明 細 書
変異型 PCNA
技術分野
[0001] 本発明は、 DNA複製因子に関し、より詳しくは、 DNA複製を補助する機能に優れ た PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen、増殖核抗原)に関する。 背景技術
[0002] 遺伝子増幅技術と PCR法
DNAや RNA等の核酸を増幅する技術は、遺伝子工学技術等の発展に伴い、基 礎研究力も産業利用まで広く浸透してきている。初期には、特定の標的核酸配列を 得るためには、酵母や大腸菌宿主内で増幅した核酸より、必要な配列を制限酵素で 切り出して調製する方法が一般的であつたが、マリスらの PCR法の開発と普及により 、標的とする特定の核酸領域を試験管内で増幅する事が可能となった。 PCR法は専 用装置や関連試薬の活発な商品化、販売と平行して、多様な研究上、産業上のアブ リケーシヨン開発が行われたため、実質的に遺伝子増幅技術のスタンタードとなった 。 DNA複製の研究が進むにつれ、 PCRとは原理を異とする種々の技術が考案-開 発されてはいるが、操作性 'コスト'品質上の観点から一般性は乏しく PCR法を一蹴 するほどの技術は登場して 、な 、。
[0003] PCR法の評価ポイント
PCR法の原理は細胞内での DNA複製を最小限に模倣した形と考えられる。つまり 、 1)標的となる核酸铸型の熱変性による解離、 2)標的配列と相補的な 1対のプライ マーとの対合、 3) DNAポリメラーゼによるプライマーの铸型相補的な伸長反応、で ある。これらの反応を連続的に繰り返すことにより、目的の核酸配列を指数関数的に 増幅する。一般的な PCRのプロトコルでは ngオーダーの铸型の数 kbの標的配列を 2時間程度の反応で μ gオーダーまで増幅する事が多 、。
[0004] PCR法には技術的制約があり、代表的には次の 4点が挙げられる。 1)铸型に対す る忠実性 (铸型に対応した正確な配列を増幅する性能)、 2)伸長性 (より長 、配列を 増幅する性能)、 3)標的配列の増幅効率、 4)反応特異性の 4点である。同時にこれ
らは PCR技術を評価するポイントとして取り上げられる事も多い。これらの制約を克服 することを目標に PCR用試薬 ·キットの開発が進められて ヽる。
[0005] PCRの改善
初期の PCR用 DNAポリメラーゼとしては好熱菌 Thermus'aquaticus由来の DN Aポリメラーゼ (Taq DNA ポリメラーゼ)が一般的であった (非特許文献 1)。本酵 素を基本として、その後、さまざまな PCR用酵素もしくは試薬'キットが開発、販売さ れている。これらは、上述の技術制約ポイントについて改良される事が多ぐこれらの 特徴をもつ試薬'キットが各メーカーより販売されている。以下に PCR法の改善の一 例を紹介する。
[0006] 铸型に対する忠実性を向上させる例としては、高忠実度型の DNAポリメラーゼを P CR法に使用することが一般的である。 Taq DNAポリメラーゼは、 5'→3 'ポリメラー ゼ活性のみを有し、 3,→5,ェキソヌクレアーゼ活性を保持しないタイプの Pol I型 D NAポリメラーゼである。これに対し、超好熱性古細菌 Pyrococcus'furiosus由来の DNAポリメラーゼは 5,→3,ポリメラーゼ活性と 3,→5,ェキソヌクレアーゼ活性の両 者を保持する α型 DNAポリメラーゼである。 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性は校正 活性として機能する。このため、この DNAポリメラーゼを PCR反応に使用した場合、 3,→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を保持しな 、Taqポリメラーゼと比較して増幅時の铸 型忠実度が飛躍的に向上する (非特許文献 2)。
[0007] このような DNAポリメラーゼのうち巿販化されている製品の例としては、 Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)、 Pfu DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社)、 KO D DNAポリメラーゼ(東洋紡社)、 Deep Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs (NEB)社)、 Vent DNAポリメラーゼ(NEB社)、 Pwo DNAポリメラーゼ (ロッシュ 'ダイァグノスティックス社)がある。
[0008] Barnsらは、校正機能を保持する α型 DNAポリメラーゼと校正機能を保持しな 、P ol I型 DNAポリメラーゼを適切な比率で混合して PCR反応に使用すると、伸長可能 な標的配列が長くなり、増幅効率も併せて向上する事を報告している (非特許文献 3 、特許文献 1)。このような混合型 DNAポリメラーゼで市販化されている製品例として は、 TaKaRa EX Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)、 Taq Plus Long (ス
トラタジーン社)などがある。
[0009] PCRの反応特異性の向上の一例としては、ホットスタート法が知られている。 PCR 反応の非特異性は、主に铸型 DNAにプライマーが非特異的にアニーリングする事 が原因で起こる事が多 、。これを防ぐには高温下で PCR反応液の完全な混合を行 なった直後に PCR反応を開始させるホットスタート法が効果的である。ホットスタート 法には、数通りの方法が報告されている力 現在の主流は、 DNAポリメラーゼと、そ の特異的抗体とで複合体を形成させて、低温条件では不活性型にしておき、ホットス タート時の高温条件ではじめて活性ィ匕させ、 PCR反応を行なうものである。この方法 で PCR反応の特異性が高まる事が報告されて 、る(特許文献 2)。このホットスタート 法に対応した製品も各遺伝子工学メーカーより販売され、一般的に利用されている。
[0010] 上述の PCR法の改善法はいずれも実用性があり製品化され、一般的に利用されて いるが、いずれも一長一短があり、前項に示した PCR法のすべての改善点を同時に 満たすものではない。例えば、高忠実度型の α型 DNAポリメラーゼは、 Pol I型 DN Aポリメラーゼと比較して伸長性に劣る事が多ぐまた、 α型と Pol I型 DNAポリメラ ーゼを混合する PCR法では、高忠実度型 DNAポリメラーゼの忠実度には及ばな ヽ 。すべてのポイントに優れた DNAポリメラーゼもしくは DNA増幅系が待望されて!、る
[0011] DNA複製過程
一般に DNA複製開始には、まず複製起点の二本鎖構造が解かれている必要があ る力 それには DNAヘリカーゼが必要である。解かれた DNAには、一本鎖 DNA結 合タンパク質が結合して一本鎖が安定ィ匕される。さらに、それぞれの鎖上にプライマ 一を合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子 Replication Factor C (R FC)がプライマーを認識して結合し、増殖核抗原 (PCNA)を DNA鎖上に誘導する 。 PCNAは DNAポリメラーゼを DNA鎖上に留めておくためのクランプの役目をする 。そして PCNAと複合した DNAポリメラーゼが新生鎖を合成する。連続合成では、そ のまま長い新生鎖が合成されるが、不連続合成のほうでは、各 Okazaki断片に付随 する RNAプライマーがヌクレアーゼで分解され、 DNA鎖に置きかえられた後 DNAリ ガーゼが断片間を結合し、一本の新生鎖が完成する (非特許文献 4および 5)。
[0012] Pfu— PCNAと RFC
Pyrococcus -furiosus PCNA (以下、「Pfu—PCNA」または「PfuPCNA」とも 表記する)は、分子量 28.0kDaで、 Pfu— PCNAは真核生物の PCNAと同様にホモ 三量体を形成し、ポリメラーゼと相互作用して機能する事が報告されている(非特許 文献 6)。一方、 Pyrococcus 'furiosus RFC (以下、「Pfu—RFC」または「PfuRF C」とも表記する)は、 RFCSと RFCLのサブユニット構造をとる。 Pfu— RFCSのォー プンリーディングフレームはインティンを 1力所コードし、成熟型 Pfu—RFCSの分子 量は 37. 4kDaである。 Pfu— RFCLの分子量は 55. 3kDaである。プライマーェクス テンション試験で Pfu— RFC、 Pfu— PCNAの添カ卩は Pfu DNAポリメラーゼの DN A伸長活性を著しく促進する事が報告されて ヽる (非特許文献 7)。
[0013] Pfu— PCNAの構造と性質
Pfu— PCNAは結晶構造解析が行われている(非特許文献 8)。それによれば、 Pf u— PCNA三量体は, 2つのサブユニットの anti— parallel j8 strand ( j8 IIと j8 D2 )間の主鎖の水素結合 (T108— K178, T110-E176, R112— E174)により形成 され、さらに、酸性'塩基性アミノ酸側鎖による分子間のイオン対ネットワークが三量 体構造の維持に関与している。さらに,そのイオン対ネットワークに関与する残基 (N 末端側領域の R82, K84, R109と C末端側領域の E139, D143, D147)のうち、 D143、 D147を、中性アミノ酸であるァラニンに置換した変異体 2種(PfuPCNA(D 143A)と PfuPCNA(D143AZD147A) )に関して調べた論文がある(非特許文献 9)。論文には, PfuPCNA(D143A)と PfuPCNA(D143AZD147A)がゲルろ過 で単量体の位置に溶出すること,結晶では三量体でなく V— shaped dimersとして 得られることのほ力,プライマーエクステンション試験における活性測定結果の記述 がある。それによると, PfuPCNA(D143AZD147A)は PCNA単独時, RFC併用 時のどちらの場合も DNA合成促進活性を示さないが, PfuPCNA(D143A)は RF Cの有無に関わらず DNA合成促進活性を示し,かつ PCNA単独時の場合には野 生型よりも優れた結果を示したとされている。
[0014] KOD— PCNAと RFC
KOD - PCNA (以下、「KOD - PCNAJまたは「KODPCNA」とも表記する)と
OD-RFC (以下「KOD— RFC」または「KODRFC」とも表記する)は Thermococc us -kodakaraensis KOD— 1株より得られる PCNAと RFCである。
[0015] KOD— PCNAについては非特許文献 12により報告されている。報告によれば K OD— PCNAは 249残基を有し、計算上の分子量は 28. 2kDaである。先に報告の ある Pfu— PCNAも 249残基を有し、両者のアミノ酸配列は 84. 3%がー致している 。また、 KOD— PCNAは Pfu— PCNAと同様に PCNAに特徴的な全ての保存領域 を保持しており、 KOD— PCNAの結晶構造解析は行なわれていないものの、 Pfu— PCNAとの高い相同性力 推測して Pfu— PCNA同様の形態でホモ三量体を形成 する可能性が高 、ことが記されて 、る。
[0016] KOD— RFCについては非特許文献 10により報告されている。報告によれば、 KO D— RFCは他の RFCと同様に RFCLと RFCSのサブユニット構造をとる。 RFCLは 分子量 57. 2kDaである。 RFCS遺伝子はオープンリーディングフレーム中にインテ インを 1力所コードし、成熟型 KOD—RFCSの分子量は 37. 2kDaである。
[0017] 上述の 2報は KOD— PCNA、 KOD— RFCを KOD— DNAポリメラーゼによる DN A合成系に添加した場合の効果に関しても報告して 、る。報告によればプライマー 伸長実験の場合は KOD - PCNAを単独添加もしくは KOD—RFCとの共存下で伸 長活性を促進し、 PCR反応系では KOD— PCNA添カ卩時には「Sensitivity」が向上 すると記されている。
[0018] 特許文献 1 :米国特許第 5, 436, 149号公報
特許文献 2 :米国特許第 5, 338, 671号公報
非特許文献 l : Saiki, R. K. , Gelfand, D. H. , Stoffel, S. , Scharf, S. J. , Hi guchi, R. , Horn, G. T. , Mullis, K. B. and Erlich, H. A. Science 239, 487-491 (1988)
非特許文献 2 : Cline, JC Braman, and HH Hogrefe Nucl. Acids Res.
24, 3546- 3551 (1996)
非特許文献 3 : Barnes, W. M Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2216- 2220 (19 94)
非特許文献 4:Waga, S. and Stillman, B. Annu. Rev. Biochem. 6
7, 721-751(1998)
非特許文献 5:Kornberg, A. and Baker, T. A. DNA replication , 2 nd ed. W. H. Freeman, New York. (1992)
非特許文献 6:Cann et al, J. Bacteriol, 181, 6591— 6599(1999) 非特許文献 7:Cann et al J. Bacteriol, 183, 2614-2623(2001) 非特許文献 8:Matsumiya et al. Protein Sci. , 10, 17— 23(2001) 非特許文献 9:Matsumiya et al. Protein Sci. 12, 823— 831(2003) 非特許文献 10:Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Nov ;6
7(11) :2373-2380(2003)
非特許文献 ll:Takagi et al. Appl Environ Microbiol. Nov;63(ll) :4 504-4510 (1997)
非特許文献 12:Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Oct ;66 (10) :2194-2200 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 上記のような状況の下、汎用性に優れ、使いやすい DNA増幅系を構築することを 課題とする。
課題を解決するための手段
[0020] 本発明者らは、上述の DNA複製過程で利用される諸因子 (以下、「アクセサリータ ンパク質」、「AP」とも表記する)と DNAポリメラーゼで細胞内 DNA複製系を試験管 内で再構築することにより、既存の PCR技術の欠点を克服する、新規な DNA増幅系 を作成することを試みて来た。とりわけ、 3 '→5 'ェキソヌクレア一ゼ活性を持ち、铸型 忠実度が高 、超好熱性古細菌 Pyrococcus 'furiosus由来の DNAポリメラーゼ、お よび細胞内 DNA複製系の諸因子 (アクセサリータンパク質)のうち、 DNAポリメラー ゼと直接的に相互作用する可能性の高い PCNAと RFCに着目し、鋭意研究を進め た。
[0021] その結果、一方の単量体の N末端側領域と他の単量体の C末端側領域とが界面と なって多量体を形成した場合に、界面領域にお 1、て単量体相互の分子間相互作用
を形成する部位のアミノ酸残基力 他方の単量体の界面領域内のアミノ酸残基と相 互に電荷的反発を生じるアミノ酸残基で構成されるように調製することにより、 RFCの 有無にほとんど依存せず、伸長性、忠実性のバランス良く DNAの伸長反応を促進し 得る作用を備えた PCNAが得られるという知見を得、本発明を完成させるに至った。 本発明は、以下の PCNA等を提供するものである。
〔1〕 PCNAの単量体であって、
単量体の N末端側領域と他の単量体の C末端側領域とが界面となって多量体を形 成した場合に、各単量体の界面領域で単量体相互の分子間相互作用を形成する部 位のアミノ酸残基が、電荷的に反発しあうアミノ酸残基で構成され、かつ、
単量体のまま又は多量体を形成して、 DNA複製を促進する活性を備える、変異型 PCNA単量体。
〔2〕前記 PCNA単量体が、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列の場合における 第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目か らなる群より選ばれる少なくとも 1つの位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に換え たアミノ酸配列を有し、
下記 (i)群から選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と、下記 (ii)群から選ばれ る 1つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基により構成される、上 記 [1]に記載の変異型 PCNA単量体。
(i)第 82番目、 84番目および第 109番目のアミノ酸残基群
(ii)第 139番目、第 143番目および第 147番目のアミノ酸残基群
〔3〕さらに、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 1 47番目以外の部位に、付加、挿入、置換、および欠失力もなる群より選ばれる 1また は数個のアミノ酸残基の変異を含む、上記〔2〕に記載の変異型 PCNA単量体。 〔4〕配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 73番目のアミノ酸残基を ロイシンに換えた配列を有する、上記〔3〕に記載の変異型 PCNA単量体。
〔5〕前記 (i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上アミノ酸と (ii)群力 選ばれる少なくと も 1つ以上のアミノ酸とが、双方とも酸性アミノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸であ る、上記〔2〕から〔4〕の 、ずれか 1項に記載の変異型 PCNA単量体。
〔6〕配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列において、第 143番目のアミノ酸残基を アルギニンに換えた配列を有する、上記〔2〕から〔5〕の 、ずれか 1項に記載の変異型 PCNA単量体。
〔7〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体が備えるアミノ酸配列 をコードするポリヌクレオチド。
〔8〕上記〔7〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
〔9〕上記〔8〕に記載の形質転換体を培地で培養し、当該形質転換体および Zまたは 培地中に、 PCNA単量体および Zまたは前記単量体で構成された多量体を蓄積さ せることを特徴とする、変異型 PCNAの製造方法。
〔10〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記 単量体で構成された多量体を含む DNA複製用試薬。
〔11〕上記〔10〕に記載の試薬を備えた、 DNA複製用キット。
〔12〕PCR用の試薬を備えた、上記〔11〕に記載の DNA複製用キット。
〔13〕上記〔1〕から〔6〕の 、ずれか一項に記載の PCNA単量体および Zまたは前記 単量体で構成された多量体および DNAポリメラーゼの存在下で DNAの合成反応を 行うことを特徴とする、 DNAの複製方法。
〔14〕前記 DNAの合成が PCRである、上記〔13〕に記載の DNAの複製方法。
[0023] 本発明は, DNA複製反応をより促進し得るように, PCNA単量体の界面領域のァ ミノ酸配列を特定したものである。本発明の PCNAは,菌主の異なる多数の DNAポ リメラーゼにも適用性があり,汎用性が高い。また,本発明の PCNAは, RFCを併用 しな 、場合でも優れた DNA伸長促進活性を発揮する点にぉ 、て,従来に比し極め て特異な性能を発揮し得るものである。
発明の効果
[0024] 本発明により、 DNAの伸長反応を促進する、汎用性の高!ヽ DNA複製促進因子が 提供される。本発明により、伸長性および反応速度などの諸特性に優れた DNAの伸 長反応を行い得る。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]図 1は、 PCNAの三量体を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、 PCNA単量体が多量体を形成する場合に、単量体どうしの接合部とな る界面領域において形成される単量体相互の分子間相互作用部位の一例を示す図 である。
[図 3]図 3は、 PCNA、 RFC遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 4]図 4は、 PCNA遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 5]図 5は、 PCNA (タンパク質)の調製フローを示す図である。
[図 6]図 6は、 PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す 図である。
[図 7]図 7は、 RFCL発現プラスミドを示す図である。
[図 8]図 8は、 RFCSm発現プラスミドを示す図である。
[図 9]図 9は、 RFC (タンパク質)の調製フローを示す図である。
[図 10]図 10は、 RFC標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
[図 11]図 11は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果(2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 12]図 12は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果(8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 13]図 13は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果(15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
[図 14]図 14は、増幅長 2kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添加効果 を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 15]図 15は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添カロ 効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 16]図 16は、増幅長 15. 8kbの場合における、 Pyrobestに対する PCNA13添カロ 効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 17]図 17は、増幅長 2kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添加効果を 、伸長時間ごとに示す図である。
[図 18]図 18は、増幅長 8. 4kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添カロ効 果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 19]図 19は、増幅長 15. 8kbの場合における、 ExTaqに対する PCNA13添カロ効 果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 20]図 20は、増幅長 2kbの場合における、 Vent DNA Polymeraseに対する P CNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 21]図 21は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Vent DNA Polymeraseに対す る PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 22]図 22は、増幅長 2kbの場合における、 Deep Vent DNA Polymeraseに 対する PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 23]図 23は、増幅長 8. 4kbの場合における、 Deep Vent DNA Polymerase に対する PCNA13添加効果を、伸長時間ごとに示す図である。
[図 24]図 24は、 Pfu Turbo DNA Polymeraseに対する PCNAl 3添カ卩効果を示 す図である。
[図 25]図 25は、 KOD DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果を示す図 である。
[図 26]図 26は、 Pwo DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果を示す図で ある。
