WO2015122432A1 - 核酸増幅の正確性を向上させる方法 - Google Patents

核酸増幅の正確性を向上させる方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015122432A1
WO2015122432A1 PCT/JP2015/053760 JP2015053760W WO2015122432A1 WO 2015122432 A1 WO2015122432 A1 WO 2015122432A1 JP 2015053760 W JP2015053760 W JP 2015053760W WO 2015122432 A1 WO2015122432 A1 WO 2015122432A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcna
dna polymerase
nucleic acid
amino acid
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/053760
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
弘嵩 松本
哲大 小林
Original Assignee
東洋紡株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東洋紡株式会社 filed Critical 東洋紡株式会社
Priority to JP2015562843A priority Critical patent/JP6638399B2/ja
Publication of WO2015122432A1 publication Critical patent/WO2015122432A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to the field of nucleic acid amplification. More specifically, the present invention relates to a method for improving accuracy in a PCR reaction.
  • the PCR (Polymerase chain reaction) method is (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of primer to template single-stranded DNA, (3) DNA
  • This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating three cycles of three steps of extending the primer using a polymerase as one cycle.
  • This method can amplify the target nucleic acid hundreds of thousands of times from a trace amount sample such as several copies, so it can be used not only for research purposes but also in forensic fields such as genetic diagnosis and clinical diagnosis, or for microbial testing in food and the environment. Etc. are also widely used.
  • Important points in performing PCR include amplification efficiency and high accuracy.
  • the accuracy of PCR is important in cloning of a target gene, PCR amplification at the time of preparing a library for sequence analysis, and the like.
  • mismatch error the frequency of mismatch errors largely depends on the strength of the 3'-5 'exonuclease activity (repair activity) of the DNA polymerase used.
  • mismatch error another measure is the frequency of repeat sequence replication errors (slippage errors) due to enzyme slipping. Slippage errors cannot be repaired with 3'-5 'exonuclease activity. As described above, the two kinds of scales are generated due to completely different causes.
  • DNA polymerase belonging to family B is, for example, a thermostable DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (PfufDNA polymerase; Patent Document 1), a thermostable DNA polymerase derived from Thermococcus toralis (Ti ( Vent) polymerase, Patent Document 2), thermostable DNA polymerase derived from Pyrococcus kodakaraensis KOD1 (former name: Pyrococcus sp. KOD1), and the like are known.
  • DNA polymerase belonging to Family B Since these DNA polymerases belonging to Family B have 3′-5 ′ exonuclease activity (Proof reading activity / proofreading activity), accuracy is higher than that of DNA polymerase belonging to Family A (pol type I) such as Taq DNA polymerase. Is excellent.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Patent 3453397 JP 06-007160 A Patent 3132624 WO2007 / 004654 British patent 6333158 Patent 4395377 Special table 2006-507012
  • an object of the present invention is to provide a method for improving the accuracy of nucleic acid amplification by reducing mismatch errors and slippage errors when a repeat sequence is amplified. Furthermore, the other object of this invention is to provide the reagent kit suitable for said objective. In summary, an object of the present invention is to provide an improved PCR method and a PCR reaction reagent suitable for PCR amplification at the time of preparing a library for cloning and sequence analysis with improved PCR accuracy.
  • the present inventor has reduced the mismatch error in nucleic acid amplification and amplified repeat sequences by adding Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) in addition to DNA polymerase belonging to Family B as a result of intensive studies. As a result, the present invention has been completed.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • the present invention has the following configuration.
  • a method for improving the accuracy of nucleic acid amplification which comprises a DNA polymerase belonging to family B and Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) in a reaction solution.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • the improvement in the accuracy of nucleic acid amplification may be a reduction in mismatch error and / or a reduction in slippage error when a repeat sequence is amplified.
  • PCNA Cell Nuclear Antigen
  • PCNA is at least one of (a) an N-terminal region consisting of amino acids corresponding to the 82nd, 84th and 109th amino acids, and (b) a C-terminal region consisting of amino acids corresponding to the 139th, 143rd and 147th amino acids
  • PCNA is a variant in which the amino acid at position 142 (corresponding to position 143 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2) is changed to a basic amino acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 [1 ]
  • [6] The nucleic acid amplification method according to any one of [1] to [5], wherein the DNA polymerase belonging to Family B is an archaea-derived DNA polymerase.
  • [8] The nucleic acid amplification method according to any one of [1] to [5], wherein the DNA polymerase belonging to Family B is an archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity.
  • a kit comprising a reagent for performing the nucleic acid amplification method according to any one of [1] to [8].
  • the present invention can reduce nucleic acid amplification (PCR) errors (for example, mismatch errors and / or slippage errors when a repeat sequence is amplified). As a result, it is possible to reduce the time and cost of cloning, which took time to find a sequence free from amplification errors. Furthermore, in sequence, accurate data and sequence information can be obtained by performing nucleic acid amplification (PCR) by reducing nucleic acid amplification errors (for example, mismatch errors and / or slippage errors when a repeat sequence is amplified). I can expect that.
  • This technique can be widely used not only in the research field, but also in the clinical field such as genetic diagnosis or the field of forensic medicine, or in the examination of microorganisms in food or the environment.
  • FIG. 6 shows the results of evaluating the influence of KOD-PCNA on the accuracy of archaeal DNA polymerase mutants having reduced base analog detection activity. It is the result of evaluating the influence of Mja-PCNA on the accuracy of KOD DNA polymerase.
  • mutant PCNA and “PCNA mutant” means “mutant type” and “mutant”, which means that the amino acid sequence is different from that of conventionally known PCNA. Yes, it does not distinguish between human and natural mutations. The same applies to mutants of DNA polymerase.
  • the nucleic acid amplification method with improved PCR accuracy according to the present invention is characterized in that the reaction solution contains a DNA polymerase belonging to Family B and Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA).
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • PCR accuracy means the accuracy of base incorporation during DNA synthesis.
  • Methods for evaluating the accuracy of PCR include a method using a ribosomal protein S12 (rpsL) gene involved in streptomycin resistance, a method of cloning and sequencing an amplification product, and the like.
  • rpsL ribosomal protein S12
  • a method of cloning and sequencing an amplification product is used.
  • PCR amplification is performed with a primer capable of amplifying an arbitrarily selected region using genomic DNA as a template.
  • the amplified product is cloned into a vector, a plurality of clones are picked up, the base sequence is confirmed by sequencing, and the ratio of error to the number of amplified bases is calculated.
  • the template is genomic DNA containing a repeat sequence
  • the template is calculated by determining the ratio of deletion or insertion errors occurring in the repeat sequence.
  • PCR is performed with and without PCNA addition.
  • the PCR reaction composition it can be amplified except that 15 pmol primer pair (SEQ ID NO: 18 and 19) is used as a primer pair and 50 ng human genomic DNA (Roche Applied Science) is used as a template. It is not limited.
  • the PCR cycle may be performed under conditions suitable for each DNA polymerase. In order to make the amount of amplification uniform with or without the addition of PCNA, the number of cycles is set for each of the cases with and without PCNA addition.
  • Confirmation of the amount of amplification is performed by performing agarose electrophoresis on 5 ⁇ l of the reaction solution after completion of the PCR reaction, and after confirming the strength of the amplified DNA fragment of about 2.4 kb under ultraviolet irradiation after ethidium bromide staining. it can.
  • cloning is performed for each amplification product with and without PCNA added. Since this PCR product is amplified by a DNA polymerase belonging to family B having 3′-5 ′ exonuclease activity, the 3 ′ end is blunted. Therefore, it is necessary to perform TA cloning after adding adenine to the blunt end of the PCR product.
  • TARGET Clone-Plus- may be used, and the method may be performed according to the instruction manual.
  • the cloning method is not limited to the above method, and a known method can be used.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ is transformed with the plasmid obtained by cloning, seeded on an LB agar medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. A plurality of the obtained colonies are picked up, cultured in an LB medium containing ampicillin, extracted with a plasmid, and then sequenced.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 20 is used.
