JP2000503521A - 末梢神経系特異的ナトリウムチャンネル、それをコードするdna、結晶化、x線回折、コンピューター分子モデリング、合理的薬物設計、薬物スクリーニング、ならびにその製造法および使用法 - Google Patents

末梢神経系特異的ナトリウムチャンネル、それをコードするdna、結晶化、x線回折、コンピューター分子モデリング、合理的薬物設計、薬物スクリーニング、ならびにその製造法および使用法

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Abstract

(57)【要約】 少なくとも1つの末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネル(SC)調節活性を有する治療剤または診断剤またはリガンドを単離し、結晶化し、X線分析分子モデリングし、合理的薬物設計し、選択し、製造し、そして用いるための少なくとも1つの末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネルペプチド(SCP)をコードする核酸を含むクローニング、発現、ウイルスおよび送達べクターおよび宿主、単離されたPN SSCP、ならびに化合物および組成物および方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 末梢神経系特異的ナトリウムチャンネル、それをコードするDNA、結晶化、X線 回折、コンピューター分子モデリング、合理的薬物設計、薬物スクリーニング、 ならびにその製造法および使用法 関連する用途への相互参照 本出願は、1994年11月2日に提出された米国特許出願第08/334,029号の一部継 続出願である、1995年6月7日に提出された米国特許出願第08/482,401号の一部 継続出願であり、両出願の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用され る。 連邦政府援助による研究および開発のもとでなされた発明に対する権利に関する 表示 本発明は合衆国政府の援助でなされた。従って、合衆国政府は本発明に一定の 権利を有している。 発明の分野 本発明は、バイオテクノロジー、タンパク質精製および結晶化、X線回折分析 、三次元コンピューター分子モデリング、および合理的薬物設計(RDD)の分野に 関する。本発明は、単離された末梢神経系(PNS)特異的ナトリウムチャンネルタ ンパク質(SCP)およびコードする核酸、ならびにナトリウムチャンネル調節活性 を有する化合物、組成物、およびそのような治療剤または診断剤の選択、製造お よび使用方法に関する。本発明は、コンピューター読み出し可能な媒体上のX線 データおよび/またはアミノ酸配列データの使用に基づく、PNS SCPの三次元コン ピューターモデリング、およびRDDをさらに提供する。 発明の背景 電圧感受性イオンチャンネルは、イオンで発生する膜電位を経由して情報を伝 達する能力として、細胞興奮性の基礎を提供する膜貫通タンパク質のクラスであ る。膜電位における変化に応答して、これら分子は、神経細胞膜中の高度に選択 的な孔を通じて迅速なイオン流を仲介する。チャンネル密度が十分に高いとき、 活動電位と呼ばれる適切な再生可能な脱分極が起こる。 電圧感受性ナトリウムイオンチャンネルは、興奮性細胞における活動電位発生 の最もしばしば原因となるイオンチャンネルである。異なる興奮性組織中のナト リウムに基づく活動電位は似ているように見えるが(Hille,B.,:Ionic Channelso f Excitable Membranes,B.Hille編、Sinauer,Sunderland,MA,(1984)、70〜71 頁)、最近の電気生理学的研究は、異なる細胞のナトリウムチャンネルはその構 造および機能的特性の両方が異なることを示し、そして別個の主要構造を有する 多くのナトリウムチャンネルが現在同定されている。例えば、Mandel,J.Membran e Biol.125:193〜205(1992)を参照のこと。 機能的に異なるナトリウムチャンネルが、種々のニューロン細胞型(Linasら、 J.Physiol.305:197〜213(1980); Kostyukら、Neuroscience 6:2423〜2430(1981 ); Bossuら、Neurosci.Lett.51:241〜246(1984)1981; Gillyら、Nature 309:4 48〜450(1984); Frenchら、Neurosci.Lett.56:289〜294(1985);Ikedaら、J.Ne urophysiol.55:527〜539(1986); Jonesら、J.Physiol.389:605〜627(1987); A lonso & Llinas,1989; Gillyら、J.Neurosci.9:1362〜1374(1989)、および骨 格筋(Gonoiら、J.Neurosci.5:2559〜2564(1985);Weissら、Science 233:361〜3 64(1986))に記載されている。神経膠およびニューロンにおけるナトリウム流の 動力学もまた区別され得る(Barresら、Neuron 2:1375〜1388(1989))。 中枢神経系(CNS)で広範に発現するII型およびIII型遺伝子は、PNS中のある細 胞では非常に低レベルで発現する(Beckh,S.,FEBS Lett.262:317〜322(1990))。I I型およびIII型mRNAは、脊髄神経節(DRG)、脳神経および坐骨神経において、ノ ーザンブロット分析によりかろうじて検出され得た。これに対してI型mRNAは、D RGおよび脳神経中に適度に多量に存在したが、坐骨神経中には低レベルであった 。保存cDNAプローブを用いて検出された総ナトリウムチャンネルmRNAに対する3 つすべての脳mRNA量の比較は、DRGニューロンにおける、まだ未同定のさらなる ナトリウムチャンネル型の存在を示唆した。mRNA研究と一致して、免疫化学的研 究 は、I型またはII型のナトリウムチャンネルαサブユニットのいずれもが、上頸 神経節または坐骨神経中の総ナトリウムチャンネルの顕著な成分を構成しないこ とを示した(Gordonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8682〜8686(1987))。 脊椎動物DRG中のニューロン集団が電気生理学的に同定されており、これは、 より一般的なチャンネルに加えて、別のナトリウムチャンネル型を含む;このDR Gチャンネルは、骨格筋または心臓のいずれかにおけるナトリウムチャンネルのkD に比べ約10倍高いTTXのkDを有する(Jonesら、J.Physiol.389:605〜627(1987)) 。 神経系における特定領域に対する異なるナトリウムチャンネルの局在性は、こ の遺伝子ファミリーの細胞特異的調節が転写レベルである可能性を支持する。他 の真核生物遺伝子との類似性により、個々のナトリウムチャンネル遺伝子の細胞 特異的および一時的な調節を仲介する別のDNA要素が存在し得る。 ナトリウムチャンネル遺伝子調節の研究は、ニューロン分化の一般的な細胞モ デルであるクロム親和性(PC12)細胞のような良く特徴付けられた細胞株の使用に より促進されてきた(Greenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:2424〜2428(1976);H alegouaら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.165:119〜170(1991))。軸索の伸長お よび特定の神経伝達物質の合成開始に加えて、NGF処理PC12細胞は、ナトリウム に基づく活動電位を発生する能力を獲得する(Dichterら、Nature 268: 501〜504 (1977))。この能力は、NGF処理細胞の膜中の機能的ナトリウムチャンネルの密度 の増加により付与される(Rudyら、J.Neurosci.7:1613〜1625(1987); Mandelら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:924〜928(1988); O'Lagueら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:1701〜1705(1980))。ノーザンブロット分析は、未分化のPC12細胞は、NG F処理後観察されたチャンネル活性における増加と一致して増加したナトリウム チャンネルmRNAの基礎レベルを含んでいたことを示した(Mandelら、Proc.Natl.A cad.Sci.USA 85:924〜928(1988))。 末梢神経系(PNS)損傷に伴うか、または遺伝的または他の疾患状態(例えば、PN Sナトリウムチャンネル(SC)の欠如または欠損を含む)において、損なわれたPNS 神経伝達に関連する病状の診断および/または処置が長年必要とされている。細 胞または組織特異的ナトリウムチャンネルの可能性を考慮して、単離されたPNS SCの発見および使用、ならびにコードする核酸は、適切なPNS SC調整薬物または 分子(例えば鎮痛薬)をスクリーニングすることにより、またはインサイチュまた はインビボ遺伝子療法に組換えPNS SCを用いて、PNS SC関連病状を患う哺乳動物 患者の末梢神経系の少なくとも一部分においてPNS SCを置換または補充すること のいずれかにより、このような病状を診断または処置する機会を提供し得る。 発明の要旨 本発明(以後「発明」)は、末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネルペプ チド(SCP)、コードする核酸、ベクター、宿主細胞および抗体、ならびに組換え 発現、精製、細胞を基礎にした薬物スクリーニング、遺伝子療法、結晶化、X線 回折分析を含むその製造法および使用法、ならびにコンピューター読み出し可能 な媒体上の少なくとも1つのPNS SCPアミノ酸配列および/またはX線回折データ を利用するコンピューター構造決定および合理的薬物設計を提供する。 本発明はまた、PNS SCPコード配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、 ならびにプローブが標識されるサンプル中の検出方法を包含する。本発明は、PN S SCPを製造する方法をさらに包含し、この方法は、PNS SCP核酸を含む宿主を培 養培地で培養する工程;およびこの宿主またはこの培養培地からPNS SCPを単離 する工程を包含する。 本発明は、PNS SCPに特異的なエピトープに結合する抗体、およびこの抗体を 発現する宿主細胞をさらに含む。この抗体を用いる診断または治療方法もまた本 発明に含まれる。 本発明は、遺伝子療法および少なくとも1つのPNS SCPをコードするかまたは それに相補的な核酸を含む送達ベクター、ならびに薬学的に受容可能なその組成 物をさらに包含する。 本発明はまた、アンチセンスPNS SCP核酸を、鎮痛効果のようなPNS SC調節効 果を提供するために有効な量で動物に投与する方法による遺伝子療法を包含する 。 本発明はまた、タンパク質の三次元分子モデリングに有用であるに十分な高解 像度のX線回折パターンを得るために分析され得るPNS SCPを精製および結晶化 する方法をさらに提供する。コンピューター読み出し可能な媒体上に提供される X線回折データ、原子座標、および/またはアミノ酸配列は、本発明の方法を用 いてコンピューターシステム上でモデル化され、PNS SCPの二次、三次および/ま たは四次構造を生成し、これら構造は、それらの全体の三次元構造、ならびにPN S SCPの結合および活性部位に寄与する。 合理的薬物設計(RDD)のための分子モデリング法およびコンピューターシステ ムもまた本発明により提供される。これらの薬物設計法は、コンピューターモデ リングプログラムを用い、PNS SCP上の部位またはドメインと結合するために計 算される潜在的リガンドまたは作用因子を見出す。次いで潜在的リガンドまたは 作用因子を調節または結合活性についてスクリーニングする。このようなスクリ ーニング法は、既知のナトリウムチャンネルアッセイに従ってPNS SCP関連病状 または傷害と関連するような、タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性に対 するアッセイから選択され得る。本発明の方法により提供され、得られるリガン ドは合成され、そして哺乳動物において少なくとも1つのPCS SCP関連病状また は傷害を処置、阻害または予防するために有用である。 本発明のさらなる目的、特徴、有用性、実施態様および/または利点は、本明 細書中に提供されるさらなる記載から明らかであり得る。 図面の簡単な説明 図1は、配列番号2のアミノ酸233〜555、および配列番号1のヌクレオチド69 9〜1665として、末梢神経I型(PNI)ナトリウムチャンネルα()サブユニットのド メインIIIの一次構造としてアミノ酸およびDNA配列の両方について、PNS SCPの3 23アミノ酸配列および対応する969ヌクレオチド配列を示す。一文字のアミノ酸 コードを推定アミノ酸を表示するために用いる。YJ1およびY01Cは、PN1 cDNAの 初期PCRフラグメントを得るために用いたオリゴヌクレオチドプライマーを指す 。 図2A〜2Bは、神経成長因子で処理されたラットクロム親和性(PC12)細胞におけ るナトリウムチャンネルαサブユニットmRNAのノーザンブロット分析を示す。図 2(A)では、用いたプローブは、ラットII型ナトリウムチャンネルの高度に保存さ れた第4反復ドメインをコードするpRB211である。このプローブでH型およびPN1 型 mRNAの両方が検出される。図2(B)では、用いたプローブはPN1に特異的な配列 を含む。ナトリウムチャンネルmRNAのレベルは、示されたように、シクロフィリ ンmRNA量を参照して定量される。コントロール細胞は、NGFの非存在下で増殖し たPC12細胞である。 図3A〜3Bは、PN1 mRNAの組織特異的分布の例を示す。図3(A)は、組織由来の等 量のRNAを用いるノーザンブロット分析を表す。PN1 mRNAは点線で示される。28S は28S rRNAを示す。プローブはPN1遺伝子に特異的な配列を含む。骨格筋、心筋 にはPN1 mRNAは存在しないこと、および脊髄中ではPN1 mRNAが低レベルであるこ とに注意。図3(B)はPN1 mRNAのRNAase保護分析を示す。PN1は、異なる組織サン プル由来のmRNAにより保護されたPN1プローブを示す。アクチンは同じmRNAによ り保護されたアクチンプローブ配列を示す。 図4A〜4Fは、インサイチュハイブリダイゼーション分析による上頸神経節(SCG )および脊髄神経節(DRG)組織中のPN1 mRNAの局在性を示す。図4A〜4Bは、PN1特 異的アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズしたニューロンを表す。図4C〜4 Dは、非標識PN1競合剤DNAの存在下で放射標識したPN1プローブとハイブリダイズ したニューロンを表す。図4E〜4Fは、アンチセンスII型プローブとハイブリダイ ズした組織切片を表す。 図5は、SCG中のPN1レベルと脳Ia型サブユニットmRNAを比較するブロット分析 を示す。保存されたナトリウムチャンネルブローブpRB11は、II/IIA型およびPN1 型転写物の両方を検出する。 図6A〜6Bは、生後のラット成長の間のPN1およびI型ナトリウムチャンネルmRNA の発現の違いを示すノーザンブロット分析を示す。図6(A)は、プローブとして放 射標識したアンチセンスpRB211RNAを用いるノーザンブロットの代表的なオート ラジオグラムを示す。生後7日(P7)から42日(P42)までが示される。図6(B)は、 誕生後、時間とともにI型mRNAが減少することを示すノーザンブロットの定量プ ロットを示す。 図7A〜7Dは、部分的な3033ヌクレオチド(配列番号1)配列、および部分的な10 11アミノ酸(配列番号2)配列として、PN1aサブユニットcDNAのクローン化部分の 推定一次構造を示す。 図8A〜8Dは、PN1(配列番号2の1〜988)および脳II/IIA型αサブユニット(配 列番号)の推定一次アミノ酸配列の比較を示す。 図9A〜9Dは、ラットPN1 PNS SCP(配列番号9)の全長DNA配列を示す。 図10は、ラットPN1 PNS SCP(配列番号10)の全長アミノ配列を示す。 図11A〜11Eは、ラットPN1(「RATPN1」)(配列番号10)のアミノ酸配列と、2つ の予想されるヒトPN1配列「HUMPN1A」(配列番号11)「HUMPN1B」(配列番号12)HUM PN1C(配列番号7)およびHUMPN1D(配列番号)を示す。代替II配列は、「X」が表1 または表2から必要に応じて選択され得る同じかまたは異なるアミノ酸の0、1 、2、または3である配列を含む。 図12は、三次元構造決定および/または合理的薬物設計に適切なコンピュータ ーシステムを示す。 図13A〜13Bは、ヒトPN1(HUMPN1A)(配列番号13)をコードする代表的なDNA配列 を示す。 図14A〜14Bは、ヒトPN1(HUMPN1B)(配列番号14)をコードする代表的なDNA配列 を示す。 発明の詳細な説明 少なくとも1つの末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネル(SC)の活 性化を調節する必要がある。このような調節は、PNSにおける神経伝導に関連す る疼痛または病状のための鎮痛薬または診断薬を潜在的に提供し得る。 特定のナトリウムチャンネル(本発明のPNS SCPに対応する)は、現在、優先 的にまたは選択的に末梢神経系(PNS)において発現されることが見出される。 これらのナトリウムチャンネルは、優先的にPNSにおける末梢神経刺激伝導を調 節する。本発明は、末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネルペプチド(S CP)、それをコードする核酸、ベクター、宿主細胞および抗体、ならびにこれら を作製および使用する方法を提供する。これらには、組換え発現、精製、細胞に 基づく薬物スクリーニング、遺伝子療法、結晶化、X線回折分析、ならびにコン ピューター読み出し可能な媒体上に提供される少なくとも1つのPNS SCPアミノ 酸配列および/またはX線回折データを利用する、コンピューター構造決定およ び合理的な薬物設計を含む。 PNSナトリウムチャンネルペプチド(PNS SCP)は、フラグメント、コンセンサ ス配列、または繰り返し単位としてSC活性を有するPNSナトリウムチャンネル(S C)のいずれかのサブセットを指し得る。本発明のPNS SCPは、以下によって調製 され得る: (a)組換えDNA法; (b)完全な分子のタンパク質またはそのフラグメントのタンパク質分解消化; (c)当該分野で周知の化学的ペプチド合成法;および/または (d)PNS SCPを生成し、そしてPNS SCPの活性部分に類似したコンホメーション を有しかつSC活性を有することができる任意の他の方法による。SC活性は、ナト リウムチャンネル活性についての公知のスクリーニングアッセイによって、イン ビトロ、インサイチュ、またはインビボでスクリーニングされ得る。活性を有す るための最小のペプチド配列は、少なくとも1つのPNS SCPの特定の領域、ドメ イン、コンセンサス配列、またはそれらの繰り返し単位を含む最小単位に基づく 。 本発明によれば、PNS SCPは、PNS SCP(例えば、1〜40ドメインまたはその中 の任意の範囲または値)に対応する2つ以上のポリペプチドドメイン(例えば、 膜貫通ドメイン、孔内張りドメイン(pore lining domain)、またはそれらのフ ラグメント)の会合物を含む。