WO2007004654A1 - 変異型ｐｃｎａ - Google Patents

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WO2007004654A1
WO2007004654A1 PCT/JP2006/313337 JP2006313337W WO2007004654A1 WO 2007004654 A1 WO2007004654 A1 WO 2007004654A1 JP 2006313337 W JP2006313337 W JP 2006313337W WO 2007004654 A1 WO2007004654 A1 WO 2007004654A1
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pcna
dna
amino acid
pcr
monomer
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PCT/JP2006/313337
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Tadaaki Tokida
Satoshi Hihara
Takashi Kudou
Akira Kawamura
Hirofumi Doi
Yoshizumi Ishino
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Celestar Lexico-Sciences, Inc.
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a DNA replication factor, and more particularly, to a PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) having an excellent function of assisting DNA replication.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • PCR The principle of PCR is thought to be a form that mimics DNA replication in cells to a minimum. In other words, 1) dissociation of the target nucleic acid cage by thermal denaturation, 2) pairing with a pair of primers complementary to the target sequence, and 3) primer complement extension reaction by DNA polymerase. is there. By repeating these reactions continuously, the target nucleic acid sequence is exponentially amplified. Common PCR protocols often amplify several kb of target sequence in the ng order to a microgram order in a reaction of about 2 hours.
  • the PCR method has technical limitations, and the following four points are typical. 1) Fidelity to vertical type (ability to amplify accurate sequence corresponding to vertical type), 2) Extensibility (length, capability to amplify sequence), 3) Amplification efficiency of target sequence, 4) Reaction 4 points of specificity. This at the same time Are often taken up as points to evaluate PCR technology. PCR reagents and kits are being developed with the goal of overcoming these limitations.
  • DNA polymerase (Taq DNA polymerase) derived from the thermophilic bacterium Thermus'aquaticus was generally used (Non-patent Document 1). Based on this enzyme, various PCR enzymes or reagents' kits have since been developed and sold. Reagents' kits with these characteristics that are often improved with respect to the above technical constraint points are sold by manufacturers. An example of PCR method improvement is introduced below.
  • Taq DNA polymerase is a type of Pol I DNA polymerase that has only 5 ′ ⁇ 3 ′ polymerase activity and does not retain 3, ⁇ 5, exonuclease activity.
  • the DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus'furiosus is an ⁇ -type DNA polymerase that retains both 5,3,3 and 5,5 exonuclease activities. 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity functions as proofreading activity. Therefore, when this DNA polymerase is used in a PCR reaction, it does not retain the 3, ⁇ 5 'exonuclease activity, and the type fidelity during amplification is dramatically improved compared to Taq polymerase. Reference 2).
  • DNA polymerases examples include Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio), Pfu DNA polymerase (Stratagene), KO D DNA polymerase (Toyobo), Deep Vent DNA polymerase (New England Biolabs (NEB)), Vent DNA polymerase (NEB), Pwo DNA polymerase (Roche Diagnostics).
  • a hot start method As an example of improving the reaction specificity of PCR, a hot start method is known. Non-specificity of PCR reaction is often caused mainly by non-specific annealing of primers to vertical DNA. To prevent this, a hot start method is effective, in which the PCR reaction is started immediately after complete mixing of the PCR reaction solution at high temperature.
  • the current mainstream method is to form a complex between DNA polymerase and its specific antibody and leave it in an inactive form under low temperature conditions. The PCR is carried out for the first time under the high temperature conditions at the start of the reaction. This method has been reported to increase the specificity of PCR reactions (Patent Document 2). Products that support this hot start method are also sold by each genetic engineering manufacturer and are generally used.
  • Pyrococcus -furiosus PCNA (hereinafter also referred to as “Pfu—PCNA” or “PfuPCNA”) has a molecular weight of 28.0 kDa, and Pfu—PCNA, like eukaryotic PCNA, forms a homotrimer and interacts with polymerase. It has been reported to work and function (Non-Patent Document 6).
  • Pyrococcus' furiosus RFC hereinafter also referred to as “Pfu—RFC” or “PfuRF C” has a subunit structure of RFCS and RFCL.
  • Pfu—RFCS The open reading frame of Pfu—RFCS encodes one intin, and the molecular weight of mature Pfu—RFCS is 37.4 kDa. Pfu—RFCL molecular weight is 55.3 kDa.
  • Pfu—RFC and Pfu—PCNA supplements have been reported to significantly promote the DNA elongation activity of Pfu DNA polymerase (Non-patent Document 7).
  • Pfu—PCNA has been analyzed for crystal structure (Non-patent Document 8). According to it, Pfu-PCNA trimer is a main-chain hydrogen bond between two subunit anti-parallel j8 strands (j8 II and j8 D2) (T108—K178, T110-E176, R112—E174) In addition, an intermolecular ion-pair network with acidic 'basic amino acid side chains is involved in maintaining the trimeric structure. Furthermore, among the residues involved in the ion pair network (R82, K84, R109 in the N-terminal region and E139, D143, D147 in the C-terminal region), D143 and D147 were replaced with the neutral amino acid alanine.
  • Non-patent Document 9 There is a paper (Non-patent Document 9) that examined the two mutants (PfuPCNA (D143A) and PfuPCNA (D143AZD147A)).
  • the paper states that PfuPCNA (D143A) and PfuPCNA (D143AZD147A) elute at the monomer position by gel filtration, and that crystals are obtained as V-shaped dimers instead of trimers. There is a description of the activity measurement results.
  • PfuPCNA (D143AZD147A) does not show DNA synthesis promoting activity when PCNA alone or in combination with RFC, but PfuPCNA (D143A) shows DNA synthesis promoting activity regardless of the presence of RF C, and In the case of PCNA alone, it is said that the results were superior to those of wild type.
  • KOD-PCNAJ KOD-PCNA
  • KOD—RFC OD-RFC
  • KOD—RFC OD-RFC
  • Non-patent document 12 reports KOD—PCNA. According to reports, K OD—PCNA has 249 residues and the calculated molecular weight is 28.2 kDa. The previously reported Pfu-PCNA also has 249 residues, and the amino acid sequences of both are 84.3%. KOD-PCNA, like Pfu-PCNA, retains all the storage regions characteristic of PCNA, and although crystal structure analysis of KOD-PCNA has not been performed, it has high homology with Pfu-PCNA. It is speculated that it is highly possible to form a homotrimer in the same form as Pfu—PCNA.
  • Non-patent document 10 reports the KOD—RFC. According to reports, KO D—RFC has the same RFCL and RFCS subunit structure as other RFCs. RFCL has a molecular weight of 57.2 kDa. The RFCS gene encodes one intein in the open reading frame, and the molecular weight of mature KOD-RFCS is 37.2 kDa.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 5,436,149
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,338,671
  • Non-Patent Literature l Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Hi guchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. Science 239, 487-491 (1988)
  • Non-Patent Document 2 Cline, JC Braman, and HH Hogrefe Nucl. Acids Res.
  • Non-Patent Document 3 Barnes, W. M Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2216-2220 (19 94)
  • Non-Patent Document 4 Waga, S. and Stillman, B. Annu. Rev. Biochem. 6 7, 721-751 (1998)
  • Non-Patent Document 5 Kornberg, A. and Baker, T.A.DNA replication, 2nd ed.W.H.Freeman, New York. (1992)
  • Non-patent document 6 Cann et al, J. Bacteriol, 181, 6591— 6599 (1999)
  • Non-patent document 7 Cann et al J. Bacteriol, 183, 2614-2623 (2001)
  • Non-patent document 8 Matsumiya et al. Protein Sci., 10, 17-23 (2001)
  • Non-patent document 9 Matsumiya et al. Protein Sci. 12, 823-831 (2003)
  • Non-patent document 10 Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Nov; 6
  • Non-patent literature ll Takagi et al. Appl Environ Microbiol. Nov; 63 (ll): 4 504-4510 (1997)
  • Non-Patent Document 12 Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Oct; 66 (10): 2194-2200 (2002)
  • an object is to construct a DNA amplification system that is versatile and easy to use.
  • the present inventors have developed an intracellular DNA replication system in vitro using various factors (hereinafter also referred to as “accessory proteins” and “AP”) used in the DNA replication process described above and DNA polymerase.
  • accessory proteins hereinafter also referred to as “accessory proteins” and “AP”
  • AP DNA polymerase
  • the monomers interact with each other in the interfacial region of each monomer.
  • the amino acid residue at the site that forms the action is composed of amino acid residues that repel charges, and
  • a mutant PCNA monomer that has the activity of promoting DNA replication in the form of a monomer or a multimer.
  • PCNA monomer has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 32 It has an amino acid sequence in which an amino acid residue at at least one position selected is replaced with another amino acid residue,
  • At least one amino acid residue selected from the following group (i) and one or more amino acid residues selected from the following group (ii) are composed of amino acid residues that are repulsively charged: The mutant PCNA monomer according to the above [1].
  • the sites other than the 82nd, 84th, 109th, 139th, 143rd, and 147th sites are selected from the group having addition, insertion, substitution, and deletion ability 1
  • the mutant PCNA monomer according to the above [2] comprising a mutation of several amino acid residues.
  • the mutant PCNA monomer according to [3] above which has a sequence in which the 73rd amino acid residue is replaced with leucine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 32.
  • the transformant according to [8] above is cultured in a medium, and a PCNA monomer and a multimer composed of Z or the monomer are accumulated in the transformant and Z or the medium.
  • a method for producing a mutant PCNA characterized in that
  • a DNA replication reagent comprising the PCNA monomer according to any one of [1] to [6] and a multimer composed of Z or the monomer.
  • a DNA replication kit comprising the reagent according to [10] above.
  • the DNA synthesis reaction is carried out in the presence of the PCNA monomer according to any one of the above [1] to [6] and Z or a multimer composed of the monomer and a DNA polymerase.
  • DNA replication method characterized by the above.
  • the amino acid sequence in the interface region of the PCNA monomer is specified so that the DNA replication reaction can be further promoted.
  • the PCNA of the present invention is applicable to a large number of DNA polymerases with different fungi and is highly versatile. Further, the PCNA of the present invention can exhibit extremely unique performance as compared with the conventional one in that it exhibits excellent DNA elongation promoting activity even in the absence of RFC.
  • a highly versatile DNA replication promoting factor that promotes DNA elongation reaction is provided.
  • a DNA elongation reaction excellent in various properties such as elongation and reaction rate can be performed.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a PCNA trimer.
  • Fig. 2 shows an example of the intermolecular interaction site between monomers formed in the interface region where the monomers are joined when PCNA monomers form multimers.
  • FIG. 3 is a diagram showing a preparation flow of PCNA and RFC gene expression vectors.
  • FIG. 4 is a view showing a PCNA gene expression plasmid.
  • FIG. 5 is a diagram showing a preparation flow of PCNA (protein).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of polyacrylamide gel electrophoresis of a PCNA protein preparation.
  • FIG. 7 shows an RFCL expression plasmid.
  • FIG. 8 is a view showing an RFCSm expression plasmid.
  • FIG. 9 is a view showing a preparation flow of RFC (protein).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of polyacrylamide gel electrophoresis of an RFC sample.
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 2 kb amplification).
  • FIG. 12 shows the effects of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 8.4 kb amplification).
  • FIG. 13 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 15.8 kb amplification).
  • FIG. 14 is a diagram showing the effect of adding PCNA13 to Pyrobest for each extension time when the amplification length is 2 kb.
  • FIG. 15 is a graph showing the PCNA13-added calo effect for Pyrobest for each extension time when the amplification length is 8.4 kb.
  • FIG. 16 is a diagram showing the PCNA13-added caro effect for Pyrobest for each extension time when the amplification length is 15.8 kb.
  • FIG. 17 is a diagram showing the effect of adding PCNA13 to ExTaq for each extension time when the amplification length is 2 kb.
  • FIG. 18 is a graph showing the PCNA13-added caro effect for ExTaq for each extension time when the amplification length is 8.4 kb.
  • FIG. 19 is a diagram showing the effect of adding PCNA13 to ExTaq for each extension time when the amplification length is 15.8 kb.
  • FIG. 20 is a diagram showing the effect of adding PCNA13 to Vent DNA Polymerase for each extension time when the amplification length is 2 kb.
  • FIG. 21 is a graph showing the effect of adding PCNA13 to Vent DNA Polymerase for each extension time when the amplification length is 8.4 kb.
  • FIG. 22 is a diagram showing the effect of adding PCNA13 to Deep Vent DNA Polymerase for each extension time when the amplification length is 2 kb.
  • FIG. 23 is a graph showing the effect of adding PCNA13 to Deep Vent DNA Polymerase for each extension time when the amplification length is 8.4 kb.
  • FIG. 24 is a graph showing the effect of PCNAl 3 added to Pfu Turbo DNA Polymerase.
  • FIG. 25 is a graph showing the effect of adding PCNA13 to KOD DNA Polymerase.
  • FIG. 26 is a graph showing the effect of adding PCNA13 to Pwo DNA Polymerase.
  • FIG. 27 is a diagram showing a flow of preparing a KOD PCNA gene expression vector.
  • FIG. 28 is a view showing a KOD-PCNA gene expression plasmid.
  • FIG. 29 is a diagram showing a flow of preparing a KOD PCNA protein.
  • FIG. 30 is a view showing the results of polyacrylamide gel electrophoresis of a KOD-PCNA protein preparation.
  • FIG. 31 is a diagram showing a flow of preparing a KOD-RFCL gene expression vector.
  • FIG. 32 shows a KOD-RFCL gene expression plasmid.
  • FIG. 33 is a diagram showing a flow of preparing a KOD-RFCSm (mature RFCS) gene expression vector.
  • FIG. 34 is a view showing a KOD-RFCS gene expression plasmid.
  • FIG. 35 is a view showing a flow of preparing a KOD—RFC protein.
  • Figure 36 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of KOD—RFC protein preparation. It is a figure which shows a fruit.
  • FIG. 37 is a diagram showing the effects of adding a KOD-PCNA mutant and KOD-RFC to KOD DNA polymerase.
  • FIG. 38 is a diagram showing KOD-PCNA mutant and KOD-RFC-added caro effect for Pyrobest.
  • FIG. 39 is a diagram showing a measurement flow of PCR type fidelity.
  • FIG. 40 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of a PCNA protein preparation.
  • FIG. 41 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 2 kb amplification).
  • FIG. 42 is a diagram showing the effect of adding PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 8.4 kb amplification).
  • FIG. 43 shows the effects of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 15.8 kb amplification).
  • FIG. 44 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 2 kb amplification).
  • FIG. 45 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 8.4 kb amplification).
  • FIG. 46 is a diagram showing the effect of adding various PCNA mutants and RFC to Pyrobest (in the case of 15.8 kb amplification).
  • PCNA gene PCNA gene ORF
  • T7promoter T7 Flomo ⁇ Ta ' ⁇
  • T7terminator T7 terminator Amp: Ampicillin resistance gene
  • RFCL gene RFCL gene ORF
  • RFCSm gene Mature RFCS gene ORF
  • Kan Kanamycin resistance gene
  • the base sequence, amino acid sequence, and individual constituent elements thereof may be expressed in alphabetical notation, but all of them are in the field of molecular biology and genetic engineering.
  • the notation “D143A” is used in order to simply show the mutation of the amino acid sequence.
  • “D143A” indicates that the 143rd aspartic acid was substituted with alanine, that is, the type of amino acid residue before substitution, its location, and the type of amino acid residue after substitution.
  • sequence numbers correspond to the sequence numbers described in the sequence listing unless otherwise specified.
  • the PCNA monomer of the present invention specifies an amino acid residue at a predetermined position in an interface region that contributes to multimer formation. That is, the PCNA monomer of the present invention is composed of amino acid residues in which the sites that form intermolecular interactions in the interface region repel each other in charge.
  • intermolecular interaction means the physical interaction between molecules. , Chemical or electrical interactions, for example, effects due to the structure of a molecule such as a conformation 'conformation, as well as between various molecules such as ionic bonds, hydrogen bonds, hydrophobic interactions, etc. Effects are included.
  • the multimer is formed by an intermolecular interaction such as the interfacial region between the monomers attracting or joining.
  • the amino acid residues are configured such that the amino acid residues that form intermolecular ion pairs or ion pair networks repel each other electrically.
  • the PCNA monomer of the present invention has an activity of promoting DNA replication as a monomer or forming a multimer.
  • the term “mutant” in the case of “mutant PCNA” means that it has a different amino acid sequence from the conventionally known PCNA. It does not distinguish whether it depends on.
  • PCNA multimers one of the factors involved in DNA replication reactions, are joined by the interface between the N-terminal region of one monomer and the C-terminal region of the other monomer. Formed.
  • the N-terminal region means the site from the N-terminal from the center when the protein is viewed as a single chain
  • the C-terminal region is the region from the C to the C-terminal.
  • Figure 1 shows the PCNA trimer model. As shown in FIG. 1, PCNA monomers 10a, 10b, and 10c are joined to other monomers at each terminal region to form a multimer 1 on the ring structure.
  • FIG. 2 shows a model diagram of the intermolecular interaction of Pyrococcus' furiosus PCNA.
  • FIG. 2 illustrates PCNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (wild-type Pfu—PCNA amino acid sequence).
  • the amino acid residue contained in the N-terminal region of one monomer 10a and the amino acid residue contained in the C-terminal region of the other monomer 10c form an intermolecular pair.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the 139th, 143rd and 147th amino acid residues, and the 82nd, 84th and 109th amino acid residues Groups are thought to form networks that interact with each other.
  • both amino acid residues are composed of acidic amino acids or both are composed of basic amino acids.
  • acidic amino acids include aspartic acid (abbreviation: Asp or D), glutamic acid (abbreviation: Glu or E), and the like.
  • basic amino acids include lysine (abbreviation: Lys or K), arginine (abbreviation: Arg or R), histidine (abbreviation: His or H), and the like.
  • the PCNA of the present invention is obtained by using the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 32.
  • the amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of the 82nd, 84th, 109th, 139th, 143rd and 147th forces is changed.
  • the following (i) at least one amino acid residue whose group strength is also selected and the following (ii) one or more amino acid residues whose group strength is also selected are mutually charged:
  • a form constituted by amino acid residues repelling each other is exemplified.
  • the combination power of (i) at least one amino acid residue selected by force and at least one amino acid residue selected by (ii) is both a combination of acidic amino acids.
  • a certain force is preferably a combination of both basic amino acids. That is, at least one amino acid residue force of each of the groups (i) and (ii) is also selected as an acidic amino acid selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid, and (i) the group and (ii) Each group strength of group (II)
  • a preferred example is a form in which at least one amino acid residue selected is a basic amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine strength.
  • the activity of promoting DNA replication means that DNA replication is promoted compared to the original wild-type PCNA. Specifically, it is described in SEQ ID NO: 2 or 32. It is more preferable that the DNA replication promoting activity is superior to the PCNA monomer having the amino acid sequence described above or a multimer thereof. As another specific index, when the elongation and reaction rate are measured according to the DNA replication activity measurement method shown in the following examples, the elongation and the reaction rate are about the same as those of Taq polymerase, but 10 times or more. It is preferable to have a DNA replication promoting activity that increases the activity up to.
  • the PCNA of the present invention also includes PCNA substantially the same as PCNA having an amino acid sequence containing the above mutation.
  • the PCNA of the present invention for example, it has a preferable DNA replication promoting activity as described above, and the 82nd, 84th, 109th, 139th, 143rd and A mutant PCNA containing a mutation of one or several amino acid residues selected from the group consisting of addition, insertion, substitution, and deletion ability may be mentioned at a site other than the 147th site as long as the effect of the present invention is not inhibited.
  • the “several” is specifically 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 to 10, and particularly preferably 2 to 5.
  • amino acid residues corresponding to positions selected from the groups (i) and (ii) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 32 are configured to repel each other in a chargeable manner. That is, even if the amino acid residues other than the predetermined amino acid residues related to the positions of (i) group and Z or ( ⁇ ) group are not significantly impaired, they are within the range! Other mutations are permissible. Such mutations can include, for example, so-called conservative substitutions of amino acid residues.
  • the number of the acid residue may be different from the number of the amino acid residue before mutagenesis, but it is located within the interface when forming a multimer and interacts with each other (i) And as long as it corresponds to the position shown in (ii), even if the numbers are changed, they are included in the PCNA of the present invention.
  • those containing only the substitution in which the 73rd amino acid residue is replaced with leucine, or those containing other mutations can be easily prepared and purified. Therefore, it is preferable.
  • PCNA of the Present Invention Can Promote DNA Replication Reaction '
  • the mechanism is not necessarily clear, but it has a structure in which the ring structure formed by the multimer is released when the temperature rises. Allows the DNA replication reaction to be repeated smoothly, resulting in DNA replication reaction. It is speculated that the response will be further promoted.
  • PCNA has mainly been thought to function as a DNA replication promoter by exerting a role as a stable clamp by firmly joining monomers together to form a multimer.
  • the present invention provides findings that are different from conventional ones. For the activity of PCNA without the use of RFC, it is not good that the multimer is too tightly bound, especially when the replication reaction such as PCR is repeated. This results in an even better promoting activity than when using wild-type PCNA with RFC.
  • PCNA of the present invention a PCNA monomer having a sequence (D143R) in which the 143rd amino acid residue is also replaced by arginine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 32
  • the body is mentioned.
  • the 143rd amino acid residue belongs to the group (ii).
  • the 82nd, 84th, 109th amino acid residues belonging to group (i) are arginine, lysine, and arginine in this order, and this intermolecular interaction is usually in the interface region. It is possible to form a state that is more contradictory.
  • PCNA of this form exhibits a particularly excellent auxiliary action with a good balance in terms of the elongation and reaction rate of the DNA replication reaction.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the PCNA of the present invention.
  • the base sequence is deduced to amino acids by the codon table.
  • One amino acid sequence can be encoded by multiple base sequence species by codon condensation.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 32 is encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 31, for example. Therefore, one embodiment of the polynucleotide of the present invention includes the following polynucleotide (a).
  • the polynucleotide having the base sequence as shown in (a) can be easily obtained by modifying the base sequence at the site corresponding to the amino acid residue at the predetermined position in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 31. Can be produced. Also, base sequence conversion based on amino acid type Can be easily converted based on the codon table.
  • the polynucleotide referred to in this specification includes DNA and RNA, and may be single-stranded or double-stranded, and also a DNA and RNA chimera or a hybrid of DNA and RNA. Etc. are included.
  • Polynucleotides as shown in (b) below may also be included in the polynucleotide of the present invention.
  • a probe that can be used to obtain a gene to be hybridized can be prepared by a conventional method based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 31, for example.
  • a method for isolating a target polynucleotide by lifting a polynucleotide hybridizing with the probe using a probe may be performed according to a conventional method.
  • a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned into a plasmid or a phage vector, cutting out and extracting the base sequence to be used as a probe with a restriction enzyme. The cut-out location can be adjusted according to the target DNA.
  • the "stringent conditions” refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. 60 ° C, 1 X SSC is a condition washing ⁇ of typical Southern hybrida I See sucrose emissions, 0. 1 0/0 SDS, preferably ⁇ or, 0. 1 X SSC, equivalent to 0. 1% SDS The conditions for hybridizing at a salt concentration are included.
  • the polynucleotide that hybridizes “under stringent conditions” the polynucleotide of (b) is preferably 50% or more, more preferably 80% or more, more preferably, more than the polynucleotide of (a). It is preferable to have a homology of 90% or more, more preferably 95% or more. As a homology calculation method, for example, BLAST, FASTA, ClustalW, etc. can be used.
  • a protein having an amino acid sequence obtained by translating the base sequence has DNA replication promoting activity. More specifically, the above-described tongue of the present invention. It has DNA replication promoting activity similar to that described for the protein.
  • the polynucleotide of the present invention can be incorporated into an appropriate vector and used as a recombinant polynucleotide.
  • a recombinant polynucleotide is a hybrid molecule in which two or more polynucleotides are linked.
  • a preferred form of the recombinant polynucleotide of the present invention is an expression vector.
  • Various forms of expression vectors are already known and some are commercially available.
  • the form of the recombinant polynucleotide may be a known expression vector such as a commercially available expression vector which is appropriately selected depending on the application. Although not limited to the following, specific examples related to the expression vector are shown.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUCI3, commercially available products such as pBT Vector, pTRG Vector (Stratagene), etc.
  • plasmids derived from enzymes eg, YEp24, YCp50
  • Butteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus
  • plasmids suitable for Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194, etc.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host cell used for gene expression.
  • the host cell is an Escherichia bacterium, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 pp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host cell is a Bacillus bacterium, the SPOl promoter, Examples include the SP02 promoter and penP promoter.
  • yeast examples include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like.
  • the host cell is an insect cell, examples include polyhedrin promoter and P10 promoter.
  • SRa promoter, SV40 promoter, HIV 'LTR promoter, CMV (cytomegaloinores) promoter, HSV-IV promoter and the like can be mentioned.
  • the expression vector preferably has a multicloning site from the viewpoints of recombination operations, easy handling, and ease.
  • expression vectors may be selected as desired.
  • Selectable marker, enhancer, splicing signal, poly A-attached signal, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori), terminator, etc. can be incorporated.
  • selectable markers include ampicillin resistance gene (also referred to as carbe-silin resistance gene; hereinafter abbreviated as Amp), kanamycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Kam), tetracycline resistance gene.
  • a signal sequence suitable for the host cell is added to the N-terminal side of the random oligonucleotide or cassette of the present invention. If the host cell is Escherichia genus, force such as PhoA 'signal sequence, Omp A signal sequence, etc. If the host cell is Bacillus, a amylase' signal sequence, subtilisin 'signal sequence, etc.
  • MF a signal sequence, SUC2 'signal sequence, etc.
  • the host cell is an animal cell
  • the insulin' signal sequence, a interferon 'signal sequence, Ras farnesylation signal sequence, etc. available.
  • an expression vector containing the polynucleotide of the present invention can be prepared, and introduced into a host cell to produce a transformant that expresses the DNA polymerase of the present invention.
  • Examples of host cells include bacterial cells such as streptococci, staphylococc i, Escherichia coli, Streptomyces, and Bacillus subtilis. ; Fungal cells such as yeast, Aspergillus; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9; CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes (Bows) Animal cells such as melanoma cells and hematopoietic cells; and plant cells.
  • bacterial cells such as streptococci, staphylococc i, Escherichia coli, Streptomyces, and Bacillus subtilis.
  • Fungal cells such as yeast, Aspergillus
  • insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9
  • CHO COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes (Bows) Animal cells such as melanoma cells and hema
  • the culture of the transformant may be adjusted according to the type of the host.
  • the medium used for the culture may be a liquid medium or an agar medium, and the carbon necessary for the growth of the transformant may be included.
