの比率は１００：１～１：１００が好ましい。より好ましくは１０：１～１：１０であり、さらに好ましくは１：１であるが、これらに限定されない。
　以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
（実施例１）
ＫＯＤ変異体の作製
　サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
　変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２５）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例２）
Ｐｆｕ変異体の作製
　パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
　変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２６）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
　実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１および表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）
（実施例３－１）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
　実施例１および２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。
（実施例３－２）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価
　ウラシルの検出活性は、前述の（１．１．１）に記載の＜塩基類似体検出活性の測定方法＞に従い測定した。
　結果、サーモコッカス・コダカラエンシス（ＫＯＤ）の野生型のＤＮＡポリメラーゼでは０．５μＭのｄＵＴＰの添加で阻害がかかり、ＰＣＲ産物が確認できないところ、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒのウラシル結合ポケットへの変異体では、多少のｄＵＴＰを添加してもＰＣＲ産物の確認が出来た。またＰ３６ＫとＰ３６Ｋ／Ｙ７Ａを比較すると、単変異に比べ２重変異を入れたものの方が、高濃度のｄＵＴＰ添加に寛容で、増幅量が多い結果となった（図１、図２）。
　図１は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの７種のＫＯＤ変異体の計８種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
　野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２－６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、７種の変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。中でも、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの６種については、ｄＵＴＰ終濃度０．５－２００μＭのすべての範囲で増幅産物が確認された。
　図２は、まず、野生型（ＫＯＤ）、Ｎ２１０Ｄの変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ　Ｎ２１０Ｄ）およびＩ１４２Ｒの変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ　Ｉ１４２Ｒ）の３種を用意し、さらに、ＫＯＤおよびＫＯＤ　Ｎ２１０ＤのそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（計８種）、ＫＯＤ　Ｉ１４２ＲにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。また、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの二重変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤに、さらに、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。これらの計１５種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
　野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２－６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。野生型と３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異型（Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ）では、３‘－５’エキソヌクレアーゼ欠損の変異型の方がｄＵＴＰ耐性濃度が高いことが示された。また同じＹ７Ａの変異をもつ変異型でも３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠損させた変異（Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ）と組み合わせることでより高いｄＵＴＰ濃度まで耐性が示された。同様にＶ９３ＱとＶ９３Ｑ／Ｎ２１０Ｄについても、３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠損させたＶ９３Ｑ／Ｎ２１０Ｄの方が高いｄＵＴＰ濃度まで耐性が示された。これらのことから、ウラシル結合ポケットへの変異に加え、３‘－５’エキソヌクレアーゼに欠損を与える変異を加えるとｄＵＴＰの耐性能が向上することがわかる。
　その他のＫＯＤ変異体でも同様の実験を行い、表３のｄＵＴＰ耐性の欄に増幅が見られたｄＵＴＰ濃度をまとめた。０は０．５μＭのｄＵＴＰでＰＣＲができなかったことを示し、同様に０．５や５、１００は、それぞれ０．５、５、１００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られたが、それぞれ１段階高い５、１００、２００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られなかったことを示す。＞２００は２００μＭを添加しても増幅が見られたことを示す。
　結果、Ｙ７、Ｐ３６、Ｖ９３のウラシル結合ポケット変異はｄＵＴＰ耐性濃度を高くする傾向があり、エキソ（＋）に比べ、エキソ（－）の方が、ｄＵＴＰ耐性濃度が高くなる傾向が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＫＯＤ変異体の評価結果を表３にまとめた。表３において、ｄＵＴＰ耐性における１１段階評価は、０に近いほど塩基類似体検出活性が強く、１０に近いほど塩基類似体検出活性が低いことを表す。また表３中、○は十分に増幅した、△はある程度増幅した、×は増幅しないことを表している。
　ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方増幅量が多いといった同様の結果が得られた。
（実施例３－３）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた長鎖ＤＮＡ増幅の評価
　表２に記載のＫＯＤ変異体を用いて、ｄＴＴＰなしのｄＵＴＰのみの条件でも、１．３ｋＢを超える長鎖ＤＮＡが増幅するかどうか調べた。表２ではエキソ領域のアミノ酸変異と、ウラシル結合に関するアミノ酸変異の両方が示されている。エキソ領域のアミノ酸変異に関して、エキソ（＋）とあるのは野生型を含め３‘－５’エキソヌクレアーゼを保持している変異、エキソ（－）とあるのは３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させた変異であることをそれぞれ示す。
　ｄＵＴＰを含むＰＣＲにおいてＨｕｍａｎ　β－グロビンの１．３ｋｂｐおよび、２．８ｋｂｐ、３．６ｋｂｐの増幅を比較した。この際、各酵素は、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ変異体を用いた。
　ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂｐの増幅では配列番号１３及び１４、２．８ｋｂｐの増幅では配列番号１５および１６、３．６ｋｂｐの増幅では配列番号１７および１８）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行った。
　またコントロールとして、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼでの増幅も行った。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
　それぞれ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図３は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの１０種のＫＯＤ変異体との計１１種を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ　β－グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図３において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。さらに対照として、Ｔａｑで同様の検討を行った。また、野生型ＫＯＤを用いて、通常のｄＴＴＰでＰＣＲを行った結果も合わせて示す。
　図４は、まず野生型（ＫＯＤ）のエキソ領域に、Ｈ１４７Ｅ、Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａのいずれかの変異を加え、さらにそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈのいずれかの変異を加えたもの（計２４種）を作製し、これらの変異体を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ　β－グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図４において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。