本発明のPNS SCPの膜貫通ドメイン、細胞質孔内 張りドメイン、または他のドメインは、本明細書中に記載のようなSCドメイン( 例えば、図1、7、8、10または11に示されるように)に対応する1つ以上に対 して少なくとも74%の相同性(例えば、74〜100%の全体にわたる相同性または 同一性)あるいはその中の任意の範囲または値を有し得る。当業者に理解される ように、ドメインの上記の配置は、本発明のPNS SCPの一部として提供される。 このようにして、機能的なPNS SCPは、適切な細胞において発現される場合、脂 質二重層、細胞膜、または膜モデルを通してナトリウムイオンを輸送し得る。十 分なナトリウムチャンネルを有する完全な細胞において、細胞は、例えば少なく とも1つの本発明のPNS SCPを発現する細胞において、活動電位のいくつかの形 態を生じ得る。このような輸送は、適切なSC活性アッセイにより測定されるよう に、1つ以上の本発明のPNS SCPのSC活性を確立する。 従って、本発明のPNS SCPは、さもなければ、少なくとも1つの20〜2005アミ ノ酸フラグメントおよび/またはPNS SCPまたはPNS SCP群のコンセンサス配列に 実質的に対応するSCアミノ酸配列の一部のペプチドを含む。ここで、PNS SCPは 、図1、7、8、10、または11の少なくとも1つの配列またはコンセンサス配列 に、少なくとも74〜99%の相同性または同一性、例えば、88〜99%(またはその 中の任意の範囲または値、例えば、87〜99、88〜99、89〜99、90〜99、91〜99、 92〜99、93〜99、94〜99、95〜99、96〜99、97〜99、または98〜99%)の相同性 を有する。1つの局面において、このようなPNS SCPは、SC生物学的活性を維持 し得る。本発明のPNS SCPが天然に存在するものでないか、あるいは天然に存在 するが天然界には存在しない精製または単離された形態であることが好ましい。 好ましくは、本発明のPNS SCPは、実質的に、図1、7、8、10、および11の少 なくとも10個の隣接するアミノ酸を有するか、またはそれらに少なくとも74%相 同性である、PN1のドメインのセットに対応する。 あるいは、またはさらに、本発明のPNS SCPは、公知のナトリウムチャンネル ドメイン、例えば、ラットの脳または脊髄のSCドメイン、例えば、膜貫通ドメイ ン、孔内張りドメイン、細胞質ドメイン、または細胞外ドメイン、例えば、IIs6 (例えば、1〜3から14〜17(IIs6)、18〜23から210〜214(細胞質性)、229〜2 36から254〜258(IIIS1)、268〜272から293〜297(IIIs2)、300〜304から321 〜325(IIIs3)、326〜330から347〜351(IIIs4)、368〜374から389〜393(III s5)、474〜478から500〜504(IIIs6)、553〜559から577〜583(IVs1)、589〜 593から611〜615(IVs2)、619〜623から642〜646(IVs3)、654〜658から678〜 682(IVs4)、690〜694から711〜715(IVs5)、779〜783から801〜805(IVs6) 、348〜352から368〜372、501〜505から550〜554、233〜555、676〜678から689 〜693、554〜557から941〜945、またはこれらの中の任意の範囲または値)に対 応するか、図7A〜7Dに示す配列番号2または74〜100%の全体にわたる相同性あ るいはそれらの中の任意の範囲または値を有し表1または表2に示される置換の ようなそれらの変異体に対応する少なくとも1つのドメインを含み得る。このよ うなドメインの少なくとも1つは、限定されない例として、図11A〜11Eに示され るPNS SCPまたはそれらのフラグメント中に存在する。別のドメインはまた、図 1、7、9、13、または14、あるいは特殊なコドンとして同じアミノ酸をコード する それらに対する置換コドンを有する、少なくとも30個の隣接するヌクレオチドに 緊縮な条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされる。さらに、リン酸化 (例えば、PKAおよびPKC)ドメインがまた、当業者に認識されるように、本発明 によるPNS SCPを提供する場合、あるいは核酸をコードする場合には、考慮され る。 相同性または同一性の割合は、例えば、配列情報を、University of Wisconsi n Genetics Computer Group(UWGCG)から入手可能なGAPコンピュータープログラ ム(第6版)を用いて比較することにより決定され得る。GAPプログラムは、Smi thおよびWaterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))により改訂されたNeedlemanお よびWunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))のアラインメント方法を利用する。簡 潔には、GAPプログラムは、類似している整列した記号(すなわち、ヌクレオチ ドまたはアミノ酸)の数を2つの配列の短い方の全記号数により割ったものを類 似性として定義する。GAPプログラムに対する好ましい初期設定パラメーターは 、以下を含む:(1)SchwartzおよびDayhoff編,ATLAS OF PR0TEIN SEQUENCE AND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation,353〜358頁(1979)に記 載されるように、ユニタリ比較行列(同一性については1の値を、そして非同一 については0の値を含む)およびGribskovおよびBurgess,Nucl.Acids Res.14 :6745(1986)の加重比較行列;(2)それぞれのギャップに対して3.0のペナルティ ーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれの記号に対してさらに0.10のペナ ルティー;および(3)末端のギャップに対してはペナルティーなし。好ましい実 施態様において、本発明のペプチドは、SCの配列番号2の生物学的活性部分また は例えば、図11A〜11Dに示すようなそれらの変異体に対応する。 従って、当業者は、本明細書に示される教示および指針が与えられれば、PNS SCPを得るために、どのように、SCの他の部分における他のアミノ酸残基を付加 、欠失、または置換するかを理解する。これには、例えば、以下の表1または2 に示されるような置換を有する、置換変異体、欠失変異体、または付加変異体が 含まれる。 本発明のPNS SCPはまた、そのペプチド中の少なくとも1つのアミノ酸残基が 、少なくとも1つの異なるアミノ酸により、保存的に置換、付加、または欠失さ れ ている変異体を含む。タンパクの質化学および構造の詳細な説明については、例 えば、Schulzら,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,New Yo rk,1978、およびCreighton,T.E.,Proteins:Structure and Molecular Prope rties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983(これらは、本明細書中に参考 として援用される)を参照のこと。コドンの優先性のような推薦されるヌクレオ チド配列置換については、Ausubelら編,Current Protocols in Molecular Biol ogy,Greene Publishing Assoc.,New York,NY(1987,1992,1993,1994,1995 )の第A.1.1章〜第A.1.24章、およびSmbrookら,Molecular Cloning:A Laborato ry Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1989 ),付録CおよびDを参照のこと。 本発明のPNS SCPの保存的置換は、そのペプチド中の少なくとも1つのアミノ 酸残基が、少なくとも1つの異なるアミノ酸により保存的に、置換、付加、また は欠失されている変異体を含む。このような置換は、好ましくは、表1に示す以 下のリストにより行われる。ここで、置換は、日常的な実験により決定され、構 造的かつ機能的特性の改変された合成ペプチド分子が、公知のSC活性アッセイに より決定されるSCの生物学的活性を維持したまま提供され得る。本発明の文脈に おいて、用語PNS SCPまたは「実質的に対応する」は、このような置換を包含す る。 表1 元の残基 代表的な置換 Ala Gly;Ser Arg Lys Asn Gln;His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Ala;Pro His Asn;Gln Ile Leu;Val Leu Ile;Val Lys Arg;Gln;Glu Met Leu;Tyr;Ile Phe Met;Leu;Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp;Phe Val Ile;Leu あるいは、本発明のPNS SCPの別の群の置換は、タンパク質分子における少な くとも1つのアミノ酸残基が除去されており、そして以下の表2に従って異なる 残基がその場所に付加されているものである。本発明のタンパク質またはペプチ ド分子において行われ得るこのタイプの置換は、例えば、Schulzら(以下)の表 1〜2に示されるもののような、異なる種の相同なタンパク質間のアミノ酸変化 の頻度分析に基づき得る。このような分析に基づいて、別の保存的置換は、本明 細書中で以下の5つの群のうちの1つの交換と定義される: 表2 1.小さな脂肪族の非極性または微極性残基:Ala、Ser、Thr、(Pro、Gly); 2.極性で負の電荷を有する残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln; 3.極性で正の電荷を有する残基:His、Arg、Lys; 4.大きな脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Val、(Cys);および 5.大きな芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。 本発明による多くの欠失および付加ならびに置換は、タンパク質またはペプチ ド分子の特性に極端な変化を生じない。「特性」は、二次構造(例えば、α-ヘ リックスまたはβ-シート)における変化、ならびに生理学的活性における(例 えば、レセプター結合アッセイにおける)変化の両方を定義するために、包含的 でない様式で定義される。 従って、特定の置換の上記の例に基づいて、別の置換が日常的な実験によって 行われ得、例えば、SC活性を提供するSCフラグメントの1つ以上の保存的置換を 行うことにより、本発明の別のPNS SCPが提供され得る。しかし、置換、欠失、 または付加の正確な効果が確認される場合、当業者は、少なくとも1つの置換、 付加、または欠失の効果が、生物学的活性(例えば、ナトリウムチャンネル活性 だが、これに限定されない)を確認するために、少なくとも1つのナトリウムチ ャンネル活性のスクリーニングアッセイ(例えば、イムノアッセイまたはバイオ アッセイだが、これらに限定されない)により評価されることを認識する。 本発明のPNS SCPのアミノ酸配列変異体がまた、そのDNA中の変異により調製さ れ得る。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の欠失形態、あるいはそ の付加または置換を含む。最終的な構築物が、かなりのSC活性を保有するという 条件で、任意の組み合わせの欠失、付加、および置換が、最終的な構築物へと到 達するために行われ得る。改善されたSC活性は、非変異体ペプチドより高い活性 が見出されることが好ましい。明らかに、変異体をコードするDNA中に作製され る変異は、その配列をリーディングフレームの外におくべきでなく、そしてmRNA の二次構造(例えば、EP特許出願公開第75,444号;Ausubel、以下;Sambrook、 以下を参照のこと)を生じ得る相補的な領域を創出しないことが好ましい。遺伝 子レベルでは、これらの変異体は、通常、PNS SCPをコードするDNAにおけるヌク レオチドの部位特異的変異誘発により調製され、それにより変異体をコードする DNAが生成され、そしてその後、組換え細胞培養においてDNAを発現する。変異体 は、代表的に、天然に存在するSC(例えば、Ausubel、以下;Sambrook、以下を 参照のこと)と質的に同じ生物学的活性を示す。 一旦PNSナトリウムチャンネルの構造または特性が決定されると、PNS SCPは、 公知の方法工程(例えば、Ausubel、以下;Sambrook、以下を参照のこと、これ らは、本明細書中に参考として全体が援用される)によって、組換えまたは合成 により生産され得、必要に応じて精製され、診断または研究への適用に使用する ために商業的に利用可能な量のPNS SCPが提供される。 当該分野で公知の種々の方法論が、本発明の単離されたPNS SCPを得るために 利用され得る。1つの実施態様において、ペプチドは、天然にそのペプチドを生 成する組織または細胞から精製される。あるいは、上記の単離された核酸フラグ メントは、任意の生物中で、PNS SCPタンパク質を発現するために用いられ得る 。本発明のサンプルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物、あるい は生物学的液体を含む。サンプルは、アッセイの形式、検出方法、ならびにサン プルとして使用される組織、細胞、または抽出物の性質に基づいて変化し得る。 細胞および/または組織は、例えば、正常なまたは病的な動物細胞または組織 (例えば、末梢神経系、およびそれらの抽出物または細胞培養物)を含み得、培 養された、継代された、継代されていない、形質転換された、組換えの、または 単離された、細胞および/または組織としてインビボ、インサイチュ、またはイ ンビトロで提供される。 任意の高等真核生物が、その供給源の生物が天然にこのようなペプチドを含む 限り、本発明の少なくとも1つのPNS SCIまたはPNS SCPの供給源として用いられ 得る。本明細書中で用いられるように、「供給源の生物」は、その生物でそのペ プチドが発現されるか、および/または最終的に単離されるかにかかわらず、そ のペプチドのアミノ酸配列が提供された元の生物を指す。少なくとも1つのPNS SCIまたはコードされる核酸の供給源として好ましい生物は、任意の脊椎動物 (例えば、哺乳動物、鳥類、硬骨魚、デンキウナギ、カエル、およびヒキガエル )であり得る。哺乳動物のなかでは、好ましいレシピエントは、霊長類(ヒト、 ヒトニザル(ape)、およびサル(monkey)を含む)、偶蹄類(Arteriodactyla )(ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む)、齧歯類(マウス、ラット、ウサ ギ、およびハムスターを含む)、および食肉類(ネコおよびイヌを含む)の哺乳 動物である。最も好ましい供給源の生物は、ヒトである。 当業者は、天然の混入物を含まないペプチドを得るために、公知のタンパク質 の単離方法を容易に行うことができる。これらは、以下を含むがこれらに限定さ れない:イムノクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC、イ オン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィー 。例えば、Ausubel、以下;Sambrook、以下;Colligan、以下を参照のこと。 PNS SCPペプチドをコードする単離された核酸分子 1つの実施態様において 、本発明は、新規なPNS SCPに対応するアミノ酸配列を有するペプチドをコード する、単離された核酸分子に関する。1つの好ましい実施態様において、この単 離された核酸分子は、配列番号1に存在する少なくとも60ヌクレオチド配列に対 して70%を超える、全体にわたる同一性または相同性を有するPNS SCPヌクレオ チド配列を含む(好ましくは80%を超える;より好ましくは90%を超える、例え ば、70〜99%の任意の範囲または値)。別の好ましい実施態様において、この単 離された核酸分子は、図1、7、または9に対応するか、あるいは図1、7、8 、10、および11の少なくとも1つのドメインをコードするPNS SCPヌクレオチド 配列を含む。 本明細書中に記載の単離された核酸分子およびそれらの誘導体の機能的等価物 もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、PNS SCPアミノ酸配列について上 記のように、配列番号1に示した核酸配列は、機能的に等価な分子を提供する置 換、付加、または欠失によって改変され得る。ヌクレオチドコード配列の縮重の ために、PNS SCPの実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が、本発 明の実施において使用され得る。これらは、図1、8、10、および11のPNS SCP アミノ酸配列のすべてまたは一部をコードするアミノ酸配列を含むが、これらに 限定されない。これらは、その配列内で機能的に等価なアミノ酸残基をコードす る異なるコドンの置換により改変され、それによりサイレントな変化を生じる。 所定の核酸配列のこのような機能的改変は、それに融合された外来アミノ酸配 列によりコードされる異種タンパク質の分泌および/またはプロセシングを促進 する機会を与える。従って、遺伝コードにより許容されるPNS SCP遺伝子および それらのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変異体は、本発明に含まれ る。例えば、Ausubel、以下;Sambrook、以下を参照のこと。 さらに、核酸配列は、図1、7、または9に対応するか、あるいは図1、8、 10、または11の少なくとも一部またはそれらの変異体をコードする、5'末端お よび/または3'末端の核酸配列に対して、少なくとも1つのヌクレオチドの付 加、欠失、または置換によりもたらされるヌクレオチド配列を含み得る。任意の ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、その付加、欠失、または置換が、その ヌクレオチド配列によりコードされるナトリウムチャンネル活性を消去しないと いう条件でこれに関して用いられ得る。さらに、本発明の核酸分子は、必要に応 じて、コードされるPNS SCPの活性を消去しない制限エンドヌクレアーゼ認識部 位を有し得る。 さらに、コドンを欠失したり、または1つ以上のコドンを縮重コドン以外のコ ドンにより置換して、構造的に改変されたペプチド(しかし、これは、改変され ないアミノ酸分予により生成されるペプチドと実質的に同じ有用性または活性を 有する)を生成することが可能である。当該分野で認識されるように、その2つ のペプチドは、たとえその核酸分子間の相違が遺伝コードの縮重と関係していな いとしても、それらの産生に対して生じる2つの核酸分子であるために、機能的 に等価である。例えば、Ausubel、以下;Sambrook、以下を参照のこと。 