SU1311251A1 - Штамм BacILLUS SтеаRотнеRморнILUS В-3361-продуцент термофильной ДНК-полимеразы и способ получени термофильной ДНК-полимеразы - Google Patents

Abstract

Штамм (Ш) Bacillus stearother- mophilus B-3361 выделен путем селекции на жидкой питательной среде из Вас. stearothermophilus ВКМ 516. Ш неспорообразующий при выращивании в более бедной по составу питательной среде вплоть до 1-1,5 ед./мл оптической плотности при 560 нм. Ш раст тна среде следующего состава, мас.%: 0,2 глюкоза; 0,1 дрожжевой экстракт; 10 аминопептид; 0,0025 MgSO^; 0,7 KHjPO^; 0,0005 CaCl,; 0,1 (KH^)^SO,, вода - остальное. ДНК-полимеразу выдел ют ив экстракта разрушенных клеток. Активность фермента 8,0-10 ед/мг белка. Цель изобретени  - повышение выхода целевого продукта, его активности и гомогенности. Продуцентом фермента  вл етс  Ш Bac.stearother- mophilus B-3361, вырап(ивание штамма ведут на среде указанного состава в течение 1-2 ч, нуклеиновые кислоты отдел ют на ДЕАЕ-целлюлозе, отдел ют белки хроматографией на фосфоцеллюло- зе с элюацией фермента в линейном градиенте 40-500 мМ раствора КС1 и 40-300 ьМ КС1 в два этапа, а конечный зтап очистки-от белков провод т при помощи а4«нной хроматогра^и на УФ ДНК-целлюлозе, элюацию ведут линейным градиентом 0,25-0,6 М раствора КС1. 3 ил., 2 табл.i О)оо

Description

ьо

СП

113

Группа изобретений относитс  к микробиологической отрасли, в част нрсти к получению ферментов микробного происхождени  - термофильной ДНКполимеразы . Термофильна  ДНК-полиме раза используетс  в качестве инструмента в биохимических исследовани х, например, дл  изуче ш  различных воздействий на ДНК мезофильных клеток, дл  введени  радиоактивной метки в ДНК in vitro.

Цель изобретени  - получение штам ма Bacillus stearothermophilus В-336I, обладающего более высокой

активностью ДНК-полимеразы.

Предлагаемый штамм Вас. stearothermophilus В-3361 выделен путем селекции на скидкой среде из Bac.stearothermophilus ВКМ 516.

Штамм Bacillus stearotherraophilus имеет следующую морфологичес кую и физиологическую характеристики штамм В-3361 принадлежит к виду Ва cillus stearothermophilus.В логарифмической стадии роста в жидкой среде клетки имеют форму пр мы-  палочек, в основном Одиночные и в виде цепочек из клеток., нитей не более 10%, средний размер клеток Oj87 мкм. В стационарной фазе роста и на 3 суточ- ных чашках с твердой средой до 80% клеток имеют концевые споры. Неспорообразующий при выращивании в более бедной по Составу питательной среде вплоть до 1-1,5 ед/мл оптической плотности при 560 нм. Штамм хорошо растет также на средах, содержащих картофельный отвар (до 20%), амино- пептид (до 30%), пептон (до 1%). На м сопептонном агаре через 15 ч роста П)и образуютс  крупные беловатоС (грые колонии размером около 1 мм. Пигменты не образует.

Физиологичес1сие свойства; факульТс1тивный аэроб, оптимум роста . Желатин умеренно разжилсает, крахмал г.-дролизует; глюкозу, фруктозу, сахарСЗу усваивает с образованием кислоть , Нитраты не восстанавливает.

В табл.1 представлена физиологи™ ческа  и биохимическа  характеристика штаммов Вас.stearothermophilus ВКМ 516 и Nac. stearothernophilus В-3361 продуцентов ДНК-полимеразы.