  • sequence analysis for example, BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) is used, and a sequence reaction is performed according to the instruction manual of the product. The analysis is performed using Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems).
  • the number of bases for which sequencing has been completed and the number of bases mistakenly incorporated are counted for each of a plurality of colonies picked up. Then, the values calculated for multiple picked-up colonies are summed, and the ratio of the total number of bases mistakenly incorporated (number of error bases) to the total number of bases that have been sequenced is calculated, and this value is used as the error rate. And By comparing the error rate with and without the addition of PCNA, the effect of adding PCNA can be confirmed.
  • the number of plasmids to be sequenced is at least 30 clones, preferably 50 clones or more.
  • the number of bases that have completed the sequence serving as the denominator of the calculated value is preferably 10,000 bases or more, more preferably 20000 bases or more. Further, in evaluating the number of bases mistakenly incorporated, errors with respect to repeat sequences (slippage errors) are excluded. This is because base incorporation errors (errors) and repeat sequence errors (slippage errors) occur due to different causes.
  • the steps up to the analysis (sequence analysis) of the region containing the repeat sequence are the same as the above (1).
  • the number of A in the repeat sequence region of (A) 12 is counted for each plasmid extracted from each colony.
  • the ratio of plasmids with 12 A to the number of plasmids subjected to sequencing is defined as an error-free ratio, and the ratio of plasmids whose number of A is not 12 to the number of plasmids subjected to sequencing is defined as an error rate.
  • the number of plasmids to be sequenced is at least 30 clones, preferably 50 clones or more.
  • the improvement of PCR accuracy in the present invention means that the error rate (error rate of nucleic acid amplification) is reduced by adding PCNA from the viewpoint of mismatch error.
  • This error is obtained by determining the ratio between the template DNA sequence and the base sequence after nucleic acid amplification.
  • improving the accuracy of PCR means that the amplification error of the repeat sequence is reduced. This error is represented by the error rate of deletion or insertion occurring in the repeat sequence.
  • the repeat sequence in the present invention refers to the same base repeat, for example,-(A) n-,-(T) n-,-(G) n-,-(C) n-, and the like. Also included are repeats of 2 bases, such as-(TA) n-,-(CA) n-,-(GA) n-,-(GT) n-, and the like. Further, the number of bases to be repeated may be 3 bases or more. A plurality of repeat sequences that are likely to cause errors have already been reported, and the number of repeats and the sequence are not limited (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • the DNA polymerase belonging to family B ( ⁇ type) in the present invention is not particularly limited.
  • DNA polymerase isolated from archaea archabacterium DNA polymerase
  • archaea bacteria of the genus Pyrococcus and the genus Thermococcus.
  • DNA polymerase derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus and Pyrococcus sp.
  • DNA polymerases isolated from GB-D Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • Thermococcus kodakaraensis sometimes abbreviated as KOD
  • Thermococcus gonorarius Thermococcus literalis
  • Thermococcus sp. JDF-3 Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp.
  • KS-1 Thermococcus celler
  • Thermococcus siculi Including, but not limited to, DNA polymerase isolated from KS-1, Thermococcus celler, or Thermococcus siculi.
  • PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, such as Pfu DNA polymerase (Agilent Technology, Promega, etc.), KOD DNA polymerase (TOYOBO), Pfx DNA polymerase (Life Technologies), Ultimate DNA polymerase (Life Technologies) Pwo DNA polymerase (Roche Applied Science), Tgo DNA polymerase (Roche Applied Science), Vent DNA polymerase (New England Biolab), Deep Vent DNA polymerase (New England Biolab), PrimeSTAR (registered trademark) DNA Polymerase (Takara Bio), MightyAmp DNA polymerase ( Karabaio), and the like.
  • Pfu DNA polymerase Alent Technology, Promega, etc.
  • KOD DNA polymerase TOYOBO
  • Pfx DNA polymerase Life Technologies
  • Ultimate DNA polymerase Life Technologies
  • Pwo DNA polymerase Roche Applied Science
  • Tgo DNA polymerase Roche Applied Science
  • Vent DNA polymerase New England Biolab
  • Deep Vent DNA polymerase New
  • the enzyme used in the present invention may be a DNA polymerase belonging to Family B, and is not particularly limited to the above-mentioned DNA polymerase. Among them, from the viewpoint of PCR efficiency, it is excellent in extensibility and thermal stability. KOD DNA polymerase is particularly preferred.
  • the DNA polymerase belonging to Family B used in the present invention may be a mutant having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence, and is not particularly limited.
  • the DNA polymerase belonging to Family B used in the present invention may be a mutant having “decreased base analog detection activity”.
  • Base analogs refer to bases other than adenine, cytosine, guanine, and thymine, and include uracil and inosine.
  • a DNA polymerase belonging to Family B binds strongly when a base analog such as uracil or inosine is detected, and inhibits the polymerase function.
  • the base analog detection activity refers to an activity that strongly binds to a base analog and inhibits the polymerase function.
  • a DNA polymerase mutant belonging to family B having reduced base analog detection activity is a DNA polymerase mutant belonging to family B characterized by low binding ability to uracil and inosine.
  • An example of such a mutant having a decreased base analog detection activity of a DNA polymerase belonging to Family B is an archaeal DNA polymerase mutant.
  • the amino acid sequence (uracil-binding pocket) relating to the binding of uracil formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130 is modified, and compared to wild-type DNA polymerase, uracil and inosine An archaeal DNA polymerase variant characterized by low binding ability.
  • the amino acid sequence relating to the binding of uracil is highly conserved in DNA polymerase derived from Pyrococcus and DNA polymerase derived from Thermococcus.
  • DNA polymerase SEQ ID NO: 3 derived from Thermococcus kodakaraensis, it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Pyrococcus furiosus SEQ ID NO: 4
  • it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus gorgonarius SEQ ID NO: 5
  • Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 6), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 7), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp. JDF-3 (SEQ ID NO: 8), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 9), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • KS-1 (SEQ ID NO: 10), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 11), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130.
  • Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 12), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • DNA polymerase mutant for use in the nucleic acid amplification method of the present invention is the seventh, thirty-six, thirty-seven, thirty-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, and ninety-first to ninety-firsts that are assumed to be directly related to interaction with uracil An archaeal DNA polymerase mutant in which at least one of the amino acids is modified.
  • mutants include those having an amino acid sequence represented by the following (a). (A) an amino acid sequence having at least one amino acid modification among amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4;
  • the archaeal DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (b).
  • BLAST Basic local alignment search tool
  • NCBI National Institute of Biotechnology Information
  • ncbi. nlm. nih The amino acid sequence identity is calculated by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /.
  • the archaeal DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (c).
  • “several” is not limited as long as “decreased base analog detection activity” is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably less than about 15%. It is a corresponding number, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 160, preferably 2 to 120, more preferably 2 to 80, still more preferably 2 to 40, and still more preferably. Is 2 to 20, more preferably 2 to 10, and even more preferably 2 to 5.
  • amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 means SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO:
  • amino acids relating to the binding of uracil corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 An expression that includes an array.
  • the amino acid sequence before modification is an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. May be.
  • the position corresponding to a certain position (order) on SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 in the amino acid sequence not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is the primary sequence
  • the position corresponds to the position of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • Various methods are known as methods for comparing the primary structures of sequences. For example, it can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet).
  • the archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention is more preferably selected from amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Having at least one amino acid modification.
  • Y7 means a tyrosine (Y) residue that is the seventh amino acid, and one letter of the alphabet represents an abbreviation of a commonly used amino acid.