  • Source, nitrogen source, inorganic substance, etc. are added.
  • Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose
  • examples of the nitrogen source include ammonium salt, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal
  • examples of inorganic or organic substances such as potato extract and inorganic salts include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium salt.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Specific examples of a suitable medium for culturing Escherichia bacteria include LB medium containing yeast extract, tryptone, and salt (NaCl).
  • an inducing agent such as isopropyl 1-thio j8-D-galactoside (IPTG) may be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • IPTG isopropyl 1-thio j8-D-galactoside
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the host is Bacillus, culture is usually performed at about 30-40 ° C for about 6-24 hours, with aeration and agitation if necessary.
  • examples of the medium include Burkholder's minimum medium and SD medium containing 0.5% casamino acid.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Incubate at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours with aeration or agitation if necessary.
  • the medium when cultivating a transformant whose host is an insect cell or an insect, the medium was immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)) 10 A product obtained by appropriately adding an additive such as% urine serum is used. Medium The pH is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Incubate at about 27 ° C for about 3 to 5 days with aeration or agitation as necessary.
  • examples of the medium include MEM medium containing about 20 to 20% fetal bovine serum, DMEM medium, RPMI 1640 medium (The Journal of the American Medical Association, 199 ⁇ , 519 (1967)), 199 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 ⁇ , L (1950)), etc. are used.
  • the pH is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-60 hours, with aeration and agitation as necessary. Adjust the CO concentration if necessary.
  • the protein of the present invention produced in the transformant can be purified and isolated by a conventional protein purification method, if necessary. As described above, the PCNA of the present invention can be obtained using the transformant.
  • the DNA replication method of the present invention is characterized in that a DNA synthesis reaction is carried out in the presence of a PCNA monomer and Z or a multimer composed of the monomer and a DNA polymerase.
  • DNA synthesis methods include PCR, primer extension, nick translation, and first strand cDNA synthesis using reverse transcriptase.
  • DNA amplification by PCR is a preferred form.
  • DNA replication is repeated using primers and saddle-type DNA, and DNA is amplified several times in succession. Therefore, PCNA functions as a clamp for DNA polymerase, and the PCNA of the present invention, which is desired to release rapidly after the DNA polymerase is stabilized on the mold or after amplification of a predetermined region, is used. This is presumed to have such characteristics.
  • the PCNA of the present invention is highly versatile because it is compatible with various DNA polymerases.
  • DNA polymerases are usually superior in either extensibility or fidelity, and generally have advantages and disadvantages.
  • the extensibility can be improved without reducing the fidelity, so that the DNA replication activity can be enhanced while reinforcing the disadvantages of the DNA polymerase.
  • DNA polymerer used for the DNA replication method of the present invention Preferably, for example, Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio), Ta KaRa EX Taq (Takara Bio), Vent DNA Polymerase (NEW ENGLAN D Bio Labs), Deep VentR DNA Polymerase (New England Biolabs), Pfu It can be applied to most DNA polymerases currently used mainly, such as Turbo DNA Polymerase (Stratagene), KOD DNA Polymerase (Toyobo), and Pwo DNA Polymerase (Roche Diagnostics).
  • the PCNA of the present invention is particularly effective in improving extensibility and is particularly useful in combination with a 0L-type polymerase of a type having excellent fidelity and inferior extensibility.
  • the PCNA of the present invention since the PCNA of the present invention does not require RFC, it is not necessary to add RFC to the reaction system.
  • RFC standards are generally not commercially available and their preparation is laborious. Even if RFC standards can be used, it is necessary to set conditions such as appropriate quantitative ratios with other factors of DNA replication system other than RFC. There is a merit that it is not necessary to consider.
  • the PCNA of the present invention exhibits superior accelerating activity than when wild-type PCNA and RFC are used together, without using RFC together.
  • the PCR conditions include, for example, the amount of DNA polymerase added, PCR reaction time, reaction solution temperature setting, reaction solution components, reaction solution pH, and amount of vertical polynucleotide to be added. Various conditions are adjusted.
  • the reagent kit of the present invention is a reagent kit for DNA replication containing the PCNA of the present invention and other reagents as necessary.
  • the PCNA of the present invention can be suitably used as a component of a DNA replication reagent in a form containing a monomer and / or a multimer composed of the monomer. Since the reagent kit of the present invention can be particularly preferably used in the PCNA force SPCR of the present invention, it is particularly suitable as a reagent kit for PCR.
  • PCNA provided in the reagent kit of the present invention may be in any form of a purified protein, a recombinant polynucleotide incorporating a protein-encoding polynucleotide. Examples of forms such as transformants into which this recombinant polynucleotide has been introduced are exemplified. Preferred forms of the recombinant polynucleotide and transformant are as described above. Further, the PCNA of the present invention may be combined with another PCNA. In addition, when the PCNA of the present invention is provided in the form of recombinant DNA or transformant, reagents and the like used to express the PCNA of the present invention may be provided. In addition, the reagent containing the PCNA of the present invention may be blended with other components and media generally used as a biotechnology reagent, if necessary.
  • PCNA mutant protein preparations and RFC protein preparations were prepared by expressing these genes in large quantities in E. coli and purifying the proteins from the expressed cells.
  • pretinase K (20 mgZmL) was added, and the mixture was allowed to stand at 55 ° C for 60 minutes. Subsequently, the reaction solution was extracted successively with phenol, phenol Z chloroform extract, and chloroform extract, and ethanol was added to insolubilize DNA. The recovered DNA was dissolved in 1 mL of TE solution (10 mM Tris—CI, pH 8.0, ImM EDTA), and 0.75 mg of Rnase A was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After that, extract the reaction solution again with phenol, phenol / chloroform, and chloroform, and then add ethanol to remove the DNA. It was collected.
  • TE solution 10 mM Tris—CI, pH 8.0, ImM EDTA
  • the Pfu—PCNA gene was registered in the NCBI database! And was obtained by cloning using PCR (FIG. 3) with reference to ABO 17486 (SEQ ID NOS: 1 and 2). Details will be described below.
  • Pfu-PCNA-F and Pfu-PCNA-R were used for amplification of the Pfu-PCNA gene. These sequences are designed to amplify the region corresponding to the stop codon from the start methionine of the PCNA gene, and to add a restriction enzyme Ndel recognition site and a restriction enzyme Xhol recognition site on the 5 'side.
  • the sequence of each primer is shown in Table 1 (SEQ ID NOs: 3 and 4).
  • Pfu genomic DNA prepared in 1.1.1 above was used as the PCR template.
  • the PCR reaction solution was performed with the following composition. (Amount added to 50 L reaction system)
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° Clmin.
  • PCR reaction product After subjecting the PCR reaction product to 1% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, a gel containing a band near 800 bp was excised under UV irradiation, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biotechnology) The PCR product in the gel was purified according to the same operation manual using Science.
  • the purified PCR product was subjected to a ligation reaction according to the operation manual using pUC118—HincIlZBAP and TaKaRa BKL Kit (both Takarabio).
  • E. coli DH5a (Takara Bio Inc.) is transformed with this ligation product and seeded on LB agar plates (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, and X-GAL each 40 ⁇ g / mL) 37
  • the culture was allowed to stand at 0 ° C. to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • a white E. coli colony on an agar plate was cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the restriction enzyme Hindi recognition site of the plasmid vector pUC118 was examined using a DNA sequencer. As a result, it was confirmed that the open reading frame of the Pfu-PCNA gene was retained in the insertion part, and that the restriction enzyme Ndel recognition sequence was added to the 5 'end and the restriction enzyme Xhol recognition sequence was added to the 3' end.
  • This plasmid vector retaining the Pfu—PCNA gene open reading frame was named pUCZPPC.
  • pUCZPPC was double cleaved with restriction enzymes Ndel and Xhol to prepare a PCNA gene fragment.
  • the gene fragment was inserted into an expression vector to prepare an expression vector for Pfu-PCNA.
  • pET-21a vector DNA (Novagen, USA) was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xhol by the following reaction.
  • the Pfu-PCNA DNA fragment (lOOng) and pET-21a DNA fragment (50 ng) obtained above were reacted as follows using DNA Ligation Kit V2 (Takara Bio Inc.).
  • DNA Ligation kit V2 Enzyme solution 5 L The sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes.
  • the ligation product (3 ⁇ L) was used to transform 100 ⁇ L E. coli BL21 (DE3) (Novagen), and the E. coli solution was plated on an LB agar plate (100 ⁇ g ZmL ampicillin). The culture was allowed to stand at 1 ° C. Three of the E. coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • a DNA sequencer was used to examine the DNA sequence inserted into the plasmid vector pET-21a and the sequence in the vicinity of the insertion site. As a result, the ORF (open reading frame) of the Pfu-PCNA gene was completely inserted into the Ndel and Xhol parts of the multicloning site. This plasmid carrying the Pfu-PCNA gene was called pPPCNA (Fig. 4).
  • the T7 promoter retained by pET-21a can be arranged in the order of rbs (ribosome binding site), PCNA gene ORF (open reading frame), and T7 terminator. confirmed. This plasmid was expected to express a large amount of PCNA gene.
  • Amino acid substitutions were made to Pfu-PCNA for the purpose of producing more sophisticated PCNA. Amino acid substitution was performed by substituting the base of the codon encoding the amino acid. Amino acid mutations were introduced at the mutation sites shown in Table 2.
  • Mutation into the PCNA gene can be performed using the mutation-introducing plasmid and the mutagenesis oligo pair (Table 3, SEQ ID NOs: 5 to 12) and Quik Change II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the operation manual. went.
  • Non-patent Document 6 when natural Pfu—PCNA was prepared as a recombinant protein using E. coli as a host, in addition to the translated protein from the original starting Met, the N-terminus was 73 A protein of about 20 kDa starting from the residue is produced as a by-product, and when the Met at residue 73 is replaced with 1 residue in Leu using genetic engineering techniques, this protein of about 20 kDa is suppressed. has been reported. In addition, it has been reported that the Pfu-PCNA produced in this way has V properties that are different from the wild-type PCNA protein. Based on these facts, the Pfu—M73L mutation is treated as a quasi-wild type in this specification.
  • Pfu-M73L mutant was designated as Pfu-PCNA01 to prepare a mutant.
  • Pfu-PC NA01 was prepared by using a p-type PPCNA as a cocoon-type plasmid and a mutagenesis oligo pair (Pfu-M73LF and Pfu-M73L-R).
  • Pfu PCNA 10 is a mutation in which the amino acid at residue 143 of Pfu—PCNAO 1 is replaced by one residue from D to A, and the structure and properties have been reported by Matsumiya (Non-patent Document 9). According to reports, aspartic acid at residue 143 is located at the interface when Pfu-PCNA forms a homotrimer, and is part of the amino acid involved in trimer formation. It has been reported that the conversion of the target aspartate to alanine results in inhibition of the trimer formation but maintains the DNA polymerase activity stimulation itself!
  • the PCNA mutant having the double mutation of D143A and M73L was designated as Pfu-PCNA10, and the Pfu-PCANAO 1 production plasmid was used as a saddle for the production of Pfu-D143A-F and Pfu-D143A. — R mutagenesis oligo was used.
  • Pfu—PCNA 12 is a mutation in which the amino acid at the 82nd residue is replaced with a C residue at the R force. According to Matsuyama (Non-patent Document 9), arginine at the 82nd residue is homozygous for Pfu—PCNA. It is reported that it is located at the interface when forming a polymer.
  • the PCNA mutant having the double mutation of R82C and M73L was designated as Pfu-PCNA12.
  • Pfu-PCANA01-producing plasmid was used as a saddle and Pfu R82C-F and Pfu R82C—R mutagenesis oligo was used.
  • arginine at 82th residue and 14 aspartic acid at 13rd residue which are highly related to formation into a trimer.
  • the Pfu-PCNA12 production plasmid was used as a saddle type, and was prepared using oligos for mutagenesis of Pfu-D143R-F and Pfu-D143R-R.
  • a mutant was prepared by substituting the 143th amino acid with lysine (basic amino acid). Even with the same basic amino acid, the pK value of the guanidinium group in the side chain of anoreginin is 12.48, butinole of the side chain of lysine
  • ammonium group has a pK value of 10.54, and lysine is less basic.
  • a mutant was prepared by substituting the 143th amino acid with histidine (basic amino acid).
  • histidine basic amino acid
  • the pK value of the side chain of histidine is 6.0 and dissociates at physiological pH. Histidine has an imidazole group at ⁇ 6.0.
  • the expression plasmid is a Pfu-PCNAOl production plasmid, which is a cocoon-shaped plasmid, using oligos for mutagenesis of Pfu D143H-F and Pfu D143H-R. Produced.
  • Pfu PCNA is located at the interface when forming homotrimers, and the 109th residue arginine (basic amino acid), which is part of the amino acids involved in trimer formation, was replaced with glutamic acid (acidic amino acid). Mutants were made.
  • the expression plasmid was prepared using Pfu-R109E-F and Pfu-R109E-R mutagenesis oligos in a Pfu-PCNA01-producing plasmid.
  • Pfu PCNA is located at the interface when forming homotrimers, and aspartic acid (acidic amino acid) at residue 147, which is part of the amino acids involved in trimer formation, is replaced with arginine (basic amino acid). Mutants were made.
  • the expression plasmid was constructed using the Pfu-D147R-F and Pfu-D147R-R mutagenesis oligos using the Pfu-PCNA01-producing plasmid as a saddle.
  • Pfu PCNA is located at the interface when forming homotrimers, replacing glutamic acid (acidic amino acid) at residue 139, which is part of the amino acids involved in trimer formation, with alanine (neutral amino acid) Mutants were made.
  • the expression plasmid was constructed using the Pfu-E139A-F and Pfu-E139A-R mutagenesis oligos, using the Pfu-PCNA01 production plasmid as a saddle.
  • Pfu PCNA was located at the interface when forming homotrimers, and glutamic acid (acidic amino acid) at residue 139, which is part of the amino acid involved in trimer formation, was replaced with arginine (basic amino acid). Mutants were made.
  • the expression plasmid was prepared by using Pfu-E139R-F and Pfu-E139R-R mutagenesis oligos with the Pfu-PCNA01-producing plasmid as a saddle.
  • Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL (Stratagene) was transformed with the mutant PCNA expression plasmid vector obtained as described above, and the expression colon of each mutant gene was expressed. A strain was obtained.
  • Each mutant PCNA expression strain was cultured with shaking at 37 ° C in 1.5 liter LB medium (containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin). When the OD in the logarithmic growth phase is 0.3-0.5, the final concentration is 0.1.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the cells were collected by centrifugation (S51), disrupted (ultrasonic disruption, S52), boiled for 5 minutes (S53), precipitated with polyethylenimine (S54), and then precipitated with ammonium sulfate. (S55), and a sample was prepared by ion exchange chromatography (S56, using HiTrap Q as the column) and gel filtration chromatography (S57, using Superdex 200). SDS—PAGE confirmed that the product was well purified.
  • Bacteria precipitated by centrifugation were collected in 25 mL of buffer A (50 mM Tris—HCl pH 8.5, 0.1 M NaCl, 2 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol) or buffer B (50 mM Tris—HCl pH 8.0). , 0.1 M NaCl, 0. ImM ED TA, 10% glycerol, 0.5 mM DTT). The cells were crushed by ultrasonic treatment.
  • the cell disruption solution was boiled for 5 minutes and then centrifuged (18,500xg, 4 ° C, 25 minutes) to recover the supernatant.
  • polyethyleneimine (SIGMA P-3143) and NaCl were added to final concentrations of 0.2% (w / v) and 0.58 M, respectively, and stirred on ice for 30 minutes.
  • the solution was centrifuged (18,500 Xg, 25 minutes, 4 ° C), and the supernatant was collected.
  • the RFC consists of two subunits, RFCL and RFCS, located in tandem on the Pyrococcus-furiosus genome.
  • RFCL and RFCS genes were placed on expression vectors separately, and each expression vector was introduced into the same host and expressed simultaneously.
  • Non-Patent Document 7 was referred to. Details are shown below.
  • Pfu—RFCL gene (NCBI GeneID1467921) was obtained by PCR using the Pfu genome as a cage (base sequence, SEQ ID NO: 13; amino acid sequence, SEQ ID NO: 14).
  • RFCL F primer and RFCL-R primer were used as PCR primers (Table 4; SEQ ID NOs: 15 and 16).
  • RFCL— F primer has restriction enzyme Ndel due to clawing operation The recognition site and the RFCL-R primer were each added with a restriction enzyme Xhol recognition site.
  • Pfu genomic DNA prepared in 1.1 above was used as the PCR template.
  • the PCR reaction was performed with the following composition. (Amount added to 50 ⁇ L reaction system)
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° Clmin.
  • PCR reaction product After subjecting the PCR reaction product to 1% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, a gel containing a band around 1.4 kb was excised under UV irradiation, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit ( The PCR product in the gel was purified according to the same operation manual using Amersham Bioscience).
  • the purified PCR product was subjected to a ligation reaction according to the operation manual using pUC118—HincIlZBAP and TaKaRa BKL Kit (both Takarabio).
  • E. coli DH5a (Takara Bio Inc.) is transformed with this ligation product and seeded on LB agar plates (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, and X-GAL each 40 ⁇ g / mL) 37
  • the culture was allowed to stand at 0 ° C. to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • a white E. coli colony on an agar plate was cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 gZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the restriction enzyme Hindi recognition site of the plasmid vector pUC118 was examined using a DNA sequencer. As a result, insert It was confirmed that the open reading frame of the Pfu-RFCL gene was retained in the part, and the restriction enzyme Ndel recognition sequence was added to the 5 'end and the restriction enzyme Xhol recognition sequence was added to the 3' end.
  • This plasmid was designated as pUC118 / RFCL.
  • PUC118ZRFCL was double cut with restriction enzymes Ndel and Xhol to prepare an RFCL gene fragment.
  • the gene fragment was inserted into an expression vector to prepare a Pfu-RFCL expression vector.
  • pUC118ZRFCL was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xhol in the following reaction system.
  • pET-29a vector DNA (Novagen) was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xho I according to the following reaction.
  • Plasmid DNA 2 ⁇ &
  • the Pfu-RFCL DNA fragment (lOOng) and pET-29a DNA fragment (50 ng) obtained above were reacted as follows using DNA Ligation Kit V2 (Takara Bio Inc.).
  • the sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes.
  • the ligation product (3 ⁇ L) was used to transform 100 ⁇ L E. coli BL21 (DE3) (Novagen), and the E. coli solution was seeded on an LB agar plate (containing 30 ⁇ g ZmL kanamycin). Then, the cells were statically cultured at 37 ° C. Three Escherichia coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 30 ⁇ g ZmL kanamycin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the plasmid vector pET-29a and the sequence near the insertion site were examined using a DNA sequencer.
  • the ORF (open reading frame) of the Pfu-R FCL gene was completely inserted into the Ndel and Xhol parts of the multicloning site.
  • the plasmid carrying the Pfu-RFCL gene was called pRFCL (Fig. 7).
  • T7 promoter retained by pET-29a, rbs (ribosome binding site), RFCL gene ORF (open reading frame), and T7 terminator are arranged in this order. It was done. This plasmid was expected to express a large amount of RFCL gene.
  • Pfu— RFCS gene (GenelD: 1467922), according to Non-Patent Document 7, has one intin (encoded by 1,575 bases), 177 bases at the N-terminal, 804 bases at the C-terminal. It is reported that it is coded (it does not include the start codon) .
  • SEQ ID NOs: 17 and 18 show the base sequence and amino acid sequence of Pfu-RFCS (both including an intin portion).
  • RFCS RFCS expression vector
  • the full length Pfu-RFCS gene containing intin was amplified using PCR reaction, and then mature RFCS (also referred to as RFCSm) from which intin was removed was prepared. Intin removal was performed by individually amplifying the N-terminal and C-terminal extines by PCR, and then fusing the two extine fragments by PCR.
  • PCR reactions were performed with combinations of Pfu genome (prepared in 1.1 above), RFCS-F, RFCS-R primers (Table 5; SEQ ID NOs: 19, 20).
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° C ⁇ lmin.
  • PCR reaction product After subjecting the PCR reaction product to 1% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, a gel containing a band around 2.6 kb was excised under UV irradiation, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit ( The PCR product in the gel was purified according to the same operation manual using Amersham Bioscience).
  • the purified PCR product was subjected to a ligation reaction according to the operation manual using pUC118—HincIlZBAP and TaKaRa BKL Kit (both Takarabio).
  • E. coli DH5a (Takara Bio Inc.) is transformed with this ligation product and seeded on LB agar plates (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, and X-GAL each 40 ⁇ g / mL) 37
  • the culture was allowed to stand at 0 ° C. to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • a white E. coli colony on an agar plate was cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 gZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the restriction enzyme Hindi recognition site of the plasmid vector pUC118 was examined using a DNA sequencer. As a result, the insert was consistent with the RFCS gene containing intin. This plasmid is called pUCZRFCS It was.
  • RFCSF1 primer and RFCSR2 primer (Table 5; SEQ ID NOs: 21 and 23) were prepared as PCR primers for N-terminal westin.
  • RFCSF2 primer and RFCSR1 primer (Table 5; SEQ ID NOs: 22 and 24) were prepared as PCR primers for C-terminal westin.
  • the RFCSF1 primer has a restriction enzyme Ndel sequence added to the RFCSF1 primer and a restriction enzyme Sail sequence added to the 5 'end for easy cloning.
  • the RFCS F2 primer and the RFCSR2 primer were provided with complementary sequences to be used when two types of ecstein fragments were fused by PCR reaction.
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° C ⁇ lmin.
  • the PCR reaction product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide. A band of about 180 bases was observed in the PCR product of the RFCSF1 primer and the RFCSR2 primer set, and a band of about 800 bases was observed in the PCR product of the RFCSF2 primer and the RFCSR1 primer set. Cut out the gel containing each band under UV irradiation and purify the PCR product in the gel using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences) according to the same operation manual. went.
  • N-edge ecstein fragment 2 ⁇ L ⁇ (50 ng equivalent)
  • the sterilized water was added to make 44.5 ⁇ L.
  • PCRSF1 primer and the RFCSR1 primer were added together with the above-mentioned 1Opmol, and the PCR reaction was performed with a program that repeated 95 ° C-3 Osec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° C ⁇ lmin for 30 cycles.
  • the PCR reaction product was purified by ethanol precipitation according to a conventional method.
  • the purified DNA fragment was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Sail.
  • pET-21a vector DNA (Novagen) was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Sail according to the following reaction.
  • the sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes.
  • E. coli BL21 (DE3) (Novagen) was transformed with this ligation product (3 ⁇ L), and the E. coli solution was seeded on LB agar plates (containing 100 ⁇ gZmL ampicillin) Then, the cells were statically cultured at 37 ° C. Three of the E. coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a standard method. [0163] 1. 5. 2. 13: Sequence confirmation by sequencing
  • the T7 promoter retained by pET-21a, rbs (ribosome binding site), mature RFCS gene ORF (open reading frame), and T7 terminator are arranged in this order. confirmed. This plasmid was expected to express a large amount of mature RFCS gene.
  • Escherichia coli BL21—CodonPlus (DE3) —RIL was simultaneously transformed with pRFCL and pRFCSm, and a transformant carrying both plasmids was selected by double selection of ampicillin and kanamycin to obtain an expression strain.
  • the above expression strain was cultured with shaking in 1.5 liter LB medium (containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 30 ⁇ g / mL kanamycin) at 37 ° C. OD of logarithmic growth phase is 0.3-3.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopy ranoside
  • the bacterial cells were collected by centrifugation (S91), disrupted by ultrasonic disruption (S92), boiled for 5 minutes (S93), subjected to polyethyleneimine precipitation (S94), and then ammonium sulfate. Precipitation was performed (S95), and preparations were prepared by affinity chromatography (S96, using HiTrap Heparin) and gel filtration chromatography (S97, using Superdex 200). SDS
  • the cell disruption solution was boiled for 5 minutes and then centrifuged (18,500xg, 4 ° C, 25 minutes) to recover the supernatant.
  • Polyethyleneimine (SIGMA P-3143) was added to the supernatant to a final concentration of 0.18% (wZv) and stirred on ice for 30 minutes. This solution was centrifuged (18,500 ⁇ g, 25 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was collected.
  • the dialyzed sample was purified using a HiTrap Heparin HP column (Amersham Biosciences).
  • the elution conditions are 0.1 -0.8 M NaCl / 17.5 mL linear gradient, and the flow rate is 1 vaL / min.
  • the standard PCR reaction solution composition was used, and the attached reaction buffer (10x Pyrobest Buffer II; composition not yet published, Takara Bio Inc.) was used as the buffer. .
  • the composition of the PCR reaction solution is shown below. Lambda DNA (GenBank accession 02459) was used as the vertical DNA.
  • PCNAxx stock solution concentration 100 ng, RFC stock solution concentration; 500 ng / jt L Buffer *: 25 mM TrisCI pH 8.0, 50 mM NaCI, 50% Glycerol
  • the amplification size is 2 kb or 8.4 kb
  • amplification can be seen only when 400 ng of RFC is added, but in other cases, the PCNA01 has a non-added (no AP) addition. It works in a comparatively inhibitory manner. This is a result of the primer extension test that shows that when wild-type PCNA is used, it cannot be amplified unless an appropriate amount of RFC is used in combination. Unlike 6 and 9), it has been shown that wild-type PCNA supplementation clearly inhibits the reaction in PCR.
  • amplification size is 2 kb or 8.4 kb
  • amplification is observed when RFC is added to 200 ng or 400 ng.
  • the amplification size is 15.8 kb
  • amplification is observed only when RFC 400 ng is added.
  • the amount of amplification is superior to that of PCNA01.
  • PCNA01 Like PCNA01, the existence of RFC is required, suggesting that the optimum amount of RFC varies depending on the amplification size.
  • the amplification amount was promoted by adding the RFC for any amplification size of 2 kb, 8.4 kb, or 15.8 kb. It was also amplified in RFC non-attached models. However, compared to the PCR enzyme alone, some amplification and power are observed.
  • PCNA16 Amplification sizes of 2 kb, 8.4 kb, and 15.8 kb were confirmed in large amounts, and the amount of amplification did not depend on the amount of added RFC. The effect of PCNA13 supplementation does not require an RFC, and is thought to significantly promote PCR amplification. [0190] PCNA16
  • PCNA13 was overwhelmingly amplified when added as compared to when not added. It was found to be highly effective and does not require the addition of RFC.
  • PCNA13 (D143R) 2. Similar to the results in 1.1.4, a large amount of amplification was observed regardless of the RFC at any size, and the amplification level was better than PCNA70.