Клетки штам1-1а Bac.stear, ВКМ 516 с питательной средой (2%-ньш агарагар , ai-шнопептид) пересевали в 100 мл среды, содержащей 0,1%-ньй дрожжевой экстракт, амниопептид, 7 г/л , 1 г/л (NH),SO, рН доведен до 7,0 КОН с плотностью до 0,1 ед/кл А 560 и выращивали при 60 с аэрацией. Через 3 ч при плотности около 0,5 ед/мп А 560 рост клеток останавливалс .Под микроскопом наблюдалось 90% спорул ци . Инкубацию продолжали в тех же услови х 18 ч, при этом плотность суспензии клеток увеличивалась до 1,5 ед/мл А 560. Делали пересев в свежую среду до плотности 0,1 ед/мл А 5ёО и инкубировали в тех же усло ВИЯХ. То же повтор ли 12 раз. В результате были отобраны клетки,которые в вышеуказанной среде росли за 1-1,5 ч с 0,1 ед/Nm до 1,5 ед/ип без спорул ции (штамм ). Проверенна  активность ДНК-полимеразы штамма В-3361 достигла 10 ед/мг и была значительно вьше.) чем в исходной культуре (до 2 ед/мг).

Пример 1. Штамм Bacillus stearothermophilus В-336 выращивают в среде следующего состава: 0,7% 0,1% (HH4)2S04; 0,0025% 0,0005% CaCl, и глюкозы; 0,1% дрожжевого экстракта, 10% амино пептида (рН - 750-7,5) при 55-65°С в течение 1-2 ч с непрерывной аэрацией . Клетки собирают центрифугирова кием и лизируют добавлением 0,1% тритона и 0,1 мг/мл лизоцима.

При лабораторной проверке лимеразной активности фермента, полу ченного из штамма, в сравнении с известным оказалось, что за 1-2 ч роста не менее богатой среде полученный штамм Bacillus stearothermophilus В-3361 продуцирует в 5 раз более активную ДНК-полимеразу, чем известный за более длительный период (3-5 ч). Кроме того, способность Вас. stearotherraophilus В-3361 расти при повышенной температуре (55-65°С) ограничивает возможность заражени  среды посторонней микрофлорой.

Claims (1)