  • the Y7 amino acid has tyrosine (Y) substituted with a nonpolar amino acid, specifically selected from the group consisting of Y7A, Y7G, Y7V, Y7L, Y7I, Y7P, Y7F, Y7M, Y7W, and Y7C.
  • Y tyrosine
  • the P36 amino acid is a proline (P) substituted with a positively charged polar amino acid, specifically a P36H, P36K, or P36R amino acid substitution.
  • the V93 amino acid is a valine (V) having a positive charge and substituted with a polar amine acid, specifically an amino acid substitution of V93H, V93K, or V93R.
  • the modification is modification of at least one amino acid selected from the group consisting of Y7A, P36H, P36K, P36R, V93Q, V93K, and V93R. More preferably, it is P36K, P36R or P36H. More preferably, it is P36H.
  • the archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity modifies two or more amino acids selected from amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. What you did is fine. Specific examples include Y7A / V93K, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, Y7A / V93Q or P36H / V93K, and preferred examples include Y7A / P36H or Y7A / V93K. It is not limited to.
  • mutants are conceivable as the modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • examples of such mutants include, but are not limited to, archaeal DNA polymerase mutants having any of the following modifications (1) to (4).
  • the base analog detection activity in the present invention can be evaluated by PCR.
  • the base analog is typically uracil.
  • a dUTP solution is added at a final concentration of 0.5 ⁇ M to 200 ⁇ M to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and a DNA polymerase to be evaluated, and thermal cycling is performed. .
  • the presence or absence of a PCR product can be confirmed by ethidium bromide-stained agarose electrophoresis, and the detection activity of uracil can be evaluated by the allowable dUTP concentration.
  • a DNA polymerase having a high uracil detection activity inhibits the extension reaction when a little dUTP is added, and the PCR product cannot be confirmed.
  • DNA polymerase with low uracil detection activity can confirm gene amplification by PCR without problems even when a high concentration of dUTP is added.
  • An archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity is a result of optimal thermal cycling using any primer and DNA as a template in an enzyme optimal reaction buffer. Compared with the wild-type without DNA, it means a DNA polymerase in which the extension reaction is not inhibited even when a high concentration of dUTP is added, and the PCR product can be confirmed. However, if it is difficult to compare with the wild type, the archaeal DNA polymerase mutant that can amplify PCR even when dUTP is added at a concentration of 0.5 ⁇ M is reduced compared to the wild type. It is presumed to have the activity of detecting a base analog.
  • the evaluation of the base analog detection activity in the present invention follows the following method. KOD -Plus- Ver. 2 (TOYOBO) attached 10 ⁇ PCR Buffer or Pfu DNA Polymerase (Agilent Technologies) attached 10 ⁇ PCR Buffer, 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 pmol of the primer according to SEQ ID NOS: 13 and 14 for amplifying about 1.3 kb (pair), 10 ng of human genomic DNA (Roche Applied Science), in a 50 ⁇ l reaction solution containing 1 U of each enzyme A reaction solution is prepared by adding dUTP (Roche Applied Science) to final concentrations of 0.5, 5, 50, 100, and 200 ⁇ M.
  • PCR is performed with PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) on a schedule of repeating 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • 5 ⁇ l of the reaction solution is subjected to agarose electrophoresis, ethidium bromide staining, and an amplified DNA fragment of about 1.3 kb is confirmed under ultraviolet irradiation to evaluate whether the base analog detection activity is reduced. .
  • a method for modifying the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention has already been established in the art. Therefore, it can modify
  • a site-directed mutagenesis method based on the inverse PCR method can be used.
  • KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO) (1) denatures a plasmid into which the target gene has been inserted, anneals the mutation primer to the plasmid, and then performs an extension reaction using KOD DNA polymerase.
  • the above-mentioned modified DNA polymerase gene is transferred to an expression vector as necessary.
  • E. coli as a host is transformed with the expression vector, and then applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form a colony.
  • the colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 ⁇ YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
  • the vector is not limited, but a vector derived from pBluescript is preferable. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells.
  • ultrasonic treatment a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • This crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured.
  • DNA polymerase activity is defined by measuring with the following method. If enzyme activity is strong, sample with storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) 25 ⁇ l of the following solution A, 5 ⁇ l of solution B, 5 ⁇ l of solution C, 10 ⁇ l of sterilized water, and 5 ⁇ l of enzyme solution are added to a microtube and reacted at 75 ° C. for 10 minutes.
  • A 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 ⁇ g / mL BSA (bovine serum albumin) B: 1.5 ⁇ g / ⁇ l activated calf thymus DNA C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP) D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate) E: 1 mg / mL calf thymus DNA
  • any method may be used as a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method, for example, the following method.
  • the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods.
  • the obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the DNA polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by heparin sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation.
  • the purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows almost a single band.
  • PCNA also referred to as Proliferating Cell Nuclear Antigen in the present specification
  • the PCNA is a kind of PCR enhancing factor.
  • the PCNA is preferably heat resistant to withstand the thermal cycle of PCR, and preferably remains active after PCR. More preferably, it is soluble even after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes, and the activity remains at 50% or more, more preferably at least 70%, more preferably at least 90%.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention is more preferably PCNA isolated from bacteria belonging to the genus Pyrococcus, Thermococcus, or Methanocaldococcus.
  • PCNA derived from the genus Pyrococcus includes Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 2), Pyrococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from GB-D, Pyrococcus wosei, Pyrococcus Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • PCNA derived from the genus Thermococcus includes Thermococcus kodakaaraensis (SEQ ID NO: 1), Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from KS-1, Thermococcus celer, or Thermococcus siculi. Further, the PCNA derived from the genus Methanocadococcus includes, but is not limited to, PCNA isolated from Methanocaldococcus_jannaschii (SEQ ID NO: 21).
  • PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a modified methionine corresponding to position 73 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in order to increase the expression level. More preferably, it is modified to M73L, but is not limited thereto.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a mutant that is loaded alone into DNA.
  • PCNA usually forms a multimer and has a ring-like structure. Loading to DNA indicates that the DNA is allowed to pass inside the ring structure of the PCNA multimer, and PCNA can be loaded into DNA only in combination with a factor usually called RFC.
  • Mutants that load DNA alone are those that modify the sites involved in PCNA multimer formation and destabilize multimer formation, making it easier to pass DNA into PCNA multimers without RFC. Show.
  • PCNA The site where PCNA is involved in multimer formation is PCNA (SEQ ID NO: 1) derived from Thermococcus kodakaraensis, and PCNA (SEQ ID NO: 2) of Pyrococcus furiosus is an N consisting of amino acids 82, 84 and 109. Examples thereof include a terminal region and a C-terminal region consisting of amino acids 139, 143 and 147. The N-terminal region is positively charged, the C-terminal region is negatively charged, and multimers are formed by interaction.
  • PCNA having an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence to be expressed is an expression including an amino acid sequence relating to multimer formation corresponding to positions 82, 84, 109, 139, 143, and 147 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence before modification may be an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the position corresponding to a certain position (order) on SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is the primary sequence
  • the position corresponds to the position of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • PCNA derived from Methanocaldococcus_jannaschii (hereinafter referred to as Mja) described in SEQ ID NO: 21.
  • Mja Methanocaldococcus_jannaschii
  • positions corresponding to positions 82, 84, 109, 139, 143, and 147 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 are positions 81, 83, 108, 138, 142, and 146, respectively. .
  • the PCNA mutant loaded on DNA alone is more preferably (a) the N-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 82, 84 and 109, which is involved in PCNA multimer formation, or (b) 139, 143 and 147 Examples include mutants that have at least one modification in the C-terminal region consisting of the amino acid corresponding to the second amino acid, and load into DNA without an RFC to promote the elongation reaction of DNA polymerase.
