KR100218919B1 - 바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 dna 폴리머라제 - Google Patents

바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 dna 폴리머라제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 재조합 DNA 폴리머라제 효소의 조성물 및 발현 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 Bst DNA 폴리머라제 효소를 정제하는 방법, 생화학 반응을 수행하기에 적합한 형태의 정제된 효소를 함유하는 조성물, 및 정제된 효소를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 DNA 폴리머라제
[발명의 상세한 설명]
본원은 1994년 4월 1일자로 출원된 제08/222,612호의 일부 연속 출원인, 1994년 9월 16일자로 출원된 제08/307,410호의 일부 연속 출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 그램 양성균인 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearother mophilus)로부터 유래된 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소에 관한 것이다. 이들 효소는 서열화 및 핵산 증폭 공정과 같이, 핵산 스트랜드의 주형-지시된 합성을 필요로하는 생화학 공정에 있어서 유용하다. 본 발명은 또한 이들 효소의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
DNA 폴리머라제 효소는 천연 세포내 효소이며, 상보적인 핵산 스트랜드를 제조하기 위한 주형 분자를 사용하는 핵산 스트랜드를 복제하기 위하여 세포에 의해 이용된다. DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소는 핵산 프라이머의 성장 말단에서 3' 히드록실기와 뉴클레오티드 트리포스페이트의 5' 포스페이트기 사이의 결합 형성을 촉매한다. 이들 뉴클레오티드 트리포스페이트는 데옥시아데노신 트리포스페이트(A), 데옥시티미딘 트리포스페이트(T), 데옥시시티딘 트리포스페이트(C) 및 데옥시구아노신 트리포스페이트(G)로부터 통상적으로 선택된다. 그러나, DNA 폴리머라제는 이들 뉴클레오티드의 개질체 또는 변형체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드가 첨가되는 순서는 DNA 주형 스트랜드에 대한 염기 쌍화(base pairing)에 의해 지시된다; 그러한 염기 쌍화는 G:U 염기 쌍화와 같이, 비정준 염기 쌍화가 당해 분야에 공지되어 있지만, "정준(canonical)" 수소 결합(반대편 DNA 스트랜드의 A와 T 뉴클레오티드 및 G와 C 뉴클레오티드간 수소 결합)을 통하여 수행된다[참조: Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids 14-32(11th ed. 1992)].
DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소의 시험관내 용도는 근년에 cDNA 합성 및 DNA 서열화 반응[참조: Sambrook et al., (2nd ed. Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989); 본원에서 참고 문헌으로 인용됨], 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)[참조: Mullis et al., 미합중국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호; 본원에서 참고 문헌으로 인용됨] 및 RNA 전사 매개된 증폭법[예를들면, Kacian et al., PCT 공보 제WO91/01384; 본원과 공통 소유이며 본원에서 참고 문헌으로 인용됨]과 같은 방법에 의해 핵산의 증폭을 포함한 다양한 생화학 용도에 더욱 일반화되고 있다.
PCR과 같은 방법은 DNA 폴리머라제 활성의 사용을 통하여 프라이머 사이클을 확장시킨 다음 생성된 이중사 핵산을 열변성시켜 또 다른 라운드의 프라이머 어닐링 및 확장을 위한 새로운 주형을 제공하도록 한다. 스트랜드 변성에 필수적인 고온은 다수의 DNA 폴리머라제를 비가역적으로 불활성화시키고, 약 37내지 42이상의 온도에서 활성을 유지할 수 있는 DNA 폴리머라제(열안정성 DNA 폴리머라제 효소)의 발견 및 용도는 비용 및 노동 효율에 있어서 잇점을 제공한다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 이들로 제한되는 것은 아니나, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써머스 써모필루스(Thermus thermophilus), 및 바실러스(Bacillus), 써모코쿠스(Thermococcus), 술포부스(Sulfobus), 피로코쿠스(Pyrococcus) 종을 포함한, 다수의 고온성 유기체중에서 발견되었다.
DNA 폴리머라제는 이들 고온성 유기체로부터 직접 정제할 수 있다. 그러나, DNA 폴리머라제 수율의 실질적인 증가는 먼저 재조합 DNA 방법에 의해 다중 카피 발현 벡터중에서 효소를 암호하하는 유전자를 클로닝하고, 상기 벡터를 상기 효소를 발현시킬 수 있는 숙주 세포조중으로 삽입하고, 상기 벡터-함유 숙주 세포를 배양한 다음, 상기 효소를 발현시킨 숙주 세포주로부터 DNA 폴리머라제를 추출함으로써 수득할 수 있다.
최근에 특성화된 세균성 DNA 폴리머라제는 이들 효소를 2개의 군: 인트론- 비코딩 뉴클레오티드 서열- 을 함유하는 유전자(부류 B DNA 폴리머라제), 및 DNA 폴리머라제 유전자가 이. 콜라이(E. coli)DNA 폴리머라제 I과 대강 유사하지만 인트론을 함유하지 않는 DNA 폴리머라제 유전자(부류 A DNA 폴리머라제)로 나누어지도록하는 특정 패턴의 유사성 및 상이점을 갖는다.
"비코딩(non-coding)"이란 서열중에 핵산 스트랜드를 모두 포함하는 뉴클레오티드가 성숙 단백질의 아미노산 잔기를 암호화하고 대응하는 3-뉴클레오티드 코돈을 함유하지 않음을 의미한다. 인트론은 진핵 고등 유기체의 유전자에서 흔히 발견되지만 아르캐박테리아(archaebacteria)와 같은 저급 유기체에서도 발견되고 있다.
고온성 유기체로부터 유래되는 수개의 부류 A 및 부류 B 고온성 DNA 폴리머라제가 클로닝되어 발현되었다. 부류 A 효소중: 로이어[Lawyer, et al., J. Biol. Chem. 264:6427-6437(1989)] 및 겔펀드(Gelfund et al., 미합중국 특허 제5,079,352호)는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus(Taq)로부터 유래되는 완전길이 고온안정성 DNA 폴리머라제의 클로닝 및 발현을 보고하였다. 로이어 등[Lawyer et al., PCR Methods and Applications, 2:275-287(1993), 및 반스[Barnes; PCT 공부 WO92/06188(1992)]는 동일한 DNA 폴리머라제의 절단 버전의 클로닝 및 발현을 기술한 반면, 설리반(Sullivan; EPO 공보 제0482714A1(1992))은 Taq DNA 폴리머라제의 돌연변이 버전의 클로닝을 보고하였다. 아사꾸라 등(Askura et al., J. Ferment. Bioeng(Japan), 74:265-269(1993))은 써머스 써모필루스로부터 DNA 폴리머라제를 클로닝하고 발현시켰다고 보고하였다. 겔펀드 등은 PCT 공보 WO92/062 02(1992)에서 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus)로부터 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제를 기술하였다. 써머스 플라버스(Thermus flavus)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라제는 아크메츠야노프 및 바크히토프(Akhmetzjanov and Vakhitov)에 의해 문헌(Nucleic Acids Res., 20:5839(1992))에 보고되었다. 우에모리(Uemori) 등은 문헌[J. Biochem. 113:401-410(1993) 및 EPO 공보 제051741A2(1992)]에서 고온성 세균 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터의 DNA 폴리머라제를 클로닝하고 발현시키는 것을 보고하였다. 이시노(Ishino) 등은 일본 특허원 제92-131400호(공개일 1993년 11월 19일)에서 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터 DNA 폴리머라제를 클로닝하는 것을 보고하였다.
부류 B 효소중: 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)로부터의 제조합 열안정성 DNA 폴리머라제가 콤브(Comb) 등에 의해 EPO 공보 제 0 455 430 A3(1991), 콤브 등의 EOP 공보 제0547920A2(1993), 및 펄러(Perler) 등에 의해 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 89:5577-5581(1992)에 보고되었다. 술폴로부스 솔로파타리우스(Sulfolobus solofatarius)로부터 클로닝된 열안정성 DNA 폴리머라제는 피사니(Pisani) 등에 의해 문헌: Nucleic Acids Res. 20:2711-2716(1992) 및 PCT 공보 WO93/25691(1993)에 개시되어 있다. 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 열안정성 효소가 우에모리(Uemori) 등의 문헌: Nucleic Acids Res. 21:259-265(1993)에 개시되었는데, 재조합 DNA 폴리머라제가 콤브 등의 EPO 공보 0547359A1(1993)에 개시된 바와 같이 피로코쿠스 종으로부터 유도된다.
"열안정성"이란 약 37내지 42이상의 온도에서 최적온 활성을 갖는 효소를 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 효소의 활성에 최적 온도는 약 50내지 75; 더욱 바람직하게는 55내지 70; 가장 바람직하게는 60내지 65이다.
다수의 열안정성 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 활성이외의 활성을 갖는다; 이들은 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및(또는) 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성일 수 있다. 5'-3' 및 3'-5' 엑소뉴클레아제의 활성은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성은 혼입될 수 있는 잘못된 염기를 제거함으로써 새롭게 합성된 스트랜드의 정확도를 향상시키고; Taq DNA 폴리머라제(참조: Lawyer et al., J. Biol Chem. 264:6427-6437(를 포함하는 것으로 보고된, 그러한 활성이 낮거나 없는 DNA 폴리머라제는 뉴클레오티드 잔기가 프라이머 확장 스트랜드중으로 혼입되는데 있어서 에러가 일어나기 쉽다. DNA 복제가 통상 프라이머 확장 사이클의 수와 관련하여 기하학적인 핵산 증폭 공정과 같은 용도에 있어서, 그러한 에러는 핵산 증폭 생성물(앰플리콘)의 서열 이형성과 같은 심각한 인위적 문제점을 일으킬 수 있다. 따라서, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성은 상기와 같은 목적으로 사용되는 열안정성 DNA 폴리머라제의 바람직한 특성이다.
대조적으로, DNA 폴리머라제 효소중에 흔히 존재하는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 비보호된 5' 말단을 갖는 프라이머를 포함한, 핵산을 분해시킬 수 있기 때문에 특정 용도에 있어서 통상적으로 바람직하지 못하다. 따라서, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 절단되어 있거나, 그러한 활성이 부재하는 열안정성 DNA 폴리머라제가 또한 생화학용 효소의 바람직한 특성이다. 상기 목적을 수행하는 DNA 폴리머라제로 개질시킨 여러가지 DNA 폴리머라제 효소가 개시되어 있다. 예를들면, 이, 콜라 이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편이 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 조절하는 단백질의 도메인이 제거된 홀로효소의 단백분해 단편으로 생산될 수 있다. 클레나우 단편은 폴리머라제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 아직까지 보유한다. 문헌: Barnes, supra, 및 Gelfund et al, 미합중국 특허 제5,079,352호에는 5'-3' 엑소뉴클레아제-결핍 재조합 Taq DNA 폴리머라제의 생산이 개시되어 있다. 문헌: Ishino et al., 유럽 특허 공보 제0517418A2에는 바실러스 칼도테낙스로부터 유래된 5'-3' 엑소뉴클레아제-결핍 DNA 폴리머라제의 생산이 기술되어 있다.
특정 DNA 폴리머라제 효소에 대한 항혈청 또는 모노클로날 항체의 제조가 당해 분야에 숙지되어 있다. 예를들면, 후(Hu) 등은 문헌: J. Virol. 60:267-274(1986)에서 겔로부터 PAGE-분리된 MMLV 역전사효소를 회수하고, 래비트를 정제된 단백질로 면역시키고, 항혈청을 회수함으로써, 이. 콜라이중에서 발현된 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스로부터 클론된 역전사효소 및 융합 단백질의 특이적 면역 침전법을 보고하였다. 리빙스톤(Livingston) 등은 문헌: Virology 50:388-395(1972)에서 바이러스와 숙주 세포 DNA 폴리머라제 사이를 차별화시킬 수 있는 항체를 사용하는 아비안 타입 C(Avian Type C) 바이러스 전사효소의 친화성 크로마토그라피를 기술하였다. 스파다리 및 바이스바흐(Spadari and Weissbach)는 문헌: J. Biol. Chem. 249:5809-5815)1974)에서 헬라-유래 DNA 폴리머라제가 메이슨-화이자 몽키 바이러스(Mason-Pfizer monkey virus), 울리 몽키 바이러스(Wooley monkey virus), 또는 라우서 쥐의 백혈병 바이러스(Rauscher murine leukemia virus)로부터 수득한 역전사효소에 대해 제조된 항혈청에 의해 억제되지 않는다고 보고하였다. 이들 문헌은 본원에서 참고 문헌으로인용된다.
[발명의 요약]
본 발명은 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus: Bst)로부터의 재조합 및(또는) 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 제공한다. 본 발명의 1개 이상의 효소는 바실러스 스테아로써모필루스의 컬쳐로부터 생산하여 정제할 수 있거나 이들 효소를 암호화하는 유전자를 적합한 발현 백터중으로 클로닝시키고, 이종 숙주중에서 발현시켜 정제할 수 있다. 본 명세서에 기술된 DNA 폴리머라제 효소중에는 효소 및(또는) 이의 대응하는 유전자의 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인에서 결실을 함유하는 천연 효소의 돌연변이 형태 또는 절단된 형태가 있다.
이들 효소는 DNA 폴리머라제 활성을 필요로하는 핵산 증폭 방법 및 기타 생화학적 프로토콜에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 효소는 열안정성이기 때문에, 이들은 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I로부터의 클레나우 단편과 같이, 다른 수많은 DNA 폴리머라제 효소 보다 고온을 사용하는 생화학용으로 사용하기에 적합하다. 특히 생화학적 용도로 허용되는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 효소는 비정제된 형태로 사용할 수 있다. 별법으로, 이들 효소는 사용전에 정제할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 Bst DNA 폴리머라제 효소의 정제 방법 및 사용 방법을 제공한다. Bst DNA 폴리머라제의 바람직한 정제 방법은 2개의 음이온-교환 단계와 포스포셀룰로스 크로마토그라피를 포함한다. 바람직한 크로마토그라피 조건은 본 명세서에 기술된다. 그러나, 이들 조건 또는 이들 순서는 본 기재 사항에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 명백한 것으로 인정되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 포함하는 조성물, 이들 유전자를 함유하는 벡터, 및 이들 재조합 효소의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 안정화제를 함유하는 완충액중에 본 발명의 DNA 폴리머라제 효소 1개 이상을 포함하는 안정한 효소 제형을 포함한다.
본 명세서에 기술되고 특허청구된 완전길이 Bst 폴리머라제 효소 및 이들의 변이체는 모두 숙주 세포를 사멸시키지 않거나 강력한 리프레서의 조정하에서 이. 콜라이 숙주 균주중에서 멀티카피 벡터에 대해 단독의 손상되지 않은 유전자로서 클로닝될 수 있다. 또한, Bst 폴리머라제는 이. 콜라이 숙주 세포내에서 구성식으로 발현될 수 있으며; 가능할 경우, 이들 효소의 유발성 발현은 활성 효소를 고수율로 수득하는데 있어서 필수적인 것은 아니다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명에서 프라이머 및 프로브로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제2도는 Bst 폴리머라제 유전자, Bst 앰플리콘을 발생시키는데 있어서 사용되는 프로브 및 PCR 프라이머에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 위치, 및 상기와 같이 발생된 앰플리콘의 Bst 유전자에 대한 위치를 나타내는 도이다.
제3도는 플라스미드 pGEM Bst 885의 도이다.
제4도는 플라스미드 pGEM Bst 1143의 도이다.
제5도는 여러가지 표지된 프로브를 사용한 서던 블롯 실험 결과의 개략도이다.
제6도는 플라스미드 pGEM Bst 2.1 Sst의 도이다.
제7도는 플라스미드 pGEM Bst 5' 말단의 도이다.
제8도는 플라스미드 pUC Bst 1의 작제용 개략도이다.
제9도는 플라스미드 pUC Bst 2의 작제용 개략도이다.
제10도는 플라스미드 pUC Bst 3의 작제용 개략도이다.
제11도는 플라스미드 pUC Bst 2 AB, pUC Bst 2 CD, 및 pUC Bst 2 EF의 작제용 개략도이다.
제12도는 여러가지 "클레나우식" Bst 폴리머라제 효소의 N-말단 아미노산 잔기를 나타낸다.
제13도는 pUC Bst 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 Bst 폴리머라제 DNA 삽입물, 5' 및 3' Bst 게놈 단편, 및 Bst DNA 폴리머라제 유전자 및 이의 3개의 도메인에 대한 1143 앰플리콘 및 885 앰플리콘의 관계의 개략도이다.
제14도는 세포 분해물, 정제된 Bst 1을 함유하는 조 세포 분해물, Bst 1의 정제된 서브틸리신 단편, 부분적으로 정제된 Bst 3, 및 Bst 3의 천연 절단 생성물의 정제된 제제의 SDS-PAGE 겔 사진이다.
[바람직한 양태의 설명]
본 발명은 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 정제된 DNA 폴리머라제 효소, 이중 숙주 세포중에서의 발현을 위한 상기 효소를 암호화하는 DNA 단편, 및 이의 제조 방법, 정제 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 이들 효소는 전사 기본 증폭 시스템을 포함한, 핵산 서열화 및 증폭과 같은 생화학적 용도에 유용하다. 바람직하게는, 본 발명의 효소는 약 37내지 42이상의 온도에서 최적의 활성을 가지며, 따라서 상대적으로 높은 반응 온도를 필요로하는 생화학적 용도에 적합하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 효소는 약 60내지 65의 온도에서 최적의 활성을 갖는 것이다.