[図 27]図 27は、 KOD PCNA遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 28]図 28は、 KOD— PCNA遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 29]図 29は、 KOD PCNAタンパク質の調製フローを示す図である。
[図 30]図 30は、 KOD— PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の 結果を示す図である。
[図 31]図 31は、 KOD—RFCL遺伝子発現ベクターの調製フローを示す図である。
[図 32]図 32は、 KOD—RFCL遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 33]図 33は、 KOD—RFCSm (成熟型 RFCS)遺伝子発現ベクターの調製フロー を示す図である。
[図 34]図 34は、 KOD—RFCS遺伝子発現プラスミドを示す図である。
[図 35]図 35は、 KOD— RFCタンパク質の調製フローを示す図である。
[図 36]図 36は、 KOD— RFCタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果を示す図である。
[図 37]図 37は、 KOD DNAポリメラーゼに対する KOD— PCNA変異体及び KOD —RFC添加効果を示す図である。
[図 38]図 38は、 Pyrobestに対する KOD— PCN A変異体及び KOD— RFC添カロ効 果を示す図である。
[図 39]図 39は、 PCR铸型忠実性の測定フローを示す図である。
[図 40]図 40は、 PCNAタンパク質標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示 す図である。
[図 41]図 41は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果(2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 42]図 42は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果(8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 43]図 43は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添加効果(15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
[図 44]図 44は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果(2kb 増幅の場合)を示す図である。
[図 45]図 45は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果(8. 4k b増幅の場合)を示す図である。
[図 46]図 46は、 Pyrobestに対する各種 PCNA変異体及び RFCの添カ卩効果(15. 8 kb増幅の場合)を示す図である。
符号の説明
1 : PCNA三量体
10a、 10b、 10c : PCNA単量体
20: PCNA単量体どうしの接合部
PCNA gene : PCNA遺伝子 ORF
T7promoter: T7フ—ロモ ~~タ' ~~
rbs :リボソーム結合部位
T7terminator: T7ターミネータ一
Amp:アンピシリン耐性遺伝子
Ori:複製起点
RFCL gene :RFCL遺伝子 ORF
RFCSm gene:成熟型 RFCS遺伝子 ORF
Kan:カナマイシン耐性遺伝子
発明を実施するための最良の形態
[0027] 以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発 明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例 えば、 Molecular Cloning : A LABORATORY MANUAL, 第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, New York (2001)、新遺伝子工学ハンドブック (村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第 3 版、 1999年)、タンパク質実験の進め方(岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 1版、 19 98年)、タンパク質実験ノート(岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 2版、 1999年)、タ ンパク質実験ハンドブック (竹縛忠臣編集、実験医学別冊、初版、 2003年 8月 15日) 、 PCR実験ノート (谷ロ武俊編集、羊土社、第 1版、 1997年)などの種々の実験マ二 ュアルの記載が参照される。
[0028] 本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子につい ては、アルファベット表記による簡略ィ匕した記号を用いる場合があるが、いずれも分 子生物学 ·遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、ァミノ 酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「D143A」などの表記を用いる。「D143A 」は、第 143番目のァスパラギン酸をァラニンに置換したことを示しており、すなわち、 置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している 。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。
[0029] 1.本発明の PCNA
本発明の PCNA単量体は、多量体形成に寄与する界面領域内における所定位置 のアミノ酸残基を特定したものである。すなわち、本発明の PCNA単量体は、界面領 域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に反発しあうよう なアミノ酸残基で構成される。ここで「分子間相互作用」とは、分子間に生じる物理的
、化学的、あるいは電気的な相互作用のことであり、例えば、立体配座'立体構造な どの分子の構造に起因する作用、並びにイオン結合、水素結合、疎水性相互作用な ど種々の分子間作用が含まれる。 PCNA単量体が多量体を形成する場合、単量体 相互の界面領域が引き合うもしくは接合するなどの分子間相互作用によって、多量 体が形成される。一つの好ましい形態としては、分子間イオン対、もしくはイオン対ネ ットワークを形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構 成される。そして、本発明の PCNA単量体は、単量体のまま又は多量体を形成して、 DNA複製を促進する活性を備える。なお、本明細書において「変異型 PCNA」とい う場合の「変異型」とは、従来知られた PCNAとは異なるアミノ酸配列を備えることを 意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するも のではない。
[0030] DNAの複製反応に関与する因子の一つである PCNAの多量体は、一方の単量 体の N末端側領域と他方の単量体の C末端側領域とが界面となって接合し形成され る。なお、本明細書において、 N末端側領域とはタンパク質を一本の鎖として見たとき にその中央より N末端よりの部位を意味し、 C末端側領域とは中央より C末端よりの部 位を意味する。真核細胞および古細菌において、多くの場合 PCNAは三量体を形 成する。図 1に PCNA三量体のモデルを図示した。図 1に示すように、 PCNA単量体 10a、 10b、 10cが各末端領域において他の単量体と接合し、環構造上の多量体 1 を形成する。接合部 20は各単量体の末端領域が界面となり、その内部に単量体を 結びつける分子間相互作用が形成される。図 2に、 Pyrococcus 'furiosus PCNA の分子間相互作用のモデル図を示す。図 2では、配列番号 2に記載のアミノ酸配列( 野生型 Pfu— PCNAのアミノ酸配列)を有する PCNAについて説明する。一方の単 量体 10aの N末端側領域内に含まれるアミノ酸残基と、他方の単量体 10cの C末端 側領域内とに含まれるアミノ酸残基とが分子間対を形成する。図 2に示すように、配 列番号 2に記載のアミノ酸配列における、 139番目、第 143番目および第 147番目 のアミノ酸残基群と、第 82番目、第 84番目、第 109番目のアミノ酸残基群とが、相互 に影響しあうネットワークを形成すると考えられる。
[0031] これに対し、本発明では、分子間相互作用を生じる部位のアミノ酸残基の少なくとも
一部が、積極的に相互に反発しあうように構成される。ここでいう「電荷的に反発しあ う」とは、界面領域に含まれるアミノ酸残基の有する電荷によって反発しあうことを ヽぅ 。したがって、そのような組み合わせとしては、界面に含まれるアミノ酸残基が、双方と もプラスにチャージして ヽる分子で構成される場合、双方ともマイナスにチャージする 分子で構成される場合が含まれる。より具体的には、アミノ酸残基が双方とも酸性アミ ノ酸、または双方とも塩基性アミノ酸により構成されることが好ましい。酸性アミノ酸とし ては、例えばァスパラギン酸 (略号: Aspまたは D)、グルタミン酸 (略号: Gluまたは E) などが挙げられる。また塩基性アミノ酸としては例えばリシン (略号: Lysまたは K)、ァ ルギニン(略号: Argまたは R)、ヒスチジン(略号: Hisまたは H)などが挙げられる。
[0032] したがって、例えば、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列を有する PCNAをべ ースとした場合、本発明の PCNAを得るには、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸 配列において、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目およ び第 147番目力もなる群より選ばれる少なくとも 1つの位置のアミノ酸残基が変更され る。本発明の好ましい形態としては、下記 (i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上のアミ ノ酸残基と、下記 (ii)群力も選ばれる 1つ以上のアミノ酸残基とが、相互に電荷的に 反発しあうアミノ酸残基により構成される形態が例示される。
(i)第 82番目、 84番目および第 109番目のアミノ酸残基群
(ii)第 139番目、第 143番目および第 147番目のアミノ酸残基群
より具体的には、前記 (i)力 選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と、前記 (ii )カゝら選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基との組み合わせ力 双方とも酸性アミノ酸 どうしの組み合わせである力 双方とも塩基性アミノ酸の組み合わせであることが好適 である。すなわち、(i)群および (ii)群の各群力も少なくとも 1つ選ばれるアミノ酸残基 力 双方共にァスパラギン酸、およびグルタミン酸力 なる群より選ばれる酸性アミノ 酸である形態、および (i)群および (ii)群の各群力 少なくとも 1つ選ばれるアミノ酸 残基が、リシン、アルギニンおよびヒスチジン力もなる群より選ばれる塩基性アミノ酸で ある形態などが好ましい例として挙げられる。
[0033] DNA複製を促進する活性 (DNA複製促進活性)は、元となる野生型の PCNAに 比べて DNA複製が促進されることを意味する。具体的には、配列番号 2又は 32に記
載のアミノ酸配列を有する PCNA単量体又はその多量体よりも DNA複製促進活性 が優れていることが、より好ましい。さらに他の具体的指標としては、下記実施例に示 した DNA複製の活性測定方法に従って伸長性、反応速度などを測定した場合に、 伸長性および反応速度では Taqポリメラーゼに比べ同程度から 10倍以上まで活性を 上昇させる DNA複製促進活性を備えることが好適である。
[0034] また、本発明の PCNAとしては、上記の変異を含むアミノ酸配列を有する PCNAと 実質的に同一の PCNAも含まれる。具体的には、本発明の PCNAとして、例えば、 上記のような好ましい DNA複製促進活性を有し、かつ、第 82番目、第 84番目、第 1 09番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目以外の部位に、本発明の効果 を阻害しない範囲において、付加、挿入、置換、および欠失力もなる群より選ばれる 1 または数個のアミノ酸残基の変異を含む変異型 PCNAが挙げられる。「数個」とは、 具体的には、 2〜50個、好ましくは 2〜30個、さらに好ましくは 2〜10個、特に好まし くは 2〜5個である。このようなタンパク質においても、配列番号 2又は 32に示すアミノ 酸配列における (i)群と (ii)群から選ばれる位置に対応するアミノ酸残基は、電荷的 に反発しあうように構成される。すなわち、(i)群および Zまたは (ϋ)群の位置に係る 所定のアミノ酸残基以外にぉ 、ても、その活性が著しく損なわれな 、範囲にお!、て 他の変異が許容される。そのような変異としては例えば、アミノ酸残基のいわゆる保存 的な置換も含まれ得る。なお、第 82番目、第 84番目、第 109番目、第 139番目、第 143番目および第 147番目以外の部位に、欠失、挿入、付加といった変異が導入さ れた場合、変異導入後のアミノ酸酸残基の番号は、変異導入前のアミノ酸残基の番 号とは異なることがあり得るが、多量体を形成する場合の界面内に位置し分子間相 互作用を及ぼしあう上記 (i)および (ii)に示す位置に相当する限りにおいて、番号が 前後しても本発明の PCNAに含まれる。上記変異型 PCNAのうち、特に、第 73番目 のアミノ酸残基をロイシンに代えた置換のみを含むもの、またはそれにカ卩えて他の変 異を含むものは、容易に調製及び精製することができるため好ましい。
[0035] 本発明の PCNAが DNAの複製反応を促進し得る作用 '機序は必ずしも明確では ないが,多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有す ることにより, DNAの複製反応の繰り返しが円滑に行われ,その結果, DNA複製反
応をより促進するということが推測される。従来 PCNAは,単量体どうしが堅固に接合 して多量体を形成することにより安定したクランプとしての役割を発揮し, DNA複製 促進因子として機能するとの考え方が主流であつたが,この点において本発明は従 来とは異なる知見を提供するものである。 RFCを併用しな 、場合の PCNAの活性に は,多量体の結合が堅固すぎるのは良くなく,特に PCRのような複製反応の繰り返し の際には,環構造が温度上昇時に解除されるように弱められていることにより,野生 型 PCNAの RFC併用時よりもさらに優れた促進活性を発揮するというものである。
[0036] 本発明の好ましい PCNAの具体例としては、配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸 配列において、第 143番目のアミノ酸残基をァスパラギン酸力もアルギニンに換えた 配列(D143R)を有する PCNA単量体が挙げられる。第 143番目のアミノ酸残基は( ii)群に属する。この場合、(i)群に属する第 82番目、第 84番目、第 109番目、のアミ ノ酸残基は順番にアルギニン、リシン、アルギニンであり、この分子間相互作用は、界 面領域が通常よりも相反しあう状態を形成し得る。本形態の PCNAは、下記実施例 に示されるように、 DNA複製反応の伸長性および反応速度などについてバランス良 く特に優れた補助作用を発揮する。
[0037] また、本発明は、上記本発明の PCNAをコードするポリヌクレオチドを提供する。塩 基配列はコドン表によりアミノ酸に演繹される力 コドンの縮合により 1つのアミノ酸配 列は複数の塩基配列種によりコードされ得る。例えば、配列番号 2又は 32に記載の アミノ酸配列は、例えば配列番号 1又は 31に記載の塩基配列によりコードされる。し たがって、本発明のポリヌクレオチドの一形態としては、下記(a)のポリヌクレオチドが 挙げられる。
(a)配列番号 2又は 32に記載のアミノ酸配列にぉ 、て (i)群力も選ばれる少なくとも 1 つ以上のアミノ酸残基と (ii)群から選ばれる 1つ以上のアミノ酸残基とが電荷的に反 発するようにアミノ酸残基が置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す るポリヌクレオチド
[0038] (a)のような塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号 1又は 31に記載の塩 基配列において、上記所定位置のアミノ酸残基が対応する部位の塩基配列を改変 することにより容易に作製可能である。また、アミノ酸の種類に基づく塩基配列の変換
はコドン表に基づき容易に変換可能である。なお、本明細書でいうポリヌクレオチドに は、 DNA、 RNAが含まれ、一本鎖であっても二本鎖であってもよぐさらに DNAお よび RNAのキメラ体、あるいは DNAおよび RNAのハイブリッド等が含まれる。
[0039] また、下記 (b)のようなポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含み得る。
(b)上記 (a)のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌ クレオチドとストリンジェントな条件下においてノ、イブリダィズし;
(i)群力も選ばれる少なくとも 1つ以上のアミノ酸残基と (ii)群力も選ばれる 1つ以上 のアミノ酸残基とが電荷的に反発しあうアミノ酸残基の組み合わせとなるアミノ酸配列 をコードする塩基配列を有し;かつ
上記所定の DNA複製促進活性を有する PCNAをコードするポリヌクレオチド
[0040] ノ、イブリダィズする遺伝子を得るために用いることができるプローブは、例えば配列 番号 1又は 31に記載の塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、 プローブを用いてこれとハイブリダィズするポリヌクレオチドをつり上げ、 目的とするポ リヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、 DNAプローブ はプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブと して用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切 り出す箇所は、 目的とする DNAに応じて調節することができる。
[0041] また、「ストリンジェントな条件」とは、 、わゆる特異的なハイブリッドが形成され、非 特異的なノ、イブリツドが形成されな 、条件を 、う。通常のサザンハイブリダィゼーショ ンの洗 \ヽの条件である 60°C、 1 X SSC、 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。また、「ストリンジ ヱントな条件で」ハイブリダィズするポリヌクレオチドとして、上記 (b)のポリヌクレオチド は(a)のポリヌクレオチドに対し、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、さ らに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性 (homology)を有する ことが好適である。なお、相同性の計算方法としては、例えば、 BLAST, FASTA、 ClustalWなどを用い得る。
[0042] 上記 (b)に示すポリヌクレオチドは、その塩基配列が翻訳されたアミノ酸配列を備え るタンパク質が、 DNA複製促進活性を有する。より具体的には、上記本発明のタン
ノ ク質について説明したのと同様の DNA複製促進活性を有する。
[0043] 上記本発明のポリヌクレオチドは、適当なベクターに組み込み、組換えポリヌクレオ チドとして用いることができる。本明細書において組換えポリヌクレオチドとは、 2種以 上のポリヌクレオチド同士が連結されたハイブリッド分子のことである。本発明の組換 えポリヌクレオチドの好ま 、形態としては発現ベクターが挙げられる。発現ベクター は様々な形態のものが既に知られており、また市販されているものもある。本発明で は組換えポリヌクレオチドの形態は、用途などに応じて適宜選択してよぐ市販の発 現ベクターなど公知の発現ベクターを用いることができる。下記に限定されるもので はないが発現ベクターに関連する具体例を示す。
[0044] ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、 pBR322、 pBR325、 pUC12、 pU CI 3、市販品として pBT Vector, pTRG Vector (Stratagene社製)など)、酵 母由来プラスミド(例、 YEp24、 YCp50など)、 λファージなどのバタテリオファージ、 レトロウイルス,ワクシニアウィルス,バキュロウィルスなどの動物ウィルス、枯草菌に 好適に用いられるプラスミド(例、 pUB110、 pTP5、 pC194など)などの他、 pAl— 1 1、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAlZNeoなどが用いられる。
[0045] プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモ 一ターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシ リヒア属菌である場 合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 λ PLプロモーター、 1 ppプロモーター、 T7プロモーターなど力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーターなどが挙げられる。ま た、宿主細胞が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場 合は、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが挙げられる。また、動物細 胞を宿主細胞として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 HIV' LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウイノレス)プロモーター、 HSV— ΤΚプロモー ターなどが挙げられる。
[0046] 発現ベクターは、組換え操作につ!、ての扱!、やすさの観点からマルチクローユング サイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選
択マーカー、ェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付カ卩シグナル、 SV40複 製オリジン (以下、 SV40oriと略称する場合がある)、ターミネータ一などを組み込む ことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子 (カルべ-シリ ン耐性遺伝子ともいわれる。以下、 Ampと略称する場合がある)、カナマイシン耐性 遺伝子(以下、 Kamと略称する場合がある)、テトラサイクリン耐性遺伝子(以下、 Tet と略称する場合がある)、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、 dhfrと略称する場合がある) 遺伝子〔メソトレキセート (MTX)耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、 Neoと略称 する場合がある、 G418耐性)等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合つ たシグナル配列を、本発明のランダムオリゴヌクレオチドまたはカセットの N端末側に 付加する。宿主細胞がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA'シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列など力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は、 a アミラーゼ'シ グナル配列、サブチリシン'シグナル配列など力 宿主細胞が酵母である場合は、 M F a ·シグナル配列、 SUC2 'シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合に は、インシュリン 'シグナル配列、 a インターフェロン 'シグナル配列、 Rasフアルネ シル化 ·シグナル配列などをそれぞれ利用できる。
[0047] 上記のように本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、これを宿主細 胞に導入し、本発明の DNAポリメラーゼを発現する形質転換体を作製することがで きる。
