JPH09511643A

JPH09511643A - バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH09511643A
Application number: JP7525895A
Authority: JP
Inventors: リッグス，マイケル・ガース; シバラム，マソール; トゥドール，スターラ・ダイアン
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1997-11-25
Also published as: US6100078A; EP0699760A1; AU694952B2; CA2186021A1; US5874282A; AU2277195A; WO1995027067A1; US6066483A; CA2186021C

Abstract

(57)【要約】バチルス・サーモフィルス由来の組み換えＤＮＡポリメラーゼ酵素からなる組成物およびその発現方法。さらに本発明は、組み換えＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素の精製方法、生化学的反応を行うのに適した形態の該精製酵素を含有する組成物、および精製酵素の使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製ＤＮＡポリメラーゼ本願は、１９９４年４月１日出願の第０８／２２２,６１２号の一部継続出願である１９９４年９月１６日出願の第０８／３０７,４１０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、グラム陽性細菌バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus）由来の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素に関する。これらの酵素は、配列決定および核酸増幅手順のごとき鋳型により指向される核酸鎖の合成を必要とする生化学的手順において有用である。さらに本発明は、これらの酵素の製造方法および使用方法に関する。本発明の背景ＤＮＡポリメラーゼ酵素は天然に存在する細胞内酵素であり、鋳型分子を用いて核酸鎖を複製して相補的核酸鎖を作るために細胞によって使用される。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの伸長末端の３'ヒドロキシル基とヌクレオチド三リン酸の５'ホスフェート基との間の結合形成を触媒する。通常には、これらのヌクレオチド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸( Ａ)、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシチジン三リン酸（Ｃ）およびデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）から選択される。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼは、修飾された、または変化しているバージョンのこれらの核酸を取り扱うことができる。ヌクレオチドが添加される順序は、ＤＮＡ鋳型鎖との塩基対形成により決定される。かかる塩基対形成は、「規則的な」水素結合（ＡとＴヌクレオチドとの間、およびＧとＣヌクレオチド間の水素結合）により行われるが、Ｇ：Ｕ塩基対形成のごとき不規則な塩基対形成が当該分野において知られている。例えば、アダムス（Adams）ら、ザ・バイオケミストリー・オブ・ザ・ヌクレイック・アシッズ（The Biochemistry of the Nucleic Acids）、１４〜３２頁（第１１版、１９９２年）参照。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のインビトロでの使用は、ｃＤＮＡ合成ならびにＤＮＡ配列決定（サムブルック（Sambrook）ら、（第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laborator y Press）、１９８９年）参照、参照により本明細書に記載されていると見なす）、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき方法による核酸の増幅（ムリス（Mullis）ら、米国特許第４,６８３,１９５号および第４,８００,１５９号、参照により本明細書に記載されていると見なす）、およびＲＮＡ転写により媒介される増幅方法（例えば、カシアン（Kacian）ら、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０１３８４号、該出願は本願と所有者が共通であり、参照により本明細書に記載されていると見なす）を包含する種々の生化学的応用において、近年、より通常となっている。ＰＣＲのごとき方法は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の利用によるプライマー伸長サイクルを利用し、次いで、得られた２本鎖核酸の熱変性を行って別のラウンドのプライマーのアニーリングおよび伸長を行う。鎖の変性に必要な高温が多くのＤＮＡポリメラーゼの不可逆的不活性化を引き起こすため、約３７℃ないし４２ ℃よりも高温で活性を保持することのできるＤＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素）の発見および使用は、経費および労働効率における利点を提供する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Thermus aq uatics）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、およびバチルス（Bacillus）、サーモコッカス（Thermococcus）、スルフォブス（Sulfobus）、ピロコッカス（Pyrococcus）属を包含する多くの耐熱性生物（これらに限らない）において見い出されている。ＤＮＡポリメラーゼをこれらの耐熱性生物から直接精製することができる。しかしながら、まず、組み換えＤＮＡ法により該酵素をコードしている遺伝子を多コピー発現ベクター中にクローン化し、酵素を発現できる宿主細胞中にベクターを挿入し、ベクター含有宿主細胞を培養し、次いで、酵素を発現した宿主細胞からＤＮＡポリメラーゼを抽出することにより、ＤＮＡポリメラーゼ収率の実質的増加を得ることができる。現在のところ特徴づけられている細菌のＤＮＡポリメラーゼは、これらの酵素を２つの群に分けることとなる類似性および相違のある種のパターンを有している。遺伝子がイントロン−介在非コーディングヌクレオチド配列を有するもの（クラスＢのＤＮＡポリメラーゼ）と、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がイー・コリ（ E.coli）・ＤＮＡポリメラーゼＩにおおまかに類似していてイントロンを含まないもの（クラスＡのＤＮＡポリメラーゼ）とがある。「非コーディング」は、成熟蛋白のアミノ酸残基をコードしていてこれに対応している３'−ヌクレオチドコドンを含まない配列における核酸配列からなるヌクレオチドを意味する。イントロンは、真核高等生物の遺伝子において最も頻繁に見いだされるが、古細菌のごとき下等生物においても見いだされる。耐熱性生物由来のクラスＡおよびクラスＢのいくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがクローン化され発現されている。クラスＡの酵素では：ロイヤー（Lawyer ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、第２６４巻６４２７〜６４３７頁（１９８９年）およびゲルフンド（Gelfund）ら、米国特許第５,０７９,３５２号にはサーマス・アクアティクス由来の全長の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）のクローニングおよび発現が報告されている。ロイヤーら、ＰＣＲ・メソッズ・アンド・アプリケイションズ（PCR Method s and Applications）、第２巻：２７５〜２８７頁（１９９３年）、およびバーネス（Barnes）、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８８（１９９２年）には、同じＤＮＡポリメラーゼの切断バージョンのクローニングおよび発現が開示されており、一方、サリバン（Sullivan）、ＥＰＯ公開０４８２７１４Ａ１（１９９２年）には、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの変異バージョンのクローニングが報告されている。アサクラ（Asakura）ら、ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（J.Ferment.Bioeng.）（日本）、第７４巻：２６５〜２６９頁（１９９３年）には、クローン化され発現されたサーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼが報告されている。ゲルフンド（Gelhund）ら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６２０２（１９９２年）には、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）由来の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが開示されている。サーマス・フラブス（Thermus flavus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがアフメツジャノフ（Akhmetzjanov）およびバヒトフ（ Vakhitov）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Asids Res.）第２０巻：５８３９頁（１９９２年）により報告された。ウエモリ（Uemori）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第１１３巻：４０１〜４１０頁（１９９３年）およびＥＰＯ公開０５１７４１８Ａ２（１９９２年）には、耐熱性細菌バチルス・カルドテナックス（Bacillu scaldotenax）由来のＤＮＡオイメラーゼのクローニングおよび発現が報告されている。イシノ（Ishino）ら、日本国特許出願平４［１９９２年］−１３１４００（１９９３年１１月１９日公開）には、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼのクローニングが報告されている。Ｂクラスの酵素では：コーム（Comb）ら、ＥＰＯ公開０４５５４３０Ａ３（１９９１年）、コームら、ＥＰＯ公開０５４７９２０Ａ２（１９９３年）、およびパーラー（Perler）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.）（米国）、第８９巻：５５７７〜５５８１頁（１９９２年）により、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の組み換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが報告された。スルフォロブス・ソロファタリウス（Sulfolobus solofatarius）由来のクローン化された耐熱性ＤＡＮポリメラーゼが、ピサニ（Pisani）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第２０巻：２７１１〜２７１６頁（１９９２年）およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５６９１（１９９３年）に開示されている。ピロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）の耐熱性酵素はウエモリ（Uemori）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第２１巻：２５９〜２６５頁（１９９３年）に開示されており、一方、コームら、ＥＰＯ公開０５４７３５９Ａ１（１９９３年）に開示されているように組み換えＤＮＡポリメラーゼがピロコッカスの種から誘導された。「耐熱性」は、酵素が、３７℃ないし４２℃より高い温度において活性最適温度を保持することを意味する。好ましくは、本発明酵素は、約５０℃ないし７５ ℃；より好ましくは５５℃ないし７０℃；最も好ましくは６０℃ないし６５℃の間の活性最適温度を有する。多くの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ以外の活性を有する。これらは、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性および／または３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を包含しうる。５'−３'および３'−５'エキソヌクレアーゼは当業者によく知られている。３'−５'エキソヌクレアーゼ活性は、含まれている可能性のある不正な塩基を除去することにより、新たに合成された鎖の正確さを改善する。かかる活性が低いかまたはこれを有しないＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを包含することが報告されており（ロイヤーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２６４巻：６４２７〜６４７３頁）、それらはプライマー伸長鎖中へのヌクレオチド残基の取り込みにおいてエラーを起こす傾向がある。ＤＮＡ複製がプライマー伸長サイクルの数に関してしばしば幾何学的である核酸増幅手順のような適用において、かかるエラーは、核酸増幅生成物（アンプリコン（Amplicon））の配列の不均一性のごとき重大な人為的な問題を引き起こす可能性がある。よって、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性は、かかる目的に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの望ましい特性である。対照的に、しばしばＤＮＡポリメラーゼ酵素に存在する５'−３'エキソヌクレアーゼ活性は、特定の適用例においてはしばしば望ましくない。なぜなら、該活性は、保護されていない５'末端を有する核酸（プライマーを包含する）を消化するからである。よって、弱体化した５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有するか、またはかかる活性を有しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも、生化学的応用に関して酵素の望ましい特性である。種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素がすでに記述されており、そこでは、この目的を達成する修飾がＤＮＡポリメラーゼに導入されている。例えば、イー・コリのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを、該ホモザイム（homozyme）の蛋白分解フラグメントとして得ることができ、該フラグメントにおいては蛋白を支配する５'−３'エキソヌクレアーゼ活性のドメインが除去されている。クレノウフラグメントはやはりポリメラーゼ活性および３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を保持している。バーネスの上記文献およびゲルフンドらの米国特許第５,０７９,３５２号において、５'−３'エキソヌクレアーゼ欠損組み換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼが製造されている。イシノら、ＥＰＯ公開０５１７４１８Ａ２において、バチルス・カルドテナックス由来の５ '−３'エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが製造されている。特定のＤＮＡポリメラーゼ酵素に対する抗血清またはモノクローナル抗体が記載されており、当該分野においてよく知られている。例えば、フー（Hu）ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）、第６０巻：２６７〜２７４頁（１９８６年）には、ＰＡＧＥ分離されたＭＭＬＶ逆転写酵素をゲルから取り出し、該精製酵素でウサギを免疫し、次いで、抗血清を回収することによる、イー・コリで発現されたモロニーミュリン（Moloney Murine）白血病ウイルス由来の逆転写酵素および融合蛋白の特異的な免疫沈降が報告されている。リビングストン（ Livingston）ら、ウイロロジー（Virology）第５０巻：３８８〜３９５頁（１９７２年）には、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼと宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼとを識別することのできる抗体を用いるトリのタイプＣウイルス転写酵素のアフィニティークロマトグラフィーが開示されている。スパダリ（Spadari）およびバイスバッハ（Weissbach）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４９巻：５８０９〜５８１５頁（１９７４年）には、ＨｅＬａ由来のＤＮＡポリメラーゼは、マソン−ファイザーモンキー（Mason-Pfizer monkey）ウイルス、ウーリーモンキー（Wooley monkey）ウイルス、またはラウシャーミュリン（Rauscher murine）白血病ウイルスのいずれから得られた逆転写酵素に対して調製された抗血清によっては阻害されないことが報告されている。これらの刊行物を参照により本明細書に記載されているものとみなす。発明の概要本発明は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｓｔ）由来の組み換えおよび／または精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を提供する。１またはそれ以上の本発明酵素をバチルス・ステアロサーモフィルスの培養物から得て精製してもよく、あるいはこれらの酵素をコードしている遺伝子を適当な発現ベクター中にクローン化し、異種宿主において発現させ、精製してもよい。本明細書に開示されたＤＮＡポリメラーゼ酵素のなかには、酵素の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインおよび／またはその対応遺伝子の欠失を有する、無処理酵素の変異または切断形態もある。ＤＮＡポリメラーゼ活性を必要とする核酸増幅反応および他の生化学的プロトコールにこれらの酵素を使用してもよい。さらにそのうえ、本発明酵素は耐熱性であるので、他の多くのＤＮＡポリメラーゼ酵素、例えばイー・コリのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントよりも高温を用いる生化学的応用例における使用に適している。特定の生化学的応用例により許されるように、本発明酵素を未精製形態で用いてもよい。別法として、これらの酵素を使用前に精製してもよい。したがって、さらに本発明は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素の精製および使用方法を提供する。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの好ましい精製方法は、２つのアニオン交換工程およびホスホセルロースクロマトグラフィーからなる。好ましいクロマトグラフィー条件を本明細書に記載してある。しかしながら、これらの条件または順序の変更は、本開示を参照すれば当業者に明白であろう。さらに、本発明は、本発明酵素をコードしている遺伝子を含んでいるＤＮＡフラグメントからなる組成物、これらの遺伝子を含んでいるベクター、およびこれらの組み換え酵素の製造方法を提供する。また、本発明は、安定化剤を含有するバッファー中の１またはそれ以上の本発明ＤＮＡポリメラーゼ酵素からなる安定な酵素処方を包含する。本明細書に記載され、権利請求されている全長のＢｓｔポリメラーゼ酵素およびその変種を、イー・コリ中の多コピーベクター上の単一で切れ目のない遺伝子としてクローン化してもよく、該遺伝子は宿主細胞にとり致命的なものではなく、あるいは強力なリプレッサーの支配下にある。そのうえ、イー・コリ宿主細胞においてＢｓｔポリメラーゼを構成的に発現させてもよい。また、これらの酵素の誘導的発現が可能であるが、高収率の活性酵素を得るには必要ない。図面の簡単な説明図１は、本発明においてプライマーおよびプローブとして使用するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。図２は、Ｂｓｔポリメラーゼ遺伝子、プローブおよびＢｓｔアンプリコンを得る際に使用するＰＣＲプライマーに相補的なその中のヌクレオチド配列の位置、およびそのようにして得られたアンプリコンのＢｓｔ遺伝子に関する位置をグラフで示したものである。図３は、プラスミドｐＧＥＭＢｓｔ８８５の説明である。図４は、プラスミドｐＧＥＭＢｓｔ１１４３の説明である。図５は、種々のプローブとのサザンブロット実験の結果の図式的ダイヤグラムである。図６は、プラスミドｐＧＥＭＢｓｔ２.１Ｓｓｔの説明である。図７は、プラスミドｐＧＥＭＢｓｔ５'ｅｎｄの説明である。図８は、プラスミドｐＵＣＢｓｔ１の構築方法の説明である。図９は、プラスミドｐＵＣＢｓｔ２の構築方法の説明である。図１０は、プラスミドｐＵＣＢｓｔ３の構築方法の説明である。図１１は、プラスミドｐＵＸＣＢｓｔ２ＡＢ、ｐＵＣＢｓｔ２ＣＤ、およびｐＵＣＢｓｔ２ＥＦの構築方法の説明である。図１２は、種々の「クレノウ様」Ｂｓｔポリメラーゼ酵素のＮ末端アミノ酸残基を示す。図１３は、ｐＵＣＢｓｔ１、２、３、４、５ならびに６のＢｓｔポリメラーゼＤＮＡインサート、５'ならびに３'Ｂｓｔゲノムフラグメント、および１１４３アンプリコンならびに８８５アンプリコンの、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子ならびにその３個のドメインに対する関係の図式的ダイヤグラムである。図１４は、細胞溶解物、精製Ｂｓｔ１を含有する粗細胞溶解物、Ｂｓｔ１の精製ズブシリシンフラグメント、部分精製Ｂｓｔ３、およびＢｓｔ３の天然の開裂生成物の精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。