JPH05506364A - 熱安定性 ｄｎａポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異 関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、全て１９９０年９月２８日付で提出され、全て、米国特許第４．８８ ９，８１８号として発行され１９８６年８月２２日付の放棄された８９９，２４ １号の一部継続出＠（ＣＩＰ）である１９８７年６月１７付第０６３　、５０９ 号のＣＩＰである１９８８年１月１２日付の放棄された第１４３．４４１号のＣ ＩＰである１９９０年５月１５日付の第５２３，３９４号のＣＩＰである同時係 属出願第５９０，２１３号、５９０．４６６号及び５９０．４９０号の一部継続 出Ｉ＃ｃＴＰ）テアル。 本出願は同様に、１　）　１９８８年１月１２日付第１４３，４４１号及び上述 のとおりのその組型のＣＩＰである１９８９年１２月２２日付第４５５，６１１ 号のＣＩＰである１９９０年９月２０日付の第５８５．４７１号のＣＩＰである １９９０年１２月２１日付ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７６４１　；及び２　）　１９ ９０年７月２４日付第５５７．５１７号（７）ＣＩＰである１９９０年１１月２ 日付第６０９．１５７号のＣＩＰである１９９１年８月１５日付の第７４６．１ ２１号のＣＩＰでもある。 このＣＩＰは同様に、以下の特許出願にも関連する：１９９０年５月１５日付米 国特許第５２３．３９４号；１９８９年１２月２２日付米国特許第４５５．９６ ７号；１９９１年８月６日付ＰＣＴ出願第９１１０５５７１号；１９９１年８月 １３日付ＰＣＴ出願第９１１０５７５３号。 この項で参照指示されている特許出願明細書は全て、本書に参考として内含され る。 発明の背景 Ｍ丑 本発明は、未変性酵素が示すものとは異なるレベルの５′→３′エキソヌクレア ーゼ活性が示されるように変更又は突然変異された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ に関する０本発明は同様に、このような変更ポリメラーゼを単離及び生産するた めの手段にも関する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは数多くの組換えＤＮＡ技術 、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅、自立的（ｓｅｌｆ−ｓ ｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）及び高温ＤＮＡ配列決定において役立つ ものである。 意見１亙 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）などの中温菌からの［］ＮＡポリメラーゼの単離に関し ては広範な研究が行なわれてきた。例えばＢｅ５ｓ■ａｎｉ、１９５７年、幾分 か少ないものの、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　凹９工国■）、テ ルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｅ＋ｕｓ　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）　、 テルモタガ・マリチマ（ル肛鯰蝕■ｍａｒｉｔｉｍａ）　、テルムス（Ｔｈｅｒ ＋ｍｕｓ　）スペーシース５ｐｓｌＬ　テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　）スベーシ ースＺＯ５及びテＪレモシボ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒμｍ匡眩ａｆｒ４ｃａｎ ｕｓ）といった好熱住物からＤＮＡポリメラーゼを単離及び純化することについ ても研究が行なわれてきた。当初存在している量に比べて多い量に既存の核酸配 列を増幅するために熱安定性酵素を使用することは、米国特許第４．６８３，１ ９５号及び４，６８３，２０２号の中で記述されていた（引用により、これらを 本明細書に組み入れる）。標的ＤＮＡの変性、プライマのハイブリッド形成及び 相補鎖の合成が関与するＩ？ＣＲ方法では、プライマ、鋳型、ヌクレオシド三燐 酸、適当な緩衝液及び反応条件、並びにポリメラーゼが用いられる。各々のプラ イマの延長生成物は望ましい核酸配列の生産のための鋳型となる。２つの特許は 、使用するポリメラーゼが熱安定性酵素である場合、熱がポリメラーゼ活性を破 壊することは無いことから全ての変性段階の後にポリメラーゼを付加する必要が 無いということを開示している。 米国特許第４，８８９，８１８号、欧州特許公報第２５８□０１７号及びＰＣＴ 公開第８９１０６６９１は、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｏ＋ｕｓ　旦咀 山至）からの〜９４ｋＤａの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの単離及び組換え体発 現ならびにＰＣＨにおけるこのポリメラーゼの利用について記述している（これ らの記載を引用により本明細書に組み入れる）。Ｔ、アクアチフス（Ｔ、　Ｂ± ｘｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ及びその他の組換えＤＮＡ技法 において使用するのに特に好まれるものであるが、その他の熱安定性ポリメラー ゼに対する必要性も残っている。 又１少１１１ その他の熱安定性ポリメラーゼに対する必要性に取り組みながら、当該発明者は 、テルムス・アクアチフス（乃五μｍμ巳匹尺並）　（ｆｉ！Ａ）から分離され たもののようないくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが５′→３′エキソヌク レアーゼ又は構造依存性一本領エンドヌクレアーゼ（ＳＯ５ＳＥ）活性を示すこ とを発見した。以下でさらに詳細に説明するように、このような５′→３′のエ キソヌクレアーゼ活性は、生産される生成物の量を制限し、通常は指数的に蓄積 される生成物のプラトー現象に貢献する可能性があることから、ＲＣＲで使用す べき酵素の中では望ましくないものである。さらに、熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼ内の５′→３′ヌクレアーゼ活性の存在は、特にＧ＋Ｃが豊富な標的について １０ｋｂ以上の長いＰＣＲ生成物を効率良く生成する能力の欠陥に貢献する可能 性がある。ＤＮＡ配列決定の利用分野及びサイクル配列決定の利用分野において は、５′→３′のヌクレアーゼ活性の存在は、望まれるバンド強度の減少及び／ 又は擬似又はバンクグラウンドバンドの生成に貢献する可能性がある。最後に、 ５′→３′ヌクレアーゼ活性が無ければ、組合せ型ポリメラーゼ−リガーゼ連鎖 反応（ＰＬＣＩ？）検定におけるより高感度の対立遺伝子識別を容易にすること ができる。 しかしながら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける強化された又はより多くの 量の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、標的核酸配列の同時の増幅及び検出 のための均質検定システムにおいて用いられるような酵素においては望ましいも のであり得る。一般に、強化された５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、高 められたエキソヌクレアーゼ開裂速度又はニックトランスレーション合成の高め られた速度、或いは又フラグメントの開裂の前の比較的大きいヌクレオチドフラ グメントの置換によって定義づけされる。 従って、本発明は、変更された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼを提供することによって先行技術の必要性を満たすべく開 発された。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用目的に応じて、ポリメラーゼの５ ′→３′エキソヌクレアーゼ活性を、一定範囲の５′→３′エキソヌクレアーゼ 活性が発現されうるように変更することが可能である。この５′→３′エキソヌ クレアーゼ活性の範囲は、強化された活性から活性の全く欠如した状態にまで広 がっている。いくつかのＰＣＲ利用分野例えば均質検定においては強化された活 性が有利であるが、その他のほとんどのＰＣＲ利用分野において利用される熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼにおいては、できるかぎり少ない５′→３′エキソヌク レアーゼ活性が望まれる。 同様に部位特異的突然変異誘発ならびに欠失突然変異誘発が両方共、本発明の熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける望ましい変更された５′→３′エキソヌクレ アーゼ活性をもたらしうるということも見出された。エキソヌクレアーゼ活性を 変えるいくつかの突然変異がＤＮＡポリメラーゼのプロセシングの可能性を変え ることがわかっている。数多くの利用分野（例えば、大量の高度に複雑なゲノム ＤＮＡが存在する中での中サイズの標的の増幅）において、プロセシング可能性 の低下はＰＣＲの最適化を単純なものにし、高い酵素濃度での特異性の強化に寄 与する可能性がある。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を除去するいくつかの 突然変異は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのプロセシング可能性を減少させず強 化させる可能性があり、従ってこれらの突然変異体酵素がその他の利用分野（例 えば長いＰＣＲ生成物の生成）においては好ましい可能性もある。５′→３′エ キソヌクレアーゼ活性を除去するいくつかの突然変異は、同時に、野性型との関 係において、突然変異体の熱安定性ポリメラーゼの耐熱性を高め、従ってこれら の突然変異体酵素は、Ｇ＋Ｃが豊富な又はその他の形では変性が困難な標的の増 幅においてさらに有効である。 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼゲノムの特定の共通領域又はドメインが、酵素の５ ′→３′エキソヌクレアーゼに突然変異誘発が影響を及ぼすのに好ましい部位と して同定された。これらのドメインを単離し、そして天然の５′→３′エキソヌ クレアーゼ活性を全く又はほとんどもたない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの中に 挿入して、その活性を増強することができる。かくして、変更された５′→３′ エキソヌクレアーゼ活性を有するキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造する 方法も本発明に包含される。 見更旦圧稚笠脱凱 本発明は、５′→３′エキソヌクレアーゼの発現を変えるべく突然変異を受けた 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列及び発現ベクタを提供する 。本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下で定義づけする。 「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」という語は、互換性ある形で使用でき 、このような呼称は全て子孫を含んでいる。従って、「形質転換体」又は「形質 転換された細胞」という語は、トランスファ（転移）の回数に関わりなく、最初 に形質転換された細胞及びこの細胞から誘導された培養物を含んでいる。意図的 な又は偶然の突然変異のため、全ての子孫がＤＮＡ含有量について正確に同一と は限らない。当初形質転換された細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能性 をもつ突然変異体子孫が、この形質転換体の定義中に含まれる。 「制御配列」という語は、特定の宿主生物体の中で作動的（ｏｐｅｒａｂｌｅ） に連鎖されたコード配列の発現に必要なりＮＡ配列のことを意味する。 例えば、原核生物に通した制御配列には、プロモータが含まれ、任意のものとし てオペレータ配列、リポソーム結合部位及び可能性あるものとしてその他の配列 が含まれる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサ を使用することが知られている。 「発現系」という語は、作動的な連鎖の中に所望のコード配列及び制御配列を含 み、そのためこれらの配列によって形質転換された宿主がコードされたタンパク 質を生産することができるようになっているＤＮＡ配列のことを意味する。形質 転換を実行するためには、発現系はベクター上に含有されていてよい；しかしな がら、関連ＤＮＡが宿主染色体に組込まれていてよい。 「遺伝子」という語は、回収可能な生物活性ポリペプチド又は前駆物質の生産に 必要な制御配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列のことを意味する。ポリペプチ ドは、酵素活性が保持されるかぎり全長のコード配列により又はコード配列のい ずれか一部分によってコードされうる。 「作動的に連鎖された」（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）という語は、制御 配列がコード配列によってコードされたタンパク質の発現を駆動するために機能 することになるようなコード配列の位置づけのことである。従って、制御配列に 対し「作動的に連鎖された」コード配列というのは、コード配列が制御配列の指 令の下で発現されうるような配置のことである。 熱安定性ポリメラーゼを含む混合物に関連する場合の「混合物」という語は、望 ましい熱安定性ポリメラーゼを含むがその他のタンパク質も同様に含みうる材料 の収集物のことを意味する。望ましい熱安定性ポリメラーゼが組換え宿主細胞に 由来する場合、その他のタンパク質は通常宿主と関連するものである。宿主が細 菌宿主である場合、汚染タンパク質は当然のことながら細菌性タンパク質となる 。 ［非イオン重合体洗剤」という語は、本発明においては約３．５乃至約９．５好 ましくは４〜８．５のｐＨ範囲で熱安定性ポリメラーゼ酵素を安定化させる能力 によって特徴づけられる、イオン電荷を全くもたない界面活性剤のことを指して いる。 ここで使用する「オリゴヌクレオチド」という語は２つ以上好ましくは３つ以上 通常は１０以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成る分子 として定義づけされる。正確なサイズは数多くの要因によって左右されるが、こ れらの要因はそれ自体オリゴヌクレオチドの究極的機能又は用途によって左右さ れるものである。オリゴヌクレオチドは合成的にでも又クローニングによってで も誘導することができる。 ここで使用する「プライマ」という語は、プライマ延長が開始される条件下に置 かれたとき、合成開始点として作用することのできるオリゴヌクレオチドのこと を言う。オリゴヌクレオチド「プライマ」は、純化された制限消化物の中といっ たように天然にも発生しうるが、合成で生産することもできる。核酸鎖に相補的 なものであるプライマ延長生成物の合成は、４つの異なるヌクレオシド三燐酸及 び１つの熱安定性ポリメラーゼ酵素が適切な緩衝液内で適当な温度で存在する中 で開始される。「緩衝液」の中には、望ましいｐ■に調整された状態で補因子（ 例えば二価金属イオン）及び塩（適切なイオン強度を提供するため）が含まれる 。 プライマは、増幅における最大効率を得るため一本鎖であるが、代替的には２本 鎖であってもよい。２本鎖である場合、プライマは、延長生成物を調製する前に まずその鎖を分離する処理を受ける。プライマは通常オリゴデオキシリボ核酸で ある。プライマはポリメラーゼ酵素が存在する中で延長生成物の合成を起動させ るのに充分長いものでなくてはならない。プライマの正確な長さは、プライマ供 給源及び望まれる結果といった数多くの要因によって左右され、反応温度は、鋳 型に対するプライマの適切なアニーリングを確保するべ（プライマの長さ及びヌ クレオチド配列に応じて調整されなくてはならない。標的配列の複雑性に応じて 、オリゴヌクレオチドプライマは標準的に１５〜３５のヌクレオチドを含んでい る。短かいプライマ分子は一般に、鋳型と充分に安定した複合体を形成するのに 比較的低い温度を必要とする。 プライマは、鋳型の特定の配列の１つの饋に対し「実質的に」相補的となるよう に選択される。プライマは、プライマの伸長が起こるために鋳型鎖とハイブリッ ド形成するのに充分相補的でなくてはならない、プライマ配列が鋳型の正確な配 列を反映している必要ばない０例えば、非相補ヌクレオチドフラグメントをプラ イマの５′末端に付け、プライマ配列の残りの部分は実質的にその鎖に相補的で あることが可能である。プライマ配列が／”ｌイブリント形成しか（してプライ マの延長生成物の合成のための鋳型プライマ複合体を形成するのに充分な相補性 を鋳型の配列との間に有することを条件として、プライマの中に非相補的塩基又 は比較的長い配列を点在させることが可能である。 「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という語は、２本鎖ＤＮＡを特定 のヌクレオチド配列又はその近くにて切断する細菌性酵素のことを意味する。 ［熱安定性ポリメラーゼ酵素」という語は、熱に対して安定し、耐熱性を有し、 鋳型核酸鎖に対して相補的なプライマ延長生成物を形成するのに適切な要領でヌ クレオチドの結合に触媒として作用する（容易にする）酵素のことを意味する。 一般に、プライマ延長生成物の合成はプライマの３′末端で始まり、合成が終結 するまで鋳型鎖に沿って５′方向に進む。 本発明の理解をさらに容易にするため、本発明の広い概念を例示するため明細書 全体を通して特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が参考として示されている が、これらの参考は本発明を制限する意図をもつものではない。頻繁に言及され ている特定の酵素は、明細書で使用されることになる共通の略号及びそのそれぞ れのヌクレオチド及びアミノ酸配列の配列番号と共に、以下に記されている。 配列番号：　５　（ａ、ａ、） 配列番号：　８　（ａ、ａ、） 配列番号：　１０　（ａ、ａ、） 配列番号：　１２　（ａ、ａ、） 性又は低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性のし）ずれ力１を示しアーゼ 活性であり、もう１つは５′→３′エキソヌクレアーゼ活性である。２つのエキ ソヌクレアーゼ活性はｐｏｌ　１分子の異なる２つのドメインと関連づけられる 。しかしながら、ｐｏｌ　Ｉの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が自ら作用を及ぼす基 質に対しより厳しい構造的要件を有するという点で、この熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼのものと異なっている。 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性についての 適切かつ感度の高い検定は、活性の構造的要件の発見を利用している。この検定 の設計の重要な特徴は、標識された下流オリゴヌクレオチドプローブのエキソヌ クレアーゼ開裂のために適切な形でポリメラーゼを位１づける上流のオリゴヌク レオシドプライマである。重合−非依存性エキソヌクレアーゼ活性の検定（すな わちデオキシヌクレオシド三燐酸が無い状態で行なわれる検定）については、プ ローブは、鋳型に対し相補的なプローブの領域がプライマの３′末端に直ぐ隣接 するような形で位置づけされなくてはならない。さらに、プローブは、鋳型に対 して相補的でない少なくとも１つ、好ましくは２〜１０の又最も好ましくは３〜 ５のヌクレオチドをプローブの５′末端に含んでいるべきである。鋳型に対して アニーリングされた時プライマとプローブの組合せは、ニックの３′−ヒドロキ シル５′及びニックの置換された一本鎖３′を伴うニックを含む２本鎖構造を作 り出す。あるいは、検定は、重合依存性反応として行なうことができ、この場合 、各々のデオキシヌクレオシド三燐酸が１μＭ〜２ｍＭ好ましくは１０μＭ〜２ ００　μＭの濃度で含まれるべきであるが、ただし、鋳型配列によって命じられ る通りに、制限されたｄＮＴＰの添加（従って、制限されたｄＮＴＰの含有）が 関与する可能性もある。　ｄＮＴＰが存在する中で検定が行なわれる場合、必要 な構造的条件は、ポリメラーゼによる鋳型の相補的鎖の合成を誘導するための上 流のオリゴヌクレオチドプライマ、及び上流プライマを延長する過程においてポ リメラーゼによる接触を受番することになる標識づけされた下流のオリゴヌクレ オチドプローブ゛である。重合−非依存的熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ５′→３ ′エキソヌクレアーゼ検定の一例が、以下に記されている。 合成３′リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（ポリメラーゼ延長を排除するた めにリン酸化されたもの）ＢＷ３３　（ＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＣＡ ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣｐ）　（配列番号：　１３）　（１００ｐｗｏ ｌ）を、力゛ンマー（３！　ｐ　）ＡＴｐ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼにより５′末端において１ｔｐ−標識した。反応混合 物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール った。５ｔＰ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを１００μ２のＴＥ緩衝液 内に再溶解させ、取り込まれなかったＡＴＰをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピ ンカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィによって除去した。 ３２Ｐ標識されたＢ−３３プロ一ブ５ｐｍｏｌを、１ｈＨのトリス−ＨＣＩ　（ ｐＨ　８．３）、５０ｎＭのＫＣＩ及び３１１ＭのＭｇｃｈを含む１００μｌの 反応混合物中で５ｐｓｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマＢＷ３７　（ＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡ）　（配列番号： １４）の存在下で５ｐ請Ｏｌの一本鎖Ｍ１３ｍｐｌＯｗ　ＤＮＡにアニーリング した。アニーリング混合物を５分間９５°Ｃまで加熱し、１０分間７０°Ｃで冷 却し、さらに１０分間７０゛Ｃで保温し、次に３０分間Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｏ＋ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーマルサイクラ−の中で２５°Ｃまで冷却した。１ ０μ２のアニーリング混合物を含むエキソヌクレアーゼ反応混合物を１分間７０ ℃で予備保温した。予備保温反応物に２．５μｍの体積で熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼ酵素（ＤＮＡポリメラーゼ活性約０．０１〜１単位、又はｏ．ｏｏｓ〜０ ．０５ｐｍｏｌの酵素）を加え、反応混合物を７０°Ｃで保温した。１分及び５ 分後にアリコート（５μ！！．）を取り出し、Ｉｕ７！の６０ｔｓＭＥＤＴＡを 添加して停止させた０反応生成物をホモクロマトグラフィで分析し、オートラジ オグラフィに従ってエキソヌクレアーゼ活性を数量化した。　Ｐｏｌｙｇｒａ＋ ｗ　ＣＥＬ３００ＤＥＡＥセルロース薄層クロマトグラフィ板上で７Ｍの尿素中 ２％の部分的に加水分解された酵母ＲＮＡを含むホモクロマトグラフィ混合物中 で、クロマトグラフィを行なった。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が存在す る結果、３！Ｐ標識されたオリゴマーが生成されることになり、このオリゴマー はＴＬＣ板を上へ移動し、オートラジオグラム上で、原点にとどまっている未分 解プローブから容易に区別される。 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、二本ｔｌ 　Ｄ　Ｎ　Ａの５′末端領域を切除し、逐次的に５′−モノ−及びオリゴヌクレ オチドを解放する。エキソヌクレアーゼのための好ましい基質は、除去された（ ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）−重鎖ＤＮＡであり、ここで、除去された（ｄｉｓｐｌａ ｃｅｄ）−重鎖ＤＮＡと二重らせんＤＮＡの間ではホスフォジエステル結合の加 水分解が発生している。好ましいエキソヌクレアーゼ開裂部位は、２重らせん領 域内のホスフォジエステル結合である。従ってエキソヌクレアーゼ活性は、構造 依存型−末鎖エンドヌクレアーゼ（ＳＯ５ＳＥ）としてより良く描写することが できる。 ｈＬｂ晩、ハ■１７．　ＴＺＯ５，月１及びり工を含め数多くの熱安定性ポリメ ラーゼがこの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を示す。５′→３′エキソヌク レアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼがＰｃｔ？法において利用される場 合、生産される生成物の量の制限、長いＰＣＲ生成物を生成するか又は有意な二 次構造を含む頭載を増幅する能力の障害、シャドウバンドの生成又はＤＮＡ配列 決定中の望ましい終結バンドの信号強度の低下、２末鎖プライマー鋳型複合体の 情況内でのオリゴヌクレオチドプライマの５′末端の分解、オリゴヌクレオチド 誘導突然変異誘発中のニックトランスレーション合成、及び１？ｌＩＡ　：　Ｄ ＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分の分解、を含むさまざまな望ましくない結果が観 察されている。 生成されたＰＣＲ生成物の量の制限は、そうでなければ指数的な生成物の蓄積に おけるプラトー現象のせいである。このようなプラトー現象は、一部には、５′ →３′エキソヌクレアーゼ活性を伴うポリメラーゼがＰＣＲ基質上買上ォーク状 構造と遭遇したとき５′→３′エキソヌクレアーゼ活性がホスフォジエステル結 合の開裂又は加水分解をひき起こすために起こるものである。 このようなフォーク状構造は一般に成る種のＧ及びＣが豊富なりＮＡ鋳型の中に 存在する。これらの状況下でのこれらのホスフォジエステル結合の開裂は、ＰＣ Ｒ法によるある種のＧ−及びＣが豊富な標的の増幅を排除することから、望まし くないものである。さらにホスフォジエステル結合の開裂は同様に、生成物の鎖 濃度及び再生動態がフォーク状構造基質を生じさせる場合にＰＣＩ？の後期サイ クルの生成におけるプラトー現象にも寄与する。 ＤＮＡ配列決定の状況下で、ＤＮＡ延長反応中のホスフォジエステル結合の開裂 が「偽停止」をひき起こすことから、ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌ クレアーゼ活性はここでもフォーク状構造の鋳型で障害となる。一方これらの「 偽体止」はシャドウバンドに寄与し、極端な場合には、正確且つ解釈が可能な配 列データが不在をもたらしうる。 ２末鎖プライマー鋳型複合体と共にＰＣＲ法で利用された場合、ＤＮＡポリメラ ーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、オリゴヌクレオチドプライマの５ ′−末端の分解をもたらしうる。この活性は、ＰＣＲにおいて望ましくないもの であるばかりでなく第２鎖ｃＤＮＡ合成及び配列決定法においても望ましくない 。 最適な効率のオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発法の間、使用されるＤＮＡポ リメラーゼは、鎖除去（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）合成及び／ 又は二ックトランスレーシゴン能力を有していてはならない。 従って、オリゴヌクレオチド誘導型突然変異誘発に用いられるポリメラーゼにお ける５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性の存在も又同様に望ましくないことで ある。 最後に、ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は一般に同様に固有 のＲＮａｓｅ　Ｈ活性も含んでいる。しかしながら、ＲＮＡ　：ＤＮ＾ハイプリ ントを含むＰＣＲ法におけるようにポリメラーゼが逆転写酵素としても使用され なくてはならない場合、このような固有のＲＮａｓｅ　Ｈ活性は不利なものであ りうる。 従って、本発明の一態様には、大幅に減少もしくは低下された又は完全に除去さ れた５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ変異 体の生成が含まれる。このような変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ 、第２鎖ｃＤＮＡ合成、配列決定及びオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発とい った方法において使用するのにより適切かつ望ましいものとなるだろう。 ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が低下又は除去された熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼ変異体の生産は、部位特異的突然変異誘発及び欠失突然変異誘発といった 方法によって達成できる。 例えば、ＴＨＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の残基４６におけるＧｌｙの コドンの第２の位置でのＧからＡの部位特異的変異（すなわちＤＮＡ配列におけ るＧ　（１３７）から（Ａ）の変異）は、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の 約１０００分の１の減少をもたらし、ポリメラーゼ活性、プロセシング可能性又 は延長速度には見かけの変化が全く無いということがわかった。　Ｔ！Ｌ！１Ｄ ＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列のこの部位特異的変異はＧｌｙ　（４６） からＡｓｐへのアミノ酸変化をもたらす。 Ｄ瓜［ＩＮＡポリメラーゼのグリシン４６はテルムス（Ｔｈｅｒｒｍｕｓ　）ス ペーシス５ｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ内で保存されているが、残基４３に位置 しており、同じＧｌｙからＡｓｐへの変異はハＬＨＤＮＡポリメラーゼの５′→ ３′エキソヌクレアーゼ活性に対し同様の効果をもつ。７ｔｈ（ＧＩｙ４６）、 …競（１１；Ｉｙ４６）、シ阻（１；Ｉｙ３７）及びＬ江（Ｇ］ｙ３７）　ＤＮ Ａポリメラーゼの保存されたＧｌｙのＡｓｐへのこのような変異は、これらのポ リメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に対しても類僚の低下効果をも つ。 ｍ幻、７　Ｇ１ｙ４３．　Ｔ頃Ｇ１ｙ４６．　ＴｉＺ臣Ｇ１３１４６．垣Ｇ１ｙ ３７及び−江Ｇ１ｙ３７は、同様に、保存されたＡ　（Ｖ／Ｔ）　ＹＧ　（配列 番号：１５）配列ドメイン内にも見い出され、いずれのポリメラーゼのこの保存 された配列ドメイン内でのグリシンのアスパラギン酸への変化も５′→３′エキ ソヌクレアーゼ活性を低下されることが予想される。具体的に言うと、Ｌ正ゴユ Ｇｌｙ４３．　Ｔ即Ｇ１ｙ４６．豆亜Ｇ１ｙ４６．及びＬ迂Ｇ１ｙ３７はＡＶＹ Ｇ配列ドメインを共有し、Ｔｗａ　Ｇ１ｙ３７はＡＴＹＧドメイン内に見出され る。保存されたＡ　（Ｖ／Ｔ）　ＹＧ　（配列番号：１５）ドメインを含むその 他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおけるグリシンからアスパラギン酸への変異 は、Ｌ狙ポリメラーゼの部位特異的変異誘発のために用いられるものと同じ原理 及び技術を利用して達成されうる。このような部位特異的変異誘発技術の例とし ては、１９９０年５月１５日付出願の米国出願第５２３．３９４号の例５．１９ ９１年９月２７日付出願の弁理士事件整理番号第２５８３．１号の例４．１９８ ９年１２月２２日付出願の米国出願第４５５．９６７号の例４及び５、ならびに １９９１年８月１３日付のｐｃ丁出願第９１１０５７５３号の例５及び８がある 。 このような部位特異的変異誘発は一般に、部位特異的プライマ誘導変異誘発によ って達成される。この技術は現在当該技術分野において標準的なものであり、望 まれる突然変異を表わす制限された誤対合を除いて突然変異誘発されるべき一本 鎖ファージＤＮＡに対し相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマを用いて行な われる。簡単に言うと、プラスミド又はファージに対し相補的な鎖の合成を誘導 するためのプライマとして、合成オリゴヌクレオチドが用いられ、得られる２重 鎖ＤＮＡは、ファージ支持宿主細菌に形質転換される。 形質転換された細菌の培養は、ファージを宿す単細胞からのプラーク形成を可能 にする上部寒天培地内で平板培養されるか或いは又、プラスミドベクターのため の薬物選択的培地上で平板培養される。 理論的には、新しいプラークの５０％が一重鎖止して変異された形態を存するフ ァージを含み、５０％はもとの配列を有する。プラークはニトロセルロースフィ ルターに移送され、「リフト」は、正確な対合のハイブリッド形成を可能にする かもとの鎖との誤対合がハイブリッド形成を妨げるのに充分であるような温度で 、キナーゼ付加された合成プライマとハイブリッド形成させられる。次に、プロ ーブとハイブリッド形成するプラークが採取され、培養され、そしてＤＮＡが回 収される。 以下に記述する構成においては、プラスミド構成のための正しい連結は、連結混 合物で大腸菌（影４連Ｉｔ）　ＤＧ９Ｂ、　ＤＧＩＯＩ、　ＤＧ１１６、又はそ の他の適切な宿主をまず形質転換することによって確認される。 成功した形質転換体は、当該技術分野において理解されているように、プラスミ ド構成の様式に応じて、アンピシリン、テトラサイクリンその他の抗生物質耐性 によって、或いは又その他の標識を用いて選択される。次に形質転換体からのプ ラスミドを、Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ他、ｋ匹ユｈμ工±１粒Ｊ吐ユ照紅（１ ９６９年＞　６２　：　１１５９の方法に従って、又任意にはクロラムフェニコ ール増幅（ＣＩｅｗｅｌＬ　Ｄ、Ｂ−＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．　（１９７２ 年）　１１０　：　６６７）に従って調製する。次に、分離されたＤＮＡは制限 酵素により分析され、そして／又は、Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ、他のＮｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　（１９８１年）　９　：　３０９又はＭａｘａｍその他 の伽暉優り力＋　Ｅｎ、限駐包■（酵素化学方法（１９８１年）　６５　ｉ　４ ９９によってさらに記述されているように、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、他、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ）　（１９７７年＞　７４　：　５４６３（７） ジデオキシ（チェーンターミネータ）法によって配列決定される。 