  • PCNA10, 13, 70, 71 The effect of addition to the PCR reaction system was examined for four variants (PCNA10, 13, 70, 71) in which mutations were introduced at residue 143 of PCNA V, but it did not depend on RFC. Only PCNA70 (D143K) and PCNA13 (D143R) showed a promoting effect, and PCNA13 substituted with a more basic arginine residue showed the strongest promoting effect. Therefore, in order to bring about the PCR-promoting effect of PCNA alone by introducing mutations into D143 residue, it is necessary to replace it with an amino acid residue that shows basicity. It is considered that it is important that the positive charge possessed by .about.0-) causes charge repulsion to the ion pair network at the monomer interface.
  • RFC 200-400 ng is added at the same time, and the presence of the RFC is essential for the power amplification that has been confirmed to be effective. Addition inhibited the reaction. In comparison with PCNA79, when 200 ng of RFC was added simultaneously, the amount of amplification was inferior to that of PCNA79 when 400 ng of RFC, which was different in strength depending on the amplification size, was added simultaneously.
  • substitution with a basic amino acid (arginine) is considered to be more effective than neutral amino acid (alanine).
  • Pfu—PCNA is located at the interface when homotrimers are formed, and among the amino acids involved in the formation of trimers, the effect of addition of substitution mutations in 4 types to the PCR reaction system
  • Addition alone inhibits the reaction, but when RFC is added at the same time, the reaction recovers depending on the amount of addition of RFC, and depending on the amount of addition, better amplification is observed than when no addition (no AP) is added. something like. It is assumed that there is almost no change from the case of single addition and simultaneous addition of RFC (no AP) and that it is not involved in the reaction. It promotes reaction with or without RFC.
  • trimer structure is too rigid, the reaction will not proceed without the help of the RFC. If the ability to form a trimer is lost, it cannot function as a clamp. It is speculated that a moderately weak trimer structure in the middle is important for promoting enzyme activity in PCR.
  • trimer formation ability effective for promoting enzyme activity in PCR is realized.
  • trimer is likely to dissociate at high temperatures by weakening the ion-pair network, which is presumed to contribute to thermal stability.
  • a reaction mechanism in which the replication reaction is repeated when the temperature rises to the next cycle in PCR or when the trimer dissociates at the high temperature of the first denaturation step of the cycle is inferred.
  • Pyrobest DNA Polymerase is a thermostable a-type DNA polymerase having 3 ⁇ 5 exonuclease activity (proof reading activity) derived from Pyrococcus' sp.
  • PCNA13 stock solution concentration 100ng / ⁇ L, Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
  • TaKaRa EX Taq (Takara Bio Inc.) is a metathermic DNA Polymerase with 3, ⁇ 5, exonuclease activity (proof reading activity). Under normal PCR conditions, high sensitivity PCR can be realized with higher amplification efficiency and lower error rate than conventional Taq DNA Polymerase.
  • Electrophoresis After the PCR reaction, add 5 L of 10x loading buffer (Glycerol 50%, Bromphenol BlueO. 4%, Xylene Cyanol 0.4%) to 50 L PCR reaction solution, mix, An amount equivalent to 10 / zL was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. Lambda ZStyl marker (Toyobo Co., Ltd.) was used as an electrophoresis marker. The results are shown in FIGS. 17 to 19 for each size of amplified fragment.
  • FIG. 20 and FIG. 21 show the size of each amplified fragment, respectively.
  • the promotion effect (amplification amount, reaction rate) by the additive is observed at extension times 1 min, 3 min, and 5 min.
  • Deep Vent DNA Polymerase (New England Biolabs) is a metathermic DNA polymerase derived from Pyrococcus species GB—Dl and retains 3, ⁇ 5 exonuclease activity.
  • the CR reaction solution composition is shown.
  • Factor is a factor that degrades dUTP. By adding this factor, inhibition of PCR reaction is prevented, and as a result, PCR reaction efficiency is increased.
  • the composition of the standard PCR reaction solution was used except for the PCNA13 supplement, and the reaction buffer (10x Cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer; 200 mM Tris-HCl ( pH 8.8), 100 mM (NH) SO
  • KOD DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) is a DNA Polymerase derived from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus'koda karaensis KOD1 strain. In addition to the Polymerase activity, it has a strong 3, ⁇ 5, Exonuclease activity (Proofreading activity), so it exhibits a PCR Fidelity approximately 50 times higher than Taq DNA Polymerase. Many commercially available high-accuracy PCR enzymes, mainly derived from the genus Pyrococcus, have a slow extension rate, but this enzyme has a very high extension rate, which is about twice that of Taq DNA Polymerase. Has speed. Therefore, highly accurate PCR can be performed in a short time.
  • PCNA13 100 ng / ⁇ , Buffer; 25 mM TrisCI pH8.0,
  • PCNA13 has been demonstrated to exhibit excellent elongation-promoting activity against seven typical commercially available DNA polymerases for PCR.
  • the PCNA13 used was a Pyrococcus furiosus-derived PCNA mutation-improved force Pyroc It was shown to be effective not only for DNA polymerases from occus furiosus but also for DNA polymerases of different bacterial species.
  • PCNA mutant protein sample and RFC protein sample derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain were prepared by expressing these genes in large quantities in E. coli and purifying the protein from the expressed cells.
  • Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain 3 ⁇ 4 JCM was obtained as an lOmL culture solution (JCM NO. 12, 380). The culture was centrifuged at 6, OOOxg, 15 min, 4 ° C to recover the cells. The collected cells were suspended in lmL TBS buffer (50 mM Tris-HC1 pH 7.2, 150 mM NaCl), washed, and collected by centrifugation at 15, OOOxg, 5 min, 4 ° C.
  • KOD—PCNA—F and KOD—PCNA—R were used for the amplification of the KOD—PCNA gene.
  • This primer set is designed to amplify the region corresponding to the stop codon from the start methionine of the PCNA gene, and add a restriction enzyme Ndel recognition site and a restriction enzyme Xhol recognition site on the 5 'side.
  • the sequence of each primer is shown in Table 17 (Sequence Nos. 33 and 34).
  • the PCR reaction solution was performed with the following composition. (Amount added to 50 L reaction system)
  • E. coli DH5a (Takara Bio Inc.) is transformed with this ligation product on an LB agar plate (100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, X-GAL each containing 40 ⁇ g / mL) And incubated at 37 ° C for a while to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • E. coli colonies showing white color on an agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the restriction enzyme Hindi recognition site of the plasmid vector pUC118 was examined using a DNA sequencer. As a result, it was confirmed that the open reading frame of the KOD-PCNA gene was retained in the insertion part, and that the restriction enzyme Ndel recognition sequence was added to the end and the restriction enzyme Xhol recognition sequence was added to the 3 'end.
  • KOD The plasmid vector carrying the open reading frame of the PCNA gene was named pUC / KPC.
  • pUCZKPC was double cut with restriction enzymes Ndel and Xhol to prepare a PCNA gene fragment.
  • the gene fragment was inserted into an expression vector to prepare an expression vector for KOD—PCNA.
  • pUCZKPC was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xhol in the following reaction system.
  • Plasmid DNA (Novagen, USA) was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xhoi according to the following reaction. [0280] Plasmid DNA:
  • the KOD-PCNA DNA fragment (lOOng) and pET-21a DNA fragment (50 ng) obtained above were reacted as follows using DNA Ligation Kit V2 (Tacarano).
  • the ligation product (3 ⁇ L) was used to transform 100 ⁇ L E. coli BL21 (DE3) (Novagen), and the E. coli solution was plated on an LB agar plate (100 ⁇ gZmL ampicillin). The culture was allowed to stand at 1 ° C. Three of the E. coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • a DNA sequencer was used to examine the DNA sequence inserted into the plasmid vector pET-21a and the sequence in the vicinity of the insertion site. As a result, the open reading frame of the KOD-PCNA gene was completely inserted into the Ndel and Xhol portions of the cloning site. This plasmid carrying the KOD-PCNA gene was called pKPCNA (Fig. 28).
  • Mutation into the PCNA gene is performed using the mutation-introducing plasmid and mutagenesis oligo pair (Table 19, column numbers 35-38) and Quik Change II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Went according to.
  • Non-patent document 6 when wild-type Pfu-PCNA was prepared as a recombinant protein using E. coli as a host, In addition to the translation protein from Met, it has been reported that a protein of about 20 kDa, whose translation is initiated at the 73rd residue at the N-terminus, is produced as a by-product, reducing the efficiency of target protein production. This approximately 20 kDa protein is suppressed when 1-substitution of Met at residue 73 is replaced with Leu, and the produced Pfu—PCNA has properties different from those of the wild-type PCNA protein. This is also reported together.
  • KOD-PCNA and Pfu-PCNA have a total length of 249 amino acid residues, 84.3% of the amino acids that perfectly match, and very high homology when amino acids with similar properties are added.
  • KOD—PCNA M73L mutation in which Met at residue 73 of KOD—PCNA is replaced with Leu is treated as a quasi-wild type.
  • KOD-M73L mutant was named KOD-PCNA01 to produce a mutant.
  • the preparation of K OD—PCNA01 was carried out using pKPCNA as the cocoon-type plasmid and a mutagenesis oligo pair (K OD—M73L—F and KOD—M73L—R) (see Table 19, Sequence 35, Sequence 36). .
  • Non-patent Document 9 In the case of Pyrococcus friosus PCNA, it is known that the 143rd amino acid residue is involved in the formation of an ion pair network when monomers form a trimer (Non-patent Document 9). Our group discovered that a mutant PCNA that reverses the electrical properties of the amino acid residue at this position dramatically accelerates the DNA polymerase reaction during DNA synthesis, as in Examples 1-2 above. ing.
  • the amino acid corresponding to this position is glutamic acid (acidic amino acid) in the wild type. By substituting it with arginine (basic amino acid), the electrical properties of the amino acid at this site can be completely changed. Is possible.
  • KOD-PCNA01-producing plasmid was used as a saddle type and prepared using KOD-E143R-F and KOD-E143R-R mutagenesis oligos (Table 19, sequences 37 and 38).
  • Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL (Stratagene) was transformed with the mutant PCNA expression plasmid vector obtained as described above, and the expression colon of each mutant gene was expressed. A strain was obtained.
  • the bacterial cells are collected by centrifugation (S291), disrupted (ultrasonic disruption, S292), boiled for 5 minutes (S293), subjected to polyethyleneimine precipitation (S294), and further precipitated by ammonium sulfate. (S295), ion exchange chromatography (S296, using HiTrap Q as the column), gel filtration chromatography (S297, using Superdex 200), and the preparation was prepared. As a result of confirmation by SDS-PAGE, a purity of 90% or more can be ensured for all samples.
  • Each mutant PCNA expression strain was cultured with shaking at 37 ° C in 1.5 liter LB medium (containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin). When the OD in the logarithmic growth phase is 0.3-0.5, the final concentration is 0.1.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the cells precipitated by centrifugation were suspended with 25 mL of buffer B (50 mM Tris—HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0. ImM EDTA, 10% glyceronole, 0.5 mM DTT).
  • buffer B 50 mM Tris—HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0. ImM EDTA, 10% glyceronole, 0.5 mM DTT.
  • the cell disruption solution was boiled for 5 minutes and then centrifuged (18,500xg, 4 ° C, 25 minutes) to recover the supernatant.
  • polyethyleneimine (SIGMA P-3143) and NaCl were added to final concentrations of 0.2% (w / v) and 0.58 M, respectively, and stirred on ice for 30 minutes.
  • the solution was centrifuged (18,500 Xg, 25 minutes, 4 ° C), and the supernatant was collected.
  • the dialyzed sample was subjected to ion exchange chromatography (HiTrap Q; Amersham Biosciences) using AKTAexplorer 10S (Amersham Biosciences). Elution conditions were 0.1 -0.8 M NaCl / 17.5 mL linear gradient, flow rate was 1 mLZmin, and peak fractions of KOD-PCNA01 and KOD-PCNA13 were obtained.
  • Thermococcus kodakaraensis KOD RFC consists of two subunits, RFCL and RF CS, which are located in tandem on the genome.
  • RFCL and RFCS genes were placed on expression vectors separately, and each expression vector was introduced into the same host and expressed simultaneously.
  • Non-Patent Document 10 was referred to. Details are shown below.
  • the KOD—RFCL gene (Genbank ID; 182, 830) was obtained by PCR using the KOD genome as a cage (SEQ ID NO: 39).
  • KOD— RFCL F primer and KOD— RFCL R primer were used (Table 20; SEQ ID NOs: 40 and 41). Because of the clawing operation, the KOD-RFCL-F primer has a restriction enzyme Ndel recognition site, KOD— RFCL— R primer First, a restriction enzyme Xhol recognition site was added.
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° Clmin.
  • PCR reaction product After subjecting the PCR reaction product to 1% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, a gel containing a band around 1.5 kb was excised under ultraviolet irradiation, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit ( The PCR product in the gel was purified according to the same operation manual using Amersham Bioscience).
  • the purified PCR product was subjected to a ligation reaction according to the operation manual using pUC118—HincIlZBAP and TaKaRa BKL Kit (both Takarabio).
  • This ligation product is used to transform E. coli DH5a (Takara Bio) and LB
  • the cells were seeded on an agar plate (containing 40 ⁇ g / mL each of 100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, and X-GAL) and incubated at 37 ° C. for a period of time to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • the DNA sequence inserted into the restriction enzyme Hindi recognition site of the plasmid vector pUC118 was examined using a DNA sequencer. As a result, it was confirmed that the open reading frame of the KOD-RFCL gene was retained in the insertion part, and the restriction enzyme Ndel recognition sequence was added to the 5 'end and the restriction enzyme Xhol recognition sequence was added to the 3' end.
  • This plasmid was designated as pUC118 / KRFCL.
  • PUC118ZKRFCL was double cut with restriction enzymes Ndel and Xhol to prepare an RFCL gene fragment.
  • the gene fragment was inserted into an expression vector to prepare a KOD—RFCL expression vector.
  • pUC 118ZKRFCL was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Xhol in the following reaction system.
  • pET—29a vector DNA (Novagen) was digested with the restriction enzymes Ndel and Xho Double cut with I.
  • the KOD-RFCL DNA fragment (lOOng) and pET-29a DNA fragment (50 ng) obtained above were reacted as follows using DNA Ligation Kit V2 (Tacarano).
  • the sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes.
  • the ligation product (3 ⁇ L) was used to transform 100 ⁇ L E. coli BL21 (DE3) (Novagen), and the E. coli solution was seeded on an LB agar plate (30 ⁇ g ZmL kanamycin). The culture was allowed to stand at 1 ° C. Three of the E. coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 30 ⁇ g ZmL kanamycin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the DNA sequence inserted into the plasmid vector pET-29a and the sequence near the insertion site were examined using a DNA sequencer.
  • the ORF (open reading frame) of the KOD—RFCL gene was completely inserted into the Ndel and Xhol parts of the multicloning site.
  • the plasmid carrying the K OD— RFCL gene was called pKRFCL (FIG. 32).
  • pKRFCL As shown in Fig. 32, it was confirmed that pKRFCL was arranged in the order of T7 promoter retained by pET-29a, rbs (ribosome binding site), RFCL gene open reading frame, and T7 terminator. . This plasmid was expected to express a large amount of RFCL gene.
  • the KOD—RFCS gene (Genebank ID: BD182, 829) is encoded by a total length of 2,601 bases, retains one intin, has 177 bases at the N-terminal, and EXTine at the C-terminal. Has been reported to be encoded by 804 bases (not including the stop codon).
  • SEQ ID NO: 42 in the sequence listing shows the base sequence of KOD-RFCS (mature sequence from which the intin portion has been removed).
  • the RFCS expression vector was constructed by first cloning the entire length of the KOD-RFCS gene including intin using a PCR reaction (S331 to S334), and then using the two ecstein fragments.
  • S335-336 was amplified individually by PCR reaction (S335-336), then the intin was removed, and mature RFCS (also called RFCSm) was prepared by combining two types ofext and incorporated into an expression vector (S337-S339) .
  • PCR primers used were KOD-RFCS-F and KOD-RFCS-R primers (Table 21; SEQ ID NOs: 43 and 44).
  • the PCR type KOD genomic DNA prepared in 3.1 above was used.
  • the PCR reaction solution was performed with the following composition. (Amount added to 50 L reaction system)
  • reaction solution prepared above was subjected to PCR reaction with a program that repeated 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30 sec ⁇ 72 ° C ⁇ lmin.
  • PCR reaction product After subjecting the PCR reaction product to 1% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, a gel containing a band around 2.6 kb was excised under UV irradiation, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit ( The PCR product in the gel was purified according to the same operation manual using Amersham Bioscience).
  • the purified PCR product was subjected to a ligation reaction according to the operation manual using pUC118—HincIlZBAP and TaKaRa BKL Kit (both Takarabio).
  • E. coli DH5a (Takara Bio Inc.) is transformed with this ligation product and seeded on LB agar plates (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin, IPTG, and X-GAL each 40 ⁇ g / mL) 37
  • the culture was allowed to stand at 0 ° C. to obtain an E. coli clone retaining the PCR product.
  • a white Escherichia coli colony on an agar plate was cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • RFCS-Nde-F primer and RFCS-Exl-R primer were prepared as PCR primers for N-terminal westin.
  • RFCS-Ex2-F primer and RFCS-Sal-R primer were prepared as PCR primers for C-terminal side extension.
  • the restriction enzyme Ndel sequence is added to the RFCS-Nde-F primer, and the restriction enzyme Sail sequence is added to the 5 'end of the RFCS-Sal-R primer.
  • the RFCS-Exl-R primer and the RFCS-Ex2-F primer were provided with complementary sequences to be used for fusing the two ecstein fragments by PCR reaction.
  • the PCR reaction for amplification of the two types of ecstein was performed with the following composition. (Amount added to the 50 / z L reaction system)
  • the PCR reaction product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide.
  • the RFCS—Nde—F primer, RFCS—Exl—R primer set PC R product has an approximately 180 base band
  • the RFCS—Ex2—F primer and RFCS—Sal—R primer set PCR product has an approximately 800 base band.
  • the gel containing each band was cut out under ultraviolet irradiation, and the PCR product in the gel was purified using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences) according to the same operation manual.
  • N-edge ecstein fragment 2 ⁇ L ⁇ (50 ng equivalent)
  • PCR with a program that repeats 30 cycles of 95 ° C ⁇ 30sec ⁇ 55 ° C ⁇ 30sec ⁇ 72 ° C ⁇ lmin with the addition of RFCS-Nde-F primer and RFCS-Sal-R primer. Reaction was performed.
  • pET-21a vector DNA (Novagen) was double-cut with the restriction enzymes Ndel and Sail according to the following reaction.
  • the sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes.
  • the ligation product (3 ⁇ L) was used to transform 100 ⁇ L E. coli BL21 (DE3) (Novagen), and the E. coli solution was plated on an LB agar plate (100 ⁇ gZmL ampicillin). The culture was allowed to stand at 1 ° C. Three of the E. coli colonies formed on the agar plate were cultured with shaking in 3 mL of LB liquid medium (100 ⁇ g ZmL ampicillin) at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • pKRFCSm a mature RFCSm sequence (984 bases) in which two types ofext were bound to the Ndel and Sail portions of the cloning site (excluding the intin).
  • pKRFCSm is arranged in the order of T7 promoter held by pET-21a, rb s (ribosome binding site), mature RFCS gene open reading frame, and T7 terminator. It was done. This plasmid was expected to express a large amount of mature RFCS gene.
  • E. coli BL21—CodonPlus (DE3) —RIL was simultaneously transformed with pKRFCL and pKRFCSm, and a transformant carrying both plasmids was selected by double selection of ampicillin and kanamycin to obtain an expression strain.
  • the cells are collected by centrifugation (S351), disrupted (ultrasonic disruption, S352), boiled for 5 minutes (S353), subjected to polyethyleneimine precipitation (S354), and further precipitated by ammonium sulfate. (S355), Affinity chromatography (S356, using HiTrap Heparin HP as a column), gel filtration chromatography (S357, using Superdex 200), and the preparation was prepared. By SDS-PAGE confirmation, it is possible to secure a purity of 90% or more even if the sample is misaligned! [0357] 3. 3. 4. 1: Cell culture and expression induction
  • the above expression strain was cultured with shaking in 1.5 liter LB medium (containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 30 ⁇ g / mL kanamycin) at 37 ° C.
  • Logarithmic growth phase OD is 0.3 -0.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopy ranoside
  • the cells precipitated by centrifugation were suspended with 25 mL of buffer B (supra). The cells were crushed by sonication.
  • the cell disruption solution was boiled for 5 minutes and then centrifuged (18,500xg, 4 ° C, 25 minutes) to recover the supernatant.
  • polyethyleneimine SIGMA P-3143
  • SIGMA P-3143 polyethyleneimine
  • the dialyzed sample was purified using a HiTrap Heparin HP column (Amersham Biosciences).
  • the elution conditions were a linear gradient of 0.1 -0.8 M NaCl / 17.5 mL, the flow rate was 1 mLZmin, and peak fractions were obtained.
  • Peak fractions from HiTrap Heparin affinity chromatography It was further purified by gel filtration chromatography using 00 (supra), and used as a standard for assembly. The obtained sample was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and it was confirmed that the sample had a molecular size and was well purified (FIG. 36).
  • KOD DNA Polymerase Toyobo
  • Pyrobest DNA Polymerase Takara Bio
  • KOD DNA polymerase is a DNA polymerase derived from the thermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KO D-1 strain.
  • KOD DNA polymerase is a so-called alpha-type DNA polymerase that has strong activity of 3 ⁇ 5 and exonuclease activity (Proofreading activity) in addition to polymerase activity. Since it retains 3 ' ⁇ 5' Exonuclease activity, it exhibits a higher PCR Fidelity than Taq DNA Polymerase, which is commonly used.
  • many other alpha-type high-accuracy PCR enzymes mainly derived from the genus Pyrococcus have a slow extension rate, but it has been reported that this enzyme has a very high extension rate (Non Patents). Reference 11).
  • Lambda DNA (GenBank accession 02459) was used as the vertical DNA.
  • the target sequence for PCR amplification was the 25th and the 142th sequences from the 23rd and 119th lambda DNA.
  • the PCR primer sequences used at this time are listed in Table 8, but are shown in Table 23 separately.
  • Primer name Primer sequence 5 ' ⁇ 3' SEQ ID NO
  • compositions of the reaction solutions are shown in Tables 24 and 25.
  • the reaction solution was reacted with the following PCR program.
  • Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) commercially available as a DNA synthase derived from the genus Pyrococcus was examined using a PCR reaction system.
  • Pyrobest DNA Polymerase is a thermophilic a-type DNA polymerase with 3, ⁇ 5, exonuclease activity (proof reading activity) derived from Pyrococcus' sp.
  • Pfu DNA polymerase derived from Pyrococcus' furiosus is characterized by highly accurate amplification equivalent to Vent DNA polymerase.
  • compositions of the reaction solutions are shown in Tables 26 and 27.
  • the reaction solution was reacted with the following PCR program.
  • KOD-PCNA13 promotes the PCR reaction for two typical PCR enzymes.
  • this reaction was superior in promoting activity compared to the case where the wild type and the RFC were added simultaneously as well as the RFC was not required.
  • PCNA derived from Pyrococcus cus furiosus even with PCNA derived from Tnermococcus kodakaraensis KOD 1 strain.
  • identification of amino acid residues in the interfacial region of the mer is not limited to PCNA derived from Pyrococcus fur iosus, but can be applied to PCNA with a similar structural background.
  • Pfu—Pyrobest DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc., hereinafter simply abbreviated as “Pyrobest”) is the influence on the type fidelity when PCNA13 is added to the PCR reaction. )). Pyrobest is a DNA polymerase derived from Pyrococcus archaea with 3, ⁇ 5, exonuclease activity, which functions as a proofreading activity.
  • Fidelity was determined by examining the sequence of the PCR product and comparing it to the saddle type sequence. The outline is shown in FIG. First, Pyrobest alone or Pfu-PCNA13 was added to carry out a PCR reaction (S511), the ends of the amplified DNA fragments were blunted and phosphated (S512), and this fragment was transformed into a plasmid vector. (S513), introduce into E. coli, isolate colonies and extract plasmids (S514, S515). 0 Check part of the inserted sequence (500 bp) of each plasmid using a DNA sequencer (S516). Compared to the vertical sequence, an error occurs. The frequency of life was examined (S517).
  • Taq does not have 1S 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity, which is a commonly used Poll-type PCR enzyme, and is considered to be less fidelity than a template PCR enzyme that retains this activity.
  • Lambda DNA (Genbank accession 02459) was used as a type of PCR reaction, and seven regions were investigated.
  • Table 28 shows the position, size, and primer combination used to amplify each region in lambda DNA, and Table 29 shows the primer sequences.
  • the PCR reaction solution was a general PCR reaction solution composition (Table 30).
  • lOxPyrobest buffer II composition unpublished
  • lOxPCR Buffer 100 mM Tris-Cl (pH 8.3) is used as an attachment buffer.
  • the final concentration when adding NA13 was 0.6 ng ZwL (0.3 / zL), and when not added, sterilized water was added in the same volume (0.3 / zL).
  • Each PCR product obtained by the above PCR reaction is subjected to 1% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and then the gel containing the DNA fragment of the desired size is excised, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham)
  • the DNA fragment in the gel was purified according to the operation manual using Bioscience).
  • the purified DNA fragment was subjected to terminal blunting 'phosphorylation using TaKaRa BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit) (manufactured by Takarabio) according to the kit manual.
  • the sterilized water was added to 10 L, and the reaction was performed at 16 ° C for 60 minutes.
  • E. coli JM109 Transform 100 L E. coli JM109 (Takarabio) with the above ligation product (3 L), and use E. coli solution in LB agar plate (100 g / mL ampicillin, IPTG, X-GAL 40 ⁇ g / mL each) ) Seeded on the top and cultured at 37 ° C for 1 hour.
  • E. coli colonies showing white color on the agar plate were cultured with shaking in TB liquid medium (containing 100 ⁇ g / mL ampicillin) 1.5 mL at 37 ° C overnight, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method.
  • the extracted plasmid was used as a cage, and the DNA sequence was analyzed using a DNA sequencer.
  • Enzyme, APJ Combination of enzyme and Pfu-PCNA13 during PCR reaction.
  • “Lambda DNA Position” Indicates the position of the base sequence to be analyzed among the seven PCR amplified fragments.
  • Sample Represents the number of plasmids (ie, the number of PCR amplified fragments) subjected to sequence analysis.
  • Base The number of bases subjected to sequence analysis.
  • ND Number of bases that could not be deciphered due to noise in the sequencing data.
  • A11 Total number of bases other than “ND” that could be decoded.
  • Error The number of bases in which replication errors are confirmed out of the total number of bases.