好ましい具体例の説明本発明は、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製ＤＮＡポリメラーゼ酵素、異種宿主細胞における発現用の該酵素をコードしているＤＮＡフラグメント、およびそれらの製造、精製ならびに使用方法に関する。核酸配列決定および転写に基づく増幅系を包含する増幅のごとき生化学的応用例において、これらの酵素は有用である。好ましくは、本発明酵素は、約３７℃ないし４２℃よりも高温において最適に活性を有し、よって、反応に比較的高温を必要とする生化学的応用例に適する。最も好ましくは、本発明酵素は約６０℃ないし６５℃の温度において最適に活性を有する。本発明酵素は、非耐熱性イー・コリ・ＤＮＡポリメラーゼＩがメンバーの１つであるクラスＡと呼ばれるＤＮＡポリメラーゼ酵素に対するいくつかの類似点を有するアミノ酸配列を有し、クラスＡのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の比較により、合理的に十分に定義されている多くの「可変」領域によって分断されている相対的配列相同性のある領域が明らかとなる。可変領域とは、これらの領域のアミノ酸配列の比較により、比較されるＤＮＡポリメラーゼ配列の一定領域中の連続したアミノ酸残基の約１０％またはそれ以上が異なるということが明らかになることを意味する。この目的からすると、１の領域は２０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基であると定義される。同様に、クラスＡのＤＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子のヌクレオチド配列の比較により、ヌクレオチド配列が種間で高度に保存されている領域、および他の、種々の領域が明らかになる。遺伝コードの縮重により、ヌクレオチド配列の変化可能性の量は、対応する蛋白間のアミノ酸の変化可能性の量よりも多いことが有り得る。また、各アミノ酸は３個のヌクレオチドによりコードされており、それらのうちの１つの変化が別のアミノ酸に対応するコドンを生じる可能性があるので、これらの酵素をコードしている遺伝子におけるヌクレオチド配列の変化可能性の量は、パーセンテージの上からは、対応するアミノ酸配列の変化可能性の量よりも少ないことが有り得る。ＲＮａｓｅ欠損細胞における組み換え蛋白の発現および選択可能マーカー遺伝子としてのテトラサイクリン耐性の使用は、カシアン（Kacian）らによる同時係属出願（高度に精製された組み換え逆転写酵素というタイトルであり、本願と所有者が共通であり同日に出願された）に記載されている。参照によりこの出願を本明細書に記載されているものと見なす。定義特記しないかぎり、本明細書に用いられる下記用語は次のように表される意味を持つ。「選択可能マーカー遺伝子」とは、選択可能マーカー遺伝子を含まない細胞と比較して、いずれも一定の組成の培地で増殖させられた場合に、宿主細胞によって担持され発現されると増殖上の利点を当該宿主細胞に付与しうる遺伝子をコードしているＤＮＡフラグメントを意味する。例えば、β−ラクタマーゼをコードしている遺伝子は、この遺伝子を含んでいる宿主細胞にアンピシリン耐性を付与し、一方、該遺伝子を含まない細胞はアンピシリンに感受性があるだろう。よって、β−ラクタマーゼに関する遺伝子を発現する細胞のみがアンピシリン含有培地で増殖するであろう。同様に、必須アミノ酸を合成できない細胞は当該アミノ酸を含まない培地では増殖しないであろうが、細胞に必須アミノ酸を作ることを可能にさせる遺伝子を含む細胞はその培地において増殖するであろう。慣用的には、選択可能遺伝子および「沈黙の」遺伝子および／または遺伝学的エレメントの双方を含んでいる細胞を同定する手段として、選択可能マーカー遺伝子を、例えばプラスミドもしくは発現ベクター、１もしくはそれ以上の他の遺伝子または遺伝学的エレメントに結合させることができる。「精製」核酸または蛋白とは、炭水化物、所望でない核酸、または所望でない蛋白のごとき細胞成分を当該核酸または蛋白から除去する少なくとも１の工程に供された核酸または蛋白を意味する。「上流」とは、核酸鎖上の特定の遺伝子座の５'側、あるいは２本鎖核酸分子の場合には核酸分子の当該領域における遺伝子転写方向に関する特定の遺伝子座の５'側を意味する。「下流」とは、核酸鎖上の特定の遺伝子座の３'側、あるいは２本鎖核酸分子の場合には核酸分子の当該領域における遺伝子転写方向に関する特定の遺伝子座の３'側を意味する。「Ｔ_m」は、２本鎖核酸分子、または２本鎖領域を有する核酸分子の集団のうち５０％が１本鎖になるかまたは熱変性する温度を意味する。「組み換え体」とは、核酸分子または蛋白が少なくとも一部にはインビトロ生化学的方法の結果物であることを意味する。よって、「組み換えＤＮＡ分子」は天然に存在しない分子である。かかる組み換え分子は、制限エンドヌクレアーゼフラグメントからなる分子、インビトロ核酸ライゲーション生成物、インビトロエキソヌクレアーゼフラグメント、およびプロモーター、リプレッサー遺伝子、選択可能マーカー遺伝子、温度感受性ＤＮＡ複製エレメント、構造遺伝子等のうちの１つまたはそれ以上のごとき異種の遺伝学的エレメントからなる発現ベクターを包含するが、これらに限らない。「組み換え」蛋白または酵素は天然には見いだされないものである。これらのものは、精製蛋白標品および組み換えＤＮＡ分子から精製された蛋白を包含する。通常には、後者の蛋白は異種宿主細胞、すなわち、対象とする蛋白または酵素については本来のものではない細胞において発現される。しかしながら、対象蛋白が由来した生物と同一種の宿主細胞中に含まれている発現ベクター上に組み換え蛋白をコードしている遺伝子が存在していてもよい。「切断された」とは、より小型のバージョンの対象遺伝子または蛋白を意味する。はじめの核酸またはアミノ酸配列に関して、リファレンスとなる核酸または蛋白の切断バージョンは、リファレンスとなる分子と比較すると、１もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を欠くものである。「実質的な配列相同性」とは、第１の核酸または蛋白分子が、第２のリファレンスとなる核酸または蛋白に対して、認識可能なほどのランダムでない類似性（その核酸またはアミノ酸配列のそれぞれ少なくとも約８９％以上について）を有することを意味する。核酸または蛋白の「ドメイン」とは、連続した核酸またはアミノ酸残基からなる少なくとも１の一定の領域を意味する。「複製開始点」とは、プライマー生成およびＤＮＡポリマラーゼ活性の開始が起こるＤＮＡの特定の領域を意味する。本明細書においては、宿主中で発現ベクターのコピー数を増加させる、ＤＮＡ発現ベクター上に存在する核酸エレメントを意味するために該用語を用いる。「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素が結合でき、ＤＮＡ鋳型の転写を開始できるＤＮＡの特定の領域からなる遺伝学的エレメントを意味する。かくして、核酸配列に含まれる遺伝学的情報の、当該核酸配列に対応するアミノ酸配列からなる蛋白生成物への翻訳の第１段階が提供される。「遺伝子発現」または「蛋白発現」とは、宿主生物による、遺伝子中に含まれる情報からの蛋白生成物の生産を意味する。「形質転換」とは、宿主細胞に核酸分子を含ませるように誘導する生化学的方法を意味する。通常には、かかる核酸分子は、少なくとも１つの複製開始点、選択可能マーカー遺伝子、および宿主細胞内での選択可能マーカー遺伝子の発現のためのプロモーターからなる遺伝学的エレメントである。「異種」とは同じ種でないことを意味する。よって、異種宿主細胞において発現される酵素は、その酵素がもともと由来する種とは異なる種の宿主細胞において生産されることとなる。「遺伝子」とは発現蛋白またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸領域を意味する。遺伝子は、発現蛋白のアミノ酸残基に対応するコドンを含む１またはそれ以上の「コーディング配列」からなっており、さらに遺伝子は、発現蛋白のアミノ酸残基に対応するコドンを含まない１またはそれ以上の「非コーディング」ヌクレオチド配列からなっていてもよいが、必ずしもその必要はない。材料および方法細菌株、プラスミドおよび酵素のソースバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｓｔ）ＡＴＣＣタイプ株１２９８０番を、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ameriacn Type Culture Collection）から得た。３株の細菌エシェリシア・コリ（Escherichia coli）を、本発明ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素のクローニングおよび発現用細胞として使用した。イー・コリＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'株およびＪＭ１０９株をストラタジーン・クローニング・システムズ（Strat agene Cloning Systems）（カリフォルニア州サン・ディエゴ）から得て、イー・コリ１２００株（ＣＧＳＣ株４４４９番）をイー・コリ・ジェネティック・ストック・センター（E.coli Genetic Stock Center）（コネチカット州ニュー・ヘブンのエール大学）から得た。プラスミドベクターｐＵＣ１８をライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Life Technologies Inc.）（メリーランド州ゲイサースバーグ）から得て、ベクターｐＧｅｍ３Ｚをプロメガ社（Promega Corp.）（ウィスコンシン州メジソン）から得た。すべての制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ、イー・コリのＤＮＡポリメラーゼＩ由来のクレノウフラグメント、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼならびにポリヌクレオチドキナーゼのごとき核酸修飾酵素を市販業者から得て、特記しないかぎり、製造者の説明書に従って使用した。細菌の培養バチルス・ステアロサーモフィルスおよびイー・コリの培養を、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０.５％（ｗ／ｖ）酵母エキすおよび０.５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム（ＬＢブロス）中または１.３％（ｗ／ｖ）の寒天を含有する同じ溶液の入ったペトリ皿（ＬＢ寒天）にて増殖させた。必要な場合および以下の開示に示される場合には、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で用い、テトラサイクリンを１２μｇ／ｍｌの濃度で、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０.５ｍＭの濃度で、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ −ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ビー・ステアロサーモフィルスの培養を５５℃でインキュベーションし、イー・コリの培養を３７℃でインキュベーションし、いずれも通気のために振盪した。ＤＮＡの調製プラスミドＤＮＡの調製を以下の開示に示した２つの方法のうちの１つにより行った。第１の方法は、サムブルックらの上記文献（すでに参照により本明細書に記載されているものと見なした）の１.２９頁に記載された、プラスミド微量調製のための標準的な煮沸法である。第２の方法は、キアジェン・インコーポレイテッド（Qiagen,Inc.）（カリフォルニア州チャッツワース）から市販されているキアジェン・プラスミド・キット（Qiagen Plasmid Kit）を用いるものであって、精製ＤＮＡを調製するためのものであった。この方法は、特許アニオン交換樹脂および一連の特許溶離バッファーを使用してＣｓＣｌグラジエントの必要なくＤＮＡを調製するものである。該方法は、キアジェン・プラスミド・ハンドブック・フォー・プラスミド・ミディ・キット・アンド・プラスミド・マキシ・キット（Qiagen Plasmid Handbook for Plasmid Midi Kit and Plasmid Maxi Ki t）、^c１９９２年ディアジェンＧｍｂＨ、キアジェン・インコーポレイテッドに記載されている。ビー・ステアロサーモフィルスのゲノムＤＮＡの調製には、細胞の一晩培養物を遠心分離し、もとの体積の１／５０の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌおよび５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７.０）中にペレットを再懸濁した。リゾチームを最終濃度２ｍｇ／ｍｌとして添加し、懸濁液を３７℃で２０分インキュベーションした。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２５０ｍＭＮａＣｌ、１.２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ、１２ｍＭＥＤＴＡおよび０.５Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有する９倍の体積の溶液を細胞懸濁液に添加し、混合物を氷上で２０分インキュベーションした。混合物中プロテイナーゼＫ濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、ゆるやかに撹拌しながら５０℃で２時間インキュベーションした。次いで、溶液を１５〜２００００ｘｇで１０分遠心分離し、上清を傾斜法で取った。次いで、プラスミドＤＮＡ回収用の上記キアジェン法の変法を用いてＢｓｔゲノムＤＮＡを調製した。清澄化した細胞溶解物からのゲノムＤＮＡの他の調製法は当業者によく知られている。プローブの標識１本鎖ＤＮＡオリゴマープローブを、以下の開示に示す２つの方法のうちの１つにより標識した。第１の方法は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの５'末端を放射活性³²Ｐで標識するものであった（サムブルックらの上記文献（すでに参照により本明細書に記載されているものと見なした）の１０.６０頁に記載）。放射活性原子でプローブを標識する他の方法は当業者によく知られている。このプロトコールを用いてオリゴヌクレオチド１６、２４および２５を標識した。使用した第２の標識方法は、プロメガ・コーポレイション（Promega Corp.）から得たＬＩＧＨＴＳＭＩＴＨ^TM化学発光系（光ストリンジェンシー）であって、オリゴヌクレオチド１５、２１および２０を標識するのに用いた。この方法は非放射活性標識を用いるものであり、かくして一般的には³² Ｐまたは他の検出用放射性核を用いるよりも便利である。しかしながら、検出能を失うことなく上記放射活性原子でオリゴヌクレオチド１５、２０および２１を容易に標識することができる。ＤＮＡフラグメントのゲル電気泳動およびゲル単離特記しないかぎり、アガロースゲルは１％（ｗ／ｖ）アガロース（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド）であった。アガロースゲルを、２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１ＸＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８.０）、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ）中で電気泳動した。ＤＮＡフラグメントのゲル精製を行うために、所望フラグメントを含有するアガロースゲルスライスを切り出し、ドライアイスで凍結した。次いで、ゲルスライスを融解し、押し潰し、ＴＡＥ飽和フェノールで抽出した。短時間の遠心分離後、水相を集め、５０％（ｖ／ｖ）ＴＥ−（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）および１ＥＤＴＡ）飽和フェノール、４９％（ｖ／ｖ）クロロホルムおよび１％（ｖ／ｖ）イソアミルアルコールで抽出した。これに次いで、２４：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム：イソアミルアルコールの溶液で水相を抽出した。核酸をエタノール沈殿するために、水相を集め、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２１／２体積のエタノールを添加し、遠心分離した。ペレットを適当量のＴＡＥバッファーに溶解した。サザンブロット、ハイブリダイゼーション、洗浄および検出方法ＤＮＡフラグメントを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、サムブルックらの上記文献（すでに参照により本明細書に記載されているものと見なした）の９.３８頁に記載のごとく、毛細管現象により２０ＸＳＳＣ（３Ｍ酢酸ナトリウム、０.３Ｍクエン酸ナトリウム）中でニトラン（＋）ナイロン膜（シュライヒャー・アンド・シュール、・インコーポレイテッド（Schleicher & Schuell,I nc.）、キーン、ＮＨ）に移した。膜を風乾し、減圧オーブン中、８０℃で２時間加熱してからハイブリダイゼーションを行った。３２Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションされる膜を、まず、６ＸＳＳＰＥ（２０ＸＳＳＰＥ＝３.０ＭＮａＣｌ、０.２ＭＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７ .４）、０.０２ＭＥＤＴＡ）（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Life Technologies,Inc.））、５Ｘデンハーツ溶液（下記のものそれぞれ０.１％（ｗ／ｖ）：ウシ・血清アルブミン、フィコールおよびポリビニルピロリドン）、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｇ／ｍｌ超音波処理変性サケ・精子ＤＮＡおよびホルムアミド（オリゴマー１６については２５％（ｖ／ｖ）、オリゴマー２４および２５については２０％（ｖ／ｖ））中、３７℃で約２時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、１Ｘ（５Ｘでなく）デンハーツ溶液を用い、毎分１Ｘ１０⁶カウント（ＣＰＭ）／ｍｌの標識プローブを添加すること以外は上記と同様に調製した溶液中で膜を３７℃ で一晩インキュベーションした。次いで、室温で膜を、５ＸＳＳＣおよび０. １％ＳＤＳ、１ＸＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ、次いで、０.２ＸＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳで順次洗浄した。標識オリゴヌクレオチド２４および２５とともにインキュベーションした膜を、さらに０.１ＸＳＳＣおよび０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで洗浄した。洗浄工程後、膜を乾燥し、増強スクリーンを用いて−８０℃で３時間Ｘ線フィルムにさらした。オリゴヌクレオチド１５、２１および２０とハイブリダイゼーションされる膜を、製造者の「高厳密性」プロトコール（プロメガ・コーポレイション）に従って処理した。上記にように、化学発光プローブの使用は便宜のためだけのものであった。プローブを³²Ｐ標識し、サザンハイブリダイゼーション法を上記のごとく行うことができた。用いたハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、オリゴマー１５については５６℃、オリゴマー２１については４８℃、オリゴマー２１については５１℃であった。配列決定反応クローンｐＧｅｍＢｓｔ２.１ＳｓｔおよびｐＧｅｍＢｓｔ５' ｅｎｄのプラスミドＤＮＡ標品を、ジデオキシ鎖ターミネーション法を用いるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列決定用鋳型として用いた。例えば、サンガー（Sanger）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７４巻：５４６３〜５４６７頁（１９７７年）参照（参照により本明細書に記載されているものと見なす）。ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（United States Biochemical）社から得たシクエナーゼ^T ^M キット（バージョン２.０）を用い、製造者のプロトコールに従って配列決定を行った。配列決定が困難な核酸鎖領域においては、当業者に知られた種々の方法を用いて、配列決定反応およびポリアクリルアミドゲルにおける分子内または分子間再アニーリングを最小にした。読むのが困難なヌクレオチド配列領域を解析するための最もうまくいく方法は、配列決定ゲルに４０％（ｖ／ｖ）を含ませることであった。マキサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第６５巻：４９７〜５５９頁（１９８０年）の方法にような他の核酸配列決定法と同様、ジデオキシ配列決定法の変法は当業者によく知られており、それらを参照により本明細書に記載されているものと見なす。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ活性のアッセイＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ活性を、合成１本鎖鋳型および鋳型の一部に相補的なプライマーを用いるｃＤＮＡ合成反応により測定した。ｃＤＮＡ鎖に相補的であるように設計されたアクリジニウムエステル標識プローブにポリメラーゼ生成物をハイブリダイゼーションさせることによりｃＤＮＡ鎖の検出を行った。アーノルド（Arnold）ら、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第３５巻：１５８８〜１５９４頁（１９８９年）およびアーノルドら、米国特許第５,２８３, １７４号（２者のうち後者は本願と共同出願であり、２者とも参照により本明細書に記載されているものと見なす）に記載のハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を用いて標識２本鎖ハイブリッドを検出した。