[0048] 宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococc i)、ェシエリヒア属菌(Escherichia coli)、ストレプトミセス属菌(Streptomyces)お よび枯草菌(Bacillus subtilis)などの細菌細胞;酵母、ァスペルギルス属(Asperg illus)などの真菌細胞;ドロソフイラ S2 (Drosophila S2)およびスポドプテラ Sf 9 (Sp odoptera Sf9)などの昆虫細胞; CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK 293、ボウズ (Bows)黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞;ならびに植物 細胞が挙げられる。
[0049] 発現ベクターの宿主細胞への導入は、 Davisら、 BASIC METHODS IN MO LECULAR BIOLOGY (1986) ; Sambrookら、 MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL、第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)のような、多くの標準的な実験マ -ュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カル シゥムトランスフエクシヨン、 DEAE デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロイ ンジェクシヨン、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、トラン スダクシヨン、ノ ィオリスティック導入 (biolistics法)または感染等がある。
[0050] 形質転換体の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は 多数に上る力 いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がェシエリ ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地 は液体培地でも寒天培地でもよぐその中には形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリ ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類 、コーンスチープ.リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な どの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素 ナトリウム、塩ィ匕マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長 促進因子などを添カ卩してもよい。培地の pHは約 5〜8が望ましい。ェシエリヒア属菌を 培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩 (NaCl)を含 む LB培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働力せるため に、例えば、イソプロピル 1 チォー j8— D—ガラクトシド (IPTG)のような誘導剤を添 加してもよい。宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24 時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養 は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌をカ卩える。
[0051] 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、 Burkholder 最小培地、 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地などが挙げられる。培地の pHは約 5 〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0052] また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195、 788 (1962) ) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。培地の
pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行 ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0053] 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5〜2 0%の胎児牛血清を含む MEM培地、 DMEM培地、 RPMI 1640培地(The Jour nal of the American Medical Association, 199卷、 519 (1967) )、 199培 地 (Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine、 73卷、: L (19 50) )などが用いられる。 pHは約 6〜8であることが好ましい。培養は通常約 30〜40 °Cで約 15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、 CO濃度の調節を行う。
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[0054] 形質転換体に生成させた本発明のタンパク質は、必要に応じて、タンパク質精製の 定法により、精製、単離することができる。以上のようにして、形質転換体を用いて、 本発明の PCNAを得ることができる。
[0055] 2.本発明の PCNAを用いた DNAの複製方法
本発明の DNA複製方法は、 PCNA単量体および Zまたは前記単量体で構成され た多量体および DNAポリメラーゼの存在下で DNAの合成反応を行うことを特徴とす る。 DNAの合成方法としては、 PCR、プライマーエクステンション、ニックトランスレー シヨン、逆転写酵素による First strand cDNA合成、などが挙げられる。
[0056] 本発明の DNA複製方法としては、 PCRによる DNA増幅が好適な形態として挙げ られる。 PCRにおいては、プライマーと铸型 DNAを用いて DNA複製を繰り返し、幾 何級数的に DNAを増幅させる。そのため、 PCNAは DNAポリメラーゼに対するクラ ンプとしての機能を果たすと共に、 DNAポリメラーゼが铸型上で安定した後または所 定領域の増幅後には铸型力 速やかに外れることが望ましぐ本発明の PCNAがこ のような特性を備えているものと推察される。
[0057] 本発明の PCNAは、様々な DNAポリメラーゼと相性がよぐ汎用性が高い。 DNA ポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があ るのが一般的である。しかし、本発明の PCNAと組み合わせることにより、忠実性を低 下させずに、伸長性を向上し得るため、 DNAポリメラーゼの短所を補強しつつ DNA 複製活性が増強され得る。本発明の DNA複製方法にぉ ヽて用いる DNAポリメラー
ゼとして好ましくは、例えば、 Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社)、 Ta KaRa EX Taq (タカラバイオ社)、 Vent DNA Polymerase (NEW ENGLAN D Bio Labs社)、 Deep VentR DNA Polymerase (New England Biolabs 社)、 Pfu Turbo DNA Polymerase (ストラタジーン社)、 KOD DNA Polyme rase (東洋紡社)、および Pwo DNA Polymerase (ロッシュ ·ダイァグノスティックス 社)など、現在主要に用いられている DNAポリメラーゼのほとんどに適用し得る。また 、本発明の PCNAは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れる力 伸長性に 劣るタイプの 0L型ポリメラーゼとの組み合わせにお 、て特に有用である。
[0058] 本発明の DNA複製方法においては,本発明の PCNAが RFCを必要としないこと から,反応系に RFCを添加しなくてよい。 RFC標品は一般には市販されておらず, その調製は手間を要する。 RFC標品が利用できるとしても,添加して使用する場合 には, RFC以外の DNA複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であ るが,本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また,特に PC Rでの使用の場合には,本発明の PCNAは RFCを併用しなくとも,野生型 PCNAと RFCの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。
[0059] また、 PCRの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発 明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。 P CRの条件としては、例えば、 DNAポリメラーゼの添カ卩量、 PCRの反応時間、反応溶 液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液の pH、投入する铸型ポリヌクレオチド の量などの種々の条件が調整される。
[0060] 3.試薬キット
本発明の試薬キットは、上記本発明の PCNAおよび必要に応じその他の試薬類を 含む DNA複製用の試薬キットである。本発明の PCNAは、単量体および/または 前記単量体で構成された多量体を含む形態で、 DNA複製用試薬の一成分として好 適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明の PCNA力 SPCRにおいて特に好適 に用い得るため、 PCR用の試薬キットとして特に好適である。
[0061] 本発明の試薬キットに備えられる PCNAはどのような形態であってもよぐ精製タン パク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチ
ド、ある!/、はこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示 される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説 明したとおりである。また、本発明の PCNAと他の PCNAを組み合わせてもよい。ま た、本発明の PCNAが、組換え DNAまたは形質転換体の形態で提供される場合に は、本発明の PCNAを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、 本発明の PCNAを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般 に用いられる他の成分や媒体を配合してもよ ヽ。
実施例
[0062] 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にな んら限定されるものではな 、。
[0063] l : Pfu— PCNA.RFCタンパク質の調製
PCNA変異体タンパク質標品と RFCタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子 を大量発現させ、発現菌体よりタンパク質を精製することにより調製した。
[0064] 1. 1 :菌体入手'ゲノム DNA調製
1. 1. l : Pfu菌体入手'ゲノム DNA調製
Pyrococcus · funosus D: V[3638株を Deutsche Sammlung von Mikroo ganismen und Zelkuluren GmbH (英名: German Collection of Microor ganisms and Cell Cultures、住所: Mascheroder Weg lb, 38124 Brau nschweig, Germany)より入手した。 DSM3638株を、文献(Uemori et al. , Nucl. Acids Res. 21 : 259— 265 (1993) )【こ記載の方法【こ従って培養した 。 500mLの培養液力ら約 1. 2gの菌体を得た。これをバッファー(lOmMTris— C1 pH8. 0, ImM EDTA, lOOmM NaCl) lOmLにけん濁し、 10%SDSを lmL カロえた。撹拌の後、プレティナーゼ K (20mgZmL)を 50 /z L加えて、 55°Cで 60分 静置した。その後反応液を順次フエノール抽出、フエノール Zクロ口ホルム抽出、クロ 口ホルム抽出した後、エタノールを加えて DN Aを不溶化した。回収した DNAを lmL の TE液(10mM Tris— CI, pH8. 0, ImM EDTA)に溶解し、 0. 75mgの Rn aseAをカ卩えて 37°Cで 60分反応させた。その後、反応液をもう一度フエノール抽出、 フエノール/クロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出した後、エタノールをカ卩えて DNAを
回収した。
[0065] 1. 2 : PCNA遺伝子クロー-ング
Pfu— PCNA遺伝子は、 NCBIデータベースに登録されて!、る塩基配列情報 ABO 17486 (配列番号 1および 2)を参考とし、 PCRを利用したクローユング(図 3)によつ て獲得した。以下に詳細を説明する。
[0066] 1. 2. 1 : PCRプライマー
Pfu— PCNA遺伝子の増幅用には、 Pfu—PCNA— F、 Pfu— PCNA—Rを使用 した。これらの配列は PCNA遺伝子の開始メチォニンから終止コドンに相当する領域 を増幅し、さらに 5'側に制限酵素 Ndel認識部位、制限酵素 Xhol認識部位が付カロ するように設計されている。それぞれのプライマーの配列は表 1 (配列番号 3および 4 )に示した。
[0067] [表 1]
PCNA遺伝子増幅用プライマー
[0068] 1. 2. 2 :铸型 DNA
PCRの铸型としては上記 1. 1. 1で調製した Pfuゲノム DNAを使用した。
[0069] 1. 2. 3 : PCR反応液組成
PCR反応液は、次の組成で行った。(50 L反応液系への添加量)
铸型 DNA: lOOng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
lOxExTaqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0070] 1. 2. 4 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0071] 1. 2. 5 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 800bp付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0072] 1. 2. 6 : PCR産物のサブクローニング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0073] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 μ gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0074] 1. 2. 7 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には Pfu—PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5,端に制限 酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認さ れた。 Pfu— PCN A遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミドべ クタ一を pUCZPPCと命名することとした。
[0075] 1. 3 : PCNA発現プラスミド作製
pUCZPPCを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し PCNA遺伝子断片を調製した 。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 Pfu— PCNAの発現ベクターを作製した。
[0076] 1. 3. 1 : PCNA DNA断片調製
pUCZPPCを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0077] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0078] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 30分間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 Pfu—PCNA遺伝子に相当する バンド(約 800bp付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら PCNA DNA断片の精製を行った。
[0079] 1. 3. 2 :pET—21a発現ベクター
pET— 21aベクター DNA (米国ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0080] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0081] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0082] 1. 3. 3 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た Pfu—PCNA DNA断片(lOOng)と pET— 21a DNA断片(50ng) を DNA Ligation Kit V2 (タカラバイオ社)を利用して以下の様に反応した。
[0083] PCNA DNA断片: lOOng
pET- 21a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0084] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地(100 μ gZmLアンピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0085] 1. 3. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記糸且換えプラスミドにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に Pfu—PCNA遺伝子の ORF (オープンリー デイングフレーム)が完全に挿入されていた。この Pfu— PCNA遺伝子を保持するプ ラスミドを pPPCNAと呼ぶこととした(図 4)。
[0086] 図 4に示すように、 pPPCNAでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rbs ( リボソーム結合部位)、 PCNA遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム)、 T7ター ミネ一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが PCNA遺伝子を大量発 現することが期待された。
[0087] 1. 4 : PCNA遺伝子への変異導入
より高機能な PCNAを作製する目的で Pfu— PCNAに対してアミノ酸置換を行なつ た。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードするコドンの塩基を置換することにより行った 。表 2に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。
[0088] [表 2]
PCNA変異部位
[0089] 1. 4. 1 :置換変異導入
PCNA遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア( 表 3、配列番号 5〜: 12)、 Quik Change II Site - Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社)を利用し、同操作マニュアルに従って行った。
[0090] [表 3]
変異導入後に より DNA配列確認し、目的部位に変異導入され 、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各 PCNA変異体設計につ いて説明する。
[0092] 1. 4. 1. l : Pfu— PCNA01
Pfu— PCNAについての報告(非特許文献 6)によれば、天然型の Pfu— PCNAを 大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来の開始 Metからの 翻訳タンパク質以外に、 N末端が 73残基目からスタートする約 20kDaのタンパク質 が副産物として生成され、 73残基目の Metを Leuに遺伝子工学的手法を用いて 1残 基置換した場合、この約 20kDaのタンパク質が生成が抑えられることが報告されて ヽ る。また、このように作製された Pfu— PCNAは、野生型 PCNAタンパク質とかわらな Vヽ性質を有して 、る事が併せて報告されて 、る。これらの事実より Pfu— M73Lの変 異を準野生型として本明細書では取り扱う。
[0093] この Pfu— M73Lの変異体を Pfu— PCNA01とし、変異体を作製した。 Pfu -PC NA01の作製は、铸型プラスミドを pPPCNAとし変異導入用オリゴペア(Pfu— M73 L Fと Pfu— M73L— R)を使用して行った。
[0094] 1. 4. 1. 2 : Pfu— PCNA10
Pfu PCNA 10は Pfu— PCNAO 1の 143残基目のアミノ酸を Dから Aに一残基置 換した変異であり、 Matsumiya (非特許文献 9)により構造と性質が報告されている。 報告によれば、 143残基目のァスパラギン酸は Pfu— PCNAがホモ三量体を形成す る際に界面に位置し、三量体形成に関与するアミノ酸の一部であり、この 143残基目 のァスパラギン酸をァラニンに変換した結果、三量体形成は阻害されるものの DNA ポリメラーゼ活性刺激自体は維持されることが報告されて!、る。
[0095] この D143Aと M73Lの二重変異を持つ PCNA変異体を Pfu— PCNA10とし、作 製にあたっては Pf u— PCANAO 1産生プラスミドを铸型として Pf u— D 143 A— Fと Pf u— D143A— Rの変異導入用オリゴを使用した。
[0096] 1. 4. 1. 3 : Pfu— PCNA12
Pfu— PCNA 12は 82残基目のアミノ酸を R力も Cに一残基置換した変異であり、 M atsumiya (非特許文献 9)によれば、 82残基目のアルギニンは Pfu— PCNAがホモ 三量体を形成する際に界面に位置することが報告されている。
[0097] この R82Cと M73Lの二重変異を持つ PCNA変異体を Pfu— PCNA12とし、作製 にあたっては Pfu— PCANA01産生プラスミドを铸型として Pfu R82C— Fと Pfu
R82C— Rの変異導入用オリゴを使用した。
[0098] 1. 4. 1. 4 : Pfu— PCNA13
143残基目をアルギニン (塩基性アミノ酸)にかえる事で、準野生型(Pfu— PCNA 01)のァスパラギン酸(酸性アミノ酸)や Pfu— PCNA10のァラニン(中性アミノ酸)と 電気的性質を全く変える事により、 PCNAの三量体形成能を積極的に阻害した場合 の DNA複製への影響を調べる目的で作製した。具体的には、 Pfu—PCNAOl産生 プラスミドを铸型として、 Pfu— D143R—Fと Pfu— D143R—Rの変異導入用オリゴ を使用して作製した。
[0099] 1. 4. 1. 5 : Pfu - PCNA16
三量体に形成に関連の可能性の高い 2種のアミノ酸、 82残基目のアルギニンと 14 3残基目のァスパラギン酸の 2つのアミノ酸を同時に変異させる事での、効果を調べ る目的で作製した。具体的には、 Pfu— PCNA12産生プラスミドを铸型として、 Pfu — D143R— Fと Pfu— D143R— Rの変異導入用オリゴを使用して作製した。
[0100] 1. 4. 1. 6 : Pfu— PCNA70
143残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として, 143残基目の アミノ酸をリシン (塩基性アミノ酸)に置換した変異体を作製した。同じ塩基性アミノ酸 でもァノレギニンの側鎖のグァニジニゥム基の pK値は 12. 48,リシンの側鎖のブチノレ
R
アンモ-ゥム基の pK値は 10. 54であり,リシンの方が塩基性が低い。発現プラスミド
R
は, Pfu— PCNA01産生プラスミドを铸型として, Pfu— D143K— Fと Pfu— D143 K—Rの変異導入用オリゴを使用して作製した。