  • the amino acid corresponding to the 143rd position of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is changed to a basic amino acid or a neutral amino acid
  • the 82nd and 143rd positions are both changed to a neutral amino acid
  • the 147th position is a neutral amino acid Or those obtained by modifying both the 109th and 143rd positions to neutral amino acids.
  • the types of basic amino acids and neutral amino acids to be substituted are not particularly limited.
  • arginine As a basic amino acid, if natural, arginine, histidine, lysine, as a neutral amino acid, if natural, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, Examples include serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine.
  • a sequence in which the 147th amino acid residue is replaced with alanine (D147A), the 82nd and 143rd amino acid residues are alanine.
  • Sequence (R82A / D143A or R82A / E143A), 109th and 143th amino acid residues changed to alanine (R109A / D143A or R109A / E143A), 143th amino acid residue Examples include, but are not limited to, sequences (D143R, D143K, E143R, E143K) in which the group is changed to arginine or lysine.
  • a method for modifying PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention has already been established in the art. Therefore, it can modify
  • Whether or not a PCNA mutant can be loaded into DNA alone can be evaluated by PCR.
  • a PCNA mutant is added to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and DNA polymerase belonging to Family B, with no PCNA added, or with wild-type PCNA added
  • the amount of amplification with that of DNA it can be confirmed whether it can be loaded into DNA alone.
  • the PCR amplification amount does not change, but rather the amplification amount tends to decrease.
  • a mutant that can be loaded into DNA alone can obtain an amplification amount superior to that without PCNA addition or with wild-type PCNA addition.
  • the evaluation of “whether a PCNA mutant can be loaded alone into DNA” (evaluation of amplification enhancing activity) follows the following method.
  • KOD -Plus- Ver. 2 (TOYOBO) attached 10 ⁇ PCR Buffer, 0.2 mM dNTPs (dATP, dUTP, dCTP) containing 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , dUTP (Roche Applied Science) instead of dTTP , DGTP), 15 pmol of the primer according to SEQ ID NOS: 13 and 14 for amplifying about 1.3 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche Applied Science), and 50 ⁇ l of a reaction solution containing 1 U KOD DNA polymerase V93K mutant.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a method for amplifying a target nucleic acid, and is not particularly limited except that a DNA polymerase belonging to Family B and PCNA are contained in the reaction solution.
  • a typical example of a method that can be amplified by a DNA polymerase is PCR.
  • PCR DNA polymerase
  • DNA is used as a template, and one primer, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) is reacted.
  • dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
  • a primer extension method, a sequencing method, a conventional method that does not perform temperature cycling, and a cycle sequence method are included.
  • a PCR enhancing factor BSA, a nonionic surfactant and the like may be further used as necessary.
  • a base analog such as dUTP can be used as a DNA synthesis substrate.
  • an antibody having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3'-5 'exonuclease activity of thermostable DNA polymerase may be used.
  • the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. This reaction composition is particularly effective for increasing the sensitivity of PCR and reducing nonspecific amplification.
  • the reagent for carrying out the nucleic acid amplification method of the present invention or the kit containing the reagent contains DNA polymerase belonging to Family B and PCNA in the reaction solution, and the other configurations are not particularly limited. Further, the nucleic acid amplification method to be applied is not particularly limited.
  • examples of the reagent of the present invention or a kit containing the reagent include the following structures (a) to (e), but are not limited thereto.
  • A DNA polymerase belonging to family B
  • a DNA synthesis substrate deoxynucleotide triphosphate (dNTP)
  • D a buffer solution containing magnesium ions and / or ammonium ions and / or potassium ions
  • PCNA PCNA
  • the reagent and kit may further use other reagents such as BSA and nonionic surfactant as necessary.
  • Example 1 Preparation of KOD-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain was prepared.
  • the DNA template used for mutagenesis was PCNA (SEQ ID NO: 15) (pKOD PCNA) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript. Mutation was introduced using a KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 2 Preparation of Pfu-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Pyrococcus furiosus was prepared.
  • PCNA SEQ ID NO: 16
  • pPfu PCNA derived from Pyrococcus furiosus cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using a KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 1 The plasmids prepared in Example 1 and Example 2 are shown in Table 1.
  • Example 3 Preparation of KOD DNA Polymerase Mutants Various mutants of KOD DNA polymerase were prepared by the following method for use in the evaluation of PCNA in the examples described later.
  • a DNA template used for mutagenesis a modified heat-resistant DNA polymerase gene (SEQ ID NO: 17) (pKOD) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using a KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • the prepared plasmid is shown in Table 2.
  • Example 4 Production of KOD-PCNA and Pfu-PCNA
  • the cells obtained in Example 1 or 2 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia coli cultured for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance. DH5 ⁇ (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, the nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and Q sepharose chromatography were performed.
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 .1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 .1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • Example 5 Production of modified thermostable DNA polymerase The cells obtained in Example 3 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia coli cultured for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance. JM109 (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Further, nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and heparin sepharose chromatography were performed.
  • thermostable DNA polymerase 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin.
  • the DNA polymerase activity in these purification steps was measured according to the above-described DNA polymerase activity measurement method.
  • Example 6 Evaluation of PCNA To confirm whether PCNA can be loaded into DNA alone, KOD-PCNA mutants (M73L, M73L / E143R, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, M73L) / E143F, M73L / E143A), and the difference in amplification amount by PCR in the presence of dUTP was compared by amplifying 1.3 kb of Human ⁇ -globin according to the method for measuring the amplification enhancing activity. At this time, the KOD V93K mutant prepared in Examples 3 and 5 was used as the DNA polymerase. As described above, the M73L mutation is considered to correspond to the wild type.
  • PCR KOD-Plus-Ver. 2 (TOYOBO) attached Buffer, using MgSO 4, 1 ⁇ PCR Buffer, and dNTPs to the 0.2 mM dTTP was replaced by dUTP (dATP, dUTP, dCTP, dGTP), 1.5mM MgSO 4, 15pmol primer (vs. ) (SEQ ID NOs: 13 and 14) 50 ⁇ l of a reaction solution containing 10 ng of human genomic DNA (Roche Applied Science) and 1 U of enzyme mixed with an antibody was prepared. PCR was performed using PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystems) on a schedule of 35 cycles of 10 ° C.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis of the products obtained by adding 250 ng of various PCNA mutants and performing PCR reaction.
  • the PCNA mutants used were 7 types in total: M73L, M73L / E143R, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, M73L / E143F, and M73L / E143A.
  • the KOD V93K mutant used this time has a small amount of amplification due to dUTP inhibition. Although no band was confirmed in the case of no PCNA addition or in the M73L mutant, a firm band was confirmed by the addition of other KOD-PCNA mutants.
  • PCNA forms a multimer and promotes a nucleic acid synthesis reaction. Usually, however, the reaction cannot proceed without loading into DNA without the action of RFC. M73L / E143R, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, M73L / E143F, and M73L / E143A are changes to sites involved in multimer formation, and multimer formation is moderately weakened. Therefore, it is conceivable that PCNA can be loaded into DNA alone and the amount of PCR amplification has been improved.
  • Example 7 Evaluation of accuracy of DNA polymerase belonging to family B provided by PCNA It was verified whether PCNA affects the accuracy of DNA polymerase belonging to family B.
  • KOD-Plus-DNA polymerase TOYOBO
  • PrimeSTAR DNA polymerase Takara Bio
  • PCNA alone is an example of a mutant that is loaded into DNA.
  • KOD-Plus-DNA polymerase KOD-PCNA mutant (M73L / D147A)
  • PrimeSTAR DNA polymerase Pfu-PCNA mutation The body (M73L / D143R) was used.
  • KOD-PCNA The effect of KOD-PCNA on the accuracy of KOD-Plus-DNA polymerase was evaluated by the following method.
  • KOD-Plus-Ver. 2 TOYOBO
  • MgSO 4 MgSO 4
  • dNTPs 1 ⁇ PCR Buffer
  • 0.2 mM dNTPs dATP, dTTP, dCTP, dGTP
  • 1.5 mM MgSO 4 15 pmol primers (SEQ ID NOs: 18 and 19)