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを含有する可能性のある試料を、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来の８６塩基対の合成ＤＮＡ鋳型２０ｆｍｏｌならびに該鋳型鎖の３'末端に相補的な２３塩基のプライマー３０ｐｍｏｌとともに、反応混合物（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）、２５ｍＭＫＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭスペルミジン、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰを含有）中にて６０℃で８分間インキュベーションした。反応混合物を９５℃で３分間インキュベーションしてＤＮＡ鎖を変性させ、次いで、１.５ｐｍｏｌのアクリジニウムエステル標識検出プローブとともに６０℃で１０分間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションしなかったプローブをアルカリ性ホウ酸バッファーを用いて６０℃で７分間加水分解し、希Ｈ₂Ｏ₂溶液および水酸化ナトリウム溶液の注入後、ＬＥＡＤＥＲ１^TMルミノメーター（ジェン−プローブ・インコーポレイテッド（Gen-Probe Incorporated）、カリフォルニア州サン・ディエゴ）でハイブリダイゼーションした標識プローブによる残存化学発光を測定した。プライマーおよびプローブの設計いくつかのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がクローン化され、配列決定され、これらの配列が並べて比較されて、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が種間でいくぶん保存されている多くの領域が明らかとなっている。例えば、デラリュー（Delarue）、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineering）第３巻：４６１〜４６７０頁（１９９０年）参照。出発点としてＢｃａヌクレオチド配列を用いてこれらの保存的領域のいくつかに対するプライマーおよびプローブを設計するための基礎として、公表されたＢｃａ配列（ウエモリ（Uemori）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第１１３巻：４０１〜４１０頁（１９９３年）を用いた。この刊行物に記載されているＢｃａＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列を参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明において用いるプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を図１に示す。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ配列とこれらのプライマーおよびプローブとの間のミスマッチがいくつかの場合に存在する。これらのプライマーおよびプローブを、２つの理由のうちの１の理由により、ミスマッチを伴うように故意に設計した。第１に、時々、コドンを作成するためにミスマッチが設計されており、既知配列の蛋白をコードしている種々のビー・ステアロサーモフィルス遺伝子におけるコドン利用についての分析によれば、ミスマッチは、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に存在するコドンよりもビー・ステアロサーモフィルスによって好まれると考えられた。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列と本明細書記載のプライマーとの間のミスマッチが設計された第２の理由は、他のＤＮＡポリメラーゼの配列から推定されるように、その相対的位置に存在するヌクレオチドの種間での一致とうまく合致したということである。場合によっては、Ｂｓｔプライマーおよびプローブにおいて、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ配列中のＣのかわりにＴを用いた。なぜなら、Ｇ／Ｔミスマッチは比較的安定だからであり、それゆえ、オリゴヌクレオチドが異なる標的にうまくハイブリダイゼーションするであろう。Ｂｓｔポリメラーゼ酵素の精製Ｂｓｔポリメラーゼ酵素をコードしている遺伝子を含む細菌宿主細胞を上記のごとく液体培地中で振盪しながら６０時間増殖させた。好ましい宿主細胞株はイー・コリ１２００株であった。３７℃において６０時間後、細胞培養物を９０００ｘｇで１０分間遠心分離し、０.１ｍＭＥＤＴＡを含有する２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７.５）で細胞ペレットを１回洗浄した。５０グラムの細胞ペレットを１０倍体積の溶解バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１０ｍＭＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））に懸濁した。次いで、細胞懸濁液をガウリン（ Gaulin）細胞ホモジナイザー（８０００ｐｓｉ）に２回通して細胞を溶解させた。次いで、細胞溶解物を１２０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を集め、− ７０℃で保存した。クロマトグラフィーを２５℃で行った。２５０ｍｌの細胞溶解物を１９０ｘ２６ｍｍのＰｏｒｏｓ−ＨＱアニオン交換樹脂（パーセプティブ・バイオシステムズ（PerSeptive Biosystems）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のカラムに適用した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）および０.１ＭＥＤＴＡを含有する溶液（バッファーＡ）１６０ｍｌでカラムを洗浄した。バッファーＡ中０から０.５ＭＮａＣｌまでの５００ｍｌの直線的グラジエントで結合蛋白を溶離した（流速５ｍｌ／分）。０.１ないし０.２ＭＮａＣｌの塩濃度に対応するイオン強度においてＤＮＡポリメラーゼ活性が溶離した。１０ｍｌのフラクションを集めた。いくつかの場合、活性フラクションをプールし、同様の条件下で第２のＰｏｒｏｓ−ＨＱカラムに通した。４０ｍｌの体積となったプールしたアニオン交換フラクションを３倍体積のバッファーＡで希釈し、５０ｍＭＮａＣｌを含有するバッファーＡで平衡化した１９０ｘ２６ｍｍのホスホセルロースＰ−１１カラムに提供した。カラムを２００ｍｌの同じバッファーで洗浄した。バッファーＡ中０.１Ｍから０.７ＭＮａＣｌまでの直線的グラジエントで結合蛋白を溶離した。約０.２５〜０.３０ＭＮａＣｌの塩濃度に対応するイオン強度においてＤＮＡポリメラーゼ活性が溶離した。１０ｍｌのフラクションを集めた。ホスホセルロース工程からのプールされた活性フラクションを、１リットルのバッファーＡに対して２５℃において２回透析し、バッファーＡで前以て平衡化しておいた２５０ｘ１０ｍｍのＳｙｎＣｈｒｏｐａｋＡＸ−３００アニオン交換ＨＰＬＣカラム（レイニン・コーポレイション（Rainin Corp.）、カリフォルニア州エマリービル）に適用した（流速２.４ｍｌ／分）。試料はバッファーＡ中に存在した。バッファーＡ中１００ｍＭから７００ｍＭまでのＮａＣｌの直線的グラジエント５０ｍｌで結合蛋白を溶離した。約０.２〜０.４ＭＮａＣｌの塩濃度に対応するイオン強度においてＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ活性が溶離した。いくつかの場合において、精製全長Ｂｓｔポリメラーゼをさらにプロテアーゼで処理して該酵素の活性切断形態を得た。かかる場合において、精製Ｂｓｔポリメラーゼ（０.３３ｍｇ／ｍｌ）をバッファーＡ中のズブチリシン（Ｂｓｔポリメラーゼに対するプロテアーゼの割合は１：２００（ｗ／ｗ））で２５℃において処理した。反応混合物を２５℃で４０分インキュベーションし、最終濃度１ｍＭのＰＭＳＦを添加することにより反応を停止した。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの活性蛋白分解フラグメントを、ジエイコブソン（Jacobson）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）第４５巻：６２３頁（１９７４年）（参照により本明細書に記載されているものと見なす）の方法に従って、ヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＧｅｌ−ＨＴ、カリフォルニア州リッチモンドのバイオラッド・ラボラトリーズ（BioRad Laboratories）製）の６０ｘ１０ｍｍのカラムを用いて精製した。ＨＡカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）で平衡化し、２０から３５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）の直線的グラジエント（流速１ｍｌ／分）でＢｓｔポリメラーゼを溶離した。約０.３Ｍのリン酸ナトリウムに対応するイオン強度において活性蛋白が溶離した。活性フラクションをプールした。図１４は、粗細菌溶解物、精製Ｂｓｔ１、精製Ｂｓｔ３、天然に存在するＢｓｔ３分解産物、およびＢｓｔ４を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である（さらに後で説明する）。上記精製スキームにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシ・ブルー染色によって検出される高度に精製されたＢｓｔポリメラーゼ酵素標品が得られた。しかしながら、このスキームまたは上記工程の順序の変更に基づく変法は、本明細書を参照すれば当業者に容易に明らかとなろう。実施例以下の実施例は、当業者が本発明を実施し、その方法および組成物を使用することを可能にするために、本発明の種々の具体例を説明するものである。しかしながら、本明細書記載の核酸のヌクレオチド配列または本明細書記載の蛋白のアミノ酸配列における変化、あるいはその両方が、バチルス・ステアロサーモフィルスの異なる株の間における変化により、または遺伝子の変動の結果として生じる自発的変異により存在してもよいことが理解されるであろう。さらにそのうえ、遺伝学的および生化学的方法によって本明細書開示のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を容易に修飾してＤＮＡポリメラーゼ活性を有する誘導体蛋白を得てもよい。得られた蛋白は、本明細書開示のＢｓｔポリメラーゼ酵素と実質的に同じアミノ酸配列を有するであろうし、より高いまたはより低いレベルのＤＮＡポリメラーゼ活性を示すかもしれない。すべてのかかる誘導体の活性を上記のごとく検出し測定してもよい。よって、本発明の範囲は下記具体例のみに限定されるのではなく、該範囲はこの開示の後にある請求の範囲によってのみ決定される。実施例１：ゲノムＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の同定アンプリコン８８５および７６４これらのアンプリコンを得るために用いたＰＣＲアンプリコンおよびプライマーの位置を、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と比較して図２に示す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸増幅を行うための特許方法であり、下記米国特許において特許されている：ホフマン−ラ・ロッシュ,インコーポレイテッド（Hoffman-La Roche,Inc.）（ニュージャージー州ナッツリー）に譲渡されたムリス（Mullis）らの米国特許第４,６８３,１９５号、４,６８３,２０２号および４,８００,１５９号。ＢｓｔゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によりアンプリコン８８５を得た。アンプリコン８８５中のヌクレオチド配列に対する第２のセットのプライマーを用い、アンプリコン８８５を基質として用いてアンプリコン７６４を得た。図１（それぞれ配列番号：１および３）に示すオリゴヌクレオチド１６および２５を、鋳型としてゲノムＢｓｔＤＮＡを用いるＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いた。ＰＣＲ反応混合物は、５０ピコモルの各プライマー、０.５μ ｇの鋳型ＤＮＡおよび５ユニットのサーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼを、１００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１.５ｍＭ塩化マグネシウム、および各０.２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにｄＴＴＰ中に含有していた。反応混合物に１００μｌのシリコンオイルを重層し、サーモサイクラー装置中で、９５℃１.５分、次いで、９５℃０.５分、５０℃２.５分、７２℃１.５分を３０サイクル行ってインキュベーションした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を最終濃度１３.３％（ｖ／ｖ）となるよう添加してプライマーのＴ_mを約８℃低下させたことを除いては上記のごとく第２のセットの反応を行った。生じた反応物の効果的なアニーリング温度は５８℃であった（チェスター（Chester）およびマーシャク（Marshak）、アナリテイカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第２０９巻：２８４〜２９０頁（１９３３年））。Ｂｓｔ鋳型ＤＮＡを添加せずに別個の反応を行い、陰性対照とした。やはり図１に示されたオリゴマー１７および２４（それぞれ配列番号：５および７）を第２のＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いた。上記の各１次反応混合物からのアンプリコンを含有する２μｌの部分試料を鋳型として使用した。すべての反応条件は１次反応におけるものと同じであった。１次増幅において５０℃のアニーリング温度で得られたアンプリコンを第２の反応において５０℃で使用し、１次増幅において１３.３％ＤＭＳＯを用いて得られたアンプリコンを第２の反応において同じく１３.３％ＤＭＳＯとともにインキュベーションした。各反応混合物からの１６μｌの部分試料を１.５％アガロースゲル上の電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジウムで染色した。公表されているＢｃａ配列に基づいて予想アンプリコンサイズを計算した。鋳型ＤＮＡを含有する反応混合物に対応する各ゲルレーンにおいて、ほぼ予想したサイズを有するシングルバンドが出現した。オリゴマー１６および２５をＰＣＲプライマーとして用いた反応混合物においては約８８５塩基対のバンド、オリゴマー１７および２４をＰＣＲプライマーとして用いた反応混合物においては約７６４塩基対のバンドが出現した。鋳型を欠く陰性対照においてはアンプリコンは観察されなかった。ゲルをサザンブロットし、上記のごとく図１（配列番号：１１）に示す標識オリゴヌクレオチド２０でプローブした。１次および２次双方のＰＣＲ反応のプライマー伸長生成物を標識オリゴヌクレオチド２０により検出した。陰性対照の反応においてはハイブリダイゼーションは観察されなかった。アンプリコン１１４３上記１次増幅と同じ条件を用いるＢｓｔゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によりアンプリコン１１４３（図２にも示す）を得た。この反応に用いたプライマーは、図１に示すオリゴヌクレオチド２０および２１（それぞれ配列番号：１１および９）であった。この反応混合物の一部を１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。ほぼ予想された１１４３塩基対のサイズの単一のアンプリコンが観察され、陰性対照においてはアンプリコンは観察されなかった。ゲルをサザントランスファー法に供し、上記のごとく標識オリゴヌクレオチド１６（図１）で膜をプローブした。プライマー伸長生成物は標識オリゴヌクレオチド１６（配列番号：１）とハイブリダイゼーションした。陰性対照反応物とのハイブリダイゼーションが観察されなかった。アンプリコン８８５および１１４３のクローニング上記のようにアンプリコン８８５および１１４３をゲルで単離した。精製アンプリコンをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン・クローニング・システムズ）とともにインキュベーションして末端の平滑化を確実にした。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌアセチル化ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Bi olabs））および各０.１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにｄＴＴＰを含有する５０μｌの反応物中において、５ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼとともにアンプリコンを１１℃で２０分間インキュベーションした。反応後、アンプリコンをＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０））で希釈し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、次いで、上記のごとくクロロホルム／イソアミルアルコールの溶液で抽出した。ＳｍａI消化された０.１５μｇのプラスミドｐＧｅｍ３Ｚとともにプライマー伸長生成物をエタノール中で共沈させ、上と同じ２種の溶液を用いて再抽出した。沈殿した核酸を、全体積１０μｌ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７. ６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭジチオスレイトール、５％ポリエチレングリコール８０００、および１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有）中に再懸濁し、一晩室温でインキュベーションした。８ユニットのＳｍａIをこの反応物にさらに添加してベクターの再ライゲーションを防止した。得られた環化したアンプリコン含有プラスミドを用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換した。形質転換細胞を、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ −ｇａｌを含有するＬＢ寒天上に撒いた。ＤＮＡインサートの存在を示す白色コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させた。標準的な煮沸法（例えば、サムブルックの上記文献（すでに参照により本明細書に記載されていると見なした））に従ってプラスミド微量調製を行い、クローンに対する制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて単離物を分析した。各プラスミド微量調製物をＥｃｏＲIプラスＨｉｎｄIIIで消化することにより８８５アンプリコンインサートの検出を行った。消化物を１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、上記のごとくサザンブロットを行った。サザンブロットを標識オリゴヌクレオチド２０とハイブリダイゼーションさせた。プローブはかすかな低分子量バンドを検出した。オリゴヌクレオチド２０の配列がアンプリコンの末端近くの配列に近いと考えられたので（図２および３参照）、アンプリコン中のその対応配列はベクター制限部位とアンプリコン中のＥｃｏＲIまたはＨｉｎｄIII制限部位との間に位置する可能性があるように思えた。オリゴヌクレオチド１６（プライマーの１つ）は既知ＥｃｏＲI部位を有していたが、かかる小型の制限フラグメントを生じるものではなかった。ＳｓｔIおよびＨｉｎｄIII消化のみならずＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIII消化を別々および同時に行い、次いで、サザンブロットおよび標識オリゴヌクレオチド２０とのハイブリダイゼーションを行うことにより、２つの単離物をさらに試験した。アンプリコン８８５を含有するクローンの構造をこれらの実験から推定し、図３に示す。このクローンをｐＧｅｍＢｓｔ８８５と命名した。各プラスミド微量調製物をＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIII消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動することにより、上記のごとく１１４３アンプリコンインサートの検出を行った。臭化エチジウム染色により検出したいくつかの単離物において予想サイズのインサートが観察された。サザンブロットハイブリダイゼーション分析後、インサートは標識オリゴヌクレオチド１６に強力にハイブリダイゼーションすることがわかった。典型例として１のクローンを選択し、その推定制限地図を図４に示す。このクローンをｐＧｅｍＢｓｔ１１４３と命名した。アンプリコンクローンの部分的配列決定ｐＧｅｍＢｓｔ８８５およびｐＧｅｍＢｓｔ１１４３ＤＮＡ試料を用いて上記のごとく配列決定反応を行った。両方のセットの反応に使用したプライマーは、プロメガ・コーポレイションから市販されているＳＰ６およびＴ７プロモータープライマーであった（それぞれ配列番号：１５および１６）。これらのプライマーは、ｐＧｅｍベクター中のＳＰ６およびＴ７プロモーター領域に特異的であり、両方向のＢｓｔアンプリコンインサートの配列決定に有用であった。得られたアンプリコン配列を既知Ｂｃａポリメラーゼ遺伝子配列と並べて比較したところ、重複領域において約８８％の相同性があることがわかった。さらに、２つのアンプリコンの重複領域に存在する配列は同じであり、それらが同じ遺伝子から生じたことが示された。それゆえ、その証拠は、アンプリコンはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の真のフラグメントを表すことを示す。