  • Error rates Salts with duplicate errors for the total number of bases that can be decoded “All” Proportion of radix "Error”,
  • the present invention is useful in biotechnology-related industries, and particularly useful in the technology related to DNA synthesis.
  • SEQ ID NO: 2 Pfu-PCNA
  • SEQ ID NO: 3 primer Pfu-PCNA-F
  • SEQ ID NO: 4 Primer: Pfu-PCNA-R
  • SEQ ID NO: 5 primer: Pfu_M73L-F
  • SEQ ID NO: 6 primer: Pfu_M73L-R
  • SEQ ID NO: 7 primer: Pfu— D143A— F
  • SEQ ID NO: 8 primer: Pfu— D143A— R
  • SEQ ID NO: 9 primer: Pfu_R82C-F
  • SEQ ID NO: 12 primer Pfu— D143R— R
  • SEQ ID NO: 15 primer RFCL- F primer

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Abstract

　汎用性に優れ、使いやすいＤＮＡ複製反応系を構築することを課題とする。ＤＮＡ複製に関与する因子の一つであるＰＣＮＡの単量体のアミノ酸配列を、単量体のＮ末端側領域と他の単量体のＣ末端側領域とが界面となって多量体を形成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成されるように調製する。

Description

明 細 書
変異型 PCNA
技術分野
[0001] 本発明は、 DNA複製因子に関し、より詳しくは、 DNA複製を補助する機能に優れ た PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen、増殖核抗原）に関する。 背景技術
[0002] 遺伝子増幅技術と PCR法
DNAや RNA等の核酸を増幅する技術は、遺伝子工学技術等の発展に伴い、基 礎研究力も産業利用まで広く浸透してきている。初期には、特定の標的核酸配列を 得るためには、酵母や大腸菌宿主内で増幅した核酸より、必要な配列を制限酵素で 切り出して調製する方法が一般的であつたが、マリスらの PCR法の開発と普及により 、標的とする特定の核酸領域を試験管内で増幅する事が可能となった。 PCR法は専 用装置や関連試薬の活発な商品化、販売と平行して、多様な研究上、産業上のアブ リケーシヨン開発が行われたため、実質的に遺伝子増幅技術のスタンタードとなった 。 DNA複製の研究が進むにつれ、 PCRとは原理を異とする種々の技術が考案-開 発されてはいるが、操作性 'コスト'品質上の観点から一般性は乏しく PCR法を一蹴 するほどの技術は登場して 、な 、。
[0003] PCR法の評価ポイント
PCR法の原理は細胞内での DNA複製を最小限に模倣した形と考えられる。つまり 、 1)標的となる核酸铸型の熱変性による解離、 2)標的配列と相補的な 1対のプライ マーとの対合、 3) DNAポリメラーゼによるプライマーの铸型相補的な伸長反応、で ある。これらの反応を連続的に繰り返すことにより、目的の核酸配列を指数関数的に 増幅する。一般的な PCRのプロトコルでは ngオーダーの铸型の数 kbの標的配列を 2時間程度の反応で μ gオーダーまで増幅する事が多 、。
[0004] PCR法には技術的制約があり、代表的には次の 4点が挙げられる。 1)铸型に対す る忠実性 (铸型に対応した正確な配列を増幅する性能)、 2)伸長性 (より長 、配列を 増幅する性能)、 3)標的配列の増幅効率、 4)反応特異性の 4点である。同時にこれ らは PCR技術を評価するポイントとして取り上げられる事も多い。これらの制約を克服 することを目標に PCR用試薬 ·キットの開発が進められて ヽる。
[0005] PCRの改善
初期の PCR用 DNAポリメラーゼとしては好熱菌 Thermus'aquaticus由来の DN Aポリメラーゼ (Taq DNA ポリメラーゼ）が一般的であった (非特許文献 1)。本酵 素を基本として、その後、さまざまな PCR用酵素もしくは試薬'キットが開発、販売さ れている。これらは、上述の技術制約ポイントについて改良される事が多ぐこれらの 特徴をもつ試薬'キットが各メーカーより販売されている。以下に PCR法の改善の一 例を紹介する。
[0006] 铸型に対する忠実性を向上させる例としては、高忠実度型の DNAポリメラーゼを P CR法に使用することが一般的である。 Taq DNAポリメラーゼは、 5'→3 'ポリメラー ゼ活性のみを有し、 3，→5，ェキソヌクレアーゼ活性を保持しないタイプの Pol I型 D NAポリメラーゼである。これに対し、超好熱性古細菌 Pyrococcus'furiosus由来の DNAポリメラーゼは 5，→3，ポリメラーゼ活性と 3，→5，ェキソヌクレアーゼ活性の両 者を保持する α型 DNAポリメラーゼである。 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性は校正 活性として機能する。このため、この DNAポリメラーゼを PCR反応に使用した場合、 3，→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を保持しな 、Taqポリメラーゼと比較して増幅時の铸 型忠実度が飛躍的に向上する (非特許文献 2)。
[0007] このような DNAポリメラーゼのうち巿販化されている製品の例としては、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社）、 Pfu DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社）、 KO D DNAポリメラーゼ（東洋紡社）、 Deep Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs (NEB)社）、 Vent DNAポリメラーゼ（NEB社）、 Pwo DNAポリメラーゼ (ロッシュ 'ダイァグノスティックス社）がある。
[0008] Barnsらは、校正機能を保持する α型 DNAポリメラーゼと校正機能を保持しな 、P ol I型 DNAポリメラーゼを適切な比率で混合して PCR反応に使用すると、伸長可能 な標的配列が長くなり、増幅効率も併せて向上する事を報告している (非特許文献 3 、特許文献 1)。このような混合型 DNAポリメラーゼで市販化されている製品例として は、 TaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社）、 Taq Plus Long (ス トラタジーン社)などがある。
[0009] PCRの反応特異性の向上の一例としては、ホットスタート法が知られている。 PCR 反応の非特異性は、主に铸型 DNAにプライマーが非特異的にアニーリングする事 が原因で起こる事が多 、。これを防ぐには高温下で PCR反応液の完全な混合を行 なった直後に PCR反応を開始させるホットスタート法が効果的である。ホットスタート 法には、数通りの方法が報告されている力 現在の主流は、 DNAポリメラーゼと、そ の特異的抗体とで複合体を形成させて、低温条件では不活性型にしておき、ホットス タート時の高温条件ではじめて活性ィ匕させ、 PCR反応を行なうものである。この方法 で PCR反応の特異性が高まる事が報告されて 、る（特許文献 2)。このホットスタート 法に対応した製品も各遺伝子工学メーカーより販売され、一般的に利用されている。
[0010] 上述の PCR法の改善法はいずれも実用性があり製品化され、一般的に利用されて いるが、いずれも一長一短があり、前項に示した PCR法のすべての改善点を同時に 満たすものではない。例えば、高忠実度型の α型 DNAポリメラーゼは、 Pol I型 DN Aポリメラーゼと比較して伸長性に劣る事が多ぐまた、 α型と Pol I型 DNAポリメラ ーゼを混合する PCR法では、高忠実度型 DNAポリメラーゼの忠実度には及ばな ヽ 。すべてのポイントに優れた DNAポリメラーゼもしくは DNA増幅系が待望されて!、る
[0011] DNA複製過程
一般に DNA複製開始には、まず複製起点の二本鎖構造が解かれている必要があ る力 それには DNAヘリカーゼが必要である。解かれた DNAには、一本鎖 DNA結 合タンパク質が結合して一本鎖が安定ィ匕される。さらに、それぞれの鎖上にプライマ 一を合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子 Replication Factor C (R FC)がプライマーを認識して結合し、増殖核抗原 (PCNA)を DNA鎖上に誘導する 。 PCNAは DNAポリメラーゼを DNA鎖上に留めておくためのクランプの役目をする 。そして PCNAと複合した DNAポリメラーゼが新生鎖を合成する。連続合成では、そ のまま長い新生鎖が合成されるが、不連続合成のほうでは、各 Okazaki断片に付随 する RNAプライマーがヌクレアーゼで分解され、 DNA鎖に置きかえられた後 DNAリ ガーゼが断片間を結合し、一本の新生鎖が完成する (非特許文献 4および 5)。 [0012] Pfu— PCNAと RFC
Pyrococcus -furiosus PCNA (以下、「Pfu—PCNA」または「PfuPCNA」とも 表記する）は、分子量 28.0kDaで、 Pfu— PCNAは真核生物の PCNAと同様にホモ 三量体を形成し、ポリメラーゼと相互作用して機能する事が報告されている（非特許 文献 6)。一方、 Pyrococcus 'furiosus RFC (以下、「Pfu—RFC」または「PfuRF C」とも表記する）は、 RFCSと RFCLのサブユニット構造をとる。 Pfu— RFCSのォー プンリーディングフレームはインティンを 1力所コードし、成熟型 Pfu—RFCSの分子 量は 37. 4kDaである。 Pfu— RFCLの分子量は 55. 3kDaである。プライマーェクス テンション試験で Pfu— RFC、 Pfu— PCNAの添カ卩は Pfu DNAポリメラーゼの DN A伸長活性を著しく促進する事が報告されて ヽる (非特許文献 7)。
[0013] Pfu— PCNAの構造と性質
Pfu— PCNAは結晶構造解析が行われている（非特許文献 8)。それによれば、 Pf u— PCNA三量体は， 2つのサブユニットの anti— parallel j8 strand ( j8 IIと j8 D2 )間の主鎖の水素結合 (T108— K178, T110-E176, R112— E174)により形成 され、さらに、酸性'塩基性アミノ酸側鎖による分子間のイオン対ネットワークが三量 体構造の維持に関与している。さらに，そのイオン対ネットワークに関与する残基 (N 末端側領域の R82, K84, R109と C末端側領域の E139, D143, D147)のうち、 D143、 D147を、中性アミノ酸であるァラニンに置換した変異体 2種（PfuPCNA(D 143A)と PfuPCNA(D143AZD147A) )に関して調べた論文がある（非特許文献 9)。論文には， PfuPCNA(D143A)と PfuPCNA(D143AZD147A)がゲルろ過 で単量体の位置に溶出すること，結晶では三量体でなく V— shaped dimersとして 得られることのほ力，プライマーエクステンション試験における活性測定結果の記述 がある。それによると， PfuPCNA(D143AZD147A)は PCNA単独時， RFC併用 時のどちらの場合も DNA合成促進活性を示さないが， PfuPCNA(D143A)は RF Cの有無に関わらず DNA合成促進活性を示し，かつ PCNA単独時の場合には野 生型よりも優れた結果を示したとされている。
[0014] KOD— PCNAと RFC
KOD - PCNA (以下、「KOD - PCNAJまたは「KODPCNA」とも表記する）と OD-RFC (以下「KOD— RFC」または「KODRFC」とも表記する）は Thermococc us -kodakaraensis KOD— 1株より得られる PCNAと RFCである。
[0015] KOD— PCNAについては非特許文献 12により報告されている。報告によれば K OD— PCNAは 249残基を有し、計算上の分子量は 28. 2kDaである。先に報告の ある Pfu— PCNAも 249残基を有し、両者のアミノ酸配列は 84. 3%がー致している 。また、 KOD— PCNAは Pfu— PCNAと同様に PCNAに特徴的な全ての保存領域 を保持しており、 KOD— PCNAの結晶構造解析は行なわれていないものの、 Pfu— PCNAとの高い相同性力 推測して Pfu— PCNA同様の形態でホモ三量体を形成 する可能性が高 、ことが記されて 、る。
[0016] KOD— RFCについては非特許文献 10により報告されている。報告によれば、 KO D— RFCは他の RFCと同様に RFCLと RFCSのサブユニット構造をとる。 RFCLは 分子量 57. 2kDaである。 RFCS遺伝子はオープンリーディングフレーム中にインテ インを 1力所コードし、成熟型 KOD—RFCSの分子量は 37. 2kDaである。
[0017] 上述の 2報は KOD— PCNA、 KOD— RFCを KOD— DNAポリメラーゼによる DN A合成系に添加した場合の効果に関しても報告して 、る。報告によればプライマー 伸長実験の場合は KOD - PCNAを単独添加もしくは KOD—RFCとの共存下で伸 長活性を促進し、 PCR反応系では KOD— PCNA添カ卩時には「Sensitivity」が向上 すると記されている。
[0018] 特許文献 1 :米国特許第 5, 436, 149号公報
特許文献 2 :米国特許第 5, 338, 671号公報
非特許文献 l : Saiki, R. K. , Gelfand, D. H. , Stoffel, S. , Scharf, S. J. , Hi guchi, R. , Horn, G. T. , Mullis, K. B. and Erlich, H. A. Science 239, 487-491 (1988)
非特許文献 2 : Cline, JC Braman, and HH Hogrefe Nucl. Acids Res.
24, 3546- 3551 (1996)
非特許文献 3 : Barnes, W. M Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2216- 2220 (19 94)
非特許文献 4:Waga, S. and Stillman, B. Annu. Rev. Biochem. 6 7, 721-751(1998)
非特許文献 5:Kornberg, A. and Baker, T. A. DNA replication , 2 nd ed. W. H. Freeman, New York. (1992)
非特許文献 6:Cann et al, J. Bacteriol, 181, 6591— 6599(1999) 非特許文献 7:Cann et al J. Bacteriol, 183, 2614-2623(2001) 非特許文献 8:Matsumiya et al. Protein Sci. , 10, 17— 23(2001) 非特許文献 9:Matsumiya et al. Protein Sci. 12, 823— 831(2003) 非特許文献 10:Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Nov ;6
7(11) :2373-2380(2003)
非特許文献 ll:Takagi et al. Appl Environ Microbiol. Nov;63(ll) :4 504-4510 (1997)
非特許文献 12:Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Oct ;66 (10) :2194-2200 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 上記のような状況の下、汎用性に優れ、使いやすい DNA増幅系を構築することを 課題とする。
課題を解決するための手段
[0020] 本発明者らは、上述の DNA複製過程で利用される諸因子 (以下、「アクセサリータ ンパク質」、「AP」とも表記する）と DNAポリメラーゼで細胞内 DNA複製系を試験管 内で再構築することにより、既存の PCR技術の欠点を克服する、新規な DNA増幅系 を作成することを試みて来た。とりわけ、 3 '→5 'ェキソヌクレア一ゼ活性を持ち、铸型 忠実度が高 、超好熱性古細菌 Pyrococcus 'furiosus由来の DNAポリメラーゼ、お よび細胞内 DNA複製系の諸因子 (アクセサリータンパク質)のうち、 DNAポリメラー ゼと直接的に相互作用する可能性の高い PCNAと RFCに着目し、鋭意研究を進め た。
[0021] その結果、一方の単量体の N末端側領域と他の単量体の C末端側領域とが界面と なって多量体を形成した場合に、界面領域にお 1、て単量体相互の分子間相互作用 を形成する部位のアミノ酸残基力 他方の単量体の界面領域内のアミノ酸残基と相 互に電荷的反発を生じるアミノ酸残基で構成されるように調製することにより、 RFCの 有無にほとんど依存せず、伸長性、忠実性のバランス良く DNAの伸長反応を促進し 得る作用を備えた PCNAが得られるという知見を得、本発明を完成させるに至った。 本発明は、以下の PCNA等を提供するものである。
〔1〕 PCNAの単量体であって、
単量体の N末端側領域と他の単量体の C末端側領域とが界面となって多量体を形 成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部 位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、かつ、
単量体のまま又は多量体を形成して、 DNA複製を促進する活性を備える、変異型 PCNA単量体。
〔2〕前記 PCNA単量体が、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列の場合における 第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目か らなる群より選ばれる少なくとも 1つの位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換え たアミノ酸配列を有し、
下記 (i)群から選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と、下記 (ii)群から選ばれ る 1つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される、上 記 [1]に記載の変異型 PCNA単量体。
(i)第 82番目、 84番目および第 109番目のアミノ酸残基群
(ii)第 139番目、第 143番目および第 147番目のアミノ酸残基群
〔3〕さらに、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 1 47番目以外の部位に、付加、挿入、置換、および欠失力もなる群より選ばれる 1また は数個のアミノ酸残基の変異を含む、上記〔2〕に記載の変異型 PCNA単量体。 〔4〕配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 73番目のアミノ酸残基を ロイシンに換えた配列を有する、上記〔3〕に記載の変異型 PCNA単量体。
〔5〕前記 (i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上アミノ酸と (ii)群力 選ばれる少なくと も 1つ以上のアミノ酸とが、双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸であ る、上記〔2〕から〔4〕の 、ずれか 1項に記載の変異型 PCNA単量体。 〔6〕配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 143番目のアミノ酸残基を アルギニンに換えた配列を有する、上記〔2〕から〔5〕の 、ずれか 1項に記載の変異型 PCNA単量体。
〔7〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体が備えるアミノ酸配列 をコードするポリヌクレオチド。
〔8〕上記〔7〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
〔9〕上記〔8〕に記載の形質転換体を培地で培養し、当該形質転換体および Zまたは 培地中に、 PCNA単量体および Zまたは前記単量体で構成された多量体を蓄積さ せることを特徴とする、変異型 PCNAの製造方法。
〔10〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記 単量体で構成された多量体を含む DNA複製用試薬。
〔11〕上記〔10〕に記載の試薬を備えた、 DNA複製用キット。
〔12〕PCR用の試薬を備えた、上記〔11〕に記載の DNA複製用キット。
〔13〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記 単量体で構成された多量体および DNAポリメラーゼの存在下で DNAの合成反応を 行うことを特徴とする、 DNAの複製方法。
〔14〕前記 DNAの合成が PCRである、上記〔13〕に記載の DNAの複製方法。
[0023] 本発明は， DNA複製反応をより促進し得るように， PCNA単量体の界面領域のァ ミノ酸配列を特定したものである。本発明の PCNAは，菌主の異なる多数の DNAポ リメラーゼにも適用性があり，汎用性が高い。また，本発明の PCNAは， RFCを併用 しな 、場合でも優れた DNA伸長促進活性を発揮する点にぉ 、て，従来に比し極め て特異な性能を発揮し得るものである。
発明の効果
[0024] 本発明により、 DNAの伸長反応を促進する、汎用性の高!ヽ DNA複製促進因子が 提供される。本発明により、伸長性および反応速度などの諸特性に優れた DNAの伸 長反応を行い得る。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]図 1は、 PCNAの三量体を模式的に示す図である。 [図 2]図 2は、 PCNA単量体が多量体を形成する場合に、単量体どうしの接合部とな る界面領域において形成される単量体相互の分子間相互作用部位の一例を示す図 である。
[図 3]図 3は、 PCNA、 RFC遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 4]図 4は、 PCNA遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 5]図 5は、 PCNA (タンパク質）の調製フローを示す図である。
[図 6]図 6は、 PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す 図である。
[図 7]図 7は、 RFCL発現プラスミドを示す図である。
[図 8]図 8は、 RFCSm発現プラスミドを示す図である。
[図 9]図 9は、 RFC (タンパク質）の調製フローを示す図である。
[図 10]図 10は、 RFC標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
[図 11]図 11は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果（2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 12]図 12は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果（8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 13]図 13は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果（15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
[図 14]図 14は、増幅長 2kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添加効果 を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 15]図 15は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添カロ 効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 16]図 16は、増幅長 15. 8kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添カロ 効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 17]図 17は、増幅長 2kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添加効果を 、伸長時間ごとに示す図である。
[図 18]図 18は、増幅長 8. 4kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添カロ効 果を、伸長時間ごとに示す図である。 [図 19]図 19は、増幅長 15. 8kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添カロ効 果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 20]図 20は、増幅長 2kbの場合における、 Vent DNA Polymeraseに対する P CNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 21]図 21は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Vent DNA Polymeraseに対す る PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 22]図 22は、増幅長 2kbの場合における、 Deep Vent DNA Polymeraseに 対する PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 23]図 23は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Deep Vent DNA Polymerase に対する PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 24]図 24は、 Pfu Turbo DNA Polymeraseに対する PCNAl 3添カ卩効果を示 す図である。
[図 25]図 25は、 KOD DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果を示す図 である。
[図 26]図 26は、 Pwo DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果を示す図で ある。
[図 27]図 27は、 KOD PCNA遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 28]図 28は、 KOD— PCNA遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 29]図 29は、 KOD PCNAタンパク質の調製フローを示す図である。
[図 30]図 30は、 KOD— PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の 結果を示す図である。
[図 31]図 31は、 KOD—RFCL遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 32]図 32は、 KOD—RFCL遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 33]図 33は、 KOD—RFCSm (成熟型 RFCS)遺伝子発現ベクターの調製フロー を示す図である。
[図 34]図 34は、 KOD—RFCS遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 35]図 35は、 KOD— RFCタンパク質の調製フローを示す図である。
[図 36]図 36は、 KOD— RFCタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結 果を示す図である。
[図 37]図 37は、 KOD DNAポリメラーゼに対する KOD— PCNA変異体及び KOD —RFC添加効果を示す図である。
[図 38]図 38は、 Pyrobestに対する KOD— PCN A変異体及び KOD— RFC添カロ効 果を示す図である。
[図 39]図 39は、 PCR铸型忠実性の測定フローを示す図である。
[図 40]図 40は、 PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示 す図である。
[図 41]図 41は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果（2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 42]図 42は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果（8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 43]図 43は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果（15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
[図 44]図 44は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果（2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 45]図 45は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果（8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 46]図 46は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果（15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
符号の説明
1 : PCNA三量体
10a、 10b、 10c : PCNA単量体
20： PCNA単量体どうしの接合部
PCNA gene : PCNA遺伝子 ORF
T7promoter： T7フ—ロモ ~~タ' ~~
rbs :リボソーム結合部位
T7terminator： T7ターミネータ一 Amp：アンピシリン耐性遺伝子
Ori:複製起点
RFCL gene :RFCL遺伝子 ORF
RFCSm gene：成熟型 RFCS遺伝子 ORF
Kan：カナマイシン耐性遺伝子
発明を実施するための最良の形態
[0027] 以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発 明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例 えば、 Molecular Cloning : A LABORATORY MANUAL, 第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, New York (2001)、新遺伝子工学ハンドブック (村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第 3 版、 1999年)、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 1版、 19 98年)、タンパク質実験ノート（岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 2版、 1999年)、タ ンパク質実験ハンドブック (竹縛忠臣編集、実験医学別冊、初版、 2003年 8月 15日） 、 PCR実験ノート (谷ロ武俊編集、羊土社、第 1版、 1997年)などの種々の実験マ二 ュアルの記載が参照される。
[0028] 本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子につい ては、アルファベット表記による簡略ィ匕した記号を用いる場合があるが、いずれも分 子生物学 ·遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、ァミノ 酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「D143A」などの表記を用いる。「D143A 」は、第 143番目のァスパラギン酸をァラニンに置換したことを示しており、すなわち、 置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している 。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。
[0029] 1.本発明の PCNA
本発明の PCNA単量体は、多量体形成に寄与する界面領域内における所定位置 のアミノ酸残基を特定したものである。すなわち、本発明の PCNA単量体は、界面領 域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に反発しあうよう なアミノ酸残基で構成される。ここで「分子間相互作用」とは、分子間に生じる物理的 、化学的、あるいは電気的な相互作用のことであり、例えば、立体配座'立体構造な どの分子の構造に起因する作用、並びにイオン結合、水素結合、疎水性相互作用な ど種々の分子間作用が含まれる。 PCNA単量体が多量体を形成する場合、単量体 相互の界面領域が引き合うもしくは接合するなどの分子間相互作用によって、多量 体が形成される。一つの好ましい形態としては、分子間イオン対、もしくはイオン対ネ ットワークを形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構 成される。そして、本発明の PCNA単量体は、単量体のまま又は多量体を形成して、 DNA複製を促進する活性を備える。なお、本明細書において「変異型 PCNA」とい う場合の「変異型」とは、従来知られた PCNAとは異なるアミノ酸配列を備えることを 意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するも のではない。
[0030] DNAの複製反応に関与する因子の一つである PCNAの多量体は、一方の単量 体の N末端側領域と他方の単量体の C末端側領域とが界面となって接合し形成され る。なお、本明細書において、 N末端側領域とはタンパク質を一本の鎖として見たとき にその中央より N末端よりの部位を意味し、 C末端側領域とは中央より C末端よりの部 位を意味する。真核細胞および古細菌において、多くの場合 PCNAは三量体を形 成する。図 1に PCNA三量体のモデルを図示した。図 1に示すように、 PCNA単量体 10a、 10b、 10cが各末端領域において他の単量体と接合し、環構造上の多量体 1 を形成する。接合部 20は各単量体の末端領域が界面となり、その内部に単量体を 結びつける分子間相互作用が形成される。図 2に、 Pyrococcus 'furiosus PCNA の分子間相互作用のモデル図を示す。図 2では、配列番号 2に記載のアミノ酸配列（ 野生型 Pfu— PCNAのアミノ酸配列）を有する PCNAについて説明する。一方の単 量体 10aの N末端側領域内に含まれるアミノ酸残基と、他方の単量体 10cの C末端 側領域内とに含まれるアミノ酸残基とが分子間対を形成する。図 2に示すように、配 列番号 2に記載のアミノ酸配列における、 139番目、第 143番目および第 147番目 のアミノ酸残基群と、第 82番目、第 84番目、第 109番目のアミノ酸残基群とが、相互 に影響しあうネットワークを形成すると考えられる。
[0031] これに対し、本発明では、分子間相互作用を生じる部位のアミノ酸残基の少なくとも 一部が、積極的に相互に反発しあうように構成される。ここでいう「電荷的に反発しあ う」とは、界面領域に含まれるアミノ酸残基の有する電荷によって反発しあうことを ヽぅ 。したがって、そのような組み合わせとしては、界面に含まれるアミノ酸残基が、双方と もプラスにチャージして ヽる分子で構成される場合、双方ともマイナスにチャージする 分子で構成される場合が含まれる。より具体的には、アミノ酸残基が双方とも酸性アミ ノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸により構成されることが好ましい。酸性アミノ酸とし ては、例えばァスパラギン酸 (略号: Aspまたは D)、グルタミン酸 (略号: Gluまたは E) などが挙げられる。また塩基性アミノ酸としては例えばリシン (略号: Lysまたは K)、ァ ルギニン（略号: Argまたは R)、ヒスチジン（略号: Hisまたは H)などが挙げられる。
[0032] したがって、例えば、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列を有する PCNAをべ ースとした場合、本発明の PCNAを得るには、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸 配列において、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目およ び第 147番目力もなる群より選ばれる少なくとも 1つの位置のアミノ酸残基が変更され る。本発明の好ましい形態としては、下記 (i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上のアミ ノ酸残基と、下記 (ii)群力も選ばれる 1つ以上のアミノ酸残基とが、相互に電荷的に 反発しあうアミノ酸残基により構成される形態が例示される。
(i)第 82番目、 84番目および第 109番目のアミノ酸残基群
(ii)第 139番目、第 143番目および第 147番目のアミノ酸残基群
より具体的には、前記 (i)力 選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と、前記 (ii )カゝら選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基との組み合わせ力 双方とも酸性アミノ酸 どうしの組み合わせである力 双方とも塩基性アミノ酸の組み合わせであることが好適 である。すなわち、（i)群および (ii)群の各群力も少なくとも 1つ選ばれるアミノ酸残基 力 双方共にァスパラギン酸、およびグルタミン酸力 なる群より選ばれる酸性アミノ 酸である形態、および (i)群および (ii)群の各群力 少なくとも 1つ選ばれるアミノ酸 残基が、リシン、アルギニンおよびヒスチジン力もなる群より選ばれる塩基性アミノ酸で ある形態などが好ましい例として挙げられる。
[0033] DNA複製を促進する活性 (DNA複製促進活性）は、元となる野生型の PCNAに 比べて DNA複製が促進されることを意味する。具体的には、配列番号 2又は 32に記 載のアミノ酸配列を有する PCNA単量体又はその多量体よりも DNA複製促進活性 が優れていることが、より好ましい。さらに他の具体的指標としては、下記実施例に示 した DNA複製の活性測定方法に従って伸長性、反応速度などを測定した場合に、 伸長性および反応速度では Taqポリメラーゼに比べ同程度から 10倍以上まで活性を 上昇させる DNA複製促進活性を備えることが好適である。
[0034] また、本発明の PCNAとしては、上記の変異を含むアミノ酸配列を有する PCNAと 実質的に同一の PCNAも含まれる。具体的には、本発明の PCNAとして、例えば、 上記のような好ましい DNA複製促進活性を有し、かつ、第 82番目、第 84番目、第 1 09番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目以外の部位に、本発明の効果 を阻害しない範囲において、付加、挿入、置換、および欠失力もなる群より選ばれる 1 または数個のアミノ酸残基の変異を含む変異型 PCNAが挙げられる。「数個」とは、 具体的には、 2〜50個、好ましくは 2〜30個、さらに好ましくは 2〜10個、特に好まし くは 2〜5個である。このようなタンパク質においても、配列番号 2又は 32に示すアミノ 酸配列における (i)群と (ii)群から選ばれる位置に対応するアミノ酸残基は、電荷的 に反発しあうように構成される。すなわち、（i)群および Zまたは (ϋ)群の位置に係る 所定のアミノ酸残基以外にぉ 、ても、その活性が著しく損なわれな 、範囲にお！、て 他の変異が許容される。そのような変異としては例えば、アミノ酸残基のいわゆる保存 的な置換も含まれ得る。なお、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目以外の部位に、欠失、挿入、付加といった変異が導入さ れた場合、変異導入後のアミノ酸酸残基の番号は、変異導入前のアミノ酸残基の番 号とは異なることがあり得るが、多量体を形成する場合の界面内に位置し分子間相 互作用を及ぼしあう上記 (i)および (ii)に示す位置に相当する限りにおいて、番号が 前後しても本発明の PCNAに含まれる。上記変異型 PCNAのうち、特に、第 73番目 のアミノ酸残基をロイシンに代えた置換のみを含むもの、またはそれにカ卩えて他の変 異を含むものは、容易に調製及び精製することができるため好ましい。
[0035] 本発明の PCNAが DNAの複製反応を促進し得る作用 '機序は必ずしも明確では ないが，多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有す ることにより， DNAの複製反応の繰り返しが円滑に行われ，その結果， DNA複製反 応をより促進するということが推測される。従来 PCNAは，単量体どうしが堅固に接合 して多量体を形成することにより安定したクランプとしての役割を発揮し， DNA複製 促進因子として機能するとの考え方が主流であつたが，この点において本発明は従 来とは異なる知見を提供するものである。 RFCを併用しな 、場合の PCNAの活性に は，多量体の結合が堅固すぎるのは良くなく，特に PCRのような複製反応の繰り返し の際には，環構造が温度上昇時に解除されるように弱められていることにより，野生 型 PCNAの RFC併用時よりもさらに優れた促進活性を発揮するというものである。
[0036] 本発明の好ましい PCNAの具体例としては、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸 配列において、第 143番目のアミノ酸残基をァスパラギン酸力もアルギニンに換えた 配列（D143R)を有する PCNA単量体が挙げられる。第 143番目のアミノ酸残基は（ ii)群に属する。この場合、（i)群に属する第 82番目、第 84番目、第 109番目、のアミ ノ酸残基は順番にアルギニン、リシン、アルギニンであり、この分子間相互作用は、界 面領域が通常よりも相反しあう状態を形成し得る。本形態の PCNAは、下記実施例 に示されるように、 DNA複製反応の伸長性および反応速度などについてバランス良 く特に優れた補助作用を発揮する。
[0037] また、本発明は、上記本発明の PCNAをコードするポリヌクレオチドを提供する。塩 基配列はコドン表によりアミノ酸に演繹される力 コドンの縮合により 1つのアミノ酸配 列は複数の塩基配列種によりコードされ得る。例えば、配列番号 2又は 32に記載の アミノ酸配列は、例えば配列番号 1又は 31に記載の塩基配列によりコードされる。し たがって、本発明のポリヌクレオチドの一形態としては、下記（a)のポリヌクレオチドが 挙げられる。
(a)配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列にぉ 、て (i)群力も選ばれる少なくとも 1 つ以上のアミノ酸残基と (ii)群から選ばれる 1つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反 発するようにアミノ酸残基が置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す るポリヌクレオチド