[0101] 1. 4. 1. 7 : Pfu— PCNA71
143残基目に置換導入するアミノ酸による活性の比較を目的として, 143残基目の アミノ酸をヒスチジン (塩基性アミノ酸)に置換した変異体を作製した。ヒスチジンの側 鎖の pK値は 6. 0で,生理的 pHで解離する。ヒスチジンは ρΗ6. 0でイミダゾール基
R
の 50%が電荷をもつ型,残る 50%が電荷をもたない型なので,生理的 pH範囲でも ρ Ηが高めの方では中性となる。よって置換導入するアミノ酸として,アルギニンやリシ ンとは異なる性質が予想される。発現プラスミドは, Pfu—PCNAOl産生プラスミドを 铸型として, Pfu D143H— Fと Pfu D143H— Rの変異導入用オリゴを使用して
作製した。
[0102] 1. 4. 1. 8 : Pfu— PCNA72
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し,三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 109残基目のアルギニン (塩基性アミノ酸)をグルタミン酸 (酸性 アミノ酸)に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは, Pfu— PCNA01産生ブラ スミドを铸型として, Pfu— R109E— Fと Pfu— R109E— Rの変異導入用オリゴを使 用して作製した。
[0103] 1. 4. 1. 9 : Pfu— PCNA77
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し,三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 147残基目のァスパラギン酸 (酸性アミノ酸)をアルギニン (塩基 性アミノ酸)に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは, Pfu— PCNA01産生プ ラスミドを铸型として, Pfu— D147R— Fと Pfu— D147R— Rの変異導入用オリゴを 使用して作製した。
[0104] 1. 4. 1. 10 : Pfu— PCNA78
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し,三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 139残基目のグルタミン酸 (酸性アミノ酸)をァラニン(中性アミノ 酸)に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは, Pfu— PCNA01産生プラスミド を铸型として, Pfu— E139A— Fと Pfu— E139A— Rの変異導入用オリゴを使用し て作製した。
[0105] 1. 4. 1. l l : Pfu - PCNA79
Pfu PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し,三量体形成に関与する アミノ酸の一部である 139残基目のグルタミン酸 (酸性アミノ酸)をアルギニン (塩基性 アミノ酸)に置換した変異体を作製した。発現プラスミドは, Pfu— PCNA01産生ブラ スミドを铸型として, Pfu— E139R— Fと Pfu— E139R— Rの変異導入用オリゴを使 用して作製した。
[0106] 1. 4. 2 :発現株の作製
以上のように取得した変異型 PCNA発現プラスミドベクターにより大腸菌 BL21 C odonPlus (DE3) RIL (ストラタジーン社)を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸
菌株を得た。
[0107] 1. 4. 3 :菌体培養と発現誘導
各変異 PCNA発現株を 1. 5リットル LB培地(50 μ gZmLアンピシリン含有)にて、 37°Cで振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3-0. 5の時期に終濃度 0. 1
600
mMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopyranoside)を添カ卩して 発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の菌体は遠心分離 (4°C 、 6, 000xg、 6分)によって回収した。
[0108] 1. 4. 4 : PCNAタンパク質精製(図 5)
図 5に示すように、菌体を遠心回収し (S51)、菌体破砕 (超音波破砕、 S52)、 5分 間煮沸し (S53)、ポリエチレンィミン沈澱を行い(S54)、さらに硫安沈澱を行い(S55 )、イオン交換クロマトグラフィー(S56、カラムとして HiTrap Qを使用)、ゲルろ過ク 口マトグラフィー(S57、 Superdex 200を使用)という処理により標品を調製した。 S DS— PAGEにより、良好に精製されたことを確認した。
[0109] 1. 4. 4. 1 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー A(50mM Tris—HCl pH 8. 5, 0. 1M NaCl, 2mM 2—メルカプトエタノール, 10% グリセロール)ま たはバッファー B (50mM Tris—HCl pH8. 0, 0. 1M NaCl、 0. ImM ED TA、 10% グリセロール、 0. 5mM DTT)によりけん濁した。超音波処理により 菌体を破砕した。
[0110] 1. 4. 4. 2 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0111] 1. 4. 4. 3 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン(SIGMA P— 3143)と NaClをそれぞれ終濃度 0 . 2% (w/v) , 0. 58Mになるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠 心分離(18, 500 X g, 25分, 4°C)して,上清を回収した。
[0112] 1. 4. 4. 4 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹
拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を 80%飽和させた 50mM Tris- HCl (pH8. 5)ノ ッファー 80mLを添加して、遠心分離(30, OOO x g, 25分, 4 °C)により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファー C (50mM Tris-HCl pH8. 0 , 0. 1Μ NaCl)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して透析を行った。
[0113] 1. 4. 4. 5 :イオン交換クロマトグラフィー
透析したサンプルは、 Pfu— PCNA01, 10, 12, 13, 16に関しては、 FPLCタン パク質精製システム(アマシャムバイオサイエンス社)を、その他の Pfu— PCNA70, 71, 72, 77, 78, 79【こ関して ίま、 AKTAexplorer 10S (アマシャムノィ才サイェン ス社)を使用して、イオン交換クロマトグラフィー(HiTrap Q ;アマシャムバイオサイエ ンス社)を実施した。溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェ ントとし、流速は lmLZminとした。
[0114] 1. 4. 4. 6 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Qイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれ Superdex 20 0 (アマシャムバイオサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに 精製し、以降のアツセィ用標品とした。
[0115] 得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび 良好に精製されたことが確認された(図 6及び図 40)。
[0116] 1. 5 : Pfu— RFC遺伝子クローユング
RFCは 2つのサブユニット RFCLと RFCSから構成されており、 Pyrococcus -furio susゲノム上ではタンデムに位置して 、る。 RFCタンンパク質標品の調製にあたって は、 RFCLと RFCS遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同一宿主内に各々の発 現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プラスミドの作製にあた つては非特許文献 7を参照した。以下に詳細を示す。
[0117] 1. 5. 1 : RFCLの遺伝子クローユングと発現プラスミド作製
Pfu— RFCL遺伝子(NCBI GeneID1467921)は Pfuゲノムを铸型とした PCR により得た (塩基配列、配列番号 13; アミノ酸配列、配列番号 14)。 PCR用プライマ 一として、 RFCL Fプライマーと RFCL— Rプライマーを使用した(表 4;配列番号 1 5および 16)。クローユング操作の都合上、 RFCL— Fプライマーには制限酵素 Ndel
認識部位、 RFCL— Rプライマーには制限酵素 Xhol認識部位をそれぞれ付加した。
[表 4]
PCRの铸型としては上記 1. 1で調製した Pfuゲノム DNAを使用した。
[0120] PCR反応は、次の組成で行った。 (50 μ L反応系への添加量)
铸型 DNA; 100ng
プライマー;各 lOpmol
dNTP ;各 lOnmol
EX Taq*; 1.25U
10X EX Taqバッファー; 5 L
以上に滅菌蒸留水を添加して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0121] 1. 5. 1. 1 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0122] 1. 5. 1. 2 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 1. 4kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0123] 1. 5. 1. 3 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0124] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0125] 1. 5. 1. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入
部分には Pfu—RFCL遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5,端に制限 酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認さ れた。このプラスミドを pUC118/RFCLとした。
[0126] 1. 5. 1. 5 : RFCL発現プラスミド作製
PUC118ZRFCLを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し RFCL遺伝子断片を調 製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 Pfu— RFCLの発現ベクターを作製し た。
[0127] 1. 5. 1. 6 : RFCL DNA断片調製
pUC 118ZRFCLを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0128] プラスミド DNA :
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0129] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間、制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 1 %ァガロースゲル電気泳動を行った、 Pfu—RFCL遺伝子に相当する バンド(約 1. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら RFCL DNA断片の精製を行った。
[0130] 1. 5. 1. 7 : pET— 29a発現ベクター
pET— 29aベクター DNA (ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xho Iで二重切断した。
[0131] プラスミド DNA : 2 μ &
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0132] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1 %ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 29aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica
tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 29a DNA断片の精製を行った。
[0133] 1. 5. 1. 8 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た Pfu—RFCL DNA断片(lOOng)と pET— 29a DNA断片(50ng)を DNA Ligation Kit V2 (タカラバイオ社)を利用して以下の様に反応した。
[0134] RFCL DNA断片: lOOng
pET- 29a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0135] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(30 μ gZmLカナマイシン含 有)上に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロ ニーのうち 3個を LB液体培地(30 μ gZmLカナマイシン含有) 3mL、 37°Cにて終夜 振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0136] 1. 5. 1. 9 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 29aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれ のプラスミド DNAについてもマルチクロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に Pfu— R FCL遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム)が完全に挿入されていた。 Pfu —RFCL遺伝子を保持するプラスミドを pRFCLと呼ぶこととした(図 7)。
[0137] 図 7に示すように、 pRFCLでは pET— 29aが保持する T7プロモーターから rbs (リ ボソーム結合部位)、 RFCL遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム)、 T7ターミ ネーターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが RFCL遺伝子を大量発 現することが期待された。
[0138] 1. 5. 2 : RFCS遺伝子のクローユングと発現プラスミド作製
Pfu— RFCS遺伝子(GenelD: 1467922)は非特許文献 7によれば、インティン( 1, 575塩基によりコード)を 1個所保持し、 N端のェクスティンは 177塩基、 C端のェ タスティンは 804塩基にコードされて 、ることが報告されて 、る(終始コドンは含まず)
。配列番号 17および 18に Pfu—RFCSの塩基配列およびアミノ酸配列(いずれもィ ンティン部分を含む)を示す。
[0139] RFCS発現ベクター作製にあたっては、まず、インティンを含む Pfu—RFCS遺伝 子全長を PCR反応を利用して増幅し、その後、インティンを除去した成熟型 RFCS ( RFCSmとも呼ぶ)を調製した。インティン除去は、 N端側と C端側のェクスティンを個 別に PCRで増幅した後に、 2種のェクスティン断片を PCR反応により融合する事によ り実施した。
[0140] 1. 5. 2. 1インティンを含む RFCS遺伝子の PCR反応
Pfuゲノム(上記 1. 1で調製)、 RFCS— F、 RFCS—Rプライマー(表 5 ;配列番号 1 9、 20)の組合せで PCR反応を行なった。
[0141] [表 5]
〔〕0142
铸型 DNA: lOOng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
lOx EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0143] 1. 5. 2. 2 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0144] 1. 5. 2. 3 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 2. 6kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0145] 1. 5. 2. 4 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0146] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0147] 1. 5. 2. 5 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分はインティンを含む RFCS遺伝子と一致した。このプラスミドを pUCZRFCSとし
た。
[0148] 1. 5. 2. 6 :ェクスティン増幅用プライマー
N端側ェクスティン用 PCRプライマーとして、 RFCSF1プライマー、 RFCSR2プラ イマ一 (表 5 ;配列番号 21、 23)を準備した。また、 C端側ェクスティン用 PCRプライ マーとして、 RFCSF2プライマー、 RFCSR1プライマー(表 5 ;配列番号 22、 24)を 準備した。クローユングを容易にする目的で RFCSF1プライマーには制限酵素 Ndel 配列、 RFCSR1プライマーには制限酵素 Sail配列を 5'端に付加してある。また、 2種 のェクスティン断片を PCR反応により融合する際に利用する相補的な配列を RFCS F2プライマーと RFCSR2プライマーに設けた。
[0149] 2種のェクスティン増幅のための PCR反応は、次の組成で行った。(50 μ L反応液 系への添加量)
pUC/RFCS DNA: 50ng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0150] 1. 5. 2. 7 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0151] 1. 5. 2. 8 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った。 RFCSF1プライマーと RFCSR2プライマーセットの PCR産物では約 18 0塩基のバンドが、 RFCSF2プライマーと RFCSR1プライマーセットの PCR産物では 約 800塩基のバンドが観察された。紫外線照射下でそれぞれのバンドを含むゲルを 切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバ ィォサイエンス社)を使用して同操作マニュアルに従 、ゲル中の PCR産物の精製を
行った。
[0152] 1. 5. 2. 9 : PCR融合反応
2種のェクスティン PCR産物を 1チューブ内で 1組のプライマーセットで PCR反応に 供する事で 2種の断片を融合し、成熟型 RFCSをコードする遺伝子断片を得た。以 下に詳細を示す。
[0153] 2種のェクスティン PCR産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
N端ェクスティン断片: 2 μ L· (50ng相当)
C端ェクスティン断片: 2 μ L· (50ng相当)
10x EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 44.5 μ Lとした。
上記を 95°C · 3min加熱し、 37°Cまで 30分間でゆっくりと冷却した。
[0154] 上記反応液に以下を添加する
dNTP : 5 (各10 01)
これを 72°C · lOmin反応させる。
(*タカラバィォ社製)
[0155] 上記に、 RFCSF1プライマーと RFCSR1プライマーを各 lOpmol添カ卩し、 95°C - 3 Osec→55°C · 30sec→72°C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を 行った。
[0156] 1. 5. 2. 10 : PCR産物の制限酵素切断'精製
上記 PCR反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製した DNA断片 は制限酵素 Ndelと Sailで二重切断した。
PCR産物: 相当
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 2種のインティンの融合断片 (成
熟型 RFCSコード配列)と想定されるバンド (約 lkb付近)を切り出し、 GFX PCR D NA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用 し精製した。
[0157] 1. 5. 2. 11 :pET— 21a発現ベクターの制限酵素切断
pET— 21aベクター DNA (ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと Sail で二重切断した。
[0158] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
[0159] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0160] 1. 5. 2. 12 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た 2種のインティンの融合断片 (成熟型 RFCSコード配列)と予測される約 lkbの DNA断片(lOOng)と pET—21a DNA断片(50ng)を DNA Ligation Ki t V2 (タカラバィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0161] lkbDNA断片: lOOng
pET- 21a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0162] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(100 μ gZmLアンピシリン含 有)上に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロ ニーのうち 3個を LB液体培地(100 μ gZmLアンピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終 夜振とう培養し、定法に従 、プラスミド DNAを調製した。
[0163] 1. 5. 2. 13 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET
— 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Sail部分にインティンを除去した成熟型の RFCSmの配 列(984塩基)が確認された (pRFCSmと命名 )。
[0164] 図 8に示すように、 pRFCSmでは pET—21aが保持する T7プロモーターから rbs ( リボソーム結合部位)、成熟型 RFCS遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム)、 T7ターミネータ一の順に並んで 、る事が確認された。本プラスミドが成熟型 RFCS遺 伝子を大量発現することが期待された。
[0165] 1. 6 : Pfu— RFC遺伝子発現株の作製
pRFCLと pRFCSmで大腸菌 BL21— CodonPlus (DE3)— RILを同時に形質転 換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質転換 体を選択し発現株を得た。
[0166] 1. 7 : Pfu— RFC遺伝子発現
上記の発現株を 1. 5リットル LB培地(50 μ gZmLアンピシリンおよび 30 μ g/mL カナマイシン含有), 37°Cにて振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3— 0.