８８５および１１４３アンプリコンクローンから得られた配列は、ゲノムＢｓｔＤＮＡから得られる遺伝子フラグメントの単離を可能にする２つの情報を提供した。第１に、オリゴヌクレオチド１６、１７、２０および２４に対応する領域中のＢｓｔポリメラーゼ遺伝子の配列は、これらのオリゴヌクレオチドがサザンブロットにおけるゲノムＢｓｔＤＮＡのプローブとしての使用に適するであろうことを示した。第２に、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中の２つの制限エンドヌクレアーゼ部位が同定された。それらは、Ｂｃａ座標１５１６のＳｓｔ I制限部位およびＢｃａ座標１６８７のＨｉｎｄIII制限部位であった。これらの部位は、ゲノムＤＮＡからのＢｓｔポリメラーゼ遺伝子フラグメントの単離のための戦略を提供する。実施例２：ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの同定およびクローニング遺伝子の３'末端のクローニングゲノムＢｓｔＤＮＡの部分試料をＳｓｔIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、次いで、上記のごとくサザンブロットに供した。次いで、上記のごとく、移行した膜を６種の標識オリゴヌクレオチドで別個にプローブし、オートラジオグラムを得た。図５に示すように、標識オリゴヌクレオチド１６、２０、４および２５は、長さ約２.１ｋｂのＳｓｔIフラグメントにハイブリダイゼーションした。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３'末端付近の配列に基づいてこれらのオリゴヌクレオチドを設計した。他の２つのオリゴヌクレオチド１５および２１は該遺伝子の５'末端近くにＢｃａ配列に基づくものであり、このＳｓｔIフラグメントにハイブリダイゼーションしなかった。これらの結果は、ＳｓｔI制限部位を用いて該遺伝子の３'末端を含有するゲノムＤＮＡフラグメントを単離することができることを示した。２５μｇの精製ＢｓｔゲノムＤＮＡをＳｓｔIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供した。約２.１ｋｂに対応するゲルの領域においてゲルスライスを切り出した。上記のごとくゲルスライスからＤＮＡを精製した。約０.４５ μｇを回収した。ベクターＧｅｍ３ＺをＳｓｔIで消化し、次いで、上記のごとくフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールの溶液で抽出した。ゲル精製した２.１ｋｂのＳｓｔIフラグメントを、Ｓｓｔ I消化したｐＧｅｍ３Ｚベクター０.２３μｇとともにエタノール沈殿させた。上記のごとく、沈殿したＤＮＡを１５μｌの反応物中に再溶解し、１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ' 細胞を形質転換し、形質転換細胞を、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上に撒いた。インサートＤＮＡを示す白色コロニーを選択し、マイクロタイターディッシュ中、アンピシリン含有ＬＢブロス２００ μｌ中で一晩増殖させた。各培養物の１００μｌの部分試料を、バイオラッドのＢｉｏ−Ｄｏｔ微量濾過装置を用いてシュライヒャー・アンド・シュール社のニトラン（＋）膜上で濾過し、２００μｌの１０ＸＳＳＣで洗浄した。この膜を５分間風乾し、次いで、１０％ＳＤＳに浸した濾紙上に３分、０.５Ｍ水酸化ナトリウムに浸した濾紙上に５分、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に浸した濾紙上に５分、次いで、１.５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０.７ＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に浸した濾紙上に５分置いた。濾紙を風乾し、減圧オーブン中、８０℃で２時間加熱し、次いで、上記のごとく標識オリゴヌクレオチド２０とハイブリダイゼーションさせた。オリゴヌクレオチド２０とハイブリダイゼーションする１のクローンを同定した。このクローンを、アンピシリン含有ＬＢブロスで３７℃において一晩培養した。プラスミド微量調製を上記のごとく行い、プラスミドＤＮＡをＳｓｔIおよびＨｉｎｄIIIで、別個におよび同時に消化した。制限消化物を１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。約２.１ｋｂおよび２.７ｋｂに対応する位置に２本のＳｓｔIバンドが観察され、ＳｓｔIプラスＨｉｎｄ IIIで消化したプラスミドＤＮＡを負荷したゲル上に実質的に同一のパターンが観察された。ＨｉｎｄIIIのみで消化したプラスミドＤＮＡは電気泳動において、約４.５ｋｂの大きなバンドと約０.１〜０.２ｋｂの非常に小さなバンドとを生じた。上記のごとくゲルをサザンブロットし、標識オリゴヌクレオチド２５とハイブリダイゼーションさせた。該プローブは、ｓｓｔIおよびｓｓｔIプラスＨｉｎｄIII制限消化反応に対応するレーンにおける２.１ｋｂのＳｓｔIバンド、およびＨｉｎｄIII消化に対応するレーンにおける４.５ｋｂのバンドにハイブリダイゼーションした。クローンが２.１ｋｂのＳｓｔIフラグメントの予想される５'末端を含むことを証明するために、ＳｓｔI部位に非常に近いＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の領域に相補的であると考えられる標識オリゴヌクレオチド１６でそれをプローブした。この場合、サザンブロット法ではなくＤＮＡドットブロットを用いて所望ヌクレオチド配列を含んでいるクローンを同定した。プラスミドｐＧｅｍ３Ｚ、ｐＧｅｍＢｓｔ１１４３および２.１ｋｂのＳｓｔIフラグメントを含むと考えられるプラスミドの部分試料１μｇを、１１０μｌの０.３Ｍ水酸化ナトリウム中、６５℃で１時間変性させた。１１μｌの２Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、上記のごとくバイオラッドのＢｉｏ−Ｄｏｔ微量濾過装置を用いてシュライヒャー・アンド・シュール社のニトラン（＋）膜上で試料を濾過した。１Ｍ酢酸アンモニウムで膜を洗浄し、減圧オーブン中、８０℃で４５分間加熱した。次いで、上記のごとく膜をオリゴヌクレオチド１６とハイブリダイゼーションさせた。２.１ｋｂのＳｓｔIゲノムフラグメントクローンを含むと考えられるプラスミドおよびｐＧｅｍＢｓｔ１１４３アンプリコンクローンは両方とも該標識プローブと強力にハイブリダイゼーションし、該フラグメントの５'末端が両方のプラスミドに存在することが示された。ＳＰ６プロモータープライマー（配列番号：１５）を用いて予備的な配列決定反応を上記のごとく行った。得られたヌクレオチド配列は、アンプリコンクローンｐＧｅｍＢｓｔ８８５およびｐＧｅｍＢｓｔ１１４３から推定された配列と合致し、さらに、ゲノムクローン中のＨｉｎｄIII部位の存在が確認された。制限エンドヌクレアーゼＳａｌIを用いての、このプラスミドに対するさらなる制限エンドヌクレアーゼ消化により、約３.１および１.８ｋｂの２本のバンドが得られ、ＳａｌI部位が該ポリメラーゼ遺伝子の３'末端の下流の３'非コーディング領域に存在することが示された。このクローンをｐＧｅｍＢｓｔ２. １と命名し、図６に示す。遺伝子の５'末端のクローニング３'末端クローンｐＧｅｍＢｓｔ２.１ＳｓｔはＨｉｎｄIII制限部位を５'末端付近に有するので、ＨｉｎｄIII部位を用いてｐＧｅｍＢｓｔ２.１の２.１ｋｂのＳｓｔI遺伝子フラグメントと重複しているゲノムＢｓｔＤＮＡフラグメントを単離した。これを行うために、ＢｓｔゲノムＤＮＡをＨｉｎｄII Iプラス第２の酵素集団で消化して、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の失われた５'部分を含むに十分な長さであると計算される少なくとも１.７ｋｂのフラグメントを同定した。ＢｓｔゲノムＤＮＡをＨｉｄIIIのみおよびＨｉｎｄIIIプラス下記の第２の酵素で消化した：ＢａｍＨI、ＥｃｏＲI、ＫｐｎI、ＳｐｈI、ＸｂａIおよびＸｍｎI。各反応混合物の３マイクログラムの部分試料を、２系にして１％アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、標識オリゴヌクレオチド２０または２１をプローブとして用いて上記のごとく各ゲルをサザンブロットにより分析した。分析により、２系の膜はそれぞれ同じハイブリダイゼーションパターンを示した。各制限消化物に対応するレーンにおいて、ＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈIおよびＨｉｎｄIIIプラスＸｍｎIの試料以外は、約４ｋｂの単一バンドが見られ、先に決定した３'フラグメントクローン中のＨｉｎｄIII部位の上流の最も近くにあるＨｉｎｄIII部位は４ｋｂ離れており、これらのＨｉｎｄIII部位の間には第２位の酵素に関する制限部位は存在しないことが示された。ＨｉｎｄIIIプラスＸｍｎI消化物に対応するレーンは約１.４ｋｂの単一バンドを示し、Ｂｃａヌクレオチド配列から推定すると、それは遺伝子の５'末端全体を含むに十分な長さではなかった。ＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈI消化物に対応するレーンは約２.８〜３ｋｂの単一バンドを示した。この３ｋｂフラグメントを以下のように精製し、クローン化した。ＨｉｎｄII IプラスＳｐｈIで、ＢｓｔゲノムＤＮＡを３７℃において消化した。ベクターｐＧｅｍ３Ｚも同じ酵素で消化した。両方の消化物を１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。得られたベクターフラグメントおよび３ｋｂのＨｉｎｄIII／ＳｐｈI Ｂｓｔゲノムフラグメントをゲルから切り出し、ＤＮＡを上記のごとく精製した。約１２５ｎｇのベクターＤＮＡを、３ｋｂのＨｉｎｄIII／ＳｐｈIフラグメントとともにエタノール沈殿させた。全体積１５ μｌ中１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中に沈殿したＤＮＡを再溶解し、１６℃で一晩ライゲーションさせた。ライゲーション反応混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上に形質転換細胞を撒いた。ＤＮＡインサートを示す白色コロニーを選択し、マイクロタイターディッシュ中のアンピシリン含有２００μｌＬＢブロス培地中で一晩増殖させた。各培養物の１００μｌの部分試料を上記のごとく２系のハイブリダイゼーション膜上で濾過し、風乾し、減圧オーブン中、８０℃で２時間加熱した。２系の膜を別々に標識オリゴヌクレオチド２０および２１とハイブリダイゼーションさせた。３つの培養物から得た試料は各プローブとある程度のハイブリダイゼーションを示した。これらの培養物をアンピシリン含有ＬＢブロスで一晩培養し、上記のごとくプラスミド微量調製を行った。各試料から得られたプラスミドＤＮＡをＸｍｎIのみおよびＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。２つのクローンからの試料は予想したサイズのＤＮＡバンドを生じた（ＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈI反応は約３ｋｂおよび２. ７ｋｂのフラグメントを生じると考えられた。これらのバンドはゲルで分離できなかった。ＸｍｎI反応は約３.４および２.４ｋｂのＤＮＡフラグメントを生じると考えられた）。これらのクローンの１つをさらなる分析のために選択した。このクローン由来のプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、上記のごとく電気泳動に供した。直線上プラスミドと予想される約５.６ｋｂの単一バンドが存在した。また、同じプラスミドＤＮＡをＸｍｎI、ＨｉｎｄIIIプラスＸｍｎ IおよびＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色し、上記のごとくサザン法によりハイブリダイゼーション膜に移した。次いで、３系の膜を別々に標識オリゴヌクレオチド１５、２１および２０とハイブリダイゼーションさせた。得られた結果のまとめを下表に示す。これらの結果は、このクローンがＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５'末端を含むことを示した。ヌクレオチド配列番号：１５のＳＰ６プロモータープライマーを用いて予備配列決定反応を上記のごとく行った。このプロモーター−プライマーは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼコーディング領域の外側から始まり該遺伝子の５'末端方向へと伸長する配列決定反応を開始する。配列決定反応の結果は、ベクターのクローニング部位に最も近いＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列が、ｐＧｅｍＢｓｔ２.１Ｓｓｔの３'遺伝子フラグメントの５'末端から先に得られた配列と合致することを示した。それゆえ、これらのデータは、新たな５'遺伝子フラグメントクローンがクローン化された３'遺伝子フラグメントインサートと重複していることを示すものであった。新たなインサートに関するさらなる制限マッピングにより２つのＳａｌI部位の存在も明らかになった。１つは５'フランキング領域における該遺伝子の５'末端から約０.２ｋｂ上流にあり、もう１つは該遺伝子の５'末端から約０.５ｋｂ下流のコーディング領域にある。この新たなプラスミドをｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄと命名し、図７に示す。実施例３：全長のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドの構築５'ならびに３'遺伝子フラグメントクローンｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄおよびｐＧｅｍＢｓｔ２.１Ｓｓｔのセグメントを結合することにより、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の全長のコピーを含むプラスミドを構築した。用いた方法を図８に概説する。まず、図８にフラグメントＡとして示す遺伝子の３'末端の一部を含む前駆体プラスミドを構築した。精製プラスミドｐＧｅｍＢｓｔ２.１ＳｓｔのＤＮＡをＨｉｎｄIIIプラスＳａｌIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供した。上記のごとく、約１.６ｋｂのＤＮＡバンド（フラグメントＡ）を含むゲルスライスを切り出し、ＤＮＡをゲル精製した。プラスミドベクターｐＵＣ１８を同じ２つの酵素で消化し、同時に精製した。約０.２５μｇのフラグメントＡおよび０.１５μｇのｐＵＣ１８フラグメントを一緒にエタノール沈殿した。上記のごとく、体積１５μｌ中１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中に核酸を再溶解し、１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上に形質転換細胞を撒いた。ＤＮＡインサートを示す白色コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させた。プラスミド微量調製を上記のごとく行い、得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIIIプラスＳａｌIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。１.６および２.７ｋｂの予想サイズのＤＮＡバンドを生じる試料を同定した。このプラスミドクローンをｐＵＣＢｓｔ３'ｅｎｄと命名した。図８においてＡａｔII／ＨｉｎｄIIIフラグメント（フラグメントＢ）として示されている遺伝子の５'末端の部分を単離するためにｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄを以下のように用いた。このクローンの配列決定および制限マッピングにより、ＳａｌIおよびＡａｔII制限部位が示された。精製ｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄＤＮＡをＨｉｎｄIIIプラスＳｐｈIプラスＳｓｐIで消化し、上記のごとく前駆体２.８６ｋｂＨｉｎｄIII／ＳｐｈIフラグメントをゲル精製した。次いで、前駆体フラグメントをＡａｔIIで消化し、上記のごとく２.３ｋｂのフラグメントＢをゲル精製した（このフラグメントを２段階で調製した。すなわち、最初のＳｐｈIおよびＳｓｐI消化は、電気泳動中の所望フラグメントと同時に移動する所望でないプラスミドフラグメントを除去するためのものであった）。プラスミドｐＵＣＢｓｔ３'ｅｎｄＤＮＡをＨｉｎｄIIIプラスＡａｔII で消化し、大きいフラグメントを上記のごとくゲル精製した。約０.６μｇの消化ｐＵＣＢｓｔ３'ｅｎｄＤＮＡを、約０.５μｇのフラグメントＢとともにエタノール沈殿し、１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中、１６℃において一晩ライゲーションさせた。ライゲーション混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに形質転換細胞を撒いた。上記のごとく、クローンを選択し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させ、プラスミド微量調製を行った。プラスミドＤＮＡをＳａｌIで消化し、上記のように消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。約２.７、２.６および０.７の予想サイズを有する３つのバンドがそのようにしてスクリーニングされたプラスミドの大部分において観察され、５'および３'ゲノムフランキング配列を含む全長のＤＮＡポリメラーゼの構築の成功が示された。これらのクローンの１つを典型的なクローンとして選択した。このプラスミドをｐＵＣＢｓｔ Iと命名し、図８に示す。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子およびその５'および３'フランキング配列を配列番号：１９に示す。実施例４：５'−３'エキソヌクレアーゼドメインを欠くＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローンの構築ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３'−５'エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼドメインのみを含むプラスミドクローンを以下のように構築した。一般的には、まず、プラスミドｐＭＡＬ^TM−Ｐ２（ニュー・イングランド・バイオラブズ）由来のｌａｃＩ^qリプレッサー遺伝子を修飾ｐＵＣ１８プラスミド中に挿入して、最終クローンが種々の宿主細胞においてＩＰＴＧを誘導できるようにする。以前の刊行物は、全長のＤＮＡポリメラーゼIの発現はイー・コリ宿主細胞にとり致命的であることを示した。例えば、ジョイス（Joyce）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８０巻：１８３０〜１８３４頁（１９８３年）参照。クローン化されるべきＤＮＡポリメラーゼ遺伝子フラグメントを３つの成分から集めて作成した。該３つの成分とは、ｐＧｅｍＢｓｔ２.１Ｓｓｔ由来のＨｉｎｄIIIからＳａｌ Iまでの領域を含む３'遺伝子フラグメント、ｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄ中のＳｔｙI部位からＨｉｎｄIII部位までの領域を含む真ん中の遺伝子フラグメント、およびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼに関するコーディング領域の５'末端を完成してクローニング部位を提供するために合成オリゴヌクレオチドを用いて作成されたフラグメントであった。クローンニング法を図９に示す。工程１：１μｇのプラスミドｐＭＡＬ^TM−ｐ２を制限エンドヌクレアーゼＭｓｃIプラスＳｓｐIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、生じたｌａｃＩ^q リプレッサー遺伝子を含む約１.３９ｋｂのバンドを上記のごとくゲル精製した。次いで、上記のごとく、２０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中で、このフラグメントを２０ｐｍｏｌのＳｐｈIリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブズ）と室温で一晩ライゲーションさせた。Ｔ４ＤＮＡアーゼを７５℃で５分間熱失活させ、ライゲーション混合物をエタノール沈殿した。次いで、上記のごとく、ＤＮＡフラグメントを再溶解し、ＳｐｈIで消化し、次いで、電気泳動に供し、ゲル精製した。得られたＤＮＡフラグメントを図９においてフラグメント「ａ」として示す。新たなＮｃｏIクローニング部位を生じることとなるｐＵＣ１８中の２個の塩基の置換を行うことによってプラスミドベクターｐＵＣ１８Ｎを前以て構築した。下に示すように、ＥｃｏＲI部位から１１塩基上流のＡヌクレオチドがＧに置換され、ＥｃｏＲI部位から１５塩基上流のＴヌクレオチドがＣに置換された。制限エンドヌクレアーゼ部位を含むヌクレオチド配列を下線で示す。プラスミドｐＵＣ１８ＮをＳｐｈIで消化し、上記のごとくアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル精製した。次いで、直線状となったプラスミドを、上記のごとくｌａｃＩ^qフラグメントとともにエタノール沈殿させ、上記のごとく２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中で２つのＤＮＡフラグメントを１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を用いてＸＬ１ −ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、アンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢプレートに形質転換細胞を撒いた。上記のごとく、ＤＮＡインサートの存在を示す白色コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させ、プラスミド微量調製を行った。