　増幅量について、Ｖ９３ＫとＰ３６Ｈとの比較、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈとの比較、Ｖ９３ＫとＰ３６Ｒとの比較、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｒとの比較をそれぞれ行った結果、Ｖ９３Ｋの変異より、Ｐ３６位への変異の方が増幅量が多く、長いターゲットまで増幅できることが確認された。また、単変異のものよりウラシル結合ポケットへ二重変異入れたものの方が、増幅量が多くなった。これらの変異体はＴａｑでは増幅できないような長鎖長を増幅することが可能となっていた（図３）。
　また、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものとエキソ（－）の変異体であるＮ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異体に、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものを比較するとエキソ（－）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果となった（図３および図４）。
　さらに、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものとＰＣＲ効率が向上する変異体であるＨ１４７ＥにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨおよびＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの各変異を施したものを比較すると、Ｈ１４７Ｅ変異体の方が多い増幅量を示された。これはＨ１４７Ｅの改変の効果がウラシル結合ポケットへの改変とは独立しており、Ｈ１４７Ｅの改変による効果により増幅量が増えたことが考えられる。（図３および図４）
　ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方が増幅量が多いといった同様の結果が得られた。
（実施例４）
（実施例４－１）
ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体の作製
　サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
　変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号２７）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例４－２）
Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体の作製
　パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
　変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号２８）（ｐＰｆｕＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
　実施例４で作製したプラスミドを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例４－３）
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
　実施例４－２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
（実施例４－４）
ＰＣＮＡの評価
　ＰＣＮＡの効果を確認するため、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ　β－グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。この際、ＤＮＡポリメラーゼは、実施例３で作製した変異体のうち、ＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ変異体を用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、およびを０．２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３及び１４）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図５は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの計７種である。
　ＰＣＮＡの添加がない場合（レーン８）やＰＣＮＡとしてＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ変異体を用いた場合（レーン１）では、バンドがわずかに見出されたに過ぎなかったが、他のＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体を添加した場合は、増幅量が多くなり、より明確なバンドが確認された。
　ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡがＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる（図５）。
　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。
（実施例５）
変異型ＰＣＮＡを用いた長鎖ターゲットの増幅評価
　ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で長鎖ターゲットの増幅（ＨＢｇ８．５ｋｂ）を実施し、変異型ＰＣＮＡありなしで評価した。
　酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの８．５ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
　上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭまたは２．０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には５０ｎｇのヒトゲノム（Ｒｏｃｈｅ製）を用いた。また、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、９分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
　図６は、ｄＵＴＰを含む反応液８．５ｋｂの長鎖ターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）あり／なしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の１，２レーン目はＰＣＮＡなし、３，４レーン目はＰＣＮＡを添加したこと示す。１、３レーン目は１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２、４レーン目は２ｍＭ　ＭｇＳＯ４の増幅を示す。
　結果、変異型ＰＣＮＡなし、ＫＯＤ　Ｎ２１０Ｄ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨではＭｇＳＯ４が１．５ｍＭでも２．０ｍＭでも増幅は見られなかったものの、変異型ＰＣＮＡを添加することで、８．５ｋｂのしっかりしたバンドを増幅することができた（図６）。
（実施例６）
変異型ＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価
　ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で血液から様々な長さのターゲットの増幅を実施し、変異型ＰＣＮＡありなしで評価した。
　酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐ、１．３ｋｂ、２．８ｋｂ、３．６ｋｂ、５．７ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
　上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（４８２ｂｐの増幅は配列番号２１および２２、１．３ｂｐの増幅は配列番号１３および１４、２．８ｋｂの増幅は配列番号１５および１６、３．６ｋｂの増幅は配列番号１７および１８、５．７ｋｂの増幅は配列番号２３および２４）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（４８２ｂｐの増幅は１分、１．３ｂｐの増幅は１．５分、２．８ｋｂの増幅は３分、３．６ｋｂの増幅は４分、５．７ｋｂの増幅は６分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分／ｋｂ（上記と同様）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ
　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図７は、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰを含む反応液で様々な長さのターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）ありなしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の－はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。１レーン目は４８２ｂｐ、２レーン目は１．３ｋｂ、３レーン目は２．８ｋｂ、４レーン目は３．６ｋｂ、５レーン目は５．７ｋｂの増幅を示す。
　結果、ｄＴＴＰとｄＵＴＰで増幅量を比べると、ｄＵＴＰで大きく阻害が見られることがわかる。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼでは、ｄＴＴＰでは４８２ｂｐが増幅しているところ、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐの増幅は確認できなかった。ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、ｄＴＴＰではすべてのターゲットで良好な増幅が見られているが、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐ以上のターゲットでほとんど増幅が見られなかった。そこに変異型ＰＣＮＡを添加した結果は、Ｔａｑでは大差はないものの、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、変異型ＰＣＮＡを添加することで、増幅できなかった２．８ｋｂ以上のターゲットを増幅することができた（図７）。ＰＣＮＡ変異体の添加でｄＵＴＰ存在下、ｄＴＴＰと同等の増幅ができることが示された。また、ＰＣＮＡの添加でクルードサンプルから直接ＰＣＲも可能であることが示された。