  • 50 ng of human genomic DNA (Roche Applied Science)
  • 1U KOD-Plus- 100 ng KOD-PCNA mutant (M73L / D147A)
  • 50 ⁇ l of a reaction solution was prepared.
  • PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystems) the reaction solution was subjected to a reaction of 94 ° C, 2 minutes before reaction, 94 ° C, 15 seconds ⁇ 60 ° C, 30 seconds ⁇ 68 ° C, 2.5 minutes after 21 cycles. PCR was performed. Since this PCR product uses a DNA polymerase belonging to Family B having 3′-5 ′ exonuclease activity, the 3 ′ end is blunted. Therefore, TA cloning was performed after adding adenine to the blunt end of the PCR product. Specifically, for the addition of adenine and TA cloning, TARGET Clone-Plus- (TOYOBO) was used, and the method was performed according to the instruction manual.
  • TARGET Clone-Plus- TOYOBO
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid, seeded on an LB agar medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. A plurality of the obtained colonies were picked up, cultured in an LB medium containing ampicillin, extracted with a plasmid, and then sequenced. The sequence reaction was performed using BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the instruction manual of the product. For analysis, Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) was used, and analysis was performed using the primer of SEQ ID NO: 20 as a sequence primer.
  • This reaction solution was subjected to PCR using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) on a schedule of repeating 98 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 55 ° C., 5 seconds ⁇ 72 ° C., 2.5 minutes. Since this PCR product uses a DNA polymerase belonging to Family B having 3′-5 ′ exonuclease activity, the 3 ′ end is blunted. Therefore, TA cloning was performed after adding adenine to the blunt end of the PCR product. Specifically, for the addition of adenine and TA cloning, TARGET Clone-Plus- (TOYOBO) was used, and the method was performed according to the instruction manual.
  • adenine and TA cloning TARGET Clone-Plus- (TOYOBO) was used, and the method was performed according to the instruction manual.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid, seeded on an LB agar medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. A plurality of the obtained colonies were picked up, cultured in an LB medium containing ampicillin, extracted with a plasmid, and then sequenced.
  • the sequence reaction was performed using BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the instruction manual of the product.
  • Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) was used, and the primer of SEQ ID NO: 20 was used as a sequence primer.
  • the effect of Pfu-PCNA on the accuracy of PrimeSTAR DNA polymerase was evaluated by comparing error rates with and without PCNA addition.
  • Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) was used, and the primer of SEQ ID NO: 20 was used as a sequence primer in order to analyze a region containing a repeat sequence.
  • the effect of Pfu-PCNA on the accuracy of PrimeSTAR DNA polymerase was evaluated by determining the ratio of errors related to insertion and deletion with respect to the repeat sequence (A) 12 from the sequence results.
  • Frequency of mismatch error Table 3 shows the results of determining the error rate when amplification was performed without addition of PCNA using KOD-Plus-DNA polymerase and the error rate when amplification was performed with addition of PCNA. Without addition of PCNA, the number of error bases was 3 per 33450 bases, whereas the addition of PCNA was shown to decrease to 0 per 33598 bases. The error rate decreased from 8.97 ⁇ 10 ⁇ 5 to 0, indicating that the accuracy was improved by adding PCNA.
  • Table 4 shows the results of calculating the error rate when amplification was performed without addition of PCNA using PrimeSTAR DNA polymerase and the error rate when amplification was performed with addition of PCNA. It was shown that without PCNA addition, the number of error bases was 2 per 31986 bases, but by adding PCNA it was reduced to 0 bases per 32323 bases. The error rate decreased from 6.25 ⁇ 10 ⁇ 5 to 0, indicating that the accuracy was improved by adding PCNA.
  • FIG. 3 shows the results of counting the number of bases in the repeat sequence portion when PrimeSTAR DNA polymerase was amplified without adding PCNA and the number of bases in the repeat sequence portion when amplified with addition of PCNA. Without PCNA addition, the number of error-free clones is 53.5%, but adding PCNA shows that the error rate is reduced by 20% and the accuracy is improved to about 75%. It was.
  • Example 8 Accuracy evaluation of DNA polymerase belonging to family B with reduced base analog detection activity given by KOD-PCNA The accuracy of DNA polymerase belonging to family B with reduced base analog detection activity We examined whether it affects sex.
  • DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity the KOD H147E / P36H / Y7A mutant, the KOD H147E / V93K / Y7A mutant prepared in Examples 3 and 5 were used, and PCNA Used the KOD-PCNA mutant (M73L / D147A).
  • Example 9 Preparation of Mja-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from the Methanocaldococcus_jannaschii strain was prepared.
  • the DNA template used for mutagenesis was PCNA (SEQ ID NO: 22) (pMja PCNA) derived from the Methanocaldococcus_jannaschii strain cloned in pET23b. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (TOYOBO) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation. The prepared plasmid is shown in Table 6.
  • the mutation introduction site of Mja-PCNA is at position 142, but this position corresponds to position 143 of the amino acid sequence in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • Example 10 Production of Mja-PCNA
  • the cells obtained in Example 9 were cultured as follows. First, 80 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin that had been sterilized was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. This medium was inoculated with Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (plasmid transformant) (using a test tube) previously cultured at 37 ° C. for 16 hours in 3 mL LB medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco
  • aeration culture was performed until OD600 became 0.3 to 0.6. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM, and aeration culture was performed for 4 hours.
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation.
  • Example 11 Accuracy evaluation of DNA polymerase belonging to family B with reduced base analog detection activity given by Mja-PCNA The accuracy of DNA polymerase belonging to family B with reduced base analog detection activity We examined whether it affects sex.
  • the KOD H147E / V93K / Y7A mutant prepared in Examples 3 and 5 was used as an example of a DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity, and PCNA was prepared in Examples 9 and 10.
  • Mja-PCNA mutant (E142R) was used.
  • PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystems) the reaction solution was subjected to a reaction of 94 ° C, 2 minutes before reaction, 94 ° C, 15 seconds ⁇ 60 ° C, 30 seconds ⁇ 68 ° C, 2.5 minutes after 21 cycles. PCR was performed. Since this PCR product uses a DNA polymerase belonging to Family B having 3′-5 ′ exonuclease activity, the 3 ′ end is blunted. Therefore, TA cloning was performed after adding adenine to the blunt end of the PCR product. Specifically, for the addition of adenine and TA cloning, TARGET Clone-Plus- (TOYOBO) was used, and the method was performed according to the instruction manual.
  • TARGET Clone-Plus- TOYOBO
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid, seeded on an LB agar medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. A plurality of the obtained colonies were picked up, cultured in an LB medium containing ampicillin, extracted with a plasmid, and then sequenced. The sequence reaction was performed using BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the instruction manual of the product. For analysis, Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) was used, and analysis was performed using the primer of SEQ ID NO: 20 as a sequence primer.
  • FIG. 5 shows the result of counting the number of bases in the repeat sequence when amplified with addition. It was shown that the addition of Mja-PCNA reduces the error by 6% and improves the accuracy to about 70%, compared to 65% or less without the addition of PCNA. From this result, Mja-PCNA is also effective for DNA polymerase belonging to Family B having reduced base analog detection activity, and is expected to be used in PCR that requires accuracy.
  • the present invention can reduce nucleic acid amplification (PCR) errors (for example, mismatch errors and / or slippage errors when a repeat sequence is amplified).
  • PCR nucleic acid amplification
  • mismatch errors and / or slippage errors when a repeat sequence is amplified can be reduced, so that it is expected that accurate data and sequence information can be obtained.
  • This technique can be widely used industrially not only in the research field, but also in the clinical field or forensic field such as genetic diagnosis, or in the inspection of microorganisms in food and the environment.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　クローニングやシークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などにおいて、ＰＣＲの正確性は重要である。そのため、高正確と言われているファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにおいても、さらなる正確性向上が望まれている。特に、リピート配列のエラーは、高正確性と言われているファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにおいても発生しやく、リピート配列のエラー低減が望まれている。そこで、本発明の目的は、核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供すること、リピート配列のエラーを低減させることで核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供することである。　ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに加え、ＰＣＮＡを添加することで核酸増幅の正確性を向上させることができた。また、ＰＣＮＡを添加することでリピート配列のエラーを低減させ、核酸増幅の正確性を向上させることができた。