600
5の時期に終濃度 0. ImMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopy ranoside)を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の 菌体は遠心分離 (4°C、 6, 000xg、 6分)によって回収した。
[0167] 1. 8 : Pfu— RFCタンパク質精製
図 9に示すように、菌体を遠心回収し (S91)、超音波破砕により菌体を破砕し (S92 )、 5分間煮沸処理し (S93)、ポリエチレンィミン沈澱を行い(S94)、硫安沈澱を行い (S95)、ァフィ-ティークロマトグラフィー(S96、 HiTrap Heparinを使用)、ゲルろ 過クロマトグラフィー(S97、 Superdex 200を使用)処理にて標品を調製した。 SDS
— PAGEによる確認では、 90%以上の純度を確保できた。
[0168] 1. 8. 1 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (前出)によりけん濁した。 超音波処理により菌体を破砕した。
[0169] 1. 8. 2 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0170] 1. 8. 3 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン(SIGMA P— 3143)を終濃度 0. 18% (wZv)に なるように添加し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠心分離(18,500 X g, 25分, 4°C)して,上清を回収した。
[0171] 1. 8. 4 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離(18, 500xg, 4°C, 25分)により沈澱を 回収した後、この沈澱をバッファー C (前出)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して 透析を行った。
[0172] 1. 8. 5 :ァフィ二ティーク口マトクロマトグラフィー
透析したサンプルは HiTrap Heparin HPカラム(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して精製した。
[0173] 溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、流速は 1 vaL/ minとし 7こ。
[0174] 1. 8. 6 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Heparinァフィ-ティークロマトグラフィーでのピーク画分を Superdex 2
00 (前出)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アツセィ用の標 品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大き さおよび良好に精製されたことが確認された(図 10)。
[0175] 2 : PCNA変異体の評価
上記で調製した各種 PCNA変異体の DNA増幅系への効果、とくに PCR反応系へ の効果を調べた。具体的には PCR反応系に PCNA変異体、 RFCを単独もしくは併 用して添加した場合、未添加の場合で PCR反応を行い、その反応産物を電気泳動 に供して標的領域の増幅状態を比較することで行った。
[0176] 2. 1 :各種 PCNA変異体の評価
Pyrococcus属由来の DNA合成酵素として市販されている Pyrobest DNA Pol ymerase (タカラバイオ社)を対象として各種 PCNA変異体の添加効果を PCR反応 の系を禾 IJ用して調べた。 Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp. 由来 の 3,→5, exonuclease活性(proof reading活性)を有する而熱性 a型 DNAポリ メラーゼである。 Pyrococcus ' furiosus由来の Pfu DNAポリメラーゼゃ、 Vent D NAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。
[0177] 2. 1. 1 :反応液組成
アクセサリータンパク質 (APとも記す)を添加する点を除 、ては標準的な PCR反応 液の組成とし、バッファ一としては添付反応バッファー(10x Pyrobest Buffer II; 組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。なお 铸型 DNAとしてはラムダ DNA (GenBank accession 02459)を使用した。
[0178] [表 6] 表 6
増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを変 る。 プライマ一の組み合わせについては表 8および表 9を参照。
[表 7]
表 7 AP溶液 (アクセサリ一タンパク質溶液)
ただし、 PCNAxxの原液濃度: 100ng し RFC原液濃度; 500ng/ jt L Buffer *: 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0180] 2. 1. 2 : PCR反応プログラム
2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · lmin) 30cycles→4°Cで保持
[0181] 8. 4kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 3. 5min) 30cycles→4°Cで保持
[0182] 15. 8kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 7min) 30cycles→4°Cで保持
[0183] 2. 1. 3 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 1%ァガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動マーカーとして ラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、増幅した断片の大きさごとに 、それぞれ図 11〜図 13 (PCNA01, 10, 12, 13, 16)、図 41〜43 (PCNA01, 10 , 13, 70, 71)及び図 44〜46 (PCNA13, 72, 77, 78, 79)に示す。
〕 〔
表 8 PCNA評価用プライマー配列
表 9 ラムダ DNA増幅領域
[0186] 2. 1. 4 :結果 1
図 11〜13の結果について述べる。
PCNA01
増幅サイズが 2kb, 8. 4kbの際は、 RFCを 400ng添カ卩した時にのみ、増幅がみら れるが、その他の場合では PCNA01の添力卩は未添カ卩(no AP)の場合と比較して 阻害的に働いている。これは,野生型 PCNAを使用する際には, RFCを適当量併用 しなければ増幅ができな 、と 、う結果であり,単独添加で DNA合成促進活性を示す プライマーエクステンション試験結果 (非特許文献 6および 9)と異なり, PCRにおいて は野生型 PCNAの単独添カ卩は反応を明確に阻害することを示している。
[0187] PCNA 10
増幅サイズが 2kb、 8. 4kbの際は、 RFCを 200ng、 400ng添カ卩した時に増幅がみ られる力 15. 8kbの場合には RFC400ng添カ卩時のみ増幅が観察される。増幅量は PCNA01の場合より優れている力 PCNA01同様に RFCの存在が必要で、増幅サ ィズによって RFCの至適添カ卩量が異なることが示唆される。
[0188] PCNA 12
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも、 RFC添カ卩することで増幅 量が促進されることが観察された。また RFC未添カ卩においても増幅した。ただし PCR 酵素単独に比べて、若干の増幅促進し力観察されて 、な 、。
[0189] PCNA 13
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも大量の増幅が確認され、増 幅量は RFCの添カ卩量に依存しない。 PCNA13の添カ卩効果には RFCを必要とせず、 PCRによる増幅を顕著に促進して 、ると考えられる。
[0190] PCNA16
増幅サイズ 2kb、 8. 4kb、 15. 8kbのいずれの場合でも増幅が確認される。 RFC未 添カ卩においても増幅した力 PCR酵素単独と同等の増幅レベルである。また RFC添 加の効果が余り観察されな!、。
[0191] 5種の PCNAについて Pyrobest DNA polymeraseを使用する PCR反応系へ の添加効果の確認をおこなったが、 PCNA13については未添カ卩時と比較して、圧倒 的に添カ卩時の増幅効果が高ぐまた、 RFCの添加を必要としないことが判明した。
[0192] 2. 1. 5 :結果 2
図 41〜43の結果について述べる。
PCNA01 (準野生型)
2. 1. 4での結果と同様に、 RFCを 400ng添カ卩した場合以外はいずれのサイズに お!ヽても増幅が認められず、 PCNA未添カ卩 (no AP)の場合と比べて阻害的に作用 した。
[0193] PCNA10 (D143A)
増幅サイズが 2kbの場合は RFCを 200— 400ng、 8. 4kbの場合は 400ng添加し た時に明瞭な増幅がみられ、 15. 8kbの際は RFC400ng添加でも増幅は認められ なかった。 2. 1. 4での結果と同様に、増幅量としては PCNA01よりも優れているが、 増幅には RFCの存在が必須で、増幅サイズによって RFCの至適添カ卩量が異なること が示唆された。
[0194] PCNA7KD143H)
RFC未添加では増幅が認められなかった力 増幅サイズが 2kbと 8. 4kbの場合は RFC200— 400ng、 15. 8kbの場合は RFCを 400ng添カ卩した場合に増幅が認めら れた。 PCNA10に比べて増幅量はさらに多くなつているものの、増幅には RFCの添 加が必要であった。
[0195] PCNA70 (D143K)
RFCの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察さ れた。
[0196] PCNA13 (D143R)
2. 1. 4での結果と同様に、いずれのサイズにおいても RFCに依存せずに大量の 増幅が観察され、増幅レベルは PCNA70よりも良好であった。
[0197] PCNAの 143残基目に変異を導入した変異体 4種(PCNA10、 13、 70、 71)につ V、て PCR反応系への添加効果を検証したが、 RFCに依存しな 、促進効果を示した のは PCNA70 (D143K)と PCNA13 (D143R)のみで、より塩基性度の高いアルギ ニン残基に置換した PCNA13が最も強い促進効果を示した。従って、 D143残基へ の変異導入により PCNA単独での PCR促進効果をもたらすためには、塩基性を示 すアミノ酸残基への置換が必要で、その置換した残基が PCR反応条件下 (pH8. 0 〜)で有する正電荷が、単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引 き起こすことが重要であるものと考えられる。
[0198] 2. 1. 6 :結果 3
図 44〜46の結果につ!、て述べる。
PCNA13 (D143R)
2. 1. 4、 2. 1. 5での結果と同様に、いずれのサイズにおいても RFCに依存せず に大量の増幅が観察された。
[0199] PCNA77 (D147R)
RFCの有無、添加量に依存せず、いずれのサイズにおいても大量の増幅が観察さ れたが、その増幅量は PCNA13よりも劣っていた。
[0200] PCNA72 (R109E)
いずれのサイズの増幅の場合でも、 RFCの有無、添加量に依存せず、未添カ卩(no AP)の場合と比較してほとんど変化が認められな力つた。
[0201] PCNA79 (E139R)
いずれのサイズの増幅の場合にも RFCを 200— 400ng同時添カ卩することにより、 促進効果が認められた力 増幅には RFCの存在が必須であり、 PCNA79の単独添 加では反応を阻害した。
[0202] PCNA78 (E139A)
いずれのサイズの増幅の場合にも RFCを 200— 400ng同時添カ卩することにより、 促進効果が認められた力 増幅には RFCの存在が必須であり、 PCNA78の単独添
加では反応を阻害した。また、 PCNA79との比較では、 RFCを 200ng同時添加する 場合には、増幅サイズにより優劣が異なった力 RFCを 400ng同時添加する場合に は、その増幅量は PCNA79よりも劣っていた。 E139に置換導入する場合にも、中性 アミノ酸 (ァラニン)よりも塩基性アミノ酸 (アルギニン)に置換する方が効果大と考えら れる。
[0203] Pfu— PCNAがホモ三量体を形成する際に界面に位置し、三量体形成に関与する アミノ酸のうち、 4種に置換変異導入した変異体の、 PCR反応系への添加効果を検 証したが、 3つのタイプに分類された。単独添加では反応を阻害するが、 RFCを同時 添加すると RFCの添カ卩量依存的に反応が回復し、添カ卩量によっては、未添加(no AP)の場合より優れた増幅が認められるというもの。単独添加、 RFC同時添加とも未 添加 (no AP)の場合とほとんど変化が認められない、反応に関与していないと推測 されるもの。 RFCの有無に関わらず、反応を促進するものである。ポイントは三量体 の形成能にあり、イオン対ネットワークを弱める加減による現象と考えられる。すなわ ち、三量体構造が堅固すぎると RFCの助けがないと反応が進まない。三量体形成能 が失われるとクランプとして機能できない。その中間の適度に三量体構造が弱くなつ た状態が PCRでの酵素活性促進に重要ということだと推測される。
[0204] 単量体界面のイオン対ネットワークに対して電荷的反発を引き起こすことにより、 PC Rでの酵素活性促進に有効な三量体形成能を実現して ヽるものと考えられる。また、 熱安定性にも寄与していると推測されるイオン対ネットワークを弱めることにより、高温 下で三量体が解離しやすくなるものと考えられる。 PCRでの次のサイクルへの温度上 昇時、あるいはサイクル最初の変性ステップの高温時に三量体が解離することにより 、複製反応が繰り返されるという反応機構が推察される。
[0205] 11種の変異体について、 PCR反応系への添加効果の確認を行った力 RFCに依 存しない促進効果を示したのは、 PCNA13 (D143R)、 PCNA70 (D143K)、 PCN A77 (D147R)の 3種で、中でも PCNA13が最も強い圧倒的な増幅効果を示した。 また、 RFCを同時添加することにより、むしろ増幅量が減少するような傾向も見受けら れた。
[0206] 2. 2 : PCNA13の各種PCR用DNAポリメラーゼに対する効果
上記の結果を受けて、各種 PCNA変異体のうち特に性質が優れている PCNA13 について、巿販の 7種の PCR用 DNAポリメラーゼを使用した PCR反応系を対象に 添加効果を調べた。具体的には、 2〜3種類の増幅鎖長の異なる標的配列について 、伸長時間の異なる PCR反応を行ない、添加効果を確認した。
[0207] 2. 2. l : Pyrobest DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp.由来の 3 →5 exonucleas e活性 (proof reading活性)を有する耐熱性 a型 DNAポリメラーゼである。
[0208] PCNA13の添カ卩を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨する PCR反応液の 組成とし、バッファ一としては製品添付反応バッファー(10x Pyrobest Buffer II; 組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0209] [表 10]
表 10
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマ一の組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/〃 L, Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0210] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C · 0. 5, 1 , 2min) 30cycles→4°Cで保持
8. 4kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 2, 3. 5, 5min) 30cycles→4°Cで保持 15. 8kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 2, 5, 6, 7min) 30cycles→4°Cで保持 [0211] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー(G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を、増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 14〜 16に示す。
[0212] まとめ:
2kb増幅の場合
図 14に示すように、伸長時間(Extension time) 0. 5min、 lminで PCNA13添 加による反応促進が明確に観察される。伸長時間(Extension time) 2minでは反 応が飽和に近い状態である力 やはり PCNA13添カ卩時の方が若干増幅量が多いこ とが観察される。
[0213] 8. 4kb増幅の場合
図 15に示すように、伸長時間(Extension time) 2minでは添カ卩効果は見られな いが、 3. 5min、 5minでは添カ卩による促進効果が観察される。
[0214] 15. 8kb増幅の場合
図 16に示すように、伸長時間(Extension time) 2minでは添カ卩効果は見られな いが、 5min、 6min、 7minでは添カ卩による促進効果が観察される。
[0215] 2. 2. 2 :TaKaRa EX Taqに対する PCNA13添カ卩効果
TaKaRa EX Taq (タカラバイオ社)は、 3,→5,exonuclease活性(proof read ing活性)を持つ而熱性 DNA Polymeraseである。通常の PCR条件下において、 従来の Taq DNA Polymeraseと比べて、高い増幅効率、低いエラー率で高感度 の PCRを実現できる。
[0216] PCNA13の添カ卩を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨する PCR反応液の
組成とし、バッファ一としては製品添付反応バッファー 10x Ex Taq buffer (20m M Mg2+plus);組成は未公表、タカラバィォ社)を使用した。以下に PCR反応液の 組成を示す。
[0217] [表 11] 表 1 1
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA1 3の原液濃度; 100ng/ し Buffer; 25m M TrisCI pH8.0, 50m M NaCI, 50% Glycerol
[0218] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 30sec, 40sec, lmin) 30cycles→72°C . 10min→4。Cで保持
[0219] 8. 4kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C - 1. 5min, 2min, 3min) 30cycles→72 °C ' 10min→4°Cで保持
[0220] 15. 8kb増幅の場合
94°C - lmin→ (98°C - 5sec→68°C · 3. 5min, 4min, 5min) 30cycles→72 °C ' 10min→4°Cで保持
[0221] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 17〜図 19に示す。
[0222] まとめ:
2kb増幅の場合
図 17に示すように、伸長時間(Extension time) 30sec, 40secで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間(Extension tim e) lminでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 40secの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0223] 8. 4kb増幅の場合
図 18に示すように、伸長時間(Extension time) l. 5min、 2minで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間(Extension tim e) 3minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 2minの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0224] 15. 8kb増幅の場合
図 19に示すように、伸長時間(Extension time) 3. 5min、 4minで PCNA13添 加による増幅量と反応速度の増大が明確に観察される。伸長時間(Extension tim e) 5minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 4minの PCNA13 添カ卩時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0225] 2. 2. 3 : Vent DNA polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Vent DNA Polymeraseは好熱菌 Thermococcus litoralis由来の DNA po lymeraseで NEW ENGLAND Bio Labs社より販売されている PCR用酵素であ る。
[0226] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー(10x ThermoPol Reaction Buffer ; 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH ) SO , 100 mM KC1, 20 m
M MgSO , 1 % Triton X—100, pH 8. 8 @ 25° C)を使用した。以下
4
に PCR反応液の組成を示す。
[0227] [表 12] 表 1 2
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2 ) PCNA1 3の原液濃度; 100ng/ iし Buffer ; 25mM TrisCI pH8.0, 50m M NaCI, 50% Glycerol
[0228] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - 5sec, 15sec, 30sec) 3 0cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0229] 8. 4kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - lmin, 3min, 5min) 30 cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0230] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー(G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 Ι 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 ;z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果
を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 20、図 21に示す。
[0231] まとめ:
2kb増幅の場合