본 발명의 효소는 부류 A로 표시되는 DNA 폴리머라제 효소(비-열안정성 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I가 여기에 속함)와 일부 유사점을 보유하는 아미노산 서열을 갖는다. 부류 A DNA 폴리머라제의 아미노산 서열의 비교로 설득력있게 정의된 "가변" 영역으로 분리되는 상대적 서열 상동성 영역이 밝혀졌다. 가변 영역이란 이들 영역중 아미노산 서열의 비교로 비교되는 DNA 폴리머라제 서열의 주어진 영역내의 인접하는 아미노산 잔기의 약 10이상이 상이한 것으로 밝혀지는 것을 의미한다. 상기 목적의 경우, 20개 이상의 인접하는 아미노산 잔기로 정의되는 영역이다.
마찬가지로, 부류 A DNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 비교로 뉴클레오티드 서열이 종간에 고도로 유지되는 영역, 및 기타 가변 영역이 밝혀졌다. 유전 코드의 퇴화때문에, 뉴클레오티드 서열 변이성 양은 백분율로 표현해서, 대응하는 단백질간의 아미노산 변이성의 양 보다 더 클 수 있다. 달리, 각 아미노산이 3개의 뉴클레오티드 잔기에 의해서 암호화되고 이들중 하나에서 변화가 생길 경우, 상이한 아미노산에 대응하는 코돈이 되기 때문에, 이들 효소를 암호화하는 유전자에 있어서 뉴클레오티드 서열 변이성의 양은 백분율 기준으로 대응하는 아미노산 서열의 것 보다 더 적을 수 있다.
RNase-결핍 세포에 있어서 재조합 단백질의 발현 및 선택성 마커 유전자로서 테트라사이클린 내성을 사용하는 것이 동시 계류중이며 본원과 동일자로 출원되고 공동 소유인 카시안 등의 특허원[Kasian et al; Highly Purified Recombinant Reverse Transcriptase]에 개시되어 있다. 상기 출원은 본 원에서 참고 문헌으로 인용된다.
[정의]
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어는 달리 표현하지 않는한 다음과 같은 의미를 갖는다.
"선택성 마커 유전자"란 숙주 세포에 의해 보유되어 발현될 경우, 선택성 마커 유전자를 함유하는 숙주 세포와 함유하지 않는 숙주 세포를 둘다 주어진 조성의 컬쳐 배지중에서 성장시킬 경우 선택성 마커 유전자를 함유하지 않는 세포와 비교하여 선택성 마커 유전자를 함유하는 숙주 세포에 성장 잇점을 부여할 수 있는 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 의미한다. 예를들면, β-락타마제를 암호화하는 유전자는 상기 유전자를 함유하는 숙주 세포에 대해 암피실린에 대한 내성을 부여하는 반면, 상기 유전자를 함유하지 않는 세포는 암피실린에 대해 감응성이 되고; 따라서, β-락타마제에 대한 유전자를 발현시키는 세포만이 암피실린을 함유하는 배지중에서 성장한다. 유사하게, 필수 아미노산을 합성할 수 없는 세포는 필수 아미노산을 함유하지 않는 배지중에서 성장할 수 없는 반면, 필수 아미노산을 합성하도록 하는 유전자를 함유하는 세포는 동일한 배지중에서 성장한다.
선택성 마커 유전자는 예를들면 플라스미드 또는 발현 벡터중에서, 선택성 유전자 및 "사일런트" 유전자(들)을 모두 함유하고(하거나) 유전 요소를 함유하는 세포를 동정함으로써 1종 이상의 다른 유전자 또는 유전 요소(들)에 공유결합될 수 있다.
"정제된" 핵산 또는 단백질은 탄수화물, 지방, 원치않는 핵산, 또는 원치않는 단백질과 같은 세포 성분을 표시한 핵산 또는 단백질로부터 제거하는 단계를 1개 이상 실행한 핵산 또는 단백질을 의미한다.
"업스트림"이란 핵산 스트랜드상의 제시된 위치의 5' 면, 또는 이중사 핵산 분자인 경우, 핵산 분자의 영역에 있어서 유전자 전사 방향에 대해 특정 위치의 5' 면을 의미한다.
"다운스트림"이란 핵산 스트랜드상의 제시된 위치의 3' 면, 또는 이중사 핵산 분자인 경우, 핵산 분자의 영역에 있어서 유전자 전사 방향에 대해 특정 위치의 3' 면을 의미한다.
"Tm"이란 이중사 핵산 분자, 또는 이중사 영역을 갖는 핵산 분자의 50가 단일사 또는 열변성되는 온도를 의미한다.
"재조합"이란 핵산 분자 또는 단백질이 적어도 부분적으로 생체내 생화학적 방법의 결과임을 의미한다. 따라서 "재조합 DNA 분자"는 비천연 분자이다. 그러한 재조합 분자로는, 이들로 제한되는 것은 아니나, 제한 엔도뉴클레아제 단편, 시험관내 핵산 결합 생성물, 시험관내 엑소뉴클레아제 단편, 및 다음 프로모더, 리프레서 유전자, 선택성 마커 유전자, 온도-감응성 DNA 복제 요소, 유전자 구조물 등 중에서 1개 이상과 같은 이종 유전적 요소를 포함하는 발현 벡터가 있다.
"재조합" 단백질 또는 효소는 천연에서 발견되지 않는 것이다. 이들로는 재조합 DNA 분자로부터 생상된 정제된 단백질 제제 및 단백질이 있다. 정제된 단백질은 통상적으로 이종 숙주 세포, 즉, 당해 단백질 또는 효소에 대해 원형 상태의 것이 아닌 것으로 발현된다. 그러나, 재조합 단백질을 암호화하는 유전자는 당해 단백질이 유도되는 유기체와 동일한 종의 숙주 세포내에 포함된 발현 벡터상에 남아있을 수 있다.
"절단된"이란 당해 유전자 또는 단백질의 더 작은 버전을 의미하는 것으로, 1차 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대해, 참고 핵산 또는 단백질의 절단된 형태는 참고 분자와 비교한 바 뉴클레오티드 또는 아미노산중 1개 이상이 결여되어 있는 것이다.
"실질적인 서열 상동성"이란 제1 핵산 또는 단백질 분자가 각각 이의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열중 적어도 약 89이상이 제2 참고 핵산 또는 단백질과 인지가능한 비-랜덤 유사성을 갖는 것을 의미한다.
핵산 또는 단백질 "도메인"이란 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 정의된 영역중 적어도 1개를 의미한다.
"복제 기원"이란 프라이머 생산 및 DNA 폴리머라제 활성 개시가 시작되는 DNA의 특정 영역을 의미한다. 본 명세서에서는, 본 용어를 제공된 숙주 세포내에서 카피수를 증가시키도록 하는 DNA 발현 벡터상에 존재하는 핵산 요소를 의미한다.
"프로모터"란 RNA 폴리머라제 효소가 결합하여 DNA 주형의 전사가 개시될 수 있어, 핵산 서열중에 포함된 유전 정보가 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열의 단백질 생산으로 해독되는 1단계를 제공하는 DNA의 특이적 영역을 포함하는 유전 요소를 의미한다.
"발현", "유전자 발현" 또는 "단백질 발현"이란 숙주 유기체에 의해 유전자 내에 포함된 정보로부터 단백질이 생산됨을 의미한다.
"형질전환"이란 핵산 분자를 내부화시키기 위하여 숙주 세포를 유발시키는 생화학적 방법을 의미한다. 그러한 핵산 분자는 통상적으로 복제 기원, 선택성 마커 유전자, 및 숙주 세포내에서의 선택성 마커 유전자의 발현용 프로모터 중 적어도 1종 이상을 포함하는 유전 요소이다.
"이종성"이란 동일종이 아님을 의미한다. 따라서, 이종성 숙주 세포에서 발현된 효소는 효소가 원래 유래되는 것과는 상이한 종의 숙주 세포에서 생산되는 것이다.
"유전자"란 발현가능한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 갖는 핵산 영역을 의미한다. 유전자는 발현된 단백질의 아미노산 잔기에 대응하는 코돈을 함유하는 "코딩 서열"을 1개 이상 포함할 수 있으며; 상기 유전자는 또한 발현된 단백질의 아미노산 잔기에 대응하는 코돈을 함유하지 않는 "비코딩 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 이들을 포함할 필요는 없다.
[재료 및 방법]
[세균성 균주, 플라스미드 및 효소 공급원]
바실러스 스테아로써머필루스(Bst) ATCC 타입 균주 번호 12890은 매릴랜드주 록크빌소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수한다. 세균성 에쉐리키아 콜라이의 3개의 균주는 본 발명의 Bst DNA 폴리머라제 효소의 클로닝 및 발현용 숙주 세포로서 사용된다: 이. 콜라이 균주 XL1-Blue MRF' 및 JM109는 다음 기관: Stratagene Cloning System(캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 입수하며, 이. 콜라이 균주 1200(CGSC 균주 # 4449)은 다음 기관: E. coli Genetic Stock Center(코넥티커트주 뉴헤븐 소재의 예일 대학교내 소재)으로부터 입수한다.
플라스미드 벡터 pUC 18은 다음 기관: Life Technologies Inc.(매릴랜드주 가이터스버그 소재)로부터 입수하고, 벡터 pGem 3Z는 다음 기관: Promega Corp.(위스콘신주 매디슨 소재)로부터 입수한다. T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I로부터의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 폴리머라제, 및 폴리뉴클레오티드 키나제와 같은, 제한 엔도뉴클레아제 및 핵산 개질 효소는 모두 상업적 공급처로부터 입수하며 달리 언급하지 않는한 제조업자의 지침에 따라서 사용한다.
[세균 컬쳐]
바실러스 스테아로써모필루스 및 이. 콜라이 컬쳐는 1(w/v) 트립톤, 0.5(w/v) 이스트 추출물 및 0.5(w/v) 염화나트륨(LB 브로쓰)중에서 또는 1.3(w/v) 아가를 함유하는 동일 용액(LB 아가)의 페트리 플레이트상에서 성장시킨다. 필요할 경우 및 다음 기술에 나타낸 바와 같이, 암피실린은 100 ㎍/㎖, 테트라사이클린은 12 ㎍/㎖, 이소프로필티오-β-갈락토시드(IPTG)는 0.5 mM의 농도로, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드(X-gal)은 50 ㎍/㎖의 농도로 사용한다. 비. 스테아로써모필루스 컬쳐는 55에서, 이. 콜라이 컬쳐는 37에서 배양하며, 둘다 통기를 위하여 진탕시킨다.
[DNA 제조]
플라스미드 DNA 제조는 다음에 기술하는 바와 같은 두가지 방법중 하나로 수행한다. 첫번째 방법은 문헌[Sambrook et al., supra, 1.29 면; 본원에서 참고 문헌으로 인용됨]에 기술된 바와 같이 플라스미드 미니제조를 위한 표준 비등법이다. 두번째 방법은 정제된 DNA 제조용으로 사용되는 퀴아젠 인크.(Qiagen Inc.; 캘리포니아주 채트워스 소재)로부터 입수가능한 퀴아젠 플라스미드 키트를 이용하는 것이다. 상기 방법은 전매 음이온 교환 수지와 일련의 전매 용출 완충액을 사용하여 CsCl 구배가 없이도 플라스미드 DNA를 제조할 수 있도록한다. 상기 방법은 문헌: Qiagen Plasmid Handbook for Plasmid Midi Kit and Plasmid Maxi Kitⓒ1992 Diagen GmbH, Qiagen, Inc.에 기술되어 있다. 비. 스테아로써모필루스 게놈 DNA의 제조를 위하여, 세포 컬쳐를 밤새 원심분리시키고 펠릿을 10 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl 및 5 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(pH 7.0)의 원래 용적의 1/50에 재현탁시킨다. 리소자임을 최종 농도 2 ㎎/㎖로 가하고 상기 현탁액을 20 분간 37에서 배양한다. 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 250 mM NaCl, 1.2(v/v) 트리톤 X-100, 100 ㎍/㎖ Rnase A, 12 mM EDTA 및 0.5 M 구아니딘-HCl을 함유하는 용액의 9배 용적을 상기 세포 현탁액에 가하고 혼합물을 빙상에서 20 분간 배양시킨다. 혼합물을 프로테아제 K중에 2 ㎎/㎖가 되도록하고 50에서 2 시간 동안 부드럽게 진탕시키면서 배양시킨다. 상기 용액을 15-20,000 X g에서 10 분간 원심분리시키고 상등액을 경사시켜 버린다. 이후 플라스미드 DNA의 회수를 위하여 상기한 바와 같은 퀴아젠 방법의 변형 방법을 이용하여 Bst 게놈 DNA를 제조한다; 청전 세포 분해물로부터 게놈 DNA를 제조하는 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다.
[프로브 표지화]
단일사 DNA 올리고머 프로브를 하기 기술되는 바와 같은 두가지 방법 중 하나로 표지시킨다. 첫번째 방법은 상기에서 참고 문헌으로 인용되는 문헌: Sambrook et al., supra, 10.60면에 예시된 바와 같이, T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하여 방사성32P로 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 표지한다. 방사성 원자를 갖는 프로브를 표지시키는 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 상기 프로토콜을 사용하여 올리고뉴클레오티드 16, 24 및 25를 표지시킨다. 두번째 표지 방법은 올리고뉴클레오티드 15, 21 및 20을 표지시키는데 사용되는, 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)으로부터 수득한 LIGHTSMITHTM화학발광 시스템(매우 엄밀함)를 이용한다. 상기 방법은 비방사성 표지물을 사용하며 따라서 일반적으로 검출을 위하여32P 또는 기타 방사선 핵종을 사용할 경우 보다 더욱 편리하다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 15, 20 및 21은 검출성에 있어서 손실없이 상기한 바와 같이 방사성 원자로 용이하게 표지시킬 수 있다.
[DNA 단편의 겔 전기영동법 및 겔 분리법]
달리 명시하지 않는 한, 아가로스 겔은 1(w/v) 아기로스(Life Technologies Inc.)이다. 아가로스 겔을 브롬화에티듐 2 ㎍/㎖를 함유하는 1 x TAE 완충액(40 mM 트리스 염기(pH 8.0), 20 mM 아세트산나트륨, 2 mM EDTA)중에 흐르게 한다. DNA 단편을 겔 정제하기위하여, 목적하는 단편을 함유하는아가로스 겔 슬라이스를 절제하고 드라이 아이스상에서 냉동시킨다. 겔 슬라이스를 해동시키고, 분쇄하여 TAE-포화 페놀로 추출한다. 간단히 원심분리시킨 다음, 수상을 수거하여 50(v/v) TE-(10 mM 트리스(pH 8.0) 및 1 mM EDTA) 포화 페놀, 49(v/v) 클로로포름 및 1(v/v) 이소아밀 알콜로 추출한다. 이어서 수상을 24:1(v/v) 클로로포름:이소아밀 알콜로 수상을 추출한다. 핵산을 에탄올 침전시키기 위하여, 수상을 수거하고, 3 M 아세트산나트륨의 1/10 용적 및 에탄올의 2 1/2 용적을 제공하여, 원심분리시킨다. 상기 펠릿을 적합한 용적의 TAE 완충액에 용해시킨다.
[서던 블롯, 하이브리드화, 세척 및 검출 방법]
DNA 단편을 1(s/v) 아가로스 겔상에서 분리하고 20 X SSC(3 M 염화나트륨, 0.3 M 시트르산나트륨)중에서 모세관 작용에 의해, 상기에서 참고 문헌으로 인용된 문헌: Sambrook et al., supra, 9.38면에 기술된 바와 같은 서던 방법으로 나이트란(+) 나일론 막(Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH)으로 이송시킨다. 상기 막을 공기 건조시키고 하이브리드화시키기 전에 진공 오븐중에 80에서 2 시간 동안 베이킹한다.
32P 표지된 프로브로 하이브리드화시킨 막을 먼저 37에서 대략 2 시간 동안 6 X SSPE(20 X SSPE = 3.0 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4(pH 7.4), 0.02 M EDTA)(Life Technologies Inc.), 5 X 덴하르트 용액(다음 각 성분 0.1(w/v): 소혈청 알부민, 피콜 및 폴리비닐피롤리돈), 1(w/v) SDS(나트륨 도데실 술페이트), 100 ㎍/㎖ 음파파쇄시킨 변성 연어 혈청 DNA 및 포름아미드(올리고머 16의 경우 25(v/v)이고 올리고머 24 및 25의 경우 20(v/v))중에서 미리 하이브리드화시킨다. 이후 상기 막을 1 X(5 X이기 보다는) 덴하르트 용액 및 표지된 프로브 ㎖당 분당 1 X 106개를 첨가하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 제조된 하이브리드화 용액중에 37에서 밤새 배양시킨다. 이어서 상기 막을 실온에서 5 X SSC 및 0.1SDS, 1 X SSC 및 0.5SDS, 및 0.2 X SSC 및 0.5SDS의 수용액으로 세척한다. 표지된 올리고뉴클레오티드 24 및 25와 함께 배양한 막을 0.1 X SSC 및 0.1(w/v) SDS로 추가로 세척한다. 세척 단계후, 막을 건조시키고 보력 스크린을 사용하여 -80에서 3 시간 동안 X-선 필름에 노출시킨다.
올리고머 15, 21 및 20으로 하이브리드화시킨 막을 제조업자의 "높은 엄밀도" 프로토콜(Promega, Inc.)에 따라서 가공한다. 상기 언급한 바와 같이, 화학발광성 프로브의 사용은 편리하며;32P 표지된 프로브를 가지며, 서던 히이브리드화 방법은 상기한 바와 같이 수행한다. 사용되는 하이브리드화 및 세척 온도는 올리고머 15의 경우 56, 올리고머 21의 경우 48, 올리고머 20의 경우 51이다.