[0038] (a)のような塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号 1又は 31に記載の塩 基配列において、上記所定位置のアミノ酸残基が対応する部位の塩基配列を改変 することにより容易に作製可能である。また、アミノ酸の種類に基づく塩基配列の変換 はコドン表に基づき容易に変換可能である。なお、本明細書でいうポリヌクレオチドに は、 DNA、 RNAが含まれ、一本鎖であっても二本鎖であってもよぐさらに DNAお よび RNAのキメラ体、あるいは DNAおよび RNAのハイブリッド等が含まれる。
[0039] また、下記 (b)のようなポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含み得る。
(b)上記 (a)のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌ クレオチドとストリンジェントな条件下においてノ、イブリダィズし；
(i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と (ii)群力も選ばれる 1つ以上 のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基の組み合わせとなるアミノ酸配列 をコードする塩基配列を有し；かつ
上記所定の DNA複製促進活性を有する PCNAをコードするポリヌクレオチド
[0040] ノ、イブリダィズする遺伝子を得るために用いることができるプローブは、例えば配列 番号 1又は 31に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、 プローブを用いてこれとハイブリダィズするポリヌクレオチドをつり上げ、 目的とするポ リヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、 DNAプローブ はプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブと して用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切 り出す箇所は、 目的とする DNAに応じて調節することができる。
[0041] また、「ストリンジェントな条件」とは、 、わゆる特異的なハイブリッドが形成され、非 特異的なノ、イブリツドが形成されな 、条件を 、う。通常のサザンハイブリダィゼーショ ンの洗 \ヽの条件である 60°C、 1 X SSC、 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。また、「ストリンジ ヱントな条件で」ハイブリダィズするポリヌクレオチドとして、上記 (b)のポリヌクレオチド は（a)のポリヌクレオチドに対し、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、さ らに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性 (homology)を有する ことが好適である。なお、相同性の計算方法としては、例えば、 BLAST, FASTA、 ClustalWなどを用い得る。
[0042] 上記 (b)に示すポリヌクレオチドは、その塩基配列が翻訳されたアミノ酸配列を備え るタンパク質が、 DNA複製促進活性を有する。より具体的には、上記本発明のタン ノ ク質について説明したのと同様の DNA複製促進活性を有する。
[0043] 上記本発明のポリヌクレオチドは、適当なベクターに組み込み、組換えポリヌクレオ チドとして用いることができる。本明細書において組換えポリヌクレオチドとは、 2種以 上のポリヌクレオチド同士が連結されたハイブリッド分子のことである。本発明の組換 えポリヌクレオチドの好ま 、形態としては発現ベクターが挙げられる。発現ベクター は様々な形態のものが既に知られており、また市販されているものもある。本発明で は組換えポリヌクレオチドの形態は、用途などに応じて適宜選択してよぐ市販の発 現ベクターなど公知の発現ベクターを用いることができる。下記に限定されるもので はないが発現ベクターに関連する具体例を示す。
[0044] ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR322、 pBR325、 pUC12、 pU CI 3、市販品として pBT Vector, pTRG Vector (Stratagene社製）など）、酵 母由来プラスミド（例、 YEp24、 YCp50など）、 λファージなどのバタテリオファージ、 レトロウイルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルス、枯草菌に 好適に用いられるプラスミド（例、 pUB110、 pTP5、 pC194など）などの他、 pAl— 1 1、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAlZNeoなどが用いられる。
[0045] プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモ 一ターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシ リヒア属菌である場 合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 λ PLプロモーター、 1 ppプロモーター、 T7プロモーターなど力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーターなどが挙げられる。ま た、宿主細胞が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場 合は、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが挙げられる。また、動物細 胞を宿主細胞として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 HIV' LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウイノレス）プロモーター、 HSV— ΤΚプロモー ターなどが挙げられる。
[0046] 発現ベクターは、組換え操作につ!、ての扱!、やすさの観点からマルチクローユング サイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選 択マーカー、ェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付カ卩シグナル、 SV40複 製オリジン (以下、 SV40oriと略称する場合がある）、ターミネータ一などを組み込む ことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子 (カルべ-シリ ン耐性遺伝子ともいわれる。以下、 Ampと略称する場合がある）、カナマイシン耐性 遺伝子（以下、 Kamと略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、 Tet と略称する場合がある）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dhfrと略称する場合がある） 遺伝子〔メソトレキセート (MTX)耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Neoと略称 する場合がある、 G418耐性)等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合つ たシグナル配列を、本発明のランダムオリゴヌクレオチドまたはカセットの N端末側に 付加する。宿主細胞がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA'シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列など力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は、 a アミラーゼ'シ グナル配列、サブチリシン'シグナル配列など力 宿主細胞が酵母である場合は、 M F a ·シグナル配列、 SUC2 'シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合に は、インシュリン 'シグナル配列、 a インターフェロン 'シグナル配列、 Rasフアルネ シル化 ·シグナル配列などをそれぞれ利用できる。
[0047] 上記のように本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、これを宿主細 胞に導入し、本発明の DNAポリメラーゼを発現する形質転換体を作製することがで きる。
[0048] 宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（streptococci)、ブドウ球菌（staphylococc i)、ェシエリヒア属菌（Escherichia coli)、ストレプトミセス属菌（Streptomyces)お よび枯草菌（Bacillus subtilis)などの細菌細胞；酵母、ァスペルギルス属（Asperg illus)などの真菌細胞；ドロソフイラ S2 (Drosophila S2)およびスポドプテラ Sf 9 (Sp odoptera Sf9)などの昆虫細胞； CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK 293、ボウズ (Bows)黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物 細胞が挙げられる。
[0049] 発現ベクターの宿主細胞への導入は、 Davisら、 BASIC METHODS IN MO LECULAR BIOLOGY (1986) ; Sambrookら、 MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL、第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)のような、多くの標準的な実験マ -ュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カル シゥムトランスフエクシヨン、 DEAE デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロイ ンジェクシヨン、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、トラン スダクシヨン、ノ ィオリスティック導入 (biolistics法)または感染等がある。
[0050] 形質転換体の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は 多数に上る力 いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がェシエリ ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地 は液体培地でも寒天培地でもよぐその中には形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリ ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類 、コーンスチープ.リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な どの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素 ナトリウム、塩ィ匕マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長 促進因子などを添カ卩してもよい。培地の pHは約 5〜8が望ましい。ェシエリヒア属菌を 培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩 (NaCl)を含 む LB培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働力せるため に、例えば、イソプロピル 1 チォー j8— D—ガラクトシド (IPTG)のような誘導剤を添 加してもよい。宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24 時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養 は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌をカ卩える。
[0051] 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、 Burkholder 最小培地、 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地などが挙げられる。培地の pHは約 5 〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0052] また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195、 788 (1962) ) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行 ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0053] 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5〜2 0%の胎児牛血清を含む MEM培地、 DMEM培地、 RPMI 1640培地（The Jour nal of the American Medical Association, 199卷、 519 (1967) )、 199培 地 (Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine、 73卷、： L (19 50) )などが用いられる。 pHは約 6〜8であることが好ましい。培養は通常約 30〜40 °Cで約 15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、 CO濃度の調節を行う。
2
[0054] 形質転換体に生成させた本発明のタンパク質は、必要に応じて、タンパク質精製の 定法により、精製、単離することができる。以上のようにして、形質転換体を用いて、 本発明の PCNAを得ることができる。
[0055] 2.本発明の PCNAを用いた DNAの複製方法
本発明の DNA複製方法は、 PCNA単量体および Zまたは前記単量体で構成され た多量体および DNAポリメラーゼの存在下で DNAの合成反応を行うことを特徴とす る。 DNAの合成方法としては、 PCR、プライマーエクステンション、ニックトランスレー シヨン、逆転写酵素による First strand cDNA合成、などが挙げられる。
[0056] 本発明の DNA複製方法としては、 PCRによる DNA増幅が好適な形態として挙げ られる。 PCRにおいては、プライマーと铸型 DNAを用いて DNA複製を繰り返し、幾 何級数的に DNAを増幅させる。そのため、 PCNAは DNAポリメラーゼに対するクラ ンプとしての機能を果たすと共に、 DNAポリメラーゼが铸型上で安定した後または所 定領域の増幅後には铸型力 速やかに外れることが望ましぐ本発明の PCNAがこ のような特性を備えているものと推察される。
[0057] 本発明の PCNAは、様々な DNAポリメラーゼと相性がよぐ汎用性が高い。 DNA ポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があ るのが一般的である。しかし、本発明の PCNAと組み合わせることにより、忠実性を低 下させずに、伸長性を向上し得るため、 DNAポリメラーゼの短所を補強しつつ DNA 複製活性が増強され得る。本発明の DNA複製方法にぉ ヽて用いる DNAポリメラー ゼとして好ましくは、例えば、 Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社）、 Ta KaRa EX Taq (タカラバイオ社）、 Vent DNA Polymerase (NEW ENGLAN D Bio Labs社)、 Deep VentR DNA Polymerase (New England Biolabs 社）、 Pfu Turbo DNA Polymerase (ストラタジーン社）、 KOD DNA Polyme rase (東洋紡社）、および Pwo DNA Polymerase (ロッシュ ·ダイァグノスティックス 社)など、現在主要に用いられている DNAポリメラーゼのほとんどに適用し得る。また 、本発明の PCNAは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れる力 伸長性に 劣るタイプの 0L型ポリメラーゼとの組み合わせにお 、て特に有用である。
[0058] 本発明の DNA複製方法においては，本発明の PCNAが RFCを必要としないこと から，反応系に RFCを添加しなくてよい。 RFC標品は一般には市販されておらず， その調製は手間を要する。 RFC標品が利用できるとしても，添加して使用する場合 には， RFC以外の DNA複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であ るが，本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また，特に PC Rでの使用の場合には，本発明の PCNAは RFCを併用しなくとも，野生型 PCNAと RFCの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。
[0059] また、 PCRの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発 明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。 P CRの条件としては、例えば、 DNAポリメラーゼの添カ卩量、 PCRの反応時間、反応溶 液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液の pH、投入する铸型ポリヌクレオチド の量などの種々の条件が調整される。
[0060] 3.試薬キット
本発明の試薬キットは、上記本発明の PCNAおよび必要に応じその他の試薬類を 含む DNA複製用の試薬キットである。本発明の PCNAは、単量体および/または 前記単量体で構成された多量体を含む形態で、 DNA複製用試薬の一成分として好 適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明の PCNA力 SPCRにおいて特に好適 に用い得るため、 PCR用の試薬キットとして特に好適である。
[0061] 本発明の試薬キットに備えられる PCNAはどのような形態であってもよぐ精製タン パク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチ ド、ある!/、はこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示 される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説 明したとおりである。また、本発明の PCNAと他の PCNAを組み合わせてもよい。ま た、本発明の PCNAが、組換え DNAまたは形質転換体の形態で提供される場合に は、本発明の PCNAを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、 本発明の PCNAを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般 に用いられる他の成分や媒体を配合してもよ ヽ。
実施例
[0062] 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にな んら限定されるものではな 、。
[0063] l : Pfu— PCNA.RFCタンパク質の調製
PCNA変異体タンパク質標品と RFCタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子 を大量発現させ、発現菌体よりタンパク質を精製することにより調製した。
[0064] 1. 1 :菌体入手'ゲノム DNA調製
1. 1. l : Pfu菌体入手'ゲノム DNA調製
Pyrococcus · funosus D: V[3638株を Deutsche Sammlung von Mikroo ganismen und Zelkuluren GmbH (英名： German Collection of Microor ganisms and Cell Cultures、住所： Mascheroder Weg lb, 38124 Brau nschweig, Germany)より入手した。 DSM3638株を、文献（Uemori et al. , Nucl. Acids Res. 21 : 259— 265 (1993) )【こ記載の方法【こ従って培養した 。 500mLの培養液力ら約 1. 2gの菌体を得た。これをバッファー（lOmMTris— C1 pH8. 0, ImM EDTA, lOOmM NaCl) lOmLにけん濁し、 10%SDSを lmL カロえた。撹拌の後、プレティナーゼ K (20mgZmL)を 50 /z L加えて、 55°Cで 60分 静置した。その後反応液を順次フエノール抽出、フエノール Zクロ口ホルム抽出、クロ 口ホルム抽出した後、エタノールを加えて DN Aを不溶化した。回収した DNAを lmL の TE液（10mM Tris— CI, pH8. 0, ImM EDTA)に溶解し、 0. 75mgの Rn aseAをカ卩えて 37°Cで 60分反応させた。その後、反応液をもう一度フエノール抽出、 フエノール/クロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出した後、エタノールをカ卩えて DNAを 回収した。
[0065] 1. 2 : PCNA遺伝子クロー-ング
Pfu— PCNA遺伝子は、 NCBIデータベースに登録されて!、る塩基配列情報 ABO 17486 (配列番号 1および 2)を参考とし、 PCRを利用したクローユング（図 3)によつ て獲得した。以下に詳細を説明する。
[0066] 1. 2. 1 : PCRプライマー
Pfu— PCNA遺伝子の増幅用には、 Pfu—PCNA— F、 Pfu— PCNA—Rを使用 した。これらの配列は PCNA遺伝子の開始メチォニンから終止コドンに相当する領域 を増幅し、さらに 5'側に制限酵素 Ndel認識部位、制限酵素 Xhol認識部位が付カロ するように設計されている。それぞれのプライマーの配列は表 1 (配列番号 3および 4 )に示した。
[0067] [表 1]
PCNA遺伝子増幅用プライマー
Figure imgf000025_0001
[0068] 1. 2. 2 :铸型 DNA
PCRの铸型としては上記 1. 1. 1で調製した Pfuゲノム DNAを使用した。
[0069] 1. 2. 3 : PCR反応液組成
PCR反応液は、次の組成で行った。（50 L反応液系への添加量）
铸型 DNA: lOOng
プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
lOxExTaqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製） [0070] 1. 2. 4 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0071] 1. 2. 5 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 800bp付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0072] 1. 2. 6 : PCR産物のサブクローニング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0073] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 μ gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0074] 1. 2. 7 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には Pfu—PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5，端に制限 酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認さ れた。 Pfu— PCN A遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミドべ クタ一を pUCZPPCと命名することとした。
[0075] 1. 3 : PCNA発現プラスミド作製
pUCZPPCを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し PCNA遺伝子断片を調製した 。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 Pfu— PCNAの発現ベクターを作製した。
[0076] 1. 3. 1 : PCNA DNA断片調製 pUCZPPCを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0077] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0078] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 30分間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 Pfu—PCNA遺伝子に相当する バンド（約 800bp付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら PCNA DNA断片の精製を行った。
[0079] 1. 3. 2 :pET—21a発現ベクター
pET— 21aベクター DNA (米国ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0080] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0081] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0082] 1. 3. 3 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た Pfu—PCNA DNA断片（lOOng)と pET— 21a DNA断片（50ng) を DNA Ligation Kit V2 (タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。
[0083] PCNA DNA断片： lOOng
pET- 21a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L 以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0084] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地（100 μ gZmLアンピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0085] 1. 3. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記糸且換えプラスミドにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に Pfu—PCNA遺伝子の ORF (オープンリー デイングフレーム）が完全に挿入されていた。この Pfu— PCNA遺伝子を保持するプ ラスミドを pPPCNAと呼ぶこととした（図 4)。
[0086] 図 4に示すように、 pPPCNAでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rbs ( リボソーム結合部位）、 PCNA遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム）、 T7ター ミネ一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが PCNA遺伝子を大量発 現することが期待された。
[0087] 1. 4 : PCNA遺伝子への変異導入
より高機能な PCNAを作製する目的で Pfu— PCNAに対してアミノ酸置換を行なつ た。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードするコドンの塩基を置換することにより行った 。表 2に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。
[0088] [表 2]
PCNA変異部位
Figure imgf000029_0001
[0089] 1. 4. 1 :置換変異導入
PCNA遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア（ 表 3、配列番号 5〜： 12)、 Quik Change II Site - Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社)を利用し、同操作マニュアルに従って行った。
[0090] [表 3]
Figure imgf000030_0001
変異導入後に より DNA配列確認し、目的部位に変異導入され 、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各 PCNA変異体設計につ いて説明する。 [0092] 1. 4. 1. l : Pfu— PCNA01
Pfu— PCNAについての報告（非特許文献 6)によれば、天然型の Pfu— PCNAを 大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来の開始 Metからの 翻訳タンパク質以外に、 N末端が 73残基目からスタートする約 20kDaのタンパク質 が副産物として生成され、 73残基目の Metを Leuに遺伝子工学的手法を用いて 1残 基置換した場合、この約 20kDaのタンパク質が生成が抑えられることが報告されて ヽ る。また、このように作製された Pfu— PCNAは、野生型 PCNAタンパク質とかわらな Vヽ性質を有して 、る事が併せて報告されて 、る。これらの事実より Pfu— M73Lの変 異を準野生型として本明細書では取り扱う。
[0093] この Pfu— M73Lの変異体を Pfu— PCNA01とし、変異体を作製した。 Pfu -PC NA01の作製は、铸型プラスミドを pPPCNAとし変異導入用オリゴペア（Pfu— M73 L Fと Pfu— M73L— R)を使用して行った。
[0094] 1. 4. 1. 2 : Pfu— PCNA10
Pfu PCNA 10は Pfu— PCNAO 1の 143残基目のアミノ酸を Dから Aに一残基置 換した変異であり、 Matsumiya (非特許文献 9)により構造と性質が報告されている。 報告によれば、 143残基目のァスパラギン酸は Pfu— PCNAがホモ三量体を形成す る際に界面に位置し、三量体形成に関与するアミノ酸の一部であり、この 143残基目 のァスパラギン酸をァラニンに変換した結果、三量体形成は阻害されるものの DNA ポリメラーゼ活性刺激自体は維持されることが報告されて!、る。
[0095] この D143Aと M73Lの二重変異を持つ PCNA変異体を Pfu— PCNA10とし、作 製にあたっては Pf u— PCANAO 1産生プラスミドを铸型として Pf u— D 143 A— Fと Pf u— D143A— Rの変異導入用オリゴを使用した。
[0096] 1. 4. 1. 3 : Pfu— PCNA12
Pfu— PCNA 12は 82残基目のアミノ酸を R力も Cに一残基置換した変異であり、 M atsumiya (非特許文献 9)によれば、 82残基目のアルギニンは Pfu— PCNAがホモ 三量体を形成する際に界面に位置することが報告されている。
[0097] この R82Cと M73Lの二重変異を持つ PCNA変異体を Pfu— PCNA12とし、作製 にあたっては Pfu— PCANA01産生プラスミドを铸型として Pfu R82C— Fと Pfu R82C— Rの変異導入用オリゴを使用した。
[0098] 1. 4. 1. 4 : Pfu— PCNA13
143残基目をアルギニン (塩基性アミノ酸）にかえる事で、準野生型（Pfu— PCNA 01)のァスパラギン酸（酸性アミノ酸）や Pfu— PCNA10のァラニン（中性アミノ酸）と 電気的性質を全く変える事により、 PCNAの三量体形成能を積極的に阻害した場合 の DNA複製への影響を調べる目的で作製した。具体的には、 Pfu—PCNAOl産生 プラスミドを铸型として、 Pfu— D143R—Fと Pfu— D143R—Rの変異導入用オリゴ を使用して作製した。
[0099] 1. 4. 1. 5 : Pfu - PCNA16
三量体に形成に関連の可能性の高い 2種のアミノ酸、 82残基目のアルギニンと 14 3残基目のァスパラギン酸の 2つのアミノ酸を同時に変異させる事での、効果を調べ る目的で作製した。具体的には、 Pfu— PCNA12産生プラスミドを铸型として、 Pfu — D143R— Fと Pfu— D143R— Rの変異導入用オリゴを使用して作製した。
[0100] 1. 4. 1. 6 : Pfu— PCNA70
143残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として， 143残基目の アミノ酸をリシン (塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。同じ塩基性アミノ酸 でもァノレギニンの側鎖のグァニジニゥム基の pK値は 12. 48,リシンの側鎖のブチノレ
R
アンモ-ゥム基の pK値は 10. 54であり，リシンの方が塩基性が低い。発現プラスミド
R
は， Pfu— PCNA01産生プラスミドを铸型として， Pfu— D143K— Fと Pfu— D143 K—Rの変異導入用オリゴを使用して作製した。
[0101] 1. 4. 1. 7 : Pfu— PCNA71
143残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として， 143残基目の アミノ酸をヒスチジン (塩基性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。ヒスチジンの側 鎖の pK値は 6. 0で，生理的 pHで解離する。ヒスチジンは ρΗ6. 0でイミダゾール基
R
の 50%が電荷をもつ型，残る 50%が電荷をもたない型なので，生理的 pH範囲でも ρ Ηが高めの方では中性となる。よって置換導入するアミノ酸として，アルギニンやリシ ンとは異なる性質が予想される。発現プラスミドは， Pfu—PCNAOl産生プラスミドを 铸型として， Pfu D143H— Fと Pfu D143H— Rの変異導入用オリゴを使用して 作製した。
[0102] 1. 4. 1. 8 : Pfu— PCNA72
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 109残基目のアルギニン (塩基性アミノ酸)をグルタミン酸 (酸性 アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは， Pfu— PCNA01産生ブラ スミドを铸型として， Pfu— R109E— Fと Pfu— R109E— Rの変異導入用オリゴを使 用して作製した。
[0103] 1. 4. 1. 9 : Pfu— PCNA77
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 147残基目のァスパラギン酸 (酸性アミノ酸)をアルギニン (塩基 性アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは， Pfu— PCNA01産生プ ラスミドを铸型として， Pfu— D147R— Fと Pfu— D147R— Rの変異導入用オリゴを 使用して作製した。
[0104] 1. 4. 1. 10 : Pfu— PCNA78
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 139残基目のグルタミン酸 (酸性アミノ酸)をァラニン（中性アミノ 酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは， Pfu— PCNA01産生プラスミド を铸型として， Pfu— E139A— Fと Pfu— E139A— Rの変異導入用オリゴを使用し て作製した。
[0105] 1. 4. 1. l l : Pfu - PCNA79
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し，三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 139残基目のグルタミン酸 (酸性アミノ酸)をアルギニン (塩基性 アミノ酸）に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは， Pfu— PCNA01産生ブラ スミドを铸型として， Pfu— E139R— Fと Pfu— E139R— Rの変異導入用オリゴを使 用して作製した。
[0106] 1. 4. 2 :発現株の作製
以上のように取得した変異型 PCNA発現プラスミドベクターにより大腸菌 BL21 C odonPlus (DE3) RIL (ストラタジーン社)を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸 菌株を得た。
[0107] 1. 4. 3 :菌体培養と発現誘導
各変異 PCNA発現株を 1. 5リットル LB培地（50 μ gZmLアンピシリン含有）にて、 37°Cで振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3-0. 5の時期に終濃度 0. 1
600
mMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopyranoside)を添カ卩して 発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の菌体は遠心分離 (4°C 、 6, 000xg、 6分）によって回収した。
[0108] 1. 4. 4 : PCNAタンパク質精製（図 5)
図 5に示すように、菌体を遠心回収し (S51)、菌体破砕 (超音波破砕、 S52)、 5分 間煮沸し (S53)、ポリエチレンィミン沈澱を行い（S54)、さらに硫安沈澱を行い（S55 )、イオン交換クロマトグラフィー（S56、カラムとして HiTrap Qを使用）、ゲルろ過ク 口マトグラフィー（S57、 Superdex 200を使用）という処理により標品を調製した。 S DS— PAGEにより、良好に精製されたことを確認した。
[0109] 1. 4. 4. 1 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー A(50mM Tris—HCl pH 8. 5, 0. 1M NaCl, 2mM 2—メルカプトエタノール， 10% グリセロール）ま たはバッファー B (50mM Tris—HCl pH8. 0, 0. 1M NaCl、 0. ImM ED TA、 10% グリセロール、 0. 5mM DTT)によりけん濁した。超音波処理により 菌体を破砕した。
[0110] 1. 4. 4. 2 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0111] 1. 4. 4. 3 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン（SIGMA P— 3143)と NaClをそれぞれ終濃度 0 . 2% (w/v) , 0. 58Mになるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠 心分離（18, 500 X g, 25分， 4°C)して，上清を回収した。
[0112] 1. 4. 4. 4 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を 80%飽和させた 50mM Tris- HCl (pH8. 5)ノ ッファー 80mLを添加して、遠心分離（30, OOO x g, 25分， 4 °C)により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファー C (50mM Tris-HCl pH8. 0 , 0. 1Μ NaCl)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して透析を行った。
[0113] 1. 4. 4. 5 :イオン交換クロマトグラフィー
透析したサンプルは、 Pfu— PCNA01, 10, 12, 13, 16に関しては、 FPLCタン パク質精製システム（アマシャムバイオサイエンス社）を、その他の Pfu— PCNA70, 71, 72, 77, 78, 79【こ関して ίま、 AKTAexplorer 10S (アマシャムノィ才サイェン ス社）を使用して、イオン交換クロマトグラフィー（HiTrap Q ;アマシャムバイオサイエ ンス社）を実施した。溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェ ントとし、流速は lmLZminとした。
[0114] 1. 4. 4. 6 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Qイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれ Superdex 20 0 (アマシャムバイオサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに 精製し、以降のアツセィ用標品とした。
[0115] 得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび 良好に精製されたことが確認された（図 6及び図 40)。
[0116] 1. 5 : Pfu— RFC遺伝子クローユング
RFCは 2つのサブユニット RFCLと RFCSから構成されており、 Pyrococcus -furio susゲノム上ではタンデムに位置して 、る。 RFCタンンパク質標品の調製にあたって は、 RFCLと RFCS遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同一宿主内に各々の発 現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プラスミドの作製にあた つては非特許文献 7を参照した。以下に詳細を示す。
[0117] 1. 5. 1 : RFCLの遺伝子クローユングと発現プラスミド作製
Pfu— RFCL遺伝子（NCBI GeneID1467921)は Pfuゲノムを铸型とした PCR により得た (塩基配列、配列番号 13； アミノ酸配列、配列番号 14)。 PCR用プライマ 一として、 RFCL Fプライマーと RFCL— Rプライマーを使用した（表 4；配列番号 1 5および 16)。クローユング操作の都合上、 RFCL— Fプライマーには制限酵素 Ndel 認識部位、 RFCL— Rプライマーには制限酵素 Xhol認識部位をそれぞれ付加した。
[表 4]
Figure imgf000036_0001
PCRの铸型としては上記 1. 1で調製した Pfuゲノム DNAを使用した。 [0120] PCR反応は、次の組成で行った。 (50 μ L反応系への添加量）
铸型 DNA; 100ng
プライマー；各 lOpmol
dNTP ;各 lOnmol
EX Taq*; 1.25U
10X EX Taqバッファー； 5 L
以上に滅菌蒸留水を添加して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製）
[0121] 1. 5. 1. 1 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0122] 1. 5. 1. 2 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 1. 4kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0123] 1. 5. 1. 3 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0124] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0125] 1. 5. 1. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には Pfu—RFCL遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5，端に制限 酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認さ れた。このプラスミドを pUC118/RFCLとした。