Description

核酸増幅の正確性を向上させる方法
　本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、ＰＣＲ反応における正確性を向上させる方法に関する。
　ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この方法により、数コピーといった極微量サンプルから標的核酸を何十万倍に増幅することができるため、研究用途のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
　ＰＣＲを行う上で重要となる点として、増幅効率と高正確性などが挙げられる。特に、ＰＣＲの正確性は、目的遺伝子のクローニング、シークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などにおいて重要となる。
　ＰＣＲの正確性の評価の物差しには種々の異なる観点がある。その物差しとしては、例えば、塩基の取り込み間違い（ミスマッチエラー）の頻度が挙げられる。ミスマッチエラーの頻度は、使用するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性（修復活性）の強さに大きく依存する。一方、別の物差しとして、酵素のスリッピングによるリピート配列の複製エラー（スリッページエラー）の頻度が挙げられる。スリッページエラーは３’－５’エキソヌクレアーゼ活性では修復できない。このように、前記２種類の物差しは全く異なる原因で発生するものである。
　ＰＣＲの正確性を向上させるために、超好熱始原菌由来のファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼが開発されてきた。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、例えばパイロコッカス・フリオサス(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献１)、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Ｖｅｎｔ)ポリメラーゼ、特許文献２）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ) ＫＯＤ１（旧名：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ. ＫＯＤ１）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、特許文献３)などが知られている。これらファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは３’－５’エキソヌクレアーゼ活性(Ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ活性・校正活性)を有するため、正確性は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのファミリーＡ（ｐｏｌ　Ｉ型）に属するＤＮＡポリメラーゼに比べて優れている。
　しかしながら、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合でも、これらのエラーを完全に消失できるわけではない。例えばミスマッチエラーの観点では、特にクローニングやシークエンス解析において、より正確性の高いＰＣＲ方法が求められている。また、スリッページエラーの観点では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合でもリピート配列における挿入や欠損に関するエラーは、ほとんど改善が認められていないことが報告されている（非特許文献１）。これは、リピート配列におけるエラーは、ＤＮＡのポリメラーゼのスリッピングによるものであるため、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性(Ｐｒｏｏｆ ｒｅａｄｉｎｇ活性・校正活性)では、修復できないからである。
特許３４５３３９７ 特開平０６－００７１６０ 特許３１３２６２４ ＷＯ２００７／００４６５４ 英国特許６３３３１５８ 特許４３９５３７７ 特表２００６－５０７０１２
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ: Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ２００１;５４:３５１-３５３ ＮＵＣＬＥＩＣ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３ Ｆｅｂ １;３１(３):９７４－８０
　そこで、本発明はミスマッチエラーやリピート配列を増幅する際のスリッページエラーなどを低減させることで、核酸増幅の正確性を向上させる方法を提供することを目的とする。
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、ＰＣＲの正確性が向上し、クローニングやシークエンス解析のためのライブラリー調製時のＰＣＲ増幅などに適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することである。
　本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに加え、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を添加することで核酸増幅におけるミスマッチエラーの低減や、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減に繋がることを見出し、本発明の完成に至った。
　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）は、ＤＮＡ複製に関与する因子のひとつである増殖核抗原である。ＰＣＮＡをファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに添加すると核酸増幅の時間が短縮できること（特許文献４）や、プライマーエクステンション試験で伸長性が向上し、核酸増幅でも比較的長めのターゲットを増幅できること（特許文献５）が知られている。しかし、核酸増幅におけるミスマッチエラーの低減に効果があることや、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減に効果があることを示した例は知られていない。
　本発明は以下の構成からなる。
［１］核酸増幅の正確性を向上させる方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
（ここで、核酸増幅の正確性向上が、ミスマッチエラーの低減、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減であってもよい。）
［２］ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である［１］に記載の方法。
［３］ＰＣＮＡが、（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、［１］または［２］に記載の核酸増幅法。
［４］ＰＣＮＡが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、［１］－［３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［５］ＰＣＮＡが配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１４２番目（配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当）のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である［１］－［３］のいずれかに記載の核酸増幅方法。
［６］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである［１］－［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［７］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼである［１］－［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［８］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である［１］－［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［９］［１］－［８］のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬。
［１０］［１］－［８］のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬を含むキット。
　本発明により、核酸増幅（ＰＣＲ）のエラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させることができる。これにより、増幅エラーのない配列を見つけ出すことに時間を要していたクローニングの時間・コストの削減につなげることができる。さらに、シークエンスにおいては、核酸増幅エラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させ核酸増幅（ＰＣＲ）を行えることで正確なデータ、配列情報が得られることが期待できる。この手法は研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。
ＰＣＮＡ変異体の評価として増幅増強活性を調べた結果である。 ＫＯＤ－ＰＣＮＡが、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。 Ｐｆｕ－ＰＣＮＡが、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。 ＫＯＤ－ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体に与える正確性への影響を評価した結果である。 Ｍｊａ－ＰＣＮＡが、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響を評価した結果である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
　また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」、「ＰＣＮＡ変異体」という場合の「変異型」、「変異体」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの変異体についても同様である。
　本発明におけるＰＣＲの正確性を向上した核酸増幅法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする。
　ＰＣＲの正確性とは、ＤＮＡ合成時における塩基の取り込みの正確性を意味する。ＰＣＲの正確性の評価を行う方法として、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）遺伝子を用いた方法や、増幅産物をクローニングし、シークエンスする方法などが挙げられる。
［ＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価方法］
　本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、増幅産物をクローニングし、シークエンスする方法を用いている。方法は、まず、ゲノムＤＮＡを鋳型として、任意に選択した領域を増幅できるプライマーにてＰＣＲ増幅を実施する。その後、増幅産物をベクターにクローニングし、複数クローンをピックアップ、シークエンスにより塩基配列を確認し、増幅塩基数に対するエラーの割合を求めることにより算出する。一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムＤＮＡである場合は、リピート配列に生じた欠失や挿入のエラーの割合を求めることにより算出する。
　具体的な正確性の評価方法を記載する。
（１）ミスマッチエラーの観点から
　まず、ＰＣＲをＰＣＮＡ添加の有り、無しそれぞれについて実施する。ＰＣＲの反応組成については、プライマー対として、１５ｐｍｏｌのプライマー対（配列番号１８及び１９）、鋳型として５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）を使用する以外は、増幅が可能な組成であれば限定されない。また、ＰＣＲサイクルについても各ＤＮＡ　ポリメラーゼに適した条件で実施すればよい。ＰＣＮＡ添加の有無で増幅量を揃えるために、ＰＣＮＡ添加あり、無しのそれぞれについてサイクル数を設定する。増幅量が揃っているかの確認は、ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下約２．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片の強度を確認することで評価できる。
　次にＰＣＮＡ添加有り、無しのそれぞれの増幅産物についてクローニングを実施する。本ＰＣＲ産物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにより増幅しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施する必要性がある。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行えばよい。クローニング方法については、上記方法に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。
　クローニングにより得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養する。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施する。シークエンス反応は、配列番号２０に示すプライマーを用いる。シークエンス解析は、例えば、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行う。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、解析を実施する。
　シークエンス後、複数ピックアップしたコロニーそれぞれについて、シークエンスが完了した塩基数と、間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）のカウントを実施する。その後、複数ピックアップしたコロニーについて算出した値を合計し、シークエンスが完了した塩基数の合計値に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の合計値の割合を算出し、この値をエラー率とする。このエラー率について、ＰＣＮＡ添加有り、無しで比較することによりＰＣＮＡ添加効果を確認することができる。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低３０クローン、好ましくは５０クローン以上で実施する。また、計算値の分母となるシークエンスが完了した塩基数は１００００塩基以上が望ましく、より好ましくは２００００塩基以上である。
　さらに、間違えて取り込まれた塩基数を評価するにあたり、リピート配列に対するエラー（スリッページエラー）は除外する。これは、塩基の取り込み間違い（エラー）とリピート配列に対するエラー（スリッページエラー）は異なる原因で発生するからである。
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの観点から
　一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムＤＮＡである場合は、リピート配列を含む領域の解析（シークエンス解析）までの工程を前記（１）と同様に実施した後、（Ａ）１２のリピート配列領域のＡの数を各コロニーから抽出したプラスミドごとに集計する。シークエンスを実施したプラスミド数に対するＡの数が１２個であるプラスミドの割合をエラーのない割合とし、シークエンスを実施したプラスミド数に対するＡの数が１２個ではないプラスミドの割合をエラー率とし、ＰＣＮＡ添加有り・無しで比較する。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低３０クローン、好ましくは５０クローン以上で実施する。
　本発明におけるＰＣＲの正確性の向上とは、ミスマッチエラーの観点からは、ＰＣＮＡ添加によりエラー率（核酸増幅のエラー率）が低下することを意味している。このエラーは、鋳型ＤＮＡ配列と核酸増幅後の塩基配列が異なる割合を求めたものである。一方、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの観点からは、ＰＣＲの正確性の向上とは、リピート配列の増幅エラーが低減することを意味している。このエラーは、リピート配列に生じた欠失や挿入のエラー率で表される。
　なお、本発明におけるリピート配列とは、同じ塩基の繰り返し、例えば－（Ａ）ｎ－、－（Ｔ）ｎ－、－（Ｇ）ｎ－、－（Ｃ）ｎ－などを指す。また、２塩基の繰り返し、例えば、－（ＴＡ）ｎ－、－（ＣＡ）ｎ－、－（ＧＡ）ｎ－、－（ＧＴ）ｎ－なども含まれる。さらに繰り返しの対象となる塩基数が３塩基以上でもよい。エラーが生じやすいリピート配列については、すでに複数報告されており、リピート数や配列は限定されるものではない（非特許文献１、非特許文献２）。
　本発明におけるファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。たとえば、古細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼ（古細菌ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。古細菌としては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌が例示される。
　パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
　サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤと略称することもある）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、　またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
　これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー、プロメガなど）、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、Ｐｆｘ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）、Ｕｌｔｉｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）Ｐｗｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｔｇｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）などが挙げられる。本発明において使用する酵素は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性に優れたＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
　本発明で使用するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。
　本発明で使用するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、「減少した塩基類似体検出活性」を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
　このようなファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性を有する変異体としては、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示できる。
　具体的には、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
　ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号４）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号５）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号６）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄ（配列番号７）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３（配列番号８）のおいては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７（配列番号９）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ－１（配列番号１０）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号１１）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１２）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。
　本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルとの相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。そのような変異体として、例えば、下記の（ａ）で示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（ａ）配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列。
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一（好ましくは８５％以上同一であり、さらに好ましくは９０％以上同一であり、さらに好ましくは９５％以上同一であり、さらに好ましくは９８％以上同一であり、さらに好ましくは９９％以上同一である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
　アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販のまたは電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
　上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
　ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１６０個、好ましくは２～１２０個、より好ましくは２～８０個、更に好ましくは２～４０個であり、更に好ましくは２～２０個であり、更に好ましくは２～１０個であり、より更に好ましくは２～５個である。
　なお、本明細書において、「配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号３または配列番号４の７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。
　例えば、上記の（ａ）から（ｃ）に示される古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
　本願明細書において、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号３または配列番号４上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号３または配列番号４の当該位置と対応する位置とする。配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販のまたは電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
　本明細書では、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
　本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号３または配列番号４におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。
　ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。
　より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。
　本発明における減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３または配列番号４におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
　なお、特許文献６または７には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
　上記に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか
　本発明における塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ～２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。
　減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、および鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができる古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
　本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アジレント・テクノロジー）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー（対）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(ロッシュ・アプライド・サイエンス)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるように添加した反応液を調製する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。
　本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
　アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
　上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、限定されるものではないがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
　本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、以下の方法で測定することにより定義される。なお酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ　塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ　塩化マグネシウム１５ｍＭ　ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ　［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％　トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
　上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
　この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