[서열화 반응]
클론 pGem Bst 2.1 Sst 및 pGem Bst 5' 말단의 플라스미드 DNA 제제를 디데옥시 쇄-종결법을 사용하는 Bst DNA 폴리머라제 유전자를 서열화시키기 위한 주형으로서 사용한다[참조: Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci.(USA) 74:5463-5467(1977); 본원에서 참고 문헌으로 인용됨]. DNA 4 ㎍을 각 반응에서 프라이머 1 pmol과 사용한다. 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 캄파니(United States Biochemical Co.)로부터 구입한 시퀴나제(SequenaseTM) 키트(버전 2.0)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 서열화를 수행한다. 서열화시키기 어려운 핵산 스트랜드 영역에서는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 서열화 반응 및 폴리아크릴아미드 겔중에서의 분자간 및 분자내 재어닐링을 최소화한다. 뉴클레오티드 서열의 영역을 판독하기에 어려운 문제점을 해결하기에 가장 성공적인 방법은 서열화겔중에 40(v/v) 포름아미드를 포함시키는 것이다. 디데옥시 서열화 방법의 변형 방법이 막삼과 길버트의 방법(Maxam and Gilbert, Methods in Enzymology 65:497-559(1980); 본원에서 참고 문헌으로 인용됨)과 같은 다른 핵산 서열화 방법과 같이, 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다.
[Bst DNA 폴리머라제 활성 검정]
Bst DNA 폴리머라제 활성은 합성 단일사 주형 및 주형의 일부분에 대해 상보적인 프라이머를 사용하는 cDNA 합성 반응으로 측정한다. cDNA 스트랜드의 검출은 cDNA 스트랜드에 대해 상보적으로 고안된 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브로 폴리머라제 생성물을 하이브리드화시킴으로써 수행한다. 표지된 이중사 하이브리드는 본원에서 참고 문헌으로 인용되는, 문헌: Arnold et al., Clin. Chem. 35:1588-1594(1989) 및 Arnold et al., 미합중국 특허 제5,283,174호(이는 본원과 동일인의 소유임)에 기술된 바와 같이 하이브리드화 보호 검정법(HPA)을 사용하여 검출한다. Bst DNA 폴리머라제를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 50 mM 트리스(pH 7.5), 25 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2 mM 스퍼미딘, 0.2 mM dNTP를 각각 함유하는 반응 혼합물중에 60에서 8 분간 박테리오파지 T7 유전자 10으로부터 유래된 86 염기쌍 합성 DNA 주형 20 fmol + 주형 스트랜드의 3' 말단에 대해 상보적인 23 염기 프라이머 30 pmol과 함께 배양한다. 반응 혼합물을 95에서 3 분간 배양시켜 DNA 스트랜드를 변성시킨 다음, 60에서 10 분간 아크리디늄 에스테르 표지된 검출 프로브와 함께 10 분간 배양시킨다. 하이브리드화시키지 않은 프로브를 알칼리성 붕산염 완충액 및 나머지 화학발광체와 함께 7 분간 60에서 가수분해시키고, 하이브리드화시킨 표지된 프로브로 인하여, H2O2의 희석 용액 및 수산화나트륨 용액을 주입한 후, LEADER 1TM발광계(Gen-Probe Incorporated, 캘리포니아주 샌디에고 소재)중에서 측정한다.
[프라이머 및 프로브 디자인]
수개의 DNA 폴리머라제 유전자를 클로닝하여 서열화한 다음, 이들 서열을 배열시킴으로써 DNA 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 종간에 어느정도 보존되는 수개의 영역이 밝혀졌다[참조: Delarue, Protein Engineering 3:461-4670(1990)]. 공개된 Bca 서열(참조: Uemori et al., J. Biochem. 113:401-410(1993))을, 개시점으로서 Bca 뉴클레오티드 서열을 사용하는 이들 보존된 영역의 일부분에 대해 프라이머 및 프로브를 디자인하기 위한 기준으로 사용하며; 상기 문헌에 포함된 Bca DNA 폴리머라제 뉴클레오티드 서열은 본원에서 참고 문헌으로서 인용된다. 본 발명의 과정에서 사용되는 프라이머 및 프로브의 뉴클레오티드 서열이 제1도에 나타나 있다. Bca DNA 폴리머라제 서열 및 이들 프라이머와 프로브간에 미스매치가 일부 경우에 존재한다. 이들 프라이머 및 프로브는 두가지 이유중 하나에 대해 미스매치를 갖도록 의도적으로 디자인된 것이다. 먼저, Bca DNA 폴리머라제 유전자에 존재하는 코돈 보다 비. 스테아로써머필루스에 의한 것이 우선되도록, 공지된 서열의 단백질을 암호화하는 여러가지 비. 스테아로써모필루스 유전자에서의 코돈 용도 분석을 기준으로, 코돈 생산을 위하여 일부 미스매치가 디자인된다. 본원에 기술된 Bca DNA 폴리머라제 뉴클레오티드 서열과 프라이머간의 미스매치를 디자인하는 두번째 이유는 다른 DNA 폴리머라제의 배열로부터 추정되는 바와 같이, 관련 위치에 존재하는 뉴클레오티드의 종간 일치가 더욱 잘 매치되도록 하기 위함이다. 때때로, G/T 미스매치가 상대적으로 안정하며 따라서 올리고뉴클레오티드가 상이한 타겟을 더욱 안정화시킬 수 있기 때문에 Bca DNA 폴리머라제 서열중 C 대신 Bst 프라이머 및 프로브중에서는 T를 사용한다.
[Bst 폴리머라제 효소의 정제]
Bst 폴리머라제 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 세균 숙주 세포를 상기한 바와 같이, 16 시간 동안 진탕시키면서 액체 컬쳐중에서 성장시킨다. 바람직한 숙주 세포 균주는 이. 콜라이 균주 1200이다. 37에서 16 시간후, 세포 컬쳐를 9000 x g에서 10 분간 원심분리시키고, 세포 펠릿을 일단 0.1 mM EDTA를 함유하는 20 mM 트리스 HCl(pH 7.5)로 세척한다. 세포 펠릿 50 g을 분해 완충액(25 mM 트리스 HCl, 10 mM EDTA, 5 mM DTT, 1(v/v) 트리톤 X-100, 10 mM NaCl, 10(v/v) 글리세롤 및 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)) 10배 용적중에 현탁시킨다. 세포 현탁액을 가울린 세포 균질화기를 통하여 8000 psi에서 2회 통과시켜 세포를 분해시킨다. 이후 세포 분해물을 12,000 x g에서 15 분간 원심분리시키고 상등액을 수거하여 -70에서 보관한다.
크로마토그라피를 25에서 수행한다. 세포 분해물 250 ㎖를 Poros-HQ 음이온 교환 수지(PerSeptive Biosystems, 매사추세츠주 캠브리지 소재)의 190 x 26 ㎜ 컬럼에인가한다. 상기 컬럼을 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 0.1 mM EDTA(완충액 A)를 함유하는 용액 160 ㎖로 세척한다. 결합된 단백질을 완충액 A 중에서 5 ㎖/분의 유속으로 0 내지 0.5 M NaCl의 선형 구배 500 ㎖로 용출시킨다. DNA 폴리머라제 활성을 0.1 내지 0.2 M NaCl의 염 농도에 대응하는 이온 강도에서 용출시킨다. 분획 10 ㎖를 수거한다. 일부 경우에 있어서, 활성 분획을 모으고 유사한 조건하에서 제2 Poros-HQ 컬럼을 통과시킨다.
40 ㎖ 용적으로 모은 음이온 교환 분획을 3배 용적의 완충액 A로 희석시키고 50 mM NaCl을 함유하는 완충액 A중에서 평형시킨 190 x 26 ㎜ 포스포셀룰로스 P-11에 인가한다. 상기 컬럼을 동일한 완충액 200 ㎖로 세척한다. 결합된 단백질을 완충액 A중에서 3 ㎖/분의 유속으로 0.1 M 내지 0.7 M NaCl의 선형 구배로 용출시킨다. 약 0.25 내지 0.30 M NaCl의 염 농도에 대응하는 이온 강도에서 상기 컬럼으로부터 DNA 폴리머라제 활성을 용출시킨다. 분획 10 ㎖를 수거한다.
포스포셀룰로스 단계로 부터 모은 활성 분획을 25에서 완충액 A 1 리터에 대해 2회 투석하여 2.4 ㎖/분의 유속으로 완충액 A(Rainin Corp. 캘리포니아주 에머리빌 소재)중에서 미리 평형시킨 250 x 10 ㎜ SynChropak AX-300 음이온 교환 HPLC 컬럼에 인가한다. 샘플을 완충액 A에 넣는다. 결합된 단백질을 2.4 ㎖/분의 유속으로 완충액 A중에서 100 mM 내지 700 mM의 선형 구배 50 ㎖로 용출시킨다. 약 0.2 내지 0.4 M NaCl 사이의 염 농도에 대응하는 이온 강도에서 Bst DNA 폴리머라제 활성을 용출시킨다.
일부 경우에 있어서, 정제된 완전길이 Bst 폴리머라제를 프로테아제로 추가로 처리하여 효소의 활성이 절단된 형태를 생성시킨다. 그러한 경우, 정제된 Bst 폴리머라제(0.33 ㎎/㎖)를 25에서 완충액 A중에서 프로테아제 대 Bst 폴리머라제의 1:200(w/w) 비율로 서브틸리신으로 처리한다. 반응 혼합물을 25에서 40 분간 배양하고, 1 mM의 최종 농도로 PMSF를 가하여 반응을 종결시킨다. Bst DNA 폴리머라제의 활성 단백분해 단편을 쟈콥슨의 방법(참고: Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623(1974); 이의 기술 내용은 본원에서 참고 문헌으로 인용됨)에 따라서 히드록시아파타이트(HA; Bio Gel-HT, BioRad Laboratories, Richmond, CA)의 60 x 10 ㎜ 컬럼을 사용하여 정제한다. HA 컬럼을 20 mM 인산나트륨(pH 7.0) 중에서 평형화하고, Bst 폴리머라제를 1 ㎖/분의 유속으로 20 내지 350 mM 인산나트륨(pH 7.0)의 선형 구배로 용출시킨다. 약 0.3 M 인산나트륨에 대응하는 이온 강도로 활성 단백질을 용출시킨다. 활성 분획을 모은다.
제14도는 조 세균 분해물, 정제된 Bst 1, 정제된 Bst 3, Bst 3, 및 Bst 4의 천연 분해 생성물의 정제 제제(이후 추가로 기술됨)를 함유하는 사진이다.
상기 기술된 정제 도식으로 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 측정한 바와 같은 고도로 정제된 Bst 폴리머라제 효소를 제조할 수 있다. 그러나, 상기 도식을 기준으로하는 변형 방법 또는 상기 개략된 단계의 순서를 변형시키는 것이 본 명세서에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다.
[실시예]
이후 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 당해 분야의 숙련가가 사용할 수 있도록 본 발명의 여러가지 양태를 설명하기 위한 것이다. 그러나, 본 명세서에 기술된 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에 기술된 단백질의 아미노산 서열중 변형체, 또는 이들 모두 바실러스 스테아로써모필루스의 상이한 균주간의 변화 또는 유전적 표류의 결과로 일어나는 자발적 돌연변이로 인하여 존재할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열은 유전적 및 생화학적 방법에 의해서 용이하게 개질시켜 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 유도체 단백질을 생산할 수 있다. 생성된 단백질은 본 명세서에 기술된 Bst 폴리머라제 효소와 동일한 아미노산 서열을 실질적으로 가지며, 더 높거나 더 낮은 수준의 DNA 폴리머라제 활성을 나타낼 수 있다. 그러한 유도체의 활성은 상기한 바와 같이 검출하거나 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 범주는 하기 양태로만 제한되는 것은 아니며, 상기 범주는 이후 기술되는 특허청구의 범위에 의해서만 결정된다.
[실시예 1: 게놈 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 동정]
[앰플리콘 885 및 764]
이들 앰플리콘을 형성하는데 사용된 PCR 앰플리콘 및 프라이머의 위치를 Bst DNA 폴리머라제 유전자와 관련하여 제2도에 나타내었다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 핵산 증폭을 수행하는 독점적인 방법이며, 이것은 뮬리스 등(Mullis et al.)의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호(Hoffman-La Roche, Inc.(Nutley, NJ)에게 양도됨)로 특허 허여되었다. Bst 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 앰플리콘 885를 제조하였다. 기질로서 앰플리콘 885를 사용하고 앰플리콘 885 내의 뉴클레오티드 서열에 대한 두번째 셋트의 프라이머를 사용하여 앰플리콘 764를 제조하였다.
주형으로서 게놈 Bst DNA를 사용한 PCR 반응에서의 프라이머로서 제1도(각각 SEQ ID NOS: 1 및 3)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 16 및 25를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM 염화 칼륨, 1.5 mM 염화 마그네슘, 및 각각 0.2 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 100 ㎕ 중에 각 프라이머 50 pmoles, 주형 DNA 0.5 ㎍ 및 써모스 써모필루스(Thermus thermophilus) DNA 폴리머라제 5 단위를 함유하였다. 이 반응 혼합물을 실리콘 오일 100 ㎕로 커버하고 써모사이클러 장치에서 95에서 1.5분 동안, 이어서 95에서 0.5분, 50에서 2.5분 및 72에서 1.5분 동안 30 사이클로 인큐베이션시켰다. 두번째 셋트의 반응을 디메틸술폭시드(DMSO)를 최종 농도가 13.3(v/v)가 되도록 첨가하여 프라이머의 Tm을 약 8감소시킨 것을 제외하고는 상기한 바와 동일하게 행하였다. 형성된 반응의 효과적인 어닐링 온도는 58였다[Chester and Marshak, Anal. Biochem. 209: 284-290(1993) 참조]. 네가티브 대조군으로서 Bst 주형 DNA를 첨가하지 안혹 별개의 반응을 진행하였다.
2차 PCR 반응에서 제1도(각각 SEQ ID NOS: 5 및 7)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 17 및 24를 프라이머로서 사용하였다. 상기한 1차 반응 혼합물로부터 얻은 앰플리콘을 함유하는 분취량 2 ㎕를 주형으로서 사용하였다. 모든 반응 조건은 1차 반응에서와 동일하게 하고, 1차 증폭시에 50어닐링 온도에서 형성시킨 앰플리콘을 2차 반응에서 50에서 사용하고, 1차 증폭시에 13.3DMSO를 사용하여 형성시킨 앰플리콘은 2차 반응에서도 마찬가지로 13.3DMSO를 사용하여 인큐베이션시켰다.
각 반응 혼합물로부터 얻은 분취량 16 ㎕를 1.5아가로스 겔 상에서 전기 영동시키고 겔을 에티듐 브로마이드로 염색시켰다. 목적하는 앰플리콘 크기를 알려진 Bca 서열을 기준으로 계산하였다. 주형 DNA를 함유하는 반응 혼합물에 해당하는 각 겔 레인에서, 대략 목적하는 크기를 갖는 단일 밴드가 나타났다: 올리고머 16 및 25를 PCR 프라이머로서 사용한 반응 혼합물 중의 약 885 염기쌍의 밴드 및 올리고머 17 및 24를 PCR 프라이머로서 사용한 반응 혼합물 중의 약 764 염기쌍의 밴드, 주형 DNA가 없는 네가티브 대조군에서는 앰플리콘이 관찰되지 않았다. 겔을 상기한 바와 같이 서던 블롯팅시키고, 제1도(SEQ ID NO: 11)에 나타낸 표지된 올리고뉴클레오티드 20으로 프로빙시켰다. 1차 및 2차 PCR 반응의 프라이머 연장 생성물을 표지된 올리고뉴클레오티드 20으로 검출시켰다. 네가티브 대조군 반응에서는 하이브리드화가 관찰되지 않았다.
[앰플리콘 1143]
상기 1차 증폭에서와 동일한 조건을 이용하여 Bst 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 앰플리콘 1143(제2도에 나타냄)을 제조하였다. 이 반응에 사용된 프라이머는 제1도(각각 SEQ ID NOS: 11 및 9)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 20 및 21이었다. 이 반응 혼합물의 분취량을 1아가로스 겔 상에서 전기 영동시키고 에티듐 브로마이드로 염색시켰다. 1143 염기쌍의 목적하는 크기의 단일 앰플리콘이 관찰되었으며, 네가티브 대조군에서는 앰플리콘이 관찰되지 않았다. 상기한 바와같이 이 겔에 서던 전사법을 행하고 그 막을 표지된 올리고뉴클레오티드 16(제1도)으로 프로빙시켰다. 프라이머 연장 생성물은 표지된 올리고뉴클레오티드 16(SEQ ID NO: 1)과 하이브리드화시켰다. 네가티브 대조군 반응에서는 하이브리드화가 관찰되지 않았다.
[앰플리콘 885 및 1143의 클로닝]
앰플리콘 885 및 1143을 상기한 바와 같이 겔 분리시켰다. 정제된 앰플리콘을 T4 DNA 폴리머라제(Stratagene Cloning Systems)와 인큐베이션시킨 결과 그 말단이 평활되었음을 확인하였다. 앰플리콘을 10 mM Tris-HCl(pH 7.9), 10 mM 염화 마그네슘, 50 mM 염화 나트륨, 및 1 mM 디티오트레이톨, 100 ㎍/㎖ 아세틸화 소 혈청 알부민(BSA)(New England Biolabs) 및 각각 0.1 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 반응액 50 ㎕ 중의 T4 DNA 폴리머라제 5 단위와 함께 11에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 반응에 이어서, 앰플리콘을 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA(pH 8.0))로 희석하고 상기한 바와 같은 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜이 용액으로 추출하였다. 프라이머 연장 생성물을 에탄올 중에서 Sma I로 분해시킨 플라스미드 pGem3Z 0.15 ㎍와 함께 동시 침전시키고, 상기한 바와 동일한 2가지 용액을 사용하여 다시 추출하였다. 침전된 핵산을 50 mM Tris-HCl(pH 7.6), 10 mM 염화 마그네슘, 1 mM ATP, 1 mM 디티오트레이톨, 5폴리에틸렌글리콜-8000, 및 T4 DNA 기라아제 10단위를 함유하는 총 용적 10 ㎕의 반응액에 재현탁시키고 실온에서 철야로 인큐베이션시켰다. 또한, 이 반응액에 Sma I 8 단위를 첨가하여 벡터의 재결합을 방지하였다.