クローニング及び配列決定のため及びほとんどの里又はＰＬプロモータの制御下 での構成の発現のためには、大Ｘ！菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＧ９８．　ＤＧ９Ｂ 、　Ｄｌｌ；１０１．　ＤＧ１１６を宿主として用いた。ＰＬＮｍｓｓプロモー タの制御下での発現のためには、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　ＭＣ１０ ０Ｏラムダ溶原株、ＮＪｓｉｃ１８５７　Ｓｕｓ　ＰＩＯ＋　ＡＴＣＣ３９５３ １を使用することができる。ここで、変更された５′→３′エキソヌクレアーゼ 活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発現のために用いられる宿主の例とし ては、１９８７年４月７日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ５３６０６）Ｅ、 Ｃｏ１１ＤＧ１１６及び１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣ Ｃ５３０７５）　Ｅ、Ｃｏ１１ＫＢ２がある。 Ｍ１３ファージ組換え体としては、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ１２菌株ＤＧ９ ８といったようなファージ感染を受ける可能性のある大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ） 菌株が使用される。ＤＧ９８菌株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託さ れ、３９７６Ｂという受入れ番号をもつ。 哺乳動物の発現は、ＣＯ３−７，ＣＯ３−Ａ２．　ＣＶ−１及びマウス細胞内で 達成され、昆虫細胞ベースの発現はスポドブテラ・フルギベイダ（弁列」ぶｎ」 ■１匡蛙鎚）内で達成されうる。 本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一般に、プラスミドＰＬＳＧ３３の特徴 を含む大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＧ１１６から純化される。−次的特徴は、 温度調節されるプロモータ（λＰＬプロモータ）、温度調節されるプラスミドベ クター、正のレトロレギュレーション（ｒｅｔｒｏ−１ｅｇｕｌａｔｏｒｙ）要 素（ＰＲＥ）　（１９８７年５月１９日付発行の米国特許第４．６６６．８４８ 号参照）及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の変更形態である。米国特許出 願第４５５．９６７号明細書の４６ページに記載されているように、ｐＬｓＧ３ ３は、ｐＬＳＧ２４のＮｄｅｌ−Ｂｉυ旧制限フラグメントを発現ベクタｐＤＧ １７８に連結することによって調製された。得られたプラスミドはアンピシリン 耐性をもち、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレア ーゼ欠損形態を発現することのできるものである。１０リツトルの発酵用の種母 フラスコは、トリプトン（２０ｇ／ｊ２）、イーストエキス（Ｌｏｇ／ｊり　、 　ＮａＣ１（１０ｇｚｌ）及びｏ、ｏｏｓ％のアンピシリンを含んでいる。種母 フラスコは、寒天培地板からのコロニーから接種されるか或いは又、凍結したグ リセロール保存培養物を用いることも可能である。種母は０．５〜１．００．０ ゜（Ａ６１１０）まで増殖させられる。発酵内へ接種される種母培養物の量は、 細面の最終濃度がリットルあたりｌａｇの乾燥重量となるように計算される。１ ０リツトルの増殖培地には、２５ｄのＫＨｚＰ０４．１０ｍＭの（ＮＬ）Ｚ　ｓ ｏ４．４１１Ｍのくえん酸ナトリウム、０．４ｍＭのＦｅＣ１ｚ　、０．０４ｍ ＭのＺｎＣ１ｚ　％　０．０３ｍＭのＣｏＣＩｚ　、０．０３ｍＭのＣｕＣ１ｇ 及び０．０３ｍＭのＨＪＯｉが含まれている。以下の無菌成分が付加される：４ ｍＭのＭｇＳＯ４，２０ｇ／Ｉ！、のグルコース、２０Ｂ／ｊ！のチアミン−Ｆ ＩＣＩ及び５０蒙ｇ／εのアンピシリン。ｐＨはＮａＯＨで６．８に調整され、 １ｉＦＩ４０Ｆｌの添加によって発酵中に制御された。グルコースは発酵中、Ｎ １（４０）１の添加と連係して連続的に添加される。発泡は、消泡剤として必要 なだけポリプロピレングリコールを添加することによって制御される。溶存酸素 濃度は４０％に維持される。 発酵物は上述のように接種され、培を物は２１（Ａ＆１ｌＯ）の光学濃度に達す るまで３０℃で増殖させられる。次に、望まれるポリメラーゼの合成を誘発する ため温度を３７°Ｃまで上昇させる。誘導後８時間増殖を続行し、次に細胞は向 流ろ過とそれに続く遠心分離を用いての濃縮によって収穫される。得られた細胞 ペーストは一７０°Ｃで凍結され、約５００グラムの細胞ペーストが得られる。 相反する指示の無いかぎり、全ての精製段階は、４　’Ｃで行なわれる。 上述のようなプラスミドｐＬＳＧ３３を宿す凍結（−７０°Ｃ）大腸菌（Ｌ　ｃ ｏｌｉＢ１２菌株ＤＧ１１６又はその他の適切な宿主の一部分を一晩−２０’Ｃ にまで暖める。細胞ベレットに対し、次の試薬を付加する：１体積の２　ｘＴＥ 　（１０抛門のトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，２０ｍＭのＥＤＴＡ）　、１ｍ ｇ／ｍｌのロイペプチン及び１４４ｄのＰＭＳＦ　（ジメチルホルムアミド中） 、。 ロイペプチンの最終濃度は１ｄｇ／ａ＋１であり、ＰＭＳＦについては２．４１ であった。好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）をＴＥ内に含めて１　ｍ Ｍ　ＤＴＴの最終濃度を従供する。混合物は、混合機の中で低速で均質化される 。使用に先立ち全てのガラス製品は乾熱しておき、精製に用いる溶液はできれば 使用に先立って加圧滅菌しておく。細胞は１００００ｐｓｉでＭｉｃｒｏ　ｆｌ ｕｉ−ｄｉｚｅｒに２度通過させることによって溶菌させる。 溶菌液は、細胞湿潤重量の５．５×の最終体積に至るまで、１ｍＭのＤＴＴ　ヲ 含むＩＸＴＥで希釈する。ｌｕｇ／ｅｌまでロイペプチンを添加し、２．４ｍＭ までＰＭＳＦを添加する。最終体積（分画Ｉ）は約Ｌ５４０ａ＋１である。 −Ｓに硫酸アンモニウムを徐々に０．２Ｍ　（２６，４ｇ　／ｆ　）になるまで 添加し、そして溶菌液を攪拌する。硫酸アンモニウムを添加した時点で、以下に 記すポリエチレンイミン（ＰＥＩ）沈澱段階に先立って除去される沈降物が形成 される。硫酸アンモニウム沈降物は、２０分間ＪＡ−１４０−夕の中で１５００ ０〜２００００　Ｘ　ｇで懸濁液を遠心分離することによって除去される。上澄 みは、デカントされ保持される０次に硫酸アンモニウムの上澄みを、それが７５ °Ｃに達するまで加熱プレート上で攪拌し、次に７７°Ｃの浴内に置き、そこで １５分間場合によって攪拌を加えながら保持する。次に上澄みを水浴の中で２０ ’Ｃまで冷却し、Ｐε■検定のため１ｏ■ｌのアリコートを取り出す。 ０．３％のＰＥＩ（ＢＤＨからＰｏ１ｙｓｉｎ　Ｐとして市販されている）が〜 ９゜％の高分子Ｄ）ＪＡ及びＩ？ｌｉＡを沈澱させる、すなわちいがなる［ｌＮ ＡバンドもＰＥＩ処理後の臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上に見え ないということを確認するため、ＰＥＩ検定及びアガロースゲル電気泳動が用い られる。１０％の保存溶液から０．３％まで撹拌しながらゆっくりとＰＥＩを加 える。ＰＥＩ処理された上澄みを、ＪＡ−１４ロータ内テ２０分間、１００ＯＯ ＲＰＭ１００ＯＯＲＰ　ｇ　）　ニア遠心分離する。上澄みをデカントし、そし て保持する。この体Ｍ（分１ｉＩＵ）は約１３４０ｍ１である。 分画■を、０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含むＴＨの６〜１０力ラム体積での平 衡化の後の２．６Ｘ１３．３ｃｍ　（７１ｍｌ）のフェニルセファロースＣＬ− ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）カラム上に負荷する。このとき１０ｃｓ ／時の線形流速で分画■を負荷する。流速は０．９ｍｌ／分である。カラムは、 ３力ラム体積の平衡化緩衝液で洗浄し、次に２力ラム体積のＴＥで洗浄して汚染 する非ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を除去する。組換え型熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼは、２０％のエチレングリコールを含むＴＥ中２．５Ｍ尿素４力ラム体 積で溶出する。標準的な手順に従って、光学的吸収（Ａ２８゜）、　ＤＮＡポリ メラーゼ活性検定及び５Ｏ５−ＰＡＧＥによって、ＤＮＡポリメラーゼを含む分 画を識別する。ピーク分画をプールし、そして０゜２ミクロンの無菌真空ろ過装 置を通してろ過する。 体積（分画■）は約１９５ｍ１である。メーカーの推奨事項に従って、樹脂を平 衡化させそして再循環使用する。 １時間あたり１力ラム体積で、６〜１ｏ力ラム体積の０．０５ＭＫＣｌ、　５０ １のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０，１ｍＰのＥＤＴＡ及び０．２％のＴｗｅ ｅｎ２０により、２．６Ｘ１．７５ｃｍ　（９３ｍｌ）のヘパリンセファロース Ｃｌ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ−ＬＫＢ）を均衡化させる。好ましく は、緩衝液は１ｍＭのＤＴＴを含んでいる。カラムは、３力ラム体積の平衡化緩 衝液で洗浄する０本発明の望ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、同じ緩衝液 内で５０５０−７５ＯのＭＣＩ勾配の１０カラム体積の直線勾配で溶出させる。 無菌管内に分画（１０分の１力ラム体積）を収集し、望ましい熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼを含む分画をプールする（分画■１体積１７７ｍ１）　。 Ａ■１ｃｏｎ　ＹＭ３０膜上で１０−■まで分画■をｆｉ縮する。緩衝液交換の ため、２０ｍ１まで濃縮器を満たし毎回１０ｍ１まで体積をｉ！！縮することに よって、２．５×の貯蔵を緩衝液（５０ｍＭのトリス−）ＩＣＩ、　ｐ）１７． ５．２５０ｍＭのＭＣ１，０，２５ｓ＋ＨのＥＤＴＡ、　２．５ｍＦＩ　のＤＴ Ｔ及び０．５％の丁ｗｅｅｎ−２０）で５回、ダイアフィルトレージタン（ｄｉ ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行なう、濃縮器を空にし１０■ｌの２．５×の貯蔵 緩衝液で洗い流し、この緩衝液は濃縮物と合わさって分画Ｖを提供する。 残留ＤＮＡを除去するためには、陰イオン交換クロマトグラフィが用いられる。 生物学的安全用フードの中で手順を行ない、無菌技術が用いられる。１秒あたり 約５滴の速度で注射器を用いて３０＋＋１の２．５×貯蔵緩衝液で、０．２ミク ロンの無菌使い捨て注射器先端部フィルタユニットを伴うウォーターズ（Ｗａｔ ｅｒｓ）　５ｅｐ−ＰａｋプラスＱＭＡカートリッジを平衡化させる。使い捨て 注射器を用いて、１秒あたり約１滴の割合でカートリッジ内に分画Ｖを通過させ 、無菌管内に収集する。カートリッジを５翳１の２．５ｍｌ貯ａｍ衝液で流水洗 浄し、空気で押し乾燥する。８０％のグリセロールで溶離剤を１．５×に希釈し 、−２０°Ｃで貯蔵する。得られる最終分画■のプールは、変更された５′→３ ′エキソヌクレアーゼ活性を伴う活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる 。 ヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発に加えて、熱安定性ｆｌＮＡポリメラー ゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を低下させるため、欠失変異技術を使用 することも可能である。このような欠失変異の一例としては、熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼの保存されたＡ（Ｖ／Ｔ）ＹＧ（配列番号＝１５）ドメイン内のグリ シンまで（グリシンを含めて）の全てのアミン末端アミノ酸の欠失がある。 ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす第２の欠失変異は、Ｔｇ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ内のＡ］ａ７７までの欠失である。このアミノ＃　（Ａ］ａ７ ７）は、１狼ＤＮＡポリメラーゼの約８５．５ｋＤａのタンパク譬分解生成物の 中でアミノ末端アミノ酸として同定された。このタンパク質分解生成物は、いく つかの天然−副ＤＮＡポリメラーゼ調製物中で同定されており、タンパク質は安 定しているように見える。 このようなＡｌａ７７までの欠失はＧＩｙ４６を含んでいることから、これは− Ｂ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性にも影響を及ぼす 。 しかしながら、ＡＩａ７７で始まる欠失変異体は、ペプチドが安定状態にとどま ることをタンパク質分解の証拠が示唆しているという点で、フェニルアラニン４ ７で始まる欠失突然変異体に比べ付加的な利点をもつ。さらに、Ａ１ａ７７は、 担ＤＮＡポリメラーゼ内の配列ＹＫＡよりもアミノＭ５個前の配列ＨＥＡＹＧ（ 配列番号：１６）内に見出される。 ７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＴＺＯ５ＤＮＡポリメラーゼ及びｎ匹ＨＤＮＡポ リメラーゼ内には、類似の配列モチーフＨＥＡＹＥ　（配列番号：１７）が見ら れる。アラニンは、保存されたモチーフＹＫＡより５アミノ酸分前である。　Ｔ ｇ；（ＡＩａ７７に相応するその他の熱安定性ＤＩＩＡポリメラーゼ例の中のア ミノ酸は、Ｔｔｈ　Ａｌａ７８．　ＴＺＯ５Ａｌａ７８．　ハ匹■Ａ１ａ７４． ＴｅａＬｅｕ７２及びＴａｆ　ｌ１ｅ７３である。この配列を含むテルムス（Ｔ ｈｅｒｍｕｓ）の種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内のモチーフＢＲＡＹ　（Ｇ ／Ｅ）（配列番号：１６又は配列番号；１７）内のアラニン又は対応するアミノ 酸までの欠失は、その５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を低下させるであろう 。５′→３′エキソヌクレアーゼモチーフＹＫＡは同様にＴｍａ　ＤＮＡポリメ ラーゼ（アミノ酸７６−７８）及びＴａｆ　ＤＮＡポリメラーゼ（アミノ酸７７ −７９）の中に保存されている。この熱安定性ポリメラーゼ−族の中では、保存 されたモチーフ（Ｌ／　Ｉ　）　ＬＥＴ（配列番号：１８）がＹＫＡモチーフの すぐ前にある。Ｔａｆ　ＤＮＡポリメラーゼ１１ｅ７３はこのＹＫＡモチーフよ り残基５個分前にあり、一方ＴＭＡ　ＤＮＡポリメラーゼＬｅｕ７２は、ＹＫＡ モチーフより残基５個分前にある。テルモタガ（ハ肛赳包■）又はテルモシボ（ ユニμｍ厘肢）属からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内のモチーフ（Ｌ／　Ｉ　 ）　ＬＥＴＹＫＡ　（配列番号：１９）内のＬｅｕ又はＩＩｓの欠失は同様に５ ′→３′エキソヌクレアーゼ活性を低下させるであろう。 かくして、テルムス（Ｔｈｅｒ■ｕｓ）ＩｌｉのＤＩＪＡポリメラーゼならびに テルモタガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏ■）及びテルモシボ（Ｔｈｅｒ１１組蝕）のＩＩ ＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を構成する保存されたア ミノ酸配列が（Ｉ／Ｌ／Ａ）Ｘ、ＹＫＡ（配列番号：　２０）　（なおここでＸ ３は３つのアミノ酸のいずれかの配列である）として同定された。従って熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は同様に、この保存 さ冗たアミノ酸ドメインを変異させることによっても変えることができる。 当業者であれば、組換え宿主細胞内でこのような欠失変異体が発現される場合、 メチオニンコドンがつねにコード配列の５′末端に置かれ、従って欠失変異体タ ンパク質のアミノ末端配列は上述のテルムス（Ｔｈｅｒ＋ｉｕｓ　）属内でＭＥ Ｔ−ＡＬＡとなる、ということがわかる。 欠失変異を行なうための好ましい技術には、熱安定性ｒｊＮＡポリメラーゼのヌ クレオチド配列上の既知の制限部位の利用が含まれる。 欠失すべき特定の１又は複数のアミノ酸の同定に続いて、欠失されるべきアミノ 酸又はドメインに対応する位置またはその位置に対しわずかに３′遠位の位置で 標的ＤＮＡ配列の開裂をひき起こすがしかし望まれるポリメラーゼのその他の特 性をコードするドメインを、開裂された時に保持するような制限部位が同定され る。 あるいは、標的アミノ酸又はドメインをコードする配列のいずれかの側（５′又 は３′）上の制限部位を利用してその配列を開裂させることも可能である。しか しながら、この場合、次に配列の２つの望ましい部分の連結が必要となる。この 連結は、当該技術分野では標準的なものであり１９９０年５月１５日付出願の米 国出願第５２３，３９４号の例９．１９９１年８月１３日付出願のＰＣＴ出願明 細書第９１１０５７５３号の例７、及び１９９０年９月２８日付出願の米国特許 出願第５９０４９０号に例示されている技術を用いて行なうことができる。 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの欠失変異を達成するためのもう１つの技術は、Ｐ ＣＲ変異誘発法を利用することによるものである。この方法においては、制限部 位ドメイン及び任意的にはメチオニンコドンがすでに存在していない場合このコ ドンを取り込むプライマが調製される。かくして、このプライマによるＰＣＲ生 成物は、酵素の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードするドメインを除去 するべく適切な制限酵素で消化されうる。次に、生成物の２つの残りの区分が連 結されて、５′→３′工牛ソヌクレアーゼ活性の欠如した熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼのためのコード配列が形成される。このようなコード配列は、５′→３′ エキソヌクレアーゼ活性の欠如した望ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生産 するため適切な宿主細胞内で発現ベクターとして利用できる。 減少した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつＴ！！ＡＤＮＡ’ｆｆｌ　’ Ｊメラーゼ変異体に加えて、減少された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有 する末端切除されたＴｔａａ　ＤＮＡポリメラーゼを゛、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメ ラーゼ遺伝子の完全なコード化配列が大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）内の発現ベクタ ー内に存在している場合でさえ組換え技術によって生産できるということも見出 された。このような末端が切除されたＴ＋ｗａ　ＤＮＡポリメラーゼは、位置１ ４０のメチオニンコドンで出発する翻訳によって形成される。さらに組換え手段 を用いて、加コード配列の位置２８４でのメチオニンコドンにおいて翻訳を開始 することにより生産されたタンパク質に相当する末端切除されたポリメラーゼを 生成することが可能である。 アミノ酸１〜１３９の欠如したＴ！ａ　ＤＮＡポリメラーゼ（約８６ｋＤａ）及 びアミノ酸１〜２８３の欠如したＤ竪ＤＮＡポリメラーゼ（約７０ｋＯａ）は、 ポリメラーゼ活性を保持しているが、低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活 性を有する。　７０ｋＤａのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの付加的な利点は、そ れが未変性のＴｌ１ａポリメラーゼに比べて有意に熱安定性があるという点にあ る。 かくして無傷のＴ＋ｓａ　ＤＮＡポリメラーゼ■酵素の全配列が活性のために必 要とされることはないということがわかった。Ｔａ＋ａ　ＤＮＡポリメラーゼ■ コード配列の一部分を組換えＤＮＡ技術の中で用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を もつ生物学的に活性の遺伝子生成物を生産することが可能である。 さらに、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ配列をコードするＤＮＡの利用可能性は、 同様にＤＮＡポリメラーゼ活性をもつが低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ 活性を有するミューティン（変異体タンパク質）形態を生成するべくコード配列 を変更する機会を提供する。擁ＤＮＡポリメラーゼのアミノ（Ｎ）−末端部分は ポリメラーゼ活性のために必要なものではないが、むしろタンパク質の５′→３ ′エキソヌクレアーゼ活性をコードする。 かくして、組換えＤＮＡ方法を用いて、Ｔｅａ遺伝子のＮ末端コード配列のほぼ 最高３分の１まで欠失させ、クローニングし、ポリメラーゼ検定においてきわめ て活性であるが欠失の範囲に応じて５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を全くも たない遺伝子生成物を発現することが可能である。ポリメラーゼのいくつがのＮ 末端短縮形態が活性であることから、これらのポリメラーゼの発現のために用い られる遺伝子構成体は、コード配列の対応する短縮形態を含むことができる。 Ｎ末端欠失に加えて、Ｔａａａ　ＤＮＡポリメラーゼ又はその他の熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼのペプチド鎖内の個々のアミノ酸残基を、酸化、還元又はその他 の誘導体化によって変更することが可能であり、ポリメラーゼ活性を保持するが 低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつフラグメントを得るためタン パク質を開裂することもできる。Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼコード配列又はそ の他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのコード配列の一次構造に対して欠失、付加 又は変更により修正を行ない、そのコード配列から生産された５ＲＮＡの翻訳中 に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼへと取り込まれるアミノ酸を変化させることは、 タンパク質の高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊することなく行なうことができ る。 低下した又は増強された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性のごとき新規の性質 を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを調製するためのもう１つの技術は、「熱安 定性キメラＤＮＡポリメラーゼ」の構成のための［ドメインシャフリング（混合 ）」技法である０例えば、里ＤＮＡポリメラーゼＩコドン２８９−４２２に換え て約２９１〜約４８４のコドンを含むＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼコード配列を 用いることは、ＬｉＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼドメイ ン（１−２８９）、Ｔｅｒａ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレア ーゼドメイン（２９１〜４８４）及び加ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラー ゼドメイン（４２３〜８３２）を含有する新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを 生み出すことになる。あるいは、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキ ソヌクレアーゼドメイン及び３′→５′エキソヌクレアーゼドメイン（およそ、 コドン１−４８４）を、Ｌ馴ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴ Ｐ結合及びプライマ／鋳型結合ドメイン）部分（およそ、コドン４２３−８３２ ）に融合させることができる。 ここでわかるように、「ドメインシャラフリング」によるｒ熱安定性キメラＤＮ ＡポリメラーゼＪの生成のための供与体と受容体はＬｑ及ヒＴｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼに制限される必要はない。その他の熱安定性ポリメラーゼは、ｍ及びＴ ｍａ　ＤＮＡポリメラーゼと類似のドメインを提供する。その上、５′→３′エ キソヌクレアーゼドメインは、変更された５′→３′ヌクレアーゼ活性をもつ熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼから誘導されうる０例えば、Ｔ３ＤＮＡポリメラーゼ の１〜２８９の５′→３′ヌクレアーゼドメインは、シ徂　ポリメラーゼ遺伝子 のＧｌｙ　（４６）からＡｓｐへの変異体形態から誘導されうる。同様に、Ｔｔ ｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ及び３′→５′ヌクレアー ゼドメインは５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損ドメインをコードし、Ｔ！！ａ 　Ｇｌｙ　（３７）−Ａｓｐアミノ酸１〜４８４をコードするＤＮＡフラグメン ト、又はこれに代えて末端切除形Ｍｅｔ１４０〜アミノ酸４８４をコードするＤ ＮＡフラグメントとして取出すことができる。 さまざまな手段のいずれを用いてもキメラＤＮＡポリメラーゼコード配列（新し い特性をもつもの）を生成することができるが、好ましい方法は「オーバーラツ プＪ　Ｆ’ＣＲを利用する。この方法においては、意図された連結部配列はＰＣ Ｒプライマ内（その５′末端で）に盛り込まれている。個々のドメインの初期増 幅に続いて、さまざまな生成物が希釈され（約１００〜１０００倍）、組合わさ れ、変性され、アニーリングされ、延長され、その後、そうでなければ標準的な Ｐｃｔ？のために最終的順方向及び逆方向プライマが付加される。 当業者であれば、低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ上述の熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼが組換えＤＮＡ技法によって最も容易に構築されるとい うことを認識することだろう、低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をも つ本発明に従った変異体酵素の１つ又はこれらの酵素の誘導体又は相同体を生産 したい場合、酵素の組換え体形態を生産することには、発現ベクターの構成、ベ クターを用いた宿主細胞の形質転換及び発現が発生するような条件下での形質転 換された宿主細胞の培養が、典型的には含まれる。 発現ベクターを構成するためには、成熟（ここでは全てのキメラ又はミューティ ンを含む）酵素又は、活性を破壊しない付加的な配列への又は活性タンパク質を 与えるための（ペプチダーゼでの処理といった）制御された条件下で開裂可能な 付加的な配列への変異体ポリメラーゼの融合をコードするＤＮＡが得られる。次 に、コード配列は、発現ベクター内で適当な制御配列との作動的連鎖状態に置か れる。ベクターは、宿主細胞内で自律的に複製するように、又は宿主細胞の染色 体ＤＮＡ内に組込まれるように設計され得る。適切な宿主を形質転換するために このベクターが用いられ、形質転換された宿主は、組換え型ポリメラーゼの発現 に通した条件下で培養される。 前述の段階の各々はさまざまな方法で行なうことができる。例えば、ゲノムフラ グメントから望ましいコード配列を得、これを直接適切な宿主内で使用すること が可能である。さまざまな宿主内で作動的な発現ベクタのための構成は、以下に 一般的に記述するようにレプリコン及び制御配列を用いて行なわれる。望ましい コード化及び制御配列を含む適切なベクターの構成は、当該技術分野において充 分に理解されている標準的な連結及び制限技術を利用する。単離されたプラスミ ド、ＤＮＡ配列又は合成オリゴヌクレオチドは開裂され、変更され、望ましい形 に再連結される。適当な制限部位は、通常得られない場合、以下に例示するよう に発現ベクターの構成を容易にするべくコード配列の端部に付加することが可能 である。 部位特異的ＤＮＡ開裂は、当該技術分野において一般に理解されており又市販の 制限酵素のメーカーが規定しているような条件の下で適当な制限酵素（１又は複 数）で処理することによって行なわれる。 例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｇ　、製品カタログを参照のこと 、一般に、約ｌμｇのプラスミド又はその他のＤＮＡが杓２０μｌの緩衝液中で 酵素１単位によって開裂される。以下の例では、ＤＮＡの完全な消化を確保する ために過剰の制限酵素が使用されている。約３７℃で約１時間から２時間の保温 時間が標準的であるが、変更も許容できる。各保温の後、タンパク質はフェノー ル及びクロロホルムでの抽出により除去される；この抽出の後には、エーテル抽 出及びエタノールでの沈澱による水性分画からのＤＮＡの回収を続行うことがで きる。望ましい場合には、開裂された分画のサイズ分離を、標準技法を用いたポ リアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動法によって行なうことも可能 である。例えば）ｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　、　１９８０年。 ６５；　４９９−５６０を参照のこと。 −重鎖の「突出」末端を有する制限開裂されたフラグメントは、５０１ＩＩＭの トリス−（：ｌ　ｐＨ７，６，５０ｓ＋ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＭｇＣ１ｇ、 　１０ｍＭのＤＴＴ及び５〜ｌＯμＭのｄＮＴＰの中で２０°Ｃ〜２５°Ｃ１約 １５〜２５分の保温時間を用いて４つのデオキシヌクレオシド三燐酸（ｄＮＴＰ ）の存在下で大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ） の大フラグメントで処理することにより、平滑末端（２本鎖末端）にすることが できる、　Ｋｌｅｎｏｗフラグメントは５′の突出末端でフィルインするが、た とえ４つのｄＮＴＰが存在する場合でも、突出する３′−重鎖をチューバックす る。望ましい場合には、突出末端の性質によって課せられる制限条件の範囲内で ｄＮＴＰｓのうちの１つだけつまり選択されたものだけを供給することにより、 選択的修復を行なうことが可能である。Ｋｌｅｎｏ−での処理の後、混合物はフ ェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱される。Ｓ１ヌクレアーゼ を用いた適切な条件下での処理は核酸の全一本鎖部分の加水分解をもたらすから 、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて類似の結果を達成することも可能である。 Ｍａｆｔｅｕｃｉｌｉ、１９８１．　Ｊ、　ＡＪ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１ ０３　：　３１８５−３１９１のトリエステル方法、或いは又自動合成方法を用 いて、合成オリゴヌクレオチドを調製することが可能である。アニーリングに先 立つ又は標識づけのための一本鎖のキナーゼ付加は、５０ＩＩＭのトリス、ｐＨ ７，６゜］Ｏｎ＋ＭのＭｇＣ］□、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、 及び１〜２μＭのＡＴＰの存在下で０．５ｇＭの基質に対し余剰の、例えば約１ ０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて達成される。キナーゼ付加がプロー ブの標識づけのためである場合、ＡＴＰは高い比活性のＴ−０ｐを含むことにな る。 以下の標準的条件及び温度で１５〜３０μ２の体積で連結が行なわれる：　２０ ｍＭのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭのＭｇＣＩｇ、　１０ｄのＤＴＴ 、　３３ｄｇ／ｍｌのＢＳＡ、　１（１ｗＭ　〜５０ａ＋ＭのＮａＣ１及び（相 補的一本鎖末端を伴うフラグメントの連結のため）０°Ｃで０．０１〜０．０２ 　（Ｗｅｉｓｓｌ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと４０ｄＭのＡＴＰ　、又は（「平 滑末端」連結のため）１４°Ｃで０．３〜０．６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと１ ｍＭのＡＴＰのいずれか。相補的末端を伴うフラグメントの分子間結紮は、通常 ３３〜１００μｇ／−１の合計ＤＮＡ濃度（５〜１ｏｏｎＨの合計末端濃度）で 行なわれる０分子間鈍端結紮（通常、任意で２０〜３０倍のモル余剰リンカ−を 用いる）は、ＬｕＭの合計末端濃度で行なわれる。 ベクター構成において、ベクターフラグメントは一般に、５′リン酸を除去しベ クターの再連結及び再構成を防ぐため、細菌又は子ウシの腸内アルカリ性ホフフ ァターゼ（ＢＡＰ又はＣＩＡＰ）で処理される。ＲＡＰ及びＣＩＡＰ消化条件は 当該技術分野において周知のものであり、公表されたプロトコルが通常、市販の ＢＡＰ及びＣＩＡＰ酵素に付随してくる。核酸フラグメントを回収するためには 、調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱してホスファタ ーゼを除去しＤＮＡを精製させる。あるいは、適切な制限サイトが利用可能であ る場合、連結前後の制限酵素消化により、望ましくないベクターフラグメントの 再連結を防ぐことができる。配列変更を必要とするコード配列又はベクターの一 部分については、さまざまな部位特異的、プライマ誘導的な変異誘発方法が利用 可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＧＩ２）を、部位特異的変異誘発を行な うために使用することが可能である。現在当該技術分野において標準的なもので あるもう１つの技術においては、望まれる突然変異をコードする合成オリゴヌク レオチドが、変異誘発プライマの延長生成物の構成のために鋳型として用いられ るＰＨ１１３”のごとき−末鎖ベクターの相補的核酸配列の合成を誘導するため のプライマとして用いられる。 変異誘発されたＤＮＡは、宿主細菌に形質転換され、形質転換された細菌の培養 物はプレートされ同定される。変更されたベクターの同定には、ニトロセルロー スフィルタ又はその他の膜に対する選択された形質転換体のＤＮＡの移行、及び 変更された配列に対する正確な対合のハイブリッド形成を可能にするがしかじも との鎖とのハイブリッド形成を妨げるような温度でキナーゼ付加された合成プラ イマとハイブリッド形成された「リフト」が関与することが考えられる。 プローブとハイブリッド形成するＤＮＡを含む形質転換体が次に培養され、変更 されたＤＮＡの溜めとして役立つ。 