[0126] 1. 5. 1. 5 : RFCL発現プラスミド作製
PUC118ZRFCLを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し RFCL遺伝子断片を調 製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 Pfu— RFCLの発現ベクターを作製し た。
[0127] 1. 5. 1. 6 : RFCL DNA断片調製
pUC 118ZRFCLを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0128] プラスミド DNA :
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0129] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間、制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行った、 Pfu—RFCL遺伝子に相当する バンド（約 1. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら RFCL DNA断片の精製を行った。
[0130] 1. 5. 1. 7 : pET— 29a発現ベクター
pET— 29aベクター DNA (ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xho Iで二重切断した。
[0131] プラスミド DNA : 2 μ &
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0132] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1 %ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 29aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 29a DNA断片の精製を行った。
[0133] 1. 5. 1. 8 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た Pfu—RFCL DNA断片（lOOng)と pET— 29a DNA断片（50ng)を DNA Ligation Kit V2 (タカラバイオ社）を利用して以下の様に反応した。
[0134] RFCL DNA断片： lOOng
pET- 29a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0135] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（30 μ gZmLカナマイシン含 有)上に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロ ニーのうち 3個を LB液体培地（30 μ gZmLカナマイシン含有） 3mL、 37°Cにて終夜 振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0136] 1. 5. 1. 9 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 29aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれ のプラスミド DNAについてもマルチクロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に Pfu— R FCL遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム）が完全に挿入されていた。 Pfu —RFCL遺伝子を保持するプラスミドを pRFCLと呼ぶこととした（図 7)。
[0137] 図 7に示すように、 pRFCLでは pET— 29aが保持する T7プロモーターから rbs (リ ボソーム結合部位）、 RFCL遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム）、 T7ターミ ネーターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが RFCL遺伝子を大量発 現することが期待された。
[0138] 1. 5. 2 : RFCS遺伝子のクローユングと発現プラスミド作製
Pfu— RFCS遺伝子（GenelD: 1467922)は非特許文献 7によれば、インティン（ 1, 575塩基によりコード）を 1個所保持し、 N端のェクスティンは 177塩基、 C端のェ タスティンは 804塩基にコードされて 、ることが報告されて 、る（終始コドンは含まず） 。配列番号 17および 18に Pfu—RFCSの塩基配列およびアミノ酸配列（いずれもィ ンティン部分を含む)を示す。
[0139] RFCS発現ベクター作製にあたっては、まず、インティンを含む Pfu—RFCS遺伝 子全長を PCR反応を利用して増幅し、その後、インティンを除去した成熟型 RFCS ( RFCSmとも呼ぶ)を調製した。インティン除去は、 N端側と C端側のェクスティンを個 別に PCRで増幅した後に、 2種のェクスティン断片を PCR反応により融合する事によ り実施した。
[0140] 1. 5. 2. 1インティンを含む RFCS遺伝子の PCR反応
Pfuゲノム（上記 1. 1で調製）、 RFCS— F、 RFCS—Rプライマー（表 5 ;配列番号 1 9、 20)の組合せで PCR反応を行なった。
[0141] [表 5]
〔〕0142
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000041_0001
铸型 DNA: lOOng
プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
lOx EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製）
[0143] 1. 5. 2. 2 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0144] 1. 5. 2. 3 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 2. 6kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0145] 1. 5. 2. 4 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0146] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0147] 1. 5. 2. 5 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分はインティンを含む RFCS遺伝子と一致した。このプラスミドを pUCZRFCSとし た。
[0148] 1. 5. 2. 6 :ェクスティン増幅用プライマー
N端側ェクスティン用 PCRプライマーとして、 RFCSF1プライマー、 RFCSR2プラ イマ一 (表 5 ;配列番号 21、 23)を準備した。また、 C端側ェクスティン用 PCRプライ マーとして、 RFCSF2プライマー、 RFCSR1プライマー（表 5 ;配列番号 22、 24)を 準備した。クローユングを容易にする目的で RFCSF1プライマーには制限酵素 Ndel 配列、 RFCSR1プライマーには制限酵素 Sail配列を 5'端に付加してある。また、 2種 のェクスティン断片を PCR反応により融合する際に利用する相補的な配列を RFCS F2プライマーと RFCSR2プライマーに設けた。
[0149] 2種のェクスティン増幅のための PCR反応は、次の組成で行った。（50 μ L反応液 系への添加量）
pUC/RFCS DNA: 50ng
プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製）
[0150] 1. 5. 2. 7 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0151] 1. 5. 2. 8 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った。 RFCSF1プライマーと RFCSR2プライマーセットの PCR産物では約 18 0塩基のバンドが、 RFCSF2プライマーと RFCSR1プライマーセットの PCR産物では 約 800塩基のバンドが観察された。紫外線照射下でそれぞれのバンドを含むゲルを 切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバ ィォサイエンス社)を使用して同操作マニュアルに従 、ゲル中の PCR産物の精製を 行った。
[0152] 1. 5. 2. 9 : PCR融合反応
2種のェクスティン PCR産物を 1チューブ内で 1組のプライマーセットで PCR反応に 供する事で 2種の断片を融合し、成熟型 RFCSをコードする遺伝子断片を得た。以 下に詳細を示す。
[0153] 2種のェクスティン PCR産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
N端ェクスティン断片： 2 μ L· (50ng相当）
C端ェクスティン断片： 2 μ L· (50ng相当）
10x EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 44.5 μ Lとした。
上記を 95°C · 3min加熱し、 37°Cまで 30分間でゆっくりと冷却した。
[0154] 上記反応液に以下を添加する
dNTP : 5 （各10 01)
Figure imgf000044_0001
これを 72°C · lOmin反応させる。
(*タカラバィォ社製）
[0155] 上記に、 RFCSF1プライマーと RFCSR1プライマーを各 lOpmol添カ卩し、 95°C - 3 Osec→55°C · 30sec→72°C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を 行った。
[0156] 1. 5. 2. 10 : PCR産物の制限酵素切断'精製
上記 PCR反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製した DNA断片 は制限酵素 Ndelと Sailで二重切断した。
PCR産物： 相当
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 2種のインティンの融合断片 (成 熟型 RFCSコード配列）と想定されるバンド (約 lkb付近）を切り出し、 GFX PCR D NA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用 し精製した。
[0157] 1. 5. 2. 11 :pET— 21a発現ベクターの制限酵素切断
pET— 21aベクター DNA (ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと Sail で二重切断した。
[0158] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
[0159] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0160] 1. 5. 2. 12 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た 2種のインティンの融合断片 (成熟型 RFCSコード配列）と予測される約 lkbの DNA断片（lOOng)と pET—21a DNA断片（50ng)を DNA Ligation Ki t V2 (タカラバィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0161] lkbDNA断片： lOOng
pET- 21a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0162] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（100 μ gZmLアンピシリン含 有)上に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロ ニーのうち 3個を LB液体培地（100 μ gZmLアンピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終 夜振とう培養し、定法に従 、プラスミド DNAを調製した。 [0163] 1. 5. 2. 13 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET
— 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Sail部分にインティンを除去した成熟型の RFCSmの配 列（984塩基）が確認された (pRFCSmと命名 )。
[0164] 図 8に示すように、 pRFCSmでは pET—21aが保持する T7プロモーターから rbs ( リボソーム結合部位）、成熟型 RFCS遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム）、 T7ターミネータ一の順に並んで 、る事が確認された。本プラスミドが成熟型 RFCS遺 伝子を大量発現することが期待された。
[0165] 1. 6 : Pfu— RFC遺伝子発現株の作製
pRFCLと pRFCSmで大腸菌 BL21— CodonPlus (DE3)— RILを同時に形質転 換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質転換 体を選択し発現株を得た。
[0166] 1. 7 : Pfu— RFC遺伝子発現
上記の発現株を 1. 5リットル LB培地（50 μ gZmLアンピシリンおよび 30 μ g/mL カナマイシン含有)， 37°Cにて振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3— 0.
600
5の時期に終濃度 0. ImMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopy ranoside)を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の 菌体は遠心分離 (4°C、 6, 000xg、 6分）によって回収した。
[0167] 1. 8 : Pfu— RFCタンパク質精製
図 9に示すように、菌体を遠心回収し (S91)、超音波破砕により菌体を破砕し (S92 )、 5分間煮沸処理し (S93)、ポリエチレンィミン沈澱を行い（S94)、硫安沈澱を行い (S95)、ァフィ-ティークロマトグラフィー（S96、 HiTrap Heparinを使用）、ゲルろ 過クロマトグラフィー（S97、 Superdex 200を使用）処理にて標品を調製した。 SDS
— PAGEによる確認では、 90%以上の純度を確保できた。
[0168] 1. 8. 1 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (前出）によりけん濁した。 超音波処理により菌体を破砕した。 [0169] 1. 8. 2 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0170] 1. 8. 3 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン（SIGMA P— 3143)を終濃度 0. 18% (wZv)に なるように添加し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠心分離（18,500 X g, 25分， 4°C)して，上清を回収した。
[0171] 1. 8. 4 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離（18, 500xg, 4°C, 25分）により沈澱を 回収した後、この沈澱をバッファー C (前出）に溶解し、おなじくバッファー Cに対して 透析を行った。
[0172] 1. 8. 5 :ァフィ二ティーク口マトクロマトグラフィー
透析したサンプルは HiTrap Heparin HPカラム（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して精製した。
[0173] 溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、流速は 1 vaL/ minとし 7こ。
[0174] 1. 8. 6 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Heparinァフィ-ティークロマトグラフィーでのピーク画分を Superdex 2
00 (前出）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アツセィ用の標 品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大き さおよび良好に精製されたことが確認された（図 10)。
[0175] 2 : PCNA変異体の評価
上記で調製した各種 PCNA変異体の DNA増幅系への効果、とくに PCR反応系へ の効果を調べた。具体的には PCR反応系に PCNA変異体、 RFCを単独もしくは併 用して添加した場合、未添加の場合で PCR反応を行い、その反応産物を電気泳動 に供して標的領域の増幅状態を比較することで行った。
[0176] 2. 1 :各種 PCNA変異体の評価 Pyrococcus属由来の DNA合成酵素として市販されている Pyrobest DNA Pol ymerase (タカラバイオ社)を対象として各種 PCNA変異体の添加効果を PCR反応 の系を禾 IJ用して調べた。 Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp. 由来 の 3，→5， exonuclease活性（proof reading活性）を有する而熱性 a型 DNAポリ メラーゼである。 Pyrococcus ' furiosus由来の Pfu DNAポリメラーゼゃ、 Vent D NAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。
[0177] 2. 1. 1 :反応液組成
アクセサリータンパク質 (APとも記す)を添加する点を除 、ては標準的な PCR反応 液の組成とし、バッファ一としては添付反応バッファー（10x Pyrobest Buffer II； 組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。なお 铸型 DNAとしてはラムダ DNA (GenBank accession 02459)を使用した。
[0178] [表 6] 表 6
Figure imgf000048_0001
増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを変 る。 プライマ一の組み合わせについては表 8および表 9を参照。
[表 7] 表 7 AP溶液 (アクセサリ一タンパク質溶液)
Figure imgf000049_0001
ただし、 PCNAxxの原液濃度： 100ng し RFC原液濃度； 500ng/ jt L Buffer *： 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0180] 2. 1. 2 : PCR反応プログラム
2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · lmin) 30cycles→4°Cで保持
[0181] 8. 4kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 3. 5min) 30cycles→4°Cで保持
[0182] 15. 8kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 7min) 30cycles→4°Cで保持
[0183] 2. 1. 3 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 1%ァガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動マーカーとして ラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、増幅した断片の大きさごとに 、それぞれ図 11〜図 13 (PCNA01, 10, 12, 13, 16)、図 41〜43 (PCNA01, 10 , 13, 70, 71)及び図 44〜46 (PCNA13, 72, 77, 78, 79)に示す。
[0184] [表 8]
Figure imgf000050_0001
〕 〔
表 8 PCNA評価用プライマー配列
Figure imgf000050_0002
表 9 ラムダ DNA増幅領域
Figure imgf000051_0001
[0186] 2. 1. 4 :結果 1
図 11〜13の結果について述べる。
PCNA01
増幅サイズが 2kb, 8. 4kbの際は、 RFCを 400ng添カ卩した時にのみ、増幅がみら れるが、その他の場合では PCNA01の添力卩は未添カ卩（no AP)の場合と比較して 阻害的に働いている。これは，野生型 PCNAを使用する際には， RFCを適当量併用 しなければ増幅ができな 、と 、う結果であり，単独添加で DNA合成促進活性を示す プライマーエクステンション試験結果 (非特許文献 6および 9)と異なり， PCRにおいて は野生型 PCNAの単独添カ卩は反応を明確に阻害することを示している。
[0187] PCNA 10
増幅サイズが 2kb、 8. 4kbの際は、 RFCを 200ng、 400ng添カ卩した時に増幅がみ られる力 15. 8kbの場合には RFC400ng添カ卩時のみ増幅が観察される。増幅量は PCNA01の場合より優れている力 PCNA01同様に RFCの存在が必要で、増幅サ ィズによって RFCの至適添カ卩量が異なることが示唆される。
[0188] PCNA 12
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも、 RFC添カ卩することで増幅 量が促進されることが観察された。また RFC未添カ卩においても増幅した。ただし PCR 酵素単独に比べて、若干の増幅促進し力観察されて 、な 、。
[0189] PCNA 13
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも大量の増幅が確認され、増 幅量は RFCの添カ卩量に依存しない。 PCNA13の添カ卩効果には RFCを必要とせず、 PCRによる増幅を顕著に促進して 、ると考えられる。 [0190] PCNA16
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも増幅が確認される。 RFC未 添カ卩においても増幅した力 PCR酵素単独と同等の増幅レベルである。また RFC添 加の効果が余り観察されな!、。
[0191] 5種の PCNAについて Pyrobest DNA polymeraseを使用する PCR反応系へ の添加効果の確認をおこなったが、 PCNA13については未添カ卩時と比較して、圧倒 的に添カ卩時の増幅効果が高ぐまた、 RFCの添加を必要としないことが判明した。
[0192] 2. 1. 5 :結果 2
図 41〜43の結果について述べる。
PCNA01 (準野生型）
2. 1. 4での結果と同様に、 RFCを 400ng添カ卩した場合以外はいずれのサイズに お!ヽても増幅が認められず、 PCNA未添カ卩 (no AP)の場合と比べて阻害的に作用 した。
[0193] PCNA10 (D143A)
増幅サイズが 2kbの場合は RFCを 200— 400ng、 8. 4kbの場合は 400ng添加し た時に明瞭な増幅がみられ、 15. 8kbの際は RFC400ng添加でも増幅は認められ なかった。 2. 1. 4での結果と同様に、増幅量としては PCNA01よりも優れているが、 増幅には RFCの存在が必須で、増幅サイズによって RFCの至適添カ卩量が異なること が示唆された。
[0194] PCNA7KD143H)
RFC未添加では増幅が認められなかった力 増幅サイズが 2kbと 8. 4kbの場合は RFC200— 400ng、 15. 8kbの場合は RFCを 400ng添カ卩した場合に増幅が認めら れた。 PCNA10に比べて増幅量はさらに多くなつているものの、増幅には RFCの添 加が必要であった。
[0195] PCNA70 (D143K)
RFCの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察さ れた。
[0196] PCNA13 (D143R) 2. 1. 4での結果と同様に、いずれのサイズにおいても RFCに依存せずに大量の 増幅が観察され、増幅レベルは PCNA70よりも良好であった。
[0197] PCNAの 143残基目に変異を導入した変異体 4種（PCNA10、 13、 70、 71)につ V、て PCR反応系への添加効果を検証したが、 RFCに依存しな 、促進効果を示した のは PCNA70 (D143K)と PCNA13 (D143R)のみで、より塩基性度の高いアルギ ニン残基に置換した PCNA13が最も強い促進効果を示した。従って、 D143残基へ の変異導入により PCNA単独での PCR促進効果をもたらすためには、塩基性を示 すアミノ酸残基への置換が必要で、その置換した残基が PCR反応条件下 (pH8. 0 〜）で有する正電荷が、単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引 き起こすことが重要であるものと考えられる。
[0198] 2. 1. 6 :結果 3
図 44〜46の結果につ!、て述べる。
PCNA13 (D143R)
2. 1. 4、 2. 1. 5での結果と同様に、いずれのサイズにおいても RFCに依存せず に大量の増幅が観察された。
[0199] PCNA77 (D147R)
RFCの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察さ れたが、その増幅量は PCNA13よりも劣っていた。
[0200] PCNA72 (R109E)
いずれのサイズの増幅の場合でも、 RFCの有無、添加量に依存せず、未添カ卩（no AP)の場合と比較してほとんど変化が認められな力つた。
[0201] PCNA79 (E139R)
いずれのサイズの増幅の場合にも RFCを 200— 400ng同時添カ卩することにより、 促進効果が認められた力 増幅には RFCの存在が必須であり、 PCNA79の単独添 加では反応を阻害した。
[0202] PCNA78 (E139A)
いずれのサイズの増幅の場合にも RFCを 200— 400ng同時添カ卩することにより、 促進効果が認められた力 増幅には RFCの存在が必須であり、 PCNA78の単独添 加では反応を阻害した。また、 PCNA79との比較では、 RFCを 200ng同時添加する 場合には、増幅サイズにより優劣が異なった力 RFCを 400ng同時添加する場合に は、その増幅量は PCNA79よりも劣っていた。 E139に置換導入する場合にも、中性 アミノ酸 (ァラニン)よりも塩基性アミノ酸 (アルギニン）に置換する方が効果大と考えら れる。
[0203] Pfu— PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し、三量体形成に関与する アミノ酸のうち、 4種に置換変異導入した変異体の、 PCR反応系への添加効果を検 証したが、 3つのタイプに分類された。単独添加では反応を阻害するが、 RFCを同時 添加すると RFCの添カ卩量依存的に反応が回復し、添カ卩量によっては、未添加（no AP)の場合より優れた増幅が認められるというもの。単独添加、 RFC同時添加とも未 添加 (no AP)の場合とほとんど変化が認められない、反応に関与していないと推測 されるもの。 RFCの有無に関わらず、反応を促進するものである。ポイントは三量体 の形成能にあり、イオン対ネットワークを弱める加減による現象と考えられる。すなわ ち、三量体構造が堅固すぎると RFCの助けがないと反応が進まない。三量体形成能 が失われるとクランプとして機能できない。その中間の適度に三量体構造が弱くなつ た状態が PCRでの酵素活性促進に重要ということだと推測される。
[0204] 単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引き起こすことにより、 PC Rでの酵素活性促進に有効な三量体形成能を実現して ヽるものと考えられる。また、 熱安定性にも寄与していると推測されるイオン対ネットワークを弱めることにより、高温 下で三量体が解離しやすくなるものと考えられる。 PCRでの次のサイクルへの温度上 昇時、あるいはサイクル最初の変性ステップの高温時に三量体が解離することにより 、複製反応が繰り返されるという反応機構が推察される。
[0205] 11種の変異体について、 PCR反応系への添加効果の確認を行った力 RFCに依 存しない促進効果を示したのは、 PCNA13 (D143R)、 PCNA70 (D143K)、 PCN A77 (D147R)の 3種で、中でも PCNA13が最も強い圧倒的な増幅効果を示した。 また、 RFCを同時添加することにより、むしろ増幅量が減少するような傾向も見受けら れた。
[0206] 2. 2 : PCNA13の各種PCR用DNAポリメラーゼに対する効果 上記の結果を受けて、各種 PCNA変異体のうち特に性質が優れている PCNA13 について、巿販の 7種の PCR用 DNAポリメラーゼを使用した PCR反応系を対象に 添加効果を調べた。具体的には、 2〜3種類の増幅鎖長の異なる標的配列について 、伸長時間の異なる PCR反応を行ない、添加効果を確認した。
[0207] 2. 2. l : Pyrobest DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp.由来の 3 →5 exonucleas e活性 (proof reading活性）を有する耐熱性 a型 DNAポリメラーゼである。
[0208] PCNA13の添カ卩を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨する PCR反応液の 組成とし、バッファ一としては製品添付反応バッファー（10x Pyrobest Buffer II； 組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0209] [表 10]
表 10
Figure imgf000055_0001
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマ一の組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度； 100ng/〃 L, Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0210] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C · 0. 5, 1 , 2min) 30cycles→4°Cで保持 8. 4kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 2, 3. 5, 5min) 30cycles→4°Cで保持 15. 8kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 2, 5, 6, 7min) 30cycles→4°Cで保持 [0211] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー（G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を、増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 14〜 16に示す。
[0212] まとめ：
2kb増幅の場合
図 14に示すように、伸長時間（Extension time) 0. 5min、 lminで PCNA13添 加による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Extension time) 2minでは反 応が飽和に近い状態である力 やはり PCNA13添カ卩時の方が若干増幅量が多いこ とが観察される。
[0213] 8. 4kb増幅の場合
図 15に示すように、伸長時間（Extension time) 2minでは添カ卩効果は見られな いが、 3. 5min、 5minでは添カ卩による促進効果が観察される。
[0214] 15. 8kb増幅の場合
図 16に示すように、伸長時間（Extension time) 2minでは添カ卩効果は見られな いが、 5min、 6min、 7minでは添カ卩による促進効果が観察される。
[0215] 2. 2. 2 :TaKaRa EX Taqに対する PCNA13添カ卩効果
TaKaRa EX Taq (タカラバイオ社）は、 3，→5，exonuclease活性（proof read ing活性）を持つ而熱性 DNA Polymeraseである。通常の PCR条件下において、 従来の Taq DNA Polymeraseと比べて、高い増幅効率、低いエラー率で高感度 の PCRを実現できる。
[0216] PCNA13の添カ卩を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨する PCR反応液の 組成とし、バッファ一としては製品添付反応バッファー 10x Ex Taq buffer (20m M Mg2+plus)；組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の 組成を示す。
[0217] [表 11] 表 1 1
Figure imgf000057_0001
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA1 3の原液濃度； 100ng/ し Buffer; 25m M TrisCI pH8.0, 50m M NaCI, 50% Glycerol
[0218] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 30sec, 40sec, lmin) 30cycles→72°C . 10min→4。Cで保持
[0219] 8. 4kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 1. 5min, 2min, 3min) 30cycles→72 °C ' 10min→4°Cで保持
[0220] 15. 8kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C · 3. 5min, 4min, 5min) 30cycles→72 °C ' 10min→4°Cで保持
[0221] 電気泳動： PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 17〜図 19に示す。
[0222] まとめ：
2kb増幅の場合
図 17に示すように、伸長時間（Extension time) 30sec, 40secで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Extension tim e) lminでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 40secの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0223] 8. 4kb増幅の場合
図 18に示すように、伸長時間（Extension time) l. 5min、 2minで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Extension tim e) 3minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 2minの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0224] 15. 8kb増幅の場合
図 19に示すように、伸長時間（Extension time) 3. 5min、 4minで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間（Extension tim e) 5minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 4minの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0225] 2. 2. 3 : Vent DNA polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Vent DNA Polymeraseは好熱菌 Thermococcus litoralis由来の DNA po lymeraseで NEW ENGLAND Bio Labs社より販売されている PCR用酵素であ る。
[0226] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー（10x ThermoPol Reaction Buffer ; 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH ) SO , 100 mM KC1, 20 m M MgSO , 1 % Triton X—100, pH 8. 8 @ 25° C)を使用した。以下
4
に PCR反応液の組成を示す。
[0227] [表 12] 表 1 2
Figure imgf000059_0001
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2 ) PCNA1 3の原液濃度； 100ng/ iし Buffer ; 25mM TrisCI pH8.0, 50m M NaCI, 50% Glycerol
[0228] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - 5sec, 15sec， 30sec) 3 0cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0229] 8. 4kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - lmin, 3min, 5min) 30 cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0230] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー（G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 Ι 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 ;z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 20、図 21に示す。
[0231] まとめ：
2kb増幅の場合
図 20に示すように、伸長時間（Extension time) 5sec、 15secで PCNA13添カロ による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Extension time) 30secでは反応 が飽和に近い状態である力 やはり PCNA13添カ卩時の方が若干増幅量が多いこと が観察される。
[0232] 8. 4kb増幅の場合
図 21に示すように、伸長時間（Extension time) lmin、 3min、 5minで添カ卩によ る促進効果 (増幅量、反応速度)が観察される。
[0233] 2. 2. 4 : Deep Vent DNA polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Deep Vent DNA Polymerase (New England Biolabs社)は Pyrococcus species GB— Dl由来の而熱性 DNAポリメラーゼであり、 3，→5，ェキソヌクレア ーゼ活性を保持する。
[0234] 評価に際しては、 PCNA13の添加を除いては標準的な PCR反応液を組成とし、バ ッファーとしては製品添付反応バッファー（10x ThermoPol Reaction Buffer; 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH ) SO , 100 mM KC1, 20 mM
4 2 4
MgSO , 1 % Triton X— 100, pH 8. 8 @ 25° C)を使用した。以下に P
4
CR反応液組成を示す。
[0235] [表 13]
表 13
Figure imgf000061_0001
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度； 100ng/ jUし Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0236] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C · 0. 5min, lmin, 2min,
3min) 30cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0237] 8. 4kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - 5min, 7min, 9min) 30 cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0238] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー（G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 22および図 23に示す。
[0239] まとめ：
2kb増幅の場合 図 22に示すように、伸長時間（Extension time) 0. 5min, lmin, 2minで P CNA13添カ卩による反応促進が明確に観察される。伸長時間（Extension time) 3 minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 2minの PCNA13添カロ 時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0240] 8. 4kb増幅の場合
図 23に示すように、いずれの伸長時間（Extension time) 5min、 7min、 9minに おいても添加による促進効果 (増幅量、反応速度）が観察される。
[0241] 2. 2. 5 : Pfu Turbo DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Pfu Turbo DNA Polymerase (ストフタン ~~ン社)は Pyrococcus 'furiosus由 来の耐熱性 DNAポリメラーゼに ArchaeMaxx(R) ((R)は登録商標であることを示す） Factorと呼ばれる PCR反応促進剤を添加した製品である。 PCR反応過程で副次的 に産生される dUTPは PCR反応を阻害することが知られて!/、るが、 ArchaeMaxx(R)
Factorは dUTPを分解する因子であり、これを添加することで PCR反応の阻害を 防止し、結果的に PCR反応効率を高めている。
[0242] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー（10x Cloned Pfu DNA polymera se reaction buffer ; 200 mM Tris— HCl(pH 8.8) , 100 mM (NH ) SO
4 2
, 100 mM KC1, 20 mM MgSO , 1 % Triton X— 100, lmg/ml
4 4