환형으로 형성된 앰플리콘 함유 플라스미드를 사용하여 XL1-Blue MRF 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 암피실린, IPTG 및 X-gal을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켰다. DNA 삽입물의 존재를 나타내는 백색 콜로니를 선택하여 암피실린과 함께 LB 브로쓰에서 성장시켰다. 플라스미드 미니프레퍼레이션을 표준 비등 절차에 따라서 제조하고[Sambrook, 상기 참조], 클론의 제한 엔도뉴클레아제 분해법을 이용하여 단리체를 분석하였다.
885 앰플리콘 삽입물의 검출은 각 플라스미드 미니프레퍼레이션을 Eco RI + Hind Ⅲ로 분해시켜 수행하였다. 그 분해물을 상기한 바와같이 1아가로스 겔 상에서 전기 영동시키고 서던 블롯팅시켰다. 서던 블롯을 표지된 올리고뉴클레오티드 20과 하이브리드화시켰다. 프로브는 옅은 저분자량 밴드를 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 20의 서열이 앰플리콘의 말단 부근에 있는 것으로 예측되었기 때문에(제2도 및 제3도), 앰플리콘 내의 대응하는 서열은 앰플리콘 내의 벡터 제한 부위와 Eco RI 또는 Hind Ⅲ 제한 부위 사이에 위치하며, 올리고뉴클레오티드 16(프라이머 중의 하나)은 알려진 Eco RI 부위를 함유하지만 그러한 작은 제한 단편은 발생시키지 않는 것으로 나타났다. Sst I 및 Hind Ⅲ 분해법 뿐만 아니라 별개의 또한 혼합된 Eco RI 및 Hind Ⅲ 분해법을 수행하고, 서던 블롯팅시키고 표지된 올리고뉴클레오티드 20과 하이브리드화시켜 2개의 단리체를 더 시험하였다. 앰플리콘 885를 함유하는 클론의 구조를 이들 실험으로부터 추론하여 이것을 제3도에 나타내었다. 이 클론을 pGem Bst 885로서 명명하였다.
1143 앰플리콘 삽입물의 검출은 상기한 바와 같이 각 플라스미드 미니프레퍼레이션을 Eco RI 및 Hind Ⅲ로 분해하고 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 실시하였다. 에티듐 브로마이드 염색에 의해 결정되는 바와 같이 예상된 크기의 삽입물이 몇가지 단리체에서 관찰되었다. 서던 블롯팅 하이브리드화 분석 후에, 삽입물은 표지된 올리고뉴클레오티드 16과 강하게 하이브리드화되는 것으로 밝혀졌다. 1개의 클론을 대표적인 것으로 선택하고 추론된 제한 맵을 제4도에 나타내었다. 이 클론을 pGem Bst 1143으로 명명하였다.
[앰플리콘 클론의 부분 서열화]
pGem Bst 885 및 pGem Bst 1143 DNA 시료를 사용하여 상기한 바와 같이 서열화 반응을 실시하였다. 두 셋트의 반응에 사용된 프라이머는 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)에서 시판되는 SP6 및 T7 프로모터 프라이머였다(각각 SEQ ID NOS: 15 및 16). 이들 프라이머는 pGem 벡터 중의 SP6 및 T7 프로모터 영역에 대해 특이적이었고 양 방향으로 Bst 앰플리콘 삽입물을 서열화하는데 유용하였다. 형성된 앰플리콘 서열은 알려진 Bca 폴리머라제 유전자 서열로 배열되었고, 그것은 중복된 영역에서 약 88의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 2개의 앰플리콘의 중복 영역에 존재하는 서열은 동일하고, 그것은 그들이 동일한 유전자로부터 발생되었다는 것을 나타내는 것이다. 그러므로, 이 증거는 그 앰플리콘이 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 진정한 단편을 나타내는 것임을 입증하는 것이다.
885 및 1143 앰플리콘 클론으로부터 얻은 서열은 게놈 Bst DNA로부터 얻은 유전자 단편의 분리를 허용하는 2가지의 정보를 제공하였다. 첫째, 올리고뉴클레오티드 16, 17, 20 및 24에 대응하는 영역 중의 Bst 폴리머라제 유전자의 서열은 이들 올리고뉴클레오티드가 서던 블롯팅에서 게놈 Bst DNA의 프로브로서 사용하기에 적합한 것임을 나타내는 것이다. 두번째, Bst DNA 폴리머라제 유전자 내의 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 확인되었다: Bca 좌표 1516에서의 Sst I 제한 부위 및 Bca 좌표 1687에서의 Hind Ⅲ 제한 부위. 이들 부위는 게놈 DNA로부터 얻은 Bst 폴리머라제 유전자의 단편을 분리하기 위한 수단을 제공한다.
[실시예 2: Bst DNA 폴리머라제의 동정 및 클로닝
[유전자 3' 말단의 클로닝]
게놈 Bst DNA의 분취량을 Sst I로 분해시키고, 1아가로스 겔상에서 전기 영동시키고, 상기한 바와 같이 서던 블롯시켰다. 이어서, 별도로전사막을 상이한 6개의 표지화 올리고뉴클레오티드로 프로브시키고, 상기한 바와 같이 자동 방사선 사진을 찍었다. 제5도에 도시한 바와 같이, 표지화 올리고뉴클레오티드 16, 20, 24 및 25는 길이가 약 2.1 kb인 Sst I 단편에 하이브리드화되었다. 이들 올리고뉴클레오티드를 유전자의 3' 말단 부근의 Bca DNA 폴리머라제 서열에 기초하여 디자인하였다. 유전자의 5' 말단으로 향한 Bca 서열에 기초한 다른 2개의 올리고뉴클레오티드 15 및 21은 상기 Sst I 단편에 하이브리드화되지 않았다. 이들 결과로부터, Sst I 제한 부위를 유전자의 3' 말단을 함유하는 게놈 DNA 단편을 단리시키는데 사용할 수 있음을 알 수 있다.
25 ㎍의 정제된 Bst 게놈 DNA를 Sst I로 분해시키고, 1아가로스 겔상에서 전기 영동시켰다. 겔 슬라이스를 약 2.1 kb에 해당하는 겔 영역에서 절제하였다. 겔 슬라이스로부터 DNA를 상기한 바와 같이 정제하여 약 0.45 ㎍을 얻었다.
벡터 pGem 3Z를 Sst I로 분해시키고, 이어서 상기한 바와 같이 페놀/클로로포롬/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 용액으로 순차적으로 추출하였다. 겔 정제된 2.1 kb Sst I 단편을 0.23 ㎍의 Sst I 으로 분해시킨 pGem 3Z 벡터와 함께 에탄올 침전시켰다. 침전된 DNA를 재용해시키고, 상기한 바와 같이 15 ㎕의 반응액 중에서 16에서 철야 결합시켰다. 이 결합 혼합물을 사용하여 XL1-Blue MRF' 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 암피실린, IPTG 및 X-gal을 함유하는 LB 아가 평판 배지 위에 플레이팅시켰다. 삽입 DNA임을 나타내는 백색 콜로니를 선별하고, 미세역가 접시에서 암피실린을 함유하는 200 ㎕의 LB 브로쓰 배지에서 철야 성장시켰다. Bio Rad Bio-Dot 마이크로필터 장치를 사용하여 각 컬쳐의 분취량 100 ㎕를 Schleicher & Schuell Nytran (+) 막 위에서 여과하고, 10 X SSC 200 μl로 세척하였다. 막을 5분간 공기 건조시킨 다음, 계속해서 10SDS로 3분간, 0.5 M 수산화나트륨으로 5분간, 1M Tris-HCl(pH 8.0)으로 5분간 및 1.5 M 염화나트륨을 함유하는 0.7M Tris-HCl(pH 8.0)으로 5분간 침지시킨 여과지 위에 놓았다. 여과지를 공기 건조시키고, 80의 진공 오븐에서 2시간 동안 베이크(bake)시키고, 이어서 상기한 바와 같이 표지된 올리고뉴클레오티드 20으로 하이브리드화시켰다.
올리고뉴클레오티드 20에 하이브리드화되는 클론을 동정하였다. 이 클론을 암피실린을 함유하는 LB 브로쓰 중에서 37에서 철야 배양하였다. 플라스미드 미니프레퍼레이션을 상기한 바와 같이 만들고, 플라스미드 DNA를 Sst I 및 Hind Ⅲ로 개별적으로 및 함께 분해시켰다. 제한 분해물을 1아가로오스 겔에서 전기영동시키고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 2개의 SstI 밴드들이 대략 2.1 kb 및 2.7 kb에 대응하는 위치에서 관찰되었고, 궁극적으로 동일한 패턴이 Sst I 및 Hind Ⅲ로 분해한 플라스미드 DNA로 부하한 겔에서 관찰되었다. Hind Ⅲ 만으로 분해한 플라스미드 DNA는 전기영동시 대략 4.5 kb의 큰 단편과 대략 0.1-0.2 kb의 매우 작은 밴드를 나타내었다. 이 겔을 서던 블롯팅시키고 상기한 바와 같이 표지된 올리고뉴클레오티드 25와 하이브리드화시켰다. 프로브들은 Sst I 및 Sst I + Hind Ⅲ 제한 분해 반응 모두에 해당하는 레인에서 2.1 kb 및 Hind Ⅲ 분해에 해당하는 레인에서 4.5 kb에 하이브리드화되었다.
클론이 예측되는 2.1 kb Sst I 단편의 5' 말단을 함유하는 지를 확인하기 위하여, 이것을 또한 표지된 올리고뉴클레오티드 16으로프로브화시켰는데, 이는 Sst I 부위의 바로 근처의 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 영역에 상보적인 것으로 예측된다. 이 경우, DNA 도트 블롯을 서던 하이브리드화 절차 보다도 목적하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 클론을 동정하는데 사용하였다. 플라스미드 pGem 3Z, pGem Bst 1143 및 2.1 kb Sst I 단편을 함유하는 것으로 보이는 플라스미드 1 ㎍의 분취량을 0.3M 수산화 나트륨 110 ㎕ 중에 65에서 1 시간 동안 변성시켰다. 2M 암모늄 아세테이트 110 ㎕를 첨가하고 시료를 상기한 바와 같은 Bio Rad Bio-Dot 미세여과 장치를 사용하여 Schleicher & Schuell Nytran(+) 막 상에 여과시켰다. 막을 1M 암모늄 아세테이트로 세척하고 진공 오븐 중에서 45분 동안 80에서 베이킹시켰다. 이어서 막을 상기한 바와 같은 올리고뉴클레오티드 16과 하이브리드화되도록 방치하였다. 2.1 kb Sst I 게놈 단편 클론을 함유하는 플라스미드 및 pGem Bst 1143 앰플리콘 클론 모두가 표지된 프로브에 강하게 하이브리드화되었는데, 이는 단편의 5' 말단이 양 플라스미드에 존재함을 나타낸다. 예비 서열화 반응을 SP6 프로모터 프라이머(SEQ ID NO: 15)를 사용하여 상기한 바와 같이 행하였다. 생성된 뉴클레오티드 서열은 앰플리콘 클론 pGem Bst 885 및 pGem Bst 1143로 부터 추론된 서열과 일치하였고, 게놈 클론에 Hind Ⅲ 부위의 존재를 확인하였다.
이 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 Sal I으로 추가의 제한 엔도뉴클레아제 분해를 하여 약 3.1 및 1.8 kb의 두 밴드를 얻었는데, 이들은 Sal I 부위가 폴리머라제 유전자의 다운스트림 3' 비코드화 영역에 존재함을 나타낸다. 이 클론을 pGem Bst 2.1 Sst로 명명하고, 제6도에 나타냈다.
[유전자의 5' 말단의 클로닝]
3' 말단 클론 pGem Bst 2.1 Sst은 5' 말단 근처에 Hind Ⅲ 제한 부위를 함유하기 때문에, Hind Ⅲ 부위를 pGem Bst 2.1 Sst의 2.1 kb Sst I 유전자 단편과 겹치는 게놈 Bst DNA 단편을 단리하는데 사용하였다. 이를 수행하기 위해, Bst 게놈 DNA를 Hind Ⅲ + 1.7 kb 이상의 단편을 동정하기 위한 2차 효소 패널로 분해사고 DNA 폴리머라제 유전자의 없어진 5' 부분을 함유하기에 충분히 큰 것으로 계산하였다.
Bst 게놈 DNA Hind Ⅲ 단독 및 Hind Ⅲ + 다음의 2차 효소: Bam HI, Eco Ri, Kpn I, Sph I, Xba I 및 Xmn I으로 분해하였다. 각 반응 혼합물의 3㎍ 분취량을 이중 1아가로스 겔 중에서 전기영동시켰다. 이어서, 각 겔을 상기한 바와 같이 표지된 올리고뉴클레오티드 20 및 21을 사용하여 서던 블롯에 의해 분석하였다. 분석시, 각각의 이중막은 동일한 하이브리드화 패턴을 나타냈다. 각각의 제한 분해물에 대응하는 레인에 있어서, Hind Ⅲ + Sph I 및 Hind Ⅲ + Xmn I 시료를 제외하고, 대략 4kb의 단일 밴드가 나타났는데, 이는 3' 단편 클론에서 이전에 결정된 Hind Ⅲ 부위로 부터 가장 근접한 업스트림의 Hind Ⅲ가 4kb의 거리에 있고, 이들 Hind Ⅲ 부위 사이에 두번째 효소에 대한 제한 부위가 없음을 나타낸다. Hind Ⅲ + Xmn 분해물에 대응하는 레인은 대략 1.4 kb의 단일 밴드를 나타냈는데, Bca 뉴클레오티드 서열로부터 예측한 바와 같이, 유전자의 전체 5' 말단을 함유하기에 충분히 길지 못하다. Hind Ⅲ 및 Sph I 분해물에 대응하는 레인은 대략 2.8 - 3kb의 단일 밴드를 나타냈다.
이 3 kb 단편을 정제하여 다음과 같이 클로닝시켰다. Bst 게놈 DNA를 Hind Ⅲ + Sph I으로 37에서 분해시켰다. 벡터 pGem 3Z를 역시 동일한 효소로 분해하였다. 두 분해물을 1아가로스 겔 상에서 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 생성된 벡터 단편 및 3kb Hind Ⅲ/Sph I Bst 게놈 단편을 겔로부터 절제하고, 이 DNA를 상기한 바와 같이 겔 정제하였다. 벡터 DNA 약 125 ng을 3kb Hind Ⅲ/Sph I 단편과 함께 에탄올 침전시켰다. 침전된 DNA를 재용해시키고 T4 DNA 리가제 1 단위를 함유하는 전체 용적 15 ㎕의 반응 혼합물 중에 16에서 철야 방치하여 결합시켰다. 이 결합 반응 혼합물을 사용하여 Xl1-Blue MRF' 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포들을 암피실린, IPTG 및 X-gal을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켰다. DNA 삽입물을 나타내는 백색 콜로니들을 선별하고 미세역가 접시 중의 암피실린을 함유하는 LB 브로쓰 컬쳐 200 ㎕ 중에서 철야 성장시켰다. 각 컬쳐의 100 ㎕ 분취량을 상기한 바와 같은 이중 하이브리드화막상에 여과시키고, 공기 건조시키고, 진공 오븐 중에서 2 시간 동안 80에서 베이킹시켰다. 이중 막들을 개별적으로 올리고뉴클레오티드 20 및 21과 하이브리드화시켰다. 3개의 컬쳐로부터 얻은 시료들은 각 프로브와의 일부 하이브리드화를 나타냈다. 이들 컬쳐들을 암피실린을 함유하는 LB 브로쓰 중에서 철야 배양하고 플라스미드 미니프레퍼레이션을 상기한 바와 같이 만들었다. 각 시료로부터 생성된 플라스미드 DNA를 Xmn I 단독 및 Hind Ⅲ + Sph I으로 분해하고, 1아가로스 겔 상에서 전기영동시키고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 2개의 클론으로부터의 시료들은 예측한 크기의 DNA 밴드를 생성하는 것으로 나타났다. (Hind Ⅲ + Sph I 반응은 대략 3 kb 및 2.7 kb의 단편을 생성할 것으로 예측되었다. 이들 밴드는 겔 중에 용해될 수 없었다. Xmn I 반응은 대략 3.4 kb 및 2.4 kb의단편을 생성할 것으로 예측되었다) 이들 클론 중 하나를 선택하여 더 분석하였다. 이들 클론으로부터의 플라스미드 DNA을 상기한 바와 같이 Hind Ⅲ로 분해하고 전기영동시켰다. 대략 5.6 kb의 단일 밴드가 선형 플라스미드에 대해 예측한 바와 같이 존재하였다. 동일한 플라스미드 DNA를 마찬가지로 Xmn I, Hind Ⅲ + Xmn I 및 Hind Ⅲ + Sph I으로 분해시키고, 삼중 1아가로스 겔 상에서 전기영동시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하고 상기한 바와 같이 서던의 방법에 의해 하이브리드화 막으로 옮겼다. 삼중의 막을 이어서 개별적으로 표지된 올리고뉴클레오티드 15, 21 및 20과 하이브리드화되도록 방치하였다. 얻어진 결과를 아래에 요약하였다.