該プラスミドＤＮＡ調製物を、ＥｃｏＲ IプラスＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIIIプラスＥｃｏＲＶでそれぞれ消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。予想サイズのＤＮＡバンド（ＥｃｏＲI／ＥｃｏＲＶ：３.１５ｋｂ＋０.９６ｋｂ、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＶ：３.５９ｋｂ＋０ .５２ｋｂ）を示すプラスミドクローンを選択し、ｐＵＣ１８ＮＩ^qと命名した。工程２：２つの部分的に相補的な１本鎖合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１７および１８）を用いてクローン化された遺伝子の５'末端を完成させるために必要な合成フラグメントを構築した。ｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄＤＮＡの配列決定により得られたＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列に基づいてこれらのオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドの相補的領域が、ハイブリダイゼーションした場合にオリゴヌクレオチドの３'末端における２８個の塩基によって互いにオリゴヌクレオチドを重複させるように、オリゴヌクレオチドを構築した。２本鎖ＤＮＡ分子を生じるイー・コリのＤＮＡポリメラーゼ I由来のクレノウフラグメントを用いて、アニーリングされた１本鎖オリゴヌクレオチドを伸長させた。得られた２本鎖ＤＮＡ分子は、５'末端近くにＮｃｏI制限エンドヌクレアーゼ部位、３'末端近くにＳｔｙI制限エンドヌクレアーゼ部位、および遺伝子座標８６８〜１０１２に対応するＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を含んでいた。このフラグメントは、このドメインの５'末端に付加された新たなＮｃｏIクローニング部位を有するＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３'−５'エキソヌクレアーゼドメインの５'末端を含んでいる。このＤＮＡフラグメントを図９において「ｂ」で表す。工程２を行うために、配列番号：１７および１８有する有するオリゴヌクレオチド各１５ｐｍｏｌを、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウムおよび２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を含有する全体積９６μｌの溶液中で混合した。溶液を７６℃で１０分インキュベーションし、次いで、数時間かけてゆっくりと室温まで冷却してオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。イー・コリＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメント１０ユニトおよびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにｄＴＴＰ各０.２ｍＭを混合物に添加して全体積１００μｌとした。得られた反応混合物を室温で６時間、次いで、３７℃で４５分、さらに４２℃で１０分インキュベーションした。次いで、上記のごとく溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、そしてクロロホルム／イソアミルアルコールで順次抽出し、次いで、エタノール沈殿した。２５ユニットのＮｃｏIを含有する反応混合物に２本鎖フラグメントを再溶解し消化を行い、得られた０.１５ｋｂのフラグメントを上記のごとくゲル精製した。工程３：工程１で構築したプラスミドｐＵＣ１８Ｎ I^qをＮｃｏIで消化し、工程２で得たフラグメント「ｂ」と混合し、該プラスミドおよび該ＤＮＡフラグメントを１６℃で一晩ライゲーションした。６５℃で１０分間リガーゼを熱失活させ、ライゲーション生成物をエタノール沈殿した。上記のごとく、プラスミドをＳｔｙIプラスＳａｌIで消化し、ゲル精製した。工程４：ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子フラグメントを単離し、下記のごとく再構成した。プラスミドｐＧｅｍＢｓｔ５'ｅｎｄをＳｔｙIプラスＨｉｎｄIIIで消化し、電気泳動に供し、得られた０.６８ｋｂのＤＮＡフラグメント（フラグメント「ｃ」と命名）をゲル精製した。プラスミドｐＧｅｍＢｓｔ２.１ＳｓｔをＨｉｎｄIIIプラスＳａｌIで消化した。さらにこの消化混合物を上記のごとく電気泳動に供し、１.５７ｋｂのＤＮＡフラグメント（フラグメント「ｄ」と命名）をゲル精製した。精製フラグメント「ｃ」および「ｄ」を混合し、同時エタノール沈殿した。４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する３０μｌの反応混合物中にペレット化したＤＮＡを再溶解し１６℃で一晩ライゲーションした。リガーゼを６５℃で１０分間熱失活させ、ライゲーションしたフラグメント「ｃ」および「ｄ」をエタノール沈殿し、次いで、ＳａｌIで消化した。アガロースゲル電気泳動後、得られた２.２５ｋｂのライゲーションフラグメント「ｃｄ」を上記のごとくゲル精製した。工程５：２ユニットのＴ４リガーゼを含有する１７μｌの反応混合物中で、ゲル精製されたフラグメント「ｃｄ」を、工程３で得られたプラスミドと１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション反応混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に撒いた。アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖したクローンを選択し、選択コロニーのプラスミド微量調製を行った。ＮｃｏIプラスＨｉｎｄIIIおよびＳｐｈI プラスＳｔｙIでの制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてＤＮＡ調製物を分析した。制限消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色した。予想サイズの制限フラグメント（ＮｃｏI＋ＳｔｙI：２.６２ｋｂ（２本のバンド）、０.８３ｋｂ、０.３７ｋｂ、およびＳｐｈI＋ＳｔｙI：２.７７ｋｂ、１. ４１ｋｂ、１.０５ｋｂ、０.８８ｋｂ、０.３３ｋｂ）を生じるクローンを同定した。このクローンをｐＵＣＢｓｔ２と命名し、図９に示す。５'および３' 非翻訳領域を伴わないＢｓｔ２遺伝子インサート（しかし、非翻訳終止コドンを有する）は配列番号：２２の配列を有する。実施例５：ｐＵＣＢｓｔ２の修飾バージョンの構築ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現に対するｌａｃＩ^qリプレッサー遺伝子の効果を評価するために、ｌａｃＩ^qリプレッサー遺伝子が欠失しているかまたは逆方向になっているｐＵＣＢｓｔ２の修飾バージョンを構築した。これらのクローンを作るために、ｐＵＣＢｓｔＤＮＡをＳｐｈI制限エンドヌクレアーゼで消化してｌａｃＩ^qインサートを遊離させた。上記のごとく、反応混合物を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールの溶液で順次抽出し、次いで、エタノール沈殿した。次いで、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する２０μｌの反応混合物に試料を再溶解し、１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション反応混合物を用いてイー・コリ１２００細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に撒いた。コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させた。プラスミド微量調製を上記のごとく行った。次いで、試料をＥｃｏＲＶプラスＨｉｎｄIIIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供し、その後、臭化エチジウムで染色した。下表および図１１に示した予想バンドサイズに基づいてプラスミドｐＵＣＢｓｔ２「ＡＢ」、「ＣＤ」および「ＥＦ」を同定した。実施例６：５'−３'エキソヌクレアーゼドメインにおける欠失を伴うＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローンの構築３'−５'エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性に影響する遺伝子のドメインを修飾することなく発現される遺伝子産物の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を不活性化または低下させるために、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインにおけるインーフレーム欠失を含むプラスミドを構築した。実験方法は図１０に概説されており、ｐＵＣＢｓｔ１由来の２つの制限フラグメントを用いるものであった。ｐＵＣＢｓｔ１ＤＮＡをＰｖｕIIで消化することにより第１のフラグメントを調製した。制限消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。上記のごとく、３３２１塩基対のフラグメントを同定し、ゲル精製した。次いで、精製フラグメントをＨｉｎｃIIで部分消化した。このフラグメントの部分消化に適した条件を前以て決定しておいた。基質ＤＮＡの部分制限消化を行うための条件は当業者により容易に決定され、かつよく知られている。アガロースゲル電気泳動により、３１２６塩基対のフラグメントを同定し、ゲル精製した。第２の制限フラグメントを調製するために、まず、ｐＵＣＢｓｔ１をＡａｔIIで完全消化して、アガロースゲル電気泳動中に所望ＤＮＡフラグメントと同時移動すると予想されるＤＮＡフラグメントを除去した。次いで、前以て小規模パイロット消化により決定されている条件下でＤＮＡをＰｖｕIIで部分消化した。ゲル電気泳動後、２７５４塩基対のサイズを有する所望フラグメントをゲルから切り出し、ゲル精製した。そのようにして単離された２つのゲル精製されたフラグメントを混合し、エタノール沈殿し、１.５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する反応混合物中にペレットを溶解し、室温で一晩ライゲーションした。ライゲーション反応混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に撒いた。コロニーを単離し、アンピシリン含有ＬＢブロスで増殖させた。上記のごとくプラスミド微量調製を行った。次いで、プラスミドＤＮＡを含有する試料を、ＰｙｕII、ＳａｌI、ＨｉｎｄIIIプラスＡａｔIIおよびＳａｌIプラスＳｔｙIで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に供した。図１０に示すマップから推定される分子量の制限フラグメントを生じるプラスミドクローンを同定した。このクローンをｐＵＣＢｓｔ３と命名した。５'および３'非翻訳領域を伴わない（非翻訳終止コドンを伴う）Ｂｓｔ３開裂生成物のＤＮＡ配列を配列番号：２４に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５'−３'エキソヌクレアーゼドメイン中からヌクレオチドが除去されているので、プラスミドｐＵＣＢｓｔ３は、全長のＤＮＡポリメラーゼクローンｐＵＣＢｓｔ１よりも１９５塩基対短い。この欠失は、発現した修飾酵素の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインから６５個のアミノ酸（残基１７８〜２４２）の不存在を引き起こした。これら６５個のアミノ酸の中には、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性に必要なイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸に対応すると考えられる２個のグリシン残基が存在する（ジョイス（Joyce）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.B iol.）第１８６巻：２８３〜２９３頁（１９８５年）参照）。実施例７：すべてのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローン中へのテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入上記のすべてのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ含有プラスミドは、形質転換された宿主細胞にアンピシリン耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子を含んでいた。この遺伝子はβ−ラクタマーゼをコードしている。この遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、アンピシリン含有培地で増殖したた宿主細胞の培養物は、クローン化遺伝子の消失を伴う比較的高頻度の復帰がしばしば見られる。培養中の宿主細胞内でのプラスミドを安定化する試みにおいて、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔ^r）を付与するさらなる選択可能マーカー遺伝子を各プラスミドに付加した。上記のごとく、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲIプラスＡｖａIで消化し、消化混合物を電気泳動に供し、１４２７ｂｐのｔｅｔ^rフラグメントをゲル精製することにより、この遺伝子を含んでいるフラグメントをｐＢＲ３２２から単離した。イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて精製フラグメントをエンド−フィル（end-fill）し、得られた平滑末端化ｔｅｔ^rフラグメントをＡａｔIIオリゴヌクレオチドリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブズ）とライゲーションさせた。ゲル精製ＤＮＡフラグメントと合成リンカーとのライゲーションはすでに上に記載されており、当業者によく知られている（上記サムブルックの文献参照（すでに参照により本明細書に記載されていると見なした））ライゲーション混合物をエタノール沈殿し、ＤＮＡリガーゼを熱失活させた。次いで、リンカー含有フラグメントをＡａｔIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲル精製した。プラスミドベクターｐＵＣ１８をＡａｔIIで消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動を行い、直線状になった大きなフラグメントをゲル精製した。ＡａｔII消化ベクターおよびｔｅｔ^rフラグメント含有ＡａｔI Iリンカーを、上記のごとく、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールの溶液で順次抽出した。抽出ＤＮＡフラグメントを混合し、一緒にエタノール沈殿し、Ｔ４リガーゼ含有反応混合物中でライゲーションさせた。イー・コリＪＭ１０９細胞をこのライゲーション混合物で形質転換し、テトラサイクリン含有ＬＢ寒天プレート上に撒いた。上記のごとく、コロニーを単離し、テトラサイクリン含有ＬＢブロスで培養し、プラスミド微量調製を行った。プラスミド調製物をＥｃｏＲＶおよびＳｓｐIプラスＨｉｎｄIIIで消化し、アカロールゲル上の電気泳動に供した。１または２の可能な方向のｔｅｔ^r遺伝子を含有するプラスミドに関して予想されるサイズのＤＮＡフラグメントを生じるクローンを同定した。予想フラグメントサイズは、ＥｃｏＲＶ：４１２１、ＳｓｐI＋ＨｉｎｄIII：２１０２、１８６８および１５０であった。このプラスミドをｐＵＣＴｅｔ（＋）と命名した。精製ｐＵＣＴｅｔ（＋）ＤＮＡをこのクローンの細胞培養物から単離した。上記のごとく、このＤＮＡをＡａｔIIで消化し、消化混合物をアガロースゲル電気泳動に供し、１４３５ｂＰのｔｅｔ^rフラグメントをゲル精製した。次いで、各ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローンの単一ＡａｔIIベクター部位中に挿入するために、ｔｅｔ^r遺伝子源としてこのフラグメントを用いた。これを行うために、各ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローン由来のプラスミドＤＮＡ調製物をＡａｔIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、直線状になったプラスミドをゲル精製した。精製プラスミドフラグメントを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールの溶液で順次抽出した。精製ＡａｔII直線状プラスミドＤＮＡを１４３５ｂｐのｔｅｔ^rフラグメントと混合し、エタノール沈殿した。上記のごとく、Ｔ４リガーゼを含有する反応混合物にＤＮＡペレットを溶解し、該ＤＮＡフラグメントをライゲーションさせた。ライゲーション混合物を用いてイー・コリ１２００細胞を形質転換し、形質転換体をテトラサイクリン含有ＬＢ寒天上に撒いた。個々のコロニーをテトラサイクリン含有ＬＢブロスで培養し、これらの培養物のプラスミド微量調製を行った。各プラスミド中のｔｅｔ^r遺伝子の方向を決定するために、クローン化されたＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中の都合のよい認識部位を有する別の制限エンドニクレアーゼと組み合わされたＨｉｎｄIIIまたはＥｃｏＲＶのいずれかで各調製物から得たプラスミドＤＮＡを消化した。ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色後、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に方向に対して各方向に挿入されているｔｅｔ^rインサートを含むクローンを選択した。プラス（＋）方向を、Ｂｓｔポリメラーゼ遺伝子と転写に関して同じ方向であるとし、マイナス（−）方向を、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子とは逆方向とした。これらのクローンそれぞれのストックカルチャーを作成し、下記のごとくクローンを命名した。実施例８：ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼクローンにおける酵素発現の予備的評価本明細書記載のごとく構築されたクローンからの活性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの発現の予備的測定として、アンピシリンまたはテトラサイクリンのいずれかを含有するＬＢブロス培養にてそれらを一晩増殖させた。各方向のｌａｃＩ^q 遺伝子を含んでいるｐＵＣＢｓｔ２の培養物に１ｍＭのＩＰＴＧを添加して酵素発現を誘導した。Ｂｓｔ１、Ｂｓｔ２、およびＢｓｔ３の開裂生成物のアミノ酸配列を配列番号：２０、２３、および２５にそれぞれ示す。各培養物の部分試料０.５ｍｌを、ＳＤＳゲルおよび下記酵素活性アッセイにより分析した。酵素活性アッセイ用の各部分試料を微量遠心機で２分間遠心分離し、細胞ペレットを洗浄バッファー（５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、０.２５Ｍスクロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０））で１回洗浄した。ペレットを−８０℃で凍結し、それぞれを２００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１％グリセロール、２５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００μ ｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０））に溶解した。氷上に２０分置いた後、１００μｌの０.７５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を各試料に添加し、試料をドライアイスで凍結し、次いで、融解した（３回行った）。得られた細胞溶解物を、酵素希釈バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、０.１ｍＭＥＤＴＡ、０.０１％ＮＰ−４０（ポリグリコールエーテル誘導体からなる非イオン性界面活性剤、ミズーリ州、セント・ルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社製）、１０％グリセロール、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５））で５０００倍に希釈し、１０μｌの部分試料を、上記のごとく６０℃におけるＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。２つの実験の結果を下表に示す。アッセイ結果をＲＬＵ（相対光ユニット）で表す。第１の実験は、２種のイー・コリ宿主細胞、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'およびイー・コリ１２００株を用いた。イー・コリＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'はｔｅｔ^rのエピソームコピーを含む。ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'株プラスミドｐＵＣＢｓｔ１、ｐＵＣＢｓｔ２およびｐＵＣＢｓｔ３（すべて、ｔｅｔ^r遺伝子を欠く）で形質転換した。これらのクローンの培養物から得た溶解物の酵素活性を、各方向のｔｅｔ^r遺伝子を含む同じプラスミドのバージョンを含んでいるイー・コリ１２００宿主細胞から得た溶解物の活性と比較した。第２の実験において、上記のごとく構築されたｐＵＣＢｓｔ２（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ）のバージョンを、ｐＵＣＢｓｔ１Ｔ（＋）およびｐＵＣＢｓｔ３Ｔ（＋）と比較してＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ発現に対するｌａｃＩ^qリプレッサー遺伝子の影響を試験した。