BSA)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0243] [表 14]
表 14
Figure imgf000063_0001
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer. Reverse Primerの組み合わせを変える。プライマ一の 組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/jU L, Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50m NaCI, 50% Glycerol
[0244] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
95°C · 2min→ (95°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · lmin) 30cycles→72°C · 1 0min→4。Cで保持
[0245] 8. 4kb増幅の場合
92°C · 2min→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 8min) 10cycles→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 8min+ lOsec/cycle) 20cycles→4°Cで保持 [0246] 15. 8kb増幅の場合
92°C · 2min→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 15min) 10cycles→ (92°C • 10sec→55°C - 30sec→68°C - 15min+ lOsec/cycle) 20cycles→4°Cで保持 [0247] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー（G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0248] まとめ：
図 24に示すように、 、ずれのサイズの PCR反応にお!ヽても PCNA13の添カ卩により 反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。 [0249] 2. 2. 6 :KOD DNA Polymerase に対する PCNA13添カ卩効果
KOD DNA Polymerase (東洋紡社）は、超好熱始原菌 Thermococcus'koda karaensis KOD1株由来の DNA Polymeraseである。 Polymerase活性の他、 強い 3，→5，Exonuclease活性（Proofreading活性）を持っため、 Taq DNA Pol ymeraseより約 50倍の高い PCR Fidelityを示す。市販されている Pyrococcus属 由来を主とした他の高正確性 PCR用酵素は、伸長速度が遅いものが多いが、本酵 素は伸長速度が非常に速ぐ Taq DNA Polymeraseの約 2倍の伸長速度を有す る。そのため、正確性の高い PCRを短時間で行うことが可能である。
[0250] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー（10x PCR buffer 2M Tris
-HC1 pH8. 0, 60mM (NH ) SO , lOOmM KCl, l%TritonX— 100,
4 2 4
0. 01%BSAもしくは lOx PCR buffer # 2 ; 1. 2M Tris— HC1 pH8. 8, 6 OmM (NH ) SO , lOOmM KC1, l%TritonX— 100, 0. 01%BSA)を使
4 2 4
用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0251] [表 15] 表 15
Figure imgf000064_0001
1)増幅する鎖長に応じて Foreard Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8及び表 9を参照。
2) 10 X 添付 Buffer #1; 2 kb， #2; 8.4 kb, 15.8 kb
3) PCNA13の原液濃度； 100 ng/μΙ, Buffer; 25 mM TrisCI pH8.0,
50 mM NaCI, 50 %Glycerol
[0252] PCR反応プログラム: 2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 12sec) 30cycles→72°C · 3min→4°Cで保 持
[0253] 8. 4kb, 15. 8kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 2min) 30cycles→72°C · 3min→4°Cで保 持
[0254] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0255] まとめ：
図 25に示すように、いずれのサイズの PCR反応においても PCNA13の添カ卩により 反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。
[0256] 2. 2. 7 : Pwo DNA Polymerase に対する PCNA13添カ卩効果
Pwo DNA Polymerase (ロッシュ ·ダイァグノスティックス社）は、好熱性古細菌 P yrococcus .woesei株由来の DNA Polymeraseである。 Polymerase活性の他、 強い 3，→5，Exonuclease活性（Proofreading活性）を持っため、 Taq DNA Pol ymeraseより高い PCR Fidelityを示す。そのため、正確性の高い PCRを短時間で 行うことが可能である。
[0257] 評価に際しては、 PCNA13の添加を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨す る PCR反応液の組成とし、ノ ッファーとしては製品添付反応バッファー（10x PCR buffer ; 100mM Tris— HC1 pH8. 85, 50mM (NH ) SO , 250mM KC
4 2 4
1, 20mM MgSO )を使用した。以下に PCR反応液組成を示す。
4
[0258] [表 16] 表 1 6
Figure imgf000066_0001
1)増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを変える。プライマーの 組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/ /iし Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0259] PCR反応プログラム：
2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 30secもしくは lmin) 30cycles→72°C · 3m in→4。Cで保持
[0260] 8. 4kb増幅の場合
95°C · 2min→ (95°C · 30sec→60°C · 30sec→72°C · 2minもしくは 4min) 30cycl es→72°C .3min→4°Cで保持
[0261] 電気泳動：
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して X10ローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0262] まとめ：
図 26〖こ示すよう〖こ、いずれのサイズの PCR反応、伸長時間においても PCNA13 の添加により反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。
[0263] 以上の実施例に示したように， PCNA13は代表的な市販の 7種の PCR用 DNAポ リメラーゼに対して優れた伸長促進活性を発揮することが証明された。また，使用した PCNA13は， Pyrococcus furiosus由来の PCNAの変異改良体である力 Pyroc occus furiosus由来の DNAポリメラーゼだけでなく，菌種の異なる DNAポリメラー ゼに対しても有効であることが示された。
[0264] 3 :KOD— PCNA.RFCタンパク質の調製
Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来の PCNA変異体タンパク質標 品と RFCタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子を大量発現させ、発現菌体よ りタンパク質を精製することにより調製した。
[0265] 3. 1 :菌体入手 'ゲノム DN A調製
Thermococcus kodakaraensis KOD1株 ¾JCM (JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS)より lOmLの培養液として入手した (JCM NO. 12 , 380)。この培養液を 6, OOOxg, 15min, 4°Cで遠心し菌体を回収した。回収した 菌体は lmLの TBSバッファー（50mM Tris— HC1 pH7. 2, 150mM NaCl)に けん濁、洗浄し、 15, OOOxg, 5min, 4°Cの遠心操作にて回収した。
[0266] 沈殿物を 100 /z Lの溶菌バッファー（50mM Tris—HCl'pH8. 0, 50mM EDT Α·ρΗ8. 0, 0. 5% SDS)〖こ溶解し、 50°Cにて 3時間のインキュベーション反応を 行なった。その後、この反応液に 100 Lフエノール Zクロ口ホルム溶液を添カ卩した。 さらにこの溶液を 15, OOOxg, 5min,室温にて遠心分離操作を行い、上清約 100 Lを回収した。この上清溶液を Mag Extractor Genomeキット（東洋紡）を利用し、 同操作マニュアルに従 、ゲノム DNAを回収した。
[0267] 3. 2 :KOD— PCNAの調製
3. 2. l :KOD— PCNA遺伝子クロー-ング
KOD— PCNA遺伝子は、 Genbank ID BD182828 (配列番号 31および配列 番号 32)を参考とし、 PCRを利用したクローユング（図 27)によって獲得した。以下に 詳細を説明する。
[0268] 3. 2. 1. 1 : PCRプライマー
KOD— PCNA遺伝子の増幅用には、 KOD— PCNA— F、 KOD— PCNA— Rを 使用した。このプライマーセットは PCNA遺伝子の開始メチォニンから終止コドンに 相当する領域を増幅し、さらに 5'側に制限酵素 Ndel認識部位、制限酵素 Xhol認識 部位が付加するように設計されて!、る。それぞれのプライマーの配列は表 17 (配列 番号 33および 34)に示した。
[表 17]
表 1 7 KO D— P C NAクローニング用 P C Rプライマ一
Figure imgf000068_0001
[0270] 3. 2. 1. 2 : PCR反応液組成
PCR反応液は、次の組成で行った。（50 L反応液系への添加量）
铸型 DNA*: lOOng
プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq**: 1. 25U
lOxExTaqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*铸型 DNA: 3. 1で調製したゲノム DNA、 **EX Taq :タカラバィォ社製）
[0271] 3. 2. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0272] 3. 2. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 750bp付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0273] 3. 2. 1. 5 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 μ gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0274] 3. 2. 1. 6 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には KOD— PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5，端に制 限酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認 された。 KOD— PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミ ドベクターを pUC/KPCと命名することとした。
[0275] 3. 2. 2 :KOD—PCNA遺伝子発現プラスミド構築
pUCZKPCを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し PCNA遺伝子断片を調製した 。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 KOD— PCNAの発現ベクターを作製した。
[0276] 3. 2. 2. 1 : PCNA DNA断片調製
pUCZKPCを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0277] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0278] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断を行なった。反応 終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 KOD— PCNA遺伝子に相当する バンド（約 750bp付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら PCNA DNA断片の精製を行った。
[0279] 3. 2. 2. 2 :pET—21a発現ベクター
pET— 21aベクター DNA (米国ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと X hoiで二重切断した。 [0280] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0281] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0282] 3. 2. 2. 3 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た KOD—PCNA DNA断片（lOOng)と pET— 21a DNA断片（50ng )を DNA Ligation Kit V2 (タカラノィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0283] PCNA DNA断片： lOOng
pET- 21a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0284] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地（100 μ gZmLアンピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0285] 3. 2. 2. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記糸且換えプラスミドにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に KOD— PCNA遺伝子のオープンリーデイン グフレームが完全に挿入されて 、た。この KOD— PCNA遺伝子を保持するプラスミ ドを pKPCNAと呼ぶこととした（図 28)。
[0286] 図 28に示すように、 pKPCNAでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rbs (リボソーム結合部位）、 PCNA遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム）、 T7タ 一ミネ一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが PCNA遺伝子を大量 発現することが期待された。
[0287] 3. 2. 3 :KOD— PCNA遺伝子への変異導入
より高機能な PCNAを作製する目的で KOD— PCNAに対してアミノ酸置換を行な つた。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードする塩基を置換することにより行った。表 1
8に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。
[0288] [表 18]
表 1 8 K O D— P C N A変異導入部位
Figure imgf000071_0001
[0289] 3. 2. 3. 1 :置換変異導入
PCNA遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア（ 表 19、酉己列番号 35〜38)、 Quik Change II Site -Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社)を利用し、同操作マニュアルに従って行った。
[0290] [表 19]
表 1 9 K O D— P C N A変異導入用プライマー
Figure imgf000071_0002
[0291] 変異導入後にはシーケンシングにより DNA配列を確認し、目的部位に変異が導入 され、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各 PCNA変異体設計 について説明する。
[0292] KOD-PCNA01
Pyrococcus friosusの PCNAについての報告（非特許文献 6)によれば、野生型 の Pfu— PCNAを大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来 の開始 Metからの翻訳タンパク質以外に、 N末端が 73残基目力 翻訳が開始される 約 20kDaのタンパク質が副産物として生成され、 目的タンパク質生産の効率を落と すことが報告されて 、る。この約 20kDaのタンパク質は 73残基目の Metを Leuに 1 残基置換した場合、生成が抑えられ、作製された Pfu— PCNAは、野生型 PCNAタ ンパク質とかわらな 、性質を有して 、る事が併せて報告されて 、る。 KOD - PCNA と Pfu— PCNAはいずれも全長が 249アミノ酸残基で、完全一致するアミノ酸は 84. 3%、さらに性質が類似するアミノ酸を加味すると非常に高い相同性を有する。このよ うな状況を踏まえて、 KOD— PCNAについて 73残基目の Metを Leuに 1残基置換 した KOD— PCNAの M73Lの変異を準野生型として本明細書では取り扱う。
[0293] この KOD— M73Lの変異体を KOD— PCNA01と命名し、変異体を作製した。 K OD— PCNA01の作製は、铸型プラスミドを pKPCNAとし変異導入用オリゴペア (K OD— M73L— Fと KOD— M73L— R)を使用して行った（表 19参照、配列 35、配 列 36)。
[0294] KOD-PCNA13
Pyrococcus friosusの PCNAの場合、 143残基目のアミノ酸残基は単量体どうし が三量体を形成する際に、イオンペアネットワーク形成に関わる事が知られている（ 非特許文献 9)。我々のグループは、上記実施例 1〜2の通り、この位置のアミノ酸残 基の電気的性質を逆にかえた変異型 PCNAが DNA合成に際し DNAポリメラーゼ の反応を飛躍的に促進することを発見している。 Thermococcus kodakaraensis の場合、この位置に相当するアミノ酸は野生型ではグルタミン酸 (酸性アミノ酸)であ る力 これをアルギニン (塩基性アミノ酸)へ置換することによりこの部位のアミノ酸の 電気的な性質を全くかえる事が可能である。 DNA合成時に添加した場合の影響を 調べる目的でこの変異体を作製した。具体的には、 KOD— PCNA01産生プラスミド を铸型として、 KOD— E143R—Fと KOD— E143R—Rの変異導入用オリゴを使用 して作製した (表 19、配列 37、 38)。
[0295] 3. 2. 3. 2 :KOD— PCNA発現株の作製
以上のように取得した変異型 PCNA発現プラスミドベクターにより大腸菌 BL21 C odonPlus (DE3) RIL (ストラタジーン社)を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸 菌株を得た。
[0296] 3. 2. 4 :KOD— PCNAタンパク質精製
図 29に示すように、菌体を遠心回収し (S291)、菌体破砕 (超音波破砕、 S292)、 5分間煮沸し (S293)、ポリエチレンィミン沈澱を行い（S294)、さらに硫安沈澱を行 い（S295)、イオン交換クロマトグラフィー（S296、カラムとして HiTrap Qを使用）、 ゲルろ過クロマトグラフィー（S297、 Superdex 200を使用）という処理により標品を 調製した。 SDS— PAGEによる確認ではいずれの標品についても 90%以上の純度 を確保できている。
[0297] 3. 2. 4. 1 :菌体培養と KOD— PCNA発現誘導
各変異 PCNA発現株を 1. 5リットル LB培地（50 μ gZmLアンピシリン含有）にて、 37°Cで振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3-0. 5の時期に終濃度 0. 1
600
mMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopyranoside)を添カ卩して 発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の菌体は遠心分離 (4°C 、 6, 000xg、 6分）によって回収した。
[0298] 3. 2. 4. 2 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (50mM Tris—HCl pH 8. 0, 0. 1M NaCl、 0. ImM EDTA、 10% グリセローノレ、 0. 5mM DT T)によりけん濁した。超音波処理により菌体を破砕した。
[0299] 3. 2. 4. 3 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0300] 3. 2. 4. 4 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン（SIGMA P— 3143)と NaClをそれぞれ終濃度 0 . 2% (w/v) , 0. 58Mになるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠 心分離（18, 500 X g, 25分， 4°C)して，上清を回収した。
[0301] 3. 2. 4. 5 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を 80%飽和させた 50mM Tris- HCl (pH8. 5)ノ ッファー 80mLを添加して、遠心分離（30, 000 x g, 25分， 4 °C)により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファー C (50mM Tris-HCl pH8. 0 , 0. 1Μ NaCl)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して透析を行った。
[0302] 3. 2. 4. 6 :イオン交換クロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルは AKTAexplorer 10S (アマシャムバイオサイエンス社）を使 用して、イオン交換クロマトグラフィー（HiTrap Q；アマシャムバイオサイエンス社）を 実施した。溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、 流速は lmLZminとし、 KOD - PCNA01と KOD - PCNA13のピーク画分を得た
[0303] 3. 2. 4. 7 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Qイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれ Superdex 20 0 (アマシャムバイオサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに 精製し、以降のアツセィ用標品とした。
[0304] 得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび 良好に精製されたことが確認された（図 30)。
[0305] 3. 3 :KOD— RFCの調製
Thermococcus kodakaraensis KODの RFCは 2つのサブユニット RFCLと RF CSから構成されており、ゲノム上ではタンデムに位置している。 RFCタンンパク質標 品の調製にあたっては、 RFCLと RFCS遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同 一宿主内に各々の発現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プ ラスミドの作製にあたっては非特許文献 10を参照した。以下に詳細を示す。
[0306] 3. 3. l :KOD—RFCLの遺伝子クローユングと発現プラスミド構築（図 31)
KOD— RFCL遺伝子（Genbank ID ; 182, 830)は KODゲノムを铸型とした PC Rにより得た (配列番号 39)。
[0307] 3. 3. 1. 1 : PCRプライマー
PCR用プライマ一として、 KOD— RFCL Fプライマーと KOD— RFCL Rプライ マーを使用した (表 20 ;配列番号 40および 41)。クローユング操作の都合上、 KOD -RFCL - Fプライマーには制限酵素 Ndel認識部位、 KOD— RFCL— Rプライマ 一には制限酵素 Xhol認識部位をそれぞれ付加した。
[表 20]
表 2 0 K O D— R F C Lクローニング用プライマ一
Figure imgf000075_0001
[0309] 3. 3. 1. 2 : PCR反応液組成
PCRの铸型としては上記 3. 1で調製した KODゲノム DNAを使用した。 PCR反応は、次の組成で行った。（50 L反応系への添加量）
铸型 DNA; 100ng
プライマー；各 lOpmol
dNTP ;各 lOnmol
EX Taq*; l. 25U
10X EX Taqバッファー； 5 L
以上に滅菌蒸留水を添加して 50 μ Lとした。
( *タカラバィォ社製）
[0310] 3. 3. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0311] 3. 3. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 1. 5kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0312] 3. 3. 1. 5 : PCR産物のサブクローユング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0313] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0314] 3. 3. 1. 6 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には KOD—RFCL遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5，端に制 限酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認 された。このプラスミドを pUC118/KRFCLとした。
[0315] 3. 3. 1. 7 :KOD—RFCL発現プラスミド作製
PUC118ZKRFCLを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し RFCL遺伝子断片を調 製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 KOD— RFCLの発現ベクターを作製 した。
[0316] 3. 3. 1. 8 :RFCL DNA断片調製
pUC 118ZKRFCLを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0317] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0318] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間、制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 1%ァガロースゲル電気泳動を行った、 KOD—RFCL遺伝子に相当する バンド（約 1. 5kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら RFCL DNA断片の精製を行った。
[0319] 3. 3. 1. 9 :pET— 29a発現ベクター
pET— 29aベクター DNA (ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xho Iで二重切断した。
[0320] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0321] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 29aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 29a DNA断片の精製を行った。
[0322] 3. 3. 1. 10 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た KOD— RFCL DNA断片（lOOng)と pET— 29a DNA断片（50ng )を DNA Ligation Kit V2 (タカラノィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0323] RFCL DNA断片： lOOng
pET- 29a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0324] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（30 μ gZmLカナマイシン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地（30 μ gZmLカナマイシン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0325] 3. 3. 1. 11 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 29aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれ のプラスミド DNAについてもマルチクロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に KOD— RFCL遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム）が完全に挿入されていた。 K OD— RFCL遺伝子を保持するプラスミドを pKRFCLと呼ぶこととした（図 32)。 [0326] 図 32に示すように、 pKRFCLでは pET— 29aが保持する T7プロモーターから rbs (リボソーム結合部位）、 RFCL遺伝子のオープンリーディングフレーム、 T7ターミネ 一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが RFCL遺伝子を大量発現 することが期待された。
[0327] 3. 3. 2 :KOD—RFCSの遺伝子クローユングと発現プラスミド構築
非特許文献 10によれば、 KOD— RFCS遺伝子（Genebank ID : BD182, 829) は全長 2, 601塩基によってコードされ、インティンを 1個所保持し、 N端のェクスティ ンは 177塩基、 C端のェクスティンは 804塩基にコードされていることが報告されてい る（終始コドンは含まず)。配列表の配列番号 42に KOD—RFCSの塩基配列 (イン ティン部分を除去した成熟型配列)を示す。
[0328] 図 33に示したように RFCS発現ベクター作製にあたっては、まず、インティンを含む KOD—RFCS遺伝子の全長を PCR反応を利用してクローユングし（S331〜S334) 、その後、 2種のェクスティン断片を個別に PCR反応により増幅した後（S335〜336 )、インティンを除去し、 2種のェクスティンを結合した成熟型 RFCS (RFCSmとも呼 ぶ）を調製し、発現ベクターへ組み込んだ（S337〜S339)。
[0329] 3. 3. 2. 1 :インティンを含む RFCS遺伝子全長のクローユング
3. 3. 2. 1. 1 : PCRプライマー
PCRプライマーは KOD— RFCS— F、 KOD— RFCS— Rプライマー（表 21；配列 番号 43及び 44)を使用した。
[0330] [表 21] 表 2 1 K O D— R F C Sクローニング用プライマー
Figure imgf000078_0001
3. 3. 2. 1. 2 : PCR反応組成
PCRの铸型としては上記 3. 1で調製した KODゲノム DNAを使用した。
PCR反応液は、次の組成で行った。（50 L反応液系への添加量）
铸型 DNA: lOOng プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製）
[0332] 3. 3. 2. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0333] 3. 3. 2. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 2. 6kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0334] 3. 3. 2. 1. 5 : PCR産物のサブクローニング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート（100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0335] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地（100 μ gZmLアン ピシリン含有） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0336] 3. 3. 2. 1. 6：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分は RFCS遺伝子の 2種のェクスティンの塩基配列を完全に含んで 、た。このプ ラスミドを pUC/KRFCSとした。 [0337] 3. 3. 2. 2 :ェクスティン結合操作 (インティン除去操作）
3. 3. 2. 2. 1 :ェクスティン結合用プライマー
N端側ェクスティン用 PCRプライマーとして、 RFCS— Nde— Fプライマー、 RFCS —Exl—Rプライマー（表 22 ;配列番号 45及び 48)を準備した。また、 C端側ェクス ティン用 PCRプライマーとして、 RFCS— Ex2— Fプライマー、 RFCS— Sal—Rプラ イマ一（表 22；配列番号 47及び 46)を準備した。クローユングを容易にする目的で R FCS- Nde - Fプライマーには制限酵素 Ndel配列、 RFCS -Sal- Rプライマーに は制限酵素 Sail配列を 5'端に付加してある。また、 2種のェクスティン断片を PCR反 応により融合する際に利用する相補的な配列を RFCS— Exl—Rプライマーと RFC S— Ex2— Fプライマーに設けた。
[0338] [表 22] 表 2 2 K O D一 R F C sェクスティン結合用 (ィンテイン除去用） プライマ プライマ一名 プライマ一配列 5， -→3 配列番号
RFCS-Nde-F cca tat gtc cga gga agt gaa gga ag 45
RFCS-Sal-R gtc gac tea ctt acc cat aat cgt gaa ctg 46
RFCS - Ex2- F cgt egg gaa gac aac cgc tgc act ggc ttt ag 47
RFCS-Exl-R cag egg ttg tct tec cga cgc egg gtg gc 48
[0339] 3. 3. 2. 2. 2 : PCR反応液組成
2種のェクスティン増幅のための PCR反応は、次の組成で行った。（50 /z L反応液 系への添加量）
pUC/KRFCS DNA: 50ng
プライマー： 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製）
[0340] 3. 3. 2. 2. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0341] 3. 3. 2. 2. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った。 RFCS— Nde— Fプライマー、 RFCS— Exl— Rプライマーセットの PC R産物では約 180塩基のバンドが、 RFCS— Ex2— Fプライマー、 RFCS— Sal— R プライマーセットの PCR産物では約 800塩基のバンドが観察された。紫外線照射下 でそれぞれのバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用して同操作マニュアルに 従 、ゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0342] 3. 3. 2. 2. 5 : PCR融合反応
2種のェクスティン PCR産物を 1チューブ内で 1組のプライマーセットで PCR反応に 供する事で 2種の断片を融合し、成熟型 RFCSをコードする遺伝子断片を得た。以 下に詳細を示す。
[0343] 2種のェクスティン PCR産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
N端ェクスティン断片： 2 μ L· (50ng相当）
C端ェクスティン断片： 2 μ L· (50ng相当）
10x EX Taqバッファー： 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 44. 5 Lとした。
上記を 95°C · 3min加熱し、 37°Cまで 30分間でゆっくりと冷却した。
[0344] 上記反応液に以下を添加する
dNTP : 5 （各10 01)
EX Taq* : 0. 5 μ L· (2. 5U)
これを 72°C · lOmin反応させる。
(*タカラバィォ社製）
[0345] 上記に、 RFCS— Nde— Fプライマーと RFCS— Sal— Rプライマーを各 lOpmol添 加し、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · lminを 30サイクル繰り返すプログラム で PCR反応を行った。
[0346] 3. 3. 2. 2. 6 : PCR産物の制限酵素切断'精製 上記 PCR反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製した DNA断片 は制限酵素 Ndelと Sailで二重切断した。
PCR産物： 相当
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 2種のインティンの融合断片 (成 熟型 RFCSをコードする配列）と想定されるバンド (約 lkb付近)を切り出し、 GFX P CR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエンス社） を使用し精製した。
[0347] 3. 3. 2. 2. 7 : pET— 21a発現ベクターの制限酵素切断
pET— 21aベクター DNA (ノバジェン社）を以下の反応により制限酵素 Ndelと Sail で二重切断した。
[0348] プラスミド DNA : 2 μ &
10X制限酵素バッファー：
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
[0349] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1 %ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド（約 5. 4kb付近）を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット（アマシャムバイオサイエンス社）を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0350] 3. 3. 2. 2. 8：ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た 2種のインティンの融合断片 (成熟型 RFCSコード配列）と予測される約 lkbの DNA断片（lOOng)と pET—21a DNA断片（50ng)を DNA Ligation Ki t V2 (タカラバィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0351] lkbDNA断片： lOOng pET- 21a DNA断片： 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0352] このライゲーシヨン産物（3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地（100 μ gZmLアンピシリン） 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養 し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0353] 3. 3. 2. 2. 9：シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Sail部分に 2種のェクスティンが結合した (インティンを除 去した）成熟型の RFCSmの配列（984塩基）が確認された (pKRFCSmと命名）。
[0354] 図 34に示すように、 pKRFCSmでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rb s (リボソーム結合部位）、成熟型 RFCS遺伝子のオープンリーディングフレーム、 T7 ターミネータ一の順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが成熟型 RFCS遺伝 子を大量発現することが期待された。
[0355] 3. 3. 3 :KOD— RFC発現株の作製
pKRFCLと pKRFCSmで大腸菌 BL21— CodonPlus (DE3)— RILを同時に形 質転換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質 転換体を選択し発現株を得た。
[0356] 3. 3. 4 :KOD— RFCタンパク質精製
図 35に示すように、菌体を遠心回収し (S351)、菌体破砕 (超音波破砕、 S352)、 5分間煮沸し (S353)、ポリエチレンィミン沈澱を行い（S354)、さらに硫安沈澱を行 い（S355)、ァフィ-ティークロマトグラフィー（S356、カラムとして HiTrap Heparin HPを使用）、ゲルろ過クロマトグラフィー（S357、 Superdex 200を使用）という処 理により標品を調製した。 SDS— PAGEによる確認では!、ずれの標品につ 、ても 90 %以上の純度を確保できて!/ヽる。 [0357] 3. 3. 4. 1 :菌体培養と発現誘導
上記の発現株を 1. 5リットル LB培地（50 μ gZmLアンピシリンおよび 30 μ g/mL カナマイシン含有)， 37°Cにて振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3 -0.