이들 결과는이 클론이 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 5' 말단을 함유함을 나타낸다. 예비 서열화 반응은 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 15)의 SP6 프로모터 프라이머를 사용하여 행하였다. 이 프로모터-프라이머는 Bst DNA 폴리머라제 코딩 영역으로부터 외부로부터 시작하여, 유전자의 5' 말단을 향해 연장하는 서열화 반응을 촉진한다. 서열화 반응의 결과는 백터 클로닝 부위의 가장 근접한 DNA 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 이전에 pGem Bst 2.1 Sst의 3' 유전자 단편의 5' 말단으로 부터 얻은 서열과 일치됨을 나타냈다. 따라서, 이들 데이타는 새로운 5' 유전자 단편 클론이 클로닝된 3' 유전자 단편 삽입물과 중복됨을 나타낸다. 새로운 삽입물의 추가의 제한 지도화는 또한 두 Sal I 부위, 즉 5' 플랭킹 영역의 유전자의 5' 말단으로부터의 대략 0.2 kb 업스트림의 하나, 및 암호화 영역의 유전자의 5' 말단으로부터 대략 0.5 kb 다운스트림의 하나의 존재를 나타냈다. 이 새로운 플라스미드를 pGem Bst 5' 말단으로 명명하고, 제7도에 나타냈다.
[실시예 3: 완전길이 Bst DNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 플라스미드의 작제]
5' 및 3' 유전자 단편 클론 pGem Bst 5' 말단 및 pGem Bst 2.1 Sst의 세그먼트들을 합하여, Bst DNA 폴리머라제 유전자의 완전길이 카피를 포함하는 플라스미드를 작제하였다. 사용된 방법을 제8도에 개략적으로 도시하였다.
먼저, 제8도에서 단편 A로 나타낸 유전자의 3' 말단 부분을 포함하난 전구체 플라스미드를 작제하였다. 정제 플라스미드 pGem Bst 2.1 Sst DNA를 Hind Ⅲ + Sal I로 분해시키고, 1아가로스겔 상에서 전기영동시켰다. 대략 1.6 kb의 DNA 밴드를 포함하는 겔 슬라이스(단편 A)를 절제하여, 상기한 바와 같이 DNA를 겔 정제하였다. 플라스미드 벡터 pUC 18을 동일한 2개의 효소로 분해시키고, 동시에 정제하였다. 대략 0.25 ㎍ 단편 A 및 0.15 ㎍ pUC 18 단편을 함께 에탄올 침전시켰다. 핵산을 상기한 바와 같이, 15 ㎕의 용적으로 10 단위 T4 DNA 리가제를 포함하는 반응 혼합물에 16에서 재용해시키고 하룻밤동안 결합 반응시켰다. 결합반응 혼합물을 사용하여 XL1-블루 MRF 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 암피실린, IPTG 및 X-갈을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에서 배양하였다. DNA 삽입물을 나타내는 백색 콜로니를 선택하여 암피실린이 있는 LB 브로쓰 중에서 성장시켰다. 상술한 바와 같이 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조하고 생성되는 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ + Sal I로 분해시키고, 1아가로스겔 상에서 전기 영동시키고, 에티듐 브로마이드로 염색시켰다. 시료가 1.6 및 2.7 kb의 예상 크기의 DNA 밴드를 발생시키는 것을 확인하였다. 이 플라스미드 클론을 pUC Bst 3' 말단으로 명명하였다.
pGem Bst 5' 말단을 사용하여, 다음과같이 제8도에서 Aat Ⅱ/Hind Ⅲ 단편(단편 B)로 나타낸 유전자의 5' 말단 부분을 단리하였다. 이 클론의 서열화 및 제한 유전자 지도로부터 지시된 Sal I 및 Aat Ⅱ 제한 부위를 밝혀내었다. 정제된 pGem Bst 5' 말단을 DNA를 상기한 바와 같이 Hind Ⅲ + Sph I + Ssp I로 분해시키고, 전구체 2.86 kb Hind Ⅲ/Sph I 단편을 겔 정제시켰다. 이어서, 전구체 단편을 Aat Ⅱ로 분해시키고, 2.3kb 단편 B를 상기와 같이 겔 정제시켰다. (이 단편은 전기영동 동안 소망한 단편과 함께 공동 이동되는 원하지 않은 플라스미드 단편을 제거하기 위하여 초기의 Sph I 및 Ssp I 분해와 더불어 2 단계로 제조하였다.)
플라스미드 pUC Bst 3' 말단 DNA를 Hind Ⅲ + Aat Ⅱ로 분해시키고, 대형 단편을 상기와 같이 겔 정제시켰다. 대략 0.6 ㎍의 분해 pUC Bst 3' 말단 DNA를 대략 0.5 ㎍ 단편 B와 함께 에탄올 침전시키고, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 포함하는 반응 혼합물에서 16에서 하룻밤 동안 결합 반응시켰다. 결합 반응 혼합물을 사용하여 XL1-블루 MRF 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 암피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에서 배양하였다. 콜로니를 선택하여 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰 중에서 성장시키고, 상술한 바와 같이 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조하였다. 플라스미드 DNA를 Sal I 분해로 분해시키고, 상기한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동시켰다. 약 2.7, 2.6 및 0.7 kb의 에상 크기를 지닌 3개 밴드들이 이와 같이 스크리닝된 대부분의 플라스미드 제제에서 관찰되었는데, 이는 5' 및 3' 게놈 측면 서열을 포함하는 완전길이 DNA 폴리머라제 유전자가 성공적으로 작제되었음을 의미한다. 이들 클론 중 어느 하나를 대표 클론으로 선택하였다. 이 플라스미드를 pUC Bst I으로 명명하고, 제8도에 도시하였다. Bst DNA 폴리머라제 유전자 및 그의 5' 및 3' 측면 서열을 SEQ ID NO: 19에 나타내었다.
[실시예 4: 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인이 결여된 Bst DNA 폴리머라제 클론의 작제]
Bst DNA 폴리머라제 유전자의 3'-5' 엑소뉴클레아제 및 폴리머라제 도메인만을 포함하는 플라스미드 클론을 다음과 같이 작제하였다. 일반적으로, 먼저 플라스미드 pMALTM-P2(New England Biolabs)로부터의 lac Iq리프레서 유전자를 최종 클론이 다양한 숙주 세포에서 IPTG로 유도될 수 있도록 변형 pUC 18 플라스미드 중에 삽입하여 플라스미드를 작제하였다. 종래의 발간물들에는 완전길이 DNA 폴리머라제 I의 발현이 이. 콜라이 숙주 세포에 치명적이라고 밝히고 있다(참조: Joyce, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1830-1834(1983)). 3개 성분 즉, Hind Ⅲ 내지 pGem Bst 2.1 Sst로부터의 Sal I 영역을 포함하는 3' 유전자 단편, Sty I 부위로부터 pGem Bst 5' 말단의 Hind Ⅲ 부위까지의 영역을 포함하는 중앙 유전자 단편, 및 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제조한 단편들로부터 클로닝되는 DNA 폴리머라제 유전자 단편을 모아서, Bst DNA 폴리머라제의 코딩 영역의 5' 말단을 완성하고 클로닝 부위를 제공하였다. 클로닝 방법은 제9도에 나타내었다.
단계 1: 1 ㎍ 플라스미드 pMALTM-P2를 제한 엔도뉴클레아제 Msc I + Ssp I로 분해하고, 아가로스 겔 중에서 전기영동시키고, lac Iq리프레서 유전자를 포함하는 대략 1.39 kb의 생성 밴드를 상기한 바와 같이 겔 정제시켰다. 이어서 이 단편을 상기한 바와 같이 20 단위의 T4 DNA 리가제를 포함하는 반응 혼합물 중에서 실온에서 하룻밤 동안 20 pmol의 Sph I 링커(New England Biolabs)에 결합 반응시켰다. T4 리가제를 75에서 5분 동안 가열 불활성화시키고, 결합 반응 혼합물을 에탄올 침전시켰다. DNA 단편을 재용해시키고 Sph I으로 분해시킨 다음, 상기한 바와 같이 전기 영동시키고 겔 정제시켰다. 생성된 DNA 단편을 제9도에서 단편 "a"로 나타내었다. 새로운 Nco I 클로닝 부위를 창출하는 pUC 18 내에 2개의 염기 치환을 만들어서 플라스미드 벡터 pUC 18N을 사전에 작제하였다. 전술한 바와 같이, Eco RI 부위로부터의 A 뉴클레오티드 11 염기 업스트림을 G로 치환하고, EcoR I 부위로부터의 T 잔기 15 염기 업스트림을 C로 치환하였다. 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같이 표시된다.
pUC 18 5'-.....CTATGACCATGATTACGAATTC......-3'
pUC 18N 5'-.....CCATGGCCATGATTACGAATTC......-3'
Nco I Eco RI
플라스미드 pUC 18N을 Sph I으로 분해하고, 아가로스 겔 중에서 전기 영동시키고, 상기한 바와 같이 겔 정제시켰다. 선형화 플라스미드를 상기한 lac Iq단편과 함께 동시 에탄올 침전시키고, 2개의 DNA 단편을 전술한 바와 같이 2 단위의 T4 DNA 리가제를 포함하는 반응 혼합물 중에서 16에서 하룻밤 동안 결합 반응시켰다. 결합 반응 혼합물을 사용하여 XL1-블루 MRF 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 암피실린, IPTG 및 X-갈을 포함하는 LB 플레이트 상에서 배양하였다. DNA 삽입물의 존재를 나타내는 백색 콜로니를 선택하여 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰 중에서 성장시키고, 상술한 바와 같이 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조하였다. 플라스미드 DNA 제제를 각각 Eco RI + Eco RV 및 Hind Ⅲ + Eco RV로 분해시키고, 아가로스겔 중에서 전기영동시켰다. 예상된 크기(Eco Ri/Eco RV: 3.15 kb + 0.96 kb, Hind Ⅲ/Eco Rv: 3.59 kb + 0.52 kb)의 DNA 밴드를 나타내는 플라스미드 클론을 선택하여 pUC 18N Iq로 명명하였다.
단계 2: 2개의 부분적으로 상보적인 단일사 합성 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NOS: 17 및 18)를 사용하여 클로닝된 유전자의 5' 말단을 완성하는 데에 요구되는 합성 단편을 작제하였다. 이들 올리고뉴클레오티드를 pGem Bst 5' 말단 DNA를 서열화하여 얻은 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 서열에 근거하여 디자인하였다. 올리고뉴클레오티드를 그의 상보적 영역이 하이브리드화시 그의 3' 말단에서 28 염기에 의하여 서로 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 발생시키도록 작제하였다. 어닐링된 단일사 올리고뉴클레오티드를 이중사 DNA 분자를 형성시키는 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I으로부터의 클레나우 단편으로 연장시켰다. 생성된 이중 DNA 분자는 5' 말단 근처의 Nco I 제한 엔도뉴클레아제 부위, 3' 말단 근처의 Sty I 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 유전자 배위 868-1012에 대응하는 Bst DNA 폴리머라제 유전자 서열을 포함하고 있었다. 이 단편은 새로운 Nco I 클로닝 부위가 도메인의 5' 말단에 부가되었고, 본래의 Sty I 클로닝 부위가 단편의 3' 말단에 있으면서 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 3'-5' 엑소뉴클레아제 도메인의 5' 말단을 포함한다. 이 DNA 단편은 제9도에서 단편 "b"로 나타내었다.
단계 2를 수행하기 위하여, 각각 15 pmol의 SEQ ID NO: 17 및 18의 올리고뉴클레오티드를 50 mM 염화칼륨, 2 mM 염화마그네슘 및 20 mM 트리스 HCl(pH 8.0)을 포함하는 총용적 96 ㎕의 용액 중에서 혼합하였다. 용액을 76에서 10 분 동안 배양한 다음, 올리고뉴클레오티드를 어닐링하기 위하여 수시간에 걸쳐 서서히 실온으로 냉각시켰다. 10단위의 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편 및 각각 0.2 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 첨가하면서 총 용적을 100 ㎕로 만들었다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 6분 동안, 37에서 45분 동안 42에서 10분 동안 배양하였다. 이어서, 용액을 상술한 바와 같이 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 용액으로 연속적으로 추출한 다음, 에탄올 침전시켰다. 이중사 단편을 25 U의 Nco I를 포함하는 반응 혼합물에 재용해시켜 분해하고, 생성된 0.15 kb 단편을 상술한 바와 같이 겔 정제하였다.
단계 3: 단계 1에서 작제한 플라스미드 pUC18N Iq를 단계 2로부터의 단편 "b"와 배합된 Nco I로 분해시키고, 플라스미드 및 DNA 단편을 16에서 하룻밤 동안 결합 반응시켰다. 리가제를 65에서 10분 동안 가열 불활성화시키고, 결합 반응 생성물을 에탄올 침전시켰다. 플라스미드를 Sty I + Sal I로 분해시키고, 상술한 바와 같이 겔 정제시켰다.
단계 4: Bst DNA 폴리머라제 유전자 단편을 다음과 같이 단리시키고 모았다. 플라스미드 pGem Bst 5' 말단을 Sty I + Hind Ⅲ로 분해시키고, 전기 영동시키고, 생성된 0.68 kb DNA 단편(단편 "c"로 명명)을 겔 정제시켰다. 플라스미드 pGem Bst 2.1 Sst를 Hind Ⅲ + Sal I로 분해시켰다. 이 분해 혼합물을 또한 전기 영동시키고, 1.57 kb DNA 단편(단편 "d"로 명명)을 상술한 바와 같이 겔 정제시켰다. 정제 단편 "c" 및 "d"를 합하여 동시 에탄올 침전시켰다. 펠렛화 DNA를 4 U의 T4 리가제를 함유하는 30 ㎕ 반응 혼합물에 재용해시키고, 16에서 하룻밤 동안 결합 반응시켰다. 리가제를 65에서 10 분 동안 가열 불활성화시키고, 결합 반응된 단편 "c" 및 "d"를 에탄올 침전시킨 다음, Sal I로 분해시켰다. 아가로스 겔 전기영동법을 거친 후, 생성된 2.25 kb 결합 반응 단편 "cd"를 상술한 바와 같이 겔 정제시켰다.
단계5: 겔 정제 단편 "cd"를 2 U의 T4 리가제를 포함하는 17 ㎕ 반응 혼합물 중에서 16에서 하룻밤 동안 단계 3에서 제조한 플라스미드와 결합 반응시켰다. 결합 반응 혼합물을 사용하여, XL1-블루 MRF 세포를 형질전환시키고, 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에서 배양하였다. 콜로니를 선택하여 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰 중에서 성장시키고, 선택된 콜로니의 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조하였다. DNA 제제를 Nco I + Hind Ⅲ 및 Sph I + Sty I 를 사용한 제한 엔도뉴클레아제 분해법을 사용하여 DNA 제제를 분석하였다. 제한 분해물을 아가로스 겔 전기영동시키고, 에티듐 브로마이드 염색시켰다. 클론은 예상된 크기(Nco I + Sty I: 2.62 kb, 0.83 kb, 0.37 kb에서 2개 밴드 및 Sph I + Sty I: 2.77 kb, 1.41 kb, 1.05 kb, 0.88 kb, 0.33 kb)의 제한 단편을 발생시키는 것으로 확인되었다. 이 클론을 pUC Bst 2라고 명명하고 제9도에 나타내었다. 5' 및 3' 비번역 영역이 없는 (그러나 해석되지 않은 말단 코돈이 있는) Bst 2 유전자 삽입물은 SEQ ID NO: 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
[실시예 5: pUC Bst 2의 변형체의 작제]
Bst DNA 폴리머라제 유전자의 발현에 대한 lac Iq리프레서 유전자의 효과를 측정하기 위하여, pUC Bst 2 의 변형체는 lac Iq리프레서 유전자가 결실 또는 역전되는 방향으로 있도록 작제된다. 이들 클론을 제조하기 위하여, pUC Bst 2 DNA를 Sph I 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 lac Iq삽입물을 방출시킨다. 반응 혼합물을 상기한 바와 같이 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 용액을 사용하여 연속적으로 추출한후, 에탄올을 침전시킨다. 그후 시료를 16에서 하룻밤 T4 DNA 리가제 1 U를 함유하는 20 ㎕ 반응 혼합물에서 재용해 및 재결합시킨다. 결합 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜리 1200 세포들을 형질 전환시키고, 형질 전환된 세포들을 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에서 플레이팅한다. 콜로니를 선택하고, 암피실린을 함유하는 LB 육즙에서 배양한다. 플라스미드 미니프레퍼레이션을 상술한 바와 같이 행한다. 그후 시료를 Eco RV 및 Hind Ⅲ을 사용하여 분해하고, 1아가로오스 겔상에서 전기영동한후, 에티듐 브롬화물을 사용하여 염색시킨다. 플라스미드 pUC Bst 2 "AB", "CD" 및 "EF"을 하기 표 및 제11도에 기재된 예상 밴드 크기를 기준으로 하여 동정하였다.
[실시예 6 : 5'-3' 엑소뉴클레아제 영역에서 결실된 Bst 폴리머라제 클론의 작제]
Bst DNA 폴리머라제 유전자의 5'-3' 엑소뉴클레아제 영역에서 골격내 결실을 함유하는 플라스미드는 3'-5' 엑소뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제 활성에 영향을 미치는 유전자의 영역을 변형시키지 않고 발현된 유전자 생성물의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 불활성화 또는 소멸시킬 목적으로 작제된다.
실험 전략은 제10도에 도시되어 있고, pUC Bst 1으로부터 두 개의 제한 단편을 이용한다. 첫번째 단편은 Pvu Ⅱ을 사용하여 pUC Bst 1 DNA를 분해함으로써 제조한다. 제한 분해물을 아가로오스 겔 전기영동시킨다. 상기한 바와 같이 3,321 개의 염기쌍 단편을 동정하고, 겔 정제한다. 그후 정제 단편을 Hind Ⅱ을 사용하여 부분적으로 분해한다. 이 단편을 부분적 분해하는데 적절한 조건은 이미 결정되었다: 기질 DNA의 부분 제한 분해물을 유도하기 위한 조건들은 용이하게 측정되며, 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 아가로오스 겔 전기영동상에서, 3,126 개의 염기쌍 단편을 동정하고 겔 정제한다.