核酸の単離 本発明の別の局面において、PNS SCPに対応するアミノ酸配列を 有するペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。特に、その核酸 分子は、高等真核生物から得られるPNS SCに特異的なプローブに対応するように 、哺乳動物核酸を含有する生物学的サンプルから単離され得る。 核酸分子は、核酸を含有する生物学的サンプルから公知の技術(例えば、プラ イマー増幅またはcDNAクローニングであるが、これらに限定されない)を用いて 単離され得る。 核酸分子は、ゲノムDNAを含有する生物学的サンプルまたはゲノムライブラリ ーから単離され得る。適切な生物学的サンプルは、正常または病的な動物細胞ま たは組織、例えば、脳脊髄液(CNS)、末梢神経系(神経、神経節)、および、 心臓、平滑筋、骨格筋、または心筋、自律神経系の一部、細胞、および培養され た、継代された、継代されていない、形質転換された、組み換えの、または単離 された、細胞および/または組織としてインビボ、インサイチュ、またはインビ トロで提供される、それらの抽出物または細胞培養物を含むが、これらに限定さ れない。生物学的サンプルを得る方法は、サンプルの性質により変化する。 当業者は、哺乳動物のゲノムが、個体の間のわずかな対立遺伝子変異体に供さ れ得ることを理解する。従って、その単離された核酸分子はまた、その配列がPN S SCPをコードする限り、対立遺伝子変異を包含することが意図される。PNS SCP 対立遺伝子が、図1、8、10、または11に見出されるものと同一のアミノ酸配列 または少なくともそれらのドメインをコードしない場合、PNS SCPとして本明細 書中に用いられるのと同じ技術、特に、本明細書中に開示される配列に基づくプ ライマーを用いて、適切な遺伝子を増幅するための核酸増幅技術を用いて、単離 および同定され得る。このような変異体は、例えば、図11および表1および2に 示される。 大きなcDNAのクローン化は、同様である(例えば、本発明のPNS SCPとしてのP N1は、約13kDaの重複するクローンを含む)が、小さなcDNAよりも多くの日常的 な実験を必要とする。1つの有用な方法は、cDNAバクテリオファージライブラリ ースクリーニングによる(例えば、Sambrook、以下;Ausubel、以下を参照のこ と)。スクリーニングのためのプローブは、例えば、ランダムヘキサマーおよび クレノウ酵素(Pharmaciaキット)を用いて標識される。5'cDNAがこれらのアプ ローチによって得られない場合、subcDNAライブラリーが調製され得、ここで、 オリゴdTまたはランダムプライマーの代わりに、特異的なPN1プライマーが逆転 写反応を準備するために用いられる。次いで、cDNAサブライブラリーは、標準的 なベクター(例えば、λzap)にクローン化され、そして従来の技術を用いてス クリーニングされる。このストラテジーは、以前、脳のI型およびII型ナトリウ ムチャンネルcDNAをクローン化するために用いられた(Nodaら,Nature 320:18 8-192(1986);Nodaら,Nature 322:826-828(1986))。完全長cDNAの構築は、重 複するフラグメントを発現ベクター(原核生物性または真核生物性のいずれか) にサブクローン化することにより行われる。この仕事は、大きなcDNAについては より難しい。なぜなら、単一の制限部位が少ないにもかかわらず、フラグメント を連結するために日常的に制限、クローン化、またはPCRが用いられるからであ る。 核酸の合成 本発明の単離された核酸分子はまた、化学的に合成されたものを 含むことが意図される。例えば、PNS SCP遺伝子の発現産物をコードするヌクレ オチド配列を有する核酸分子は、設計され得、そして必要であれば、適切なより 小さいフラグメントに分割される。次いで、核酸分予または分割されたフラグメ ントのそれぞれに対応するオリゴマーは、合成され得る(例えば、10〜6015ヌク レオチドまたはその中の任意の範囲または値、例えば、10〜100ヌクレオチド) 。このような合成オリゴヌクレオチドは、例えば、公知の技術(例えば、Ausube l、以下;Sambrook、以下を参照のこと)によって、または自動DNA合成機を用い ることによって調製され得る。 標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、合成またはクローン化により分割 される。必要であれば、そのオリゴマーの5'末端は、T4ポリヌクレオチドキナ ーゼを用いてリン酸化され得る。アニール化の前または標識化のための一本鎖の リン酸化は、過剰の酵素を用いることにより達成され得る。リン酸化がプローブ の標識のためである場合、ATPは比活性の高い放射性同位元素を含有し得る。次 いで、DNAオリゴマーは、アニール化およびT4リガーゼなどを用いる連結に供さ れ得る。 PNS SCPの特異的欠失のための核酸プローブ 別の実施態様において、本発明 は、上記の核酸分子または少なくとも1つのPNS SCPをコードする核酸に緊縮な 条件下で結合する少なくとも1つのそれらのフラグメントを含むサンプルにおけ る、PNS SCPの存在の特異的な検出のための15〜6000ヌクレオチドの核酸プロー ブに関する。 この核酸プローブは、本発明のPNS SCPをコードする核酸分子を得るために、 公知のハイブリダイゼーション方法の工程により、適切な染色体ライブラリーま たはcDNAライブラリーをスクリーニングするために用い得る。染色体DNAまたはc DNAライブラリーは、当該分野で認識される方法(例えば、Ausubel,以下;Samb rook、以下を参照のこと)によって適切な細胞から調製され得る。 あるいは、PNS SCPのアミノ酸配列の適切な部分に対応するヌクレオチド配列 を有する核酸プローブを得るために、有機化学合成が行われる。従って、合成さ れた核酸プローブは、核酸増幅方法の工程においてプライマーとして用いられ得 る。 従って、本発明は、熱に安定な、交差結合する核酸プライマーを用いて、DNA および/またはRNAの増幅方法を提供し得る。このプライマーは、本発明のプラ イマーに交差連結して本発明によるPNS SCPをコードする核酸を提供する。 RNAまたはDNAの増幅方法は当該分野で周知であり、そして本明細書中に示され る教示および指針に基づいて、過度の実験を行うことなく本発明によって用いら れ得る。本発明により、本発明によるPNS SCPの部分をコードする核酸の増幅プ ライマーとしての使用は、増幅の感度、選択性、および/または速度における増 加のために、公知の増幅プライマーを上回る利点を可能とする。 DNAまたはRNAの増幅の公知の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および関 連する増幅方法(例えば、Mullisらに対する米国特許第4,683,195号、同第4,683 ,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号;Taborらに対する同第4,795,699号 および同第4,921,794号;Innisに対する同第5,142,033号;Wilsonらに対する同 第5,122,464号;Innisに対する同第5,091,310号;Gyllenstenらに対する同第5,0 66,584号;Gelfandらに対する同第4,889,818号;Silverらに対する同第4,994,37 0号;Biswasに対する同第4,766,067号;Ringoldに対する同第4,656,134号;Gros zらに対する同第5,340,728号;Gelfandらに対する同第5,322,770号;Scaliceら に対する同第5,338,671号;Cetus Corpに対するPCT WO 92/06200;Strackらに対 するPCT WO 94/14978、この特許の開示は、本明細書中に参考として全体が援用 される)および二本鎖DNA合成のテンプレートとして標的配列に対するアンチセ ンスRNAを用いるRNA媒介増幅(商標NASBAを用いる、Malekに対する米国特許第5, 130,238号)(これらの特許および参考文献の全体の内容は、本明細書中に参考 として全体が援用される)を包含するが、これらに限定されない。PCRの総説は 、 Mullis(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273(1986));Saikiら (Bio/Technology 3:1008-1012 (1985));およびMullisら(Meth.Enzymol.155: 335-350(1987))により提供される。当業者は、本明細書中に開示された配列に基 づいて、当該分野で公知のコンピューターアラインメントおよび配列分析のよう な方法を用いて、このようなプローブを容易に設計し得る。例えば、Ausubel、 以下;Sambrook、以下を参照のこと。 本発明のハイブリダイゼーションプローブは、例えば、放射標識、酵素標識、 蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光、および任意の他の公知で適切な 標識を用いる標準的な標識技術によって標識され得る。ハイブリダイゼーション 後、プローブは公知の方法を使用して可視化され得る。本発明の核酸プローブに は、RNAプローブおよびDNAプローブが含まれ、このようなプローブは、当該分野 において公知の技術を用いて作成される(例えば、Ausubel、下記;Sambrook、下 記を参照)。上記の方法の1つの実施態様において、核酸プローブは固体支持体 に固定される。このような固体支持体の例には、プラスチック(例えば、ポリカ ーボネート)、複合炭水化物(例えば、アガロースおよびSEPHAROSE)、ならびにア クリル樹脂(例えば、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ)が含まれるが 、これらに限定されない。核酸プローブをこのような固体支持体に結合させる技 術は、当該分野において周知である(例えば、Ausubel、下記;Sambrook、下記) 。 本発明の核酸プローブ法に適切な試験サンプルには、例えば、細胞または細胞 の核酸抽出物、あるいは生物学的液体が含まれる。上記の方法において使用され るサンプルは、アッセイの方式、検出方法、およびアッセイされるべき組織、細 胞または抽出物の性質に基づいて変化する。細胞の核酸抽出物を調製するための 方法は当該分野において周知であり、そして利用する方法に適合するサンプルを 得るために容易に適応され得る。 生物学的サンプルにおけるPNS SCPをコードする核酸の存在を検出するための 方法。別の実施態様において、本発明は、サンプルにおけるPNS SCPをコードす る核酸の存在を検出するための方法に関する。このような方法は、(a)このサン プルを上記核酸プローブと、ハイブリダイゼーションを生じる条件下で、接触さ せる工程、および(b)この核酸プローブに結合した標識プローブを検出する工程 を包含する。当業者は、上記のような当該分野において公知の技術に従って、適 切な、標識された核酸プローブを選択し得る。試験されるべきサンプルには、哺 乳動物組織のRNAサンプルが含まれるが、これに限定されない。 PNS SCPは末梢神経および後根神経節細胞において発現することが見出されて いる。従って、PNS SCPプローブは、このような生物学的サンプルにおけるPN細 胞由来のRNAの存在を検出するために使用され得る。さらに、正常レベルと比較 したとき、個体におけるPNS SCP RNAの発現レベルの変化は、疾患の存在を示し 得る。PNS SCPプローブは、さらに、末梢神経系組織において一般的および特異 的な細胞活性をアッセイするために使用され得る。 サンプルにおけるPNS SCPの存在を検出するためのキット。別の実施態様にお いて、本発明は、サンプルにおけるPNS SCPの存在を検出するための、上記核酸 プローブが配置された少なくとも1つの容器を含むキットに関する。好ましい実 施態様において、キットは、1またはそれ以上の下記のものを含む他の容器をさ らに含む:洗浄試薬、および結合した核酸プローブの存在を検出し得る試薬。検 出試薬の例には、放射標識プローブ、酵素標識プローブ(西洋ワサビペルオキシ ダーゼ、アルカリホスファターゼ)、および親和性標識プローブ(ビオチン、アビ ジン、またはストレプトアビジン)が含まれるが、これらに限定されない(例えば 、Ausubel、下記;Sambrook、下記を参照)。 区画化されたキット(compartmentalized kit)には、試薬が別個の容器に含ま れる任意のキットが含まれる。このような容器には、小さなガラス容器、プラス チック容器、またはプラスチックまたは紙の小片(strip)が含まれる。このよう な容器は、ある区画から別の区画への試薬の効率的な移動を可能にし、サンプル および試薬が互いに混入せず、そして各容器の因子(agent)または溶液がある区 画から別の区画へ定量的な様式で添加され得る。このような容器には、試験サン プルを受容する容器、アッセイに使用されるプローブまたはプライマーを含む容 器、洗浄試薬(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、TRIS緩衝液など)を含む容器、 およびハイブリダイズしたプローブ、結合した抗体、増幅産物などを検出するた めに使用される試薬が含まれる。 当業者は、本願に記載される核酸プローブが、当該分野において周知である確 立されたキット方式のうちの1つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識する 。 PNS SCP核酸分子を含むDNA構築物、およびこれらの構築物を含む宿主。本発明 のPNS SCPをコードする核酸配列は、従来技術(連結のための平滑末端化末端また はスタッガー末端化末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、付着末端の適切 な充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および 適切なリガーゼでの連結)に従ってベクターDNAと組換えられ得る。このような操 作のための技術は、例えば、Ausubelら、下記により開示され、そして当該分野 において周知である。 核酸分子(例えば、DNA)は、それが転写および翻訳調節情報を含む核酸配列を 含み、そしてこのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「 作動可能に連結している」場合、ポリペプチドを「発現し得る」という。作動可 能な連結は、調節DNA配列および発現することを求められるDNA配列が、回収可能 な量で、PNS SCPまたはAbフラグメントとしての遺伝子発現を可能にする方法で 接続している連結である。遺伝子発現に必要とされる調節領域の正確な性質は、 類似の分野において周知であるように生物ごとに変化する(例えば、Sambrook、 下記;Ausubel、下記を参照)。 従って、本発明は、真核細胞性の発現が好ましいが、原核生物細胞または真核 生物細胞のいずれかにおけるPNS SCPの発現を包含する。 好ましい宿主は、細菌宿主または真核生物宿主(インビボまたはインサイチュ の細菌、酵母、昆虫、菌類、鳥類および哺乳動物の細胞、あるいは哺乳動物、昆 虫、鳥類または酵母起源の宿主細胞を含む)である。哺乳動物の細胞または組織 は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、 ヤギ、イヌ、またはネコ起源であることが好ましいが、任意の他の哺乳動物細胞 を使用し得る。 真核生物宿主には、酵母、昆虫、菌類、およびインビボまたは組織培養の哺乳 動物細胞が含まれ得る。好ましい真核生物宿主はまた、昆虫細胞、インビボまた は組織培養のいずれかの哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。好まし い哺乳動物細胞には、Xenopus卵母細胞、HeLa細胞、線維芽細胞起源の細胞(例え ば、VEROまたはCHO-K1)、あるいはリンパ様起源の細胞およびその誘導体が含ま れる。 哺乳動物細胞は、タンパク質分子に対する翻訳後改変(正確な折り畳みまたは 正確な部位でのグリコシル化)を提供する。宿主として有用であり得る哺乳動物 細胞には、線維芽細胞起源の細胞(例えば、NIH 3T3、VEROまたはCHOであるが、 これらに限定されない)、またはリンパ様起源の細胞(例えば、ハイブリドーマSP 2/0-AgJ4またはマウスミエローマP3-X63Ag8であるが、これらに限定されない)、 ハムスター細胞株(例えば、CHO-KIおよび始原細胞、例えば、CHO-DUXB11)および その誘導体が含まれる。哺乳動物細胞の1つの好ましいタイプは、遺伝的に欠陥 のある細胞の機能をインビボで置換することを意図される細胞である。神経系由 来の細胞は、神経系の疾患の遺伝子療法に好ましい。哺乳動物細胞宿主について 、多くの可能なベクター系が少なくとも1つのPNS SCPの発現のために利用可能 である。広範囲の転写および翻訳調節配列が、宿主の性質に依存して用いられ得 る。転写および翻訳調節シグナルは、ウイルス起源(例えば、アデノウイルス、 ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどであるが、これらに限定されな い)に由来し得る。ここで、調節シグナルは、高レベルに発現する特定の遺伝子 に関連する。あるいは、哺乳動物発現産物(例えば、アクチン、コラーゲン、ミ オシン、タンパク質産生であるが、これらに限定されない)由来のプロモーター( Ausubel、下記;Sambrook、下記を参照)に関連する。 生きている昆虫を使用する場合、silk moth caterpillarおよびバキュロウイ ルスベクターが、本発明に従う大規模なPNS SCP産生のために現在好ましい宿主 である。昆虫におけるPNS SCPの産生は、例えば、この昆虫宿主を、関連分野に おける当業者に公知の方法によって少なくとも1つのPNS SCPを発現するように 操作されたバキュロウイルスに感染させることによって達成され得る(Ausubelら 編、Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,§§16.8- 16.11(1987,1992,1993,1994)を参照)。 好ましい実施態様において、導入されたヌクレオチド配列は、レシピエント宿 主において自己複製可能なプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれ得る 。任意の広範囲のベクターがこの目的のために用いられ得る(例えば、Ausubelら 、下記、§§1.5、1.10、7.1、7.3、8.1、9.6、9.7、13.4、16.2、16.6、および 16. 8-16.11を参照)。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要 な要因には、容易に、このベクターを含むレシピエント細胞が認識され、そして このベクターを含まないレシピエント細胞から選択され得ること;特定の宿主に おいて望ましいベクターのコピー数;および異なる種の宿主細胞間でベクターを 「往復(shuttle)」させ得ることを望むかどうかが含まれる。 異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後のプロセッシングおよび改 変(例えば、グリコシル化、切断)のための特徴的で特異的な機構を有する。