図 20に示すように、伸長時間(Extension time) 5sec、 15secで PCNA13添カロ による反応促進が明確に観察される。伸長時間(Extension time) 30secでは反応 が飽和に近い状態である力 やはり PCNA13添カ卩時の方が若干増幅量が多いこと が観察される。
[0232] 8. 4kb増幅の場合
図 21に示すように、伸長時間(Extension time) lmin、 3min、 5minで添カ卩によ る促進効果 (増幅量、反応速度)が観察される。
[0233] 2. 2. 4 : Deep Vent DNA polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Deep Vent DNA Polymerase (New England Biolabs社)は Pyrococcus species GB— Dl由来の而熱性 DNAポリメラーゼであり、 3,→5,ェキソヌクレア ーゼ活性を保持する。
[0234] 評価に際しては、 PCNA13の添加を除いては標準的な PCR反応液を組成とし、バ ッファーとしては製品添付反応バッファー(10x ThermoPol Reaction Buffer; 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH ) SO , 100 mM KC1, 20 mM
4 2 4
MgSO , 1 % Triton X— 100, pH 8. 8 @ 25° C)を使用した。以下に P
4
CR反応液組成を示す。
[0235] [表 13]
表 13
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/ jUし Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0236] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C · 0. 5min, lmin, 2min,
3min) 30cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0237] 8. 4kb増幅の場合
95°C - 2min→ (95°C - 30sec→55°C - 30sec→72°C - 5min, 7min, 9min) 30 cycles→72°C · 10min→4°Cで保持
[0238] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー(G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果 を増幅した断片の大きさごとにそれぞれ図 22および図 23に示す。
[0239] まとめ:
2kb増幅の場合
図 22に示すように、伸長時間(Extension time) 0. 5min, lmin, 2minで P CNA13添カ卩による反応促進が明確に観察される。伸長時間(Extension time) 3 minでは添加、未添カ卩によらず反応が飽和に達している力 2minの PCNA13添カロ 時の増幅量がほぼ反応の飽和状態に近いものであることがわかる。
[0240] 8. 4kb増幅の場合
図 23に示すように、いずれの伸長時間(Extension time) 5min、 7min、 9minに おいても添加による促進効果 (増幅量、反応速度)が観察される。
[0241] 2. 2. 5 : Pfu Turbo DNA Polymeraseに対する PCNA13添カ卩効果
Pfu Turbo DNA Polymerase (ストフタン ~~ン社)は Pyrococcus 'furiosus由 来の耐熱性 DNAポリメラーゼに ArchaeMaxx(R) ((R)は登録商標であることを示す) Factorと呼ばれる PCR反応促進剤を添加した製品である。 PCR反応過程で副次的 に産生される dUTPは PCR反応を阻害することが知られて!/、るが、 ArchaeMaxx(R)
Factorは dUTPを分解する因子であり、これを添加することで PCR反応の阻害を 防止し、結果的に PCR反応効率を高めている。
[0242] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー(10x Cloned Pfu DNA polymera se reaction buffer ; 200 mM Tris— HCl(pH 8.8) , 100 mM (NH ) SO
4 2
, 100 mM KC1, 20 mM MgSO , 1 % Triton X— 100, lmg/ml
4 4
BSA)を使用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0243] [表 14]
表 14
1 )増幅する鎖長に応じて Forward Primer. Reverse Primerの組み合わせを変える。プライマ一の 組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/jU L, Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50m NaCI, 50% Glycerol
[0244] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
95°C · 2min→ (95°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · lmin) 30cycles→72°C · 1 0min→4。Cで保持
[0245] 8. 4kb増幅の場合
92°C · 2min→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 8min) 10cycles→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 8min+ lOsec/cycle) 20cycles→4°Cで保持 [0246] 15. 8kb増幅の場合
92°C · 2min→ (92°C · 10sec→55°C · 30sec→68°C · 15min) 10cycles→ (92°C • 10sec→55°C - 30sec→68°C - 15min+ lOsec/cycle) 20cycles→4°Cで保持 [0247] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して 10xローデイングバッファー(G lycerol 50%. Bromphenol Blue 0. 4%. Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0248] まとめ:
図 24に示すように、 、ずれのサイズの PCR反応にお!ヽても PCNA13の添カ卩により 反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。
[0249] 2. 2. 6 :KOD DNA Polymerase に対する PCNA13添カ卩効果
KOD DNA Polymerase (東洋紡社)は、超好熱始原菌 Thermococcus'koda karaensis KOD1株由来の DNA Polymeraseである。 Polymerase活性の他、 強い 3,→5,Exonuclease活性(Proofreading活性)を持っため、 Taq DNA Pol ymeraseより約 50倍の高い PCR Fidelityを示す。市販されている Pyrococcus属 由来を主とした他の高正確性 PCR用酵素は、伸長速度が遅いものが多いが、本酵 素は伸長速度が非常に速ぐ Taq DNA Polymeraseの約 2倍の伸長速度を有す る。そのため、正確性の高い PCRを短時間で行うことが可能である。
[0250] 評価に際しては、 PCNA13の添カ卩を除いては標準的な PCR反応液の組成とし、 バッファ一としては製品添付反応バッファー(10x PCR buffer 2M Tris
-HC1 pH8. 0, 60mM (NH ) SO , lOOmM KCl, l%TritonX— 100,
4 2 4
0. 01%BSAもしくは lOx PCR buffer # 2 ; 1. 2M Tris— HC1 pH8. 8, 6 OmM (NH ) SO , lOOmM KC1, l%TritonX— 100, 0. 01%BSA)を使
4 2 4
用した。以下に PCR反応液の組成を示す。
[0251] [表 15] 表 15
1)増幅する鎖長に応じて Foreard Primer, Reverse Primerの組み合わせを 変える。プライマーの組み合わせについては表 8及び表 9を参照。
2) 10 X 添付 Buffer #1; 2 kb, #2; 8.4 kb, 15.8 kb
3) PCNA13の原液濃度; 100 ng/μΙ, Buffer; 25 mM TrisCI pH8.0,
50 mM NaCI, 50 %Glycerol
[0252] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 12sec) 30cycles→72°C · 3min→4°Cで保 持
[0253] 8. 4kb, 15. 8kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 2min) 30cycles→72°C · 3min→4°Cで保 持
[0254] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0255] まとめ:
図 25に示すように、いずれのサイズの PCR反応においても PCNA13の添カ卩により 反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。
[0256] 2. 2. 7 : Pwo DNA Polymerase に対する PCNA13添カ卩効果
Pwo DNA Polymerase (ロッシュ ·ダイァグノスティックス社)は、好熱性古細菌 P yrococcus .woesei株由来の DNA Polymeraseである。 Polymerase活性の他、 強い 3,→5,Exonuclease活性(Proofreading活性)を持っため、 Taq DNA Pol ymeraseより高い PCR Fidelityを示す。そのため、正確性の高い PCRを短時間で 行うことが可能である。
[0257] 評価に際しては、 PCNA13の添加を除いてはメーカーが取り扱い説明書で推奨す る PCR反応液の組成とし、ノ ッファーとしては製品添付反応バッファー(10x PCR buffer ; 100mM Tris— HC1 pH8. 85, 50mM (NH ) SO , 250mM KC
4 2 4
1, 20mM MgSO )を使用した。以下に PCR反応液組成を示す。
4
[0258] [表 16]
表 1 6
1)増幅する鎖長に応じて Forward Primer, Reverse Primerの組み合わせを変える。プライマーの 組み合わせについては表 8および表 9を参照。
2) PCNA13の原液濃度; 100ng/ /iし Buffer; 25mM TrisCI pH8.0, 50mM NaCI, 50% Glycerol
[0259] PCR反応プログラム:
2kb増幅の場合
94°C · lmin→ (98°C · 10sec→68°C · 30secもしくは lmin) 30cycles→72°C · 3m in→4。Cで保持
[0260] 8. 4kb増幅の場合
95°C · 2min→ (95°C · 30sec→60°C · 30sec→72°C · 2minもしくは 4min) 30cycl es→72°C .3min→4°Cで保持
[0261] 電気泳動:
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して X10ローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 PCR反応液の 10 /z L相当量を 1%ァガロースゲル電気泳動に供 した。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。
[0262] まとめ:
図 26〖こ示すよう〖こ、いずれのサイズの PCR反応、伸長時間においても PCNA13 の添加により反応速度の促進、増幅量の増大の効果が観察された。
[0263] 以上の実施例に示したように, PCNA13は代表的な市販の 7種の PCR用 DNAポ リメラーゼに対して優れた伸長促進活性を発揮することが証明された。また,使用した PCNA13は, Pyrococcus furiosus由来の PCNAの変異改良体である力 Pyroc
occus furiosus由来の DNAポリメラーゼだけでなく,菌種の異なる DNAポリメラー ゼに対しても有効であることが示された。
[0264] 3 :KOD— PCNA.RFCタンパク質の調製
Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来の PCNA変異体タンパク質標 品と RFCタンパク質標品は大腸菌内でこれらの遺伝子を大量発現させ、発現菌体よ りタンパク質を精製することにより調製した。
[0265] 3. 1 :菌体入手 'ゲノム DN A調製
Thermococcus kodakaraensis KOD1株 ¾JCM (JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS)より lOmLの培養液として入手した (JCM NO. 12 , 380)。この培養液を 6, OOOxg, 15min, 4°Cで遠心し菌体を回収した。回収した 菌体は lmLの TBSバッファー(50mM Tris— HC1 pH7. 2, 150mM NaCl)に けん濁、洗浄し、 15, OOOxg, 5min, 4°Cの遠心操作にて回収した。
[0266] 沈殿物を 100 /z Lの溶菌バッファー(50mM Tris—HCl'pH8. 0, 50mM EDT Α·ρΗ8. 0, 0. 5% SDS)〖こ溶解し、 50°Cにて 3時間のインキュベーション反応を 行なった。その後、この反応液に 100 Lフエノール Zクロ口ホルム溶液を添カ卩した。 さらにこの溶液を 15, OOOxg, 5min,室温にて遠心分離操作を行い、上清約 100 Lを回収した。この上清溶液を Mag Extractor Genomeキット(東洋紡)を利用し、 同操作マニュアルに従 、ゲノム DNAを回収した。
[0267] 3. 2 :KOD— PCNAの調製
3. 2. l :KOD— PCNA遺伝子クロー-ング
KOD— PCNA遺伝子は、 Genbank ID BD182828 (配列番号 31および配列 番号 32)を参考とし、 PCRを利用したクローユング(図 27)によって獲得した。以下に 詳細を説明する。
[0268] 3. 2. 1. 1 : PCRプライマー
KOD— PCNA遺伝子の増幅用には、 KOD— PCNA— F、 KOD— PCNA— Rを 使用した。このプライマーセットは PCNA遺伝子の開始メチォニンから終止コドンに 相当する領域を増幅し、さらに 5'側に制限酵素 Ndel認識部位、制限酵素 Xhol認識 部位が付加するように設計されて!、る。それぞれのプライマーの配列は表 17 (配列
番号 33および 34)に示した。
[表 17]
表 1 7 KO D— P C NAクローニング用 P C Rプライマ一
[0270] 3. 2. 1. 2 : PCR反応液組成
PCR反応液は、次の組成で行った。(50 L反応液系への添加量)
铸型 DNA*: lOOng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq**: 1. 25U
lOxExTaqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*铸型 DNA: 3. 1で調製したゲノム DNA、 **EX Taq :タカラバィォ社製)
[0271] 3. 2. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0272] 3. 2. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 750bp付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0273] 3. 2. 1. 5 : PCR産物のサブクロー-ング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上
に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 μ gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0274] 3. 2. 1. 6 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には KOD— PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5,端に制 限酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認 された。 KOD— PCNA遺伝子のオープンリーディングフレームを保持した本プラスミ ドベクターを pUC/KPCと命名することとした。
[0275] 3. 2. 2 :KOD—PCNA遺伝子発現プラスミド構築
pUCZKPCを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し PCNA遺伝子断片を調製した 。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 KOD— PCNAの発現ベクターを作製した。
[0276] 3. 2. 2. 1 : PCNA DNA断片調製
pUCZKPCを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0277] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0278] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断を行なった。反応 終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 KOD— PCNA遺伝子に相当する バンド(約 750bp付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら PCNA DNA断片の精製を行った。
[0279] 3. 2. 2. 2 :pET—21a発現ベクター
pET— 21aベクター DNA (米国ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと X hoiで二重切断した。
[0280] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0281] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0282] 3. 2. 2. 3 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た KOD—PCNA DNA断片(lOOng)と pET— 21a DNA断片(50ng )を DNA Ligation Kit V2 (タカラノィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0283] PCNA DNA断片: lOOng
pET- 21a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0284] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地(100 μ gZmLアンピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0285] 3. 2. 2. 4 :シーケンシングによる配列確認
上記糸且換えプラスミドにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に KOD— PCNA遺伝子のオープンリーデイン グフレームが完全に挿入されて 、た。この KOD— PCNA遺伝子を保持するプラスミ ドを pKPCNAと呼ぶこととした(図 28)。
[0286] 図 28に示すように、 pKPCNAでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rbs
(リボソーム結合部位)、 PCNA遺伝子 ORF (オープンリーディングフレーム)、 T7タ 一ミネ一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが PCNA遺伝子を大量 発現することが期待された。
[0287] 3. 2. 3 :KOD— PCNA遺伝子への変異導入
より高機能な PCNAを作製する目的で KOD— PCNAに対してアミノ酸置換を行な つた。アミノ酸置換は当該アミノ酸をコードする塩基を置換することにより行った。表 1
8に示す変異部位にアミノ酸変異を導入した。
[0288] [表 18]
表 1 8 K O D— P C N A変異導入部位
[0289] 3. 2. 3. 1 :置換変異導入
PCNA遺伝子への変異導入は変異を導入するプラスミドと変異導入用オリゴペア( 表 19、酉己列番号 35〜38)、 Quik Change II Site -Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社)を利用し、同操作マニュアルに従って行った。
[0290] [表 19]
表 1 9 K O D— P C N A変異導入用プライマー
[0291] 変異導入後にはシーケンシングにより DNA配列を確認し、目的部位に変異が導入 され、目的以外の部位には変異がない点を確認した。以下に各 PCNA変異体設計 について説明する。
[0292] KOD-PCNA01
Pyrococcus friosusの PCNAについての報告(非特許文献 6)によれば、野生型 の Pfu— PCNAを大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来
の開始 Metからの翻訳タンパク質以外に、 N末端が 73残基目力 翻訳が開始される 約 20kDaのタンパク質が副産物として生成され、 目的タンパク質生産の効率を落と すことが報告されて 、る。この約 20kDaのタンパク質は 73残基目の Metを Leuに 1 残基置換した場合、生成が抑えられ、作製された Pfu— PCNAは、野生型 PCNAタ ンパク質とかわらな 、性質を有して 、る事が併せて報告されて 、る。 KOD - PCNA と Pfu— PCNAはいずれも全長が 249アミノ酸残基で、完全一致するアミノ酸は 84. 3%、さらに性質が類似するアミノ酸を加味すると非常に高い相同性を有する。このよ うな状況を踏まえて、 KOD— PCNAについて 73残基目の Metを Leuに 1残基置換 した KOD— PCNAの M73Lの変異を準野生型として本明細書では取り扱う。
[0293] この KOD— M73Lの変異体を KOD— PCNA01と命名し、変異体を作製した。 K OD— PCNA01の作製は、铸型プラスミドを pKPCNAとし変異導入用オリゴペア (K OD— M73L— Fと KOD— M73L— R)を使用して行った(表 19参照、配列 35、配 列 36)。
[0294] KOD-PCNA13
Pyrococcus friosusの PCNAの場合、 143残基目のアミノ酸残基は単量体どうし が三量体を形成する際に、イオンペアネットワーク形成に関わる事が知られている( 非特許文献 9)。我々のグループは、上記実施例 1〜2の通り、この位置のアミノ酸残 基の電気的性質を逆にかえた変異型 PCNAが DNA合成に際し DNAポリメラーゼ の反応を飛躍的に促進することを発見している。 Thermococcus kodakaraensis の場合、この位置に相当するアミノ酸は野生型ではグルタミン酸 (酸性アミノ酸)であ る力 これをアルギニン (塩基性アミノ酸)へ置換することによりこの部位のアミノ酸の 電気的な性質を全くかえる事が可能である。 DNA合成時に添加した場合の影響を 調べる目的でこの変異体を作製した。具体的には、 KOD— PCNA01産生プラスミド を铸型として、 KOD— E143R—Fと KOD— E143R—Rの変異導入用オリゴを使用 して作製した (表 19、配列 37、 38)。
[0295] 3. 2. 3. 2 :KOD— PCNA発現株の作製
以上のように取得した変異型 PCNA発現プラスミドベクターにより大腸菌 BL21 C odonPlus (DE3) RIL (ストラタジーン社)を形質転換し、各変異遺伝子の発現大腸