제2 제한 단편을 제조하기 위하여, 우선 아가로오스 겔 전기영동을 진행하는 동안 목적하는 DNA 단편을 사용하여 함께 이동하는 것으로 예상된 DNA 단편을 제거하기 위하여 Aat Ⅱ을 사용하여 pUC Bst 1을 분해하여 종결한다. 그후 DNA를 소규모 파일롯 분해에 의해 이미 측정된 조건들하에 Pvu Ⅱ를 사용하여 부분적으로 분해시킨다. 겔 전기영동한후, 2754 개의 염기쌍 크기를 갖는 목적하는 단편을 겔로부터 자른 후, 겔 정제한다.
이렇게 분리한 두 개의 겔 정제 단편들을 결합시키고, 에탄올을 침전시킨후, 펠렛을 재용해시키고, 실온에서 T4 DNA 리가제 1.5 U를 함유하는 반응 혼합물 10 ㎕중에서 하룻밤 결합시킨다. 결합 반응 혼합물을 사용하여 XL1-블루 MRF' 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포들을 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에서 플레이팅한다. 콜로니를 분리하고, 암피실린을 함유하는 LB 육즙에서 배양한다. 플라스미드 미니프레퍼레이션을 상술한 바와 같이 제조한다. 그후 플라스미드 DNA 를 함유하는 시료들을 Pvu Ⅱ, Sal I, Hind Ⅲ 및 Aat Ⅱ, Sal I 및 Sty I을 사용하여 분해하고, 1아가로오스 겔상에서 전기영동한다. 제10도에 도시된 지도로부터 예상된 분자량을 가진 제한 단편을 제조하는 플라스미드 클론을 동정하고; 이 클론을 pUC Bst 3이라 명칭하며; 5' 및 3' 비번역 영역이 없는 (및 비번역 말단 코돈을 가지는) Bst 3 분해 생성물의 DNA 서열은 SEQ ID NO:24에서 제시된다.
플라스미드 pUC Bst 3은 DNA 폴리머라제 유전자의 5'-3' 엑소뉴클레아제 영역내에 뉴클레오티드를 제거함으로 인하여 DNA 폴리머라제 클론 pUC Bst 1의 완전길이보다 짧은 195 개의 염기쌍을 가지고 있다. 이러한 결실은 발현된 변형 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 영역 (잔기 178-242 개)으로부터 65 개의 아미노산 잔기의 부재를 초래한다. 이들 65 개의 아미노산중에는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 필요한 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I 의 아미노산에 상응하는 것으로 생각되는 2개의 글리신 잔기가 있다(참조; Joyce, et al., J. Mol. Biol. 186:283-293(1985)).
[실시예 7: 테트라사이클린 내성 유전자의 모든 Bst DNA 폴리머라제 클론으로의 삽입]
상기의 플라스미드를 함유하는 모든 Bst DNA 폴리머라제는 발현된 숙주 세포상에서 암피실린 내성을 부여하는 선택성 마커 유전자를 포함한다. 이 유전자는 β-락타마제를 암호화한다. 이 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하여 형질전환시키고, 암피실린을 함유하는 배지에서 성장시킨 숙주 세포 컬쳐는 자주 클론 유전자를 상실하는 결과와 함께 비교적 고비율의 반전(reversion)을 가지는 것으로 발견된다. 배양하는 동안 숙주 세포내에서 플라스미드를 안정화시키려는 시도에서, 테트라사이클린 내성(tetr)을 부여하는 부가적인 선택성 마커 유전자를 각 플라스미드에 가한다. 이 유전자를 함유하는 단편을 Eco RI 및 Ava I를 사용하여 상술한 바와 같이 플라스미드를 분해함으로써 pBR322로부터 분리하고, 이 분해 혼합물을 전기영동시키며, 1427 개의 bp tetr단편을 겔 정제시킨다. 정제 단편을 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하여 말단-충전하고, 생성된 평활 말단의 tet 단편을 Aat Ⅱ 올리고뉴클레오티드 링커를 사용하여 결합시키고(New England Biolabs); 겔 정제된 DNA 단편의 합성 링커를 사용한 결합 반응은 상술한 바와 같고, 당업자들에게 잘 알려져 있다(참조: Sambrook, supra, 이미 본 명세서의 참조문헌에 의해 삽입됨). 결합 혼합물은 에탄올 침전되고, DNA 리가제는 열 불활성화된다. 그후 링커 함유 단편을 Aat Ⅱ을 사용하여 분해하고, 아가로오스 겔 전기영동 및 겔 정제시킨다. 플라스미드 벡터 pUC 18을 Aat Ⅱ을 사용하여 분해하고, 아가로오스 겔 전기영동한 후, 선형화된 큰 단편을 겔 정제한다. Aat Ⅱ 링커를 포함하는 Aat Ⅱ 분해 벡터 및 tetr단편을 전술한 바와 같이 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 용액중에서 연속적으로 추출하였다. 추출된 DNA 단편을 결합시키고, 함께 에탄올을 침전시키며, T4 리가제를 함유하는 반응 혼합물에서 결합시킨다. 이. 콜리 JM109 세포들을 이러한 결합 혼합물을 사용하여 형질 전환시키고, 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에서 플레이팅한다. 상술한 바와 같이 콜로니를 분리하고, 테트라사이클린을 함유하는 LB 육즙에서 배양시켜, 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조한다. 플라스미드 제제를 Eco RV, 및 Ssp I 및 Hind Ⅲ을 사용하여 분해시키며, 아가로오스 겔상에서 전기영동을 행한다. 두 개의 가능한 방향중 한 방향에서 tetr유전자를 함유하는 플라스미드에 대해 예상된 크기를 가지는 DNA 단편들을 생성하는 클론을 동정한다. 예상 단편 크기는 Eco Rv: 4121, Ssp I + Hind Ⅲ: 2102, 1868 및 150이다. 이 플라스미드를 pUC Tet (+)이라 명명한다. 정제 pUC Tet (+) DNA를 이 클론의 세포 컬쳐로부터 분리한다. 상술한 바와 같이 이 DNA를 Aat Ⅱ를 사용하여 분해하고, 분해 혼합물을 아가로오스 겔 전기영동하며, 1435 bp tetr단편을 겔 정제한다. 그후 이 단편을 이들의 독특한 Aat Ⅱ 벡터 부위에서 각각의 Bst DNA 폴리머라제 클론으로 삽입하기 위하여 tetr유전자의 공급원으로서 사용한다.
이를 수행하기 위하여, 각각의 Bst DNA 폴리머라제 클론으로부터 플라스미드 DNA의 제제를 Aat Ⅱ을 사용하여 분해하고, 아가로오스 겔 전기영동하며, 선형화 플라스미드 겔을 정제한다. 정제된 플라스미드 단편을 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 용액으로 연속적으로 추출한다. 정제 Aat Ⅱ 선형화 플라스미드 DNA를 1435 bp tetr단편과 결합시키고, 에탄올을 침전시킨다. DNA 펠렛을 용해시키고, DNA 단편들을 상술한 바와 같이 T4 DNA 리가제를 함유하는 반응 혼합물에서 결합시킨다. 결합 혼합물을 사용하여 이. 콜리 1200 세포들을 형질 전환시키고, 형질전환체를 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천상에서 플레이팅한다. 각각의 콜로니를 테트라사이클린을 함유하는 LB 육즙에서 배양하고, 이들 컬쳐의 플라스미드 미니프레퍼레이션을 제조한다. 각각의 플라스미드에서 tetr유전자의 방향성을 결정하기 위하여, 각각의 제제로부터 플라스미드 DNA는 클론된 Bst DNA 폴리머라제 유전자내의 적절한 인지 부위를 가지는 다른 제한 엔도뉴클레아제와 배합된 형태의 Hind Ⅲ 또는 Eco RV를 사용하여 분해한다. 겔 전기영동 및 에티듐 브롬화물의 염색후, Bst DNA 폴리머라제 유전자의 경우에 대하여 각 방향에서 tetr삽입물을 포함하는 클론을 선택한다. 플러스 (+) 방향은 전사에 대하여 Bst 폴리머라제 유전자와 동일 방향으로 표시된 것이도, 마이너스(-) 방향은 Bst DNA 폴리머라제 유전자에 대해 반대 방향임을 표시한 것이다. 이들 클론들의 각각의 스톡 컬쳐를 제조하고, 클론을 하기와 같이 명염한다.
[실시예 8 : Bst DNA 폴리머라제 클론내에서의 효소 발현 예비 시험]
본 명세서에 기재된 바와 같이 작제된 클론으로부터의 활성 Bst DNA 폴리머라제 발현의 예비 측정을 위해, 이들을 암피실린 또는 테트라사이클린 중의 하나를 함유하는 LB 브로쓰의 배양액 내에서 철야로 성장시켰다. 각각의 복제 방향에 I 유전자를 포함하는 pUC Bst 2의 컬쳐에 1mM IPTG를 가하여 상기 효소의 발현을 유도하였다. Bst 1, Bst 2의 아미노산 서열 및 Bst 3의 절단 생성물을 SEQ ID NO: 20, 23 및 25에 각각 도시한다. 각각의 컬쳐 분취량 0.5 ㎖를 하기하는 바와 같이 SDS 겔 및 효소 활성 분석법에 의해 분석하였다.
효소 활성 분석에 이용되는 각각의 분취량을 미세원심분리기 내에서 2 분간 원심분리하고 세포 펠릿을 세척 완충액(50mM 염화나트륨, 5mM EDTA, 0.25 M 슈크로스, 50mM Tris-HCl(pH 8.0))으로 일회 세척하였다. 펠릿을 -80에서 냉동시키고 각각 용균 완충액(10mM 염화나트륨, 1mM EDTA, 1글리세롤, 25mM 디티오트레이톨, 1mM 페닐메틸술포닐 플로오라이드(PMSF), 500 ㎍/㎖ 라이소자임, 10mM Tris-HCl(pH 8.0))중에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 20분간 방치 후, 100㎕의 0.75(v/v) Triton X-100을 각각의 샘플에 가하고 이 샘플을 3회 드라이 아이스 상에서 냉동 및 해동시켰다. 얻어지는 세포 분해물을 효소 희석 완충액(100mM 염화나트륨, 0.1mM EDTA, 0.01NP-40(폴리글리콜 에테르 유도체를 포함하는 비이온성 세제: Sigma Chemical 사, 세인트 루이스, 미주리주), 10글리세롤, 20mM Tris-HCl(pH 7.5))으로 5,000 배 희석시키고, 10㎕ 분취량을 상기한 바와 같이 60에서 DNA 폴리머라제 활성에 대해 분석하였다. 2개의 실험 결과를 하기 표에 제시한다. 분석 결과를 RLU(상대적 광 단위, relative light unit)로 나타낸다.
첫번째 실험은 2개의 이. 콜라이 숙주 세포 균주(XL1-Blue MRF'균주 및 이. 콜라이 1200 균주)를 이용하여 실험하였다. 이. 콜라이 XL1-Blue MRF'은 tetr의 에피좀성 카피를 포함한다. Xl1-Blue MRF' 균주를 플라스미드 pUC Bst 1, pUC Bst 2, 및 pUC Bst 3(이들 모두에게는 tetr유전자가 없다)로 형질전환시켰다. 이들 클론의 컬쳐로부터의 분해물의 효소 활성을 동일한 버젼이지만 각각의 복제 방향에 tetr유전자를 함유하는 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 1200 숙주 세포로부터의 분해물의 효소 활성과 비교하였다.
두번째 실험에서, 상기한 바와 같이 제조된 pUC Bst2(A, B, C, D, E 및 F) 버젼을 pUC Bst 1 T(+) 및 pUC Bst 3 T(+)와 비교하여 Bst DNA 폴리머라제 발현에 대한 lac I 리프레서 유전자의 영향을 조사하였다. 본 실험에 이용한 모든 클론은 이. 콜라이 1200 세포주 내에 존재하며, lac Iq 유전자을 포함하는 모든 클론들(pUC Bst 2A, B, C 및 D)을 1 mM의 IPTG 존재 하에서 성장시켜, 이들 플라스미드내에서의 lac 프로모터의 조절 하에서의 Bst DNA 폴리머라제 유전자 발현을 유도하였다.
두개의 실험에서 제조된 세포 분해물의 분취량을 SDS 폴리아트릴아미드 겔 상에 영동시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루(본 명세세에 참고 문헌으로 인용된 상기 문헌 Sambrook에서 기술함)로 염색시켰다. 음성 대조구와 비교시, pUC Bst 1 및 pUC Bst 3을 함유하는 숙주 세포로부터 제조된 모든 세포 분해물을 영동시킨 겔에서 진한 새로운 밴드들이 발견되었다. 반면, pUC Bst 2 계열 플라스미드 중 어느 하나를 함유하는 숙주 세포로부터 제조된 분해물에 상응하는 겔 레인에서는 새로운 밴드들이 관찰되지 않았다. pUC Bst 1 계열 플라스미드를 함유하는 세포에서 새로이 관찰된 밴드들은 97 kDa 분자량 마커 유전자와 대략 동일한 위치까지 영동되었으며, pUC Bst 3 계열 플라스미드를 함유하는 숙주 세포로부터 새로이 관찰된 밴드들은 수 kDa 적은 위치에 영동되었다. 이들 단백질 밴드들은 특정 플라스미드 작제물에 의해 암호화되는 Bst DNA 폴리머라제 효소의 대략적으로 예상된 크기 위치에 영동되었다.
이들 2개 실험에서 얻어진 데이타는 몇가지 사실을 알려준다. Bst DNA 폴리머라제 유전자는 lac 프로모터와 같은 이종성 프로모터를 이용하지 않고 이. 콜라이 숙주 세포에서 발현될 수 있다. pUC Bst 1 계열 및 pUC Bst 3 계열의 클론들은 대략 폴리머라제 유전자의 5' 말단에 결합된 대략 600개의 염기쌍을 함유한다. 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 DNA 폴리머라제 유전자 생성물의 발현이 이 영역 내의 하나 이상의 본래 존재하는 프로모터 또는 프로모터 유사 서열에 의해 고무된다고 생각한다. 이들 클론들은 클로닝 벡터내에 lac 프로모터를 포함하지만, 이것은 폴리머라제 유전자로부터 다운스트림이어서, Bst 폴리머라제 유전자의 반대편 복제 방향에서 전사를 지시한다. 따라서, 이 프로모터는 폴리머라제 유전자의 발현에 관여하지 않는 것으로 예상된다.
놀랍게도, 본 발명의 재조합 Bst DNA 폴리머라제 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터(예: lac I 유전자 조절하의 lac 프로모터)를 이용하지 않고 이. 콜라이 숙주 세포내에서 구조적으로 발현될 수 있다. 반면, 숙주 세포로서 이. 콜라이를 이용한 기타 유기체로부터 유도된 DNA 폴리머라제 유전자 전길이를 발현시키려는 시도는 성공적이지 못했다. 예를 들어, 문헌[Uemori 등. J. Biochem. 113:401-410(1983)] 및 [Joyce 등, J. Biol. Chem. 257:1958-1964(1982)]에는 DNA 폴리머라제 유전자 전길이를 포함하는 클론들은 불안정하여, 이 DNA 폴리머라제 유전자는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 대폭 감소하거나 결여된 클레나우 형 단편으로서만 증식될 수 있다고 보고되어 있다. 이론에 국한되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 본 발명의 클론들이 tet 유전자에 의해, 또한 최적 온도 60인 점에 비해 37에서의 Bst DNA 폴리머라제의 저활성 농도에 의해 향상된 안정성을 가진다고 생각한다[Kaboev 등, J.Bacteriol. 145:21-26(1981)].
본 실험은 이. 콜라이 1200 숙주 세포주내에서 tetr클론들은 이. 콜라이 XL1-Blue MRF' 숙주 세포주 내에서의 비(非)-tetr의 상응하는 클론들보다 고농도 활성의 효소를 발현시킨다는 것을 입증한다. 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 이것은 tetr유전자가 선택성 마커로서 이용될 경우, 역전 빈도가 낮다는 점에 기인하는 것으로 생각한다.
(+) 복제 방향(클로닝된 폴리머라제 유전자와 동일한 복제 방향)에 tetr유전자를 포함하는 클론도 (-)복제 방향에 tetr유전자를 포함하는 클론보다 높은 활성 농도의 DNA 폴리머라제를 제공한다.
[실시예 9: pUC Bst 1T(+) 유래 Bst DNA 폴리머라제와 Bst DNA 폴리머라제 시판 제제와의 비교]
완전길이 Bst DNA 폴리머라제를 상기한 바와 같이 플라스미드 pUC Bst 1T (+)를 함유하는 E. Coli 1200 세포 컬쳐로부터 정제하고, 분취물을 서브틸리신으로 분해시켰다. 약 66,000 달톤의 생성된 큰 "클레나우(Klenow)-형" 단편은 DNA 폴리머라제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 도메인을 함유하였고, 상기한 바와 같이 정제하였다. 바이오 라드(Bio-rad Laboratories)사의 Bst DNA 폴리머라제 서브틸리신 단편의 시판 제제을 구입하고, 비교용으로 사용하였다. 후자 효소는 서브틸리신 절단 전에 B. stearothermophilus 균주로부터 직접 정제한 것이다. 이 균주는 본 발명의 조성물을 위한 출발 물질로서 사용된 것과는 다른 균주이다. 이 효소는 에(Ye) 및 홍(Hong)등, Scientia Sinica 30: 503-506(1987)에 보고되어 있고, DNA 서열화 반응에 사용되는 것으로 루(Lu) 등, BioTechniques 11: 465-466(1991), 맥클라리(McClary)등, DNA Sequence 1: 173-180(1991), 미드(Mead) 등, BioTechniques 11:76-87(1991)에 보고되어 있다.