以下に記される構成においては、プラスミド構成のための適正な連結は、まず連 結混合物で大ｍＮ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＧＩＯＩ又はその他の適切な宿主を 形質転換することによって確認される。成功した形質転換体は、当該技術分野で は周知の通り、プラスミド構成様式に応じて、アンピシリン、テトラサイクリン 又はその他の抗生物質耐性又は怒受性又はその他の標識を用いることによって選 択される。形質転換体からのプラスミドは次に、Ｃｌｅｗｅｌｌ血、　、　１９ ６９年、ｋ匹５ハ旦。 Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｊｅｓ刊行物Ｆｏｃ ＋徂、第５巻、第２号の１１ページに「塩基−酸」抽出方法として記述されてお り、プロトコルの段階１２〜１７を、ＤＮＡのｃｓｃｌ／臭化エチジウム超遠心 分離で置き換えることによって、非常に純粋なプラスミドＤＮＡを得ることがで きる０分離されたＤＮＡは、制限酵素消化によって分析され、及び／又はＭｅｓ ｓｉｎｇ　ｋ、１９８１年、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　’４　：　３０ ９によってさらに詳述されているようなＳａｎｇｅｒｌｌｌ、　、　１９７７年 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：　５４６３のジデオキシ（チェーンターミネータ） 法によってか、或いは又Ｍａｘａｗ血、１９８０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚ　５ｏｌｏ　６５　：４９９の方法によって配列決定される。 制御配列、発現ベクター及び形質転換方法は、遺伝子を発現するのに用いられる 宿主細胞のタイプによって異なる。一般に、宿主としては、原核生物、酵母菌、 昆虫又は哺乳動物の細胞が用いられる。 原核生物の宿主は一般に、組換えタンパク質の生産のために最も効果的で便利な ものであり、従って本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発現にとって好まし いものである。 組換え型タンパク質を発現するのに最も頻繁に用いられる原核生物は、大腸菌で ある。クローニング及び配列決定のためそして大部分の細菌性プロモータの制御 下での構成の発現のためには、ＧＣ５Ｃ＃６１３５として大腸菌（ＥＬｃｏＨ） 遺伝材料センタから入手できる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２株財２θ４を 宿主として使用することが可能である。ＰＬＮ□、制御配列を伴う発現ベクタに ついては、大ｌｉ凹（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２株ＭＣ１００Ｏラムダ溶原株、 ＮＪｓｓＣＩ＊ｓ、Ｓｕｓ　Ｐｓｏ＋ＡＴＣＣ３９５３１を用いることができる 。　１９８７年４月７日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ５３６０６）大腸菌 （Ｌ組旦）　ＤＧ１１６及び１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに寄託された（Ａ ＴＣＣ５３０７５）大腸菌（Ｌ並田ユＫＢ２も同様に有用な宿主細胞である。Ｍ １３ファージ組換え体については、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２株ＤＧ９ ８といったファージ感染を受けやすい大腸菌（月工吐）株が使用される。ＤＧ９ ８株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託されている（　ＡＴＣＣ３９７ ６８）。 しかしながら、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの組換え体発現のためには 、バシルス・スプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）などのかん菌 、さまざまなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓ　）の種及びその他の細 菌株といった大腸菌（Ｅ、　ｃｏＨ）以外の微生物株も用いることができる。 このような原核生物系においては、宿主又は宿主と適合性ある種から誘導された 制御配列及び複製部位を含むプラスミドベクタが標準的に用いられる。 例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）は典型的には、Ｂｏｌｉｖｅｒ　ｌ１ｌＬ、 、　１９７７年、ン耐性のための遺伝子を含んでいる。これらの薬物耐性標識は 、望ましいベクタを構成する上で保持することも破壊することもでき、従って望 まれる組換え体の存在を検出する助けとなる。一般に使用されている制御配列、 すなわち、リポソーム結位部位配列と共に任意には１つのオペレータを伴う転写 開始のためのプロモータとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラ クトース（ｌａｃ）プロモータ系（Ｃｈａｎｇ　、ｆｉ１．．１９７”１年、Ｎ ａｔｕｒｅ　１９８　：　１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）　プロモータ 系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｆｉ、１９８０年Ｎｕｃ、　Ａｃ±ｄｓ　Ｒｅｓ。 ８　：　４０５７）及びラムダ誘導量ＰＬプロモータ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　、 ｆｉｉＬ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ　２９２　：　１２Ｂ）及びＮ−遺伝子リ ポソーム結合部位（Ｎｕｎｓ）が含まれる。１９８７年１２月８日付発行の米国 特許第４，７１１．８４５号に、ポータプル式制御システムカセットが記述され ている。このカセットは、ＮＲＲ３配列の６ｂｐ３’内の開裂を許容する少なく とも１つの制限部位をもつ第３のＩ）ＮＡ配列の上流に位１するＮＲ，、に作動 的に連鎖されたＰＬプロモータを含んでいる。同様に有効なのは、１９８６年１ ０月８日に公示された欧州特許公開第１９６．８６４号中にＣｈａｎｇ他によっ て記述されているホスファターゼＡ　（ｐｈｏＡ）系である。しかしながら、本 発明の変更された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクターを構成するためには 、原核生物と適合性ある入手可能なあらゆるプロモータ系を用いることができる 。 細菌に加えて、酵母のごとき真核微生物を組換え宿主細胞上して使用することも 可能である。 サツカロミセス・セレビシェ−（シ三加臣邊匹競ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験 用株、つまりパン酵母菌が最も多く用いられるが、その他のいくつかの菌株も一 般に入手可能である。２ミクロン複製起点を用いるベクターが一般的である（Ｂ ｒｏａｃｈ、　１９８３年、据１Ｌ監ムＰ■：３０７）が、酵母での発現に適し たその他のプラスミドベクタも知られている（例えば、５ｔｉｎｃｈｃｏｓｂ　 ＭＬ、　１９７９年、Ｎａｔｕｒｅ　２８２　：　３９　；Ｔｓｃｈｅｔｓｐｅ ＠、、　１９８０年、Ｇｅｎｅ　１０　：　１５７　：及びＣ１ａｒｋｅｌｌｌ 、１９８３年、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　１０１　：　３００を参照のこと）。酵 母ベクターのた・めの制御配列には、解糖系酵素の合成のためのプロモータが含 まれている（Ｈｅｓｓｉ、、　１９６８年、Ｊ、　Ａｄｖ、側Ｉ紅駐Ｒｇｇ、　 ７　：　１４９．　ＨａｌｌａｎＪｌｌ、。 １９７８年、Ｂｉｏｔｅｃ　勧劇旦旺１７　：　４９００　；及びＨａｌｌａｎ ｄ［１，、１９８１年Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍユυ小：　１３８５）。当該 技術分野において知られているさらなるプロモータとしては、３−ホスフォグリ セリン酸キナーゼのためのプロモータ（Ｈｉｔｚｅｍａｎｌｌ、、　１９８０年 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、　２５５　：２０７３）　、及びグリセルアルデ ヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラー ゼ、ホスフォフラクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホ スフォグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラ ーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼといったその他の解 糖酵素のためのプロモータが含まれる。増殖条件によって制御される転写の付加 的利点をもつその他のプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイ トクロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、並びにマルト ース及びガラクトースの利用を担う酵素（ｌ（ａｌｌａｎｄ　、　皿述）のため のプロモータ領域である。 コード配列の３′末端に置かれたとき、ターミネータ配列も発現強化のために用 いることができる。このようなターミネータは、酵母由来の遺伝子内のコード配 列に続く３′非翻訳領域内に見い出される。酵母適合性プロモータ、複製起点及 びその他の制御配列を含むあらゆるベクターが、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼのための酵母発現ベクターの構成に使用するのに適している。 本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、多細胞 生物に由来する真核宿主細胞培養物の中でも発現されうる。例えばＴｉ５ｓｕｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ＋　八ｃａｄｅｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｒｕｚ　ａｎｄ　Ｐ ａｔｔｅｒｓｏｎ。 ｅｄｉｔｏｒｓ　（１９７３年）を参照のこと、有用な宿主細胞系としては、Ｃ ｏ５−７　、　Ｃｏ５−Ａ２．　ＣＶ−１，マウス細胞例えばマウスの骨髄腫Ｎ ５１及びＶＥＲＯ，ＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ） 細胞が含まれる。このような細胞のための発現ベクターには、通常、例えば一般 に用いられるシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）からの初期及び後期プロモー タ（Ｆｉｅｒｓ　ｉ、、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ　２７３　：　１１３）又は 、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、ウシの乳頭腫ウィルス（ＢＰν）又 は鳥類の肉腫ウィルスといったその他のウィルス性プロモータ、又は免疫グロブ リンプロモータ及びヒートショックプロモータといったような哺乳動物細胞と適 合性ある制御配列及びプロモータが含まれる。ＢＰＶベクター系を用いた哺乳動 物系内でＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号の中で 開示されている。この系の変形態様は、米国特許第４，６０１，９７８号に記述 されている。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的観点は、Ａχｅ１の米国特許 第４．３９９．２１６号に記述されている。「エンハンサ−」領域も又、発現を 最適化する上で重要である。これらは、一般にプロモータ領域の上流に見られる 配列である。複製起点は必要とあらばウィルス性供給源から得ることができる。 しかしながら、染色体内への統合は、真核生物内のＤＮＡ複製にとって共通のメ カニズムである。 植物細胞を宿主として利用することもでき、ツバリンシンターゼプロモータ及び ポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒｆｉ、１９８２年、Ｌル状１皿 、５狙、　１　：５６１）といった、植物細胞と適合性ある制御配列が利用可能 である。バキュロウィルスベクターによって提供される制御系を用いた昆虫細胞 を利用する発現系も同様に記述されている（ＭＮｌｅｒｆｆｂ、１９８６年、Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　（ＳｅｔＩｏ−他、＋　ｅｄｓ、＋Ｐ１ ｅｎｕａ＋　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）旦＋　２７７−２９７）。昆虫細胞ベース の発現はスボドフテラ・７　）Ｌ’ｌ　ヘイタＣ釘剋並旦■７）内で達成できる 。 これらの系は、同様に本発明の組換え熱安定性ポリメラーゼを生産するのに用い ることができる。 使用する宿主細胞に応じて、このような細胞に適切な標準的技術を用いて転質転 換が行なわれる。Ｃｏｈｅｎ、　１９７２年、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 ｋ■、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９　：　２１１０により記述されているような塩 化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリヤを含む原核生物 又はその他の細胞のために用いられる。成る種の植物細胞のためには、アグロバ クテリウム・チュメファシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ）を用いる感染（Ｓｈａｗｌｌｌ、、　１９８３年、Ｇｅｎｅ　ｌｌ　 ：　３１５）が用いられる。哺乳動物の細胞のためには、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ 　ｖａｎ　ｄｅｒεｂ、　１９７８年、ＬＬ出１Ｌ５２　：　５４６のリン酸カ ルシウム沈澱方法が好まれる。酵母への形質転換は、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ ｌｌｌ、１９７７年、Ｊ、　Ｂａｃｔ。 １３０　：　９４６及びＨｓｉａｏｌｌ、１９７９年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃ閃、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７６　：３８２９の方法に従って行なわれ る。 組換え宿主細胞内で、変更された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する望 ましい熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがひとたび発現されると、タンパク質の精製 が望まれる可能性がある０本発明の組換え熱安定性ポリメラーゼを精製するため にはさまざまな精製手順を用いることができるが、等しい純度の酵素調製物を生 み出すためには、比較的少ない段階しか必要でない可能性がある。大腸菌（Ｅ、 　ｃｏｌｔ）の宿主タンパク質は熱に敏感であることから、本発明の組換え熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼは、粗溶菌液を熱不活性化することによって著しく富化 することができる。この段階は、宿主ＤＮＡからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ の解離を確実に行ない、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとその他の細胞溶菌液タン パク質とのイオン相互作用を減少させるため、充分な量の塩（標準的には０．２ 〜０．３Ｍの硫酸アンモニウム）の存在下で行なわれる。 さらに、０．３Ｍの硫酸アンモニウムの存在は、フェニールセファロースカラム との疎水性相互作用を促進する。疎水性相互作用クロマトグラフィは、疎水性基 を含む未負荷のベッド材料との疎水性相互作用の強度の差に基づいて物質が分離 される分離技術である。典型的には、カラムはまず、高イオン強度のごとき疎水 結合にとって有利な条件の下で平衡化される。次に、試料を溶出させるため、下 降する塩勾配を用いることができる。 本発明に従うと、（変更された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ組換え 型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む）水性混合物が、フェニルセファロース（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）又はＰｈｅｎｙｌ　Ｔｓｋ　（東ソー製）のごとき比較 的強い疎水性ゲルを含むカラム上に負荷される。フェニルセファロースカラムと の疎水性相互作用を促進するため、０．３Ｍ以上の硫酸アンモニウム（０，３Ｍ が好ましい）又は０．５Ｍ以上のＮａＣｌを含む溶剤が用いられる。カラム及び 試料は、同様に０．５＋ＩＩＭのＤＴＴを含む５０１のＴｒｉｓ　（ｐｉ（７， ５）及び１．０ｍＨのＥＤＴＡ　（ｒＴＥＪ　）　ｌｌｋ衝液の中で０．３Ｍの 硫酸アンモニウムに調整され、試料はカラムに対し適用される。カラムは０．３ Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。 次に、減少する塩勾配、エチレンもしくはプロピレングリコール又は尿素のごと き疎水的相互作用を低下させる溶剤で、酵素を溶出させることができる。 長期にわたる安定性のためには、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ−酵素は 、■又は複数の非イオン性ポリマー洗剤を含む緩衝液の中で保存することができ る。このような洗剤は、一般に約１００〜２５０．０００ダルトン好ましくは約 ４，０００〜２００，０００ダルトンの範囲内の分子量を有するものであり、約 ３．５〜約９．５好ましくは約４〜８．５のｐＨで酵素を安定化させる。このよ うな洗剤の例としては、Ｍｃ（：ｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｎｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ ＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、＋　１７５　Ｒｏｃｋ　Ｒｏａｄ、　Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ、　ＮＪ　（ＵＳＡ）により発行されたＭｃ　ＣｕｔｃｈｅｏｎのＥ＋ ｗｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　（乳化剤と清浄側）の２９５ 〜２９８ページ及び１９８９年７月２８日付の同時係属米国出願第３８７，００ ３号に規定されているものが含まれる（これらの記載を引用により本明細書に組 み入れる）。 好ましくは、洗剤はエトキシル化脂肪族アルコールエーテル及びラウリルエーテ ル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノ ール化合物、修飾オキシエチル化及び／又はオキシプロピル化直鎖アルコール、 モノオレイン酸ポリエチレングリコール化合物、ポリソルビン酸化合物及びフェ ノール脂肪族アルコールエーテルを含むグループの中から選択される。より具体 的には、ＩＣＩＡｍｅｒｉｃａｓ　Ｉｎｃ、、　Ｗｉ１ｗｉｎｇｔｏｎ＋　ＤＥ からのポリオキシエチル化（２０）モノラウリン酸ソルビタンであるＴｗｅｅｎ ２０　、及びＢＡＳＦＷｙａｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ 、　ＮＪからのエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）であるＩｃｏｎｏｌ 　ＮＰ−４０が好ましい。 本発明の熱安定性酵素は、このような酵素の活性が必要であるか又は望まれるあ らゆる用途に用いることができる。 Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド法によるＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ血 、　＋１９７７年、匡、ｈ旦、紅組３担、■Ａ　７４　：　５４６３−５４６７ ）は近年、新たなベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｌｉ、　＋　１９８ ５年、Ｇｅｎｅ　３３　：　１０３−１１９）、塩基類似体（Ｍｉｌｌｓ　１１ １．．１９７９年、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＋　Ａｃａｄ＋　Ｓｃｉ　ｌｌ５Ａ　７ ６　：２２３２−２２３５、及びＢａｒｒｌｉｌ、、　１９８６年、Ｂｔｏ　Ｔ ｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　４　：　４２Ｂ−４３２）＋酵素（Ｔａｂｏｒ　１１１． ．１９８７年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　： 　４７６３−４７７１及びＩｎｎ１ｓ、　Ｍ、Ａ、　血、１９８８年、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｆ　ＵＳＡ　８５　：９４３６　：　９４４０） 及び［１ｌｌｌＡ配列分析の部分的自動化のための計器（Ｓｍｉｔｈ　＆、、１ ９８６年、Ｎａｔｕｒｅ　３２１　；　６７４−６７９　；　Ｐｒｏｂｅｒ　１ １１．１９８７年、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　３３６−３４１　；及びＡｎ ｓｏｒｇｅ　ｌｊｌ、１９８７年、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１５　：　 ４５９３−４６０３）の開発を含め、著しい改良を受けてきた。 基本的なジデオキシ配列決定手順には、（ｉ）適切な一本鎖又は変性２本［ＤＮ ＾鋳型にオリゴヌクレオチドプライマをアニーリングすること；（ｉｉ）各４１ −Ｍ）　ｄ　ＩｍｄＮＴＰ又ハｄｄＮＴＰ（代替的ニハ、標識プライマを用いる ことができる）、　未標識ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ｓの混合物及び１つの読み終りジデ オキシヌクレオチド−５′−三燐酸（ｄｄＮＴＰ　）を含む４つの別々の反応に おいてＤＮＡポリメラーゼでプライマを延長すること；　（ｉｉｉ）高解像度ポ リアクリルアミド−尿素ゲル上で反応生成物の４Ｍを分離すること；並びに（ｉ ｖ）ＤＮＡ配列を推論するため検査することのできるゲルのオートラジオグラフ ィ画像を生産すること、が含まれる。あるいは、反応生成物を同定するため蛍光 標識プライマ又はヌクレオチドを用いることができる。既知のジデオキシ配列決 定方法は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメン ト、逆転写酵素、ＴＢＤＮＡポリメラーゼ又は変更Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼの ごときＤＮＡポリメラーゼを利用する。 市販のキットの導入はこの技術を大幅に簡略化し、ＤＮＡ配列決定をあらゆる実 験室にとっての日常的技術にした。しかしながらそれでもなお、パリンドローム へヤビンルーブといった二次的構造を含む核酸及びＧ＋Ｃの豊富なりＮＡでうま く機能する配列決定プロトコルに対する必要性が、当該技術分野には存在してい る。一本ｔｌＤＮＡは、ヘヤビンルーブといったような、延長反応における不適 切な停止を通して又は５　’　−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素の場合 にはヘヤピンの接合における鋳型鎮の開裂を通してジデオキシ（チェーンターミ ネータ）配列決定プロトコルと著しく妨害する可能性のある二次構造を形成する ことができる。高温は二次構造を不安定にするから、熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼでの例えば７０〜７５°Ｃといった高温における延長反応を行なう能力は、こ のような二次構造を含むＤＮＡの配列決定における著しい改善をもたらす。しか しながら、ポリメラーゼ延長と適合性ある温度が全ての二次構造を除去するわけ ではない。５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、 この分野におけるさらなる改良である。というのもこのポリメラーゼは、鋳型を 開裂して不適切な停止すなわち延長ラン−オフ・フラグメントをもたらすのでは なくむしろ鎖の除去（ｔｈｓρＩａｃｅｍｅｎｔ）反応においてヘヤピンを通し て合成できるからである。 基本的ジデオキシ（チェーンターミネータ）配列決定に代るものとして、サイク ルジデオキシ配列決定は、ジデオキシチェーンターミネータの存在下での標的配 列の非対称な増幅である。単一のサイクルは考えられる全ての長さの延長生成物 の１群を生成する。延長反応生成物をＤＮＡ鋳型から変性した後、プライマアニ ーリングとプライマ延長の多くのサイクルがジデオキシターミネータの存在上で 起こる。この方法はＰＣＢ法とは異る。なぜなら、わずか１つのプライマしか用 いられず各サイクル内の配列決定反応生成物の増加は直線的であり、増幅生成物 は長さが不均一であり、次の反応に対する鋳型として役立たないからである。サ イクルジデオキシ配列決定は、自動化されたＤＮＡ配列決定計器を用いる実験室 及びその他の大量配列決定実験室にとって利点を提供する技術である。技術の特 異性及び生成されるシグナル量の増大のため、クローニング無しに直接ゲノミッ クＤＮＡを配列決定することが可能である。サイクル配列決定プロトコルは、ゲ ノミック、クローニング及びＰｃｔ？増幅された鋳型を含む一本鎖及び二本鎖の 鋳型に対処する。 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、サイクル配列決定においていくつかの利点をも つ；すなわち、これらのポリメラーゼは、ゲノミック標的に対するプライマの特 異的ハイブリッに形成のために必要とされるストリンジェント・アニーリング温 度に耐え、しかも各サイクル内で起こる高温変性の多くのサイクルに耐える。７ ０〜７５℃といった高い温度で延長反応を実行することは、二次構造の不安定化 のため、二次構造を含むＤＮＡでの配列決定結果における著しい改善をもたらす 。しかしながらこのような温度は、全ての二次構造を排除するものではない。５ ′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはこの分野におけ るさらなる改良である。というのも、このポリメラーゼは、鋳型を開裂して不適 切な停止を作り出すのではなくむしろ鎖除去（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）反応 においてヘヤビンを通して合成できるからである。さらに、ＰＣＢと同様に、サ イクル配列決定は生成物の鎖の復元という現象に悩まされる。５’−３’エキソ ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの場合、生成物鎖復元に よって作られた２本鎖領域へのプライマの延長は、復元された相補的生成物鎖の 開裂をもたらす。開裂された鎖はさらに短かいものとなり、かくして不適切な停 止として現われる。さらに、適正な予め合成された停止シグナルは減少すること になる。５′＝３′エキソヌクレアーゼ活性が欠損している熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼは、このような延長生成物フラグメントが形成されないという点で、改 良をもたらす。サイク配列決定の一変形ａ祿には、一定の増幅レベルを保持しな がら２本鎖鋳型の各鎖に対し配列決定梯子を同時に生成することが含まれる（Ｒ ｕａｎｓ及びＫｉｄｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 歓赳、凪１里１９９１年、８８　：　２８１５−２８１９）。結合された増幅及 び配列というこの方法は、鎖サイクル配列決定と同様の形で５’−３’エキソヌ クレアーゼ活性が欠損した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用からの恩恵をこう むることになる。 特に好ましい態様においては、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が減少される か又は除去された酵素は、ＰＣＢとして知られている核酸増幅反応を触媒し、上 述のとおり、その結果、より高い５′−３′エキソヌクレアーゼ活性をもつそれ ぞれの天然性酵素で達成される以上に優れた望ましい生成物の収量が生み出され ることになる。 収量の改善は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によってひき起こされる、す でに合成された生成物を分解する能力が無いことの結果である。核酸配列を増幅 させるためのこの方法は、米国特許第４．６８３，２０２号及び４，８６５，１ ８８号の中で開示されそして特許請求されている。これらの記載を引用により本 明細書に組み入れる。ＰＣＲ核酸増幅方法には、核酸又は核酸混合物の中に含ま れている少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅することが関与し、量も一般的 な態様においては、２本ＭＤＮＡが生成される。収量の改善の他に、低下した５ ’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、より長 いＰＣＲ生成物を生成する改善された能力、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型から生成物を生 産する改善された能力及びＰＣＲ生成物及びＤＮＡ配列決定梯子（ｌａｄｄｅｒ ）を高レベルの２次構造をもつ鋳型から生成する改善された能力を示す。 論述する上で容易なように、以下に記すプロトコルでは、増幅すべき特定の配列 が２本鎖核酸の中に含まれているということを仮定している。しかしながら、こ の方法は、＠ＲＮＡのごとき１本鎖核酸を増幅する上でも同様に有効である。た だし好ましい実施１１様において、究極的な生成物は２本鎖ＤＮＡである。−末 鎖核酸の増幅においては、第１の段階には相補的鎖の合成が関与しており（この 目的で２つの増幅プライマのうちの１つを用いることができる）、その後に続く 段階は以下で記す２本額増幅法と同じように進められる。 この増幅法は、以下のような段階を含んでいる；（ａ）増幅されるべき各特定の 配列について２つのオリゴヌクレオチドブライフ及び４つの異なるヌクレオシド 三燐酸と各核酸鎖とを接触させる段階：ここで、各プライマは、特定の配列の異 なる鎖に対し実質的に相補的であるよう選択されており、かくして、１つのプラ イマから合成された延長生成物はその相補体から分離されたときその他のプライ マの延長生成物の合成のための鋳型として役立つことができるようになっている 。この接触作業は、相補的核＃饋に対する各プライマのハイプリント形成を可能 にする温度で行なわれる： （ｂ）特定の核酸配列の各鎖に対し相補的なプライマ延長生成物を形成するため ヌクレオシドリン酸の結合を可能にする本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと 各核酸鎖を、段階（ａ）と同時に又はその後で接触させる段階； （ｃ）酵素の活性を促進し、増幅中の異なる各配列について各核酸鎖鋳型に対し て相補的な各プライマの延長生成物を合成するために有効な時間にわたりそのた めに有効な温度において、ただし相補的鎖鋳型から各延長生成物を分離するほど 高くはない温度及び時間で、段階 （ｂ）からの混合物を維持する段階； （ｄ）−末鎖分子を生成するためプライマ延長生成物が合成された鋳型からこの プライマ延長生成物を分離するのに有効な、ただし酵素を不可逆的に変性するほ ど高くはない温度及び時間で、段階（ｃ）からの混合物を加熱する段階； （ｅ）段階（ｄ）で生産された一本鎖分子の各々に対するプライマのハイブリッ ド形成を促進するため有効な時間にわたり、そのために有効な温度まで、段階（ ｄ）からの混合物を冷却する段階；及び（ｆ）酵素の活性を促進し、増幅中の異 なる各配列について、段階（ｄ）で生産された各核酸鋳型に相補的な各プライマ の延長生成物を合成するのに有効な時間にわたり、そのために有効な温度で、た だし相補的鎖鋳型から各々の延長生成物を分離するほど高くない温度及び時間で 、段階（ｅ）からの混合物を維持する段階。段階（ｅ）と（ｆ）の有効な時間と 温度は一致していてよく、かくして段階（ｅ）及び（ｆ）は同時に行なうことが できる。段階（ｄ）〜（ｆ）は望ましい増幅レベルに至るまで反復される。 増幅方法は、既知の配列の特定の核酸配列を大量に生産するのに有効であるのみ ならず、存在することはわかっているが完全に特定されていない核酸配列を生産 するためにも有効である。１つのプライマから合成された延長生成物が鋳型（相 補体）から分離された時点で規定の長さの核酸へのその他のプライマの延長のた めの鋳型として役立つことができるように配列に沿って相対的な位置に望ましい 配列の異なる鎖に対しハイブリッド形成することになる２つのオリゴヌクレオチ ドポリマーが調製されうるように充分に詳しく、充分な数の塩基が配列の両端に おいてわかっていることだけが必要なのである。配列の両端での塩基についての 知識が多ければ多いほど、標的核酸配列に対するプライマの特異性及び反応の特 異性及び方法の効率は高いものとなりうる。 いずれの場合でも、増幅すべき配列の初期コピーが利用可能でなくてはならない が、この配列は純粋な又は分離された分子である必要はない。一般に、増幅プロ セスには、（ａ）ハイブリッド形成されることになるオリゴヌクレオチドが合成 されうるのに充分詳細に所要配列の末端がわかっていること及び（ｂ）連鎖反応 を開始するのに少量の配列が利用可能であることを仮定して、関与する反応段階 の数との関係において指数的な量で少なくとも１つの特定の核酸配列を生産する ための連鎖反応が関与している。連鎖反応の生成物は、使用された特定のプライ マの５′末端に相応する末端をもつ分離された核酸の２重鎖となる。 増幅しようとする特定の核酸配列を含んでいるか又は含んでいると思われるもの であることを条件として精製された又は精製されていない形のあらゆる核酸配列 を出発核酸として利用することが可能である。増幅すべき核酸は、あらゆる供給 源例えばｐＢＲ３２２のごときプラスミド、クローニングされたＤＮＡもしくは ＲＮＡ　、又は細菌、酵母菌、ウィルス、オルガ不う（細胞器官）及びさらに高 等植物及び動物などの生物体からの天然のＤＮＡ又はＲＮＡから得ることができ る。 ＤＮＡ又はｌ？ＮＡは、血液、絨毛膜絨毛などの組織材料又は羊膜細胞から、さ まざまな技術によって抽出することができる。例えば、Ｍａｎｉａｅｉｓ血、圧 録生、伽り畠山エエ艮虹」」工りは的ｎ造Ｄす１肌虹（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ＋　ＮＹ）　ｐ２８０〜２８１を参照のこと。従って、この方法は例えば 、メツセンジャーＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲ１１Ａを利用することができ、これ らのＤＮＡ又は１？