菌株を得た。
[0296] 3. 2. 4 :KOD— PCNAタンパク質精製
図 29に示すように、菌体を遠心回収し (S291)、菌体破砕 (超音波破砕、 S292)、 5分間煮沸し (S293)、ポリエチレンィミン沈澱を行い(S294)、さらに硫安沈澱を行 い(S295)、イオン交換クロマトグラフィー(S296、カラムとして HiTrap Qを使用)、 ゲルろ過クロマトグラフィー(S297、 Superdex 200を使用)という処理により標品を 調製した。 SDS— PAGEによる確認ではいずれの標品についても 90%以上の純度 を確保できている。
[0297] 3. 2. 4. 1 :菌体培養と KOD— PCNA発現誘導
各変異 PCNA発現株を 1. 5リットル LB培地(50 μ gZmLアンピシリン含有)にて、 37°Cで振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3-0. 5の時期に終濃度 0. 1
600
mMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopyranoside)を添カ卩して 発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の菌体は遠心分離 (4°C 、 6, 000xg、 6分)によって回収した。
[0298] 3. 2. 4. 2 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (50mM Tris—HCl pH 8. 0, 0. 1M NaCl、 0. ImM EDTA、 10% グリセローノレ、 0. 5mM DT T)によりけん濁した。超音波処理により菌体を破砕した。
[0299] 3. 2. 4. 3 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0300] 3. 2. 4. 4 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン(SIGMA P— 3143)と NaClをそれぞれ終濃度 0 . 2% (w/v) , 0. 58Mになるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠 心分離(18, 500 X g, 25分, 4°C)して,上清を回収した。
[0301] 3. 2. 4. 5 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。この溶液に、硫安を 80%飽和させた 50mM Tris-
HCl (pH8. 5)ノ ッファー 80mLを添加して、遠心分離(30, 000 x g, 25分, 4 °C)により沈澱を回収した後、この沈澱をバッファー C (50mM Tris-HCl pH8. 0 , 0. 1Μ NaCl)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して透析を行った。
[0302] 3. 2. 4. 6 :イオン交換クロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルは AKTAexplorer 10S (アマシャムバイオサイエンス社)を使 用して、イオン交換クロマトグラフィー(HiTrap Q;アマシャムバイオサイエンス社)を 実施した。溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、 流速は lmLZminとし、 KOD - PCNA01と KOD - PCNA13のピーク画分を得た
[0303] 3. 2. 4. 7 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Qイオン交換クロマトグラフィーでのピーク画分をそれぞれ Superdex 20 0 (アマシャムバイオサイエンス社)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに 精製し、以降のアツセィ用標品とした。
[0304] 得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大きさおよび 良好に精製されたことが確認された(図 30)。
[0305] 3. 3 :KOD— RFCの調製
Thermococcus kodakaraensis KODの RFCは 2つのサブユニット RFCLと RF CSから構成されており、ゲノム上ではタンデムに位置している。 RFCタンンパク質標 品の調製にあたっては、 RFCLと RFCS遺伝子は個別に発現ベクター上にのせ、同 一宿主内に各々の発現ベクターを導入し、同時に発現させる方法を用いた。発現プ ラスミドの作製にあたっては非特許文献 10を参照した。以下に詳細を示す。
[0306] 3. 3. l :KOD—RFCLの遺伝子クローユングと発現プラスミド構築(図 31)
KOD— RFCL遺伝子(Genbank ID ; 182, 830)は KODゲノムを铸型とした PC Rにより得た (配列番号 39)。
[0307] 3. 3. 1. 1 : PCRプライマー
PCR用プライマ一として、 KOD— RFCL Fプライマーと KOD— RFCL Rプライ マーを使用した (表 20 ;配列番号 40および 41)。クローユング操作の都合上、 KOD -RFCL - Fプライマーには制限酵素 Ndel認識部位、 KOD— RFCL— Rプライマ
一には制限酵素 Xhol認識部位をそれぞれ付加した。
[表 20]
表 2 0 K O D— R F C Lクローニング用プライマ一
[0309] 3. 3. 1. 2 : PCR反応液組成
PCRの铸型としては上記 3. 1で調製した KODゲノム DNAを使用した。 PCR反応は、次の組成で行った。(50 L反応系への添加量)
铸型 DNA; 100ng
プライマー;各 lOpmol
dNTP ;各 lOnmol
EX Taq*; l. 25U
10X EX Taqバッファー; 5 L
以上に滅菌蒸留水を添加して 50 μ Lとした。
( *タカラバィォ社製)
[0310] 3. 3. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °Clminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0311] 3. 3. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 1. 5kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0312] 3. 3. 1. 5 : PCR産物のサブクローユング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB
寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0313] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0314] 3. 3. 1. 6 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分には KOD—RFCL遺伝子のオープンリーディングフレームを保持し 5,端に制 限酵素 Ndel認識配列、 3 '端に制限酵素 Xhol認識配列が付加されて ヽる事が確認 された。このプラスミドを pUC118/KRFCLとした。
[0315] 3. 3. 1. 7 :KOD—RFCL発現プラスミド作製
PUC118ZKRFCLを制限酵素 Ndelと Xholで二重切断し RFCL遺伝子断片を調 製した。遺伝子断片は発現ベクターへ挿入し、 KOD— RFCLの発現ベクターを作製 した。
[0316] 3. 3. 1. 8 :RFCL DNA断片調製
pUC 118ZKRFCLを以下の反応系で制限酵素 Ndelと Xholで二重切断した。
[0317] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0318] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間、制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 1%ァガロースゲル電気泳動を行った、 KOD—RFCL遺伝子に相当する バンド(約 1. 5kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら RFCL DNA断片の精製を行った。
[0319] 3. 3. 1. 9 :pET— 29a発現ベクター
pET— 29aベクター DNA (ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと Xho
Iで二重切断した。
[0320] プラスミド DNA:
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Xhol : 5ユニット
[0321] 以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1%ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 29aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲル力 ら pET— 29a DNA断片の精製を行った。
[0322] 3. 3. 1. 10 :ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た KOD— RFCL DNA断片(lOOng)と pET— 29a DNA断片(50ng )を DNA Ligation Kit V2 (タカラノィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0323] RFCL DNA断片: lOOng
pET- 29a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0324] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(30 μ gZmLカナマイシン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地(30 μ gZmLカナマイシン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう 培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0325] 3. 3. 1. 11 :シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 29aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、いずれ のプラスミド DNAについてもマルチクロー-ング部位の Ndelと Xhol部分に KOD— RFCL遺伝子の ORF (オープンリーディングフレーム)が完全に挿入されていた。 K OD— RFCL遺伝子を保持するプラスミドを pKRFCLと呼ぶこととした(図 32)。
[0326] 図 32に示すように、 pKRFCLでは pET— 29aが保持する T7プロモーターから rbs (リボソーム結合部位)、 RFCL遺伝子のオープンリーディングフレーム、 T7ターミネ 一ターの順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが RFCL遺伝子を大量発現 することが期待された。
[0327] 3. 3. 2 :KOD—RFCSの遺伝子クローユングと発現プラスミド構築
非特許文献 10によれば、 KOD— RFCS遺伝子(Genebank ID : BD182, 829) は全長 2, 601塩基によってコードされ、インティンを 1個所保持し、 N端のェクスティ ンは 177塩基、 C端のェクスティンは 804塩基にコードされていることが報告されてい る(終始コドンは含まず)。配列表の配列番号 42に KOD—RFCSの塩基配列 (イン ティン部分を除去した成熟型配列)を示す。
[0328] 図 33に示したように RFCS発現ベクター作製にあたっては、まず、インティンを含む KOD—RFCS遺伝子の全長を PCR反応を利用してクローユングし(S331〜S334) 、その後、 2種のェクスティン断片を個別に PCR反応により増幅した後(S335〜336 )、インティンを除去し、 2種のェクスティンを結合した成熟型 RFCS (RFCSmとも呼 ぶ)を調製し、発現ベクターへ組み込んだ(S337〜S339)。
[0329] 3. 3. 2. 1 :インティンを含む RFCS遺伝子全長のクローユング
3. 3. 2. 1. 1 : PCRプライマー
PCRプライマーは KOD— RFCS— F、 KOD— RFCS— Rプライマー(表 21;配列 番号 43及び 44)を使用した。
[0330] [表 21] 表 2 1 K O D— R F C Sクローニング用プライマー
3. 3. 2. 1. 2 : PCR反応組成
PCRの铸型としては上記 3. 1で調製した KODゲノム DNAを使用した。
PCR反応液は、次の組成で行った。(50 L反応液系への添加量)
铸型 DNA: lOOng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0332] 3. 3. 2. 1. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72 °C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0333] 3. 3. 2. 1. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った後、紫外線照射下で 2. 6kb付近のバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0334] 3. 3. 2. 1. 5 : PCR産物のサブクローニング
精製した PCR産物は pUC118— HincIlZBAP、TaKaRa BKL Kit (いずれも タカラバィォ社)を利用して操作マニュアルに準じてライゲーシヨン反応を行った。こ のライゲーシヨン産物で大腸菌 E. coli DH5 a (タカラバイオ社)を形質転換し、 LB 寒天プレート(100 μ g/mLアンピシリン、 IPTG、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養して、 PCR産物を保持する大腸菌クローンを得た。
[0335] 寒天プレート上の白色を呈する大腸菌コロニーを LB液体培地(100 μ gZmLアン ピシリン含有) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製 した。
[0336] 3. 3. 2. 1. 6:シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pUC 118の制限酵素 Hindi認識部位に挿入された DNA配列を調べた。その結果、挿入 部分は RFCS遺伝子の 2種のェクスティンの塩基配列を完全に含んで 、た。このプ ラスミドを pUC/KRFCSとした。
[0337] 3. 3. 2. 2 :ェクスティン結合操作 (インティン除去操作)
3. 3. 2. 2. 1 :ェクスティン結合用プライマー
N端側ェクスティン用 PCRプライマーとして、 RFCS— Nde— Fプライマー、 RFCS —Exl—Rプライマー(表 22 ;配列番号 45及び 48)を準備した。また、 C端側ェクス ティン用 PCRプライマーとして、 RFCS— Ex2— Fプライマー、 RFCS— Sal—Rプラ イマ一(表 22;配列番号 47及び 46)を準備した。クローユングを容易にする目的で R FCS- Nde - Fプライマーには制限酵素 Ndel配列、 RFCS -Sal- Rプライマーに は制限酵素 Sail配列を 5'端に付加してある。また、 2種のェクスティン断片を PCR反 応により融合する際に利用する相補的な配列を RFCS— Exl—Rプライマーと RFC S— Ex2— Fプライマーに設けた。
[0338] [表 22] 表 2 2 K O D一 R F C sェクスティン結合用 (ィンテイン除去用) プライマ プライマ一名 プライマ一配列 5, -→3 配列番号
RFCS-Nde-F cca tat gtc cga gga agt gaa gga ag 45
RFCS-Sal-R gtc gac tea ctt acc cat aat cgt gaa ctg 46
RFCS - Ex2- F cgt egg gaa gac aac cgc tgc act ggc ttt ag 47
RFCS-Exl-R cag egg ttg tct tec cga cgc egg gtg gc 48
[0339] 3. 3. 2. 2. 2 : PCR反応液組成
2種のェクスティン増幅のための PCR反応は、次の組成で行った。(50 /z L反応液 系への添加量)
pUC/KRFCS DNA: 50ng
プライマー: 各 lOpmol
dNTP : 各 lOnmol
EX Taq*: 1. 25U
ΙΟχ EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 50 μ Lとした。
(*タカラバィォ社製)
[0340] 3. 3. 2. 2. 3 : PCR反応条件
上記で調製した反応液を PCR装置を使用して、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72
°C · lminを 30サイクル繰り返すプログラムで PCR反応を行った。
[0341] 3. 3. 2. 2. 4 : PCR産物の精製
上記 PCR反応産物を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイド染 色を行った。 RFCS— Nde— Fプライマー、 RFCS— Exl— Rプライマーセットの PC R産物では約 180塩基のバンドが、 RFCS— Ex2— Fプライマー、 RFCS— Sal— R プライマーセットの PCR産物では約 800塩基のバンドが観察された。紫外線照射下 でそれぞれのバンドを含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用して同操作マニュアルに 従 、ゲル中の PCR産物の精製を行った。
[0342] 3. 3. 2. 2. 5 : PCR融合反応
2種のェクスティン PCR産物を 1チューブ内で 1組のプライマーセットで PCR反応に 供する事で 2種の断片を融合し、成熟型 RFCSをコードする遺伝子断片を得た。以 下に詳細を示す。
[0343] 2種のェクスティン PCR産物のアニーリング反応を次の組成で行なった。
N端ェクスティン断片: 2 μ L· (50ng相当)
C端ェクスティン断片: 2 μ L· (50ng相当)
10x EX Taqバッファー: 5 L
以上に滅菌水を添カ卩して 44. 5 Lとした。
上記を 95°C · 3min加熱し、 37°Cまで 30分間でゆっくりと冷却した。
[0344] 上記反応液に以下を添加する
dNTP : 5 (各10 01)
EX Taq* : 0. 5 μ L· (2. 5U)
これを 72°C · lOmin反応させる。
(*タカラバィォ社製)
[0345] 上記に、 RFCS— Nde— Fプライマーと RFCS— Sal— Rプライマーを各 lOpmol添 加し、 95°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · lminを 30サイクル繰り返すプログラム で PCR反応を行った。
[0346] 3. 3. 2. 2. 6 : PCR産物の制限酵素切断'精製
上記 PCR反応産物を定法に従い、エタノール沈澱精製した。精製した DNA断片 は制限酵素 Ndelと Sailで二重切断した。
PCR産物: 相当
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
以上に滅菌水を添加し 50 Lとし、 37°Cで 2時間制限酵素切断をおこなった。反 応終了後、 2%ァガロースゲル電気泳動を行った、 2種のインティンの融合断片 (成 熟型 RFCSをコードする配列)と想定されるバンド (約 lkb付近)を切り出し、 GFX P CR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエンス社) を使用し精製した。
[0347] 3. 3. 2. 2. 7 : pET— 21a発現ベクターの制限酵素切断
pET— 21aベクター DNA (ノバジェン社)を以下の反応により制限酵素 Ndelと Sail で二重切断した。
[0348] プラスミド DNA : 2 μ &
10X制限酵素バッファー:
制限酵素 Ndel : 5ユニット
制限酵素 Sail : 5ユニット
[0349] 以上に滅菌水を添加し 50 μ Lとし、 37°Cで 2時間静置した。反応終了後、 1 %ァガ ロースゲル電気泳動を行った、 pET— 21aベクター DNAの直線フォームに相当する バンド(約 5. 4kb付近)を切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purifica tionキット(アマシャムバイオサイエンス社)を使用、同操作マニュアルに従 、ゲルか ら pET— 21a DNA断片の精製を行った。
[0350] 3. 3. 2. 2. 8:ライゲーシヨン反応と形質転換
上記で得た 2種のインティンの融合断片 (成熟型 RFCSコード配列)と予測される約 lkbの DNA断片(lOOng)と pET—21a DNA断片(50ng)を DNA Ligation Ki t V2 (タカラバィォ社)を利用して以下の様に反応した。
[0351] lkbDNA断片: lOOng
pET- 21a DNA断片: 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 30分間反応した。
[0352] このライゲーシヨン産物(3 μ L)により 100 μ L大腸菌 E. coli BL21 (DE3) (ノバ ジェン社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(100 μ gZmLアンピシリン)上 に播種し 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレート上に形成された大腸菌コロニーの うち 3個を LB液体培地(100 μ gZmLアンピシリン) 3mL、 37°Cにて終夜振とう培養 し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0353] 3. 3. 2. 2. 9:シーケンシングによる配列確認
上記プラスミド DNAにっき、 DNAシーケンサーを使用してプラスミドベクター pET — 21aに挿入された DNA配列と挿入部位近傍の配列を調べた。その結果、マルチ クロー-ング部位の Ndelと Sail部分に 2種のェクスティンが結合した (インティンを除 去した)成熟型の RFCSmの配列(984塩基)が確認された (pKRFCSmと命名)。
[0354] 図 34に示すように、 pKRFCSmでは pET— 21aが保持する T7プロモーターから rb s (リボソーム結合部位)、成熟型 RFCS遺伝子のオープンリーディングフレーム、 T7 ターミネータ一の順に並んで ヽる事が確認された。本プラスミドが成熟型 RFCS遺伝 子を大量発現することが期待された。
[0355] 3. 3. 3 :KOD— RFC発現株の作製
pKRFCLと pKRFCSmで大腸菌 BL21— CodonPlus (DE3)— RILを同時に形 質転換し、アンピシリンとカナマイシンの二重選択で両方のプラスミドを保持する形質 転換体を選択し発現株を得た。
[0356] 3. 3. 4 :KOD— RFCタンパク質精製
図 35に示すように、菌体を遠心回収し (S351)、菌体破砕 (超音波破砕、 S352)、 5分間煮沸し (S353)、ポリエチレンィミン沈澱を行い(S354)、さらに硫安沈澱を行 い(S355)、ァフィ-ティークロマトグラフィー(S356、カラムとして HiTrap Heparin HPを使用)、ゲルろ過クロマトグラフィー(S357、 Superdex 200を使用)という処 理により標品を調製した。 SDS— PAGEによる確認では!、ずれの標品につ 、ても 90 %以上の純度を確保できて!/ヽる。
[0357] 3. 3. 4. 1 :菌体培養と発現誘導
上記の発現株を 1. 5リットル LB培地(50 μ gZmLアンピシリンおよび 30 μ g/mL カナマイシン含有), 37°Cにて振とう培養を行った。対数増殖期の OD が 0. 3 -0.