이 두 효소의 분석은 핵산 증폭 반응에서 DNA 합성용 주형으로 HIV 게놈 영역으로서 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 사용하여 본 명세서의 참고 문헌인 라디어(Ryder) 등의 미국 특허 제08/097262호에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 방법은 DNA 및 RNA 합성 방법을 모두 이용하여 핵산 서열을 증폭시켰다. 핵산 증폭을 5개 카피(copy)의 단일사 HIV 주형 플레이트 및 동일 단위 수의 각 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 수행하였다. 비교 실험의 결과는 하기에 나타내었고, 상대적 광 단위(RLU)로 표현하였다.
결과는 본 발명의 재조합 효소의 완전길이 및 서브틸리신 단편이 HIV DNA의 증폭을 증진시킬 수 있는 것으로 나타났다.
[실시예 10: 정상 백혈구 세포로부터 세포 분해물의 존재하에 핵산 증폭]
다른 증폭 반응을 전혈 0.5 ㎖로부터 정제된 정상인 백혈구 세포 분해물의 존재 하에 수행하는 것을 제외하고는 상기와 같이 수행하였다. 이 실험에서는 상기 5 카피가 아닌 10 카피의 HIV 주형 DNA를 사용하였다. 결과는 하기 표에 나타내었다.
이 데이타는 본 발명의 재조합 효소의 전길이 Bst DNA 폴리머라제 및 서브 틸리신에 의해 유발된 큰 단편이 세포 분해물의 존재 하에 증폭 반응을 증진시키는 것으로 나타났다.
[실시예 11: 재조합 Bst DNA 폴리머라제 효소의 감도 분석]
다른 핵산 증폭 실험을 주형 분자수를 반응당 2.5 또는 0.5 카피로 낮추는 것을 제외하고는 실시예 9에서와 같이 수행하고, HIV의 폴(pol) 및 개그(gag) 영역 게놈을 프라이머 결합 및 증폭용 타겟 서열로 사용하였다. 생성된 앰플리콘 검출을 라이더의 문헝에서와 같이 수행하였다. pUC Bst 1T의 서브틸리신 큰 단편 대신, E. Coli 1200/pUC Bst 3T 로부터 얻은 유사한 크기의 Bst DNA 폴리머라제를 사용하였다. 이 단편은 pUC Bst 3T 효소 정제 동안 내인성 프로테아제 활성에 의해 자발적으로 생성된다.
이 데이타는 특히 낮은 주형 농도에서 본 발명의 바람직한 효소의 완전길이 및 클레나우 형태가 핵산 증폭 반응을 증진시키는 것으로 나타났다.
[실시예 12: 선택된 DNA 폴리머라제 효소의 N-말단 서열화]
상이한 절단 Bst DNA 폴리머라제 효소간의 효소 구조/기능 관련성을 잘 이해하기 위하여, Bst 1의 활성 서브틸리신 단편(클레나우 단편) 시표, E. Coli 발현 클론된 Bst 3 DNA 폴리머라제의 자연 발생 분해 산물, 및 클론되지 않은 Bst DNA 폴리머라제(바이오-라드사로부터 얻음) 제제로부터 얻은 생물학적 활성 서브 틸리신 단편을 상기와 같이 정제하고, N-말단 아미노산 서열화하였다. 아미노산 서열 결정 방버은 당업계에 공지되어 있고, 이 방법은 헤위크(Hewick)등, J. Biol. Chem. 256:7990-7997(1981)에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용한다. N-말단 아미노산 서열 결정 자동화 방법은 또한 당업계에 공지되어 있고, 여기서 사용된 아미노산 서열화는 내부에 HPLC(Applied Biosystem, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 갖춘 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystem)-470A 기체상 서열기를 사용하여 수행하였다.
상기 폴리펩티드를 아미노산 서열 결정화하고, 생성된 서열을 정렬하고 완전 길이 Bst DNA 폴리머라제의 대응하는 아미노산 285 영역과 비교하였다(pUC Bst 1 클론에 의해 코딩됨). 생성된 정렬은 제12도에 도시되어 있다. Bst 1, Bst 2 및 Bst 4의 아미노산 서열(실시예 13 참조)은 핵산 서열에 의해 예견된 것이다. Bst 2 및 Bst 4의 경우에는 전사 개시 코돈 ATG(메티오닌을 코딩)가 코딩 영역의 첫번째 코돈이었다. 따라서 이 효소는 상기된 잔기 앞 N-말단에서 Met 잔기를 가질 수 있다. 별법으로 이 잔기는 발현된 단백질에서 E. Coli에 의해 제거될 수 있다. 본 발명의 완전길이의 Bst DNA 폴리머라제의 서브틸리신 단편은 완전길이 DNA 폴리머라제의 아미노산 위치 289의 대응하는 트레오닌 잔기로 시작되는 폴리펩티드 단편이다. 이 펩티드는 DNA 폴리머라제 활성을 갖는다.
완전길이 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인에 대응하는 제한 단편이 Bst DNA 폴리머라제 유전자로부터 조작되어온, pUC Bst 2에 의해 코딩되는 Bst 2 단백질은 아스파르트산으로 시작한다. 이 아미노산은 완전길이 DNA 폴리머라제의 아미노산 290의 대응 위치에 자리잡고, Bst 1 서브틸리신 단편의 두번째 잔기이다. 이. 콜라이에서 발현된 이 효소는 DNA 폴리머라제 분석에서 활성이나, Bst 1 또는 그의 서브틸리신 단편 보다 낮은 활성이다.
pUC Bst 3을 함유하는 세포에 의해 발현된 단백질은 두가지 형태로 발견된다. 첫번째 형태에서 절단되지 않은 단백질은 완전길이 Bst 1 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인에서 결실을 지닌다. 그러나, 두 단백질 모두 동일한 N-말단을 지니고, Bst 1 단백질의 아미노산 285 잔기에 대한 대응 잔기가 두 단백질에서 유사하다. Bst 3 효소의 두번째 형태는 이. 콜라이 프로테아제에 의한 Bst 3 단백질의 절단 생성물로 나타난다. 이 단편은 첫번째 아미노산으로서 발린으로 시작된다. 이 잔기는 본 발명의 완전길이 Bst 폴리머라제 클론의 아미노산 287에 대응하는 잔기이다. 이 단백질 가수분해 단편의 세번째 잔기는 Bst 1 치환 단편의 아미노산 서열로 시작되는 트레오닌 잔기이다. 네번째 잔기는 Bst 2 단백질의 아미노산 서열로 시작되는 아스파르트산 잔기이다.
놀랍게도, 시판 Bst DNA 폴리머라제 제제로부터 얻은 서열 정보(클레나오 단편)는 이 서브틸리신 단편의 N-말단 잔기가 완전길이 Bst 1 단백질 서열의 아미노산 290에 대응하는 알라닌으로 시작된다는 것을 밝히고 있다. 개시된 바에 따라 Bst 2 단백질은 이 위치에서 아스파르트산 잔기로 시작된다. 이 영역에서 서열화된 본 발명의 모든 다른 효소는 이 위치에서 아스파르트산을 보였다. 더우기 이 단편의 N-말단 첫번째 21 아미노산의 서열은 이 영역에서 시판되고 클론되지 않는 Bst DNA 폴리머라제 제제와 본 발명의 효소간에 아미노산 7개 잔기(또는 33)가 상이한 것으로 나타났다. 제12도 참조.
추가로 본 발명의 단백질의 아미노산 서열과 공개된 Bca DNA 폴리머라제 서열과의 비교는 이 영역에서 상기 첨부된 공개된 Bca DNA 폴리머라제 서열과 본 발명의 Bst DNA 폴리머라제간에 25개 잔기 중 12개, 또는 약 50의 아미노산이 상이한것으로 나타났다(제12도 참조). 대체적으로 Bst DNA 폴리머라제 아미노산의 아미노산 876 중 105(약12)가 공개된 Bca DNA 폴리머라제 서열의 대응 위치에서 발견되지 않는다.
[실시예 13: Bst 3의 활성 단백질 분해 단편과 동일한 N-말단을 갖는 Bst DNA 폴리머라제(Bst 4)의 작제]
상기 실시예 12에서 기술한 바와 같이, 플라스미드 pUC Bst 2의 작제에 사용한 방법과 유사한 방법을 사용하여 발린 잔기로 시작하고 Bst 3의 자연발생적 분해 생성물의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하기 위하여 플라스미드 클론을 작제하였다. DNA 유전자 삽입물의 코딩 영역은 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 이 플라스미드를 사용하여 균주 1200을 형질전환시켰다. 이 형질전환체의 배양 분해물을 SDS-PAGE에 의해 전기영동시키고 제14도에 도시한 바와 같이 예상된 운동성의 단백질 밴드가 관찰되었다. 이 단백질을 Bst 4로 명명하였다. 클론에 예상되는 N-말단 아미노산을 제12도에 나타내었고, Bst 4의 추정되는 아미노산의 전체 서열을 SEQ ID NO: 27로서 나타내었다.
제13도는 Bst DNA 폴리머라제 유전자 삽입물, 및 그의 게놈 Bst 유전자 및 이의 3개의 도메인과의 관계를 나타내는 다이어그램이다.
[실시예 14: 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bst DNA 폴리머라제 점 돌연변이체의 작제]
각각 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인에 단일 아미노산 치환을 갖는 Bst DNA 폴리머라제를 암호화하는 2개의 상이한 플라스미드 클론을 추가로 작제하였다. 상기 도메인에서의 단일 치환은 폴리머라제의 활성 또는 효소 발현에 큰 영향을 주지 않을 것이기 때문에, 이러한 치환을 통하여 DNA 폴리머라제 활성은 갖지만 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 결핍된 돌연변이 효소를 작제할 수 있는 방법을 정립할 수 있을 것으로 생각되었다.
제1 방법은 야생형 Bst 1 효소(SEQ ID NO:20)의 73 위치에서 티로신을 페닐알라닌 잔기로 변경시키는 것이다. 티로신 잔기의 히드록실기가 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인의 활성 부위에서 또는 그 부근에서 더이상 반응성이 없게 되지만 효소의 전체 배위가 별 영향을 받지 않아야 하기 때문에, 공간 충전 페닐 고리가 티로신 및 페닐알라닌 모두에 공통적인 상기 치호나이 선택되었다. Phe73돌연변이체는 Bst 5로 명명된다.
Bst 6으로 명명되는 다른 도연변이체 효소는 Bst 1 아미노산 서열의 73 위치에서 티로신 잔기를 알라닌으로 치환하여 작제하였다. 이 치환은 극성기를 비극성기로 치환시킬 뿐만 아니라 입체적으로 큰 아미노산 측기를 훨씬 작은 측기로 치환시키기 때문에, 상기 치환은 폴리머라제의 배위를 Bst 5보다 매우 크게 변경시킬 것으로 예상된다.
다른 Bst 삽입물 및 Bst DNA 폴리머라제 유전자의 3개의 도메인에 관련하여 pUC Bst 5 및 pUC Bst 6 DNA 삽입물의 다이어그램을 제13도에 도시하였다.
[Bst 5의 작제]
플라스미드 pUC Bst 1을 Acc I 및 Xmn I 제한효소를 사용하여 부분적으로 분해시켜 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 플라스미드의 완전길이에서, Bst 1(SEQ ID NO: 21) 좌표 103의 Acc I 부위 내지 Bst 1 좌표 256의 Xmm I 부위의 153 bp 영역을 뺀 길이에 대응하는 Acc I/Xmn I DNA 밴드를 겔에서 절제하고 표준 방법을 사용하여 겔을 정제하였다.
SEQ ID NO: 28 및 29의 합성 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 4와 유사한 방법을 사용하여 합성하였다. 각각 15 피코몰의 올리고뉴클레오티드를 복제 반응물 중에서 혼합하고 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 2 mM MgCl2및 50 mM KCl의 용액 중에서 5분 동안 72에서 배양하였다. 이어서, 용액을 40로 서서히 냉각시켜 3' 말단에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켰다. 이어서, 용액에 0.2 mM dNTP 각각 및 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편 10 단위를 첨가하여 Bst DNA 폴리머라제의 아미노산 72에 대응하는 코돈에서의 목적하는 변화를 갖는 천연 Bst DNA 폴리머라제 뉴클레오티드 서열, 및 코딩 스트랜드의 5'-말단 부근의 Acc I 부위 및 코딩 스트랜드의 3'-말단 부근의 Xmn I 부위를 포함하는 평활 말단 이중쇄 DNA 단편을 생성시켰다. 또한, 진단에 유용한 새로운 제한 부위를 생성시키기 위하여 합성 올리고뉴클레오티드는 Bst 효소 내에 추가의 아미노산 치환을 발생시키지 않는 단일 변성 돌연변이를 뉴클레오티드 서열 내에 도입하였다. 반응 혼합물을 37에서 50분 동안 배양하였다. 복제 반응물을 모아서 페놀/클로로포름, 클로로포름 순으로 사용하여 추출하고, 최종적으로 이중쇄 올리고뉴클레오티드 단편을 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 생성되는 단편을 재용해시키고 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 30 단위 및 0.5 mM ATP를 사용하여 37에서 1시간 동안 인산화시켰다.
Sma I 10 단위를 사용하여 플라스미드 pGem-3Z 1.22 ㎍을 실온에서 65분 동안 분해시킨 후, 페놀/클로로포름 및 클로로포름 단독으로 추출하였다. 약 11 피코몰의 인산화된 합성 이중쇄 단편을 0.24 ㎍의 Sma I-분해 플라스미드 pGem-3Z와 혼합하고 핵산을 에탄올과 함께 침전시켰다. 펠렛을 재구성하여 T4 DNA 리가제 15 단위를 사용하여 실온에서 철야 결합시켰다. 생성되는 결합 혼합물을 사용하여 E. coli 균주 1200을 형질전환시키고 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 아가상에 놓았다. 37에서 철야 배양한 후, 엠피실린 저항 콜로니를 선택하여 앰피실린을 포함하는 LB 중에서 성장시키고 플라스미드를 정제한 후 제한 엔도뉴클레아제(Xmn I)로 분해하여 스크리닝하였다. 예상되는 합성 DNA 단편 삽입물을 갖는 클론을 확인하여 이 클론으로 플라스미드 제제를 만들고 이 플라스미드를 Acc I 및 Xmn I로 분해하였다. 이어서, 제한 분해물을 전기영동시키고 153 bp의 단편을 겔에서 분리하여 상기와 같이 미리 겔에서 분리시킨 pUC Bst I 단편과 결합시켰다.
결합 혼합물을 사용하여 XL1-Blue MRF 세포를 형질전환시키고, 형질전환체를 앰피실린을 포함하는 LB 아가 상에 놓았다. 앰피실린 저항 콜로니를 선택하여 앰피실린을 포함하는 LB 중에서 성장시키고 플라스미드를 정제한 후 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 스크리닝하였다. 예상되는 Bst 5 삽입물을 포함하는 플라스미드를 Aat Ⅱ로 분해하고 상기 실시예 7에서 기술한 바와같이 1435 bp의 테트라사이클린 저항성 유전자 단편과 결합시켰다. 결합 혼합물을 사용하여 E. coli 균주 1200을 형질전환시키고 형질전환체를 테트라사이클린을 포함하는 LB 아가 상에 놓았다. 테트라사이클린 저항 콜로니를 테트라사이클린을 포함하는 LB 중에서 성장시키고 플라스미드를 정제하여 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 스크리닝하였다. 양 방향에서 테트라사이클린 저항성 유전자를 포함하는 클론을 확인하여 pUC Bst 5 T〔+〕 및 pUC Bst 5 T〔-〕로 명명하였다. 이들 형질전환체에 의해 발현되는 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석 결과 단백질 밴드는 Bst DNA 폴리머라제로 예상되는 위치로 이동하였음을 알 수 있었다. 이들 형질전환체의 분해물은 DNA 폴리머라제 활성을 보였다. 또한, 이들 형질전환체의 플라스미드 DNA는 돌연변이 영역 내에 서열화되었고, Bst 폴리머라제 유전자 내에 예상되는 DNA 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 서열화 반응은 상기와 같았다.
[Bst 6의 작제]
Bst 6는 Bst 5와 동일하게 작제되나, 단 이 작제에 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드 쌍은 SEQ ID NO: 28 및 30이었다.
양 방향에서 테트라사이클린 저항성 유전자를 갖는 Bst 6의 테트라사이클린 저항성 클론은 pUC Bst 6 T〔+〕 및 pUC Bst 6 T〔-〕로 명명되었다. 또한, 이들은 SDS-PAGE 겔 상에서 Bst DNA 폴리머라제와 관련된 위치로 이동하는 단백질을 발현하고 이들 형질전환체의 배양액의 분해물은 DNA 폴리머라제 활성을 보였다. 플라스미드 DNA의 서열화를 통하여 Bst 6 유전자 내에 에상 뉴클레오티드 서열이 존재함을 알았다.
[Bst 5 및 Bst 6에 대한 DNA 폴리머라제 활성 분석]
4개의 Bst 5 및 Bst 6 클론 각각의 컬쳐를 테트라사이클린을 포함하는 LB 중에서 철야 성장시키고 실시예 8에서 기술한 바와 같이 DNA 폴리머라제 활성의 발현을 분석하였다. 분석 결과를 하기 표에 나타내었다.
SDS-PAGE에 의한 Bst 5 및 6의 분해물의분석에서는 약 97 KDa에서 거의 동일량의 밴드를 현저하게 보였고, 이 밴드는 이. 콜라이 1200/pUC Tet〔+〕의 분해물에는 존재하지 않았다.