　本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡ（本明細書では、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎとも言う）は、ＰＣＲ増強因子の一種である。前記ＰＣＮＡとしては、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。
　本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡとしては、さらに好ましくはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノカルドコックス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。さらにメタノカルドコックス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号２１）から単離されたＰＣＮＡを含むが、これに限定されない。
　また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、配列番号１または配列番号２の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。
　さらに、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。
　ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。
　なお、本明細書において、「（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域」とは、配列番号１または２を基準とした場合の位置（順番）である。そのため、本明細書において、「配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列における８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＰＣＮＡにおいて、配列番号１または配列番号２の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に対応する多量体形成に関するアミノ酸配列を含む表現である。
　例えば、下記のＰＣＮＡ変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
　本願明細書において、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１または配列番号２上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１または配列番号２の当該位置と対応する位置とする。
　本明細書では、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
　上記例として、配列番号２１に記載のＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（以下、Ｍｊａ）由来のＰＣＮＡが挙げられる。Ｍｊａ由来のＰＣＮＡでは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列における８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目に対応する位置は、それぞれ８１、８３、１０８、１３８、１４２、１４６番目となる。
　単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
　たとえば、配列番号１または配列番号２の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。
　本明細書において、置換する塩基性アミノ酸、中性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
　より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１４３番目のアミノ酸残基をアルギニンあるいはリシンに変えた配列（Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｋ、Ｅ１４３Ｒ、Ｅ１４３Ｋ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
　ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうかは、ＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ＰＣＮＡ変異体を添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるかを確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。
　本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか」の評価（増幅増強活性の評価）は、以下の方法に従う。ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）を含んだ０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕ　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼＶ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を野生型ＰＣＮＡを添加したもの、あるいはＰＣＮＡを添加していないものと比較することで単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡかどうかを評価することができる。単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。
　本発明の核酸増幅法は、標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを反応液中に含んでいることを除いて、特に限定されない。
　ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法としては、典型的にはＰＣＲが挙げられるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
　本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、及び／またはアンモニウムイオン及び／または、カリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ
を、混合し、サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
　上記ＰＣＲ法においては、必要に応じて、さらに、ＰＣＲ増強因子、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼに、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いる場合は、ｄＵＴＰなどの塩基類似体をＤＮＡ合成基質として用いることが可能である。
　上記ＰＣＲ法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／または３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
　上記の本発明の核酸増幅法を実行するための試薬または前記試薬を含むキットは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、および、ＰＣＮＡを反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。また、適用する核酸増幅法も特に限定されない。
　核酸増幅法としてＰＣＲを行う場合、本発明の試薬または前記試薬を含むキットとして、以下の（ａ）～（ｅ）を含む構成が例示できるが、これに限定されない。
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））
（ｄ）マグネシウムイオン、及び／またはアンモニウムイオン、及び／またはカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
（ｅ）ＰＣＮＡ
　前記試薬、キットは、必要に応じてさらに、その他の試薬類、たとえばＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体の作製
　サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号１５）（ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例２：Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体の作製
　パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号１６）（ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
　実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３：ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
　後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
　サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１７）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４：ＫＯＤ－ＰＣＮＡ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡの作製
　実施例１または２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
実施例５：改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
　実施例３で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。これら精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、上述のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法にしたがって測定した。
実施例６：ＰＣＮＡの評価
　ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードできるかを確認するため、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、増幅増強活性の測定方法に従い、Ｈｕｍａｎ　β－グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。この際、ＤＮＡポリメラーゼには、実施例３および５で作製したＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ変異体を用いた。なお、上述のとおり、Ｍ７３Ｌ変異を野生型に相当するものとみなす。
　ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（対）（配列番号１３及び１４）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を調製し、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
　図１は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの計７種である。
　今回用いたＫＯＤ Ｖ９３Ｋ変異体はｄＵＴＰの阻害を受けて増幅量が少ない。ＰＣＮＡ添加なしやＭ７３Ｌ変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、他のＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体の添加でしっかりとしたバンドが確認された。ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる。
　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。
実施例７：ＰＣＮＡが与えるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
　ＰＣＮＡが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を使用した。また、ＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体の例として、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼに対しては、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼに対しては、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を使用した。
　ＫＯＤ－ＰＣＮＡがＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　まず、ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１Ｕ　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－、１００ｎｇ　ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
　この反応液を９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２１サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
ＫＯＤ－ＰＣＮＡがＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の割合を算出することで求めた。
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
　前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記（１）と同様に実施した。ＫＯＤ－ＰＣＮＡがＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
　上記解析は、ＰＣＲをＮ＝２で実施し、その後、独立してシークエンス解析まで実施した。
　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡが　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　まず、ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）添付のＢｕｆｆｅｒである５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋　ｐｌｕｓ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ含有）、および０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー対（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１，２５Ｕ　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１００ｎｇ　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
　この反応液を、９８℃、１０秒→５５℃、５秒→７２℃、２．５分を２３サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。
　得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用い、解析を実施した。
　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡがＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
　前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、リピート配列を含む領域の解析を実施するために、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いた。
　Ｐｆｕ－ＰＣＮＡがＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表３に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、３３４５０塩基あたり３個であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、３３５９８塩基あたり０個に減少することが示された。エラー割合としては、８．９７×１０－５から０に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表４に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が３１９８６塩基あたり２個であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、３２３２３塩基あたり０塩基に減少することが示された。エラー割合としては、６．２５×１０－５から０に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらの結果より、ファミーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにＰＣＮＡを添加することで、正確性が向上することが示された。正確性が向上することは有意義なことであり、クローニングやシークエンスにおいて利用が期待される。
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図２に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が６０％以下であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、１０％もエラー率が低減し、７０％程度まで正確性が向上することが示された。
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼをＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図３に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が５３．５％であるのに対し、ＰＣＮＡを添加することで、２０％もエラー率が低減し、７５％程度まで正確性が向上することが示された。
　これらの結果より、ファミーＢに属するＤＮＡポリメラーゼにＰＣＮＡを添加することで、正確性が１０％以上も向上することが示された。１０％向上することは有意義な差異であり、クローニングやシークエンスにおいて利用が期待される。
実施例８：ＫＯＤ－ＰＣＮＡが与える減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
　ＫＯＤ－ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの例として、実施例３および５で作製したＫＯＤ　Ｈ１４７Ｅ／Ｐ３６Ｈ／Ｙ７Ａ変異体、ＫＯＤ　Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体を使用し、またＰＣＮＡは、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を使用した。
　ＫＯＤ－ＰＣＮＡが　減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、前述のＫＯＤ　ＤＮＡ　ポリメラーゼの評価と同様な方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＫＯＤ－ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表５に記す。ＫＯＤ－ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、２８７８７塩基あたり５個であるのに対し、ＫＯＤ－ＰＣＮＡを添加することで、２８７８７塩基あたり２個に減少することが示された。エラー割合としては、１．７４×１０－４から５．９７×１０－５に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を図４に示す。２種類の減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対して評価を実施した結果、ＰＣＮＡ添加なしでは、エラーのないクローン数が６０％程度であるのに対し、ＰＣＮＡ添加によりエラー率が、１０～２０％低減することが示された。この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
　実施例９：Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体の作製
　Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＥＴ２３ｂにクローニングされたＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ＿ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来のＰＣＮＡ（配列番号２２）（ｐＭｊａ　ＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ｍｊａ－ＰＣＮＡの変異導入部位は、１４２番目であるが、この位置は、配列番号１および２におけるアミノ酸配列の１４３番目に相当する位置である。
実施例１０：Ｍｊａ－ＰＣＮＡの作製
　実施例９で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にてＯＤ６００が０．３～０．６になるまで通気培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体を得た。
実施例１１：Ｍｊａ－ＰＣＮＡが与える減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性評価
　Ｍｊａ－ＰＣＮＡが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの例として、実施例３および５で作製したＫＯＤ　Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体を使用し、またＰＣＮＡは、実施例９および１０で作製したＭｊａ－ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｒ）を使用した。
　Ｍｊａ－ＰＣＮＡが減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するポリメラーゼに与える正確性への影響評価は以下の方法にて行った。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　まず、ＰＣＲにはＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８及び１９）、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ロッシュ・アプライド・サイエンス）、１.５Ｕ　ＫＯＤ　Ｈ１４７Ｅ／Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ変異体、１０００ｎｇ　Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｒ）と混合し、５０μｌの反応液を調製した。
　この反応液を９４℃、２分の前反応の後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、２．５分を２１サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行った。本ＰＣＲ産物は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用しているため３’末端が平滑化されている。そのため、ＰＣＲ産物の平滑末端へのアデニン付加後、ＴＡクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、ＴＡクローニングには、ＴＡｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
ＫＯＤ－ＰＣＮＡが減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、ＰＣＮＡ添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数（エラー塩基数）の割合を算出することで求めた。
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
　前記（１）の方法に従って、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＴＡクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドを抽出、（Ａ）１２のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号２０のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記（１）と同様に実施した。ＫＯＤ－ＰＣＮＡがＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、（Ａ）１２のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
（１）ミスマッチエラーの頻度
　減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のエラー率とＭｊａ－ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表７に記す。Ｍｊａ－ＰＣＮＡ添加なしでは、エラー塩基数が、４４５２９塩基あたり８個であるのに対し、Ｍｊａ－ＰＣＮＡを添加することで、４２１００塩基あたり３個に減少することが示された。エラー割合としては、１．７９×１０－４から７．１３×１０－５に減少しており、ＰＣＮＡ添加により正確性が向上することが示された。
　この結果より、ＰＣＮＡは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２）リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの頻度
　減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＮＡ添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とＭｊａ－ＰＣＮＡ添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図５に記す。ＰＣＮＡ添加なしでは６５％以下であるのに対し、Ｍｊａ－ＰＣＮＡを添加することで、６％もエラーが低減し、７０％程度まで正確性が向上することが示された。
　この結果より、Ｍｊａ－ＰＣＮＡについても、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なＰＣＲにおいて利用が期待される。
　本発明により、核酸増幅（ＰＣＲ）のエラー（例えば、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラー）を低減させることができる。これにより、増幅エラーのない配列を見つけ出すことに時間を要していたクローニングの時間・コストの削減につなげることができる。さらに、シークエンスにおいては、ミスマッチエラー、および／または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーを低減させることができるため、正確なデータ、配列情報が得られることが期待できる。この手法は研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても産業上広く利用することができる。

