KR970702370A - 바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 DNA 폴리머라제(Purified DNA Polymerase from Bacillus Stearothermophilus) - Google Patents

바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 DNA 폴리머라제(Purified DNA Polymerase from Bacillus Stearothermophilus)

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Abstract

본 발명은 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 재조합 DNA 폴리머라제 효소의 조성물 및 발현 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 Bst DNA 폴리머라제 효소률 정제하는 방법, 생화학 반응을 수행하기에 적합한 형태의 정제된 효소를 함유하는 조성물, 및 정제된 효소를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 DNA 폴리머라제(Purified DNA Polymerase from Bacillus Stearothermophilus)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 본 발명에서 프라이머 및 프로브로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다,
제2도는 Bst 폴리머라제 유전자, Bst 앰플리콘을 발생시키는데 있어서 사용되는 프로브 및 PCR 프라이머에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 위치, 및 상기와 같이 발생된 앰플리콘의 Bst 유전자에 대한 위치를 나타내는 도이다,
제3도는 플라스미드 pGEM Bst 885의 도이다,
제5도는 여러가지 표지된 프로브를 사용한 서던 블롯 실험 결과의 개략도이다,
제8도는 플라스미드 pUC Bst 1의 작제용 개략도이다.

Claims (58)

  1. 열 안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써 모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된 단백질을 암호화하거나, 상기 단백질의 활성 DNA-중합화 절단 형태를 암호화하거나 활성 단백질과 실질적인 서열 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 단백질의 DNA 폴리머라제 영역, 3′-5′ 엑소뉴클레아제 영역, 및 5′-3′ 엑소뉴클레아제 영역을 암호화하는 상이한 도메인을 포함하는 정제된 재조합 DNA 분자.
  3. 제2항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 단백질이 3′-5′ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  4. 제2항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 단백질이 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  5. 제2항에 있어서, 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 단백질이 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성을 암호화하는 도메인을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열을 상기 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 감소되거나 제거되도록 변형시킨 정제된 재조합 DNA 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:21의 인접한 뉴클레오티드를 50개 이상 포함하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:21의 인접한 뉴클레오티드를 150개 이상 포함하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:21의 인접한 뉴클레오티드를 200개 이상 포함하는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:33으로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  10. 제2항에 있어서, 상기 DNA 분자가 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:33으로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  11. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO:22, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO:22로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  12. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ lD NO:26, 및 b. ATG. 이어서 SEQ ID NO:26으로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  13. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO:24, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO:24로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  14. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO:31, 및 b. ATG, 이어서 SEQ ID NO:31로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  15. 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자가 a. SEQ ID NO:33, 및 b. ATG, 이어서 SEQ lD NO:33로 이루어진 아그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  16. (a) 숙주 세포내에 DNA 분자를 증가시키기 위해 복제원을 갖는 DNA 단편, (b) 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질의 발현용으로 유효한 프로모터 영역을 포함하는 DNA 단편, (c) 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 단백질을 암호화하거나, 상기 단백질의 활성 DNA-중합화 절단 형태를 암호화하거나 활성 단백질에 대해 실질적인 서열 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 단편, 및 (d) 선택성 마커 유전자를 포함하는 DNA 단편을 포함하며, 상기 DNA 단편들은 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질이 숙주 세포에서 발현되도록 연결되어 있는, 이종 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 정제된 재조합 DNA 분자.
  17. 제16항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 상기 단백질의 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성을 추가로 암호화하는 재조합 DNA 분자.
  18. 제16항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 또한 상기 단백질의 아미노산 서열내에 5′-3′ 엑소뉴클레아제 도메인을 암호화하며, 상기 DNA 단편은 변형시키지 않은 동일한 DNA 단편에 의해 발현된 제2단백질과 비교하여 그로부터 발현된 단백질에서 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 감소되거나 소실되도록 변형시킨 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  19. 제17항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 DNA 단편이 또한 상기 단백질의 아미노산 서열내에 5′-3′ 엑소뉴클레아제 도메인을 암호화하며, 상기 DNA 단편은 변형시키지 않은 동일한 DNA 단편에 의해 발현된 제2단백질과 비교하여 그로부터 발현된 단백질에서 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 감소되거나 소실되도록 변형시킨 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  20. 제16항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편이 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 완전길이 바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제를 암호화하는 다른 DNA 단편으로부터 1개 이상의 뉴클레오티드 잔기가 결실되어 생성되고, 여기서 상기 단백질의 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 상기 완전길이 바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라제와 비교하여 감소되거나 소실된 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  21. 제20항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편이 상기 다른 코딩 DNA 단편의 5′ 말단으로부터 약 858 내지 약 867 뉴클레오티드를 결실시키고 생성된 DNA 단편의 5′ 말단에 번역 개시 코돈을 첨가함으로써 생성되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  22. 제21항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 상기 DNA 단편이 상기 다른 코딩 DNA 단편의 5′ 말단으로부터 858 뉴클레오티드를 결실시키고 생성된 DNA 단편의 5′ 말단에 번역 개시 코돈을 첨가함으로써 생성되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  23. 제21항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화는 상기 DNA 단편이 상기 다른 코딩 DNA 단편의 5′ 말단으로부터 867 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 생성되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  24. 제21항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화는 상기 DNA 단편이 상기 다른 코딩 DNA 단편의 5′ 말단으로부터 867 뉴클레오티드를 결실시키고 생성된 DNA 단편의 5′ 말단에 번역 개시 코돈을 첨가함으로씨 생성되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  25. 제18항에 있어서, 상기 비변형 DNA 단편의 코딩 영역내의 코돈을 1개 이상 변화시킨 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  26. 제25항에 있어서, 상기 DNA 분자의 발현시, 상기 변화로 SEQ ID NO:20의 아미노 말단으로부터 측정한 바, 아미노산 73에 대응하는 위치에서 티로신 잔기 대신 페닐알라닌 잔기로 대체되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  27. 제25항에 있어서, 상기 DNA 분자의 발현시, 상기 변화로 SEQ ID NO:20의 아미노 말단으로부터 측정한 바, 아미노산 73에 대응하는 위치에서 티로신 잔기 대신 알라닌 잔기로 대체되는 것인 정제된 재조합 DNA 분자.