適切 な細胞株または宿主系は、発現した外来タンパク質の所望の改変およびプロセッ シングを確実にするよう選択され得る。例えば、細菌系における発現は、非グリ コシル化コアタンパク質産物を産生させるために使用され得る。酵母における発 現はグリコシル化産物を産生する。哺乳動物細胞における発現は、異種PNS SCP タンパク質の「天然」のグリコシル化を確実にするために使用され得る。さらに 、異なるベクター/宿主発現系は、異なる程度のプロセッシング反応(例えば、 タンパク質分解切断)をもたらし得る。 上記のように、真核生物宿主におけるPNS SCPの発現は真核生物の調節領域の 使用を必要とする。このような領域には、一般には、RNA合成の開始を指揮する に十分なプロモーター領域が含まれる(例えば、Ausubel、下記;Sambrook、下記 )。 一旦、ベクターまたは核酸分子を含む構築物が発現のために調製されると、こ のDNA構築物は、任意の種々の適切な手段(すなわち、形質転換、トランスフェク ション、コンジュゲーション(conjugation)、プロトプラスト融合、エレクトロ ポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈降、ダイレクトマイ クロインジェクションなど)によって適切な宿主細胞に導入され得る。ベクター の導入後、レシピエント細胞は、ベクター含有細胞の増殖について選択する選択 培地で増殖させられる。クローン化遺伝子分子の発現は、少なくとも1つのPNS SCPの産生を生じる。このことは、形質転換細胞自体またはこれらの細胞の分化 の誘導(例えば、神経芽腫細胞へのブロモデオキシウラシルの投与によるなど)後 に生じ得る。 PNS SCPの単離。本発明のPNS SCPタンパク質またはフラグメントは、上記の組 換えDNAからの発現によって得られ得る。あるいは、PNS SCPは生物学的材料から 精製され得る。そのように所望であれば、発現した少なくとも1つのPNS SCPは 、従来方法の工程(例えば、抽出、沈降、クロマトグラフィー、アフィニティー クロマトグラフィー、電気泳動など)に従って単離および精製され得る。例えば 、少なくとも1つのPNS SCPを適切なレベルで発現する細胞は、遠心分離により 回収され、または適切な緩衝液を用いて溶解され、そして例えば、DEAE−セルロ ース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸−アガロース、ヒドロキシアパタ イト上でのカラムクロマトグラフィー、あるいは電気泳動または免疫沈降によっ てタンパク質を単離され得る。あるいは、PNS SCPは、特異的抗体(例えば、PNS SCPまたはSC抗体であるが、これらに限定されない)の使用によって単離され得る 。このような抗体は、公知方法の工程によって得られ得る(例えば、Colligan、 下記;Ausubel、下記を参照)。 本発明の目的のために、精製の1つの方法(例示的であって、限定されない)は 、以下の工程を包含する。PNS SCPの精製における最初の工程は、可溶化剤(例え ば、尿素、ギ酸、界面活性剤、またはチオシアネート)を含むかまたは含まない 緩衝液中の生物学的サンプル(例えば、末梢神経組織または後根神経節(DRG))か らのPNS SCP画分の抽出を包含する。第2の工程は、可溶化された材料を、Mono- QまたはMono-Sカラム(Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.;Piscataway,NJ)上 でのイオン交換クロマトグラフィーにかける工程を包含する。同様に、可溶化さ れた材料は、分子が、例えば、電荷密度、電荷分布および分子サイズに従って分 離され得る任意の他のプロセスによって分離され得る。イオン交換樹脂からのPN S SCPの溶出は、各画分に対するイムノアッセイ(例えば、M-IRMA)によってモニ ターされる。次いで、免疫反応性ピークは透析され、凍結乾燥され、そして分子 ふるいまたはゲルクロマトグラフィーにかけられる。第3の工程において、分子 ふるいまたはゲルクロマトグラフィーは、分離が分子サイズに基づく分配クロマ トグラフィーの1つのタイプである。デキストラン、ポリアクリルアミド、およ びアガロースゲルが、このタイプの分離のために通常使用される。本発明に有用 な1つのゲルは、SEPHAROSE 12(Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.)である。 しかし、当業者に公知の他の方法が、サイズに基づいて分子を効果的に分離する ため に使用され得る。PNS SCPの精製プロトコルにおける第4の工程は、免疫反応性 ピークを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAG E)によって分析する工程、さらなるゲルクロマトグラフィー精製工程、および染 色工程(例えば、銀染色など)を包含し得る。精製方法における第5の工程は、SD S-PAGE後に得られたPNS SCPをアフィニティークロマトグラフィー、または単離 されるべき物質とこれが特異的に結合し得る分子との間の親和性に基づく他の任 意の手順にかける工程を包含し得る。PNS SCPのさらなる精製のために、抗PNS S CP mAb(実質的に純粋なPNS SCPに対して作成された特異的mAb)に結合したSEPHAR OSE上でのアフィニティークロマトグラフィーが使用され得る。別の方法(例えば 、逆相HPLC)または良好なピーク分解能を有する迅速な分離によって特徴付けら れる他の任意の方法が有用である。 他の精製工程が上記の好ましい方法に代わり得ることが理解される。当業者は 過度な実験を要することなく別の精製スキームを考案し得る。 PNS SCPペプチドに対して結合親和性を有する抗体およびこの抗体を含むハイ ブリドーマ。別の実施態様において、本発明は、上記のようなPNS SCPペプチド またはそのフラグメントに対して特異的な結合親和性を有する抗体に関する。PN S SCPに対して選択的に結合する抗体が、PNS SCPを含む組織におけるPNS SCP発 現の変化の分析を含むが、これに限定されない方法において使用されるために選 択される。 本発明のPNS SCPタンパク質は、種々の手順および方法(例えば、抗体の作成の ため、薬学組成物の同定に使用するため、およびDNA/タンパク質相互作用を研究 するため)において使用され得る。本発明のPNS SCPペプチドは、抗体またはハイ ブリドーマを作成するために使用され得る。当業者は、抗体を所望する場合、こ のようなペプチドが、本明細書中に記載されるように作成され、そして免疫原と して使用されることを認識する。 本発明の抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれら の抗体のフラグメントを包含する。本発明は単鎖抗体をさらに包含する。この分 子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知技術により作成され得る。 用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗 体、可溶形態または結合形態で標識され得る抗体に対する抗イディオタイプ(抗I d)抗体、ならびに任意の公知技術(例えば、酵素的切断、ペプチド合成または組 換え技術であるが、これらに限定されない)によって提供されるそれらのフラグ メントを包含することを意図される。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動 物の血清に由来する抗体分子の不均質な集団である。モノクローナル抗体は、抗 原に対して特異的な抗体の実質的に均質な集団を含む。この集団は、実質的に同 じエピトープ結合部位を含む。mAbは当業者に公知の方法によって得られ得る(例 えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495-497(1975);米国特許第4,376,11 0号;Ausubelら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publish ing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987,1992);ならびにHarlowおよ びLane ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory(198 8);Colliganら編、Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Asso c.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)、これらの文献の内容は、全体 が、本明細書中に参考として援用される)。このような抗体は、任意の免疫グロ ブリンクラス(IgG、IgM、IgE、IgA、GILDおよびこれらの任意のサブクラスを含 む)であり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサ イチュまたはインビボで培養され得る。インビボまたはインサイチュでの高力価 のmAbの産生が現在好ましい産生方法である。 キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子(例えば、マウスmAb に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する分子)である 。これは、主に、適用における免疫原性を減少させるため、および産生における 収率を増大させるために使用される。例えば、マウスmAbは、ハイブリドーマか らのより高い収率を有するが、ヒトにおけるより高い免疫原性を有するので、ヒ ト/マウスキメラmAbが使用される。キメラ抗体およびその作成方法は当該分野 において公知である(Cabillyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984) ;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984);Boulianneら、Na ture 312:643-646(1984);Cabillyら、欧州特許出願第125023号;Neubergerら、 Nature 314:268-270(1985);Taniguchiら、欧州特許出願第171 496号;Morrison ら、欧州特許出願第173 494号;Neubergerら、PCT出願第WO86/01533号;Kudoら 、欧 州特許出願第184 187号;Morrisonら、欧州特許出願第173 494号;Sahaganら、J .Immunol.137:1066-1074(1986);Robinsonら、国際特許公開第PCT/US86/02269 号;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443(1987);Sunら、Proc.Natl.A cad.Sci.USA 84:214-218(1987);Betterら、Science 240:1041-1043(1988);な らびにHarlow、下記。これらの文献は本明細書中に参考として全体が援用される )。 抗イディオタイプ(抗Id)抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する独特 な決定基を認識する抗体である。Id抗体は、mAbの供給源と同じ種および遺伝型 の動物(例えば、マウス系統)を、mAb(これに対して抗Idが調製される)で免疫す ることによって調製され得る。免疫された動物は、免疫抗体のイディオタイプ決 定基を認識し、そしてこれに対して、これらのイディオタイプ決定基に対する抗 体(抗Id抗体)を産生することによって応答する(例えば、米国特許第4,699,880号 (これは、本明細書中に参考として援用される)を参照)。 抗Id抗体はまた、さらに別の動物において、いわゆる抗-抗Id抗体を産生する 免疫応答を誘導するための「免疫原」として使用され得る。抗-抗Idは、抗Idを 誘導した元のmAbとエピトープが同一であり得る。従って、mAbのイディオタイプ 決定基に対する抗体を使用することによって、特異性が同一である抗体を発現す る他のクローンを同定することが可能である。 従って、本発明のPNS SCPに対して作成されたmAbは、適切な動物(例えば、BAL B/cマウス)において、抗Id抗体を誘導するために使用され得る。このような免疫 された動物に由来する脾臓細胞は、抗Id mAbを分泌する抗Idハイブリドーマを作 成するために使用される。さらに、抗Id mAbは、キャリア(例えば、キーホール リンペットヘモシアニン(KLH))に結合され、そして別のBALB/cマウスを免疫する ために使用され得る。これらのマウス由来の血清は、PNS SCP特異的エピトープ に対して特異的な元のmAbの結合特性を有する抗抗Id抗体を含む。従って、抗Idm Abは、それ独自のイディオタイプエピトープ、または評価されるエピトープと構 造的に類似する「イディオトープ」を有する。 用語「抗体」はまた、インタクトな分子および抗原に結合し得るそのフラグメ ント(例えば、FabおよびF(ab')2)の両方を包含することを意味する。FabおよびF (ab')2フラグメントは、インタクトな抗体のFcフラグメントを欠き、循環からよ り迅速に排除され、そしてインタクトな抗体より非特異的な組織結合が少ない(W ahlら、J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。本発明において有用な抗体のFabおよ びF(ab')2ならびに他のフラグメントは、インタクトな抗体分子について本明細 書中で開示した方法に従って、PNS SCPの検出および/または定量のために使用さ れ得ることが理解される。このようなフラグメントは、代表的には、酵素、例え ば、パパイン(Fabフラグメントを作成するため)またはペプシン(F(ab')2フラグ メントを作成するため)を使用するタンパク質分解切断によって作成される。抗 体は、それが分子と特異的に反応し、そのことによってこの分子を抗体に結合さ せ得る場合、この分子に「結合し得る」という。用語「エピトープ」は、抗体に よって結合され得る任意の分子の部分にれもまたこの抗体によって認識され得る )に言及することが意図される。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、分 子の化学的に活性な表面配置(grouping)(例えば、アミノ酸または糖側鎖)からな り、そして特異的な三次元構造的特性および特異的な電荷特性を有する。 「抗原」は、抗体によって結合され得る分子または分子の部分であって、さら に、その抗原エピトープに結合し得る抗体を動物に産生させ得る分子または分子 の部分である。抗原は、1つまたは1つより多いエピトープを有し得る。上記で 言及した特異的反応は、抗原が高度に選択的な様式で対応する抗体と反応し、そ して他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すこ とを意味する。 イムノアッセイ。本発明の抗体(PNS SCPに対する抗体)は、PNS SCまたはPNS S C関連の病状を検出または診断するために使用され得る。本発明によって提供さ れるスクリーニング方法には、PNS SCPに対する特異的抗体(モノクローナルま たはポリクローナル)の作成に基づく、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)また は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)方法論を用いるイムノアッセイが含まれる 。これらのアッセイのために、生物学的サンプルは、神経生検、または他の末梢 神経系組織採取によって得られる。例えば、ある形態のRIAでは、試験される物 質は、放射標識された抗原の存在下で、希釈された抗血清と混合される。この方 法では、試験物質の濃度は、特異的抗体に結合した標識された抗原の量に反比例 し、 そして標識された遊離抗原の量に直接関係(正比例)する。他の適切なスクリーニ ング方法は当業者に容易に明かである。 さらに、当業者は、合理的に設計された抗ペプチドペプチド(例えば、Hurbyら 、「合成ペプチドの応用:アンチセンスペプチド」、Synthetic Peptides,A Us er's Guide,W.H.Freeman,NY,289〜307頁(1992)、ならびにKaspczakら、Bioch e・istry 28:9230-8(1989)を参照)を作成するために、現在利用可能な手順、な らびに抗体に関して上記で開示した技術、方法およびキットを、特定のペプチド 配列に結合し得るペプチドを作成するよう容易に適応させ得る。 PNS SCPを含む生物学的サンプルに対して本発明の診断アッセイを実施するた めの1つの実施態様は、 (a)検出可能に標識されたPNS SCP特異的抗体を固体支持体と接触させて、こ のPNS SCP特異的抗体またはそのフラグメントを固定化する工程; (b)PNS SCPを含むことが疑われるサンプルと上記固体支持体を接触させる工 程; (c)上記検出可能に標識されたPNS SCP特異的抗体をこの支持体と、固定したP NS SCP特異的抗体がPNS SCPと結合することを可能にする十分な時間、インキュ ベートする工程; (d)上記固相支持体を、工程(c)で得られたインキュベーション混合物から分 離する工程;および (e)結合した標識を検出し、それによってPNS SCPを検出および定量する工程 、を包含する。 検出可能に標識された抗体およびPNS SCPの特定の濃度、インキュベーション の温度および時間、ならびに他のアッセイ条件は、種々の要因(サンプル中のPNS SCPの濃度、サンプルの性質などを含む)に依存して変化し得る。所定の多くの 抗PNS SCP抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定され得る。当業者は、日 常的な実験を用いることによって、それぞれの測定について効果のある(operati ve)アッセイ条件および最適なアッセイ条件を決定し得る。他の工程(洗浄工程、 撹拌工程、振盪工程、濾過工程など)は、特定の状況に習慣的または必要である ようにアッセイに加えられ得る。 検出は、種々のアッセイのいずれを用いても達成され得る。例えば、PNS SCP 特異的抗体または抗体フラグメントを放射活性標識することによって、ラジオイ ムノアッセイの使用によりPNS SCPを検出することが可能になる。ラジオイムノ アッセイの十分な記述は、本明細書中にその全体が参考として援用されるCollig an(下記)およびAusubel(下記)に見出され得る。好ましくは、PNS SCPを発現する 細胞の検出は、インビボ画像化技術により達成され得る。ここでは、標識された 抗体(またはそのフラグメント)が被験体に提供され、そしてPNS SCPの存在が、 いずれの組織サンプルをも前もって摘出することなく検出される。このようなイ ンビボ検出手順は、他の検出方法より侵襲が少ないという利点を有し、そしてさ らに、患者から容易に摘出し得ない組織(例えば、脳組織)中のPNS SCPの存在を 検出し得る。 当業者に公知の多くの異なるインビボ標識および標識方法が存在する。本発明 に使用し得るタイプの標識の例には、放射活性同位体および常磁性同位体が含ま れる。当業者は、本発明に使用される抗体への結合に適切な他の標識を理解する か、あるいは日常的な実験を使用してこれを確認し得る。