この実験に使用したすべてのクローンはイー・コリ１２００宿主細胞系中に存在し、ｌａｃＩ^q遺伝子を含むすべてのクローン（ｐＵＣＢｓｔ２ＡＮＢ、ＣおよびＤ）を１ｍＭＩＰＴＧ存在下で増殖させて、これらのプラスミド中のｌａｃプロモーターの支配下でＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導した。両方の実験で得られた細胞溶解物の部分試料について、上記サムブルックの文献参照（すでに参照により本明細書に記載されていると見なした）に記載されているようにしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシブリリアントブルー染色した。これらのゲルにより、負の対照と比較すると、ｐＵＣＢｓｔ１およびｐＵＣＢｓｔ３を含む宿主細胞から作成されたすべての細胞溶解物中に顕著な新しいバンドが明らかとなった。対照的に、ｐＵＣＢｓｔ２シリーズのプラスミドのいずれかを含む宿主細胞から作成された溶解物に対応するレーンにおいては新たなバンドは見られなかった。プラスミドのｐＵＣ１シリーズを含む細胞から新たに出現したバンドは、９７ｋＤａの分子量マーカーとほぼ同じ位置に泳動したが、プラスミドのｐＵＣＢｓｔ３シリーズを含む宿主細胞からの新たなバンドは数ｋＤａ小さかった。これらの蛋白バンドは、個々のプラスミド構築物によりコードされるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素の予想サイズとほぼ等しいところに泳動した。これら２つの実験から得られたデータはいくつかのことを示している。Ｂｓｔｌａｃプロモーターのごとき異種プロモーターを使用せずにＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をイー・コリ宿主細胞において発現させることができる。ｐＵＣＢｓｔ１シリーズおよびｐＵＣＢｓｔ３シリーズのクローンは、ポリメラーゼ遺伝子の５'末端に隣接する約６００塩基対のＢｓｔゲノムＤＮＡを含んでいる。理論に拘束されることを望まないが、出願人は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子産物の発現は、この領域の少なくとも１つのネイティブなプロモーターまたはプロモーター様配列によりドライブされると考える。これらのクローンはクローニングベクター中にｌａｃプロモーターを含んでいるが、それはポリメラーゼ遺伝子の下流にあり、Ｂｓｔポリメラーゼ遺伝子とは逆方向の転写を指令する。よって、このプロモーターはポリメラーゼ遺伝子の発現において機能するとは考えられない。驚くべきことに、ｌａｃＩ^q遺伝子の調節下のｌａｃプロモーターのごとき誘導的または抑制的プロモーターを用いずに、本発明組み換えＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をイー・コリ宿主細胞中において構成的に発現させることができる。対照的に、宿主細胞としてイー・コリを用いて他の生物由来の全長のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する試みはしばしば成功していない。例えば、ウエモリ（Uemori）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）第１１３巻：４０１〜４１０頁（１９８３年）およびジョイス（Joyce）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５７巻：１９５８〜１９６４頁（１９８２年）は、全長のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むクローンは不安定であり、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はクレノウ型フラグメントとして増殖することができるだけであり、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性は非常に低下するかまたは存在しないことを報告している。理論に限定されることを望まないが、出願人は、ｔｅｔ^r遺伝子により、そして最適温度６０℃（カボエフ（Kaboev）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第１４５巻：２１〜２６頁（1９８1年）と比較すると３７℃におけるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの比較的低い活性レベルにより、本発明クローンは改善された安定性を有することができると考える。実験は、イー・コリ１２００宿主細胞中系のｔｅｔ^rクローンは、イー・コリＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'宿主細胞系におけるｔｅｔ^rを有しない対応クローンよりも高レベルの酵素活性を発現したことを示す。理論に拘束されることを望まないが、出願人は、このことは、ｔｅｔ^r遺伝子を選択可能マーカーとして用いた場合、復帰頻度が低いことによると考える。（＋）方向（クローン化されたポリメラーゼ遺伝子と同じ方向）のｔｅｔ^r遺伝子を含むクローンも、（−）方向のｔｅｔ^r遺伝子を有するクローンよりも高レベルのＤＮＡポリメラーゼ活性を生じた。実施例９：ｐＵＣＢｓｔ１Ｔ（＋）由来のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼとＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ市販品との比較全長のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを、プラスミドｐＵＣＢｓｔ１Ｔ（＋）を含むイー・コリ１２００細胞から上記のごとく精製し、部分試料をズブチリシンで消化した。得られた分子量約６６０００ダルトンの大きな「クレノウ型」フラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼおよび３'−５'エキソヌクレアーゼドメインを含んでおり、これを上で詳述したように精製した。バイオ−ラッド・ラオラオリーズ（Bio-Rad Laboratories）から得られるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼズブチリシンフラグメントの市販標品を購入し、比較のために用いた。後者の酵素は、ズブチリシン開裂の前にビー・ステアロサーモフィルスの株から直接精製されたものであると報告されている。この株は、本発明組成物のための出発材料として用いたものとは異なる株である。この酵素は、イェー（Ye）およびホング（Hong）、サイエンティア・シニカ（Scientia Sinica）第３０巻：５０３〜５０６頁（１９８７年）に記載されており、ＤＮＡ配列決定反応におけるその使用は、ルー（Lu）ら、バイオテクニックス（BioTechniques）第１１巻：４６５〜４６６頁（１９９１年）、マククラリー（McClary）ら、ＤＮＡシークエンス（D NA Sequence）第１巻：１７３〜１８０頁（１９９１年）、およびミード（Mead ）ら、バイオテクニックス第１１巻：７６〜８７頁（１９９１年）に報告されている。ライダー（Ryder）ら、米国特許出願０８／０９７２６２（参照により本明細書に記載されているものと見なされ、さらに、本願と所有者が共通である）に記載されたように行われる核酸増幅反応におけるＤＮＡ合成のための鋳型としてのＨＩＶゲノムの一部と同じヌクレオチド配列を有する核酸を用いて、これら２つの酵素のアッセイを行った。この方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方の合成を用いて核酸配列を増幅するものである。５コピーの１本鎖ＨＩＶ鋳型および同数のユニットの各ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて核酸増幅を行った。比較実験の結果を下表に示し、相対光ユニットで表す。結果は、本発明組み換え酵素の全長およびズブチリシンフラグメントはともに、ＨＩＶＤＮＡの増幅を促進することができることを示す。実施例１０：正常白血球から得た細胞溶解物の存在下での核酸増幅ライダー（Ryder）の上記文献に記載されているように０.５ｍｌの全血から精製された正常ヒト・白血球の存在下で反応を行ったこと以外は、上と同様にして別のセットの増幅反応を行った。この実験において、上記実験のように５コピーではなく１０コピーのＨＩＶ鋳型ＤＮＡを用いた。結果を下表に示した。これらのデータは、本発明の全長のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよび組み換え酵素のズブチリシンにより得られた大きなフラグメントはともに、細胞溶解物存在下での増幅反応を支持したことを示す。実施例１１：組み換えＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素の感度アッセイ鋳型分子の数を反応あたり２.５または０.５コピーに減少させ、ＨＩＶゲノムのｐｏｌおよびｇａｇ領域の両方をプライマー結合および増幅の標的配列として用いたこと以外は、実施例９と同様にして別のセットの核酸増幅実験を行った。先に参照により本明細書に記載されていると見なしたライダーらの上記文献に記載されているようにして、得られたアンプリコンの検出を行った。ｐＵＣＢｓｔ１Ｔのズブチリシンによる大きなフラグメントのかわりに、イー・コリ１２００／ｐＵＣＢｓｔ３Ｔ（＋）から得た同様のサイズのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼフラグメントを用いた。このフラグメントは、ｐＵＣＢｓｔ３Ｔ酵素の精製の間に、内在性プロテアーゼ活性により自発的に生産される。これらのデータは、特に、低い鋳型レベルにおいて、本発明の好ましい酵素の全長および「クレノウ」形態はともに、核酸増幅反応を支持することを示す。実施例１２：選択されたＤＮＡポリメラーゼ酵素のＮ末端配列決定異なる切断ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素間における構造／機能相関関係をよりよく理解するために、、Ｂｓｔ１の活性ズブチリシンフラグメント（「クレノウ」フラグメント）、イー・コリにより発現されたクローン化Ｂｓｔ３ＤＮＡポリメラーゼの自然に生じた分解産物、およびクローン化されていないＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ標品由来の生物学的に活性のあるズブチリシンフラグメント（バイオ−ラッド・ラボラトリーズから得た）の試料を上記のごとく精製し、Ｎ末端配列決定に供した。アミノ酸配列決定方法は当業者によく知られている。かかる方法は、ヘウィック（Hewick）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５６巻：７９９０〜７９９７頁（１９８１年）に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものと見なす。Ｎ末端アミノ酸配列決定の自動的方法も当該分野においてよく知られている。本明細書記載のアミノ酸配列決定は、イン−ライン（in-line）ＨＰＬＣを備えたアプライド・バイオシステムズ−４７０Ａ気相シークエンサーを用いて、製造者に説明書に従って行われた。上記ポリペプチドをアミノ酸配列決定に供し、得られた配列を並べ、全長のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ｐＵＣＢｓｔ１クローンによりコードされる）のアミノ酸残基２８５に対応する領域において比較した。得られた配列を図１２に示す。Ｂｓｔ１、Ｂｓｔ２およびＢｓｔ４（実施例１３参照）のアミノ酸配列を核酸配列により推定した。Ｂｓｔ２およびＢｓｔ４の場合には、翻訳開始コドンＡＴＧ（メチオニンをコード）がコーディング領域の第１コドンであった。よって、これらの酵素は、示された残基の前にＮ末端Ｍｅｔ残基を有していてもよい。また、この残基は発現蛋白中においてイー・コリにより除去されるかもしれない。理解できるように、本発明全長のＢｓｔポリメラーゼのズブチリシンフラグメントは、全長のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置２８９に対応するスレオニン残基から始まるポリペプチドである。このペプチドはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子由来の全長蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインに対応する制限フラグメントが組み込まれているｐＵＣＢｓｔ２によりコードされるＢｓｔ２蛋白はアスパラギン酸から始まる。このアミノ酸は全長のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２９０に対応する位置を占め、Ｂｓｔ１のズブチリシンフラグメントの２番目の残基である。イー・コリにおいて発現されるこの酵素はＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいては活性があるが、Ｂｓｔ１またはそのズブチリシンフラグメントよりも低レベルの活性である。ｐＵＣＢｓｔ３を含む細胞により発現された蛋白は２つの形態で見いだされる。これらの形態の最初のものにおいては、開裂されていない蛋白は、全長のＢｓｔ１蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインにおける欠失を含んでいる。しかしながら、両蛋白とも同じＮ末端を有しており、Ｂｓｔ１蛋白のアミノ酸残基２８５に対応する領域は両蛋白において類似している。第２の形態のＢｓｔ３酵素は、イー・コリのプロテアーゼによるＢｓｔ３蛋白の開裂産物であると思われる。このフラグメントは１番目のアミノ酸バリンから始まる。この残基は本発明の全長のＢｓｔポリメラーゼクローンのアミノ酸２８７に対応する。この蛋白分解フラグメントの３番目の残基はスレオニン残基であり、そこからＢｓｔ１ズブチリシンフラグメントのアミノ酸配列が始まる。４番目の残基はアスパラギン酸残基であり、そこからＢｓｔ２蛋白のアミノ酸配列が始まる。驚くべきことに、市販ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ標品（「クレノウ」フラグメント）から得られた配列の情報により、このズブチリシンフラグメントのＮ末端残基は、全長のＢｓｔ１蛋白配列のアミノ酸２９０に対応する位置のアラニン残基から始まることが明らかとなった。上に開示したように、Ｂｓｔ２蛋白はこの位置のアスパラギン酸残基から始まる。この領域において配列決定された本発明のすべての他の酵素も、この位置におけるアスパラギン酸を示した。そのうえ、このフラグメントのＮ末端のはじめの２１個のアミノ酸により、この領域において、市販のクローン化されていないＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ標品と本発明酵素との間で７個の残基（あるいは３３％）のアミノ酸が異なっていることが明らかとなった。図１２参照。さらに、本発明蛋白のアミノ酸配列と公表されたＢｃａＤＮＡポリメラーゼ配列との比較により、この領域において、公表されたＢｃａＤＮＡポリメラーゼ配列（先に参照により本明細書に記載されているものと見なした）と本発明ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼとの間において、２５個の残基のうち１２個、あるいは約５０％のアミノ酸が異なっていることが示される（図１２参照）。全体的には、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の８７６個のうち１０５個のアミノ酸（約１２％）が公表されたＢｃａＤＮＡポリメラーゼ配列の対応部分には見いだされない。実施例１３：Ｂｓｔ３の活性蛋白分解フラグメントと同じＮ末端を有するＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ４）の構築上記実施例１２に記載のごとく、バリン残基から始まり、かつＢｓｔ３の自然分解産物のアミノ酸配列を有している蛋白をコードするように、プラスミドｐＵＣＢｓｔ２の構築に用いた方法と同様にしてプラスミドクローンを構築した。ＤＮＡ遺伝子インサートのコーディング領域は配列番号：２６のヌクレオチド配列を有する。該プラスミドを用いて１２００株を形質転換した。この形質転換体の培養から得られた溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動に供し、予想される移動度の蛋白バンドを図１４のごとく観察した。この蛋白をＢｓｔ４と命名した。当該クローンについて予想されるＮ末端アミノ酸を図１２に示し、Ｂｓｔ４の全推定アミノ酸配列を配列番号：２７に示す。図１３は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子インサートおよびゲノムＢｓｔ遺伝子ならびにその３つのドメインに対するそれらの関係を図式的に示す。実施例１４：５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ点突然変異体の構築それぞれが５'−３'エキソヌクレアーゼドメインにおける単一のアミノ酸置換を有するＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをコードする２つの異なるさらなるプラスミドクローンを構築した。このドメインにおける単一の置換はポリメラーゼ活性または当該酵素の発現に有意に影響しそうもないので、かかる置換は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く変異酵素の構築のための方法を提供した。第１の方法は、野生型Ｂｓｔ１酵素（配列番号：２０）の位置７３のチロシンをフェニルアラニン残基に変化させることであった。チロシン残基のヒドロキシル基は、５'−３'エキソヌクレアーゼドメインの活性部位における、あるいはその付近における反応にはもはや利用されないことからこの置換を選択したが、空間を占めるフェニル基はチロシンおよびフェニルアラニンに共通しているので酵素全体のコンホーメーションはほとんど影響されないはずである。ｐｈｅ₇₃変異体をＢｓｔ５と命名した。Ｂｓｔ６と命名された他の変異体酵素を、Ｂｓｔ１アミノ酸配列の位置７３におけるチロシンをアラニン残基に置換することにより得た。この残基は、極性基を非極性基に交換するのみならず、立体的に大きなアミノ酸側鎖基をずっと小さい側鎖基と交換するので、この置換は、Ｂｓｔ５において見られるよりもポリメラーゼ酵素のコンホーメーションを変化させると考えられた。他のＢｓｔインサートおよびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３つのドメインとの関係においてｐＵＣＢｓｔ５およびｐＵＣＢｓｔ６ＤＮＡインサートを図式的に示したものを図１３に示す。Ｂｓｔ５の構築プラスミドｐＵＣＢｓｔ１をＡｃｃIおよびＸｍｎI制限酵素で部分消化し、アガロースゲル電気泳動を行った。Ｂｓｔ１座標（配列番号：２１）１０３のＡｃｃI部位からＢｓｔ１座標２５６のＸｍｎI部位までの１５３ｂｐの領域を全長のプラスミドから差し引いたものに対応するＡｃｃI／ＸｍｎI ＤＮＡバンドをゲルから切り出し、標準的方法を用いてゲル精製した。配列番号：２８および２９の合成オリゴヌクレオチドを、上記実施例４記載の方法と同様の方法を用いて合成した。１５ピコモルの各オリゴヌクレオチドを混合して２つの反応系とし、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、２ｍＭＭｇＣｌ₂および５０ｍＭＫＣｌからなる溶液中で７２℃において５分間インキュベーションした。次いで、溶液をゆっくりと４０℃まで冷却して、３'末端において相補的ヌクレオチド配列を有するそれらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。次いで、それぞれ０.２ｍＭのｄＮＴＰおよび１０ユニットのイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを溶液に添加して平滑末端２本鎖ＤＮＡフラグメントを作成した。該ＤＮＡフラグメントは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素のアミノ酸７２に対応するコドンに所望の変化を有するネイティブなＢｓｔＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列、さらにコーディング鎖の５'末端近くにＡｃｃI部位およびコーディング鎖の３'末端近くにＸｍｎI部位を含んでいた。さらに、合成オリゴヌクレオチドにより単一の縮重変異をヌクレオチド配列中に導入して、診断上有用な新たな制限部位を作成した。この変異はＢｓｔ酵素においてさらなるアミノ酸置換を生じなかった。反応混合物を３７℃で５０分インキュベーションした。２系の反応物をプールし、フェノール／クロロホルム、次いで、クロロホルムで抽出し、最後に、２本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントをエタノール沈殿した。得られたフラグメントを再溶解し、３０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼおよび０.５ｍＭのＡＴＰを用いて３７℃で１時間ホスホリレーションした。プラスミドｐＧｅｍ−３Ｚ（１.２２μｇ）を１０ユニットのＳｍａIで、室温において６５分消化し、次いで、フェノール／クロロホルム、そしてクロロホルムのみで抽出した。約１１ピコモルのホスホリレーションされた合成２本鎖フラグメントを０.２４μｇのＳｍａI消化プラスミドｐＧｅｍ−３Ｚと混合し、核酸を同時エタノール沈殿した。ペレットを復元し、１５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、室温においてライゲーションを行った。得られたライゲーション混合物を用いてイー・コリ１２００株を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天上に撒いた。３７℃で一晩インキュベーション後、アンピシリン耐性コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢ中で増殖させ、プラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化（ＸｍｎI）を用いてスクリーニングした。