（実施例７）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
　ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
　酵素には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
　ＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２１および２２）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図８は、試料として血液を用い、ｄＵＴＰを含む反応液に血液を０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％ の割合になるよう添加して、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの添加ありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の－はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
　結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋでは血液を１０％添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図８）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。
（実施例８）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
　図８と同様、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
　酵素には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄを用い、ＨＢｇの１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＰｆｕ－ＰＣＮＡ
　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
　ＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３および１４）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．０２％、０．２％、 ０．５％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＰｆｕ－ＰＣＮＡ
　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図９は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を０．０２％、０．２％、０．５％、２％、５％、１０％ になるよう反応液を調製して、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体および、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＰｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の－はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
　結果、ＰＣＮＡ添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図９）。図８と同様、ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。
（実施例９）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
　ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
　比較には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ　１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
　鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
　ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２９および３０）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃　３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図１０は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計２種である。
　各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、－はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したことを示す。
　結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを４％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図１０）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰを含む反応液でも効果があることが示された。
　一方、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
（実施例１０）
体組織（爪、髪、口腔粘膜）からのＰＣＲ
　爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、ＰＣＲができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は１本を、５０ｍＭ　ＮａＯＨ１８０μｌに添加し、９５℃１０分の熱処理で破砕を行い、その後、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を２００μｌの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
　酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
　上記と同様、ＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２１および２２）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル１μｌを用いた。また、各反応液にＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
　反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図１１は、試料として爪、髪、口腔粘液を用い、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下で行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計３種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは爪を試料とした場合、２レーンは髪、３レーンは口腔粘膜である。それぞれの「＋」レーンは、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の存在下であり、「－」はＰＣＮＡなしであることを示す。
　結果、野生型のＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰ存在下で増幅が確認されないところ、減少した塩基類似体検出活性を持つＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではｄＵＴＰ存在下でもバンドが確認された（図１１）。そこにＰＣＮＡを添加した結果、添加していないものと比べ増幅量が向上していることが確認された。
　ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、体組織（爪、髪、口腔粘膜）からの増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。またこれらに、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を添加すると、上記と同様、増幅量の向上が確認できた。
（実施例１１）
バイサルファイト処理済みＤＮＡの増幅評価