さらに、抗体へのこれ らの標識の結合は、当業者に通常の標準的な技術を使用してなされ得る。 診断的インビボ画像化のために、利用可能な検出器具のタイプは、所定の放射 性核種を選択する際の主要な要因である。選択された核種は、所定のタイプの器 具で検出可能なタイプの崩壊を有さなければならない。一般に、診断的画像化を 視覚化するための任意の従来の方法は、本発明に従って利用され得る。例えば、 ポジトロンエミッショントモグラフィー(PET)、ガンマ、ベータ、および磁気共 鳴画像(MRI)検出器が診断画像化を視覚化するために使用し得る。 本発明に有用な抗体はまた、インビボ診断の目的のために常磁性同位体で標識 され得る。特に有用な元素には、磁気共鳴画像化(MRI)のように、157Gd、55Mn、162 Dy、および56Feが含まれる。 本発明に有用な抗体(またはそのフラグメント)は、体組織、流体(例えば、 CSF)、または細胞抽出物におけるPNS SCPの存在を検出するインビトロでの免疫 アッセイの使用にも特に適している。このような免疫アッセイにおいて、抗体( またはそのフラグメント)は、上記のように、液相で利用され得るが、または、 好ましくは、固相キャリアーと結合され得る。 インサイチュ検出は、患者由来の組織学的標本を除去し、そしてこのような標 本への本発明の標識された抗体の組合せを提供し得る。抗体(またはフラグメン ト)は、好ましくは、標識された抗体(またはフラグメント)を生物学的サンプ ルヘ適用または重層することによって提供される。このような手順の使用により 、PNS SCPの存在だけでなく、試験される組織におけるPNS SCPの分布もまた決定 することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範な組織学的方法(例 えば、染色手順)のいずれもが、このようなインサイチュ検出を達成するために 改変され得ることを容易に認め得る。 本明細書中で使用されているように、効果的な量の診断試薬(例えば、抗体ま たは抗体のフラグメント)とは、所望の診断識別を達成し得る量の試薬であり、 そして被験者の年齢、条件、性、疾患の範囲、反対指示(counter indication)( ある場合)、および医師によって調整される他の変動因によって変化する。診断 試験において典型的に用いられるこのような物質の量は、一般的に0.1〜5mgであ り、そして好ましくは0.1〜0.5mgの間である。 本発明のアッセイはキットの調製にも理想的に適する。このようなキットは、 バイアル、試験管などのような1つ以上の容器を密閉した状態で受容するように 区画化されているキャリアー手段を含有し得、これらの容器手段のそれぞれは免 疫アッセイの個々の要素を含有する。 例えば、固相上に固定化した第一の抗体を含有する容器手段、および溶液中に 第二の検出可能に標識された抗体を含有するさらなる容器手段が存在し得る。さ らなる容器手段は、検出されるPNS SCPの連続希釈物を含有する標準溶液を含有 し得る。PNS SCPの標準溶液は、横座標軸上にPNS SCPの濃度を、および縦座標軸 上に検出シグナルをプロットした標準曲線を作成するために使用され得る。PNS SCPを含有するサンプルより得られた結果は、PNS SCPの濃度を得るためにこのよ うなプロットから補間され得る。 診断スクリーニングおよび処理。以下の議論はヒト患者に特に関するが、その 教示は、少なくとも1つのPNS SCを発現するいかなる動物にも適用可能であると いうことが理解されるはずである。本発明の診断およびスクリーニング法は、特 に、家族歴に基づいてPNS SCPの発現レベルの変化に関連した疾患の発達の危険 性が予想される患者またはPNS SCP関連疾患を診断することが所望される患者に 有用である。 本発明に従って、このようなスクリーニングが必要な個体の前症状スクリーニ ング(presymptomatic screening)は、現在、本発明のPNS SCPタンパク質をコー ドするDNAを用いることにより可能である。本発明のスクリーニング法は、個体 における欠失または異常型のPNS SC遺伝子の存在の前症状診断(出生前診断を包 含する)を可能とし、そして従って、このような個体がPNS SC関連疾患を発達さ せ得るかまたは発達させた見込みに関する見解を得ることを可能とする。これは 、例えば、PNS SC関連病状の家族歴をもつ個体に由来する、変化または欠失して いるPNS SC遺伝子のキャリアーの同定に特に有効である。初期診断もまた適切な 適時介入を最大限に活用するために望ましい。 スクリーニング法の1つの好ましい実施態様では、組織サンプルはこのような 個体から採取され、そして(1)「正常」PNS SCP遺伝子の存在;(2)PNS SCP mRNA の存在、および/または(3)PNS SCPタンパク質の存在についてスクリーニングさ れ得る。正常なヒト遺伝子は、例えば、本発明において教示されているPNS SC配 列(またはその機能性フラグメント)に対して調製されたDNAプローブを用いて 、「正常」対患者のDNAにおける制限消化パターンの検出(RFLP解析を含む)に 基づいて特徴づけられ得る。同様に、PNS SCP mRNAが特徴づけられ得、そして類 似のプローブを用いたPNS SCP関連疾患の発達の危険性のないヒト集団で見られ る正常なPNS SCP mRNAの(a)レベルおよび/または(b)サイズと比較され得る。最 後に、PNS SCPタンパク質は、PNS SCP活性についての生物学的アッセイまたは免 疫学的アッセイおよびPNS SCP抗体を用いて(a)検出され得、および/または(b) 定量され得る。PNS SCPタンパク質をアッセイする際、免疫学的アッセイは、そ の迅速さのために好ましい。(1)異常型のPNS SCP DNAサイズパターン、および/ または(2)異常型のPNS SCP mRNAサイズまたはレベル、および/または(3)異常型 のPNS SCPタンパク質レベルは、患者がPNS SCP関連疾患を発達させる危険性があ ることの指標となり得る。 本発明のスクリーニングおよび診断法は、全PNS SCP DNAコード配列がプロー ブに用いられ得ることを必要としない。むしろ、フラグメント、または正常また は罹患個体由来のDNA調製物におけるPNS SCP遺伝子の存在、そのような遺伝子の 欠損、またはそのような遺伝子の物理的特徴の変化(例えば、電気泳動の移動パ ターンの変化)を検出するのに十分な長さの核酸の使用のみを必要とする。 出生前診断は、所望ならば、羊水穿刺、絨毛膜絨毛サンプリング(CVS)、およ び胎児内視鏡検査を包含する、胎児細胞を獲得する公知のいかなる方法を用いて も実施され得る。出生前染色体分析は、正常なPNS SCP遺伝子を所有する染色体 の一部がヘテロ接合状態で存在するかどうかを決定するために使用され得る。 PNS SCP精製および結晶化法の概説。一般的に、膜タンパク質としてのPNS SCP は、界面活性剤(例えばオクチルグルコシド(octyglucoside)またはその他の適 切な両親媒性分子を用いて可溶形態で精製される。得られるPNS SCPは、結晶化 のために十分な純度および濃度の状態にある。精製されたPNS SCPが、次いで単 離され、そして生物学的活性について、および(結晶化を妨げる)凝集が存在し ないことについてアッセイされる。精製された切断型PNS SCPは、好ましくは、 還元または非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(非還元はシステイン 架橋の存在を評価するために使用される)下で、単一のバンドとして移動する。 精製されたPNS SCPは、好ましくは、公知の方法により、以下の少なくとも1つ の様々な条件下で結晶化される;pH、緩衝液のタイプ、緩衝液の濃度、塩のタイ プ、ポリマーのタイプ、ポリマーの濃度、その他の沈殿リガンド、および精製さ れた断片型PNS SCPの濃度。例えば、Michelら、Trends in Biochem.Sci.8:56-59 (1983);Deisenhoferら、J.Mol.Biol 180:385-398(1984);Weissら、FEBS Lett. 267:268-272(1990);Blundellら、Protein Crystallography、Academic Press、 London(1976);Oxenderら編、Protein Engineering Liss、New York(1986);McP herson;The Preparation and Analysis of Protein Crystals Wiley、N.Y.(19 82);またはCRYSTAL SCREEN(Hampton Research、Riverside、CA)のような市販の キットで供給される方法を参照のこと。結晶化されたタンパク質はまた、少なく とも1つのSC活性について試験され、そして個別にサイズ分類され、そして成形 された結晶が、さらにX線回折における適合性について試験される。一般的に、 より小さい結晶よりもより大きい結晶の方がより良好な結晶学(crystallo graphy)を提供し、そしてより厚い結晶は、より薄い結晶より良好な結晶学を提 供する。例えば、Blundell、下記;Oxender、下記;McPherson、下記;Wyckoff ら編、生物学的巨大分子の回折法、114〜115巻、Methods in Enzymology、Orlan do、FL Academic Press(1985)を参照のこと。 タンパク質結晶化法。ハンギングドロップ法が、好ましくは、精製された可溶 性のPNS SCPタンパク質の結晶化に使用される。例えば、Taylorら、J.Mol.Biol. 226:1287-1290(1992)、;Takimotoら、(1992)、下記;CRYCTAL SCREEN、Hampton Reseachを参照のこと。タンパク質および沈殿剤の混合物は、以下を包含し得る :pH(例えば、4〜10);緩衝液のタイプ(例えば、トロメタミン(tromethamine) (TRIZMA)、アジ化ナトリウム、リン酸塩ナトリウム、またはカコジル酸塩、酢酸 塩、イミダゾール、TrisHCl、ヘペスナトリウム(sodium hepes));緩衝液濃度 (例えば0.1〜100mM);塩のタイプ(例えば、アジ化ナトリウム、塩化カルシウ ム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニ ウム、リン酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛;酢酸カルシウム);ポリ マーのタイプおよび濃度:(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)1〜50%、 タイプ6000〜10,000);その他の沈殿リガンド(塩:酒石酸ナトリウムカリウム 、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、硫酸リチウム、ギ酸ナトリウム、クエン 酸ナトリウム、ギ酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム;有機物 ;2−プロパノール;不揮発性物質:2-メチル-2,4-ペンタンジオール);およ び精製されたPNS SCPの濃度(例えば、0.1〜100mg/ml、両親媒性分子を添加した もの(オクチルグルコシドのような界面活性剤))。例えば、CRYSTAL SCREEN、 Hampton Reseach、を参照のこと。 上記の混合物は、pH、緩衝液タイプ;緩衝液濃度、沈殿塩のタイプまたは濃度 、PEGタイプ、PEG濃度、および切断型タンパク質濃度の少なくとも1つを変化さ せて使用され、そしてスクリーニングされる。0.1〜1.5mmの大きさの範囲の結晶 が、1〜14日で形成される。これらの結晶は、少なくとも10Å分解能(例えば、1 .5〜10.0Å)またはその中の任意の範囲の値(例えば、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、 3.2、3.3 、3.4、3.5、または3)にX線を回折し、3.5Å以下が最も高い分解能のために好 ましい。 この最も高い分解能を持つ回折パターンに加えて、25〜3.5Åのようなより低い 分解能がさらに使用され得る。 タンパク質結晶。結晶は、1〜14日後に出現し、そして日を重ねるごとに成長 を続ける。この結晶のいくらかが取り出され、洗浄され、そして生物学的活性に ついてアッセイされる。この活性は、さらなる特徴付けに使用するために好まし い活性である。他の洗浄された結晶は、好ましくは、染色したゲル上で泳動し、 そして精製された切断型PNS SCPと同じ位置に移動する結晶が、好ましくは使用 される。1つのドロップ中に2〜100個の結晶が観察され、そして、結晶形態は 、例えば、両錐形、長斜方形、および正六面体で生じ得るが、これらに限定され ない。初期のX線分析では、このような結晶が中程度の高さの分解能から高い分 解能で回折することを示すと予想される。ドロップ中に結晶がほとんど形成され ないとき、それらはずっとより大きいサイズ(例えば、0.2〜1.5mm)であり得る 。 PNS SCPX線結晶学的方法。そのように生成されたPNS SCPの結晶は、適切なX 線源を用いてX線解析される。適度な数の回折パターンが得られる。結晶は、好 ましくは、X線ビーム中で少なくとも10時間安定である。必要に応じて凍結結晶 (例えば-220〜-50℃)がより長いX線照射(例えば4〜72時間)のために使 用され、この結晶は凍結状態においてX線に対し比較的より安定である。最大数 の有用な反射を収集するために、必要に応じて複数のフレームが、結晶が例えば 12〜96時間X線ビーム中で回転されるように収集される。X線回折の分解能を増 大させるために、より大きな結晶(0.2mmより大きい)が好ましい。結晶は、好 ましくは、シンクロトロン高エネルギーX線源を用いて解析される。凍結結晶を 用いることにより、X線回折データは、本明細書中に記載のように非常に詳細に PNS SCPの三次元構造を十分に解明できる10〜1.5Åの分解能(25〜10Åのような より低い分解能もまた有用である)に回折する結晶において収集される。 コンピューターに関連した実施態様。PNS SCPのアミノ酸配列および/または X線回折データは、PNS SCPまたはその一部のコンピューター分子モデリングに 有用であり、それらの使用を促進するために、種々の媒体において「提供」され 得る。本明細書中において使用されているように、提供されるとは、本発明のPN S SCPアミノ酸配列および/またはX線回折データを含有する製品のことをいい 、 例えば、アミノ酸配列は、図1、8、10、または11において提供されたアミノ酸 配列、それらの代表的なフラグメント、あるいは図11A-Dのアミノ酸配列または その変種の5〜2005アミノ酸フラグメントに全体で少なくとも80〜100%の相同 性を有するアミノ酸配列である。このような方法は、アミノ酸配列および/また はX線回折データを、当業者がPNS SCPまたはそのサブドメインの三次元構造を 分析でき、そして分子モデリングできる形式で提供する。 本実施態様の1つの適用において、本発明のPNS SCPまたはその少なくとも1 つのサブドメインのアミノ酸配列および/またはX線回折データは、コンピュー ター読み出し可能な媒体に記録される。本明細書中で使用される「コンピュータ ー読み出し可能な媒体」とは、コンピューターにより直接読み込みおよびアクセ スされ得るあらゆる媒体をいう。このような媒体には、磁気保存媒体(例えば、 フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープ);光学保存 媒体(例えば、光ディスクまたはCD-ROM);電子保存媒体(例えば、RAMおよびR OM);および磁気/光学保存媒体のようなこれらのカテゴリーのハイブリッドが 包含されるが、これらに限定されない。当業者は、現在公知のコンピューター読 み出し可能な媒体のいずれもが、本発明のアミノ酸配列および/またはX線回折 データをそれらに記録したコンピューター読み出し可能な媒体を含む製品を制作 するためにいかに使用され得るかを容易に認識し得る。 本明細書中で使用される「記録された」とは、コンピューター読み出し可能媒 体に情報を蓄積するプロセスをいう。当業者は、本発明のアミノ酸配列および/ またはX線回折データの情報を含む製品を生成するために、コンピューター読み 出し可能な媒体に情報を保存するための現在公知のいずれの方法をも容易に採用 し得る。 様々なデータ保存構造が、本発明のアミノ酸配列および/またはX線回折デー タをそれに記録したコンピューター読み出し可能な媒体の制作のために、当業者 に利用可能である。データ保存構造の選択は、一般的に、蓄積された情報をアク セスするために選択された手段に基づいている。さらに、様々なデータプロセッ サープログラムおよびフォーマットが、本発明の配列およびX線データ情報をコ ンピューター読み出し可能な媒体に蓄積するために使用され得る。配列情報は、 WordPerfectおよびMicroSoft Wordのような商業的に利用可能なソフトウェアで フォーマットされたワードプロセッサーのテキストファイルで表示され得るか、 またはデータベースアプリケーション(例えば、DB2、Sybase、Oracleなど)に おいて蓄積されたASCIIファイルのフォームで表示され得る。当業者は、本発明 の情報をそれに記録したコンピューター読み出し可能な媒体を得るために、多く のデータプロセッサー構築フォーマット(例えば、テキストファイルまたはデー タベース)を容易に適合させ得る。 コンピューターで読み出し可能な媒体上のPNS SCP配列および/またはX線回折 データを提供することにより、当業者は、PNS SCP、そのサブドメイン、または そのリガンドをモデル化するための配列およびX線回折データを日常的に入手し 得る。コンピューターアルゴリズムは、公的および商業的に利用可能であり、当 業者がコンピューター読み出し可能な媒体で提供されるこのデータを入手し、分 子モデリングおよび/またはRDDのためにデータを分析することを可能にする。 本発明はさらに、本明細書中に記載の配列および/または回折データを有する システム、特に、コンピューターを基本とするシステムを提供する。このような システムは、PNS SCPまたは少なくともその1つのサブドメインのための分子モ デリングおよびRDDを行うために設計される。 本明細書中で用いられる「コンピューターを基本としたシステム」は、本発明 の配列および/またはX線回折データを分析するために利用されるハードウェア 手段、ソフトウェア手段、およびデータ保存手段をいう。本発明のコンピュータ ーを基本としたシステムの最小のハードウェア手段は、中央処理装置(CPU)、入 力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含む。当業者は、現在入手可能なコ ンピユーターを基本としたシステムのどれが本発明における利用に適切であるか ということを容易に認め得る。 上記のように、本発明のコンピューターを基本としたシステムは、本発明のPN S SCPまたはフラグメントの配列および/またはX線回折データを保存するデー タ保存手段および分析手段を支援および実行するための必要なハードウェア手段 およびソフトウェア手段を含む。本明細書中に利用される「データ保存手段」は 、本発明の配列および/またはX線回折データを保存し得るメモリー、または本 発 明の配列またはX線回折データを記録している製品にアクセスし得るメモリーア クセス手段をいう。 本明細書中で用いられる「検索手段」または「分析手段」は、データ保存手段 で保存されている配列またはX線データを用いて標的配列または標的構造モチー フを比較するコンピューターを基本としたシステム上で実行される1つ以上のプ ログラムをいう。