1. Способ заключаетс  в использова™ НИИ в качестве продуцента фермента штамма Bac.stearothermophilus В-3361 получении бесклеточного экстракта вьЕаеуказанного штамма и создании схе- мы вьщелени  и очистки целевого продукта . Способ получени  ДНК-полимеразы из штамма Bacillus stearothermophiIxis В-3361 заключаетс  в следующем: вырап;енные клетки Bacillus stearothermophilus В-3361 разрушают продав ливанием во French прессе, центрифугируют и получают сырой бесклеточный экстракт, либо лизируют, как ука зано выше; из экстракта удал ют нуклеиновые кислоты (НК) на ДЕАЕ-целлюлозе . По сравнению с известным спосо бом обеспечивает более высокий выход и лучшую очистку целевого продукта; отдел ют белковые примеси при помощи хроматографии на фосфоцеллкшозе в два этапа, провод  операцию элюации первый раз в линейном градиенте 40 мМ-500 tM раствора КС1, второй раз - в линейном градиенте 40 300 мМ раствора КС1. Эти услови  подобраны экспериментально исход  из свойств фермента элюироватьс  с фосфоцеллюлозы более узким пиком, в более узком интервале мол рности КС1. Соблюдение этих условий приводит так же к повьшению выхода целевого продукта , увеличению гомогенности и активности его; конечньш этап очистки от белков провод т при помощи афин- ной хроматографии на УФ-ДНК-целлюлозе , провод  операцию элюации линейным градиентом 0,25-0,6 М раствора КС1. Это также приводит к повьшению выхода, гомогенности и активности це левого продукта. В табл.2 представлены основные стадии очистки целевого продукта из 150 г клеток Bacilltis stearothermophilus В-3361. На фиг.1 представлено графическое изображение, фосфоцеллюлозной хроматографии (А и в) целевого продукта, полученного после ДЕЛЕ-целлюлозной хроматографии сырого экстракта.Целевой продукт элюируют (см.фиг.1) с колонки с фосфоцеллюлозной (V 30 мл), уравновешенной 20 мМ трис- гидрохлоридным буфером 1 (рН 8,0), содержашгим 0,04 М КС1; 0,5 мМ ЕДТА, 10% глицерола, линейным градиентом 0,04-0,5 М.КС1 (180 180 мл) в буфере 1. Продукт с колонки раскапывают по фракци м емкостью 6 мл, В этих фракци х определ ют содержание белка (сплошна  лини  на графике) и ДНК-полимеразную активность (преры- виста  лини  на графике. Активные фракции № 20-30 (см.фиг.l) объедин ют , разбавл ют вдвое и сажают на колонку с фосфоцеллюлозой ( мл), уравновешенную буфером I (фиг.2), элюиру  целевой продукт линейным градиентом 0,04-0,3 М КС1 (3030 мп). Активный продукт, вьш1едший во фракции № 25-38, объедин ют и сажают на колонку (V 7 мл) с УФ-ДНК-целлюлозой , уравновешенной буфером 1 с 0,2 М КС1 (фиг.З). Элюацию с колонки провод т линейным градиентом 0,25-0,6 М Р:С1 (25-25 мп). Целезсй активный продукт вьП4Одит в 0,5 :-i Kv во фракци х 40-53. Активность продуцируемой из данного штамма ДНК-полимеразы составл ет 8,0-10,0 ед/мг белка. ДНК-полимераза предлагаемого штамма про вл ет максимальную активность в узких пределах рН 8,0-9,0, име  50% активности при рН 7,5 и 9,6. Температурный оптимум активности также довольно ys кий; 55-65°С. При 50°С остаетс  около 45%, а при 7Q°C лишь 20% активности фермента. ДНК-полимераза термостабильна: остаетс  максимально активной в течение нескольких часов при нагревании до 60°С. На активност фермента оказывают вли ние различные концентрации катионов: К j Mg , Со, Mn. Так, максимальной активности фермент достигает при 0,15-0,2 М КС1, уже 0,4 М КС1 снижает активность фермента до 60%. Дл  про влени  активности фермента необходимы все gHTO, , К и активированна  ДНК в качестве матрицы. Фермент об ладает примерно 100%-ной активностью. с поли g(A-T). в качестве матрицы (по сравнению с активированной ДНК), и менее 10%-ной активностью с денатурированной ДНК; он не чувствителен к сульфгидрил-блокирующими агентам. Активность фермента определ ют в 100 мкл смеси, содержащей: 80 мМ трис-гидрохлоридный буфер рН 8,0; 20 мМ MgSO, 0,15 М КС1, gHTO по 80 мМ каждого удельна  радиоактив ность Н - ТТФ, имеюща  50 имп-мин/ пмоль, 10 мкг БСА, 10 мкг активированной ДНК, 8% глицерола и фермент. После инкубации в теченн.е 10 шн при 60°С измер ют кислото-нерастворимую радиоактивность. За одну едш.ицу ферментативной активности принимают такое количество фермента, которое катализирует включение 10 нмолей всех нуклеотидов в кислотонерастворимый материал при указанных услови х. Дл  получени  фермента клетки штамма засевают на среду, состо щую из 0,7% 0,1% (.0,2% глюкозы; 0,1% дрожжевого экстракта; 10% аминопептида (АП); 0,0025% MgS04; 10 0,0005% CaCl,, рН 7,0 - 7,5. Всего 50 л среды. Начальна  плотность засева 0,1 ед./мл поглощени  при 560 им. Клетки выращивают в течение 1 ч с посто нной аэрацией при температуре 65 С до конечной плотности взвеси клеток в среде 1,5 ед/мл поглощени  при 560 им. Клетки собирают осаж дением в количестве 100 г сырого веса , затем разрушают продавливанием во French прессе и определ ют активность ДНК-полимеразы в экстракте раз рушенных клеток, котора  составл ет 10,0 ед/мг белка. Затем из экстракта удал ют нуклеиновые кислоты на ДЕАЕ целлюлозе. При этом 500 мл колонку уравновешивсцот буфером 1, состо п(им из 200 мм трис-гидрохлорида, рН 8,0, 0,5 мМ ЕДТА, 10% глицерола и содержанием 0,2 М КС1. Белки после выхода с колонки концентрируют 70% ( и обессоливают на сефадек се G-25. Удаление белковых примесей от целевого продукта провод т на фосфоцел люлозе в два этапа на 30 мп и 10 мл колонках, уравновешенных предварительно буфером 1 (см.фиг.1 и 2).Операцию элюации первый раз провод т линейным градиентом 40-500 мМ раствора КС1 (объем 180-180 мл). Выход целевого белка определ ют по ДНКполимеразной активности каждой фракции . Целевой белок, вышедший во фрак ци х № 20-30 в 0,2 М растворе КС1, развод т в 2 раза и сажают на 10-мп колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную тем же буфером. Вторую операцию элюации провод т 40-300 мМ раст вором КС1 (объем градиента мл, см.фиг. 1 и 2). Целевой белок, вы-, шедший во фракци х №№ 25-38 в 0,2 М растворе КС1, собирают и сажают на 7-мл колонку с УФ-ДНК-целлюпозой,„ уравновещенную буфером 1 с 0,25 М КС1, Операцию.элюации при этом провод т линейным градиентом 0,25-0,6 М раствора КС1 (объем градиента 25 х X 25 мл). Собирают целевой белок. вышедший во фракци х №№ 40-53 до 0,5 М растворе КС1. Выход целевого белка составл ет 22%, чистота продукта , определ ема  по электрофорезу в полиакриламидном геле, составл ет 95%. Таким образом, предлагаемый способ позвол ет получить ДНК-полимера- ЗУ 1 высокоочищенную, гомогенную 95% (в известном способе 60%), высокоактивную 20000 ед./мг белка (в известном способе 16000 ед./мг белка) с выходом 22% (в известном способе 7%). Фермент не имеет сопутствующих эндо- и экзонуклеазных активностей, термо- стабилен (не тер ет своей активности при нагревании до 60°С в течение нескольких часов), устойчив при хранении (не тер ет активности в тече- ние 1-2 лет). Полученна  ДНК-полимераза испытана в лаборатории молекул рной и радиационной биофизики ЛИЯФ АН СССР дл  фенотипической коррекции pol.A мутанта E.coli и в институте Биологии развити  АН СССР дл  ник-трансл ции и в качестве инструмента дл  определени  характера однонитевых разрывов в ДНК  дер клеток печени крыс, разрывы при этом генерировались кислородными радикалами, Результаты испытани  показали,что термофильна  ДНК-полимераза может примен тьс  в исследовательских цел х , например, дл  мечени  ДНК in vitro, дл  изучени  процессов репарации и репликации ДНК путем введени  фермента в клетки мезофилов,Благодар  своей оптимальной активности при ДНК-полимераз а может найти уникальное,применение в исследовательских работах дл  изучени  различных воздействий на ДНК мезофиль- ных клеток (действие радиации, химических реагентов)у так как при оптимуме работы этой полимеразы (60°С) не работают никакие собственные ферменты изучаемых мезофильных клеток (особенно ДНК-азы), а также дл  синтеза второй нити КДНК (при 60°С нивелируютс  стерические эффекты). Формула изобретени  Штамм Bacillus stearothermophilus В-336 1 (Коллерсци  Центрального музе  промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ЦМ1М В-3361 ) - продуцент термофильной ДНК-полимеразы.