　バイサルファイト処理後、ウラシルが含まれるＤＮＡからの増幅ができるかを検討した。メチル化の影響をなくすため、バイサルファイトに供するＤＮＡは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用い、配列番号３１および３２のプライマーで増幅した１７．５ｋｂのＰＣＲ産物を用いた。バイサルファイトはＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ　Ｘｃｅｅｄ　Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用い、ＰＣＲ、バイサルファイト処理はそれぞれ添付の取扱い説明書に準じて行った。増幅の検討はＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（５７４ｂｐの増幅は配列番号３３および３４、５１９ｂｐの増幅は配列番号３５および３６、１００４ｂｐの増幅は配列番号３５および３７、１５６１ｂｐの増幅は配列番号３８および３９、１９９３ｂｐの増幅は配列番号３８および４０）、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、上記バイサルファイト処理済みのＤＮＡ２０ｎｇを添加し、ＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体の添加無しと２５０ｎｇ添加したものを比較した。ＰＣＲは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（５７４ｂｐ、５１９ｂｐ、１００４ｂｐの増幅は１分、１５６１ｂｐ、１９９３ｂｐの増幅は２分）を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図１２は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを鋳型として様々な長さのターゲットを増幅し、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）の添加ありなしで増幅量を比較した結果を示す。各写真の左側がＫＯＤ－ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加せずに反応した場合、右側がＫＯＤ－ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加して反応した場合である。１レーンは５７４ｂｐ、２レーンは５１９ｂｐ、３レーンは１００４ｂｐ、４レーンは１５６１ｂｐ、５レーンは１９９３ｂｐのターゲットを増幅した結果を示す。結果、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加していない反応では５７４ｂｐなど増幅できないターゲットがあるところ、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものでは全てのターゲットでしっかりとした増幅が確認された。また増幅量もＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものの方が多い結果となった（図１２）。
（実施例１２）
糞便からの増幅
　ｄＵＴＰ、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子約７００ｂｐの増幅の違いをＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲ、および融解曲線で比較した。ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。
　阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号４１および４２）、 ２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、１／３００００　ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、ＫＯＤ抗体と混合した０．４Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃　１０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に１００ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×Ｔａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ別添タイプ）、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１／３００００　ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃　１０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。
　それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。
　実施例１６のＣｑ値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５はｄＵＴＰ、糞便存在下で行ったリアルタイムＰＣＲのＣｑ値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０のデフォルト設定）を示す。Ｎ．Ｄ．は増幅が見られず、Ｃｑ値が求められなかったことを示す。
　結果、Ｔａｑポリメラーゼでは０．５％の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは２．５％の糞便を添加しても増幅が確認された。また、ＰＣＮＡありなしを比較すると、ＰＣＮＡを添加したものの方が、Ｃｑ値が小さく、優れたＰＣＲ効率を示していることがわかった。
　図１４は、ｄＵＴＰ、糞便存在下でＰＣＲを用い、得られた増幅産物の融解曲線解析の結果を示す。用いたポリメラーゼはＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種である。
　１はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、２はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を、３はＴａｑポリメラーゼの結果を示す。
　結果、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤではｄＵＴＰ、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、２．５％を添加しても、目的ピークを確認することができた。ＰＣＮＡを添加したものでも同様に、２．５％の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Ｔａｑポリメラーゼでは０．２５％の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された（図１４）。
　ＫＯＤの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
　またＰＣＮＡも、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べＰＣＲ効率の向上が確認できた。
　Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　本発明によって、ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。また、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。

Claims (11)

  1. 塩基類似体を含む反応組成で核酸を増幅させる方法であって、前記反応組成に、
    （ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体、および
    （ｂ）ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ）
    を含む、前記核酸増幅方法。
  2. 減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、以下の（ａ１）から（ａ３）のいずれかで示されるものである、請求項１に記載の核酸増幅方法。
    （ａ１）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性が８０％以上またはそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
    （ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
  3. 減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の核酸増幅法。
  4. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する変異体である、請求項１～３のいずれかに記載の核酸増幅法。
  5. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変である、請求項１～４のいずれかに記載の核酸増幅法。
  6. ＰＣＮＡが、以下の（ｂ１）から（ｂ３）のいずれかで示されるものである、請求項１～５のいずれかに記載の核酸増幅方法。
    （ｂ１）配列番号１１または配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、下記（ｘ）および（ｙ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチド。
    （ｘ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
    （ｙ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
    （ｂ２）（ｂ１）で示されるＰＣＮＡにおいて、さらに、（ｘ）および（ｙ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
    （ｂ３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
  7. ＰＣＮＡが配列番号１１または配列番号１２の、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項１～６のいずれかに記載の核酸増幅方法。
  8. 精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する請求項１～７のいずれかに記載の核酸増幅法。
  9. 生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである請求項１～８のいずれかに記載の核酸増幅法。
  10. 以下の（ａ）から（ｅ）を含む、核酸増幅反応を行うための試薬。
    （ａ）減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの変異体
    （ｂ）ＰＣＮＡ
    （ｃ）プライマー対
    （ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
    （ｅ）Ｍｇイオンを含むバッファー溶液
  11. 請求項１０に記載の試薬を含むキット。
     
     
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