Claims (10)

  1. 　核酸増幅の正確性を向上させる方法であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
  2. 　ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である請求項１に記載の方法。
  3. 　ＰＣＮＡが、（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、請求項１または２に記載の核酸増幅法。
  4. 　ＰＣＮＡが配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項１－３のいずれかに記載の核酸増幅法。
  5. 　ＰＣＮＡが配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１４２番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である請求項１－３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
  6. 　ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである請求項１－５のいずれかに記載の核酸増幅法。
  7. 　ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼである請求項１－５のいずれかに記載の核酸増幅法。
  8. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１－５のいずれかに記載の核酸増幅法。
  9. 　請求項１－８のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬。
  10. 　請求項１－９のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬を含むキット。
     
     
PCT/JP2015/053760 2014-02-17 2015-02-12 核酸増幅の正確性を向上させる方法 WO2015122432A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015562843A JP6638399B2 (ja) 2014-02-17 2015-02-12 核酸増幅の正確性を向上させる方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014027276 2014-02-17
JP2014-027275 2014-02-17
JP2014-027276 2014-02-17
JP2014027275 2014-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015122432A1 true WO2015122432A1 (ja) 2015-08-20

Family

ID=53800174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/053760 WO2015122432A1 (ja) 2014-02-17 2015-02-12 核酸増幅の正確性を向上させる方法

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JP6638399B2 (ja)
WO (1) WO2015122432A1 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513726A (ja) * 2002-12-20 2006-04-27 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼブレンドおよびその使用
JP2006521112A (ja) * 2003-03-25 2006-09-21 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼ融合物およびその使用
WO2007004654A1 (ja) * 2005-07-04 2007-01-11 Celestar Lexico-Sciences, Inc. 変異型ｐｃｎａ
WO2015019951A1 (ja) * 2013-08-06 2015-02-12 東洋紡株式会社 核酸増幅法
WO2015019952A1 (ja) * 2013-08-06 2015-02-12 東洋紡株式会社 核酸増幅法
JP2015050995A (ja) * 2013-08-06 2015-03-19 東洋紡株式会社 変異型ｐｃｎａ
JP2015050996A (ja) * 2013-08-06 2015-03-19 東洋紡株式会社 変異型ｐｃｎａ

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513726A (ja) * 2002-12-20 2006-04-27 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼブレンドおよびその使用
JP2006521112A (ja) * 2003-03-25 2006-09-21 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼ融合物およびその使用
WO2007004654A1 (ja) * 2005-07-04 2007-01-11 Celestar Lexico-Sciences, Inc. 変異型ｐｃｎａ
WO2015019951A1 (ja) * 2013-08-06 2015-02-12 東洋紡株式会社 核酸増幅法
WO2015019952A1 (ja) * 2013-08-06 2015-02-12 東洋紡株式会社 核酸増幅法
JP2015050995A (ja) * 2013-08-06 2015-03-19 東洋紡株式会社 変異型ｐｃｎａ
JP2015050996A (ja) * 2013-08-06 2015-03-19 東洋紡株式会社 変異型ｐｃｎａ

Also Published As

Publication number Publication date
JP6638399B2 (ja) 2020-01-29
JP2020010702A (ja) 2020-01-23
JP6798594B2 (ja) 2020-12-09
JPWO2015122432A1 (ja) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5241493B2 (ja) Ｄｎａ結合タンパク質−ポリメラーゼのキメラ
JP6579204B2 (ja) 改変された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ
JP2020036614A (ja) 核酸増幅法
JP7014256B2 (ja) 核酸増幅試薬
JP6658796B2 (ja) 核酸増幅方法
JP2019162106A (ja) 変異型ｄｎａポリメラーゼ
JP6798594B2 (ja) 核酸増幅の正確性を向上させる方法
JP6741061B2 (ja) 核酸増幅法
JP7107345B2 (ja) Ｐｃｒ方法
JP7342403B2 (ja) 改変されたｄｎａポリメラーゼ
JP2020162510A (ja) 改変されたｄｎａポリメラーゼ
JP6699560B2 (ja) Ｐｃｎａ単量体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15749319

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015562843

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15749319

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1