期待される合成ＤＮＡフラグメントインサートを有するクローンを同定した。プラスミドの調製をこれらのクローンについて行い、ＡｃｃIおよびＸｍｎIでプラスミドを消化した。次いで、制限消化物を電気泳動し、１５３ｂｐのフラグメントをゲル単離し、上記のごとく前以てゲル単離しておいたｐＵＣＢｓｔＩフラグメントとライゲーションさせた。ライゲーション混合物を用いてＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'細胞を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天上に撒いた。アンピシリン耐性コロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢ中で増殖させ、プラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてスクリーニングした。期待されるＢｓｔ５インサートを含むプラスミドをＡａｔIIで消化し、上記実施例７記載のごとく１４３５ｂｐのテトラサイクリン耐性遺伝子フラグメントとライゲーションさせた。ライゲーション混合物を用いてイー・コリ１２００株を形質転換し、形質転換体をテトラサイクリン含有ＬＢ寒天上に撒いた。テトラサイクリン耐性コロニーを、テトラサイクリン含有ＬＢ中で増殖させ、プラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてスクリーニングした。両方向のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むクローンを同定し、ｐＵＣＢｓｔ５Ｔ［＋］およびｐＵＣＢｓｔ５Ｔ［−］と命名した。これらの形質転換体により発現された蛋白のＳＤＳ −ＰＡＧＥ分析により、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼに関して予想される位置に泳動する蛋白バンドが示された。これらの形質転換体の溶解物はＤＮＡポリメラーゼ活性を示した。さらに、これらの形質転換体からのプラスミドＤＮＡを変異領域において配列決定し、Ｂｓｔポリメラーゼ遺伝子中の予想されたＤＮＡ配列を有することを確認した。配列決定反応を上記のごとく行った。Ｂｓｔ６の構築構築に使用した合成オリゴヌクレオチドペアーが配列番号：２８および３０であること以外は、Ｂｓｔ５とちょうど同じようにしてＢｓｔ６を構築した。両方向のテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＢｓｔ６のテトラサイクリン耐性クローンを、ｐＵＣＢｓｔ６Ｔ［＋］およびｐＵＣＢｓｔ６Ｔ［−］と命名した。さらにこれらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼに対応する位置に移動する蛋白を発現し、これらの形質転換体からの溶解物はＤＮＡポリメラーゼ活性を示した。プラスミドＤＮＡの配列決定により、Ｂｓｔ６遺伝子中の予想ヌクレオチド配列が明らかになった。Ｂｓｔ５およびＢｓｔ６に関するＤＮＡポリメラーゼ活性のアッセイ４つのＢｓｔ５およびＢｓｔ６クローンのそれぞれを、テトラサイクリン含有ＬＢ中で一晩増殖させ、実施例８記載のごとくＤＮＡポリメラーゼ活性の発現について分析した。アッセイ結果を下表に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＢｓｔ５および６クローンからの溶解物の分析により、ほぼ等量の約９７ｋＤａの目立ったバンドが示された。このバンドはイー・コリ１２００／ｐＵＣＴｅｔ［＋］からの溶解物には存在しなかった。Ｂｓｔ５および６クローンの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ上記と実質的に同じ方法でＢｓｔ５およびＢｓｔ６酵素を精製した。精製Ｂｓｔ１、Ｂｓｔ５ならびにＢｓｔ６酵素、およびＢｓｔ１からの精製ズブチリシンＤＮＡポリメラーゼフラグメントを、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性につてアッセイした。５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることが知られている、ニュー・イングランド・バイオラブズから得たベント（Vent）^R ＤＮＡポリメラーゼを負の対照として用いた。パーキン・エルマー（Perkin Elm er）から得たｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を含むことが知られている。これを正の対照として用いた。アッセイを下記のごとく行った。ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドｐＧｅｍ３ＺＤＮＡを直線状にし、次いで、アルカリ性ホスファターゼで処理して５'末端をホスホリレーションした。次いで、上記のごとく、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、該ＤＮＡを５'末端において³²Ｐで標識した。約０.０１５ピコモル（１３００００ｃｐｍ）のこの標識基質を各アッセイ反応に用いた。Ｂｓｔ１、Ｂｓｔ５およびＢｓｔ６酵素についての各アッセイについては、０.５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、９０ｍＭＫＣｌおよび１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）を含有する反応混合物中の基質核酸に異なる量の各酵素を添加した。各反応系の全体積は５０μｌであった。反応混合物を６０℃で３時間インキュベーションし、次いで、氷で冷却した。次いで、担体として１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡを各試験管に添加し、次いで、反応試験管に２０μｌの冷５０％トリクロロ酢酸を添加した。試験管を氷上で２０分インキュベーションし、次いで、微量遠心機で５分間遠心分離した。上清およびペレットを分離し、それぞれを放射活性の存在についてシンチレーションカウンターでカウントした。上清中に遊離された全ｃｐｍのパーセンテージを５'− ３'エキソヌクレアーゼ活性の測定値として用いた。製造者の説明書に従って行った以下の変更を行って、ベント^RおよびｒＴｔｈ酵素を同様の方法でアッセイした。ベント^R酵素については、０.５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２ｍＭＭｇＳＯ₄、および０.１％（ｖ／ｖ）トリトン^R− Ｘ１００を含有する全体積５０μｌの反応混合物中の基質に酵素を添加した。反応混合物を７０℃でインキュベーションした。ｒＴｔｈ酵素については、さらに０.６ｍＭＭｎＣｌ₂、１００ｍＭＫＣｌ、０.７５ｍＭＥＧＴＡ、０.０５％（ｖ／ｖ）ツイン^R２０、および５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する、全体積５０μｌのＢｓｔ酵素用と同じ反応混合物中に酵素を添加した。反応混合物を７０℃でインキュベーションした。酵素活性に関する製造者のユニットがジェン−プローブの酵素活性に関するユニットと同じでないので、ベント^RおよびｒＴｔｈ反応に添加した酵素濃度は、ＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいて活性があると決定された酵素量に基づくものであった。下表は、２系のアッセイの平均データを示す。これらのデータは、Ｂｓｔ５およびＢｓｔ６酵素は、高い酵素濃度においてさえも、検出可能な５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を含まないことを示す。さらに該データは、Ｂｓｔ１の精製ズブチリシンポリメラーゼフラグメントも検出可能な５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を含まないことを確認するものである。実施例１５：核酸増幅を支持するＢｓｔ５およびＢｓｔ６の能力精製Ｂｓｔ酵素を、核酸増幅を支持する能力につて試験した。市販ソースの非組み換えＢｓｔＤＮＡポリメラーゼズブチリシンフラグメントがウィスコンシン州ミルウォーキーのモレキュラー・バイオロジカル・リゾーシズ（Molecular Biological Resouerces）のものであること以外は、実質的には実施例９記載のごとく核酸増幅を行った。同数のユニットの各酵素を各アッセイに使用した。実施例１６：配列決定反応における精製Ｂｓｔ１ズブチリシンフラグメントおよびＢｓｔ５ならびに６酵素の使用Ｂｓｔ１、Ｂｓｔ５ならびに６酵素およびＢｓｔ１クローン由来のズブチリシンフラグメントを上記のごとく精製し、配列決定反応を支持するそれらの能力について試験した。バイオ−ラッド（カリフォルニア州ハークルス（Hercul es,CA））のＢｓｔ配列決定試薬を用いて製造者のプロトコールに従って配列決定反応を行い、非組み換え（ネイティブな）酵素のズブチリシンフラグメントであるバイオ−ラッドＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いる反応と比較した。使用したプライマーおよび鋳型は、プロメガ・コーポレイション（Promega Corp. ）から得たＴ７プロモーター−プライマーおよびｐＧｅｍ３Ｚプラスミドであった。Ｂｓｔ１およびネイティブな酵素双方ののズブチリシンフラグメント、ならびにＢｓｔ５酵素と６酵素の双方は、明確な配列決定ラダーを生じたが、Ｂｓｔ１ホロ酵素はシグナルを全く生じなかった。全長のＢｓｔ１酵素は５'− ３'エキソヌクレアーゼ活性を有しているため、新たに合成された鎖の分解速度がこれらの鎖の合成速度と平衡にあり、配列決定が有効でないのである。よって、該結果は、これらの配列決定反応においてＢｓｔ５酵素と６酵素がＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのズブチリシンフラグメントと同等なものとなり、ズブチリシン消化および再精製の必要を未然になくすという利点がさらに付加される程度にまでＢｓｔ５酵素と６酵素の単一のアミノ酸置換によって所望でない５'−３' エキソヌクレアーゼ活性が除去されたことを示す。上記実施例は、本発明に種々の具体例を例示するが、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲およびその均等物は下記請求の範囲によってのみ画定される。

【手続補正書】【提出日】１９９７年４月４日【補正内容】補正した請求の範囲１．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来の蛋白をコードしているか、または該蛋白のＤＮＡポリマー化活性のある切断形態をコードしているか、または該活性蛋白に対して実質的な配列相同性を有する蛋白をコードしているヌクレオチト配列からなる精製組み換えＤＮＡ分子。２．該ヌクレオチド配列が、該バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白のＤＮＡポリメラーゼ領域、３'−５'エキソヌクレアーゼ領域、および５'−３' エキソヌクレアーゼ領域をコードしている異なるドメインからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。３．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白が３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。４．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白が５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。５．該バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をコードしているドメインからなる該ヌクレオチド配列が修飾されて該５'−３'エキソヌクレアーゼ活性が減少または除去されている請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。６．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。７．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。８．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。９．配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３１および配列番号：３３からなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１または２の精製組み換えＤＮＡ分子。１０．ａ．配列番号：２２、およびｂ．配列番号：２２が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１１．ａ．配列番号：２６、およびｂ．配列番号：２６が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１２．ａ．配列番号：２４、およびｂ．配列番号：２４が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１３．ａ．配列番号：３１、およびｂ．配列番号：３１が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１４．ａ．配列番号：３３、およびｂ．配列番号：３３が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１５．異種宿主細胞において発現可能な精製組み換えＤＮＡ分子であって、（ａ）該宿主細胞内で該分子の数を増加させるための複製開始点を有するＤＮＡフラグメント、（ｂ）該宿主細胞において、該組み換えＤＮＡ分子によってコードされる蛋白の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮＡフラグメント、（ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するバチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白をコードしているか、または上記蛋白のＤＮＡポリマー化活性のある切断形態をコードしているか、または該活性蛋白に対して実質的な配列相同性を有する蛋白をコードしているＤＮＡフラグメント、および（ｄ）選択可能マーカー遺伝子からなるＤＮＡフラグメントからなっており、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白が該宿主細胞において発現されるように上記ＤＮＡフラグメントが結合されている精製組み換えＤＮＡ分子。１６．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしているＤＮＡフラグメントがさらに該蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をコードしている請求項１５の組み換えＤＮＡ分子。１７．該蛋白をコードしているＤＮＡフラグメントが、さらに該蛋白のアミノ酸配列中の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインをコードしており、修飾を行わない場合に当該ＤＮＡフラグメントによって発現される蛋白と比較すると、発現される蛋白が５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を低下させているかまたは有しないものとなるように修飾が行われている、請求項１５または１６の精製組み換えＤＮＡ分子。１８．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する全長のバチルス・ステアロサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼをコードしている別のＤＮＡフラグメントからの１個またはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失により得られるものであり、該全長のバチルス・ステアロサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼと比較すると該蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性が低下させられているかまたは存在しないものである、請求項１５の精製組み換えＤＮＡ分子。１９．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの約８５８個ないし８６７個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項１８の精製組み換えＤＮＡ分子。２０．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８５８個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項１９の精製組み換えＤＮＡ分子。２１．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８６７個のヌクレオチドの欠失により得られるものである、請求項１９の精製組み換えＤＮＡ分子。２２．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８６４個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項１９の精製組み換えＤＮＡ分子。２３．該未修飾ＤＮＡフラグメントのコーディング領域中の１個またはそれ以上のコドンの変化を含む請求項１７の精製組み換えＤＮＡ分子。２４．発現されると、配列番号：２０のアミノ末端から数えて７３番目のアミノ酸に対応する位置におけるチロシン残基のフェニルアラニン残基への置換を生じるものである請求項２３の精製組み換えＤＮＡ分子。２５．発現されると、配列番号：２０のアミノ末端から数えて７３番目のアミノ酸に対応する位置におけるチロシン残基のアラニン残基への置換を生じるものである請求項２３の精製組み換えＤＮＡ分子。２６．請求項１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のいずれかの組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。２７．異種宿主細胞において発現され生産されるバチルス・ステアロサーモフィルス由来であって、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される約９８０００ダルトンの見かけの分子量を伴って移動し、ａ）配列番号：２０、ｂ）配列番号：３１、ｃ）配列番号：３３、ｄ）配列番号：２０が後に続くメチオニン、ｅ）配列番号：３１が後に続くメチオニン、ｆ）配列番号：３３が後に続くメチオニン、ｇ）配列番号：２０に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列、ｈ）配列番号：３１に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列、およびｉ）配列番号：３３に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する精製蛋白。２８．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白からなる請求項２７の精製蛋白。２９．さらに５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない蛋白からなる請求項２８の精製蛋白。３０．核酸プライマーの伸長末端における３'ヒドロキシル基とヌクレオチド三リン酸との間の結合形成を触媒するプライマー伸長反応における請求項４０の精製蛋白の使用方法であって：ａ．該蛋白を、鋳型核酸、核酸プライマー、核酸モノマー、およびＤＮＡポリメラーゼ活性に必要なコファクターと接触させて反応混合物を作成し、次いでｂ．順次鋳型により指向される核酸プライマーの３'末端へのヌクレオチド付加を引き起こすに十分な温度において該反応混合物をインキュベーションすることからなる方法。３１．異種宿主細胞において発現され生産されるバチルス・ステアロサーモフィルス由来であって、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される約６００００ダルトンの見かけの分子量を伴って移動し、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、上記アミノ酸配列の１つが後に続くメチオニン残基、および上記アミノ酸配列に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する精製蛋白。３２．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白からなる請求項３１の精製蛋白。３３．さらに５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない蛋白からなる請求項３２の精製蛋白。３４．イー・コリ（E.coli）宿主細胞により生産される精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素であって、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードしている遺伝子の発現により生産される蛋白分解的開裂生成物である酵素。３５．プロテアーゼでの請求項３１の蛋白の消化により得られる精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。３６．プロテアーゼがズブチリシンである請求項３５の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。３７．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く請求項３４の酵素。３８．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く請求項３５の酵素。３９．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。４０．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、ａ．