ＮＡは、−末鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに、 各々を１鎖ずつ含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用することも可能である。 これらの核酸のうちのいずれかの混合物は同様に、　（同じ又は異なるプライマ を用いた）前の増幅反応から生産された核酸と同しように用いることができる。 増幅されるべき特定の核酸配列は、大きな分子の単なる一分画であってもよいし 或いは又当初から分離された分子として存在し、か（して特定の配列が核酸全体 を構成するようになっていてもよい。 増幅すべき配列は、当初純粋な形で存在する必要はない。配列は、特定の生物学 的試料の掻めてわずかな分画しか構成しないであろう特定の微生物による核酸配 列の一部分又は、ヒ）　ＤＮＡ全体の中に含まれたβ−グロブリンの一部分（Ｓ ａｉｋｉ　ｌｌ、１９８５年、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：１５３０−１５３４ で例示されているようなもの）といった、複雑な混合物のわずかな分画であって よい。細胞は、低張緩衝液内での懸濁及び細胞間成分の細胞溶菌及び分散が起こ るまでの約９０°Ｃ〜１００°Ｃでの熱処理（一般に１〜１５分）の後に、増幅 法において直接用いることができる。加熱段階の後、増幅試薬を直接溶菌済み細 胞に付加することができる。出発核酸配列は、望ましい特定の核酸配列を複数含 むことができる。増幅法は、１つの特定の核酸配列を大量に生産するだめのみな らず、同し又は異なる核酸分子上にある複数の異なる特定の核酸配列を同時に増 幅するためにも役立つ。 ＰＣＲ法においては、プライマが主要な役割を果たす。増幅法を説明する上で用 いられる「プライマ」という語は、特に増幅すべきフラグメントの末端配列に関 する情報において幾分かのあいまいさがある場合又は１９９１年８月１３日付の ＰＣＴ出願第９１１０５−７５３号内に記されている縮重プライマ法を利用する 場合において、複数のプライマのことを指すことがある０例えば、タンパク質配 列情報から核酸配列が類推される場合、各々の鎖のために、遺伝子コードの縮重 に基づく考えられる全てのコドンの変動を表わす配列を含むプライマの１つのコ レクションを用いることができる。このコレクシジンの中の１つのプライマは、 増幅のために役立つように増幅すべき所望の配列の一部分と充分に相同的なもの となる。 さらに、異なるオリゴヌクレオチドプライマが適切な数用いられるかぎり、最初 の核酸又は核酸混合物から複数の特定の核酸配列を増幅することが可能である。 例えば、２つの異なる特定の核酸配列を生産しなくてはならない場合、４つのプ ライマが使用される。プライマのうちの２つは、特定の核酸配列の１つに対して 特異的であり、その他の２つのプライマは第２の特定の核酸配列に対して特異的 である。この要領で、２つの異なる特定の配列の各々を、当該方法によって指数 的に生産することができる。 増幅すべき配列の内部配列（すなわち末端にない配列）に対して相補的な１組の プライマを少なくとも１回の増幅サイクルの後に添加することによって反応にお いてより大きい特異性を得るため、一定の与えられた数の増幅サイクルの後に、 一定の与えられた配列内の１つの配列を増幅することが可能である。このような プライマはどの段階ででも付加することができ、より短い増幅フラグメントを提 供することになる。あるいは、以前に増幅に利用されたプライマと幾分かのオー バーラツプを有しながら非相補的な末端を伴うプライマを用いることにより、さ らに長いフラグメントを調製することができる。 プライマは同様に、生体外変異誘発のために増幅法が用いられる場合に主要な役 割を果たす、利用されるプライマがもとの鋳型と正確に相補的でない増幅反応の 生成物は、鋳型よりもむしろプライマの配列を含むことになり、従って生体並変 異を導く。さらなるサイクルにおいて、この変異は、それ以上いかなる誤対合ブ ライミングも必要とされないことから、効率が低減されることなく増幅されるこ とになる。上述のような変更ＤＮＡ配列を作成する方法は、さらなる配列変更を 誘発するべく異なるプライマを用いて変更ＤＮＡに対して反復して行なうことが できる。このようにして、系列に対して新規に付加する各々のものは、その直前 のものとわずかにしか異ならないがもとのＤＮＡ原始配列とは漸進的に大きく異 なる、一連の変更配列を段階的に生み出すことが可能である。 充分な量のプライマが増幅すべき鎖に対して相補的である１つの配列を含んでい ることを条件として、プライマはその配列の一部として非相補性配列を含むこと ができるため、その他の数多くの利点が実現可能である。例えば、プライマの一 方又は両方の５′末端において、鋳型配列に対し相補的でないヌクレオチド配列 （例えばプロモータ、リンカ−、コード配列など）を付着させ、かくしてこれを 増幅法の生成物に追加させることが可能である。延長プライマが付加された後、 非相補的ヌクレオチドインサートを含む望ましい量の新しい鋳型を達成するため 充分なサイクルが行なわれる。こうして、単純な技術を用いて比較的短かい時間 （例えば２時間以下）内で組合された大量のフラグメントの生産が可能となる。 例えば上述のホスフォトリエステル及びホスフォジエステル方法又はその自動化 された態様といった何らかの適切な方法を用いて、オリゴヌクレオチドプライマ を調製することが可能である。このような自動化されたＬＩＩｐＪの１つにおい ては、出発材料としてジエチルホスホロアミシトが用いられ、これはＢｅａｕｃ ａｇｅｉ、１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　：　 １８５９−１８６２によって記述されているように合成されうる。修飾された固 形支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４ ，４５８．０６６号に記されている。同様に、（制限エンドヌクレアーゼ消化物 などの）生物学的供給源から分離されたプライマを使用することも可能である。 しかしながら、どんなプライマが使用されようとも、反応混合物は、ＰＣＲが起 こるよう１つの鋳型を含んでいなくてはならない、というのも、特定の核酸配列 はその配列を鋳型として含む核酸を用いることによって生産されるからである。 第１の段階には、増幅中の又は検出中の各々の特定の核酸配列について２つのオ リゴヌクレオチドプライマ及び４つの異なるヌクレオシド三燐酸と各々の核酸鎖 を接触させることが含まれる。増幅又は検出すべき核酸がＤＮＡである場合、ヌ クレオシド三燐酸は通常ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰである が、工程中さまざまなヌクレオチド誘導体も同様に使用可能である。例えば、未 知の配列の試料中の既知の配列の検出のためにＰＣＲを用いる場合、１９９１年 ７月２３日付のＰＣＴ出願第９１１０５２１０号（引用によりこの記載を本明細 書に組み入れる）に教示されているように、試料の間の汚染を減少させる目的で 、ｄＴＴＰの代りにｄＵＴＰがしばしば用いられる。 ヌクレオシド三燐酸の濃度は大幅に変化しうる。標準的には、濃度は、増幅用緩 衝液内で各々のｄＮＴＰ中５０〜２００μＭであり、ＭｇＣｌ　！はポリメラー ゼを活化させ反応の特異性を増大させるため１〜３１ＩＭの量で緩衝液中に存在 する。しかしながら、１〜２０ｕＭというｄＮ丁Ｐ濃度が、高い比活性での放射 線識されたプローブの生成又はＤＩＪＡ配列決定といったいくつかの利用分野の ためには好ましいものであり得る。 標的核酸の核酸鎖は、プライマの延長生成物である追加の核酸鎖の合成のための 鋳型として役立つ、この合成は、適切ないかなる方法を用いても行なうことがで きるが、一般に、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは約８のｐＨの纒衝水溶 液内で起こる。合成を容易にするため、鋳型鎖を含む緩衝液に対して２つのオリ ゴヌクレオチドプライマのモル余剰分が加えられる。実際問題として、付加され るプライマの量は、増幅すべき配列が複雑な長連類核酸鎖の混合物内に含まれて いる場合、相補的（鋳型）の量に比ベモル過剰状態にある。 プロセスの効率を改善するためには、大きいモル過剰が好ましい。 従って、１０００：１以上のプライマ対鋳型の比率がクローニングされたＤＮＡ 鋳型に対して一般に用いられ、複雑なゲノミック試料からの増幅については一般 に約１０＠：１以上のプライマ対鋳型比率が用いられる。 次に、鋳型、プライマ及びヌクレオシド三燐酸の混合物を、増幅又は検出すべき 核酸が２本鎖であるか１本鎖であるかに応じて処理する。核酸が１本鎖である場 合、第１の延長サイクルに先立っていかなる変性段階も使用する必要がなく、反 応混合物は、プライマの相補的標的（鋳型）配列に対するハイブリッド形成を促 進する温度に保たれる。このような温度は一般に数秒から５分好ましくは３０秒 から１分の有効時間にわたり約３５℃から６５℃以上好ましくは約３７℃から６ ０℃である　５　’　−３’エキソヌクレアーゼ変異体熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼのためには、３５℃から７０°Ｃのハイブリッド形成温度を用いることがで きる。プライマのハイブリッド形成の特異性を増大させるためには、長さが１５ ヌクレオチド以上のプライマが用いられる。これよりも短かいプライマには、さ らに低いノ＼イブリ・ンド形成温度が必要である。 もとの１本鎖核酸に対する相補体は、通切な緩衝液、ｄＮＴＰｓ及びｌ又は複数 のオリゴヌクレオチドプライマの存在下で本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ を添加することによって合成できる。適切な単一のプライマが付加される場合、 プライマ延長生成物は１本鎖核酸に対し相補的なものとなり、（プライマがどこ で鋳型と）＼イブリフト形成するかに応じて）等しい又は等しくない長さの２本 鎖に核酸鎖のハイブリッド形成することになり、次にこれは上述のように２つの 単一の分離した相補的鎖を生成するべく、−末鎖へと分離されうる。このとき、 もとの−重鎖核酸及び第１のプライマ延長生成物の両方を鋳型として用いて次に 続くプライマ延長サイクルが起こるように、第２のプライマが添加される。ある いは、−重鎖核酸に対し２つ以上の適切なプライマ（そのうちの１つは鋳型とし てその他のプライマの延長生成物を用いる合成をブライミングする）を添加し、 反応を行なわせることができる。 ２末鎖標的の増幅又は−末鎖標的の第２サイクルの増幅の場合のように、核酸が ２本の鎖を含む場合、核酸の鎖はプライマがハイブリッド形成される前に分離さ れなくてはならない。この鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含む、適 切なあらゆる変性方法によって達成されうる。核酸の鎖を分離する好ましい物理 的方法には、完全な（〉９９％）変性が起こるまで核酸を加熱することが含まれ る。 典型的な熱変性には、核酸の組成及びサイズに応じて一般に約数秒から数分まで の時間の約８０°Ｃ〜１５０℃の範囲の温度が関与している。 好ましくは、有効な変性温度は数秒から１分の間で９０℃〜１００°Ｃである。 へりカーゼ活性を有しＡＴＰが存在する中でＤＮＡを変性するものであることが わかっている酵素ＲｅｃＡ又はヘリカーゼとして知られているクラスの酵素のう ちのいずれかの酵素によっても、鎖分離を誘発することが可能である。ヘリカー ゼで核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は、Ｋｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ− Ｂｅｒｌｉｎｇ、　１９７８年Ｃ３Ｈ−ｈ邦旦ぶ刀工ｒ　Ｂｉｔ江岨ｙｊ３　： 　６３によって記述されており、Ｒｅｃ＾を使用するための技術は、Ｒａｄｄｉ ｎｇ、　１９８２年＋　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１６　：４０５ −４３７の中で総説されている。変性は、等しい又は等しくない長さの２つの分 離された相補的鎖を生み出す。 ２本鎖核酸が熱によって変性される場合、反応混合物は、相補的標識（鋳型）配 列に対する各プライマのハイブリッド形成を促進する温度まで冷却される。この 温度は通常、試薬に応じて約３５゛Ｃ〜６５℃以上好ましくは３７゛Ｃ〜６０℃ である。ハイブリッド形成温度は一般に数秒から数分、好ましくは１０秒から１ 分までの有効時間中維持される。実際上は、温度は単に約９５°Ｃから３７°Ｃ まで低下させられ、ハイブリッド形成はこの範囲内の温度で起こる。核酸が一本 鎖であろうと二本鎖であろうと、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、変性 段階より前又は変性段階中又は温度低下中又は温度がハイブリッド形成を促進す るための範囲内にあるときのいずれにでも添加することができる。本発明に基づ くポリメラーゼの熱安定性のため、このようなポリメラーゼをいつでも反応混合 物に付加することが可能になっているが、混合物がストリンジヱントハイブリッ ド形成温度より下に冷却されなくなる時点で反応混合物に対しポリメラーゼを添 加することによって非特異的増幅を実質的に抑制することが可能である。ハイプ リント形成の後、反応混合物は次に、酵素の活性が促進されるか又は最適化され る温度すなわちハイブリッド形成されたプライマ及び鋳型からのプライマ延長生 成物の合成を容易にする上で酵素の活性を増大させるのに充分な温度まで加熱さ れるか又はこの温度に維持される。温度は実際には、各々の核酸鋳型に対して相 補的である各々のプライマの延長生成物を合成するのに充分なものでなくてはな らないが、各々の延長生成物をその相補的鋳型から変性するほど高いものであっ てはならない（すなわち、温度は一般に約８０°Ｃ〜９０°Ｃ未満である）。 用いられる核酸（１又は複数）に応じて、この合成反応のために有効な標準的な 温度は、約４０°Ｃ〜８０゛Ｃ好ましくは５０°Ｃ〜７５°Ｃである。 さらに好ましい温度は、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについて約６５° Ｃ〜７５°Ｃである。この合成に必要な時間は、主として温度、核酸の長さ、酵 素及び核酸混合物の複雑性に応じて、約１０秒から数分以上であると考えられる 。延長時間は通常約３０秒から数秒である。 核酸がさらに長い場合、よた長い時間が相補的鎖合成のために一般に必要とされ る。 新たに合成された鎖及び相補体核酸鎖は、増幅プロセスの次に続く段階で用いら れる２本鎖分子を形成する０次の段階では、２本鎖分子の鎖は、分子を変性させ るのに有効な時間にわたりこのために有効な温度での熱変性によって分離される が、この温度及び時間は、熱安定性酵素が完全にかつ不可逆的に変性されるか又 は不活性化されるようなものではない、この鋳型の変性の後、温度は、上述のよ うに前段階で製造された相補的−重鎖分子（鋳型）に対するプライマのハイブリ ッド形成を促進するようなレベルまで低下させられる。 このハイブリッド形成段階の後又はこの段階と同時に、温度は、新たに合成され た鎖及びもとの鎖の両方を鋳型として用いたプライマ延長生成物の合成を可能に するため熱安定性酵素の活性を促進するのに有効である温度に調整される。ここ でも、温度は上述のように延長生成物をその鋳型から分Ｍ（変性）するほど高い ものであってはならない。ハイブリッド形成はこの段階で起こる可能性があり、 従って前述の変性後の冷却段階は必要でな（なる。このような場合、同時段階を 用いて、好ましい温度範囲は５０°Ｃ〜７０°Ｃである。 鎖の分離、ハイプリント形成及び延長生成物合成の１つのサイクルに関与する加 熱及び冷却段階は、特定の核酸配列を望ましい量だけ生成するのに必要とされる だけの回数反復することができる。唯一の制限は、存在するプライマ、熱安定性 酵素及びヌクレオシド三燐酸の量である。通常１５〜３０サイクルが完全に行な われる。増幅されたＤＮＡの診断検出を目的とする場合、サイクル数は試料の性 質、試料内の初期標的濃度及び増幅後に用いられる検出法の感度によって左右さ れる。一定の与えられた検出感度に対しては、増幅中の試料が純粋でかつ初期標 的濃度が高い場合にはより少ない回数のサイクルしか必要とされない。試料が核 酸の複雑な混合物であり初期標的濃度が低い場合、検出のために充分にシグナル を増幅するには、さらに多くのサイクルが必要となる。一般的増幅及び検出のた めには、この工程が約１５回くり返される。標識された配列特異的プローブで検 出されるべき配列を生成するのに増幅が用いられる場合及びヒトゲノムＤＮＡが 増幅の標的である場合、明らかに検出可能なシグナルが生産されるようすなわち バンクグラウンドが検出を妨害することのないように充分に配列を増幅するため 工程は１５〜３０回反復される。 いかなる主要試薬も枯褐しておらず又酵素が変性又は不可逆的に不活性化された 状態になっていないことを条件として、初期添加の後いかなる追加のヌクレオチ ド、プライマ又は熱安定性酵素も添加する必要はない、なお上記条件のような場 合には、反応が続行するために追加のポリメラーゼ又はその他の試薬を加えなく てはならなくなる。望ましい量の特定の核酸配列を生産するため適切なサイクル 数が完了した後、通常の要領すなわちＥＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳ又はＣＨＣ ｌ３を添加して酵素を不活性化することによって或いは又反応の成分を分離する ことによって反応を停止することができる。 増幅法は連続的に行なうことができる。自動化された方法の一態様においては、 一定の時間中一定のレベルで制御されるべく温度がプログラミングされるような 形で反応混合物を温度循環させることができる。この目的をこのような計器の１ つとしては、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓに より開発され市販されている増幅反応を取り扱うための自動化された機械がある 。この計器でＰＣＲを行なうための詳細な指示事項は、計器購入時点で入手可能 である。 変更された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつ本発明の熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼは、ＰＣＲによる核酸配列の増幅が有用であるさまざまなプロセスに おいて非常に役に立つ、増幅方法は、米国特許第４，８００．１５９号に記述さ れているように適切な表現ベクター内への挿入のため特定の核酸配列をクローニ ングするのに利用することができる。ベクタは、組換えＤＮＡ技術の標準的方法 によって配列の遺伝子生成物を生産するべく適切な宿主生体を形質転換するのに 使用することができる。このようなりローニングには、平滑末端連結を用いたベ クタ内への直接連結、又はプライマ内に含まれている部位で開裂するための制限 酵素の使用が含まれよう。 本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに遺したその他の方法には、米国特許第４ ，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号及び欧州特許公報第２２９，７０ １号；　２３７，３６２号；及び２５８，０１７号に記されているものが含まれ る（これらの記載を引用により本明細書に組み入れる）、さらに、当該酵素は、 非対称ＰＣＲ（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ及びＥ！ｒｌｉｃｈ、　１９８８年、に匹 。 Ｎａｔｌ、　Ａｃ閃、ジ江」竪几工８５　：　７６５２〜７６５６、（本明細書 に引用により組み入しル）を参照ノコと〕　；逆ＰＣＲ（Ｏｃｈ＊ａｎＪＩＬ、 　１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓｌｐ　：　６２１　（本明細書に引用により組 入れる）〕；においても有用であり、又ＤＮＡ配列（Ｉｎｎｉｓ　血、１９８８ 年、ｎ匹、ハｔＬ　Ａｃａｄ＋　鎖ｈグメントを増幅するのに用いられるランダ ムブライミングＰＣ＋？　、及び匹旦塵影工遵１１畦姐」虹ハＩ刻１±１１丑１ 匡■（方法：酵素学方法必携）　（１９９１年’）　２　：　ｐ、１１〜１９で Ｌｏｈ＋　Ｅ−が記述しているようなアンカーＰＣＲ及び連結媒介アンカーＰＣ Ｒといった片側特異性（ｓｒｎｇｌｅｓｉｄｅｄ　５ｐｅｃｊｆｉｃｊｔｙ）を もつＰＣ１ｉ法のためにも有用である。 ５　’　−３’エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが役に立つ もう１つのプロセスは、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（ＰＬＣＲ）と呼ばれる プロセスである。その名が示唆しているように、このプロセスは、ＰＣＲの特徴 とりガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の特徴とを併せもつ。 ＰＬＣＲは一部には、利用されたｄＮＴＰの低濃度（〜工μＭ）が増幅の程度を 制限していた対立遺伝子特異的ＰＣＨの特異性を増大させる技術として開発され たものである。ＰＬＣＲでは、ＤＮＡが変性され、４つの相補的ではあるが隣接 していないオリゴヌクレオチドプライマがｄＮＴＰ、熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼ及び熱安定性リガーゼと共に添加される。 プライマは、非隣接的に標的ＤＮＡにアニーリングし、熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼは非隣接プライマの間の間隙を満たしかくしてプライマを隣接させるべく下 流プライマの３′末端に対する適切なｄＮＴＰの付加をひき起こす。このとき熱 安定性リガーゼは２つの隣接するオリゴヌクレオチドプライマを連結することに なる。 しかしながら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの中に５’−３’エキソヌクレアー ゼ活性が存在することは、このような活性が下流プライマの５′末端からのヌク レオチド又は小さいオリゴヌクレオチドの切除をひき起こしかくしてプライマの 連結を妨げることから、２つのプライマ間の間隙を閉鎖する確率を著しく低下さ せる。従って、ＰＬＣＲにおいては、低下した又は除去された５’−３’エキソ ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが特に有用となる。 簡単に言うと、減少、低下又は除去された５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を もつように変異を受けた本発明の熱安定性１）ＮＡポリメラーゼは、以下に記述 する均質検定技術のような５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を必要とする手順 及び技術を除いて、そのそれぞれの変異を受けていないポリメラーゼと同じ手順 及び技術のために役立つ。さらに、本発明の変異を受けたＤＮＡポリメラーゼは しばしば、固有の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の減少又は除去に基き、手 順及び技術のより効率の良い性能をもたらすことになる。 低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ特異的熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼは、Ｌ徂、垣、ハ匹■、Ｈ並、Ｌｌ、及び里ＤＮＡポリメラーゼの以下の 変異形態を含んでいる。以下の表内及びこの明細書全体を通して、欠失変異は、 欠失を構成する番号付けされたヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいる。 ヌクレオチド配列番号：１の　ｐＴＡＱｄ２−７６ヌクレオチド４−２２８の欠 失 ヌクレオチド配列番号：１の　ｐＴＡＱｄ２−４６ヌクレオチド４−１３８の欠 失 アミノ酸配列番号＝２のアミ　ＭＥＴ−ＰＨＥ４７ノ酸２−４６の欠失　ｍ ヌクレオチド配列番号：Ｉの　ρＴＡＱｄ２−１５５ヌクレオチド４−４６２の 欠失 アミノ酸配列番号：２のアミ　ＭＥＴ−ＶＡＬ１５５ノ酸２−１５４の欠失　加 ヌクレオチド配列番号＝１の　ｐＴＡＱｄ２−２０２ヌクレオチド４−６０６の 欠失 アミノ酸配列番号：２のアミ　ＮＥＴ−ＴＨＲ２０３ノ酸２−２０２の欠失　Ｌ 通 ヌクレオチド配列番号：ｌの　ｐＬＳＧ８ヌクレオチド４−８６７の欠失 ヌクレオチド配列番号：３の　ｐＴＭＡｄ２−３７ヌクレオチド４−１３１の欠 失 アミノ酸配列番号：４のアミ　ＭＥＴ−ＶＡＬ３８ノ酸２−３７の欠失　シ阻 ヌクレオチド配列番号：３の　ｐＴＭＡｄ２−２０ヌクレオチド４−６０の欠失 アミノ酸配列番号：４のアミ　ＭＥＴ−ＡＳＰ２１ノ酸２−２０の欠失　〕リ ヌクレオチド配列番号：３の　ｐＴＭＡｄ２−７３ヌクレオチド４−２１９の欠 失 アミノ酸配列番号：４のアミ　ＭＥＴ−ＧＬＵ７４ノ酸２−７３の欠失　カリ アミノ酸配列番号＝４の　ＭＥＴ１４０アミノ酸１−１３９の欠失　ｂ竪 ヌクレオチド配列番号＝３の　ｐＴＭＡ１５ヌクレオチド１−８４９の欠失 アミノ酸配列番号：４の　ＭＥ７２８４アミノ酸１−２８３の欠失　Ｄリ ハ■Ｕ　ヌクレオチド配列番号：５ 内でＧ（１２８）からＡ アミノ酸配列番号：６内　ＡＳＰ４３ でＧｕｙ（４３）からＡｓ２　ハユＵ ヌクレオチド配列番号：５の　ｐｓＰｓｄ２−４３ヌクレオチド４−１２９の欠 失 アミノ酸配列番号：６の　ＭＥＴ−ＰＨε４４アミノ酸２−４３の欠失　ｎ組Ｕ ヌクレオチド配列番号＝５の　ｐｓＰｓｄ２−７３ヌクレオチド４−２１９の欠 失 アミノ酸配列番号：６の　ＭＥＴ−ＡＬＡ７４アミノ酸２−７３の欠失　ハ■Ｈ ヌクレオチド配列番号：５の　ｐＳＰＳｄ２−１５１ヌクレオチド４−４５３の 欠失 アミノ酸配列番号：６の　ＭＥＴ−ＬＥＵ１５２アミノ酸２−１５１の欠失　ハ Ｌ■ ヌクレオチド配列番号＝５の　ｐｓＰｓｄ２−１９９ヌクレオチド４−５９７の 欠失 アミノ酸配列番号＝６の　ＩＩＥＴ−ＴＨＲ２００アミノ酸２−１９９の欠失　 ハ匹Ｕ ヌクレオチド配列番号＝５の　ｐｓＰｓＡ２８Ｂヌクレオチド４−８６１の欠失 アミノ酸配列番号：６の　ＭＥＴ−ＡＬＡ２８８アミノ＃２−２８７の欠失　ハ 旺Ｈ ＴＺＯ５ヌクレオチド配列番号ニア内 でＧ（１３７）からＡ アミノ展配列番号：８（７）　Ｉ’１ＥＴ−ＶＡＬ１５６アミ／　２−１５５　 ノ欠失　ＴＺＯ５アミノ酸配列番号＝８の　ＭＥＴ−ＴＨＲ２０４アミノ酸２− ２０３の欠失　ＴＺＯ５ アミン淫配列番号：８の　ＭＥＴ−ＡＬＡ２９２アミノ　２〜２９１の欠失　ヌ 並 アミノ酸配列番号：１０の　ＭＥＴ−ＡＬＡ７８アミノ酸２−７７の欠失　１ゆ アミノ酸配列番号＝１０の　ＭＥＴ−ＶＡＬ１５６アミノ酸２−１５５の欠失　 １ゆ アミノ酸配列番号＝１０の　ＭＥＴ−ＡＬＡ２９２アミノ酸２−２９１の欠失　 抛 工　ヌクレオチド配列番号ｚＩＩ内で Ｇ（１１０）からＡ、及びＡ（１１１）からＴアミノ酸配列番号＝１２の　ＭＥ Ｔ−ＴＹＩ？９４アミノ酸２−９３の欠失　Ｄσ アミノ酸配列番号：１２　（７）　ＭＥＴ−ＧＬＵ１４０アミノ酸２−１３９の 欠失　シ」 れた５′→３′エキソヌクレアーゼ“つ　性堕虹ヱユＬ立二亙 本発明のもう１つのＢ様は、それぞれの天然ポリメラーゼのものに比べて強化さ れた又は増大された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼの生成を含む。増加された又は強化された５′→３′エキソヌクレア ーゼ活性を有する本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、１９９１年８月６日 付のＰＣＴ出願出願第９１７０了５７１ 用である（引用により本明細書に組み入れる）。簡単に言うと、この系は、以下 の段階を含む、試料中の標的アミノ酸配列の検出方法である： （ａ）標的核酸の一領域に対して相補的な１つの配列を含むオリゴヌクレオチド 及び同じ標的核酸鎖の第２の領域に対し相補的な１つの配列を含むが第１のオリ ゴヌクレオチドが規定する核酸配列を含まないｉｍ議されたオリゴヌクレオチド と、一本Ｍ核酸を含む試料とを接触させて、ハイブリッド形成条件下で２！鎖の 混合物を生成する段階；なお、ここでこれらの２重鎖は、第１のオリゴヌクレオ チドの３′末端が標識されたオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するように第 １のオリゴヌクレオチド及び標識されたオリゴヌクレオチドにアニーリングされ た標的核酸を含んでいる；（ｂ）ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が 、アニーリングされ、標識されたオリゴヌクレオチドを開裂し標識されたフラグ メントを解放できるようにするのに充分な条件の下に、５′→３′ヌクレアーゼ 活性をもつ鋳型依存型核酸ポリメラーゼと共に段階（ａ）の混合物を維持する段 階；及び （ｃ）標識されたフラグメントの放出を検出し及び／又は測定する段階。 この均質検定系は、標的配列が増幅されている間にシグナルを生成し、かくして その他の検定システムに共通の増幅された生成物の増幅後の取り扱いを最＠限に おさえるものである．さらに、増大した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をも つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの特に好ましい用途は、ＰＣＢ技術を利用する均 質検定系においてである。この特定の検定系には、以下の段階が関与している： すなわち、 （ａ）前記試料を含むＰＣＢ検定に、標的核酸の領域に対し相補的な配列を含む 少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドを提供する段階；なおここでこの標識 オリゴヌクレオチドは段階（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマによって境界づ けされた標的核酸配列内でアニーリングするり （ｂ）−組のオリゴヌクレオチドプライマを提供する段階、なおここで第１のプ ライマは、標的核酸配列の１つの鎖の中の１　９Ｍ域に対し相補的な配列を含み 、相補的ＤＮＡ　ｉ［の合成を起動させ、又第２のプライマは、標的核酸の第２ の鎖内の１頭域に対し相補的な配列を含み、相補的ＤＭＡ鎖の合成を起動させる ；又ここで各オリゴヌクレオチドプライマは、同じ核酸鎖にアニーリングされた あらゆる１ｓｍオリゴヌクレオチドの上流でその相補的鋳型にアニーリングする ように選択されている； （ｃ）（ｉ）標的領域内に含まれている鋳型核酸配列へのプライマ及び８ｍオリ ゴヌクレオチドのアニーリング及び（ｉｔ）プライマの延長というＰＣＲ循環段 階を許容する条件下で鋳型依存性重合剤として５′→３′ヌクレアーゼ活性をも つ核酸ポリメラーゼを利用して標的核酸配列を増幅する段階；なおここで、この 核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が標識オ リゴヌクレオチドとその相補的鋳型核酸配列を含むアニーリングされた２！鎖か ら同時に標識フラグメントを放出して検出可能なフラグメント生成する間に、１ つのプライマ延長生成物を合成する；及び （ｄ）試料中の標的配列の存在又は不在を見極めるため標識フラグメントの放出 を検出し及び／又は測定する段階。 本発明に基づく熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの増大した５′→３′エキソヌクレ アーゼ活性は、均質検定系内で用いられた場合、その大きい方の相補的ポリヌク レオチドにアニーリングされたオリゴヌクレオチドからのモノヌクレオチド又は 小さなオリゴヌクレオチドの開裂をひき起こす、開裂が効率良く起こるためには 、上流オリゴヌクレオチドも同様に、同じ大きい方のポリヌクレオチドにアニー リングされなくてはならない。 この上流オリゴヌクレオチドの３′末端は、核酸ポリメラーゼのための初期結合 部位を提供する。結合されたポリメラーゼが下流オリゴヌクレオチドの５′末端 に遭遇すると直ちにポリメラーゼは、モノヌクレオチド又は小さいオリゴヌクレ オチドをそれから開裂させることができる。 ２つのオリゴヌクレオチドは、それらが相補的標的核酸上で極く近くでアニーリ ングして上流オリゴヌクレオチドの３′末端に対する核酸ポリメラーゼの結合が それを自動的に下流オリゴヌクレオチドの５′末端と接触状態に置くことになる ように設計されうる。この方法は、開裂を完遂するべく核酸ポリメラーゼを所定 の位置にもってくるのに重合が必要とされないことから、「重合非依存性開裂」 と呼ばれる。 あるいは、２つのオリゴヌクレオチドが鋳型核酸標的のより遠く隔離された領域 にアニールする場合、核酸ポリメラーゼが下流オリゴヌクレオチドの５′末端と 遭遇する前に重合が起こらなくてはならない。重合が続行するにつれて、ポリメ ラーゼは下流オリゴヌクレオチドの５′末端からモノヌクレオチド又は小さいオ リゴヌクレオチドを徐々に開裂させる。この開裂は、下流オリゴヌクレオチドの 残りが、鋳型分子から解離する程度にまで不安定化されてしまうまで続く。この 工程は「重合依存性開裂」と呼ばれる。 下流オリゴヌクレオチドに対する標識の取りつけが、開裂されたモノヌクレオチ ド及び小さいオリゴヌクレオチドの検出を可能にす用できる。この要領で、上流 及び下流のオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む核酸試料を識別する ことが可能である。換言すると、ＰＣＨの開始時点でプライマに付随して標識オ リゴヌクレオチドが添加され、プローブの標識ヌクレオチドの加水分解から生成 されたシグナルが標的配列の増幅中の検出のための手段を提供する。 均質検定系の方法においては、問題の特定のオリゴヌクレオチド配列すなわち「 標的核酸」を含んでいる疑いのある試料が提供される。試料中に含まれている標 的核酸はまず必要とあらばｃＤＮＡに逆転写され、次に、当業者にとっては周知 の物理的、化学的又は酵素的手段を含む適当なあらゆる変性方法を用いて変性さ れうる。鎖分離のための好ましい物理的手段には、完全に（〉９９％）変性され るまで核酸を加熱することが含まれる０代表的な変性には、数秒から数分に至る までの時間、約８０°Ｃから約１０５°Ｃまでの温度が関与する。 変性に対する１つの代替法として、標識核酸は、例えば−末鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ ウィルスといったように試料中に一本鎖形態で存在する可能性がある。 この場合、変性された核酸鎖は、単一の核酸鎖へのプライマ及びプローブの結合 を可能にする条件であるハイブリッド形成条件下で、予め選択されたオリゴヌク レオチドプライマ及び標識オリゴヌクレオチド（ここでは、「プローブ」として も言及されている）と共に保温される。当該技術分野において良（知られている ように、プライマは、その２重鎮配列に沿った相対的位置が、１つのプライマか ら合成された延長生成物がその鋳型（相補体）から分離された時点でその他のプ ライマの延長のための鋳型として役立ちかくして規定の長さの復製鎖生成するよ うに選択される。 相補的鎖はプローブ又はプライマのいずれよりも長いことから、鎖はより多（の 接触点をもち、従って与えられたいかなる時間にわたっても互いを見い出す確率 がさらに高（なっている。高いモル余剰のプローブ、及びプライマは、鋳型の再 アニーリングよりもむしろプライマ及びプローブのアニーリングの方へ平衡を傾 かせる一助ブライマは、重合剤が存在する中で延長生成物の合成を起動するのに 充分な長さをもっていなくてはならない。プライマの正確な長さ及び組成は、ア ニーリング反応の温度、プライマの供給源及び組成、プライマアニーリング部位 までのプローブアニーリング部位の近接性及びプライマ対プローブ濃度の比率を 含む数多くの要因によって左右される６例えば、標的配列の複雑性に応じて、オ リゴヌクレオチドプライマは標準的に約１５〜３０個のヌクレオチドを含んでい るが、１つのプライマがそれ以上又はそれ以下のヌクレオチドを含むこともでき る。