   Способ получени  термофильной ДНКполимеразы , предусматривающий получение бескпеточного экстракта из термофильного штамма-продуцента Bacillus stearothermophil is j выращенного на питательной среде, содержащей глюкозу , дрожжевой экстракт, аминопептид, магний серно-кисльш, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористьш , аммоний серно-кислый и воду, удаление из него нуклеиновых кислот, отделение от белков хроматографией на фосфоцеллюлозе и проведение афин ной хроматографии дл  выделени  целевого продукта элюацией линейным градиентом раствора хлористого кали , отличающийс  тем, что.

   Состав среды, необходимой

   Штамм дл  роста штамма

   0 ,0025% 0,0005% CaCljj 0,5% глюкоза; рН 7,0-7,5; 0,5%-ный дрожжевой экстракт; 10%--ный АЛ (аминопептид); 0,7% Na, 0,5% NaCl; 0,3% 0,1% , вода остальное

   рН 7,0-7,5; 0,2%-на  глюкоза; 0,1%-ный дрожжевой экстракт; 10%-ный АЛ; 0,0025% 0,7% KHjPO.; 0,0005% , 0,1% (

   с целью повышени  выхода целевого продукта, его активности и гомогенности , в качестве продуцента используют штамм Bacillus stearothermophilus В-3361I выращивание его ведут на питательной среде в течение 1 2 ч, удаление нуклеиновых кислот провод т на ДЕАЕ-целлюлозе, отделение от белков хроматографией на фосфоцеллюлозе осуществл ют в два этапа,причем операцию элюации на первом этапе провод т в линейном градиенте 40 500 мМ раствора хлористого кали , на втором этапе - в линейном градиен--5 те 40-300 мМ раствора хлористого кали , а афинную хроматографию осуществл ют на УФ ДНК-целлюлозе,

   Таблица 1

   ДНК-полимер аз на  активность в экстрактах разрушенных клеток, ед./мл белка

   3-51,8-2

   1-2.8,0-10,0

   Таблица 2