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフと適合するPN S SCPのフラグメントまたは領域を同定するために利用される。様々な公知のア ルゴリズムが公的に開示され、そして検索手段を行うために様々な商業的に利用 可能なソフトウェアが、本発明のコンピューターを基本としたシステムにおいて 利用され、そして利用され得る。当業者は、コンピューター分析を行うために利 用し得るアルゴリズムまたは実行するソフトウェアパッケージのどれもが、本発 明のコンピューターを基本としたシステムにおける利用に適合し得ることを容易 に認め得る。 本明細書中で用いられる「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、任 意の合理的に選択された配列または配列の組合せをいい、それにおいてその配列 が標的モチーフの折りたたみによって形成された三次元配置または電子密度マッ プに基づいて選択される。当該分野には様々な標的モチーフが公知である。タン パク質標的モチーフは、酵素活性部位、構造的サブドメイン、エピトープ、機能 的ドメイン、およびシグナル配列を包含するが、これらに限定されない。入力ま たは出力手段のための様々な構造の形式が、本発明のコンピューターを基本とし たシステムにおいて情報を入力または出力するために使用され得る。 様々な比較手段は、構造的モチーフまたは電子密度マップを同定するためのデ ータ保存手段とともに標的配列または標的モチーフを比較し得る。当業者は、任 意の公的に利用可能なコンピューターモデリングプログラムが、本発明のコンピ ューターを基本としたシステムの検索手段として利用され得ることを容易に認識 する。 本実施様態の1つの適用を図12に提供する。図12は、本発明の実行に利用され 得るコンピューターシステム102のブロックダイアグラムを提供する。コンピュ ーターシステム102は、バス104と連結したプロセッサー106を含む。104にはまた 、 主メモリー108(好ましくはランダムアクセスメモリー、RAMとして提供される) およびハードドライブ112および取りはずし可能な保存媒体114のような様々な二 次的な保存メモリー110が連結される。取りはずし可能な媒体、保存デバイス114 は、例えばフロッピーディスクドライブ、CD-ROMドライブ、磁気テープドライブ などを示す。(フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープのような )制御ロジックおよび/またはその中に保存されたデータを有する取りはずし可 能な保存媒体116は、取りはずし可能な保存媒体114に挿入され得る。コンピュー ターシステム102は、一旦、取りはずし可能媒体保存デバイス114に挿入されると 、取りはずし可能媒体媒体保存デバイス114から制御ロジックおよび/またはデ ータを読むための適切なソフトウェアを含む。モニター120は、構造決定データ を視覚化するためにバス104に連結して利用され得る。 アミノ酸、コードする核酸、または本発明の他の配列および/またはX線回折 データは、主メモリー108、任意の二次的な保存デバイス110、および/または取 りはずし可能な保存デバイス116に周知の方式で保存され得る。アミノ酸配列お よび/またはX線回折データをアクセスおよび処理するためのソフトウェア(検 索ツール、比較ツールなど)は、実行中の主メモリー108に存在する。 三次元構造決定。1つ以上のコンピューターモデリング工程および/またはコ ンピューターアルゴリズムは、図1、8、10、または11(またはその変異体)か らのアミノ酸配列データおよび/またはX線回折データを用いて、切断型PNS SC Pの分子3-Dモデルを提供するために用いられる。アミノ酸配列が用いられさえす れば、三次元構造決定のために、適切なモデリングプログラムが用いられ得る( 例えば、LINUS(Roseら、Proteins:Structure,Function and Genetics(1995 年6月)および本明細書中に引用された参考文献)。PNS SCPモデルは、Ramacha ndranプロットの許容されない領域(disallowed region)に残基を全く有さないか 、またはAla置換(表面に対して)残基を有し、そして正の3D-1D輪郭(Luthyら、 Nature 356:83-85(1992))を与えることが好ましい。これは、全ての残基が許容 可能な環境中に存在することを示唆する(Kraulis(1991)、下記)。あるいは、 許容されない領域は、本明細書中に記載のRAVEプログラムのような適切なアルゴ リズムの使用により矯正され得る。位相決定は、必要に応じて、切断型PNS SCPの三次元構造を解明するために用いられる。この構造は、次いでPNS SCPノイ ラミニダーゼ、エンドセリン、カテプシンA、または他の生物学的活性(例えば 、PNS SCP関連病状に関係がある活性)の調節物質のRDDのために用いられ得る。 密度修正およびマップ解釈。電子密度マップは、CCP4コンピューティングパッ ケージ(SERC(UK)Collaborative Computing Project 4,Daresbury Laborator y,UK,1979)からのプログラムのようなプログラムを用いて算出され得る。二回 相加平均(two-fold averaging)の周期が、プログラムRAVE(Kleywegt & Jones、B aileyら編、First Map to Final Model,SERC Daresbury,Laboratory,UK.59〜 66頁(1994))および漸次モデル拡大において用いられ得るように、さらに用いら れ得る。マップ視覚化およびモデル構築のために、「○」(Jones(1991)、下記 )のようなプログラムが用いられ得る。 精密化およびモデル妥当性。剛直体および位置精密化が、例えば、Enghおよび Huberの立体化学パラメーター(Acta Cryst.A47:392-400(1991))を有するX-PL 均マップのこの段階でのモデルが依然として残基(例えば、サブユニット当たり 少なくとも5〜10)を欠失する場合、欠失残基のいくつかまたは全てが位置精密 化およびモデル構築のさらなる周期の間にモデル中に取り込まれ得る。精密化手 順は、より低い解像度からのデータを用いて出発し得る(例えば、25-10Åから 10-3.0Å、そして次いで12-6Åから3.0-1.5Åからのデータを包含するように漸 次的に拡大し得る)。個々の原子に対するβ値は、一旦、2.9と1.5Åとの間のデ ータが加えられると、精密化され得る。続いて、水が徐々に加算され得る。ARP (LamzinおよびWilson、ActaCryst.D49:129-147(1993))のようなプログラムは 、結晶学的に水を加えるために用いられ得、そしてモデルにおける不良領域につ いてチェックするツールとして用いられ得る。PROCHECK(Lackowskiら、J.Appl .Cryst.26:283-291(1993))、WHATIF(Vriend、J.Mol.Graph.8:52-56(199 ラム、ならびにX-PLORにより生成される幾何学的解析は、構造を誤差についてチ ェックするために用いられ得ている。最終精密化周期のために、20〜5%の最も 弱いデータがIFobsI/δカットオフを用いて除かれ得、そしてFobsとFcalcとの 間の 異方性スケーリング因子が、データの質および完成度の評価を慎重に行った後に 適用され得る。 構造解析。DSSPのようなプログラムが、二次構造要素を割り当てるために用い られ得る(KabschおよびSander(1983)、下記)。(BIOMOL結晶学的コンピューテ ィングパッケージからの)SUPPOSのようなプログラムが、種々のモデルおよびモ デルの一部の最少二乗重なりのいくつかまたは全てについて用いられ得る。溶媒 の接近可能な表面および静電ポテンシャルは、GRASP(Nichollsら(1991)、下記 )のようなプログラムを用いて計算され得る。 用いることによるような、分子置換手順を用いて解明され得る。モノマーについ ての部分検索モデルは、関連タンパク質(例えば、コムギセリンカルボキシペプ チダーゼ構造物(Liaoら(1992)、下記)を用いて構築され得る。回転および翻訳 機能は、それらの相互作用に基づいて決定されるように、生理学的二量体を形成 する2つのサブユニットについて、2つ以上の配向および位置を得るために用い られ得る。周期的な二回密度相加平均もまたRAVEプログラムを用いて行われ得、 そしてモデル拡大もまた、各モノマーに対する欠失残基を付加するために用いら れ得る。これにより、総残基数の95〜99.9%を有するモデルが得られる。モデル 的Rfactor、に精密化され得る。このモデルデータは、次いで、合理的薬物設計 のようなさらなる分析において使用するために、コンピューター読み出し可能な 媒体上に保存される。 PNS SCPと相互作用する薬物の合理的設計.本明細書に記載の、切断されたPNS SCPの3次元構造の決定により、少なくとも1つのPNS SCP関連病状の診断およ び/または処置のための、新たなそして特異的なリガンドの設計のための基礎が 提供される。いくつかのアプローチが、PNS SCPのリガンドの合理的な設計にお いて、PNS SCPの結晶構造の使用のために取られ得る。活性部位構造のコンピュ ーター支援された手動検討が必要に応じて行われる。GRID(Goodford,J.Med.Ch em.28:849-857(1985))(種々の官能基特性を有するプローブと酵素表面との間 の可能な相互作用部位を決定するプログラム)のようなソフトウエアの使用を 用いて、活性部位を解析して阻害化合物の構造を決定する。プローブとしての分 子上の適切な阻害基(例えば、プロトン化一級アミン)についてのプログラム計 算を用いて、適切なエネルギー等強度レベル(energy contour level)で接近可 能な位置周辺の可能なホットスポットを同定する。次いで、適切なリガンド(阻 害または刺激調節化合物または組成物)を、少なくとも1つのPNS SCPの調節活 性について試験する。 本発明の診断的または治療的PNS SCP調節リガンドは、核酸、化合物、タンパ ク質、エレメント、脂質、抗体、サッカリド、同位体、炭水化物、造影剤、リポ タンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能プローブ、および抗体またはそのフ ラグメント、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも1つ であり得るが、それらに限定されない。これらは、標識抗体について検出可能に 標識され得る。そのような標識は、酵素的標識、放射性同位体あるいは放射性化 合物またはエレメント、蛍光化合物または金属、化学ルミネセンス化合物および バイオルミネセンス化合物を包含するが、それらに限定されない。あるいは、任 意の他の既知の診断剤または治療剤が、本発明の方法において使用され得る。 予備的な実験を、PNS SCPの各酵素活性について基質のKmを決定するために行 った後、リガンドの調節の時間依存性の性質Ki値を測定する(例えば、Henderso n(Biochem.J.127:321-333(1972))の方法により)。例えば、基質(または適 切な場合はブランク)および酵素を、緩衝液中でプレインキュベートする。反応 を基質の添加により開始する。アリコートを適切な時間経過にわたって取り出し 、そして各々を適切な停止緩衝液(例えば、エタノール水溶液中の水酸化ナトリ ウム)のアリコート中に添加することにより停止する。産物の濃度を、例えば蛍 光測定で、分光計を用いて測定する。時間に対する蛍光のプロットは、アッセイ 期間にわたって直線に近くあり得、そしてこれを用いてリガンドの存在下の初速 度(Vi)または非存在下の初速度(V0)についての値を得る。誤差はHenderson プロットにおける両方の軸において存在する。このことはこのプロットを標準的 な回帰分析のために不適切にする(Leatherbarrow,Trends Biochem.Sci.15:45 5-458(1990))。それゆえ、Ki値は、競合的阻害のためのHendersonの式の改変型 に適合させることにより、データから得られる: ここで(Henderson(Biochem.J.127:321-333(1972))の表示を用いて): この式は、SAS(SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina,USA)のPROCNLI N(これは、最小自乗法を用いる非線形回帰を実行する)を用いて、以下の条件 で正の根について解かれる 使用される反復法は、任意に多変量割線法である。これは、Taylor級数における 導関数が、解析的に与えられるのではなく、反復のヒストグラムから概算される 以外、Gauss-Newton法に類似している。例えば、10-3未満の損失関数における変 化が存在する場合、適切な収束基準が任意に使用される。 一旦調節リガンドが見出され、そして単離または合成されると、PNS SCPに複 合体化された化合物の結晶学的研究が行われる。非限定的な例として、PNS SCP 結晶を2日間0.01〜100mMのリガンドに浸し、そしてX線回折データをエリアデ ィテクターおよび/またはイメージプレートディテクター(例えば、Marimage p late detector)上に、回転陰極X線源を用いて収集する。データを、可能な限 り高い解像度で(例えば、1.5〜3.5Å)収集し、そして適切な強度のR因子を用 いて合わせる。インヒビターの原子モデルを、差分Fourierマップ(Finhibitor complex ‐Fnative)に組み立てる。モデルは、10〜500サイクルのエネルギー 精密化、100〜10,000 I-FS工程の室温ダイナミクスおよび/または10〜500のさ らなるサイ 下記)における解に対して精密化され得る。調和拘束(harmonic restraint)も また、インヒビターから半径10〜15Å以内の原子以外、原子の精密化のために使 用され得る。R因子を、それぞれ、理想的な結合長からの両方のr.m.s.偏差およ び角度についてのモデルのために選択する。酵素阻害の直接的な測定により、モ デリングされたリガンドがPNS SCの少なくとも1つの生物学的活性の調節物質で あるというさらなる確認が提供される。 従って、PNS SCPのリガンドもまた、この酵素の結晶構造に基づいて、本発明 により提供される。臨床的に有用なレベルの実証(例えば、インビボ活性)も重 要である。PNS SCPを評価する際に、動物モデル(例えば、ラット、マウス、ウ サギ)における生物学的活性のインヒビターが、種々の経口投与経路および非経 口投与経路を用いて評価される。このアプローチを用いて、適切な動物モデルに おいて、分子モデリングおよびX線結晶学により見出されたリガンドを用いて、 PNS SCPの調節が生じることが期待される。 診断的および/または治療的薬物.本発明の診断的または治療的PNS SCP調節 薬剤またはリガンドは、核酸、化合物、タンパク質、エレメント、脂質、抗体、 サッカリド、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素 、検出可能プローブ、および抗体またはそのフラグメント、あるいはそれらの任 意の組み合わせから選択される少なくとも1つであり得るが、それらに限定され ない。これらは、本明細書中で記載されるように標識抗体について検出可能に標 識され得る。そのような標識は、酵素的標識、放射性同位体あるいは放射性化合 物またはエレメント、蛍光化合物または金属、化学ルミネセンス化合物およびバ イオルミネセンス化合物を包含するが、それらに限定されない。あるいは、任意 の他の既知の診断剤または治療剤が、本発明の方法において使用され得る。 本発明で使用される治療剤は、標的細胞(例えば、末梢神経系の細胞またはニ ューロン)における治療効果を有し得る。この効果は、以下のものから選択され るが、これらに限定されない:欠陥遺伝子または欠陥タンパク質の修正、薬の作 用、毒性効果、成長剌激効果、成長阻害効果、代謝効果、異化作用効果、同化作 用効果、神経液性効果、細胞分化剌激効果、細胞分化阻害効果、神経調節効果、 多能性幹細胞剌激効果および任意の他の既知の治療効果(これは、末梢神経系の 細胞において少なくとも1つのSCを調節する)が、薬学的投与または本発明に従 う送達ベクターを経て標的細胞へ送達される治療剤によって提供され得る。 治療剤としての治療核酸は、標的細胞における以下の治療効果のうち少なくと も1つを有し得るが、これらに限定されない:DNA配列の転写阻害;RNA配列の翻 訳阻害;RNAまたはDNA配列の逆転写阻害;タンパク質の翻訳後修飾阻害;DNA配 列の転写誘導;RNA配列の翻訳誘導;RNAまたはDNA配列の逆転写誘導;タンパク 質の翻訳後修飾誘導;RNAとしての核酸の転写;タンパク質または酵素としての 核酸の翻訳;および治療核酸の構成発現または一過性発現のための標的細胞染色 体への核酸の組み込み。 治療核酸の治療効果は、以下のものを包含し得るが、これらに限定されない: 欠陥遺伝子の休止またはその発現のプロセシング(例えば、アンチセンスRNAま たはDNA);ウイルス複製または合成の阻害;治療タンパク質をコードする異種 核酸の発現または欠陥タンパク質の修正のような遺伝子療法;RNA(例えば、hnRN A、mRNA、tRNAまたはrRNA)の欠陥または発現低下の改変;異常細胞またはキメ ラレセプターを発現する正常細胞における薬物またはプロドラッグ、あるいは薬 物またはプロドラッグとしての化合物を産生する酵素のコード化;および任意の 他の既知の治療効果。 病原性神経細胞への送達のための、任意の既知の毒素、プロドラッグまたは遺 伝子薬物をコードするか、または治療効果を提供する本発明の治療核酸はまた、 病原性SC含有細胞に特異的な組織特異的転写調節配列(TRS)の制御下の遺伝子を 包含し得る。このようなTRSはさらに、既知の方法に従って標的細胞における治 療剤の発現を制限する。 本発明のこのようなPNS SCP調節剤またはリガンドの制限されない実施例およ びその方法は、リドフラジン(例えば、Merck Index Monograph 5311および米国 特許第3,267,104号を参照のこと。両方の文献は本明細書中に参考として全体が 援用される)のようなメチル/ハロフェニル置換ピペリジン化合物を包含する。 このような化合物は試験され、そして少なくとも1つのPNS SCPを発現する細胞 株(例えば、PC12、PK1-4および本発明の少なくとも1つのPNS SCPを発現する他 の単離された細胞または組換え細胞)において本発明の少なくとも1つのPNS SC Pのナトリウムチャンネル活性を阻害することが見出された。従って、本発明は メチル/ハロフェニル置換ピペリジンのようなPNS SCPを調節する薬剤またリガン ドを提供する。この置換はアルキルおよび/またはハロフェニル置換ピペリジン を包含し得る。 薬学的/診断的投与。PNS SCPを調節する化合物または組成物(上記のようなア ンタゴニストおよびアゴニストを含む)を使用して、本発明はさらに、細胞にお けるPNS SCPタンパク質の活性を調節する方法を提供する。一般的に、PNS SCPの 活性を阻害または増強することが同定されている薬剤(アンタゴニストまたはア ゴニスト)は、その薬剤がインビボでPNS SCPタンパク質を発現する細胞と接触 し得るように処方され得る。このような薬剤とこのような細胞との接触は、PNSS CPタンパク質の活性のインビボ調節に帰する。