プライマはそのそれぞれの鎖に選択的にアニーリングし、安定した２重鎖を 形成するだけの充分な相補性を有していなくてはならない。 ここで用いられるプライマは、増幅すべき各特定の配列の異なる鎖に対して「実 質的に」相補的となるように選択される。プライマは、鋳型の正確な配列を反映 している必要はないが、そのそれぞれの鎖に選択的にハイブリッド形成するのに 充分な相補性を有していなくてはならない。非相補的塩基又はより長い配列をプ ライマの中に点在させたり又はプライマの端部に位置づけすることも可能である が、この場合、プライマが鋳型鎖と安定した２重鎖を形成するのに充分な相補性 をこの鋳型鎖との間に保持していることを条件とする。プライマの非相補性ヌク レオチド配列は制限酵素部位を含んで性が標識オリゴヌクレオチドフラグメント を開裂及び放出するのを可能にしなくてはならない。 できる。重合非依存性工程については、プローブの５′末端がプライマの３′− 末端から比較的遠くなりかくしてプローブにはブライ分に安定したハイブリッド 複合体を形成するのに比較的低い温度しか必要としない。従って、標識オリゴヌ クレオチドがプライマアニーリングとの関係において比較的高い温度で標的に優 先的にアニーリングするように、標識オリゴヌクレオチドをプライマよりも長く なるように設計することが可能である。 有量ひいてはプライマよりも大きい熱安定性をもつように、標識オリゴヌクレオ チドのヌクレオチド組成を選択することが可能である。 同様のやり方で、天然の核酸の中に典型的に存在する塩基よりもさらに安定した 塩基対を形成する塩基類似体を含む変更されたヌクレオチドをプローブの中に取 り入れることが可能である。 当該検定の効率を最大限にするためプライマ結合に先立ってプローブ結合を容易 にすることのできるプローブの変更としては、プローブと標的のポリアニオンバ ックボーンの相反を減少させるためのプローブ内への正に帯電した又は中立のホ スフォジエステル連鎖の取込み、（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　亘、１９８８年、Ｊ、 　Ａｅａｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、υ瓜：４４７０を参照）；塩基の積み重 ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を増大させるための、プローブ内への５−ブロモウリジ ンのごときアルキル化又はハロゲン化された塩基の取込み；増大した塩基の積み 重ねをもつｒ　Ａ　Ｊ構造へとプローブ対標的の２重鎖を強制するための、プロ ーブ内へのりボヌクレオチドの取込み；及びプローブ内でのアデノシンの一部分 又は全てに対する、６−ジアミツプリン（アミノアデノシン）の置換が含まれる 。本発明に基づくこのような変更されたプローブを調製するにあたっては、２重 鎖形成の律速段階が「核形成」つまり単一の塩基対の形成であり、従って望まれ る結果を達成するためには例えば３′又は５′末端部分のみといったようにプロ ーブの一部分の生物物理学的特性を変えるだけで充分であるということを認識す べきである。さらに、プローブの３′末端部分（３′末端の８〜１２ヌクレオチ ド）がポリメラーゼによる５′末端のエキソヌクレアーゼ分解の後で解離するこ とから、３′末端の変更はポリメラーゼ／ヌクレアーゼ活性との干渉に関わり無 く、行なうことができる。 標識オリゴヌクレオチド及びプライマの異なる熱安定性を利用するべく、熱循環 パラメータも同様に変動させることができる。例えば、熱循環における変性段階 に続いて、標識オリゴヌクレオチドの結合には許容されるがプライマ結合には許 容されない中間温度を導入することが可能であり、この場合、温度はプライマの アニーリング及び延長を可能にすべくさらに低下させられる。しかしながら適当 な結果を得るためには、後のＰＣＲ法のサイクルにおいてのみプローブ開裂が起 こる必要があるという点に留意されたい。従って、後のサイクルにおいてプロー ブが優先的にプライマに結合するようたとえプライマが当初優先的にプローブに 結合しようともプライマ濃度がプライマ延長を通して減少されるような形で、反 応混合物を設定することが可能である。 プライマの前に標識オリゴヌクレオチドの結合に有利に作用するためには、プラ イマ濃度に対する標識オリゴヌクレオチドの高いモル過剰も使用することができ る。この態様においては、標識オリゴヌクレオチド濃度は、典型的に、一般に０ ．５〜５Ｘ１０−’Ｍであるそれぞれのプライマ濃度よりも約２〜２０倍高い範 囲内にある。当業者であれば、オリゴヌクレオチド濃度、長さ及び塩基組成が各 々、反応混合物内のいずれかの特定のオリゴヌクレオチドのＴｇ＋に影響を及ぼ す重要な要因であることを認識することができる。これらの要因の各々は、プラ イマアニーリングよりもプローブアニーリングに有利に作用するため熱力学的偏 りを作り出すように操作されうるちのである。 当然のことながら、増幅が関与しない系に対して、均質検定システムを適用する こともできる。実際、本発明は、重合が起こることを必要とさえしていない。重 合非依存性の系のもつ１つの利点は、標的配列の増幅の必要性を無くするという 点にある。プライマ延長が存在しない場合、標的核酸は本質的に一本鎖である。 プライマ及び標識オリゴヌクレオチドが標的核酸に対し隣接して結合されている ことを条件として、オリゴヌクレオチドのアニーリングと標識フラグメントの開 裂の逐次的ラウンドが起こりうる。従って充分な量の標識フラグメントを生成す ることができ、かくして重合が無い状態での検出が可能となる。当業者であれば わかるように、ＰＣＲ増幅中に生成されたシグナルはこの重合非依存性活性によ り増大されうる。 上述の均質検定系に加えて、強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をも つ本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは同様に、Ｐｃｔ？プライマの１つが標 的配列のＲＮＡコピーを作製するのに用いられるプロモータをコードするような 転写増幅系のごときその他の増幅系においても有用である。同様にして、本発明 は、全て単一の温度でその後ＤＮＡコピーを作製するのに使用されることになる ＲＮＡ転写物を作るのにさまざまな酵素を用いる自己保持配列複製（３ＳＲ）系 においても使用することができる。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつポ リメラーゼを適切なオリゴヌクレオチドと共にリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）シス テム内に取込むことにより、ＬＣＲ生成物を検出するのに本発明を利用すること もできる。 同様に、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＰＬ ＣＲにおいて役立つのとちょうど同じ様に、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性 をもつその他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも異なる状況下でＰＬＣＲにおいて 役に立つ、このことは、ＰＬＣＲにおける下流プライマの５′尾部が標的ＤＮＡ に対して非相補的である場合にいえることである。このような非相補性は、上流 プライマの５′末端が通常標的ＤＮＡにアニーリングすることになるフォーク状 構造をひき起こす。 熱安定性リガーゼはこのようなフォーク状構造に対して作用できない、しかしな がら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の存 在は上流プライマのフォーク状５′尾部の切除をひき起し、かくしてリガーゼが 作用できるようにする。 低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼを調製するのに効果的であるものとして以上に記述されている同じプロセス及 び技術は、強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼを調製するためにも同様に有効である。上述のように、これらの 方法は、部位特異的変異誘発、欠失変異誘発及び「ドメイン・シャフリング」と いった技術も含んでいる。 強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼを調製する上で特に有用なのは、上述の「ドメイン・シャフリング」技法であ る。簡単に要約すると、この技術には、そのポリメラーゼの非常に活発な５′→ ３′エキソヌクレアーゼ活性をコードするものとして認められているポリメラー ゼの特定のドメインの開裂及びその後このドメインをさらに低いレベル又はゼロ レベルの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードする第２の熱安定性ＤＮＡ ポリメラーゼ遺伝子の適切な部域内へと移送することが含まれる。望まれるドメ インは、第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの望ましくない特性をコードするド メインに置き換わることができ、又第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのヌクレ オチド配列に付加することもできる。 約２９１〜４８４のコドンを含むＴｅａ　ＤＮＡポリメラーゼコード配列がＴｇ ｑ　ＤＮＡポリメラーゼエコトン２８９〜４２２の代りに使用されている特定の 「ドメインシャツリング１例が上に記されている。この置換は、Ｔ３３　ＤＮＡ ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼドメイン（コドンｌ〜２８９）、 Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼ３′→５′エキソヌクレアーゼドメイン（コドン２ ９１〜４８４）及びＴ！ＡＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼドメイン（ コドン４２３〜８３２）を含む新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生み出す、 しかしながら、当業者であれば、強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性 のごときいくつかの望まれる特徴をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを構築する ためにその他の置換も行なうことができるということが認識できることだろう。 以下の例は、例示を目的としてのみ提供されているものであり、請求されている 発明の範囲を制限する意図は全（無いものである。 これらの例において、全ての百分率は、相反する規定のないかぎり、固体の場合 重量百分率であり、液体の場合体積百分率であり、全ての温度は摂氏温度で示さ れている。 既知の５′→３′エキソヌクレアーゼドメインの無作為突然変異ＲＣＲ誘発によ る−ＨＤＮＡポリメラーゼの５′→３′工キソヌクレアーゼ突然変異体の調製 エヱ土二上虫慮１ ＰＣＨのための鋳型としてプラスミドｐＬｓＧ１２を用いた。このプラスミドは 、配列番号：１のＬ阻ポリメラーゼ遺伝子ヌクレオチド６１６〜６２１がＡＡＧ ＣＴＴからＡＡＧＣＴＧに変えられたｐＬＳＧ５の肛門■マイナスヴ７−ジッン である。この変化により、コードされるタンパク質配列を変更することなく加ポ リメラーゼ遺伝子内でｔｌｉｎｄ　［１認識配列が削除された。 プライマとしてオリゴヌクレオチドＭＫ６１　（ＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣ ＣＡＣＡＣＡＣＣ）（配列番号：２１）及びＲＡＯＩ　（ＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣ ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧ）　（配列番号＝ ２２）を用い鋳型としてｐＬｓＧ１２用いて、−狙ボリメラーゼ遺伝子のＡＴＧ 出発（コドン）を含む３８４ｂｐフラグメントならびにＡＴＧ出発コドンの下流 のコード配列の追加の３３１ｂｐを増幅するため、ＰＣＲを行なった。 以下の製剤及び反応物を以下の量だけ用いて、１００μ２のＰＣＲをプライマｈ に６１（配列番号：　２１）　５０ｐｓｏｌ　；プライマＲＡＯＩ　（配列番号 ：　２２）　５０ｐｓｏｌ　；各ｄＮＴＰ５０μＭ； トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３，１０５Ｍ　；ＭｇＣ１ｚ　１．５ｍＭ　； ｐＬｓＧ１２．７５．６ｐｇ　； 次にＰＣＩ＋生成物をクロロホルムで抽出し、当該技術分野にお０てた（３０μ ｌの反応中）、この一連の消化は、クローニングのための化することによって、 ベクタを調製した。この消化の後で続けて１２μｌ添加し、４５分間６５°Ｃで 保温することによりホスファターゼを不活性化した。 上述のホスファターゼ処理されたベクタ２２５ｎｇをＩＯｎｇのＰＣＲｔｘ導さ れたインサートと１＝１のモル比で連結した。 次に、ＤＧ１１６細胞を連結混合物の５分の１で形質転換し、３０’Ｃでアンピ シリン耐性形質転換体を選択した。０Ｄｂｏ。０．７に至るまで３０°Ｃで一晩 適切なコロニーを増殖させた。ＰＬベクタを含む細胞を３７゛Ｃで４時間、９時 間又は２０時間、振とう水浴内で保温し、調製物を音波処理し、０．２Ｍの硫酸 アンモニウムが存在する中で７５℃で熱処理した。最後に、ポリメラーゼ活性及 び５′→３′エキソヌクレアーゼ活性について抽出物を検定した。 上述の５′→３′エキソヌクレアーゼ検定を利用して５′→３′エキソヌクレア ーゼ活性を数量化した。具体的に言うと、ガンマ−（”Ｐ　）　ＡＴＰ（３００ ０Ｃ：　ｌｍ５ｏｌ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端にお いて、合成３′リン酸化オリゴヌクレオチドプローブ（ポリメラーゼ延長を排診 するためリン酸化されたもの）ＢＷ３３（ＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＣ ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＰ’）　（配列番号：　１３）　（１００ｐ ｍｏｆ）をｚｉｐ標識した０反応混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミ ルアルコールで抽出しその後続けてエタノール沈澱させた。 ｎＰ標識したオリゴヌクレオチドプローブを１００μｌのＴＥ緩衝液内に再溶解 させ、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラム上でのゲルろ過クロマトグラフ ィにより、取込まれなかったＡＴＰを除去した。、１０１１？ｌのトリス−ＨＣ Ｉ　＜ｐＨ８，３）、５０ＭＨのＭＣＩ　、及び３ｓＦのＭｇＣｌｆｆ１を含む １００ｔｌＩ！、の反応において５　ｐｏｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライ マＢＷ３７　（ＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣ Ａ）（配列番号＝１４）の存在下で、５ｐｍｏ＋の３２μｌＭ識されたＢＩＩ１ ３３プローブを、５ｐｓｏｌの一本鎖Ｍ１３ｍｐｌＯＷ　ＤＮＡに７ニーリング させた。アニーリング混合物を５分間９５℃まで加熱し、１０分にわたって７０ °Ｃまで冷却し、さらに１０分間７０°Ｃで保温し、次に３０分にわたりＰｅｒ ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーマルサイクラ−の中で２５°Ｃに なるまで冷却した。ｌＯμ尼のアニーリング混合物を含むエキソμ２付加するこ とによって停止させた。反応生成物をホモクロマトグラフィによって分析し、エ キソヌクレアーゼ活性をオートラジオグラフィに従って数量化した。Ｐｏｌｙｇ ｒａｍ　ＣＥＬ３００ＤＥＡＥセルロース薄層クロマトグラフィ板上で７Ｍの尿 素内に２％の一部分加水分解された酵母菌ＲＮＡを含むホモクロマトグラフィ混 合液の中でクロマトグラフィを行なった。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の 存在は小さい２ｔｐＩａ識されたオリゴマの生成をひき起こし、このオリゴマは ＴＬＣ板を上へと移動し、原点に残った分解していないプローブからオートラジ オグラム上で容易に区別された。 クローン３−２は、予想されたレベルのポリメラーゼ活性を有していたが、５′ →３′エキソヌクレアーゼ活性はほとんど検出不可能であった。これは、天然Ｔ ｇ（ＤＮＡポリメラーゼの中に存在するものに比べ、５′→３′エキソヌクレア ーゼ活性について１０００分の１以上の減少に相当した。 このクローンを次に配列決定し、Ｇ（１３７）がＤＮＡ配列内でＡに変異してい ることがわかった。この変異は、Ｌ瓜ＤＮＡポリメラーゼノアミノ酸配列におい てＧｔｙ（４６）からＡｓｐへの変異をひき起こし、かくして著しく低下した５ ′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを もたらした。 回収されたタンパク質は、１９９０年５月１５日付出願の米国特許出願第５２３ ，３９４号（引用により本明細書に組み入れる）の中で教示されている論ＤＮＡ ポリメラーゼプロトコールに従って純化させた。 夛１乙 ？ａ　ポリメラーゼのＭｅ　ｔ２８９　Δ２８９）５４４アミノ　ノ　の１９９ ０年５月１５日に提出された米国特許第５２３，３９４号の例９に示されている ように、天然筆ポリメラーゼの精製中に、７０℃でｄＮＴＰＯ鋳型依存型組込み を触媒する変更形態のｍポリメラーゼが得られた。この変更形態のｍポリメラー ゼは、免疫学的に言うと、精製された天然ｍポリメラーゼのおよそ９０ｋｄの形 態と関係あるものであったが、分子量はそれよりも低いものであった。５ＤＳ− ＰＡＧＥ電気泳動に従ったＢＳＡ及びオバルブミンとの関係における移動度に基 づくと、この形態の見かけの分子量は約６１ｋｄである。酵素のこの変更態様は 、５Ｏ５−ＰＡＧＥウェスタンプロット分析法或いは又５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電 気泳動法に従った原位置ＤＮＡポリメラーゼ活性測定（Ｓｐａｎｏｓ、　Ａ−＋ 及びＨｕｂｓｃｈｓｒ、　Ｕ、　（１９８３年）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　９１ 　：　２６３−２７７）によって決定されるようにテルムス・アクアチフス（Ｔ ｈｅｒｍｕｓ　凹彫工国姐）細胞の入念に調製された粗抽出液の中には存在しな い、この形態は、試料の取り扱いの間に生じうるタンパク質分解の人工産物であ ると思われる。この比較的低い分子量の形態は、均質になるまで精製され、ＡＢ Ｉ　自動気相シーケンサ上でＮ末端配列決定が行われた。得られたＮ末端配列を 旭ポリメラーゼ遺伝子から予想されるアミノ酸配列（配列番号：１）と比較する と、この比較的短かい形態がＧｌｕ（２８９）　とＳｅｒ　（２９０）の間のタ ンパク質分解による開裂の結果として生じたものであることがわかる。 ５４４アミノ酸の合成を誘導するＬｕポリメラーゼ遺伝子のさら末端が切除され た形態を得るためには、−次翻訳産生ブラスミドｐＦＣ５４・ｔ　、　ｐｓＹｃ １５７Ｂ及び相補的合成オリゴヌクレオチドＤＧ２９（５′−＾ＧＣＴＴＡＴＧ ＴＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＴ）　（配列番号＝２３）及びＤＧ３０　（５’−ＡＧ ＣＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＡ）　（配列番号：２４）を用いた。肛嵯■及び石 旧を用いてプラスミドｐＦＣ５４・ｔの完全消化を行った。プラスミドｐｓＹｃ １５７８を影＋ｔＸＩで消化しく配列番号：１のヌクレオチド８７２〜８８３に おいて）、４種類のｄＮＴＰの全ての存在下で大腸菌ＣＥ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡ ポリメラーゼＫｌｅｎｏ−ラグメントで処理することによりヌクレオチド３′粘 着末端を除去し、そしてＬｉポリメラーゼ配列内にＬｅｕ２９４をコードするＣ ＴＧ末端の２重鎖鈍端を生成せしめた（ＴａｑポＩＪメラーゼ配列番号：１ヌク レオチド８８０−８８２を参照）　、　ＤＮＡ試料をＢａ１ｌＩを用いて完全消 化を行い、アガロースゲル電気泳動法と電気溶出法によっておよそ１．６ｋｂの ＢｓｔＸＩ（修復されたもの）／ｆｉｄ　Ｉ［ＬＪ　ＤＮＡフラグメントを精製 した。ｐＦＣ５４，ｔプラスミド消化物（０，Ｌｐ−ｏｌｅ）をＬｉポリメラー ゼ遺伝子フラグメント　（０，３ｐｍ＋ｏｌｅ）及びアニーリングされた非リン 酸化ＤＧ２９／ＤＧ３０２重鎖アダプタ（０，５ｐｍｏｌｅ）と３０ｕｇ／■ｌ 、１５℃で一晩、粘着性リガーゼ条件の下で連結した。　ＤＮＡを１１あたり約 １０マイクログラムまで希釈させ、平滑末端条件下で連結を続行した。連結され たＤＮＡ試料をμ＋ａｌで消化し、あらゆるＩＬ−２ミユーテインコード連結生 成物を線状化（不活性化）した、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２菌株ＤＧ１ １６をアンピシリン耐性へと形質転換するため、８０ナノグラムの連結され消化 されたＤＮＡを使用した。ＥｃｏＲＩ（４，７８１ｂｐ　＋　２．３８６ｂｐ） 　、匡Ｉ　（４，１３８ｂｐ＋３，０２９ｂｐ）、幻徂Ｉ　（７，１６７ｂｐ　 ）及び肛岨■／匡１　（３，４００ｂｐ＋３，０２９ｂｐ　＋７３８ｂｐ）で予 想された消化生成物を生成するおよそ７．１７Ｋｂのプラスミドの存在について 、Ａ■ｐ　１候補をスクリーニングした。候補プラスミドを宿す大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）コロニーを、約６１ｋｄのＴａｑポリメラーゼ関連ポリペプチドの温 度誘導性合成について、シンクロコロニー免疫プロット法によってスクリーニン グした。さらに、５′　λＰＬプロモータ：　Ｔａｑ　ＤＮＡ連結部及び３　’ 　Ｔａｑ　ＤＮＡ　：　ＢＴ　ｃｉＪＬＰＰＥ連結部において、候補プラスミド をＤＮＡ配列決定に付した。意図されたＤＮＡ配列をコードし温度誘導可能な６ １ｋｄのＬａポリメラーゼ関連ポリペプチドの合成を誘導するプラスミドの１つ を、ｐＬＳＧ６８と称した。 ６１ｋＤａのＴａＰｏｌｌの ｐＬＳＧ８を含む培養物を、米国特許出願第５２３，３６４号で教示され以下の 例３に記されているように増殖させた。　６１ｋＤａのＬ狙Ｐｏｌ　Ｉは、４１ ゛Ｃでの熱誘導の時点で分解しないように思われる。４１°Ｃで２１時間の後、 ｐＬＳＧ８を宿す培養物からの熱処理された粗抽出液は、粗抽出液タンパク質１ ｗＨにつき１２３１０単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、これは未 誘発培養物に比べ２４倍の増大に当たる。２１時間、３７゛Ｃで誘導されたｐＬ ＳＧ８培養物からの熱処理された抽出液は、粗抽出液タンパク質ｌａｇあたり９ ５０３年位の活性を有していた。３７°Ｃで５時間と２１時間の誘発の間では、 Ｌ咀Ｐｏｌ　Ｉの蓄積レベルにおいて９倍の増加が見られ、４１°Ｃでは５時間 と２１時間の誘発の間でほぼ４倍の増大が見られた。同じ全タンパク質及び熱処 理された抽出物を５Ｏ３−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルの各レーンに対して ２０ｔｔｇの粗抽出液タンパク質又は２０μｇの粗抽出液タンパク質からの熱処 理された粗抽出液を適用した。１７°Ｃ及び４１゛Ｃの２１時間誘導された全タ ンパク質レーンの両方に容易に見られる主要バンドは、その熱処理されたものと 等しいほどに強いものである。３７°Ｃ及び４１℃の２１時間試料から得られた ２０μｇの全タンパク質より熱処理された粗抽出液は、それぞれ熱安定性ＤＮＡ ポリメラーゼ活性を１８６単位及び２４３単位含んでいる。ＰＣＩＩＩにおける ６１ｋＤａのＬ通ＤＮＡポリメラーゼのを用性を見極めるため、ｐＬＳＧＨの誘 導された培養物からの熱処理された粗抽出液を用いてＰＣＲ検定を行なった。　 ＰＣＲにおける全長Ｔ３　Ｐｏｌ　１の供給源として、ｐＬｓＧ５の誘導された 培養からの熱処理された粗抽出液を用いた。末端切除酵素４単位及び２単位を使 用した反応においてＰｃｔ？生成物が観察された。全長酵素反応物のいずれにお けるよりもこれらのＰＣＨにおいてより多くの生成物が存在していた。さらに、 非特異的なより分子量の高い生成物は全く見えなかった。 ６１ｋＤａのＴａＰｏｌｌの　１ 誘導されたｐＬＳＧ８／ＤＧ１１６細胞からの５１ｋＤａのＬｕＰＯＩＩの精製 （よ、幾分かの修正は加えたが１９９０年５月１５日付の米国特許第５２３．３ ９４号の例１におけるように全長Ｔ！ＡＰｏｌ　Ｉの生成と同様に推移した。 誘導されたｐＬＳＧ８／ＤＧ１１６細胞（１５，６ｇ）を、１９９０年５月１５ 日付米国特許第５２３，３９４号及び以下の例３で記されているように均質化し 溶菌させた０分画■は、１．８７　ｇのタンパク質及び１．０４７Ｘ１０ｂ単位 の活性を含んでいた。０．２Ｍの硫酸アンモニウムの上澄みとして得られた分画 ■は、７４＋ｗｌ中１．８４　ｇのタンパク質及び１．２８Ｘ１０’単位の活性 を含んでいた。 熱処理に続いて、０．７％になるまでゆっくりとＰｏ１ｙ■ｉｎ　Ｐ　（ｐＨ７ ，５）を添加した。遠心分離の後、上澄み、分画■は１５５＋＋ｇのタンノイク 質と１．４８Ｘ１０”単位の活性を含んでいた。 分画■を１０ｍ１／ｃｄ／時で１．１５Ｘ　３．１ｃｍ　（３，２ｍ１）のフェ ニルセファロースカラム上に負荷した。適用された活性の全てがカラム上に保持 されていた。カラムをまず１５ｍ１の平衡緩衝液で洗浄し、次にＴＥ中５　ｍｌ 　（１，５力ラム体積）の０．１ＭＫＣｌで洗浄した。　２０％のエチレングリ コールを含むＴＥ中で２Ｍの尿素でポリメラーゼ活性を溶出させた。 ポリメラーゼ活性を伴う分画（各々０．５　ｍｌ）をプールしく８．５＊１）、 ０．１ＭのＭＣＩを含むヘパリンセフ１０−ス緩衝液中で透析した。透析した材 料、分画ＩＶ　（１２，５ｍ１）は、５．６３ｍｇのタンパク質と１．２９Ｘ１ ０”単位の活性を含んでいた。 分画■を、上述のように平衡された１、０■ｌのベッド体積のへツマリンセファ ロースカラム上に負荷した。カラムを６■ｌの同じ緩衝液（Ａｚｅｏ、ベースラ インまで）で洗浄し、同じ緩衝液中１５１１の直線０．１〜０．５ＭのＭＣＩ勾 配で溶出した。　０．１６Ｍと０．２７Ｍの間のＭＣＩにより溶出する分画（０ ，１５ｍ１）を５Ｏ５−ＰＡＧＥで分析した。約４７ｋＤａの少量の（〈１％） 汚染タンパク質が５１ｋＤａの−ＨＰｏ１ｌと同時精製された。　０．１６５Ｍ と０．２５５Ｍの間のＭＣＩで溶出する分画をプールし、２．５Ｘの保存緩衝液 中でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０膜上でダイアフィルトレージランした０分画Ｖは２ ．８ｇ１ｇのタンパク質及び１．０３３Ｘ１０一単位の６１ｋＤａ−狙Ｐｏｌ　 Ｉを含んでいた。 した６１ｋＤａの丁ａ　ＰＯＩＩ　いるＰＣｌｌＯ，５ｎｇのラムダＤＮＡ　、 各々１０ｐ置ｏ１の２つのラムダ特異的プライマ、を行なった。比較として、２ １ＭＭのＱｇＣｌ　ｚ及び５０５ＭのＫＣＩの置換を伴って上述のように全長Ｔ ３３　Ｐｏｌ　Ｔ　１．２５単位を用いてＰＣＲ反応を行なった。熱循環条件は 、９５°Ｃで１分、６０℃で１分を２３サイクル、そして最後の５分の延長時間 は７５°Ｃであった。−回の反応あたりのＤＮＡの量をＨｏｅｃｈｓｔ螢光染色 素検螢光染色素化定法。全長Ｔ３３　Ｐｏｔ　１（１，４Ｘ　１０’倍の増幅） の場合の０．１０ＭｇのＤＮＡと比べて６１ｋＤａのＤ５Ｐａｌ　Ｉ　（２，２ Ｘ１０’倍増幅）の場合１．１１ｇｇの生成物が得られた。 ６１ｋＤａのＴａＰ０１■の ＰＣＲを模倣した緩衝液条件下で、組換え型９４ｋＤａの７ｇ５（Ｐｏｔ　Ｔ及 び６１ｋＤａ　Ｔ！ＡＰｏｌ　Ｉの定常状態熱不活性化を行なった。９４ｋ［ｌ ａのｍＰａ１　ｌは９７．５°Ｃで約９分の見かけの半減期を有し、一方６１ｋ ＤａのｍＰｏ１　ｒの半減期は、約２１分であった。５１ｋＤａのＴｇｇ　Ｐｏ ｌ　ＩＯ熱不活性化は、０〜５ｈＭの範囲にわたりＭＣＩ　濃度によって影響さ れなかった。 プラスミドｐＦＣ８５ａ〜２．６８ｋｂのＨｉｎｄｎＩ　−損料７１８フラグメ ント内に含まれたさらにもう１つの末端切除加ポリメラーゼ遺伝子を、ＡＴＧ開 始コドンに対し、Ｔａｑ　Ｌ辻遺伝子をコードするアミノ末端Ｈ４ｎｄｌＩ［制 限部位を作動的に連鎖させることによって例えばプラスミドＰＰＬＮＩＩＯＡＴ Ｇを用いて発現させることができる。発現時点でこの融合生成物は〜７０，００ ０−７２，０００ダルトンの末端切除ポリメラーゼを生成する。 この特定の構成は、Ｉ（ｉｎｄｆｆｌでプラスミドｐＦｃ８５を消化させ、ｄＡ ＴＰ及びｄＧＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理することによって 作ることができる。得られるフラグメントは、−末鎖拡張を全て除去するためＳ １ヌクレアーゼでさらに処理され、生じたＤＮＡは幻」７１８で消化され、４つ のｄＮＴＰ全てが存在する中でＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理される６回収さ れたフラグメントは、影にＩで消化されＡＴＧ平滑末端を構成するぺ＜　ｄＧＴ Ｐの存在下でＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理された脱リン酸されたプラスミド ＰＰＬＮｌ１３　ＡＴＧに対してＴ　４　［ＩＮＡリガーゼを用いて連結されう る。この連結混合物は次に大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）ＤＧ１１６を形質転換する ために用いることができ、形質転換体は塗ポリメラーゼの生産のためにスクリー ニングされる０発現は、ウェスタン免疫プロット分析及び活性分析によって確認 することができる。 班主 １　．５′→３′エキソヌクレアーゼ　Ｔａ＋ａポリメー−ゼ？ＩＥＴ２８３の 　び 天然Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−２８３が欠けている５′→３′ 工キソヌクレアーゼ欠損ＴｍａＤＮＡポリメラーゼを発現させるために、以下の 段階を行なった。 プラスミドｐＴ＋＋ａ１２−１を８ｇ４Ｈｒ　（ヌクレオチド位置８４８）及び Ｈｒｎｄｍ（ヌクレオチド位置２６２９　）で消化した。アガロースゲル精製に より１７８１塩基対フラグメントを分離した。　ＤＮＡからアガロースを分離す るために、望ましいフラグメントを含むゲル切片を、Ｃｏ５ｔａｒ　５ｐｉｎｅ ｘフイルタユニツト内で一２０°Ｃで凍結させた。室温で解凍した後、マイクロ 遠心分離器内でユニットを回転させた。ＤＮＡを含むろ液を５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ 濃縮器の中で濃縮し、ＤＮＡをエタノール沈澱した。 及びＦｌｆｎｄｌでの消化によってプラスミドｐＴｍａ１２−１から切り出され た全長フラグメントと同じ粘着末端を有する。消化されたプラスミドと分離され たフラグメントとの連結はフラグメントスイッチをひき起こし、ｐＴｍａ１４と 呼称されたプラスミドを作製するのに用いられた。 類似の方法で、同じ分離されたフラグメントをｐＴｍａ１３にクローニングする ことによりプラスミドｐＴｗａ１５を構成した。ｐＴ…ａ１４の場合と同様に、 ｐＴｍａ１５は、天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１から２８３が欠 如したポリメラーゼの発現を駆動する：未変性コード配列の位置２８４でメチオ ニンコドンにおいて翻訳が開始する。 ｐＴｍａ１４及びｐＴｍａ１５の発現プラスミドは両方共高いレベルで、約７０ ｋＤａの分子量の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の無い生物学的に活性な熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼを発現した；プラスミドｐＴｍａ１５は、ｐＴｍａ１ ４より高いレベルでポリメラーゼを発現した。３′→５′エキソヌクレアーゼ活 性にとってきわめて重要である３つのドメイン全てにおけるアミノ酸配列モチー フの保存、エキソヌクレアーゼ活性にとってきわめて重要な第１のドメインに至 るまでのアミノ末端からの距離、及び発現されたタンパク質の長さといった大腸 菌ソヌクレアーゼ又はブルーフリーディング活性を示すが５′→３′エキソヌク レアーゼ活性が欠如している。初期ＳＯ５活性ゲル検定及び３′→５′エキソヌ クレアーゼ活性についての溶液検定は、プラスミドｐＴｍａ１５を宿す大腸菌（ Ｅ、　ｃｏＨ）宿主細胞によって発現されたポリメラーゼのブルーフリーディン グ活性のレベルの低下を示唆する。 ラスコには、トリプトン（２０ｇ／／り、酵母菌抽出物（Ｌｏｇ／ｊり、ＮａＣ １（ｌｏｇ　／　ｅ　）　、グルコース（１０ｇ／Ｉ！、）、アンピシリン（５ ０ｇまで３０°Ｃで増殖させた。発酵槽内に接種された種母培養の量は、細菌濃 度がＯ，ｈｇの乾燥重量／リットルとなるように計算される。　１０リツトルの 増殖培地は、２５ｍＭのＫＩｌｚＰＯ４，１０５Ｍの（ＮＨａ）ｚｓＯ４，４ｍ Ｍのクエン酸ナトリウム、０．４＋＊ＭのＦｅＣｌ３１０．０４５ＭのＺｎＣ１ ｚ＋　０．０３ｓＨのＣｏＣ１ｇ＋　０．０３ｍＭのＣｕＣ１ｇ及び０．０３１ ＭＭのＨＪＯｉを含んでいた。以下のような無菌成分を付加した：４ｓＭのＭｇ ＳＯ４，２０ｇ　／　ｉのグルコース、に関連付けることによってグルコースを 連続的に添加した。消泡剤として必要に応じてプロピレングリコールを付加する ことにより、発泡を制御した。溶存酵素濃度は４０％に維持した。 発酵槽には上述のように接種を行ない、培養を３０°Ｃで０．５〜１．０×１Ｑ Ｉｏ細胞／ｍｌの細胞密度（１５の光学密度（Ａ、。。〕）まで増殖させた。増 殖温度はＮＥＴ２８４　Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼの合成を誘導するため３８ °Ｃまで移行させた。温度の移行はρτ■ａ１５プラスミドのコピー数を増大さ せ、同時に、宿主内の欠損プロファージ溶原によりコードされた温度感受性ｃＩ 抑制因子の不活性化を通して変更されたＴ！！ａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の 転写をｌｌｌＩＪｍするラムダＰ、プロモータを抑制除去する。 細胞は６時間３７（Ａｍ１゜）の光学密度まで増殖させ、遠心分離によって収穫 した。細胞マス（ｃａ、　９５　ｇ　／　ｌ　）を、５０ｍＭ　）リス−Ｃ１゜ ｐＨ７，６，２０ｍＭのＥＩＩＴＡ及び２０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む 緩衝液の等量の中に再懸濁させた。懸濁液をゆっくりと液体窒素中に滴下させ、 「ビーズ」すなわち小さいペレットとして懸濁液を凍結させた。凍結細胞を一７ ０°Ｃで保存した。 凍結ビーズ２００　ｇ　（１００ｇの湿潤重量細胞を含む）に対し、１００ｍ１ の１×↑Ｅ　（５０ＭＭのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｍ−のＥＤＴＡ　 ）及び０．３ｍＭまでのＤＴＴ、　２．４ｍＭまでのＰＭＳＦ、１Ｍｇ／ｍｌま でのロイペプチン及び０．２ｍＭまでのＴＬＣＫ　（プロテアーゼインヒビター ）を添加した。試料を氷上で解凍し、低速でブレンダー内で均質に再懸濁させた 。２００００ｐｓｊでＡｍ１ｎｃｏフレンチプレスのセル内で、細胞懸濁液を溶 菌させた。 粘度を減少させるため、溶菌した細胞試料を、各々５０％の負荷率、７０％の出 力で３分間４回音波処理した。１＋ｓＭのＤＴＴ、　２．４＋ｗＭのＰＭＳＦ。 １Ｍｇ７’ｓＩＯロイペプチン及び０．２ａ＋ＭのＴＬＣＫを含むＩＸＴＥを用 いて５５０１になるまで音波処理物を調整した（分画Ｉ）。 ０．３Ｍまで硫酸アンモニウムを添加した後、沸とうしている水浴の中で粗溶菌 液を急速に７５゛Ｃにし、１５分間７５℃の水浴へ移送して大腸菌（Ｅ、　ｃｏ ｌｔ）宿主タンパク質を変性し不活性化した。