該ポリメラーゼをコードしている遺伝子を含むＤＮＡベクターを該ポリメラーゼを発現可能な宿主細胞中に挿入し、ｂ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが発現される条件下で該ベクター含有宿主細胞を培養し、次いでｃ．該宿主細胞培養物より該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを抽出することからなる方法。４１．多数の異種宿主細胞において発現されたバチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法であって、下記工程：ａ．該宿主細胞から該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抽出し、細胞抽出物を得て、ｂ．約２５ミリモラーの塩濃度を含む溶液中のアニオン交換媒体に該抽出物を接触させ、ｃ．少なくとも約０.１ないし０.２ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該アニオン交換媒体から該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離し、ｄ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをカチオン交換樹脂に結合させ、ｅ．少なくとも約０.２５ないし０.３０ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離し、ｆ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをアニオン交換樹脂に結合させ、ｇ．少なくとも約０.２ないし０.４ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離することからなる方法。４２．配列番号：２０のアミノ酸配列中に含まれる少なくとも５０個の連続したアミノ酸を有する精製蛋白。４３．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する請求項４２の精製蛋白。４４．配列番号：２０のアミノ酸配列中に含まれる少なくとも７５個の連続したアミノ酸を有する精製蛋白。４５．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する請求項４４の精製蛋白。４６．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているかまたはほとんど有しておらず、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３１および配列番号：３３、上記アミノ酸配列の１つが後に続くメチオニン残基、および上記アミノ酸配列に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、バチルス・ステアロサーモフイルス由来の修飾耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ４７．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分をコードしているヌクレオチド配列、または該一部分のフラグメントもしくは誘導体をコードしているヌクレオチド配列からなる精製組み換えＤＮＡ分子であって、該フラグメントもしくは該一部分が下記活性：ａ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する免疫応答を誘導することができる活性、ｂ．鋳型により指向される、該鋳型の一部分にハイブリダイゼーションした核酸プライマーの３'末端へのヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒することができる活性、またはｃ．上記活性の組み合わせを有するポリペプチドをコードしているものである精製組み換えＤＮＡ分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号０８／３９４，２３２ (32)優先日 1995年２月24日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者トゥドール，スターラ・ダイアンアメリカ合衆国92117カリフォルニア州サン・ディエゴ、マウント・ダーバン・ドライブ 4835番

Claims

【特許請求の範囲】１．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来の蛋白をコードしているか、または該蛋白のＤＮＡポリマー化活性のある切断形態をコードしているか、または該活性蛋白に対して実質的な配列相同性を有する蛋白をコードしているヌクレオチド配列からなる精製組み換えＤＮＡ分子。２．該ヌクレオチド配列が、該バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白のＤＮＡポリメラーゼ領域、３'−５'エキソヌクレアーゼ領域、および５'−３' エキソヌクレアーゼ領域をコードしている異なるドメインからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。３．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白が３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。４．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白が５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。５．該バチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をコードしているドメインからなる該ヌクレオチド配列が修飾されて該５'−３'エキソヌクレアーゼ活性が減少または除去されている請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。６．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。７．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。８．該ヌクレオチド配列が、配列番号：２１に示すヌクレオチド配列の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドからなる請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。９．配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３１および配列番号：３３からなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１の精製組み換えＤＮＡ分子。１０．配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３１および配列番号：３３からなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項２の精製組み換えＤＮＡ分子。１１．ａ．配列番号：２２、およびｂ．配列番号：２２が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１２．ａ．配列番号：２６、およびｂ．配列番号：２６が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１３．ａ．配列番号：２４、およびｂ．配列番号：２４が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１４．ａ．配列番号：３１、およびｂ．配列番号：３１が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１５．ａ．配列番号：３３、およびｂ．配列番号：３３が後に続くＡＴＧからなるサブグループから選択されるヌクレオチド配列を有する請求項５の精製組み換えＤＮＡ分子。１６．異種宿主細胞において発現可能な精製組み換えＤＮＡ分子であって、（ａ）該宿主細胞内で該分子の数を増加させるための複製開始点を有するＤＮＡフラグメント、（ｂ）該宿主細胞において、該組み換えＤＮＡ分子によってコードされる蛋白の発現に有効であるプロモーター領域からなるＤＮＡフラグメント、（ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するバチルス・ステアロサーモフィルス由来の蛋白をコードしているか、または上記蛋白のＤＮＡポリマー化活性のある切断形態をコードしているか、または該活性蛋白に対して実質的な配列相同性を有する蛋白をコードしているＤＮＡフラグメント、および（ｄ）選択可能マーカー遺伝子からなるＤＮＡフラグメントからなっており、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白が該宿主細胞において発現されるように上記ＤＮＡフラグメントが結合されている精製組み換えＤＮＡ分子。１７．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしているＤＮＡフラグメントがさらに該蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をコードしている請求項１６の組み換えＤＮＡ分子。１８．該蛋白をコードしているＤＮＡフラグメントが、さらに該蛋白のアミノ酸配列中の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインをコードしており、修飾を行わない場合に当該ＤＮＡフラグメントによって発現される蛋白と比較すると、発現される蛋白が５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を低下させているかまたは有しないものとなるように修飾が行われている、請求項１６の精製組み換えＤＮＡ分子。１９．該蛋白をコードしているＤＮＡフラグメントが、さらに該蛋白のアミノ酸配列中の５'−３'エキソヌクレアーゼドメインをコードしており、修飾を行わない場合に当該ＤＮＡフラグメントによって発現される蛋白と比較すると、発現される蛋白が５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を低下させているかまたは有しないものとなるように修飾が行われている、請求項１７の精製組み換えＤＮＡ分子。２０．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する全長のバチルス・ステアロサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼをコードしている別のＤＮＡフラグメントからの１個またはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失により得られるものであり、該全長のバチルス・ステアロサーモフィルスのＤＮＡポリメラーゼと比較すると該蛋白の５'−３'エキソヌクレアーゼ活性が低下させられているかまたは存在しないものである、請求項１６の精製組み換えＤＮＡ分子。２１．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの約８５８個ないし８６７個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項２０の精製組み換えＤＮＡ分子。２２．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８５８個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項２１の精製組み換えＤＮＡ分子。２３．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８６７個のヌクレオチドの欠失により得られるものである、請求項２１の精製組み換えＤＮＡ分子。２４．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白をコードしている該ＤＮＡフラグメントが、該他のコーディングＤＮＡフラグメントの５'末端からの８６４個のヌクレオチドの欠失ならびに結果生じたＤＮＡフラグメントの５'末端への翻訳開始コドンの付加により得られるものである、請求項２１の精製組み換えＤＮＡ分子。２５．該未修飾ＤＮＡフラグメントのコーディング領域中の１個またはそれ以上のコドンの変化を含む請求項１８の精製組み換えＤＮＡ分子。２６．発現されると、配列番号：２０のアミノ末端から数えて７３番目のアミノ酸に対応する位置におけるチロシン残基のフェニルアラニン残基への置換を生じるものである請求項２５の精製組み換えＤＮＡ分子。２７．発現されると、配列番号：２０のアミノ末端から数えて７３番目のアミノ酸に対応する位置におけるチロシン残基のアラニン残基への置換を生じるものである請求項２５の精製組み換えＤＮＡ分子。２８．請求項１６の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。２９．請求項１８の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３０．請求項２０の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３１．請求項２１の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３２．請求項２２の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３３．請求項２３の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３４．請求項２４の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３５．請求項２５の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３６．請求項２６の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３７．請求項２７の組み換えＤＮＡ分子を含んでいる宿主細胞。３８．異種宿主細胞において発現され生産されるバチルス・ステアロサーモフィルス由来であって、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される約９８０００ダルトンの見かけの分子量を伴って移動し、ａ）配列番号：２０、ｂ）配列番号：３１、ｃ）配列番号：３３、ｄ）配列番号：２０が後に続くメチオニン、ｅ）配列番号：３１が後に続くメチオニン、ｆ）配列番号：３３が後に続くメチオニン、ｇ）配列番号：２０に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列、ｈ）配列番号：３１に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列、およびｉ）配列番号：３３に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する精製蛋白。３９．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白からなる請求項３８の精製蛋白。４０．さらに５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない蛋白からなる請求項３９の精製蛋白。４１．核酸プライマーの伸長末端における３'ヒドロキシル基とヌクレオチド三リン酸との間の結合形成を触媒するプライマー伸長反応における請求項４０の精製蛋白の使用方法であって：ａ．該蛋白を、鋳型核酸、核酸プライマー、核酸モノマー、およびＤＮＡポリメラーゼ活性に必要なコファクターと接触させて反応混合物を作成し、次いでｂ．順次鋳型により指向される核酸プライマーの３'末端へのヌクレオチド付加を引き起こすに十分な温度において該反応混合物をインキュベーションすることからなる方法。４２．異種宿主細胞において発現され生産されるバチルス・ステアロサーモフィルス由来であって、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される約６００００ダルトンの見かけの分子量を伴って移動し、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、上記アミノ酸配列の１つが後に続くメチオニン残基、および上記アミノ酸配列に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する精製蛋白。４３．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白からなる請求項４２の精製蛋白。４４．さらに５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない蛋白からなる請求項４３の精製蛋白。４５．イー・コリ（E.coli）宿主細胞により生産される精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素であって、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードしている遺伝子の発現により生産される蛋白分解的開裂生成物である酵素。４６．プロテアーゼでの請求項４２の蛋白の消化により得られる精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。４７．プロテアーゼがズブチリシンである請求項４６の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。４８．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く請求項４５の酵素。４９．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く請求項４６の酵素。５０．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど有しないかまたは有しない精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。５１．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、ａ．該ポリメラーゼをコードしている遺伝子を含むＤＮＡベクターを該ポリメラーゼを発現可能な宿主細胞中に挿入し、ｂ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが発現される条件下で該ベクター含有宿主細胞を培養し、次いでｃ．該宿主細胞培養物より該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを抽出することからなる方法。５２．多数の異種宿主細胞において発現されたバチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法であって、下記工程：ａ．該宿主細胞から該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抽出し、細胞抽出物を得て、ｂ．約２５ミリモラーの塩濃度を含む溶液中のアニオン交換媒体に該抽出物を接触させ、ｃ．少なくとも約０.１ないし０.２ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該アニオン交換媒体から該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離し、ｄ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをカチオン交換樹脂に結合させ、ｅ．少なくとも約０.２５ないし０.３０ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離し、ｆ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをアニオン交換樹脂に結合させ、ｇ．少なくとも約０.２ないし０.４ＭのＮａＣｌの塩濃度に相当するイオン強度を有する溶液で該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶離することからなる方法。５３．配列番号：２０のアミノ酸配列中に含まれる少なくとも５０個の連続したアミノ酸を有する精製蛋白。５４．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する請求項５３の精製蛋白。５５．配列番号：２０のアミノ酸配列中に含まれる少なくとも７５個の連続したアミノ酸を有する精製蛋白。５６．ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する請求項５５の精製蛋白。５７．５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているかまたはほとんど有しておらず、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３１および配列番号：３３、上記アミノ酸配列の１つが後に続くメチオニン残基、および上記アミノ酸配列に対して実質的な配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の修飾耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ５８．バチルス・ステアロサーモフィルス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分をコードしているヌクレオチド配列、または該一部分のフラグメントもしくは誘導体をコードしているヌクレオチド配列からなる精製組み換えＤＮＡ分子であって、該フラグメントもしくは該一部分が下記活性：ａ．該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する免疫応答を誘導することができる活性、ｂ．鋳型により指向される、該鋳型の一部分にハイブリダイゼーションした核酸プライマーの３'末端へのヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒することができる活性、またはｃ．上記活性の組み合わせを有するポリペプチドをコードしているものである精製組み換えＤＮＡ分子。