処方バリアーまたは毒性バリアー が存在しない限り、上記のアッセイで同定された薬剤は、インビボの使用で有効 である。 別の実施態様において、本発明は、動物(好ましくは、哺乳動物(特に、ヒト ))へ、その動物におけるPNS SCPのレベルの変化をもたらすために十分な量で 、PNS SCPあるいはPNS SCPを調節する化合物または組成物(PNS SCPアンタゴニ ストおよびアゴニストを含む)を投与する方法に関する。投与されたPNS SCある いはPNS SCPを調節する化合物または組成物は、特にPNS SCP関連機能をもたらし 得る。さらに、PNS SCPは、末梢神経系組織で発現されるので、PNS SCあるいはP NS SCPを調節する化合物または組成物の投与は、末梢神経系におけるPNS SCPレ ベルを改変するために使用され得る。 PNS SCPアンタゴニストは、外傷あるいは中枢神経系または末梢神経系に関与 する病状による痛み、または少なくとも1つの天然に存在する神経系特異的(NS )ナトリウムチャンネル(SC)の異常に高い発現レベルに関する病状を処置するた めに使用され得る。ここで、PNS SCPアンタゴニストはまた、少なくとも1つのN S SCを阻害するか、またはここでこの痛みは、PN SCによってある程度まで媒介 される。このような病状は、以下のものを包含するが、それらに限定されない; 炎症性疾患、神経障害(例えば、糖尿病性神経障害)、栄養失調(例えば、反射 交感神経栄養失調、ヘルペス後神経痛);外傷(何らか原因による組織損傷); 何らか原因による焦点痛。 炎症性疾患は、慢性炎症性病状および血管炎症性病状を包含し得るが、それら に限定されない。慢性炎症性病状は、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰 瘍大腸炎およびクローン病を包含するが、それらに限定されない。そして、血管 炎症性病状は、例えば、汎発性血管内凝固症候群、アテローム性動脈硬化症およ び川崎病を包含するが、それらに限定されない。 PNS SCPアゴニストは、中枢神経系または末梢神経系に関与する病状あるいは 少なくとも1つの天然に生じる神経系特異的(NS)ナトリウムチャンネル(SC)の 異常に低い発現レベルに関する病状を処置するために使用され得る。ここで、PN S SCPアゴニストはまた、少なくとも1つのNS SCを増強または剌激する。このよ うな病状は、神経変性疾患、腸神経系の機能不全による胃腸管疾患(例えば、大 腸炎、回腸炎、炎症性腸症候群);心臓血管系疾患(例えば、高血圧およびうつ 血性心不全);交感神経系および副交感神経系神経支配に関与する尿生殖器管疾 患(例えば、良性前立腺過形成、性的不能);神経筋系疾患(例えば、筋ジスト ロフィー、多発硬化症、てんかん)を包含するが、これらに限定されない。 神経変性疾患は、脱髄性疾患(例えば、多発硬化症および急性横断性脊髄炎) ;運動過剰運動障害(例えば、ハンチントン舞踏病および老年舞踏病);運動低 下運動障害(例えば、パーキンソン病);進行性核上麻痺;旧小脳変性(例えば 、脊髄性運動失調、フリードリッヒ運動失調);多発性系変性(multiple syste ms degeneration)(Mencel,Dejerine-Thomas,Shi-Drager,およびMachado-Jo seph);および全身的な障害(レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、 毛細管拡張症およびミトコンドリア多系障害(mitochondrial multi-system dis order));脱髄性コア障害(例えば、多発硬化症、急性横断性骨髄炎);運動 単位障害(例えば、神経性筋萎縮症(前角細胞変性(例えば、筋萎縮性側索硬化 症、小児脊髄筋萎縮症および若年脊髄筋萎縮症));またはそれらの任意のサブ セットを包含し得るが、これらに限定されない。 PNS SCに関連する病状に対する本発明の診断的/薬学的な化合物または組成物 の薬学的/診断的投与は、その意図される目的(例えば、癌または前癌性状態を 処置または防止するために)を達成する任意の手段によって投与され得る。 本明細書中で使用された「感染または疾患からの保護」における用語「保護」 は、「防止」、「抑制」または「処置」を包含する。「防止」は、疾患の誘導前 の薬学的組成物の投与を含む。 「抑制」は、疾患の臨床出現前の組成物の投与 を含む。「処置」は、疾患の出現後の保護組成物の投与を含む。ヒト医薬および 獣医薬において、最終的な誘導事象(単数または複数)は、未知で潜在的であり 得、 または患者を、この事象(単数または複数)の発生後まで確かめないので、必ず しも「防止すること」と「抑制すること」との間の区別は可能であるとは限らな いことが理解される。従って、本明細書中で定義される「防止すること」と「抑 制すること」の両方を包含するために、「処置」とは異なる用語「予防」を用い ることは一般的である。本明細書中で使用される用語「保護」は、「予防」を包 含することが意味される。例えば、Berker、下記、Goodman、下記、Avery、下記 およびKatzung、下記を参照のこと。これらの文献は、本明細書中に参考(その 中で引用された全ての参考を含む)として全体が援用される。提供される「保護 」は、絶対である必要はない(すなわち、コントロール集団に比べ統計的に有意 な改良があれば、疾患は、完全に防止されるかまたは根絶される必要はない)。 保護は、疾患の重篤度または症状の開始速度を和らげることに制限され得る。 本発明の少なくとも1つのPNS SCを調節する化合物または組成物は、既に記載 のような薬学的組成物を使用して、意図される目的を達成する任意の手段によっ て投与され得る。 例えば、投与は、種々の非経口ルート(例えば、皮下、静脈内、皮内、筋肉内 、腹膜内、鼻腔内、頭蓋内、経皮、または頬ルート)によるものであり得る。あ るいは、または同時に、投与は、経口ルートによるものであり得る。非経口投与 は、ボーラス注射または時間にわたる緩やかな灌流によるものであり得る。 本発明の診断的/薬学的な化合物または組成物のさらなる使用の様式は、局所 適用によるものである。本発明の診断的/薬学的な化合物または組成物は、局所 的に適用されるビヒクル(例えば、膏薬または軟膏)に混ぜられ得る。 局所適用のために、処置されるべき末梢ニューロンに近接する標的領域(例え ば、皮膚表面、粘膜など)へ、有効量の本発明による診断的/薬学的な化合物ま たは組成物を投与することが好ましい。この量は一般的に、処置されるべき領域 、その使用が診断的、予防的または治療的であるかどうか、症状の重篤度および 使用される局所ビヒクルの性質に依存して一回の適用あたり約0.0001mgから約1 gのPNS SC調節化合物の範囲である。好ましい局所調製物は、軟膏であり、それ において約0.001から約50mgの活性成分が、軟膏主薬1ccあたりに使用される。 処置または予防のための局所レジメンは、一日または数日の期間にわたり、一 週間と約6ケ月との間まで、そしてそれを含む期間での有効量の投与を包含する 。 インビボまたはインビトロで投与される本発明の診断的/薬学的な化合物また は組成物の用量決定は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、同時処置の種 類、ある場合、処置の頻度、ならびに所望の診断的/薬学的な効果の性質に依存 することが理解される。本明細書中に提供される有効投与量の範囲は、制限され ることが意図されるのではなく、そして好ましい投与量範囲を示す。しかし、最 も好ましい用量決定は、当業者によって理解され、そして決定され得るように個 々の被験者に合わせて調整される。例えば、Berkowら編、The Merck Manual、第 16版、Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992;Goodmanら編、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第8版、Pergamon Press,Inc.,El msford,N.Y.,(1990);Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of C linical Pharmacology and Therapeutics,第3版、ADIS Press,LTD.,Williams a nd Wilkins,Baltimore,MD.(1987),Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,B oston,(1985); Osolら編、Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版、Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990); Katzung,Basic and Clinica1 Pharmacolog y,Appleton and Lange,Norwalk,CT(1992)を参照のこと。これらの文献は参考と して本明細書中に全体が援用される。 各処置に必要とされる総投与量は、複数回の投与量、または単回投与量により 投与され得る。診断的/薬学的な化合物または組成物は、単独で投与され得るか または病状に関する、あるいは病状の他の症状に関する他の診断薬および/また は医薬とともに投与され得る。 本発明の、有効量の診断的/薬学的な化合物または組成物は、0.1μg〜約100m g/kg体重であり、4〜72時間の間隔で、2時間〜1年間の期間、および/あるい はその中の任意の範囲または値で投与される。例えば、0.0001〜1.0、1〜10、1 0〜50および50〜100、0.0001〜0.001、0.001〜0.01、0.01〜0.1、0.1〜1.0、1.0 〜10、5〜10、10〜20、20〜50、および50〜100mg/kgで、1〜4、4〜10、10〜 16、16〜24、24〜36、36〜48、48〜72時間の間隔で、1〜14、14〜28、または30 〜44日、あるいは1〜24週間、あるいはその中の任意の範囲または値で投与され る。 本発明の化合物および/または組成物の投与の受容者は、哺乳動物の中で鳥類 、硬骨魚、カエル、およびヒキガエルのような、任意の脊椎動物でもあり得る。 哺乳動物の中で好ましい受容者は、霊長類(ヒト、ヒトニザル、およびサルを含 む)、偶蹄類(ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む)、齧歯類(マウス、ラ ット、ウサギおよびハムスターを含む)、および食肉類(ネコ、およびイヌを含 む)の哺乳動物である。鳥類の中で好ましい受容者は、七面鳥、ニワトリおよび 他の同目のメンバーである。最も好ましい受容者はヒトである。 遺伝子療法。本発明の送達ベクターは、ウイルスベクター、リポソーム、抗PN S SCP抗体または抗SC抗体、あるいはSCリガンドであり得るが、これに限定され ない。これらの送達ベクターの1つまたはそれ以上は、診断剤または治療剤と結 合する。 送達ベクターは、標的細胞において治療的または診断的効果を有するいかなる 診断剤または治療剤も包含し得る。送達ベクターの標的細胞特異性は、このよう に標的細胞特異的送達ベクターを用いることによって供与される。 送達ベクターはまた、抗体またはフラグメントから成る群から選択される少な くとも1つの結合ドメインを含む組換えウイルスベクター、キメラ結合部位抗体 またはフラグメント、標的細胞または特異的リガンド、標的細胞のリガンドに結 合するレセプター、抗イディオタイプ抗体、標的細胞に特異的なリポソームまた は他の成分であり得る。PNS SCPは、既に標的細胞と結合し得るか、または送達 ベクターは標的細胞レセプターに対するリガンドを介して標的細胞に結合し得る か、またはその逆も可能である。 従って、治療剤または診断剤(例えば、治療核酸または診断核酸、タンパク質 、薬物、化合物、組成物など)は、標的細胞に優先的に送達される。例えば、こ こで核酸は、好ましくは、部分的にまたは完全に非標的細胞を排除して標的細胞 の染色体に挿入される。 本発明は、このように、遺伝子療法に適切なベクターを含む、1つまたはそれ 以上の治療剤および/または診断剤を包含する送達ベクターを提供することが意 図される。 このような処置を必要とする患者のPNS SCPに関連した疾患を処置する方法に おいて、機能的PNS SCP DNAが、このような患者を処置するために十分な時間お よび量で(例えば、適切な送達ベクター)、このような遺伝子によって供与され るPNS SCPタンパク質の発現を可能にする方法および量で、このような患者のPNS 細胞に供与され得る。細胞から欠如している遺伝子またはタンパク質の必要なヒ ト患者にこのような送達を供与するための多くのベクター系が当業者には公知で ある。例えば、レトロウイルス系(特に改変したレトロウイルス系および特に単 純ヘルペスウイルス系)が使用され得る。このような方法は、例えば、Breakefi eldら、The New Biologist 3:203-218(1991)、Huang,Qら、Experimental Neurol ogy 115:303-316(1992)、WO93/03743およびWO90/09441の教示により供与される 。機能的なPNS SCPタンパク質をコードしているDNA配列の送達は、本発明の欠如 または変異したPNS SCP遺伝子を効果的に置き換える。 本発明の別の実施態様は、PNS SCPを調節する化合物または組成物は、細胞内 で組換え遺伝子として発現され、そのため哺乳動物、好ましくは遺伝子療法を必 要としているヒトにこの細胞を移植し得る。PNS SCPを調節する化合物または組 成物の全部または一部をコードする遺伝子配列を、個体に対する遺伝子療法を供 与するために、ベクターに組み込み、そして宿主細胞に導入する。遺伝子療法に 適切であり得る疾患の例は、神経変性疾患または障害、アルツハイマー病、精神 分裂病、てんかん、腫瘍およびガンを包含するが、これらに限定されない。遺伝 子療法に用いられ得るベクターの例は、欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、 または他のウイルスベクター(Mulligan,R.C.,Science 260:926-932(1993))を包 含するが、これに限定されない。Anderson,Gene Therapy,246 J.Amer.Med.Assn. 2737(1980);Friedmann,Progress toward human gene therapy,244 Science 127 5(1989);Anderson,256 Science 808(1992);human gene therapy protocols pu blished in Human Gene Therapy,Mary Ann Liebert Publishers,N.Y.(1990〜199 4);Bankら、565 Ann.N.Y.Acad.Sci.37(1989);LTR-Vectors(米国特許第4,405,7 12号);Ausubel,下記,第9.10〜9.17章;Jon A.Wolff編,Gene Therapeutics;meth 照のこと。 遺伝子を有するベクターが細胞に導入され得る方法は、マイクロインジェクシ ョン、エレクトロポレーション、トランスダクション、またはDEAE-Dextranを用 いたトランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは当業者 に公知の他の方法を包含するが、これに限定されない(Sambrook、下記、Ausube l、下記)。 非経口投与のための調製物は、滅菌溶液または水性溶液または非水性溶液、懸 濁液、および乳濁液を含む。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエ チレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのよう な注入可能な有機エステルである。水性キャリアは水、アルコール性/水性溶液 、乳濁液、または懸濁液(生理食塩水および緩衝化媒体を含む)を含む。非経口 ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、および塩化ナトリ ウム、乳酸化リンガー、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養 補液、電解質補液(例えば、リンガーデキストロースに基づくものなど)を含む 。保存剤および他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、 不活性ガスなどであり得る。一般に、Osolら編、Remington's Pharmaceutical S cience,第16版,(1980)を参照のこと。 他の実施態様において、本発明は、PNS SCPに関連する活性を変化させるのに 十分な量のPNS SCまたはPNS SCPを調節する化合物または組成物を包む薬学的組 成物、および薬学的に受容可能な希釈物、キャリア、あるいは賦形剤に関する。 適切な濃度および投与量のユニットサイズは、当業者によって容易に決定され得 る(例えば、0solら編、Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack.Ea ston PA(1980)およびWO91/19008を参照のこと)。 本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、少なくとも1つの有 効量のPNS SCPアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物である。こ のようなアンチセンスオリゴは、配列番号1のDNA配列に相補的な少なくとも1 つの12〜500ベースの長さのヌクレオチド配列、または配列番号2の少なくとも 4アミノ酸をコードするDNA配列、あるいは図11A〜11Eを含むが、これに限定さ れない。 あるいは、PNS SCP核酸は、脂肪親和性キャリア(例えば、コレステロール、 コール酸塩およびデオキシコール酸を含む多くのステロール類のうちの任意の1 つ)と結合され得る。好ましいステロールはコレステロールである。 本発明のPNS SCP遺伝子療法核酸および薬学的組成物は、それらの意図された 目的を達成する任意の手段により投与され得る。例えば、投与は、非経口、皮下 、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮ルートによってであり得る。投与量は、 受容者の年齢、健康、体重、同時処置の種類、ある場合、処置の頻度、および所 望される効果の性質に依存する。 本発明の範囲内の組成物は、末梢神経系ニューロンまたは神経節において少な くとも1つのPNS SCPの増強された発現を達成するために有効な量で、PNS SCPア ンチセンスオリゴヌクレオチドを含む全ての組成物を包含する。個体の要求性は さまざまであるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の範囲内である。 代表的には、PNS SCP核酸は、哺乳動物(例えば、ヒト)に、処置されている哺 乳動物の体重1日あたり0.005〜1mg/kg/日の投与量で、または薬学的に受容可 能なその塩の等量で、投与され得る。 非経口投与の適切な処方物は、水溶性の形態(例えば水溶性の塩)で、PNS SC P核酸の水溶液を含む。さらに、適切な油性注入懸濁物として活性化合物の懸濁 物が投与され得る。