熱処理された試料を、急速にＯ′ Ｃまで冷やし２０分間氷上で保持した。沈降したタンパク質及び細胞膜を５°Ｃ で３０分間２０□０ＯＯＸＧでの遠心分離により除去し、上澄み（分画■）を保 存した。 熱処理された上澄み（分画■）を、大部分のＤＮＡ及びＲＮＡを除去すべくポリ エチレンイミン（ＰＥＩ）で処理した。急速に攪拌しながら、０°Ｃで４３７１ の分画■にＰｏｌｙｗｉｎ　Ｐ　（１０％（ｗ　／　ｖ　）　３４．９６＋＋ｌ 、　ｐＨ７，５）をゆっくりと添加した。０°Ｃで３０分間の後、３０分間２０ ，０ＯＯＸＣ；で試料を遠心分離した。５０ｍＭのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５ ，０，３Ｍの硫酸アンモニウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴ内で平 衡化された１００１のフェニルセファロースカラム（３，２Ｘ１２．５ｃ＋ｓ） に対し８０ｍ１／時で上澄み（分画ｍ）を通用した。同じ緩衝液約２００蹟１で （Ａ□。、ベースラインまで）でカラムを洗浄し次に１５０＋＊１の５ｃ＋ｓＭ トリスーＣＩ。 ｐＨ７，５，１００ｗＭのＫＣＩ、　１０＋＊ＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴ で洗浄した０次に、５０１ＩＭノドリスーＣ１，ｐＨ７，５，２Ｍの尿素、　２ ０％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｓＭのＤＴ Ｔを含む緩衝液でカラムがらＭＥＴ２８４　Ｔｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを溶 出し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む分画をプールした（分画■）。 ５０１ＩＩＭトリスーＣＩ、　ｐＨ７，５，ＩＪのＥＤＴＡ、及び１ｍＰＩのＤ ＴＴ中で５０ｔａＭのＫＣＩ　と同等の伝導率に分画■を調整した。同じ緩衝液 中で平衡化された１５ｍ１のヘパリン・セファロースカラムに対して（９ｍｌ／ 時で）試料を適用した。カラムを約１４ａ＋ｌ／時（３，５力ラム体積）で同じ 緩衝液で洗浄し、同じ緩衝液中で１５０磐１の０．０５〜０．５ＭのＫＣＩ勾配 で溶出した。　ＤＮＡポリメラーゼ活性は、０．１１Ｍ−０，２２Ｍの間（７１ ＭＣＩ　’？’溶出した。ｐＴｍａ１５でコードされた変形Ｔｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼを含む分画をプールし、濃縮し、２．５×貯蔵緩衝液（５ｈＭのトリス −ＣＩ。 ｐＨ８，０，２５０ｓ＋ＦＩのＫＣｌ、　０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、　２．５ｍ ＭのＤＴＴ及び０．５％のＴｗｅｅｎ　２０）に対しダイアフィルトレージョン し、その後１．５体積の無菌８０％（ｗ／ｖ）グリセロールと混合し、−２０’ Ｃで保存した。場合によっては、ヘパリンセファロース溶出されたＤＮＡポリメ ラーゼ又はフェニールセファロース溶出されたＤＮＡポリメラーゼを透析するか 又は５０ｍＭ　ｌ−リス−Ｃ１，ｐＨ７，５，１ｍＭのＤＴＴ、　１ｍＭのＥＤ ＴＡ及び０．２％のＴｗｅｅｎ　２０中５０１１ＩＭのＫＣＩ　と同等の伝導率 に調整し、同じ緩衝液中で平衡化されたアフィゲルブルーカラムに適用する（Ｉ ｌｌｇのタンパク質／１ｍｌの樹脂）ことができる。カラムを、同じ緩衝液３〜 ５力ラム体積で洗浄し、同し緩衝液中１０カラム体積のＫＣＩ勾配（０，０５Ｍ 〜０．８Ｍ）で溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む分画（０，２５Ｍから ０．４ＭまでのＭＣＩで溶出する）をプールし、濃縮し、ダイアフィルトレージ ョンし、上述のように保存した。 種々のＤＮＡポリメラーゼの相対的な耐熱性を比較した。９７．５°Ｃで天然Ｔ ｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの半減期は、天然又は組換え型り狙ＤＮＡ（すなわち Ａ＋＊ｐｌｉ　Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼの半減期の２倍以上である。 驚（べきことに、ＭＥＴ２８４　Ｔｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの９７．５°Ｃ での半減期は、天然Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼの半減期より、２．５〜３倍長 い。 １０ｄのトリス−ＣＩ、　ｐＨ８，３及び１　、５ｍＭのＭｇＣ１２（加又は天 然簾Ｄｌｒ＾ポリメラーゼについて）又は３１駁）ＭｇＣ１ｚ　（ＭＥＴ２８４ シ咀ＤＮＡポリメラーゼについて）　、５０ｍＭのＭＣＩ　（筆、天然Ｔ＋ａ及 びＭＥＴ２８４　Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて〕又はＫＣｌ無しくＭＥ Ｔ２８４　Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて）、各々０．５μＭのプライマ ーＰＣＲＯＩ及びＰＣＲＯ２，ｌｎｇのラムダ鋳型ＤＮＡ　、各々２００．ｃｒ ＭのｄＮＴＰ　（ｄＣＴＰを除く）及び各々４単位の酵素を含むＰＣｆｌ管を、 ０〜６０分間、大型水浴内で９７．５°Ｃで保温した。時間の経過につれて、試 料をひき出し、０°Ｃで保存し、残留活性について５μ２を標準活性検定におい て１０分間７５°Ｃで検定した。 天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼが９７．５°Ｃで約２１〜２２分の半減期を有 していたのに対して、Ｌ狙ＤＮＡポリメラーゼは、９７．５’Ｃで約１０分の半 減期を有していた。驚くべきことに、丁ＩＩａ　ＤＮＡポリメラーゼのＭＥＴ２ ８４形態は、Ｚｗ又は天然Ｔｅａ　ＤＮＡポリメラーゼのいずれよりも著しく長 い半減期（５０〜５５分）を有していた。ＭＥＴ２８４　Ｔｍａ　ＤＮＡポリメ ラーゼの改良された耐熱性は、ＰＣＲ特に、標的及びＰＣＲ生成物の配列の完全 な変性のために必要とされる鎖分離温度が酵素の不活性化を導くためにＧ＋Ｃの 豊富な標的を増幅するのが困難である場合に、応用される。 １０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ８，３，３ｍＭのｈｃＩｚ、　２００　ｔｔ　Ｍ ずつのｄＮＴＰ。 ０．５ｎｇのバクテリオファージラムダＤＮＡ、　０．５μＭのプライマＰＣＲ ＯＩ。 ４単位のＭＥＴ２８４里ＤＮＡポリメラーゼ及び０．５μＭのプライマＰＣＩ？ ０２又はＰＬｌｏを５０μ２含むＰＣＲ管を、１分間９６℃の変性温度及び２分 間６０’Ｃのアニーリング−延長温度を用いて２５サイクル循環させた。ラムダ ＤＮＡ鋳型、デオキシヌクレオチド貯蔵溶液及びプライマＰＣＲＯＩ及びＰＣＲ Ｏ２は、ＰＥＣｌ　Ｇｅｎｅ　Ａ蒙ｐキットの一部を成していた。プライマＰＬ ＩＯは次の配列を有している：　５　’　−ＧＧＣＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＣ ＡＣＧＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号：２５）、又これはバクテリオファージラ ムダヌクレオチド８１０６−８１３０に対し相補的である。 プライマＰＣＲＯＩ及びＰＣＲＯ２は、ラムダから５００ｂρ生成物を増幅する 。プライマ対ｐｃＲｏｉ及びＰＬＩＯはラムダからＩｋｂ生成物を増幅する。 それぞれのプライマ組での増幅の後、５μｌのアリコートをアガロースゲル電気 泳動に付し、臭化エチジウム染色で特定の意図された生成物バンドを視覚化した ０両方のプライマ組で豊富なレベルの生成物が生成され、ＮＥＴ２８４　Ｔｔｍ ａ　ＤＮＡポリメラーゼが意図された標的配列をうまく増幅したことが示された 。 ■互 、Ｔｌ１ａＤＩｌｌＡボ１メー−ゼの ＭＥＴ　１４０での翻訳を開始す°るＴｒｎａ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３ ′エキソヌクレアーゼ欠損形態を発現するため、アミノ酸１から１３９に相当す るコード領域を発現ベクターから欠失させた。このような欠失を構成するための プロトコルは、例２及び３に記述されている構成にＭ似している：すなわち、短 縮された遺伝子フラグメントを切り出し、次に全長フラグメントが切除されたベ クター内にこれを再挿入する。しかしながら、短縮されたフラグメントは、制限 消化物から精製するのではなくむしろＰＣＲ増幅生成物として得ることができる 、この方法論は、新しい上流制限部位（又はその他の配列）が有用な場合にこれ を取り込むことができる。 位置１４０にあるメチオニンコドンまでの領域を欠失させるために、ＰＣＲを用 いてｐＴ＊ａ１２−１及びｐＴ＊ａ１３内にＳｄＴ部位を導入した。加ＤＮＡポ リメラーゼ配列番号：　３（ＦＬ６３）のヌクレオチド４０９−４３６に対応す る順方向プライマを、位置１４０のメチオニンコドンのちょうど上流で１１部位 に導入するよう設計した。　Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ配列番号：　３（ＦＬ ６９）のヌクレオチド６０８−６３４の相補体に一致する逆プライマは、位置６ ２１でＸｂａ　Ｉ部位を含むように選択された。Ｓａ＋ａ　ｌで線状化されたプ ラスミドｐＴｍａ１２−１をＰＣＲ鋳型として用い、約２２５ｂｐのＰＣＲ生成 物を生成せしめた。 消化の前に、ＰＣＲ生成物をＰｃｔ？反応混合物中でプロテイナーゼに５０μｇ ／ｒｓ１に０．５％のＳＤＳ及び５ｍＨのＥＤＴＡを加えたもので処理した。 ３７°Ｃで３０分間保温した後、プロテイナーゼＫを１０分間６８°Ｃで熱不活 性化した。この手順は、次の制限消化を抑制する可能性のある生成物に結合され たあらゆるｍポリメラーゼを除去した。緩衝液はＴＥ緩衝液に変えられ、余分な Ｐｃｔ？プライマはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００マイクロ濃縮器で除去された。 増幅したフラグメントをまずジ彷■で消化し、次にＩＩ開裂末端で平滑末端を形 成すべく　Ｋｌｅｎｏｗで処理し、最後に珈１で消化した。 得られたフラグメントを、Ｎｅｏ　Ｉで消化されたプラスミドｐＴａ＋ａ１３（ ｐＴｍａ１２−１でもよかろう）に連結させ、Ｋｌｅｎｏ−で修復し、次に珈■ で消化した。連結は、Ｎｃｏ　１部位（コード配列の第１のメチオニンコドン） 及び導入された釦１部位（位置１４０のメチオニンコドンの上流）に続く領域が 欠失された状態で、フレーム内コード配列を生成した。得られた発現ベクターは ｐＴｍａ１６と呼称された。 この例で使用されるプライマは以下にそして配列表の節で示される。 劃」− ＭＥＴ１４０　ベク　の　しくないＲＢＳの、位置１４０のメチオニンコドンの 上流のリポソーム結合部位（ＲＢＳ　）を除去することによって、Ｔ！！ａ　Ｄ ＮＡポリメラーゼのＭＥ↑１４０形態の発現の低減を達成することができる。Ｒ ＢＳは、アミノ酸配列を変えることなくオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発 を介して除去された。遺伝子コードの縮重性を利用して、核酸配列を変えるべく コドンの第３の位置に変化をもたらすことができ、かくしてコードされたタンパ ク質のアミノ酸配列を変えることなく　ＲＢＳを除去することができる。 変更された配列を含む変異誘発性プライマ（ＦＬ６４　）を合成し、リン酸化し た。Ｓｔｒａｔａｇｅｎから市販されているヘルパーファージＲ４０８と同時感 染させることによって、−重鎖のｐＴｍａ０９　（Ｎｃｏ　ｒ部位を有する全長 クローン）を調製した。−重鎖ｐＴｍａ０９とｐＢｓ１３＋のハ１■消化物から の大きなフラグメントの「ギャップを有する２重鎖」を、まず２つのプラスミド を混合し、２分間溝とうするまで加熱し、５分間６５°Ｃまで冷却することによ って形成した０次に、リン酸化したプライマを混合し２分間８０℃まで加熱し、 その後ゆっくりと室温まで冷却することにより「ギャップを有する２重鎖」とア ニーリングさせた。Ｋｌｅｎｏ−での延長により残留するギャップをフィルイン し、フラグメントをＴ　４　ＯＮＡ　リガーゼで連結した。これらの反応は両方 共、３０分間３７℃で標準塩中２００μＭずつのｄＮＴＰと４０μＭのＡＴＰの 中で行なわれた。 得られた円形フラグメントをニトロセルロースフィルタ上の平板形質転換によっ てＤＧＩＯＩ宿主細胞へと形質転換させた。重複フィルタを作り、正しいプラス ミドの存在をＴｉｚｐ−リン酸化プローブ（Ｆｆ、６５）で調査することによっ て検出した。得られたベクタは、ｐＴａ＋ａ１９と呼称された。 ｐＴｓａ１９からのｌ？Ｂｓマイナス部分は、Ｎｃｏ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉフラグ メントスイッチを介してｐＴｍａ１２−１へとクローニングした。Ｎｃｏ　Ｉ及 びＸｂａ　ＩでプラスミドｐＴａ＋ａｆ９を消化し、上述の例３のようにゲル電 気泳動により６２０ｂｐフラグメントを精製した。プラスミドｐＴ■ａ１２−１ をＮｃｏ　Ｉ　。 Ｘｂａ　ｒ、及びＸｃｍ　Ｉで消化した。Ｘｃｔｓ　Ｉ開裂は、「粘着Ｊ末端を 連結するのに適した条件下（希釈リガーゼ及び４０μＭのＡＴＰ）で行なわれる その後の連結段階を目的として、Ｉ？ＢＳ＋フラグメントを不活性化させる。最 終的に、連結生成物は、発現のためＤＧ１１６宿主細胞に形質転換され、ＰＴｍ ａ１９−ＲＢＳと呼称される。 この例で用いられるオリゴヌクレオチド配列は、以下にそして配列表の節で列挙 される。 オリゴ　Σ且ＪＬＬＥ−藍死 ＦＬ６４　配列番号：　２８　５　’　ＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣ ＡＣＣＧＧＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴ ＦＬ６５　配列番号：　２９　５　’　ＴＡＧＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧ ■亙 Ｔｍａ　ＤＮＡボリメー−ゼＭＥＴ−ＡＳＰ２１　びＭＥＴ−ＧＬＵ７４のＴｅ ａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子コード配列の位置２１においてアスパラギン酸コ ドンで翻訳開始を行なうために、このコドンの前にメチオニンコドンを導入して 、最初のＮｅｏ　Ｔ部位からこの導入されたメチオニンコドンまでの領域を欠失 させる０例４と同様に、欠失法には、５７０塩基対生成物を生成するためＮｃｏ 　１部位とメチオニンコドンを取り込むよう設計された上流プライマ（ＦＬ６６ ）及び上述の同し下流プライマ（ＦＬ６９）を用いるＰｃｔ？が含まれた。 増幅した生成物を、余分なプライマ及び緩衝液を除去するためＣｅｎｔｒｉｃｏ ｎ−１００マイクロ濃縮器で濃縮した。生成物を５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ　ａ縮重で 濃縮し、次に消化混合物中に再懸濁した。増幅生成物を上辺■及び珈Ｉで消化し た。同様にして、ｐＴｍａ１２−１．　ｐＴ＋ａ１３、又はｐＴｍａ１９−ＲＢ Ｓを同じ２つの制限酵素で消化した。消化し増幅されたフラグメントを消化され た発現ベクタに連結した。得られた構成体は、天然Ｔｍａコード配列の出発コド ンの上流のＮｃｏ　１部位から天然ｂμコード配列の位置２１においてアスパラ ギン酸コドンの上流に導入された新しいメチオニンコドンまでの欠失を有してい る。 同様にして、翻訳開始がＧ１ｕ７４つまり天然垣コード配列の位置７４における グルタミン酸コドンで始まるような形で、欠失変異体を作製した。上流プライマ （ＦＬ６７）はメチオニンコドンとＮｃｏ　１部位をＧ１ｕ７４の前に導入する ように設計される。使用された下流プライマ及びクローニングプロトコルは、Ｍ ＥＴ−ＡＳＰ２１構成体について上述した通りである。 この例で用いられた上流プライマ配列は、以下にそして配列表の節に列挙する。 ＰＬ６７　配列番号：　３１　５　’　ＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＴＴＡ ＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡ ■ユ Ｔａｆボ１−−ゼの ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているＴａｆポリメラーゼのミュー ティン形態をＴａｆポリメラーゼ遺伝子の５′末端に欠失を導入することによっ て構成した。以下のプロトコルを用いて２７９及び４１７の両方の塩基対欠失を 作った；すなわち、望まれるフラグメントを切除するため制限酵素で発現プラス ミドを消化し、平滑末端を生成するべくフラグメント末端をＫｌｅｎｏｗ及び４ つのｄＮＴＰ全てを用いて修復し、望まれる欠失を伴う新しい円形プラスミドを 生成するべく生成物を連結した。９３キロダルトンの１ポリメラーゼの５′→３ ′エキソヌクレアーゼ欠損形態を発現するため、アミノ酸２−９３を含む２７９ ｂｐ欠失を生成させた。８８キロダルトンのＴａｆポリメラーゼの５′→３′エ キソヌクレアーゼ欠損形態を発現するためには、アミノ酸２−１３９を含む４１ ７ｂｐ欠失を生成させた。 コドン２−９３が欠失されたプラスミドを作るためには、Ｎｃｏ　Ｉ及びＮｄｅ 　ＩでｐＴａｆ０３を消化し、末端をにＩｅｎｏ−処理により修復した。消化さ れ修復されたプラスミドを５μｇ／■Ｉまで希釈し、平滑末端条件下で連結した 。希釈したプラスミド濃度は、分子間連結に有利に作用する。連結されたプラス ミドをＤＧ１１６に形質転換した。ミニ−スクリーンＤＮＡ　ｔＡ製物を制限分 析に付し、適切なプラスミドをＤＮＡ配列分析によって確認した。ｐＴａｆ０３ からセグメントを欠失させることにより生み出された、得た発現ベクターはｐＴ ａｆ０９と呼称された。 ｐＴａｆ０３から作製された類似のベクターはｐＴａｆｌＯと呼称された。 コドン２−１３９が欠失した発現ベクターも作製した。最初の制限消化が違逓■ 及びシＬＬ１１で行なわれるという点を除き、同じプロトコルを用いた。ｐＴａ ｆ０３から作製された発現ベクタはρＴａｆｌｌと呼称され、ｐＴａｆ０５から 作製された発現ベクタはｐＴａｆ１２と呼称された。 Ｌ アミノ酸２９２から８３４までを含むテルムス（Ｔｈｅｒ＋５ｕｓ）スペーシス ＺＯＳのボ１メー−ゼ テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　）スペーシスＺａＳからの５′→３′エキソヌクレ アーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡフラグメントを得る ために、アミノ酸２９２から８３４を含むＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部分を 、１ｈＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，５０ｍＭのＫＣＩを含み１００μｌの 鉱油が上に被さった８０μ２の溶液：５０ｐｍｏｌｅｓのＴＺＡ２９２ ５０ｐｍｏｌｅｓのＴＺＲＯＩ Ｌｏｎｇのテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　）スペーシスＺＯ５ゲノムＤＮＡ２．５ 単位の１ｌＩＩｐｌｉ　Ｔａｑ　［ｌＮＡポリメラーゼ各々５０μＭのｄＡＴＰ 、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ中で順方向プライマＴＺＡＡ２９２及び 逆方向プライマＴＺＲＯＩを伴うＰＣＲにおいて選択的に増幅させた０反応は、 ８０℃の予熱されたサイクラ−内に管を入れた後７．５ｍＭのＭｇＣ１！を含む ２０μｌを添加することによって開始された。 ゲノムＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ引止７１８で完全に消化し、５分間９ ８“Ｃで変性させ、０℃まで急速に冷却した。試料を、以下のプロフィールに従 ってＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌａｔｅｒ　Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラの中で循環させ た： ９６°Ｃまでステップ循環させ、２０秒間保持する。 ５５°Ｃまでステップ循環させ、３０秒間保持する。 ３０秒にわたり７２°Ｃまで上昇させ１分間保持する。 このプロフィルを３サイクル反復する。 ９６゛Ｃまでステップ循環させ、２０秒間保持する。 ６５°Ｃまでステップ循環させ、２分間保持する。 プロフィルを２５サイクル反復する。 最後のサイクルの後、５分間保持する。 アガロースゲルｔｉ泳動により意図された１、６５ｋｂのＰＣＲ生成物を精製し 、フェノール−クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、回収した。精製された 生成物を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ　Ｉ及びＩｎで消化し、Ｎｄｅ　Ｉ　 ／　ＢａｍＨｒ消化され脱リン酸されたプラスミドベクターｐＤＧ１６４と連結 させる（１９８９年１２月２２日付の米国特許第４５５゜９６７号、例６Ｂ：引 用によりこの明細書に組み入れる）。大腸菌（Ｅ、匹旦）菌株ＤＧ１１６のアン ピシリン耐性形質転換体を３０゛Ｃで選択し、望ましい組換え型プラスミドにつ いてスクリーニングした。 プラスミドｐＺＯ５Ａ２９２は、例２のＰＬＳＧ８でコードされたタンパク質と 類似した、５４４アミノ酸、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルムス（Ｔｈ ｅｒｍｕｓ）スペーシスＺＯ５熱安定性［ＩＮＡポリメラーゼをコードする。Ｄ ＮＡポリメラーゼ活性は、例２と同様に精製される。精製されたタンパク質は、 ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する天然酵素に比べ耐 熱性があり、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のＰＣＲにおいて特に有用である。 プライマ　ｙ死１号二　１刀 ＴＺＡ２９２　配列番号：３２　ＧＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣ ＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣ■旦 アミノ　２８８〜８３０をＡむテルムス（Ｔｈｅｒ＋ｗｕｓ）スペーシス５ｓ１ ７の５′→３′エキソヌクレアーゼ　艶′″′ＤＮＡボリメーーゼの廷１支生曳 テルムス（Ｔｈｅｒ■ｕ３）スペーシス５ｐｓ１７から５′→３′エキソヌクレ アーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡフラグメントを得る ためには、アミン＃　２８８〜８３０を含むＤＮＡポリメラーゼの一部分を、１ ０１１Ｍのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，５０ｍＭのＭＣＩを含み１００μ！の 鉱油が上に被さった８０μ２の溶液：５０ｐａ＋ｏｌｅｓのＴＳＡ２８８ ５０ｐ＋＊ｏｌｅｓのＴＳＲＯＩ ＬｏｎＨのテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシス５ｐｓ１７ゲノムＤＮ＾２． ５単位の＾−ｐｌｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、各に５０ａＭのｄＡＴＰ、 　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ、中で順方同プライマＴＳＡ２８８及び逆 方向プライマＴＳＲＯＩを用いるＰＣＢにおいて選択的に増幅させた。８０°Ｃ の予熱されたサイクラ−内に管を入れた後７．５■ｈのＭｇＣ１，を含む２０μ ２を添加することによって反応を開始した。 ゲノムＤＮＡを９８℃で５分間変性し、０℃まで急速に冷却させた。 以下のプロフィールに従ってＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ■ｅｎ　Ｃｅｔｕ３サーマルサ イクラ内で、試料を循環させた： ９６℃までステップ循環させ、２０秒間保持する。 ５５°Ｃまでステップ循環させ、３０秒間保持する。 ３０秒にわたり７２°Ｃまで上昇させ１分間保持する。 プロフィルを３サイクル反復する。 ９６°Ｃまでステップ循環させ、２０秒間保持する。 ６５°Ｃまでステップ循環させ、２分間保持する。 プロフィルを２５サイクル反復する。 最後のサイクルの後５分間保持する。 アガロースゲル電気泳動法により、意図された１、６５ｋｂのＰＣＲ生成物を精 製し、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後回収した。精製され た生成物を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ　Ｉ及びＩｎで消化し、Ｎｄｅ　Ｔ 　／　Ｒａｍ旧で消化され脱リン酸されたプラスミドベクタｐＤＧ１６４に連結 した（１９８９年１２月１２日付出願の米国特許出願第４５５，９６７号、例６ Ｂ）、大腸菌（Ｌ延）菌株ＤＧ１１６のアンビシリ耐性形質転換体を３０℃で選 択し、望ましい組換えプラスミドについてスクリーニングした。プラスミドｐＳ ＰＳＡ２８８は、例２のｐＬｓＧ８でコードされたタンパク質と類似した、５４ ４アミノ酸、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルムス（Ｔｈｅｒ圏ＵＳ）ス ペーシス５ｐｓｌＴ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする。ＤＮＡポリメラ ーゼ活性を、例２と同様に精製する。精製されたタンパク質は５′→３′エキソ ヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する天然酵素に比べ耐熱性が高く、Ｇ＋ Ｃの豊富な鋳型のＰＣＲにおいて特に有用である。 １−ＬＬマ　配ｆｉｔ艷二　■ ＴＳＡ２８８　配列番号：３４　ＧＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＣＴＡＡＡＧ ＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣ 罰 アミノ酸２９２から８３４を含むテルムス・サーモフィルス（ＴｈｅｒＩｌｕｓ Ｔｈｅｒｅｔｏ　ｈｉｌｕｓ）の５’　→３’エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性 ＤＮＡポリメー−ゼの葎　と テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）から ５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤ ＮＡフラグメントを得るために、アミノ酸２９２〜８３４を含むＤＮＡホ’Ｊ　 メ’ｒ−セ遺伝子ノ一部分を、１０ｍＭ（７）　ト’）　ス−）１ｃＩ　ｐＨ８ ，３，５０＋＋ｃＭのにＣ１を含み上に１００μｌの鉱油が被さっている８０μ ｉの溶液：５０ｐ＊ｏｌｅｓのＴＺＡ２９２ ５０ｐｍｏｌｅｓの［ｌＧ１２２ １■ｇのＥｃｏＲＩ消化されたプラスミドｐＬｓＧ２２２．５単位のＡｍｐｌｉ 　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ各々５０μＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴ Ｐ、　ｄＴＴＰ中で順方向プライマＴＺＡ２９２及び逆方向プライマＤＧ１２２ を用いるＰＣＨにおいて選択的に増幅させる。　８０℃の予熱されたサイクラの 中に管を入れた後、７．５ｓＭのＭｇＣ１，を含む２０μ！を付加することによ って反応を開始させた。 プラスミドｐＬＳＧ２２　（１９８９年１２月２２日付出願の米国特許出願第４ ５５、９６７号；この記載は引用により本明細書に組み込まれる）を制限エンド ヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に消化し、９８℃で５分間変性し、急速にＯｏＣ まで冷却した。以下のプロフィルに従って、Ｐｅｒｋｔｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔ ｕｓサーマルサイクラ内で、試料を循環させた：９６°Ｃまでステップ循環させ 、２０秒間保持する。 ５５°Ｃまでステップ循環させ、３０秒間保持する。 ３０秒にわたり７２°Ｃまで上昇させ１分間保持する。 プロフィルを３サイクル反復する。 ９６℃までステップ循環させ、２０秒間保持する。 ６５°Ｃまでステップ循環させ２分間保持する。 プロフィルを２５サイクル反復する。 最後のサイクルの後５分間保持する。 アガロースゲル電気泳動法により、意図された１、６６ｋｂのＰＣＲ生成物を精 製し、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後回収する。精製さ れた生成物を、制限エンドヌクレアーゼが包Ｉ及び１■で消化し、Ｎｄｅｌ／Ｂ ａｇ旧で消化され脱リン酸されたプラスミドベクタｐＤＧ１６４と連結する（１ ９８９年１２月１２日付出願の米国特許出願第４５５．９６７号、例６Ｂ）、大 腸菌（Ｌ匹旦）菌株ＤＧ１１６のアンピシリン耐性形質転換体を３０°Ｃで選択 し、望ましい組換えプラスミドについてスクリーニングする。プラスミドｐＴＴ ＨＡ２９２は、例２のｐＬＳＧ８でコードされたタンパク質と類似した、５４４ アミノ酸、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルムス・サーモフィルス（Ｔｈ ｅｒｔｍｕｓ旦肛鯰執旦旦）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする。ＤＮＡ ポリメラーゼ活性を、例２と同様に精製する。精製されたタンパク質は５′→３ ′エキソヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する天然酵素に比べ耐熱性が高 く、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のＰＣＨにおいて特に有用である。 ■旦 アミノ酸２８５〜８９２を含むテルモシボ・アフリカヌス（乃ｙ見１１胚Ａｆｒ ｉｃａｎｕｓ　）の５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメー −ゼの゛　と テルモシボ・アフリカヌス（乃ｙ１１厘胚ａｆｒｉｃａｎｕｓ）から５′→３′ エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡフラグ メントを得るためには、アミノ酸２８５〜８９２を含むＤＮＡポリメラーゼ遺伝 子の一部分を、１０−Ｍのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，５０ｍＭのにＣ１を含 み１００μｉの鉱油が上に被さった８０μ２の溶液：５０ｐｍｏｌｅｓのＴＡＦ Ｉ２８５ ５０ｐｍｏｌｅｓのＴＡＦＲＯＩ ｌｎｇのプラスミドｐＢｓＭ　：　ＴａｆＲＶ３　’　ＤＮＡ２．５単位のＡｍ ｐｌｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ各々５０μＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　 ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ中で順方向でプライマＴＡＰＩ２８５及び逆方向プライマ ＴＡＦＲＯＩを用いるＰＣＨにおいて選択的に増幅させる。８０℃の予熱された サイクラ−内に管を入れた後７．５１のＭｇＣ１□を含む２０μ尼を付加するこ とによって反応を開始させた。 プラスミＦｌ）ＢＳＭ　ＴａｆＲＶ’　３　（ＣＥＴＩＪＳ　ＣＡＳＥ２５８３ ．　１　、　ＥＸ４　、ｐ５３内に記されている通りに得られたもの；引用によ り本明細書に組み入れる）を完全にＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡを９８°Ｃで５ 分間変性させ、ＯｏＣまで急速に冷却した。以下のプロフィルに従ってＰｅｒｋ ｉｎ−ＥｌｉｅｒＣｅｔｕｓサーマルサイクラ内で試料を循環させた。 ９５℃までステップ循環させ、３０秒間保持する。 ５５℃までステップ循環させ、３０秒間保持する。 ３０秒にわたり７２℃まで上昇させ、１分間保持する。 プロフィルを３サイクル反復する。 ９５°Ｃまでステップ循環させ、３０秒間保持する。 ６５°Ｃまでステップ循環させ、２分間保持する。 プロフィルを２０サイクル反復する。 最後のサイクルの後、５分間保持する。 アガロースゲル電気泳動法により、意図された１、８６ｋｂのＰＣＲ生成物を精 製し、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後回収する。精製され た生成物を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ　Ｉ及び現１旧で消化し、Ｎｄｅｌ ／ＢａｗＨＩで消化され脱リン酸されたプラスミドベクターｐｌ）Ｇ１６４と連 結する（１９８９年１２月２２日付出願の米国特許出願第４５５．９６７号、例 ６Ｂ）、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株ＤＧ１１６のアンピリジン耐性形質転換 体を３０℃で選択し、望ましい組換え型プラスミドについてスクリーニングする 。プラスミドｐＴＡＦＩ２８５は例３のＰＴＭ１５でコードされたタンパク質に 類似した、６０９アミノ酸、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルモシボ・ア フリカヌス（旦五１１匡肢ａｆｒｉｃａｎｕｓ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを コードする。 ＤＮＡポリメラーゼ活性を、例３と同様に精製される。精製されたりンパク質は ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する未変性酵素に比べ て耐熱性が高く、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のｐｃＲにおいて特に有用である。 １蓋と士マ　配置０Ｌ【二　■ ＴＡＰＩ２８５　配列番号：３７　ＧＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡ ＣＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＡＧＧ ↑ＡＦＲＯＬ　配列番号：３８　ＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴ ＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＴ 以上の明細書は当業者が本発明を実施できるようにするのに充分なものであると 考えられる０本発明は、寄託された細胞系によってその範囲が限定されるもので はない、寄託された態様は本発明の一１！様を単に例証するためのものであり、 機能的に等価のあらゆる細胞系が本発明の範囲内に入るのである。ここで、材料 の寄託は、本書に含まれている記述が本発明の最良のＵ様を含むあらゆる態様の 実施を可能にするのに不適当であることを容認するものではなく、又、寄託はそ れが代表している特定の例に請求の範囲を制限するものであるとみなされるべき ものではない。実際、本書で示し記述したものに加えて、当業者には、前述の説 明から本発明のさまざまな変形態様が明らかになると思われ、これらの変形態様 は、添付のクレームの範囲内に入るものである。 （２）配列番号：１： Ｎ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　２４９９　塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （１１）分子の型：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍ＋ｃ）（ｉｊ）ハイボセティカル： Ｎ０ （１■）アンチーセンス二Ｎ０ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（ｔｘ）特徴： （Ａ　）　ＮＡＭＥ／ｋｅｙ　：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　１．．２４９６ Ｃｘｉ　）配列の記載：配列番号：１：八τＧ　ＡＧＧ　（：Ｇに　ＡＴＧ　Ｃ ＴＣＣＣＣＣＴＣｍ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＡＧ　ＧＧＣＣＯＧ　にＴＣＣＴＣＣＴ Ｇ　４８Ｍｅｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｍａｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　 Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌａｕｌ　５　１ ｏ　１５ にＴＣＧ、Ｍ：　（ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴｒＣＣ ＡＣＧＣＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＯ（：　９６Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＨＬｓ　 Ｈｌｓ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ｌ ４ｕ　Ｌｙｇ　ＧｌｙＣＴＣＡＣＣＡＣ（：　ＡＧ（：　ＣＧＣ；　ＣＯＧに　 （：ＡＧ　ＣＣＧ　（ＴＣＣＡに　ＧＣＧ　にＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＧ（：Ｃ Ｉyｔ４ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｃｒｙ　にｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　 Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ＾１ａＡＡＧ　ＡＧ（：　Ｃ ｒＣＣｒＣＡＡＧ　ＧＣＣＣＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣＧＧＧ　Ｃ；ＡＣＣ； ＣＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣにＴＧ　１９２Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｇ 　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｃ１ｙ　Ａｓｐ＾ｌａ　Ｖａｌ　 Ｉｌａ　Ｖａ１（ＴＣｍ　ＧＡＣにＣＣＡＡＧ　ＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＧ ＣＣＡＣＧＡＧ　ＣＣＣ丁ＡＣにＣＧ　にＧＧ　２４０Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ａｓｐ 　Ａｌａ　Ｌｙｓ＾Ｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ＾ ｌａ　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　ＧｌｙＴＡＣＡＡＣＧＣＧ　ＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣ ＡＣに　ＣＣＧ　（：ＡＧ　ＣＡＣＴＴＴ　ＣＣＣＣＧＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣ２８ ８τｙｒ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ＬａｕＧＣＣＣＴＣＡＴ ＣＡＡＧ　ｃＡｃ　ｃＴｃ　ａｒｃ　にＣＡＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣＧ ＣＧ　ＣにＣＣＴＣＧＡＧ　３３６＾１ａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕｌｏｏ　１０５　１１０ Ｃ丁ＣＣＣＧ　ＧＧＣＴＡ（：　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧ　 （：ＣＣＡＧＣＣＴＧ　（：ＣＣＡＡＧ　ＡＡＧ　３１３４Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ＾ｌａ　５ｅ ｒ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＣＣＣＣＡＡ　ｋＡ（：　ＧＡＧ　ＧＧＣＴ ＡＣＧＡＧ　ＣＴＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣ，ＣＣ（：ＡＣＡＡＡ　ＧＡＣ ４３２＾Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａ ｒｇ　Ｉｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＣＴｒ　ＴＡ ＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＡ（：　ＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡ ＣＣＣＣにＡＧ　ＣＧＣ４８０しａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　ＧｌｙＩＺ、５　１５０　１５５　１６０ ＴＡＣＣ’ｒＣＡＴＣＡＣＣＣＣに　ＧＣ（：　ＴＧＧ　ＣＴＴ　丁ＧＣＣＡＡ 　ＡＡＧ　ＴＡＧ　ＧＧＣＣＴＣＡＧＧ　ＣＣＣ５２８Ｔｙｒしｒｕ　Ｉｌｅ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ＾Ｌａ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｉ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒ。 ＣＡＣＣＡＧ　丁Ｇに　ＧＣＣＧＡＧ：　ＴＡＣＣＧＣＧ（：ＣＣＴＣＡＣＣに Ｃ；に　にＣＡＣＧＡＧ　丁ＣＣＣ；Ａｃ　ＡＡＣ５７６＾ｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｒ ｐ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　 Ｇｌｕ　Ｓｅｒ＾ｇｐ　ＡｓｎＣＴｒ　ＣＣＣＧＧＧ　にＴＣＡＡＧ　Ｃ，ＧＣ ＡＴＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＱＣに　ＡＧに　ＡＡＧ　ＣＴＴ　Ｃ ＴＧ　６２S Ｌｅｕ　Ｉ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｇ　Ｔｈｒ＾ｌｘ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＣＡＣＧＡＧ　ＴＧ Ｇ　ＧＣＧ　ＡＧＣＣｒＧ　ＧＡＡ　Ｇ（：ＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧ　ｋＡＣＣＴ （：　Ｃ：ＡＣＣに（：　ＣＴＧ　６７Q Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ＾ＩＪＬ　Ｌｔｕ　 Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ＾ｒｇ　ＬａｕＡＡＣＣＣＣＧＣＣＡ ＴＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＣＴＣＧＣ：ＣＣＡＣＡＴＧ　ＣＡＣＧＡ Ｔ　ＣＴＧ　ＡＡＣ：　７２０Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｈｌｓ　Ｈｅｃ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌａ ｕ　ＬｙｓＣＴＣＴＣＣＴＯに　ＧＡＣＣＴＣＣ，ＣＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣ ＡＣＣＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＴに　ＧＡＧ　ＧＴに　７６８Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｒｐ＾ｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｔｈｒ＾ｓｐ　Ｌｅｕ 　Ｆ’ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａ１ＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡ　ＡＧＧＣＧＧ 　ＧＡＧ　ＣＣＣＧＡＣＣＧＯＧＡＣＡＧに　ＣＴＴ　ＡＧＯＧＣＣｍ　８１６ ＾ｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ＾ ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ＾ｌａ　ＰｈａＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ 　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ｍ　ＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣ Ｔｒ　ＣＴＧ　８６ＺｔＬａｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　（Ｊｕ　Ｐｈｅ　Ｇ Ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　ＨＬｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　にｌｙ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕＧＡＡ　ＡＧ（１：　ＣＣＣＡＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　にＣ ＣＣＣＣＴＧＧ　Ｃ１；ＣＣＣＧ　ＣＣＣ；　ＣｋＡ　ににＧ　X１２ Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｐ ｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　ＧｌｙＧＣＣＴＴＣＣＴＧ　 ＧＧＣｍ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＡＧ　ｅ；ＡＣ；　ＣＣＣＡＴＩＩ ；　丁ＧＧ　ＧＣＣＣＡＴ　９６０Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　 Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ｔｒｐ　 Ａｈａ　＾＄ＰＣＴｒ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＧ　Ｇ にＧ　ＧにＣＣＧＧ　ＧＴＣＣＡＣＣＧに　ＧＣＣＣＣＣ１００８Ｌａｕ　Ｌａ ｕ＾ｌａ　Ｌａｕ　ＡＬａ　ＡＬａ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　 Ｖａｔ　Ｉ（ｉｓ＾ｒｇ＾ｌａ　Ｐｒ。 ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＧＣＣＣＴＣＡＧＯＧＡＣＣＴに　ｋＡｃ； 　Ｃ：Ａに　にＣに　ＣＧＣＣＣＧ　ＣＴｒ　ＣＴＣ１０５U ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌ ｙｓ　Ｃ１ｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ＬａｕＧＣＣＡＡＡ　ＣＡＣＣ ＴＣＡＧ（：　にＴｒ　ＣＴＣ；　にＣＣＣＴＧ　ＡにＣに２Ｍ　ＧＣ；ＣＣＴ Ｔ　ＧＧＣＣＴＣＣＣＧ　１１０４＾１ａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＬＪｕ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　ＬＪｕ＾Ｌａ　Ｌａｕ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｊ、 ｅｕ　Ｐｒ。 ＣＣＣＧＧに　ＧＡＧ　ＧＡに　ＣＣＣＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＣにＣＣＴＡＣＣＴ ＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＣＴ　丁ＣＣＡＡＣ１１５２Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓ ｐ　Ｐｒｏ　Ｍａｅ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　＾１１　丁ｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｓ ｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＡｇｎＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧ　ＧにＧ　Ｇ’ＴＧ　Ｇ ＣＣＣＧＧ　ＣＧＣＴＡ（：　ＧにＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＡＣＣＧＡＧ　 １２００ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣにＣ：　にＣＣＣＣ，ＣＣＣＴＴ　 ＴＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧ　１２４１１ＴＣＧ　Ｃ Ｇに　ＡＧＯＣＴｒ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＣＴＣＣＴＴ 　ＴＧＧ　ＣＴｒ　丁ＡＣＣＧＣＧＡＧ　１２９U （ＴＣＧＡＧ　ＡＧＧ　ＣＣＣＣＴｒ　ＴＣＣＧＣＴ　ＧＴＣＣＴＣＧＣＣＣＡ ＣＡＴＣＧＡＧ　ＧＣＣＡＣＣＣＯＧ　１３４４にＴＣ：　ＣＣＣＣＴに　ＧＡ ＣＧ’ＴＧ　ＣＣＣＴＡＴ　ＣＴＣＡＧＧ　Ｃ；ＣＣＴＴに　ＴＣＣＣＴＧ　Ｇ ＡＧ　ＧＴＣ：　ＧＣＣ１３X２ ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣ ＣにＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣ１１！＋４０ＣＣＣＴｒＣＡＡＣＣＴＣ人ＡＣ ＴＣＣＣＧＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＣＴＣＧＡＡ　ＡＧＧ　ＧＴＣＣＴＣＴＩＴ　Ｇ ＡＣ１４８８ＧＡＧ　ＣＴＡ　ｃｃｃ　ｃＴＴ　ＣＣＣＧＣＣＡＴＣ（ＣＣＡＡ Ｇ　ＡＣＧ　（：ＡＣＡＡＧ　ＡｃＣＣＣＣＡＡＣＣＧＣ１５３６ＴＣＣＡＣＣ ＡＣＣ（：、ＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣＭ：　Ｇ ＣＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣ１５１１１！１ＧＴＧ　にＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＣＴＣ ＣＡＧ　丁ＡＣＣＣＬ：、ＧＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＡＡＧ　ＣＴＣ，ＡＡＧ　ＡＣ 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ｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　）Ｉｔｓ　（ｌｕ　Ａ１１　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　Ｔ ｙｒ　Ｌｙｉ　Ａ１■ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　 （：１ｙ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｒｇτｒｐ１６５　１７０　Ｌ 〕５ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｌａｕ　Ｇ ｌｕ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｃ１ｕ　Ｐｈ＠ＧＬ ｙ　Ｌｅｕし＋ｕ　Ｇｌｕ＾１１Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧＬｕ　Ｇ ｌｕ＾ｌａ　Ｉ’ｒｏ　Ｔｒｐ　Ｆ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ｐｈ■ Ａｌａ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｇｌｙ＾Ｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａ ｔ　Ｈｉｓ＾ｒｇ　Ａｌｍ　にｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ。 Ｖａｌ　Ｇｌｙ＾Ｌｍ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉ ｌａ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ３１！＋０　３４５　３ ５０ Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ＾ｒｇ　にｌｕ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ 　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ＾ｓｎ　Ｔｈｒ　ＡｇｎＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　ＡＬａ　Ａｒｇ 　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　丁ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ 　Ａ１ｍ＾１ａ＾ｌａ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｌｓｕ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ＾Ｌａ　Ｌｅｕτｙｒ　Ｐｒ。 ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｇｉｎ　ＶａＩＬａｕ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　１（ ｅｃ　（Ａｕ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ＾ｒ＆八ｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ、ｅｕ 　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ　ＩＪ■ ＾ｒｇ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　丁ｈｒ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　５ｅｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒ　ＡｓｐＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｌ ａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｗｅｅ　５ａｒ（２）配列番号＝７： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　２５０５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｊ）ハイボセティヵル： Ｎ。 （１ｖファンチーセンス：Ｎ。 （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：　Ｔｈｅｒｓ＋ｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　Ｚ０５（ｉｘ）特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ７ＫＥＹ　：　ＣｒｊＳ（Ｂ）位置：　１．．２５０２ （ｘｉ　）配列の記１配列番号ニア： ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＣＴＣＴｒＴ　ＧＡＡ　ＣＣ ＣＡＡＡ　Ｃ（：、ＣＣにＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＣＴＧ　４８Ｍａｃ　Ｌｙｓ＾ｌ ａ　Ｍａｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＠Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌａｕｌ　５　１０　１５ ＧＴＧ　ＧＡＣＣ；ＣＣＣＡＣＣＡ（：　ＣＴＧ　ＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴ ＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＧＧＣ９６Ｖａｌ＾ｓｐ　にｌｙ　Ｈｌｓ　 Ｈａｓ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ＾ｌａ　Ｌａ ｕ　Ｌｙｓ　ＧｌｙｃＴＣＡＣＣＡＣＧ　ＡＧＣＣＧＧ　ＧＧＣにＡＡ　ＣＣＧ 　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＧ　（、ｎ　ＴＡＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣ１４４ＡＡＧ　Ａ ＧＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　Ａ／心ＧＡＣＧＡＣＧＣＯＴＡＣＡＡ Ｇ　ＧＣＣＣ；ＴＣＴＴＣ１９２Ｌｙｓ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｖａ ｌ　ＰｈｅＧＴＣＧＴＣｍ　ＧＡ（：　ＧＣＣＡＡＧ　にＣＣＣＣＣＴ　ＴＣＣ ＴｒＣＣＣＣＣＡＣＧＡＧ　Ｃ；ＣＣＴＡｃＧＡＧ　２４０ＧＣＣＴＡＣＡＡＧ 　ＧＣＡ　ＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＣＣ Ｃ（ｃＣＡＧ　２８８Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌ ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇ１ ｎＣＴｃ　Ｇｃｃ　ＣｒＣＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＣＣＴ ＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　Ｃ（、ＣＣＴＣ３３６ＧＡＧ　ＧＴＴ　Ｃ ＧＧ　ＧにＣｍ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＡ（：　ＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣ ＣＴＧ　ＧＣＣＡＡＧ　３８４ＡＡＧ　に（：に　ＧＡＡ　Ａ（Ｇ；　ＧＡＧ　 ＣＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣにＣＣＣＣＡＣＣＣ 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Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ１６５　１フ０　１ ７５ Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　にＬｙ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ＬａｕＬａｕ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ＡｒｇＶａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ ｒ　Ｖａｌ　八ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈｕ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｕ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｆ’ｒｏ　Ｌａ■ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈａ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ｉ ’ｒｏ　ＡＳＰ＾ｒｇ　Ｃ１ｕ　にｌｙ　、Ｌｅｕ　ＡｒｇＣ１ｕ　Ｇｌｙ　Ａ ｌａ　Ｐｈｅνａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ＴｒｐＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ 　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ 　Ｈｌｓ　ＡｒｇＡｈａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｃ１ｙ　Ｌ ｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ＧｌｙＬｅ ｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｌ ａ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃ１ｙ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　 Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　ＴｒｐＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈ ｌｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇ ｉｎ　Ｇ１ｎ４０５　４１０　１！ｔ１５ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ＾ｒｇ　Ｖ ａｌ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｍｅｅ　Ｇｌｕ＾１ａｋ３５　４４０　４４５ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｉ’ｈａ　Ｇｌｙ＾ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖ 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Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌａ。 ＴＴＣ；　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡ（：　ＴＡＴ　ＣｋＡ　ＡＡ Ａ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＡＣ丁＾（：Ａ　ＴＡＴ　ＡＴｒ　Ｃ`Ｔ　１８２４ Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｃ１ｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　丁ｙｒ　ＩＬａ　ＡｓｎＴＣＡ　ＡＴＡ　Ｃ ＣＧ　ＴｒＡ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＧ Ｇ　ＣＴＣＣＡＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　１W７２ ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　（：（Ａ 　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＡにＴ　Ａ（πＴＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＡ@１９２０ Ｐｈｅ　ＨＬｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒ。 ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＣＭ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＡＣＣＣＭ 　ＧＡＡ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　ＣＭ　ＡＴＡ　ＡＧＡ　１９６W ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　 ＴＧＧ　ＴＣ；Ｇ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＧにＴ　ＧＣＴ　ＧＡb２０１６ Ｌｙｓ　Ａ１１ｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＧＬｎ　Ａｓｐ 　Ｔｒｐτｒｐ　ＩＩｓ　Ｌ４Ｉｕ　Ｇｌｙ＾１ｇ　ＡｓｐＴＡＴ　丁ＣＴ　Ｃ ＡＧ　ＡＴＡ　にＡＡ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　Ｃ 丁ＡＡＧτＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　２O６４ Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＧｌｕＡＡＴ　ＣＴＡＣＴ Ｔ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　７１τんｌｔＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＡＴ ｒ　ＣＡＴ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　Q１１２ ｈｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　ＡＬＰ　 Ｌｅｕ　ＡＩＩＰ　Ｉｌｅ　）ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｉｅ　Ｔ■■ ＧＣＴ　ＧＣＣＡＡＡ　ＡＴＴ　ｍ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　にＡＧ　ＡＴに 　ｍ　に丁τＡＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　２１６０Ａｌａ　ＡＬａ　Ｌｙ ｓ　ＩＬｅ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｖａ ｌ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　ＭａｃＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＡＡに 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（ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１２：Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｍａｔ　Ｐｈ ＠Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｔｙｒ 　Ａｒｇ＾１ａ（２）配列番号：１３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （１１）分子の型：　ＤＮＡプローブＢＷ３３（山）ハイボセティカル二ＮＯ （ｉｖ　）アンチーセンス二ＮＯ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１３＝ＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧ　ＣＧＴＡＡＣＣ ＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧ　ＣＧＣ３３（２）配列番号＝１４： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：３０　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　［ｌＮＡプローブＢイ３７（ｉｎ　）ハイボセティカル： Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス＝ＮＯ （ｘｔ）配列の記載：配列番号＝１４：ＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡ ＧＴ　ＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡ　３０（２）配列番号：１５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４　アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル：　ＹＥＳ（ｉｖ）アンチーセンス二Ｎ０ （ｉｘ）特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：ペプチド（Ｂ）位置：　１．．４ （Ｄ）他の情報：／ラベルーＸａａ ／注＝　”Ｘａａ　＝Ｖａｌ又はＴｈｒ″（ｘｉ）配列の記ｓ！＝配列番号：１ ５：（２）配列番号：１６： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：５　アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ　）分子の型：ペプチド （ｉｔ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチ−センス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：　１ｎｔｅｒｎａｌ（ｘｉ）配列の記１３ｉ＝配列番号 ＝１６：（ｖ）フラグメント型：　１ｎｔｅｒｎａｌ（ｉｘ）特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：ペプチド（Ｂ）位置：　１．．