600
5の時期に終濃度 0. ImMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopy ranoside)を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の 菌体は遠心分離 (4°C、 6, 000xg、 6分）によって回収した。
[0358] 3. 3. 4. 2 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (前出）によりけん濁した。こ れを超音波処理により菌体を破砕した。
[0359] 3. 3. 4. 3 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0360] 3. 3. 4. 4 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン（SIGMA P— 3143)を終濃度 0. 18% (wZv)に なるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠心分離（18, 500 X g, 25 分， 4°C)して，上清を回収した。
[0361] 3. 3. 4. 5 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離（18, 500xg, 4°C, 25分）により沈澱を 回収した後、この沈澱をバッファー C (前出）に溶解し、おなじくバッファー Cに対して 透析を行った。
[0362] 3. 3. 4. 6 :ァフィユティークロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルは HiTrap Heparin HPカラム（アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して精製した。
[0363] 溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、流速は 1 mLZminとし、ピーク画分を得た。
[0364] 3. 3. 4. 7 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Heparinァフィ-ティークロマトグラフィーでのピーク画分を Superdex 2 00 (前出）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アツセィ用の標 品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大き さおよび良好に精製されたことが確認された（図 36)。
[0365] 4 :KOD— PCNA変異体の評価
上記で調製した PCNA変異体の DNA増幅系への効果、とくに PCR反応系への効 果を調べた。具体的には PCR反応系に PCNA変異体、 RFCを単独もしくは併用し て添加した場合、未添加の場合で PCR反応を行い、その反応産物を電気泳動に供 して標的領域の増幅状態を比較することで行った。 PCR反応に使用するポリメラーゼ としては市販されている 2種の PCR用 DNAポリメラーセ、 KOD DNA Polymeras e (東洋紡社）、 Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社）を使用した。
[0366] 4. l :KOD DNA ポリメラーゼに対する KOD— PCNAの添カ卩効果
KOD DNAポリメラーゼは好熱性古細菌 Thermococcus kodakaraensis KO D— 1株由来の DNAポリメラーゼである。 KOD DNAポリメラーゼはポリメラーゼ活 性の他に、強い 3，→5，Exonuclease活性（Proofreading活性）を持つ、いわゆるァ ルファ型 DNAポリメラーゼである。 3'→5' Exonuclease活性を保持するため、一般 的に使用されている Taq DNA Polymeraseより高い PCR Fidelityを示す。また 、 Pyrococcus属由来を主とした他のアルファ型の高正確性 PCR用酵素は、伸長速 度が遅いものが多いが、本酵素は伸長速度が非常に速いことが報告されている (非 特許文献 11)。
[0367] 4. 1. 1 :铸型 DNAと反応プライマー
铸型 DNAとしてはラムダ DNA(GenBank accession 02459)を使用した。 PC R増幅の標的配列としてはラムダ DNAの 23, 119番より 25, 142番の配列とした。こ の時使用した PCRプライマー配列は表 8に記載してあるが、別途表 23に示した。
[0368] [表 23] 表 2 3 P C Rアツセィ用プライマー
プライマー名 プライマ一配列 5 ' →3 ' 配列番号
F02 GTC GTT TCT GCA AGC TTG GC 25
R03 CCG AGA TAA AAA CAA ACC CGC 28 [0369] 4. 1. 2 :反応液組成
反応液の組成を表 24及び 25に示した。
[0370] [表 24]
表 2 4
Figure imgf000086_0001
[0371] [表 25]
表 2 5
Figure imgf000086_0002
* Buffer : 25mM Tri s-HCl ρΗ8. 0, 50mM NaCl, 50% Glycerol
[0372] 4. 1. 3 : PCRプログラム
上記反応液を以下の PCRプログラムにて反応させた。
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 15sec) 30cycles→4°Cで保持 [0373] 4. 1. 4 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 50 L反応液のうち 10 Lを 1%ァガロースゲル電気泳動に供し た。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、 図 37に示す。
[0374] 4. 1. 5 :結果
結果を図 37に示した。この実験条件では KOD DNAポリメラーゼのみでも良好な 伸長増幅が確認できる（レーン 1)。準野生型 KOD— PCNA01を添加した場合に反 応阻害が観察されるが（レーン 2) , RFCの添加量を増加すると阻害が回復し未添カロ の場合と同程度の伸長増幅が観察される（レーン 3、 4)。一方、 KOD—PCNA13を 添カ卩した場合、 KOD— RFCの添カ卩に依存しない良好な伸長増幅が観察され、この 効果はし力もアクセサリー蛋白質未添カ卩の場合や KOD— PCNA01に KOD— RFC を添加した場合よりすぐれて 、た。
[0375] 4. 2 : Pyrobest DNA ポリメラーゼに対する KOD— PCNAの添カ卩効果
Pyrococcus属由来の DNA合成酵素として市販されている Pyrobest DNA Pol ymerase (タカラバイオ社)を対象として各種 PCNA変異体の添加効果を PCR反応 の系を禾 IJ用して調べた。 Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp.由来 の 3，→5， exonuclease活性（proof reading活性）を有する而熱性 a型 DNAポリ メラーゼである。 Pyrococcus 'furiosus由来の Pfu DNAポリメラーゼゃ、 Vent D NAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。
[0376] 4. 2. 1 :铸型 DNAと反応プライマー
上記 KOD DNAポリメラーゼの評価と同様の铸型 DNA、プライマーを使用した。
[0377] 4. 2. 2 :反応液組成
反応液の組成を表 26及び 27に示した。
[表 26] 表 2 6
Figure imgf000088_0001
[0378] [表 27]
表 2 7
Figure imgf000088_0002
*Buffer : 25mM Tris-HCl ρΗ8. 0, 50m NaCl, 50% Glycerol
[0379] 4. 2. 3 : PCRプログラム
上記反応液を以下の PCRプログラムにて反応さた。
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 1. 5min) 30cycles→4°Cで保持。
[0380] 4. 2. 4 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー（G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 50 L反応液のうち 10 Lを 1%ァガロースゲル電気泳動に供し た。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、 図 38に示す。 [0381] 4. 2. 5 :結果
結果を図 38に示した。この実験条件では Pyrobest DNAポリメラーゼのみでも伸 長増幅が確認できる（レーン 1)。準野生型 KOD— PCNA01を添加した場合に反応 阻害が観察されバンドが確認できないが（レーン 2) , RFCの添加量を増加すると阻 害が回復し未添加の場合と同程度の伸長増幅が観察される（レーン 3、 4)。一方、 K OD - PCNA13を添カ卩した場合は、 KOD—RFC未添カ卩時でも良好な伸長増幅が 観察され、この効果は他の 4種の条件よりも優れた伸長増幅を示した (レーン 5)。
[0382] 4. 3 :まとめ
上述の実験より KOD— PCNA13は代表的な 2種の PCR酵素に対して PCR反応 を促進する事が分かった。またこの反応は RFCを必要としないだけでなぐ野生型と RFCを同時添加した場合よりも促進活性が優れていた。以上の結果から， Pyrococ cus furiosus由来の Pし NA7こ . "な \, Tnermococcus kodakaraensis KOD 1株由来の PCNAでも同様の変異導入により優れた効果が得られることが証明され た。本発明の PCNA単量体の界面領域のアミノ酸残基の特定は， Pyrococcus fur iosus由来の PCNAにだけ限定して有効なものではなく，同様の構造的背景を持つ PCNAに応用できる発明であることが示された。
[0383] 5. Pfu— PCNA13添加反応時の忠実性測定
Pfu— PCNA13を PCR反応に添加した際の铸型忠実性に与える影響について、 市販の高忠実度型 PCR酵素である Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社 製、以下、単に「Pyrobest」と略記することがある。）を対象として検討した。 Pyrobes tは Pyrococcus属古細菌由来の DNAポリメラーゼで、 3，→5，ェキソヌクレアーゼ活 性を持ち、これがプルーフリーディング活性として機能して 、る。
[0384] 忠実性は PCR産物のシーケンスを調べ、铸型シーケンスと比較することにより求め た。概略を図 39に示した。まず、 Pyrobest単独もしくは Pfu— PCNA13を添カ卩して PCR反応を行 、（S 511)、増幅された DNA断片の末端を平滑ィ匕 ·リン酸ィ匕し (S512 )、この断片をプラスミドベクターにクローユングし (S513) ,大腸菌に導入しコロニー を単離、プラスミドを抽出する（S514, S515) 0各プラスミドの挿入配列の一部（500 bp)を DNAシーケンサーで調べ（S 516)、結果を铸型シーケンスと比較し、エラー発 生頻度を調べた (S517)。
[0385] 5. 1 : PCR反応
5. 1. 1 : PCR酵素と Pfu— PCNA13の組合せ
Pyrobest単独で PCR反応を実施した場合と Pyrobestに Pfu— PCNA13を添カロ して PCR反応を実施した場合について調査した。これらに対する対照の目的で TaK aRa Taq (タカラバイオ社製、以下、単に「Taq」と略記することがある。）単独での P CR反応についても調査した。 Taqは一般的に利用される Poll型の PCR酵素である 1S 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を持たず、同活性を保持するひ型 PCR酵素と比 較して忠実性は低 、とされて 、る。
[0386] 5. 1. 2 :铸型 '標的領域
PCR反応の铸型として、ラムダ DNA(Genbank accession 02459)を用い、 7 種の領域を調査対象とした。各領域のラムダ DNA上の位置、サイズ、各領域を増幅 するために用いたプライマーの組み合わせを表 28に、また各プライマー配列は表 29 に示した。
[0387] [表 28]
表 28
Figure imgf000090_0001
[0388] [表 29] 表 29
Figure imgf000091_0001
[0389] 5. 1.3: PCR反応液組成
PCR反応液は一般的な PCR反応液組成とした (表 30)。 PCR酵素として Pyrobest を使用する際には、添付バッファーである lOxPyrobest buffer II (組成未公表） を、 TaKaRa Taqを使用する際には添付バッファーである lOxPCR Buffer (100 mM Tris-Cl(pH8.3), 500mM KC1, 15mM MgCl )を使用した。 Pfu— PC
2
NA13添カ卩時の終濃度は 0.6ngZwL(0.3/zL)とし、未添加の場合は滅菌水を 同体積 (0.3 /zL)添カ卩した。
[0390] [表 30]
表 30
Figure imgf000092_0001
1 ) 10x Buffer ; 10xPyrobest buf ferll (Pyrobest DNA polymearase使用時）、もし <は lOx PCR Buffer (TaKaRa Taq使用時）
2) PCNA13の原液;農度； 100ng/pL
[0391] 5. 1. 4 : PCRプログラム
Pyrobest単独の場合
(98°C · 10sec→68°C · 2. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
Pyrobest + Pfu - PCNA13の場合
(98°C · 10sec→68°C · 1. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
Taq単独の場合
(94°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · 1. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
[0392] 5. 2 : PCR産物の末端平滑化反応'精製
上記 PCR反応により得られた各 PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供しェ チジゥムブロマイド染色を行った後、 目的サイズの DNA断片を含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット（アマシャムバイオサイエ ンス社)を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の DNA断片の精製を行った。精 製した DNA断片は TaKaRa BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit) ( タカラバィォ社製)を利用し、同キットマ-ユアルに従い、末端平滑化'リン酸化反応 に供した。
[0393] 5. 3 : PCR産物のクロー-ングベクターへの挿入
末端平滑化 ·リン酸化処理した DNA断片 (50ng)と制限酵素 Hindi切断 BAP処 理済み DNA(pUC118 Hinc Π/ΒΑΡ·タカラバィォ社製）（50ng)を以下の通り ライゲーシヨン反応に供した。
末端平滑化'リン酸化処理済 DNA断片： 50ng
PUC118 Hinc II/BAP : 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液： 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 60分間反応した。
[0394] 5. 4 :大腸菌コロニー単離 ·プラスミド抽出
上記ライゲーシヨン産物（3 L)により 100 L大腸菌 E. coli JM109 (タカラバィ ォ社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート（100 g/mLアンピシリン、 IPTG 、 X— GAL各 40 μ g/mL含有）上に播種し、 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレー ト上の白色を呈する大腸菌コロニーを TB液体培地（100 μ g/mLアンピシリン含有） 1. 5mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0395] 5. 5 :挿入配列のシーケンス
抽出したプラスミドを铸型とし， DNAシーケンサーを使用して DNA配列を解析した
[0396] 挿入された DNA断片（PCR増幅断片）のうちの 500bpの配列を解析対象とした。
[0397] 5. 6 :オリジナル配列と比較
結果を表 31に示した。表中の各用語は以下の通りである。
「フラグメント 」； PCR反応標的領域の識別番号。
「Enzyme, APJ； PCR反応時の酵素と Pfu—PCNA13の組合せ。
「ラムダ DNA Position ; 7種の PCR増幅断片のうち解析対象となった塩基配列 の位置を示す。
「Sample」；シークェンス解析対象となったプラスミド数 (すなわち、 PCR増幅断片 数)を表す。
「Base」；シークェンス解析の対象となった塩基数。
「ND」；シークェンシングデータのノイズ等で解読不可能であった塩基数。 「A11」；「ND」以外の解読可能であった総塩基数。
「Error」；総塩基数のうち複製エラーが確認された塩基数。
「Error rates]；解読できた総塩基数「 All」に対する、複製エラーが確認された塩 基数「Error」の割合,
[0398] [表 31] 表 31
Figure imgf000094_0001
Error rates (1 /base) 1/73,975 1/48.870 1/2,240
[0399] Pyrobest単独の場合、 592サンプルを解析したところ、総計 295, 901basesに対 して複製エラーは 4basesと!、う結果（Error ratesは 74kbあたり lbase)が得られた 。 Pyrobestに Pfu— PCNA13を添カ卩した場合， 489サンプルを解析したところ、総 計 244,351basesに対して複製エラーは 5basesという結果が得られた（Error rate sは 49kbあたり lbase)。Taqの場合， 538サンプルを解析したところ，総計 268,856 basesに対して複製エラーは 120basesという結果（Error ratesは 2. 2kbに lbase) が得られた。
[0400] 上記の 3種の試験群で比較すると， Taqに比べて， Pyrobest単独、 Pyrobest+PC NA13添カ卩の 2種は Error ratesが 1桁低ぐ両グループ間の複製忠実度に明確な 差があることが観察された。
[0401] 一方，後者の 2種の反応（Pyrobest単独と Pyrobest + PCNA13添加）の間での 比較に関しては， Error ratesに 1. 5倍の差はあるものの，複製エラー数が 4 (Pyro best単独）と 5 (Pyrobest + PCNA13添加）であり，有意な差は検出されなかった。 このデータからは， PCNA13の添カ卩により忠実度に明確な差が生じるかは不明だが ，その差は小さく，少なくとも極端に悪ィ匕することはないと考えられる。図 14から図 16 の実施例に示すとおり，高忠実度型 PCR酵素である Pyrobestの伸長能を飛躍的に 向上させる一方で，忠実度面でも Pol I型 PCR酵素である Taqよりもはるかに良いレ ベルを維持して 、ることは確かであり，本発明の PCNAの優秀性が証明された。 産業上の利用可能性
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特に DNA合成に関 わる技術関連において有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号 1 : Pfu-PCNA
配列番号 2 : Pfu-PCNA
配列番号 3 : primer： Pfu-PCNA-F
配列番号 4 : Primer： Pfu-PCNA-R
配列番号 5 : primer： Pfu_M73L-F
配列番号 6 : primer： Pfu_M73L-R
配列番号 7 : primer： Pfu— D143A— F
配列番号 8 : primer： Pfu— D143A— R
配列番号 9 : primer： Pfu_R82C-F
配列番号 10 primer： Pfu_R82C-R
配列番号 11 primer： Pfu— D143R— F
配列番号 12 primer： Pfu— D143R— R
配列番号 13 Pfu-RFCL
配列番号 14 Pfu-RFCL
配列番号 15 primer： RFCL― F primer
配列番号 16 primer- RFCL— R primer
配列番号 17 Pfu-RFCS
配列番号 18 Pfu-RFCS
配列番号 19 primer RFCS -F primer
配列番号 20 primer RFCS -R primer
配列番号 21 ： primer RFCSF1 primer
配列番号 22 ： primer RFCSF2 primer
配列番号 23 ： primer RFCSR2 primer 配列番号 24: primer： RFCSR1 primer 配列番号 25: primer： F02
配列番号 26: primer： Fll
配列番号 27: primer： F24
配列番号 28: primer： R03
配列番号 29: primer： R14
配列番号 30: primer： R16
配列番号 31: KOD- PCNA
配列番号 32: KOD- PCNA
配列番号 33: primer： KOD— PCNA- -F 配列番号 34: primer KOD— PCNA- -R 配列番号 35: primer KOD— _M73L- -F 配列番号 36: primer KOD— _M73L- -R 配列番号 37: primer KOD— — E143R F 配列番号 38: primer KOD— — E143R R 配列番号 39: KOD— RFCL
配列番号 40: primer KOD- RFCL- -F 配列番号 41: primer KOD- RFCL- -R 配列番号 42: KOD— RFCS
配列番号 43: primer ： KOD- RFCS- -F 配列番号 44: primer ： KOD- - RFCS- -R 配列番号 45: primer ： RFCS -Nde- F 配列番号 46: primer ： RFCS -Sal-R 配列番号 47: primer ： RFCS -Ex2- F 配列番号 48: primer ： RFCS — Exl— R 配列番号 49: primer F09
配列番号 50: primer F14
配列番号 51: primer F16 配列番号 52: primer F19
配列番号 53·. primer F23
配列番号 54: primer F25
配列番号 55: primer R04
配列番号 56: primer Rll
配列番号 57: primer R15
配列番号 58: primer R17
配列番号 59: primer R21
配列番号 60: primer R25
配列番号 61: primer R27
配列番号 62: primer： Pfu_一 D143K一 F 配列番号 63: primer： Pfu_一 D143K一 R 配列番号 64: primer： Pfu_一 D143H一 F 配列番号 65: primer Pfu_一 D143H一 R 配列番号 66: primer Pfu_一 R109E- - F 配列番号 67·. primer Pfu_一 R109E- -R 配列番号 68: primer Pfu_一 D147R一 F 配列番号 69: primer Pfu_一 D147R一 R 配列番号 70: primer ： Pfu_一 E139A一 F 配列番号 71: primer ： Pfu_一 E139A一 R 配列番号 72: primer ： Pfu_一 E139R一 F 配列番号 73: primer ： Pfu_一 E139R一 R

Claims

請求の範囲
[1] PCNAの単量体であって、
単量体の N末端側領域と他の単量体の C末端側領域とが界面となって多量体を形 成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部 位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、かつ、
単量体のまま又は多量体を形成して、 DNA複製を促進する活性を備える、変異型 PCNA単量体。
[2] 前記 PCNA単量体が、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列の場合における第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目力ら なる群より選ばれる少なくとも 1つの位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換えた アミノ酸配列を有し、
下記 (i)群から選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と、下記 (ii)群から選ばれ る 1つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される、請 求項 1に記載の変異型 PCNA単量体。
(i)第 82番目、第 84番目および第 109番目のアミノ酸残基群
(ii)第 139番目、第 143番目および第 147番目のアミノ酸残基群
[3] さらに、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 14 7番目以外の部位に、付加、挿入、置換、および欠失力もなる群より選ばれる 1または 数個のアミノ酸残基の変異を含む、請求項 2に記載の変異型 PCNA単量体。
[4] 配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 73番目のアミノ酸残基をロイ シンに換えた配列を有する、請求項 3に記載の変異型 PCNA単量体。
[5] 前記 (i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上アミノ酸と (ii)群力も選ばれる少なくとも 1 つ以上のアミノ酸とが、双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸である、 請求項 2から 4のいずれか 1項に記載の変異型 PCNA単量体。
[6] 配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 143番目のアミノ酸残基をァ ルギニンに換えた配列を有する、請求項 2から 5の 、ずれか 1項に記載の変異型 PC NA単量体。
[7] 請求項 1から 6の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体が備えるアミノ酸配列をコー ドするポリヌクレオチド。
[8] 請求項 7に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
[9] 請求項 8に記載の形質転換体を培地で培養し、当該形質転換体および Zまたは培 地中に、 PCNA単量体および Zまたは前記単量体で構成された多量体を蓄積させ ることを特徴とする、変異型 PCNAの製造方法。
[10] 請求項 1から 6の!、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記単量体 で構成された多量体を含む DNA複製用試薬。
[11] 請求項 10に記載の試薬を備えた、 DNA複製用キット。
[12] PCR用の試薬を備えた、請求項 11に記載の DNA複製用キット。
[13] 請求項 1から 6の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記単量体 で構成された多量体および DNAポリメラーゼの存在下で DNAの合成反応を行うこと を特徴とする、 DNAの複製方法。
[14] 前記 DNAの合成反応が PCRである、請求項 13に記載の DNAの複製方法。
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