  28. 제16항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  29. 제18항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  30. 제20항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  31. 제21항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  32. 제22항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  33. 제23항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  34. 제24항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  35. 제25항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  36. 제26항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  37. 제27항의 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포.
  38. 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 약 98,000달톤의 겉보기 분자량으로 이동하고 a) SEQ ID NO:20, b) SEQ ID NO:31, c) SEQ ID NO:33, d) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO:20, e) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO:31, f) 메티오닌, 이어서 SEQ ID NO:33, g) SEQ ID NO:20과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, h) SEQ ID NO:31과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, i) SEQ lD NO:33과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 이종 숙주 세포에서 발현되어 생산되는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 단백질.
  39. 제38항에 있어서, DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 정제된 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 거의 없거나 없는 단백질을 추가로 포함하는 정제된 단백질.
  41. a. 단백질을 주형 핵산, 핵산 프라이머, 뉴클레오티드 모노머, 및 DNA 폴리머라제 활성에 대해 필수적인 보조인자와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계; b. 상기 반응 혼합물을 핵산 프라이머의 3′ 말단에 뉴클레오티드의 서열 주형-지시된 첨가가 일어나도록 하기에 충분한 온도에서 인큐베이팅시키는 단계를 포함하는, 핵산 프라이머 및 뉴클레오티드 트리포스페이트의 성장 말단에서 3′ 히드록실기간에 결합이 형성되는 것을 촉매하기 위한 프라이머 확장 반응에 제40항의 정제된 단백질을 사용하는 방법.
  42. 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 약 60,000달톤의 겉보기 분자량으로 이동하고 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, 메티오닌 잔기, 그 다음의 상기 아미노산 서열 중 하나, 및 상기 아미노산 서열과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 이종 숙주 세포에서 발현되고 생산되는, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 단백질.
  43. 제42항에 있어서, DNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것인 정제된 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 5′-3′ 엑소뉴클라아제 활성이 거의 없거나 없는 단백질을 추가로 포함하는 것인 정제된 단백질.
  45. 효소가 Bst DNA 폴리머라제 효소를 암호화하는 유전자의 발현시 생산되는 단백질분해성 절단 생성물인, 이. 콜라이 숙주 세포에 의해 생산되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  46. 제42항의 단백질을 프로테아제로 분해시킴으로써 생산되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  47. 제46항에 있어서, 상기 프로테아제가 서브틸리신인 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  48. 제45항에 있어서, 상기 효소가 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것인 효소.
  49. 제46항에 있어서, 상기 효소가 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것인 효소.
  50. 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 거의 없거나 없는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제 효소.
  51. a. 열안정성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터를 상기 폴리머라제를 발현시킬 수 있는 숙주 세포에 삽입시키는 단계, b. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 발현되는 조건하에서 상기 벡터-함유 숙주 세포를 배양시키는 단계; c. 상기 숙주 세포 컬쳐로부터 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 추출하는 단계를 포함하는, 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제의 생산 방법.
  52. a. 이종 숙주 세포로부터 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래되는 열안정성 DNA 폴리머라제를 추출하고 세포 추출물을 형성시키는 단계, b. 상기 추출액을 염 농도가 약 25mM인 용액중에서 음이온 교환 매질과 접촉시키는 단계, c. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 상기 음이온 교환 매질로부터 약 0.1 내지 0.2M NaC1 이상의 염 농도에 대응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계, d. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계, e. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 약 0.25 내지 0.30M NaC1의 염 농도에 대응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계, f. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 음이온 교환 수지에 결합시키는 단계, g. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제를 약 0.2 내지 0.4M NaCl의 염 농도에 대응하는 이온 강도를 갖는 용액으로 용출시키는 단계를 포함하는, 다수의 이종 숙주 세포중에서 발현된 바실러스 스테아로써모필루스-유래된 열안정성 DNA 폴리머라제의 정제 방법.
  53. 아미노산 서열 SEQ ID NO:20에 함유된 인접하는 아미노산을 50개 이상 갖는 정제된 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것인 정제된 단백질.
  55. 아미노산 서열 SEQ ID NO:20에 함유된 인접하는 아미노산을 75개 이상 갖는 정제된 단백질.
  56. 제55항에 있어서, 상기 단백질이 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것인 정제된 단백질.
  57. 5′-3′ 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있거나 감소되어 있으며, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:33, 메티오닌 잔기, 그 다음의 상기 아미노산 서열중 하나, 및 상기 아미노산 서열과 실질적인 서열 상동성을 갖는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 변형된 열안정성 DNA 폴리머라제.
  58. 바실러스 스테아로써모필루스로부터 유래된 열안정성 DNA 폴리머라제의 적어도 일부분, 또는 일부분의 단편 또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 단편 또는 일부분이 a. 상기 열안정성 DNA 폴리머라제에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있고, b. 주형의 일부분에 대해 하이브리드화된 핵산 프라이머의 3′ 말단으로의 뉴클레오티드 트리포스페이트의 주형-지시된 혼입을 촉매할 수 있고, c. 상기 활성들이 함께 존재하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 정제된 재조합 DNA 분자.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
KR1019960705428A 1994-04-01 1995-03-30 바실러스 스테아로써모필루스로부터 정제된 dna 폴리머라제 KR100218919B1 (ko)

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