７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Ｘａａｌ−４／注＝″Ｘａａｌ”ｌｌｅ又はＬｅｕ 又はＡｌａ　；　Ｘａａ２−４゜それぞれ任意のアミノ酸 （ｘｉ）配列の記！！＝配列番号＝２０：（２）配列番号：２１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２　ヌクレオチド （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマー１’１Ｘ６１（ｉｊ）ハイポセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２１：ＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡ　ＣＴＧＣＣＡＣ ＡＣＡ　ＣＣ２２（２）配列番号＝２２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３８　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　［ｌＮＡプライマーＲＡＯＩ（ｉｊ）ハイボセテイカル二 Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２２＝ＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡ ＧＧ　ＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡ　ＧＣＴＣＣＴＴＧ　３８（２）配列番号＝２３＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０　核酸 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）［の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマー〇Ｇ２９（ｉｊ）ハイボセテイカル二Ｎ Ｏ （ｉｖ　）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号＝２３：ＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡ ＧＣＴ　２０（２）配列番号＝２４： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１６　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＤＧ３０（ｉｉｉ）ハイポセテイカル： ＮＯ （ｉｖ　）アンチ−センス＝ＮＯ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号：２４：ＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡ　ＧＡＣＡＴＡ 　１６（２）配列番号：２５： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｉ￥の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＰＬＩＯ（ｉｉｉ）ハイボセティカル： Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ　）配列の記！！：配列番号：２５：ＧＧＣＧＴＡＣＣＴＴ　ＴＧＴＣＴ ＣＡＣＧＧ　ＧＣＡＡＣ２５（２）配列番号＝２６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＦＬ６３（山）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチ−センス＝ＮＯ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号：２６：ＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡ　ＴＧＣＴＴＣ ＡＧＣＴ　ＴＧＴＧＡＡＣＧ　２Ｂ（２）配列番号＝２７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）［の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　ＤＮＡプライマーＦＬ６９（ｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ ０ （ｉｖ）アンチーセンス二Ｎ０ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号：２７：ＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣ ＴＧＡ　ＡＣＡＧＣＡＧ　２７（２）配列番号：２８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３６　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＦＬ６４（ｉｊ）ハイボセティカル：Ｎ Ｏ （ｉｖ　）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号＝２８：ＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧ　ＴＣＴＴＴＧ ＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＣＴＡＴ　ＣＡＡＴＡＴ　３６（２）配列番号：２９： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１８　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ　）分子の型：　ＤＮＡプライマーＦＬ６５（山）ハイボセティカル二Ｎ ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ　）配列の記１ｉｊ：配列番号＝２９：ＴＡＧＴＡＡＣＣＧＧ　ＴＧＡＣ ＡＡＡＧ（２）配列番号＝３０＝ （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：３１　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｈの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＦＬ６６（山）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチーセンス二Ｎ０ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号：３０：ＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧ　ＧＡＴＡＧＡ ＴＣＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣ（２）配列番号：３１： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：３１　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＰＬ６７（ｉｉｉ　）ハイボセティカル ：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号＝３１：ＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧ　ＧＡＡＡＣＴ ＴＡＣＡ　ＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧ　Ａ（２）配列番号：３２： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝４９　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 １８　（Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型＝ＤＮＡプライマーＴＺＡ２９２（ｉｊ）ハイボセティカル二 ＮＯ （ｉｖ　）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３２：ＧＴＣＧＧＣＡＴＡＴ　ＧＧＣＴＣＣＴ ＧＣＴ　ＣＣＴＣＴＴＧＡＧＧ　ＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＣＣＣＧＣＣ（ ２）配列番号：３３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３７　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 ３１　（Ｃ）Ｈの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二車鎖状 （ｉｉ）分子の型：　Ｄ）ＪＡブラ、Ｉ’　？　−ＴＺＲＯＩ（ｉｊ）ハイボセ ティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記ａ：配列番号＝３３：ＧＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴ ＴＧ　ＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣ（２）配列番号：３４： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：４９　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 ３１　（Ｃ）Ｈの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＴＳＡ２８Ｂ（ｉｉ）ハイボセティカル 二Ｎ０ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３４：ＧＴＣＧＧＣＡＴＡＴ　ＧＧＣＴＣＣＴ ＡＡＡ　ＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧ　ＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＣＣＣＧＣＣ４ ９（２）配列番号：３５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３７　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）１Ｎの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＴＳＲＯ１（ｉｎ）ハイボセティカル： Ｎ０ （１ｖ）アンチ−センス：Ｎｏ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３５：ＧＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴ ＴＧ　ＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣ３７（２）配列番号：３６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４１　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：　ＤＮＡプライマー〇Ｇ１２２（ｉｉ）ハイボセティカル： ＮＯ （ｉｖ　）アンチーセンス二Ｎ０ （ｘｉ　）配列の記載：配列番号＝３６＝ＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧ　ＧＣＡＧＡＴ ＣＴＧＡ　ＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴ　ＴＧＧＣＧＧＡＡＡＧ　Ｃ（２）配列番号： ３７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４８　ヌクレオチド （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡブーｙ　イ？　−ＴＡＦｒ２８５（ｉｉｉ）ハイボ セティカル＝ＮＯ （２）配列番号＝３８： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６　ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡプライマーＴＡＰＲＯＩ（ｉｉｉ）ハイポセテイカ ル＝Ｎ。 要約書 本発明は、それぞれの天然ポリメラーゼに比べて異なるレベルのソヌクレアーゼ 活性を変更する１本発明番よ同様にこのような変更されたポリメラーゼを単離及 び製造するための手段にも関する。 国際調査報告 ｍｓｗｕｍａｌＡｅｍｌｃ＊＋ｌｓａ　Ｈｅ　ＯｒイハＫ　０＋／ｎ７１’Ｙｃ 国際調査報告 Ｔｈｗ脚罰−１輪−ｍ＋−１−マー陶−轄−鵡ｔ　＋ｅ−ｐｍｓ＋＋　４哲曽− 心σｄ膳伽−書譜１日も０ｅ−１噛峠−一を叩帆召；：シフー：Ｊ苫鼠：フ：： 二；＝二ｊ＝二ｗｐｓｒｔ！−＝１ｍ−μ“二：ムγ−１ｗ　ｔｈｅ−１−−ｅ ｌ　Ｗ＊−間

Claims (75)

【特許請求の範囲】
1. １．天然ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性から変化した当該活 性を有する組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
2. ２．天然ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に比べて高い当該活 性が示される、請求項１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
3. ３．アミノ酸配列Ａ（Ｘ）ＹＧ（ここでＸはＶ又はＴである）（配列番号：１５ ）、及び／又はアミノ酸配列　ＸＡ　Ｘ２ＹＫＡ（ここでＸＡはＩ，Ｌ又はＡで あり、そしてＬＸ３は３個のアミノ酸から成る任意の配列である）（配列番号： ２０）を含んで成る、請求項２に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵 素。
4. ４．天然ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性より低い当該 活性が示される、請求項１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
5. ５．天然形態においてはアミノ酸配列Ａ（Ｘ）ＹＧ（ここで、ＸはＶ又はＴであ る）（配列番号；１５）を含んで成り、このアミノ酸配列が組換え型酵素中では 変異又は欠失されている、請求項４に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼ酵素。
6. ６．配列番号：１５のＧが変異させられている、請求項５に記載の組換え型熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
7. ７．配列番号：１５のＧがＡに変異させられている、請求項６に記載の組換え型 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
8. ８．天然形態ではアミノ酸前列ＨＥＡＹＧ（配列番号：１６）を含んで成り、こ のアミノ酸配列が組換え型酵素中では変異又は欠失されている、請求項４に記載 の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
9. ９．天然形態ではアミノ酸配列ＨＥＡＹＥ（配列番号：１７）を含んで成り、こ のアミノ酸配列が組換え型酵素中では変異又は欠失されている、請求項４に記載 の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
10. １０．天然形態ではアミノ酸配列ＸＬＥＴ（ここで、ＸはＬ又はＩである）（配 列番号：１８）を含んで成り、このアミノ酸配列が組換え型酵素中では変異又は 欠失されている、請求項４に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
11. １１．テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７、テルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスＺ０５、テルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ）、テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐ ｈｉｌｕｓ）、テルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉ ｃａｎｕｓ）及びテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉ ｍａ）の変異体形態から成る群から選択された、請求項４に記載の組換え型熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
12. １２．配列番号：２のアミノ酸７７〜８３２を含んで成るテルムス・アクアチク ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態である、請求項１１に 記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
13. １３．配列番号：２のアミノ酸４７〜８３２を含んで残るテルムス・アクアチク ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態である、請求項１１に 記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
14. １４．配列番号：２のアミノ酸１５５〜８３２を含んで成るテルムス・アクアチ クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮｎポリメラーゼ酵素。
15. １５．配列番号：２のアミノ酸２０３〜８３２を含んで成るテルムス・アクアチ クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
16. １６．配列番号：２のアミノ酸２９０〜８３２を含んで成るテルムス・アクアチ クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
17. １７．配列番号：４のアミノ酸３８〜８９３を含んで成るテルモトガ・マリチマ （Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異体形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
18. １８．配列番号：４のアミノ酸２１〜８９３を含んで成るテルモトガ・マリチマ （Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異体形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
19. １９．配列番号：４のアミノ酸７４〜８９３を含んで成るテルモトガ・マリチマ （Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異形態である、請求項１１に 記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
20. ２０．配列番号：４のアミノ酸１４０〜８９３を含んで成るテルモトガ・マリチ マ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異形態である、請求項１１ に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
21. ２１．配列番号：４のアミノ酸２８４〜８９３を含んで成るテルモトガ・マリチ マ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の変異形態である、請求項１１ にに記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
22. ２２．配列番号：６のアミノ酸４４〜８３０を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒｍ ｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
23. ２３．配列番号：６のアミノ酸７４〜８３０を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒｍ ｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
24. ２４．配列番号：６のアミノ酸１５２〜８３０を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え 型熱安定ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
25. ２５．配列番号：６のアミノ酸２００〜８３０を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え 型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
26. ２６．配列番号：６のアミノ酸２８８〜８３０を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え 型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
27. ２７．配列番号：８のアミノ酸４７〜８３４を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒｍ ｕｓ）スペーシスＺ０５の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
28. ２８．配列番号：８のアミノ酸７８〜８３４を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒｍ ｕｓ）スペシスＺ０５の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
29. ２９．配列番号：８のアミノ酸１５６〜８３４を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスＺ０５の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
30. ３０．配列番号：８のアミノ酸２０４〜８３４を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスＺ０５の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
31. ３１．配列番号：８のアミノ酸２９２〜８３４を含んで成るテルムス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ）スペーシスＺ０５の変異体形態である、請求項１１に記載の組換え型熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
32. ３２．配列番号：１０のアミノ酸４７〜８３４を含んで成るテルムス・サーモフ ィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異形態である、請求 項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
33. ３３．配列番号：１０のアミノ酸７８〜８３４を含んで成るテルムス・サーモフ ィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態である、請 求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
34. ３４．配列番号：１０のアミノ酸１５６〜８３４を含んで成るテルムス・サーモ フィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
35. ３５．配列番号：１０のアミノ酸２０４〜８３４を含んで成るテルムス・サーモ フィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
36. ３６．配列番号：１０のアミノ酸２９２〜８３４を含んで成るテルムス・サーモ フィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
37. ３７．配列番号：１２のアミノ酸３８〜８９２を含んで成るテルモシポ・アフリ カヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
38. ３８．配列番号：１２のアミノ酸９４〜８９２を含んで成るテルモシポ・アフリ カヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
39. ３９．配列番号：１２のアミノ酸１４０〜８９２を含んで成るテルモシポ・アフ リカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
40. ４０．配列番号：１２のアミノ酸２０４〜８９２を含んで成るテルモシポ・アフ リカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
41. ４１．配列番号：１２のアミノ酸２８５〜８９２を含んで成るテルモシポ・アフ リカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異形態である、 請求項１１に記載の組換え型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
42. ４２．請求の範囲第１１項に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードす るＤＮＡ配列において、この酵素がテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　 ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１のヌクレオチド ２２９−２４９９を含んで成るＤＮＡ配列。
43. ４３．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酸素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ ｉｃｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１のヌクレオチド１３９−２ ４９９を含んで成るＤＮＡ配列。
44. ４４．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ ｉｃｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１のヌクレオチド４６３−２ ４９９を含んで成るＤＮＡ配列。
45. ４５．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ ｉｃｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１のヌクレオチド６０７−２ ４９９を含んで成るＤＮＡ配列。
46. ４６．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔ ｉｃｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１のヌクレオチド８６８−２ ４９９を含んでいるＤＮＡ配列。
47. ４７．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒ ｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：３のヌクレオチド１３２− ２６８２を含んで成るＤＮＡ配列。
48. ４８．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａ ｒｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：３のヌクレオチド６１− ２６８２を含んで成るＤＮＡ配列。
49. ４９．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒ ｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：３のヌクレオチド２２０− ２６８２を含んで成るＤＮＡ配列。
50. ５０．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒ ｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：３のヌクレオチド４１８− ２６８２を含んで成るＤＮＡ配列。
51. ５１．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒ ｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：３のヌクレオチド８５０− ２６８２を含んで残るＤＮＡ配列。
52. ５２．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒ ｉｔｉｍａ）の変異体形態であり、そして配列番号：５のヌクレオチド１３０− ２４９３を含んで成るＤＮＡ配列。
53. ５３．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素ががルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の 変異体形態であり、そして配列番号：５のヌクレオチド２２０−２４９３を含ん で成るＤＮＡ配列。
54. ５４．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の 変異体形態であり、そして配列番号：５のヌクレオチド４５４−２４９３を含ん で成るＤＮＡ配列。
55. ５５．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシス３ｐｓ１７の 変異体形態であり、そして配列番号：５のヌクレオチド５９８−２４９３を含ん で成るＤＮＡ配列。
56. ５６．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスｓｐｓ１７の 変異体形態であり、そして配列番号；５のヌクレオチド８６２−２４９３を含ん で成るＤＮＡ配列。
57. ５７．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスＺ０５の変異 体形態であり、そして配列番号：７のヌクレオチド１３９−２５０５を含んで成 るＤＮＡ配列。
58. ５８．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーソスＺ０５の変異 体形態であり、そして配列番号：７のヌクレオチド２３２−２５０５を含んで成 るＤＮＡ配列。
59. ５９．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーソスＺ０５の変異 体形態であり、そして配列各号：７のヌクレオチド４７６−２５０５を含んで成 るＤＮＡ配列。
60. ６０．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーソスＺ０５の変異 体形態であり、そして配列番号：７のヌクレオチド６１０−２５０５を含んで成 るＤＮＡ配列。
61. ６１．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）スペーシスＺ０５の変異 体形態であり、そして配列番号：７のヌクレオチド８７４−２５０５を含んで成 るＤＮＡを列。
62. ６２．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕ）の変異体形態であり、そして配列番号：９のヌクレオチド１３ ９−２５０５を含んで成るＤＮＡ配列。
63. ６３．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：９のヌクレオチド２ ３２−２５０５を含んで成るＤＮＡ配列。
64. ６４．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：９のヌクレオチド４ ６６−２５０５を含んで成るＤＮＡ配列。
65. ６５．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：９のヌクレオチド６ １０−２５０５を含んで成るＤＮＡ配列。
66. ６６．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：９のヌクレオチド８ ７４−２５０５を含んで成るＤＮＡ配列。
67. ６７．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ 　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１１のヌクレオ チド１１２−２６７９を含んで成るＤＮＡ配列。
68. ６８．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 兵配列において、この酵素がテルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈ ｏ　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１１のヌクレ オチド２８０−２６７９を含んで成るＤＮＡ配列。
69. ６９．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ 　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１１のヌクレオ チド４１８−２６７９を含んで成るＤＮＡ配列。
70. ７０．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ 　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１１のヌクレオ チド６１０−２６７９を含んで成るＤＮＡ配列。
71. ７１．請求項１１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ 配列において、この酵素がテルモシポ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ 　ａｆｒｉｃａｎｕｓ）の変異体形態であり、そして配列番号：１１のヌクレオ チド８５３−２６７９を含んで成るＤＮａ配列。
72. ７２．請求項３に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配 列。
73. ７３．請求項５〜１０のいずれか１項に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素 をコードするＤＮＡ配列。
74. ７４．請求項４２〜７３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含んで成る組換え 型ＤＮＡベクター。
75. ７５．請求項７４に記載のベクターで形質転換された組換え型宿主細胞。