600
5の時期に終濃度 0. ImMとなるように IPTG (Isopropyl— β— D— thiogalactopy ranoside)を添加して発現誘導を行い、誘導後の培養を約 3時間行った。培養後の 菌体は遠心分離 (4°C、 6, 000xg、 6分)によって回収した。
[0358] 3. 3. 4. 2 :菌体破砕
遠心分離によって沈澱した菌体は 25mLのバッファー B (前出)によりけん濁した。こ れを超音波処理により菌体を破砕した。
[0359] 3. 3. 4. 3 :加熱処理
菌体破砕液を 5分間煮沸した後、遠心分離 (18, 500xg, 4°C, 25分)を行い、 上清を回収した。
[0360] 3. 3. 4. 4 :ポリエチレンィミン沈澱
上清液に対しポリエチレンィミン(SIGMA P— 3143)を終濃度 0. 18% (wZv)に なるように添カ卩し、氷上で 30分間撹拌した。この溶液を遠心分離(18, 500 X g, 25 分, 4°C)して,上清を回収した。
[0361] 3. 3. 4. 5 :硫安沈澱
上清 10mLあたり硫酸アンモ-ゥム 5. 61gを添加し (終濃度 80%)、氷上で 30分撹 拌し、タンパク質を沈澱させた。遠心分離(18, 500xg, 4°C, 25分)により沈澱を 回収した後、この沈澱をバッファー C (前出)に溶解し、おなじくバッファー Cに対して 透析を行った。
[0362] 3. 3. 4. 6 :ァフィユティークロマトクロマトグラフィー
透析したサンプルは HiTrap Heparin HPカラム(アマシャムバイオサイエンス社 )を使用して精製した。
[0363] 溶離条件は、 0. 1 -0. 8M NaCl/17. 5mLのリニアグラジェントとし、流速は 1 mLZminとし、ピーク画分を得た。
[0364] 3. 3. 4. 7 :ゲルろ過クロマトグラフィー
HiTrap Heparinァフィ-ティークロマトグラフィーでのピーク画分を Superdex 2
00 (前出)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製し、アツセィ用の標 品とした。得られた標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、標品の分子の大き さおよび良好に精製されたことが確認された(図 36)。
[0365] 4 :KOD— PCNA変異体の評価
上記で調製した PCNA変異体の DNA増幅系への効果、とくに PCR反応系への効 果を調べた。具体的には PCR反応系に PCNA変異体、 RFCを単独もしくは併用し て添加した場合、未添加の場合で PCR反応を行い、その反応産物を電気泳動に供 して標的領域の増幅状態を比較することで行った。 PCR反応に使用するポリメラーゼ としては市販されている 2種の PCR用 DNAポリメラーセ、 KOD DNA Polymeras e (東洋紡社)、 Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社)を使用した。
[0366] 4. l :KOD DNA ポリメラーゼに対する KOD— PCNAの添カ卩効果
KOD DNAポリメラーゼは好熱性古細菌 Thermococcus kodakaraensis KO D— 1株由来の DNAポリメラーゼである。 KOD DNAポリメラーゼはポリメラーゼ活 性の他に、強い 3,→5,Exonuclease活性(Proofreading活性)を持つ、いわゆるァ ルファ型 DNAポリメラーゼである。 3'→5' Exonuclease活性を保持するため、一般 的に使用されている Taq DNA Polymeraseより高い PCR Fidelityを示す。また 、 Pyrococcus属由来を主とした他のアルファ型の高正確性 PCR用酵素は、伸長速 度が遅いものが多いが、本酵素は伸長速度が非常に速いことが報告されている (非 特許文献 11)。
[0367] 4. 1. 1 :铸型 DNAと反応プライマー
铸型 DNAとしてはラムダ DNA(GenBank accession 02459)を使用した。 PC R増幅の標的配列としてはラムダ DNAの 23, 119番より 25, 142番の配列とした。こ の時使用した PCRプライマー配列は表 8に記載してあるが、別途表 23に示した。
[0368] [表 23] 表 2 3 P C Rアツセィ用プライマー
プライマー名 プライマ一配列 5 ' →3 ' 配列番号
F02 GTC GTT TCT GCA AGC TTG GC 25
R03 CCG AGA TAA AAA CAA ACC CGC 28
[0369] 4. 1. 2 :反応液組成
反応液の組成を表 24及び 25に示した。
[0370] [表 24]
表 2 4
[0371] [表 25]
表 2 5
* Buffer : 25mM Tri s-HCl ρΗ8. 0, 50mM NaCl, 50% Glycerol
[0372] 4. 1. 3 : PCRプログラム
上記反応液を以下の PCRプログラムにて反応させた。
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 15sec) 30cycles→4°Cで保持
[0373] 4. 1. 4 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 50 L反応液のうち 10 Lを 1%ァガロースゲル電気泳動に供し た。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、 図 37に示す。
[0374] 4. 1. 5 :結果
結果を図 37に示した。この実験条件では KOD DNAポリメラーゼのみでも良好な 伸長増幅が確認できる(レーン 1)。準野生型 KOD— PCNA01を添加した場合に反 応阻害が観察されるが(レーン 2) , RFCの添加量を増加すると阻害が回復し未添カロ の場合と同程度の伸長増幅が観察される(レーン 3、 4)。一方、 KOD—PCNA13を 添カ卩した場合、 KOD— RFCの添カ卩に依存しない良好な伸長増幅が観察され、この 効果はし力もアクセサリー蛋白質未添カ卩の場合や KOD— PCNA01に KOD— RFC を添加した場合よりすぐれて 、た。
[0375] 4. 2 : Pyrobest DNA ポリメラーゼに対する KOD— PCNAの添カ卩効果
Pyrococcus属由来の DNA合成酵素として市販されている Pyrobest DNA Pol ymerase (タカラバイオ社)を対象として各種 PCNA変異体の添加効果を PCR反応 の系を禾 IJ用して調べた。 Pyrobest DNA Polymeraseは、 Pyrococcus ' sp.由来 の 3,→5, exonuclease活性(proof reading活性)を有する而熱性 a型 DNAポリ メラーゼである。 Pyrococcus 'furiosus由来の Pfu DNAポリメラーゼゃ、 Vent D NAポリメラーゼと同等の正確性の高い増幅を行うのが特長である。
[0376] 4. 2. 1 :铸型 DNAと反応プライマー
上記 KOD DNAポリメラーゼの評価と同様の铸型 DNA、プライマーを使用した。
[0377] 4. 2. 2 :反応液組成
反応液の組成を表 26及び 27に示した。
[表 26]
表 2 6
[0378] [表 27]
表 2 7
*Buffer : 25mM Tris-HCl ρΗ8. 0, 50m NaCl, 50% Glycerol
[0379] 4. 2. 3 : PCRプログラム
上記反応液を以下の PCRプログラムにて反応さた。
94°C · lmin→ (98°C · 5sec→68°C · 1. 5min) 30cycles→4°Cで保持。
[0380] 4. 2. 4 :電気泳動
PCR反応終了後、 50 Lの PCR反応溶液に対して ΙΟχローデイングバッファー(G lycerol 50%、 Bromphenol BlueO. 4%、 Xylene Cyanol 0. 4%)を 5 L 添加、混合した後、 50 L反応液のうち 10 Lを 1%ァガロースゲル電気泳動に供し た。電気泳動マーカーとしてラムダ ZStylマーカー (東洋紡社)を使用した。結果を、 図 38に示す。
[0381] 4. 2. 5 :結果
結果を図 38に示した。この実験条件では Pyrobest DNAポリメラーゼのみでも伸 長増幅が確認できる(レーン 1)。準野生型 KOD— PCNA01を添加した場合に反応 阻害が観察されバンドが確認できないが(レーン 2) , RFCの添加量を増加すると阻 害が回復し未添加の場合と同程度の伸長増幅が観察される(レーン 3、 4)。一方、 K OD - PCNA13を添カ卩した場合は、 KOD—RFC未添カ卩時でも良好な伸長増幅が 観察され、この効果は他の 4種の条件よりも優れた伸長増幅を示した (レーン 5)。
[0382] 4. 3 :まとめ
上述の実験より KOD— PCNA13は代表的な 2種の PCR酵素に対して PCR反応 を促進する事が分かった。またこの反応は RFCを必要としないだけでなぐ野生型と RFCを同時添加した場合よりも促進活性が優れていた。以上の結果から, Pyrococ cus furiosus由来の Pし NA7こ . "な \, Tnermococcus kodakaraensis KOD 1株由来の PCNAでも同様の変異導入により優れた効果が得られることが証明され た。本発明の PCNA単量体の界面領域のアミノ酸残基の特定は, Pyrococcus fur iosus由来の PCNAにだけ限定して有効なものではなく,同様の構造的背景を持つ PCNAに応用できる発明であることが示された。
[0383] 5. Pfu— PCNA13添加反応時の忠実性測定
Pfu— PCNA13を PCR反応に添加した際の铸型忠実性に与える影響について、 市販の高忠実度型 PCR酵素である Pyrobest DNA Polymerase (タカラバイオ社 製、以下、単に「Pyrobest」と略記することがある。)を対象として検討した。 Pyrobes tは Pyrococcus属古細菌由来の DNAポリメラーゼで、 3,→5,ェキソヌクレアーゼ活 性を持ち、これがプルーフリーディング活性として機能して 、る。
[0384] 忠実性は PCR産物のシーケンスを調べ、铸型シーケンスと比較することにより求め た。概略を図 39に示した。まず、 Pyrobest単独もしくは Pfu— PCNA13を添カ卩して PCR反応を行 、(S 511)、増幅された DNA断片の末端を平滑ィ匕 ·リン酸ィ匕し (S512 )、この断片をプラスミドベクターにクローユングし (S513) ,大腸菌に導入しコロニー を単離、プラスミドを抽出する(S514, S515) 0各プラスミドの挿入配列の一部(500 bp)を DNAシーケンサーで調べ(S 516)、結果を铸型シーケンスと比較し、エラー発
生頻度を調べた (S517)。
[0385] 5. 1 : PCR反応
5. 1. 1 : PCR酵素と Pfu— PCNA13の組合せ
Pyrobest単独で PCR反応を実施した場合と Pyrobestに Pfu— PCNA13を添カロ して PCR反応を実施した場合について調査した。これらに対する対照の目的で TaK aRa Taq (タカラバイオ社製、以下、単に「Taq」と略記することがある。)単独での P CR反応についても調査した。 Taqは一般的に利用される Poll型の PCR酵素である 1S 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を持たず、同活性を保持するひ型 PCR酵素と比 較して忠実性は低 、とされて 、る。
[0386] 5. 1. 2 :铸型 '標的領域
PCR反応の铸型として、ラムダ DNA(Genbank accession 02459)を用い、 7 種の領域を調査対象とした。各領域のラムダ DNA上の位置、サイズ、各領域を増幅 するために用いたプライマーの組み合わせを表 28に、また各プライマー配列は表 29 に示した。
[0387] [表 28]
表 28
[0388] [表 29]
表 29
[0389] 5. 1.3: PCR反応液組成
PCR反応液は一般的な PCR反応液組成とした (表 30)。 PCR酵素として Pyrobest を使用する際には、添付バッファーである lOxPyrobest buffer II (組成未公表) を、 TaKaRa Taqを使用する際には添付バッファーである lOxPCR Buffer (100 mM Tris-Cl(pH8.3), 500mM KC1, 15mM MgCl )を使用した。 Pfu— PC
2
NA13添カ卩時の終濃度は 0.6ngZwL(0.3/zL)とし、未添加の場合は滅菌水を 同体積 (0.3 /zL)添カ卩した。
[0390] [表 30]
表 30
1 ) 10x Buffer ; 10xPyrobest buf ferll (Pyrobest DNA polymearase使用時)、もし <は lOx PCR Buffer (TaKaRa Taq使用時)
2) PCNA13の原液;農度; 100ng/pL
[0391] 5. 1. 4 : PCRプログラム
Pyrobest単独の場合
(98°C · 10sec→68°C · 2. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
Pyrobest + Pfu - PCNA13の場合
(98°C · 10sec→68°C · 1. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
Taq単独の場合
(94°C · 30sec→55°C · 30sec→72°C · 1. 5min) 30Cycles→4°Cで保持
[0392] 5. 2 : PCR産物の末端平滑化反応'精製
上記 PCR反応により得られた各 PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動に供しェ チジゥムブロマイド染色を行った後、 目的サイズの DNA断片を含むゲルを切り出し、 GFX PCR DNA and Gel Band Purificationキット(アマシャムバイオサイエ ンス社)を使用して同操作マニュアルに従いゲル中の DNA断片の精製を行った。精 製した DNA断片は TaKaRa BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit) ( タカラバィォ社製)を利用し、同キットマ-ユアルに従い、末端平滑化'リン酸化反応 に供した。
[0393] 5. 3 : PCR産物のクロー-ングベクターへの挿入
末端平滑化 ·リン酸化処理した DNA断片 (50ng)と制限酵素 Hindi切断 BAP処 理済み DNA(pUC118 Hinc Π/ΒΑΡ·タカラバィォ社製)(50ng)を以下の通り
ライゲーシヨン反応に供した。
末端平滑化'リン酸化処理済 DNA断片: 50ng
PUC118 Hinc II/BAP : 50ng
DNA Ligation kit V2 酵素液: 5 L
以上に滅菌水をカ卩えて 10 Lとし、 16°Cで 60分間反応した。
[0394] 5. 4 :大腸菌コロニー単離 ·プラスミド抽出
上記ライゲーシヨン産物(3 L)により 100 L大腸菌 E. coli JM109 (タカラバィ ォ社)を形質転換し、大腸菌液を LB寒天プレート(100 g/mLアンピシリン、 IPTG 、 X— GAL各 40 μ g/mL含有)上に播種し、 37°Cで一晚静置培養した。寒天プレー ト上の白色を呈する大腸菌コロニーを TB液体培地(100 μ g/mLアンピシリン含有) 1. 5mL、 37°Cにて終夜振とう培養し、定法に従いプラスミド DNAを調製した。
[0395] 5. 5 :挿入配列のシーケンス
抽出したプラスミドを铸型とし, DNAシーケンサーを使用して DNA配列を解析した
[0396] 挿入された DNA断片(PCR増幅断片)のうちの 500bpの配列を解析対象とした。
[0397] 5. 6 :オリジナル配列と比較
結果を表 31に示した。表中の各用語は以下の通りである。
「フラグメント 」; PCR反応標的領域の識別番号。
「Enzyme, APJ; PCR反応時の酵素と Pfu—PCNA13の組合せ。
「ラムダ DNA Position ; 7種の PCR増幅断片のうち解析対象となった塩基配列 の位置を示す。
「Sample」;シークェンス解析対象となったプラスミド数 (すなわち、 PCR増幅断片 数)を表す。
「Base」;シークェンス解析の対象となった塩基数。
「ND」;シークェンシングデータのノイズ等で解読不可能であった塩基数。 「A11」;「ND」以外の解読可能であった総塩基数。
「Error」;総塩基数のうち複製エラーが確認された塩基数。
「Error rates];解読できた総塩基数「 All」に対する、複製エラーが確認された塩
基数「Error」の割合,
[0398] [表 31] 表 31
Error rates (1 /base) 1/73,975 1/48.870 1/2,240
[0399] Pyrobest単独の場合、 592サンプルを解析したところ、総計 295, 901basesに対 して複製エラーは 4basesと!、う結果(Error ratesは 74kbあたり lbase)が得られた 。 Pyrobestに Pfu— PCNA13を添カ卩した場合, 489サンプルを解析したところ、総 計 244,351basesに対して複製エラーは 5basesという結果が得られた(Error rate sは 49kbあたり lbase)。Taqの場合, 538サンプルを解析したところ,総計 268,856 basesに対して複製エラーは 120basesという結果(Error ratesは 2. 2kbに lbase) が得られた。
[0400] 上記の 3種の試験群で比較すると, Taqに比べて, Pyrobest単独、 Pyrobest+PC NA13添カ卩の 2種は Error ratesが 1桁低ぐ両グループ間の複製忠実度に明確な 差があることが観察された。
[0401] 一方,後者の 2種の反応(Pyrobest単独と Pyrobest + PCNA13添加)の間での 比較に関しては, Error ratesに 1. 5倍の差はあるものの,複製エラー数が 4 (Pyro best単独)と 5 (Pyrobest + PCNA13添加)であり,有意な差は検出されなかった。 このデータからは, PCNA13の添カ卩により忠実度に明確な差が生じるかは不明だが ,その差は小さく,少なくとも極端に悪ィ匕することはないと考えられる。図 14から図 16 の実施例に示すとおり,高忠実度型 PCR酵素である Pyrobestの伸長能を飛躍的に 向上させる一方で,忠実度面でも Pol I型 PCR酵素である Taqよりもはるかに良いレ
ベルを維持して 、ることは確かであり,本発明の PCNAの優秀性が証明された。 産業上の利用可能性
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特に DNA合成に関 わる技術関連において有用である。
配列表フリーテキスト
配列番号 1 : Pfu-PCNA
配列番号 2 : Pfu-PCNA
配列番号 3 : primer: Pfu-PCNA-F
配列番号 4 : Primer: Pfu-PCNA-R
配列番号 5 : primer: Pfu_M73L-F
配列番号 6 : primer: Pfu_M73L-R
配列番号 7 : primer: Pfu— D143A— F
配列番号 8 : primer: Pfu— D143A— R
配列番号 9 : primer: Pfu_R82C-F
配列番号 10 primer: Pfu_R82C-R
配列番号 11 primer: Pfu— D143R— F
配列番号 12 primer: Pfu— D143R— R
配列番号 13 Pfu-RFCL
配列番号 14 Pfu-RFCL
配列番号 15 primer: RFCL― F primer
配列番号 16 primer- RFCL— R primer
配列番号 17 Pfu-RFCS
配列番号 18 Pfu-RFCS
配列番号 19 primer RFCS -F primer
配列番号 20 primer RFCS -R primer
配列番号 21 : primer RFCSF1 primer
配列番号 22 : primer RFCSF2 primer
配列番号 23 : primer RFCSR2 primer
配列番号 24: primer: RFCSR1 primer 配列番号 25: primer: F02
配列番号 26: primer: Fll
配列番号 27: primer: F24
配列番号 28: primer: R03
配列番号 29: primer: R14
配列番号 30: primer: R16
配列番号 31: KOD- PCNA
配列番号 32: KOD- PCNA
配列番号 33: primer: KOD— PCNA- -F 配列番号 34: primer KOD— PCNA- -R 配列番号 35: primer KOD— _M73L- -F 配列番号 36: primer KOD— _M73L- -R 配列番号 37: primer KOD— — E143R F 配列番号 38: primer KOD— — E143R R 配列番号 39: KOD— RFCL
配列番号 40: primer KOD- RFCL- -F 配列番号 41: primer KOD- RFCL- -R 配列番号 42: KOD— RFCS
配列番号 43: primer : KOD- RFCS- -F 配列番号 44: primer : KOD- - RFCS- -R 配列番号 45: primer : RFCS -Nde- F 配列番号 46: primer : RFCS -Sal-R 配列番号 47: primer : RFCS -Ex2- F 配列番号 48: primer : RFCS — Exl— R 配列番号 49: primer F09
配列番号 50: primer F14
配列番号 51: primer F16
配列番号 52: primer F19
配列番号 53·. primer F23
配列番号 54: primer F25
配列番号 55: primer R04
配列番号 56: primer Rll
配列番号 57: primer R15
配列番号 58: primer R17
配列番号 59: primer R21
配列番号 60: primer R25
配列番号 61: primer R27
配列番号 62: primer: Pfu_一 D143K一 F 配列番号 63: primer: Pfu_一 D143K一 R 配列番号 64: primer: Pfu_一 D143H一 F 配列番号 65: primer Pfu_一 D143H一 R 配列番号 66: primer Pfu_一 R109E- - F 配列番号 67·. primer Pfu_一 R109E- -R 配列番号 68: primer Pfu_一 D147R一 F 配列番号 69: primer Pfu_一 D147R一 R 配列番号 70: primer : Pfu_一 E139A一 F 配列番号 71: primer : Pfu_一 E139A一 R 配列番号 72: primer : Pfu_一 E139R一 F 配列番号 73: primer : Pfu_一 E139R一 R