[Bst 5 및 Bst 6 클론의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 분석]
Bst 5 및 Bst 6 효소는 상기한 바와 실질적으로 동일한 방법으로 정제한다. 정제된 Bst 1, Bst 5 및 Bst 6 효소, 및 Bst 1으로부터의 정제된 서브틸리신 DNA 폴리머라제 단편을 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 대해 검정한다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 것으로 공지된 VentDNA 폴리머라제(New England Biolabs로부터 입수)를 네가티브 대조군으로 사용한다. rTth DNA 폴리머라제(Perkin Elmer로부터 입수)는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 함유하는 것으로 공지되어 있으며; 이를 포지티브 대조군으로 사용한다.
상기 검정을 다음과 같이 수행한다. 플라스미드 pGem 3Z DNA를 Hind Ⅲ 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화한 다음, 알칼리성 포스파타제로 처리하여 5' 말단을 탈포스포릴화한다. 이후 DNA를 상기한 바와 같이, T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여32P로 5' 말단에서 표지시킨다. 상기 표지된 기질을 대략 0.015 pmol(130,000 cpm)을 각 반응에서 사용한다.
Bst 1, Bst 5, 및 Bst 6 효소의 각 검정을 위하여, 상이한 양의 각 효소를, 각각 dNTP 0.5 mM, 1.5 mM MgCl2, 90 mM KCl 및 10 mM 트리스-HCl(pH 8.3)을 함유하는 반응 혼합물로 기질 핵산에 가하고; 각 반응물의 전체 용적은 50 ㎕이다. 상기 반응 혼합물을 60에서 3 시간 동안 배양시킨 다음 빙상에서 냉각시킨다. 10 ㎎/㎖ BSA 10 ㎕를 담체로서 각 시험관에 가한 다음, 각 반응 시험관에 냉 50트리클로로아세트산 20 ㎕를 가한다. 상기 시험관을 빙상에서 20 분간 배양시킨 다음, 원심분리기에서 5 분간 원심분리시킨다. 상등액과 펠릿을 분리하고 각각을 방사성의 존재에 대해 섬광 계수기에서 계수한다. 상등액중에 방출된 전체 cpm를 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성의 척도로서 사용한다.
제조 업자의 지침에 따라서 다음과 같이 변화시킨 유사한 방법으로 Vent및 rTth 효소를 검정한다. Vent효소의 경우, 상기 효소를 각각 dNTP 0.5mM, 10 mM KCl, 10 mM(NH4)2SO4, 20 mM 트리스-HCl(pH 8.8), 2 mM MgSO4, 및 0.1(v/v) 트리톤X-100을 함유하는 반응 혼합물로 전체 용적을 50 ㎕로 하여 기질에 가한다. 반응 혼합물을 70에서 배양시킨다.
rTth 효소의 경우, 상기 효소를 Bst 효소의 경우와 동일한 반응 혼합물에, 0.6 mM MnCl2, 100 mM KCl, 0.75 mM EGTA, 0.05(v/v) Tween20, alc 5(v/v) 글리세롤을 추가로 가하여 전체 용적이 50 ㎕로 하여 가한다. 반응 혼합물을 70에서 배양시킨다.
제조업자의 효소 활성 단위가 젠-프로브의 효소 활성 단위와 동일하지 않기 때문에, Vent 및 rTth 반응물에 가할 효소의 농도는 DNA 폴리머라제 검정에서 활성으로 결정되는 효소의 양을 기준으로한다. 다음 표는 이중검정의 잇점인 데이타를 제시하는 것이다.
이들 데이타는 높은 효소 농도에서도, Bst 5 및 Bst 6 효소가 검출가능한 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 함유하지 않음을 나타낸다. 상기 데이타는 또한 Bst 1의 정제된 서브틸리신 폴리머라제 단편이 또한 검출가능한 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 함유하지 않음을 확인시켜준다.
[실시예 15: Bst 5 및 Bst 6의 핵산 증폭 지지능]
정제된 Bst 효소를 이들의 핵산 증폭 지지능에 대해 시험한다. 핵산 증폭은 비-재조합 Bst DNA 폴리머라제 서브틸리신 단편의 상업적 입수처가 다음 기관: Molecular Biological Resouces(위스콘신주 밀워키 소재)인 점을 제외하고는 실질적으로 실시예 9에 기술된 바와 같이 수행한다. 각 효소를 동수의 단위를 각 검정에 대해 사용한다.
[실시예 16: 서열화 반응에 있어서 정제된 Bst 1 서브틸리신 단편 및 Bst 5 및 Bst 6의 용도]
Bst 1, Bst 5 및 Bst 6 효소 및 Bst 1 클론으로부터 서브틸리신 단편을 상기한 바와 같이 정제하고 이들의 서열화 반응 지지능을 시험한다. 서열화 반응은 제조업자 프로토콜에 따라서 Bio-Rad(Hercules, CA)Bst 서열화제를 사용하여 수행하고 비-재조합(천연) 효소의 서브틸리신 단편인, Bio-Rad Bst DNA 폴리머라제를 사용하여 수행한 반응과 비교한다. 사용되는 프라이머 및 주형은 Promega Corp.로부터 입수한 T7 프로모터-프라이머 및 pGem 3Z 플라스미드이다.
Bst 1 및 천연 효소 서브틸리신 단편 둘다, 뿐만 아니라 Bst 5 및 6 효소 둘다 청정한 서열화 래더를 생산하는 반면, Bst 1 홀로효소를 사용하면 시그날이 전혀 생성되지 않는다. 완전길이 Bst 1 효소가 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖기 때문에, 새롭게 합성된 스트랜드의 분해 속도는 이들 스트랜드의 합성 속도와 평형이 되며, 서열화는 유효하지 못하다. 따라서, 상기 결과는 Bst 5 및 6의 단일 아미노산 치환으로 바람직하지 못한 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 Bst 5 및 Bst 6 효소가 이들 서열화 반응에서 Bst DNA 폴리머라제의 서브틸리신 단편과 필적할 정도로 제거되었음을 나타내며, 서브틸리신 분해 및 재정제의 필요성을 없애는 잇점이 추가된다.
상기 실시예는 본 발명의 여러가지 양태를 설명하며 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주 및 이의 등가물은 이후 특허청구의 범위에 의해서만 제한된다.
서 열 표
(1) 일반적 정보:
(ⅰ) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
미국 92121 캘리포니아주 샌 디에고
캠퍼스 포인트 드라이브 9880
전화: (213) 489-1600
팩스: (213) 955-0440
텔렉스: 67-3510
(ⅱ) 발명의 명칭: 바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 DNA 폴리머라제
(ⅲ) 서열 수: 34
(ⅴ) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 특허용 #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) SEQ ID NO: 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 1
(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 2
(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 42 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 3
(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 42 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 4
(2) SEQ ID NO: 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 5
(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 6
(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 7
(2) SEQ ID NO: 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 41 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 8
(2) SEQ ID NO: 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 35 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 9
(2) SEQ ID NO: 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 35 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 10
(2) SEQ ID NO: 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 11
(2) SEQ ID NO: 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 12
(2) SEQ ID NO: 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 45 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 13
(2) SEQ ID NO: 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 45 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 14
(2) SEQ ID NO: 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 15
(2) SEQ ID NO: 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 16
(2) SEQ ID NO: 17에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 94 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 17
(2) SEQ ID NO: 18에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 96 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 18
(2) SEQ ID NO: 19에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 2761 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 103..2730
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 19
(2) SEQ ID NO: 20에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 876 염기쌍
(B) 형태: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 20
(2) SEQ ID NO: 21에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 2631 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..2618
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 21
(2) SEQ ID NO: 22에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1764 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1761
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 22
(2) SEQ ID NO: 23에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 587 염기쌍
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 23
(2) SEQ ID NO: 24에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1767 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1764
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 24
(2) SEQ ID NO: 25에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 588 염기쌍
(B) 형태: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 25
(2) SEQ ID NO: 26에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1773 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1770
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 26
(2) SEQ ID NO: 27에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 590 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 27
(2) SEQ ID NO: 28에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 99 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 28
(2) SEQ ID NO: 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 97 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 29
(2) SEQ ID NO: 30에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 97 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 30
(2) SEQ ID NO: 31에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 2631 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..2631
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 31
(2) SEQ ID NO: 32에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 876 염기쌍
(B) 형태: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 32
(2) SEQ ID NO: 33에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 2631 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: DNA(게놈)
(ⅸ) 형상
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..2631
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 33
(2) SEQ ID NO: 34에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 876 염기쌍
(B) 형태: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ⅱ) 분자 타입: 단백질
(xi) 서열 설명: SEQ ID NO: 34

Claims (53)

  1. 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, DNA 중합 활성을 갖는 상기 단백질의 절단 형태를 암호화하는 상기 서열들중 어느 하나의 절단된(truncated) 서열, 또는 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearother mophilus)로부터 유래된 단백질과 실질적인 서열 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 상기 서열들중 어느 하나로부터 유래된 서열을 포함하는 정제된 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, 상기 서열들중 어느 하나의 절단된 서열, 또는 상기 서열들중 어느 하나로 부터 유래된 서열이 DNA 폴리머라제 영역, 상기 단백질의 3'-5' 엑소뉴클레아제 영역, 및 5'-3' 엑소뉴클레아제 영역을 암호화하는 상이한 도메인을 포함하는 정제된 재조합 DNA 분자.
  3. 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, 상기 서열들중 어느 하나의 절단된 서열, 또는 상기 서열들중 어느 하나로 부터 유래된 서열이 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  4. 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, 상기 서열들중 어느 하나의 절단된 서열, 또는 상기 서열들중 어느 하나로 부터 유래된 서열이 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  5. 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, 상기 서열들중 어느 하나의 절단된 서열, 또는 상기 서열들중 어느 하나로 부터 유래된 서열이 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 단백질을 암호화하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO: 22, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO: 22 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO: 26, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO: 26 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  8. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO: 24, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO: 24 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  9. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO: 31, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO: 31 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  10. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO: 33, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO: 33 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  11. (a) 이종 숙주 세포내에서 정제된 재조합 DNA 분자수를 증가시키기 위한 복제기점(origin of replication)을 갖는 DNA 단편, (b) 상기 숙주 세포에서 상기 재조합 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질의 발현에 유효한 프로모터 영역을 포함하는 DNA 단편, (c) 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, DNA 중합 활성을 갖는 상기 단백질의 절단 형태를 암호화하는 상기 서열들중 어느 하나의 절단된 서열, 또는 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 상기 단백질과 실질적인 서열 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 상기 서열들중 어느 하나로부터 유래된 서열을 포함하는 DNA 단편, 및 (d) 선별가능한 표지 유전자를 포함하는 DNA 단편를 포함하며, 상기 DNA 단편들은 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질이 상기 숙주 세포에서 발현되도록 연결되어 있는, 이종 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 정제된 재조합 DNA 분자.
  12. 제11항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 상기 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 또한 암호화하는 재조합 DNA 분자.
  13. 제11항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편이 개질된 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인을 암호화하도록 개질되어 상기 숙주세포에서 발현된 바실러스 스테아로써모필루스 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 것을 정제된 재조합 DNA 분자.
  14. 제11항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편을 1 이상의 뉴클레오티드 잔기를 결실하여 개질시킴으로서 상기 숙조세포에서 발현된 바실러스 스테아로써모필루스 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 것을 정제된 재조합 DNA 분자.
  15. 제14항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편이 SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 약 858 내지 약 867 뉴클레오티드가 결실되어 개질되고 나아가 상기 결실을 함유하는 DNA 단편의 5' 말단에 번역 개시 코돈이 첨가되어 개질되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 결실을 함유하는 상기 DNA 단편이 SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 858 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  17. 제15항에 있어서, 상기 결실을 함유하는 상기 DNA 단편이 SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 867 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  18. 제15항에 있어서, 상기 결실을 함유하는 상기 DNA 단편이 SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단으로부터 864 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  19. 제14항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편을 1개 이상의 코돈이 바뀌도록 개질시킨 것인 정제된 제조합 DNA 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 DNA 분자를 SEQ ID NO:20의 아미노 말단으로부터 아미노산 73에 있는 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 코돈을 대체하여 개질시키는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  21. 제19항에 있어서, 상기 DNA 분자를 SEQ ID NO:20의 아미노 말단으로부터 아미노산 73에 있는 티로신 잔기를 알라닌 잔기로 코돈을 대체하여 개질시키는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  22. 제11항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  23. 제13항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  24. 제14항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  25. 제15항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  26. 제16항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  27. 제17항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  28. 제18항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  29. 제19항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  30. 제20항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  31. 제21항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  32. 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 약 98,000 달톤의 겉보기 분자량으로 이동하고 a) SEQ ID NO: 20, b) SEQ ID NO: 32, c) SEQ ID NO: 34, d) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO: 20, e) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO: 32, f) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO: 34, g) SEQ ID NO: 20과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, h) SEQ ID NO: 32과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, i) SEQ ID NO: 34과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 이종 숙주 세포에서 발현되어 생산되는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 단백질.
  33. 제32항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것인 정제된 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, 또는 SEQ ID NO: 34와 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 정제된 단백질.
  35. a. 단백질을 주형 핵산, 핵산 프라이머, 뉴클레오티드 모노머, 및 DNA 폴리머라제 활성에 필요한 보조인자와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하고 b. 상기 반응 혼합물을 핵산 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오티드가 주형에 따라 순차적으로 첨가되기에 충분한 온도에서 배양시키는 것을 포함하는, 핵산 프라이머의 성장 말단에 있는 3' 히드록실기와 뉴클레오티드 트리포스페이트간에 결합이 형성되는 것을 촉매하기 위한 프라이머 신장 반응에 제40항의 정제된 단백질을 사용하는 방법.
  36. 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 약 60,000 달톤의 겉보기 분자량으로 이동하고 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열 중 1종앞에 오는 메티오닌 잔기, 및 상기 아미노산 서열 중 임의의 1종과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 이종 숙주 세포에서 발현되고 생산되는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것인 정제된 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 상기 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 것인 정제된 단백질.
  39. 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 생산하기 위한 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 DNA 서열의 대장균 숙주에서의 발현 및 상기 서열중 임의의 1종에 의하여 암호화된 단백질의 분해에 의하여 생산되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단백질 분해가 SEQ ID NO: 19에 의하여 암호화된 단백질의 생체외(in vitro) 소화(digestion)에 의한 것인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  41. 제40항에 있어서, 상기 단백질 분해가 단백질을 서브틸리신으로 소화시킨 것인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  42. 제39항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 것인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  43. a. DNA 폴리머라제를 암호화하는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열, 절단된 DNA 폴리머라제를 암호화하는 상기 서열들중 어느 하나의 절단된(truncated) 서열, 또는 상기 DNA 폴리머라제와 실질적인 서열 상동성을 갖는 개질된 DNA 폴리머라제를 암호화하는 상기 서열들 중 어느 하나로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터를 상기 폴리머라제를 발현시킬 수 있는 숙주 세포에 삽입시키고, b. 상기 DNA 폴리머라제, 절단된 DNA 폴리머라제 또는 개질된 DNA 폴리머라제가 발현되는 조건하에서 상기 벡터-함유 숙주 세포를 배양시킨 후, c. 상기 숙주 세포로부터 상기 DNA 폴리머라제, 절단된 DNA 폴리머라제 또는 개질된 DNA 폴리머라제를 추출하는 것을 포함하는, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제의 생산 방법.
  44. a. 이종 숙주 세포의 세포 추출물을 형성시키는 단계, b. 상기 추출액을 염 농도가 약 25 mM인 용액중에서 음이온 교환 매질과 접촉시키는 단계, c. 상기 음이온 교환 매질로부터 얻은 상기 DNA 폴리머라제를 약 0.1 내지 0.2 M NaCl 이상의 염 농도에 상응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계, d. 상기 DNA 폴리머라제를 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계, e. 상기 양이온 교환수지로부터 얻은 상기 DNA 폴리머라제를 약 0.25 내지 0.30 M NaCl의 염 농도에 상응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계, f. 상기 DNA 폴리머라제를 음이온 교환 수지에 결합시키는 단계, g. 상기 음이온 교환 수지로부터 얻은 상기 DNA 폴리머라제를 약 0.2 내지 0.4 M 이상의 NaCl 염 농도에 상응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계를 포함하는, 다수의 이종 숙주 세포에서 발현된 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 열안정성 DNA 폴리머라제의 정제 방법.
  45. 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소되어 있으며, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO: 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열중 어느 하나앞에 오는 메티오닌 잔기, 및 상기 아미노산 서열과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 개질된 열안정성 DNA 폴리머라제.
  46. 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 열안정성 DNA 폴리머라제의 적어도 일부분, 또는 일부분의 단편 또는 유도체를 암호화하는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 33의 뉴클레오티드 서열중 어느 하나로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 단편 또는 일부분이 a. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있고, b. 주형의 일부와 하이브리드화된 핵산 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오티드 트리포스페이트를 주형에 따라 혼입되는 것을 촉매할 수 있고, c. 상기 활성들의 조합을 갖는, 정제된 재조합 DNA 분자.
  47. 제20항에 있어서, 개질된 코돈을 함유하는 DNA 단편이 SEQ ID NO: 31의 핵산 서열을 포함하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  48. 제21항에 있어서, 개질된 코돈을 함유하는 DNA 단편이 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열을 포함하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  49. 제47항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙조 세포.
  50. 제48항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙조 세포.
  51. 제39항에 있어서, 상기 단백질 분해가 대장균에서 발현된 SEQ ID NO:24에 의해 암호화된 단백질의 분해인 것인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  52. 제51항에 있어서, 상기 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소된 것인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  53. SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열, SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열앞에 오는 메티오닌 잔기, 및 SEQ ID NO: 27과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
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