適切な脂肪親和性溶剤またはビヒクルは、脂肪油(例えば、 ゴマ油)あるいは合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチルまたはトリグ リセリド)を含む。水性注入懸濁物は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセ ルロース、ソルビトール、および/またはデキストランを含む懸濁物の粘性を増 加させる物質を含み得る。必要に応じて、懸濁物は安定剤も含み得る。 あるいは、少なくとも1つのPNS SCPは、ビリオンの形態で(これは好ましく はインビボで複製できない(例えばTaylor,WO 92/06693を参照のこと))投与さ れるDNA構築物によりコードされ得る。例えば、このようなDNA構築物はヘルペス を基にしたウイルスを用いて投与され得る(Gageら、米国特許第5,082,670号) 。あるいは、PNS SCPアンチセンスRNA配列、PNS SCPリボザイム、およびPNS SCP EGSは、組換え型の複製欠陥レトロウイルスまたはアデノウイルスのような、ビ リオンの形態で投与されるRNA構築物によりコードされ得る。レトロウイルスベ クターの調製は当該分野で周知である(例えば、Brownら、「レトロウイルスベ クター」DNA Cloning:A Practical Approach,第3巻,IRL Press,Washington.D.C . (1987))。 末梢神経系における遺伝子発現の特異性は、細胞特異的エンハンサーおよびプ ロモーターのような、適切な細胞特異的調節配列を用いることより与えられ得る 。タンパク質リン酸化は神経調節に対して重要である(Kennedy,「セカンドメ ッセンジャーおよび神経機能」An Introduction to Molecular Neurobiology,Ha ll編,Sinauer Associates Inc.(1992))ので、プロテインキナーゼプロモーター 配列は、十分なレベルのPNS SCP遺伝子発現を達成するために用いられ得る。 従って、遺伝子療法は、特定の形態のPNS SCの不適切な発現を阻害することに より、ナトリウムチャンネルと関連する病状を緩和するために用いられ得る。さ らに、遺伝子療法は、特定の形態のPNS SCPの適切なレベルの発現を供与するこ とにより、このような病状を緩和するために用いられ得る。この場合、特定のPN S SCP核酸配列は、上記のようにウイルスの形態で投与されるDNAまたはRNA構築 物によりコードされ得る。 本発明をここで一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例(これは例示の ために供与され、特定されない限り本発明を制限することを意図するものではな い)の参照により、より容易に理解される。 実施例1: PNS SCをコードする核酸のクローニングおよび配列決定 材料と方法 細胞培養。P12細胞およびPKI-4 PC12サブクローンを既に記述されているよう に増殖させた(Mandelら,1988)。NGF(2.5Sサブユニット;S.Halegoua博士(St ony BrookのSUNY)より譲渡された)を培養培地に最終濃度110ng/mlで加えた。c AMP依存性キナーゼインヒビタータンパク質(PKI)を発現するPKI-4 PC12サブク ローンもS.Halegoua博士から提供された(D'Arcangeloら,J.Cell Biol.122:9 15-921 (1993)を参照のこと)。 PCR増幅。Cathalsら,DNA 2:329-335(1983)の方法に従って、高レベルのcAMP 依存性プロテインキナーゼインヒビタータンパク質を発現するPC12サブクローン (PKI-4)から全細胞RNAを単離した。NGF処理PKI-4細胞から調製した全RNAの 2μgを使用し、逆転写反応用のランダムヘキサマープライマーを用いて第1鎖c DNAを合成した。次にそのcDNAを、ナトリウムチャンネルαサブユニット遺伝子 の反復ドメインIII内の400塩基対領域を特定する一対の縮重オリゴヌクレオチド プライマーを用いる、PCR増幅のためのテンプレートとした。5'プライマー(YJ1 と命名:GCGAAGCTT(TC)TIATITT(TC)I(GATC)IAT(ATC)ATGGG(配列番号3 );下線はHindIII制限部位を示す)(II型ナトリウムチャンネル遺伝子の1347- 1354位のアミノ酸FWLIFSIMに対応する)。3'プライマー(YO1Cと命名:GCAGGATC C (AG)TT(AG)AAA(AG)TT(AG)TC(AGT)AT(AGT)AT(AGCT)AC(AGCT)CC (配列番号5);下線はBamHI制限部位を示す)(II型遺伝子の1470-1447位のア ミノ酸GVIIDNFNに対応する。増幅反応混合物は、0.1M KCl、0.1M TRIS HCl(pH 8.3)およびゼラチン(1mg/ml)からなる緩衝液中に5%のcDNA、1mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.5μM各プライマー、Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer)からなった。 反応をPerkin-Elmerサーモサイクラー中で次のように行った:変性(94℃、1分 )、アニーリング(37℃、1分)および伸長(72℃、1分)を5サイクルの後、変 性(94℃、1分)、アニーリング(50℃、1分)および伸長(72℃、1分)を25サイ クル。PCR産物を低融点アガロースゲル(SEAPLAQUE GTG,FMC BIOPRODUCTS)か ら切り出し、そしてHindIIIおよびBamHIで予め制限しておいたBluescriptII SK プラスミドベクターにサブクローニングした。ミニプレップ(miniprep)(Sambro okら、下記)によりクローンをcDNA挿入物についてスクリーニングし、そしてジ デオキシ鎖終結法(Sequenase 2.0キット,UNITED STATES BIOCHEMICAL)により 両方向に配列決定した。配列データをGENWORKSソフトウェア(INTELLIGENETICS ,INC.,Mountain View,CA)を用いて編集および分析した。 cDNAライブラリーの構築およびスクリーニング。PKI-4 PC12サブクローン由来 のポリ(A)+mRNAを精製し(mRNA精製キット,PHARMACIA)、それを用いてランダ ム−およびオリゴ(dT)−プライムλZAPII cDNAライブラリー(STRATAGENE COR P,La Jolla,CA)を構築した。このライブラリーは、増幅前に5.6×106個の独 立したクローンからなった。ランダムプライマーで標識した(PHARMACIAキット )クローン化PCR産物pPC12-1を用いて約4×106個の組換え体をスクリーニングし たところ、1〜3kbのサイズの範囲の5つのcDNAが単離された。配列分析および 公表された配列に対する比較によって、これらのcDNAのうちの2つが3033bpの新 規ナトリウムチャンネルαサブユニット(PNI)をともにコードすることが確認 された。 ノーザンブロット分析およびリボヌクレアーゼ保護アッセイ。Chirgwin,Bioc hemstry 18:5294-5299(1979)の標準的な方法を用いて、成体Sprague-Dawleyラ ットの脳、脊髄、上頚神経節、後根神経節、骨格筋、心筋および副腎から全細胞 RNAを単離した。既に記述されているようにして(Coopermanら,Proc.Nat'l Ac ad.Sci.USA 84:8721(1987))、RNAを電気泳動し、そしてナイロン膜に移し た(DURALON-UV:STRATAGENE CORP.)。Stratalinker UVクロスリンカー(STRAT AGENE CORP.)を用いてRNAブロットをナイロンに架橋し、以下の線状化したテ ンプレートから生成した32P-UTP標識アンチセンスRNAプローブにハイブリダイズ させた:pPC12-1、pRB211(Coopermanら,下記,1987)、plB15(シクロフィリン :Danielsonら,DNA 7:261-267(1988))、ならびにI型ナトリウムチャンネル の51bpのイントロン、5'非翻訳配列および267bpのコード配列を含有するラット 脳I型。RNAプローブをT3(pPC12-1)、T7(pNach1)またはSP6(pRB211,p1B15 )RNAポリメラーゼのいずれかを用いて、製造者(PROMEGA CORP.,Madison,WI )の説明書に従って転写した。ブロットを2×SSC,0.1%NaDodSO4中で68℃で15 分間洗浄した後、0.2×SSC、0.1%NaDodSO4中で68℃で15分間2回洗浄した。プ レフラッシュしたXAR-5フィルム(EASTMAN KODAK CO.,Rochester,NY)でのオ ートラジオグラフィーをデンシトメーターによるmRNAの定量に用いた。 キット(RPA II,AMBION INC.,Austin,TX)を用いて、リボヌクレアーゼ保 護アッセイを行った。全RNAをpPC12-1から生成した104cpmのアンチセンスRNAプ ローブにハイブリダイズさせた。試料間の全RNA量の相違を制御するために、本 発明者らはpTRI-β-アクチン(AMBION,INC.)から転写したβ-アクチン用アン チセンスRNAプローブを含めた。 インサイチュハイブリダイゼーション。Yokouchiら,Develop.113:431-444( 1991)に記載の手順の改変を用い、組織の調製およびハイブリダイゼーションを 行った。SCGおよびDRGを成体Sprague-Dawleyラットから切り出し、そして4%パ ラホルムアルデヒド(0.1M PBS中)中で4℃で2〜6時間固定した。次に組織を0. 1M PBS(pH7.3)中で約5分間リンスし、30%スクロース(0.1M PBS中)中で4℃ で2時間凍結保護し、そしてO.C.T.(TISSUE-TEK)に包埋した。クライオスタッ ト切片(14μM)をSUPERFROST/Plusスライド(FISHER SCIENTIFIC)上に集め、 室温で約2時間乾燥し、次いで−80℃で保存した。 プレハイブリダイゼーションの直前に切片を室温にし、そして0.3%Triton X- 100を含む0.1M PBS(pH7.3)中で5分間再水和した。次に切片を0.2N HClで20分 間処理し、0.1M PBS中で5分間洗浄し、そしてプロテイナーゼK(0.1M PBS中5μ g/ml)で37℃で40分間消化した。次に切片を4%パラホルムアルデヒド(0.1M PB S中)で後固定(postfix)し、0.1Mグリシンを含む0.1M PBSで15分間リンスし、そ して50%ホルムアミド,2×SSC中で1時間平衡化した(室温)。 ジゴキシゲニン-UTPでのRNA標識についての製造者(BOEHRINGER MANNHEIM)の 説明書に従ってpPC12-1またはpNach2(Coopermanら,Proc.Nat'l Acad.Sci.U SA 84:8721(1987))から転写したアンチセンスジゴキシゲニン標識RNAプロー ブと切片をハイブリダイズさせた。ジゴキシゲニン-UTPをrUTPに置き換えること によって非標識プローブを合成した。20mM TRIS HCl(pH8.0)、2.5mM EDTA、50 %ホルムアミド、0.3M NaCl、1×Denhardt's、10%硫酸デキストラン、1mg/mltR NAおよび0.7μg/mlの濃度のプローブを含むハイブリダイゼーション溶液約100μ lで、各切片を覆った。次に切片をPARAFILMカバーグラスで覆い、そして加湿チ ャンバー中で終夜45℃でインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、切片 を50%ホルムアミド、2×SSC中で45℃で1時間洗浄し、その後0.5M NaCl、10mM T RIS HCl (pH8.0)および20μg/ml RNase A(BOEHRINGER MANNHEIM)中でRNase 消化した。次に切片を45℃で50%ホルムアミド、2×SSC中で1時間洗浄し、そし て50%ホルムアミド、1×SSC中で1時間洗浄した。 製造者の説明書に従ってキット(GENIUS 3 KIT,BOEHRINGER MANNHEIM)を使 用して、免疫学的検出を行った。ほとんどの実験において、切片を色溶液(color solution)中で約3〜5時間室温でインキュベートした。次に切片にAQUA-MOUNT( Lerner Laboratories)でカバーグラスをし、そして暗所に保存した。 デンシトメトリー。ナトリウムチャンネルmRNAのレベルを、Bio Imageソフト ウェア(Millipore Corp.,Ann Arbor,Michigan)を用いるオートラジオグラム のデンシメトリー分析によって測定した。RNAのレベルを、定量したシクロフィ リンmRNAレベルに対して正規化した。 結果 末梢神経内で優先的に発現されるcDNAの単離。PC12細胞のNGF処理が、既知の いずれのナトリウムチャンネル遺伝子に特異的なプローブに対してもハイブリダ イズしない約11kbのナトリウムチャンネル遺伝子転写物のレベルを増大させるこ とは、D'Arcangeloら,J.Cell Biol.122:915-921(1993)によって既に示され ている。成体ラットの交感神経節および知覚神経節由来のmRNAにも同じサイズの 転写物が検出されたが、脳由来のmRNAには検出されなかった。これらの結果は、 この転写物がナトリウムチャンネル遺伝子ファミリーの新たなメンバー(末梢神 経I型(PNI)と命名)をコードすることを示唆した。 PNI遺伝子の正体を確認するために、NGF処理PC12サブクローン(これは、PNIm RNAを優先的に発現する)(PKI-4細胞)(D'Arcangeloら)由来のcDNAを、ナト リウムチャンネルαサブユニット遺伝子の400塩基対(bp)領域を特定する一対 の縮重オリゴヌクレオチドプライマー(方法、図1を参照)を用いるポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。両プライマーは、電圧ゲートナトリウムチ ャンネル間で高度に保存されている反復ドメインIII内の推定の貫膜領域を特定 する。プライマー間の増幅領域は、厳密に保存された細孔内層(pore-lining)残 基、および異なる哺乳動物αサブユニット間で異なる(divergent)する残基を含 む。PCR産物の配列分析によって、新規の推定ナトリウムチャンネルαサブユニ ットの一部をコードするcDNA(pPC12-1)が明らかになった(図1)。全PNIコー ド領域を含むさらなるcDNAをさらに単離した。 pPC12-1がPNI遺伝子の一部をコードするかどうかを決定するために、cDNAを用 いて、コントロールのPC12細胞およびNGF処理PC12細胞由来のmRNAのノーザンブ ロット分析用のアンチセンスRNAプローブを生成した(図2B)。比較のために、 2連のブロット(図2A)をアンチセンスプローブpRB211とハイブリダイズさせた 。pRB211はナトリウムチャンネルαサブユニットの高度に保存された領域をコー ドし(Coopermanら,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 84:8721(1987))、PNI転写 物とクロスハイブリダイズし、そしてD'Arcangeloら,J.Cell Biol.122:915-9 21 (1993)により示されているように、検出される転写物のレベルが、NGF処理後 に迅速かつ一時的に増大するはずである(最大約5時間)。図2Aと2Bとの比較に より、pPC12-1がこれらの基準の両方を満たしたことが示される。また、D'Arcan geloら,J.Cell Biol.122:915-921(1993)と合致して、本発明者らはpPC12-1 によって検出される転写物のNGF誘導がcAMP依存性プロテインキナーゼ活性とは 独立しているということを見出した。 PNIをコードするさらなるcDNAを単離するために、ランダム−およびオリゴ(d T)−プライムλZAP II cDNAライブラリー(STRATAGENE、5.6×106個の独立クロ ーン)を、pPC12-1を単離したと同じPC12サブクローンから単離したポリ(A)+mR NAから調製した。pPC12-1から生成したプローブで4×104個の組換え体をスクリ ーニングしたところ、さらに2つの重複cDNAが単離され、これらは連結されて303 3bpのcDNAを与える(図7)。全PNIコード領域を含むさらなるcDNAをさらに単離 した。 PNIの推定一次構造の分析。図8に示すように、PNIの推定一次構造は、ナトリ ウムチャンネルαサブユニット遺伝子の反復ドメインIIをコードする。II型ナト リウムチャンネルとの比較により、PNI配列は電圧ゲートナトリウムチャンネル に特有の構造モチーフを、6つの推定貫膜ドメイン(IIIS1-IIIS6)を含めて、す べて含有することが示される。電圧センサーとして機能すると考えられているS4 ドメインは、3番目の位置ごとでの正に荷電した残基(リジンまたはアルギニン )の高度に保存されたパターンを示す。さらに、推定細孔内層セグメント(IIIS S1-IIISS2)は、ナトリウム選択的透過(Heinemannら,Nature 356:441-443(19 92))およびTTX親和性(Terlaueら,FEBS Lett.293:93-96(1991))に関与す ることが示されている残基を含有する。 このような高度に保存された構造上の特徴に加えて、ナトリウムチャンネルα サブユニットはいくつかの特徴的な翻訳後修飾を受ける。現在までに配列決定さ れているすべてのナトリウムチャンネルは、アスパラギン結合(N結合)グリコ シル化部位の特有のパターンを示し、それらはほとんど排他的にS5膜貫通ヘリッ クスとS6膜貫通ヘリックスとを連結する細胞外ループに見出される。PNIのN結 合グリコシル化部位はこのパターンと良く一致し、3つの潜在的細胞外グリコシ ル化部位が、IIIS5とIIIS6との間に位置する。これらの部位のうちの2つは、I 型、II型およびIII型ナトリウムチャンネルにも見出される。 αサブユニットはプロテインキナーゼC(PKC)によってリン酸化され、そして 推定PNI配列は高度に保存されたコンセンサスPKCリン酸化部位をセリン1506に含 む(図1)。この残基はドメインIIIとドメインIVとを連結する細胞質ループ(こ れはチャンネルの不活化に関連づけられている)内に位置し、そして突然変異分 析によってこのセリンがチャンネル不活化のPKC調節に必要であることが示され ている(Westら,1991)。 全DNA配列(図9A-D)および全アミノ酸配列(図10)を決定した。ラットPNIア ミノ酸配列を実施例2に示す新たなヒト配列(図11A-E)と比較した。 まとめると、PNIの推定一次構造は電圧ゲートナトリウムチャンネルのαサブ ユニットに特有の特徴構造と機能ドメインをすべて含有する。 PNI遺伝子は優先的にPNS中で発現される。PNI遺伝子が優先的にPNS内で発現さ れるかどうかを決定するために、成体ラットの脳、脊髄、SCG、DRG、骨格筋およ び心筋から全RNAを単離し、そしてノーザンブロット分析に供した。ブロットを 、pPC12-1から生成したPNI特異的アンチセンスプローブとハイブリダイズさせた 。図3Aに示すように、本発明者らは、約11kbの転写物に対する高レベルのハイブ リダイゼーションを、SCGおよびDRGの両方に見出した。脊髄および脳の両方にお ける転写物に対して、はるかに低いが検出し得るレベルのハイブリダイゼーショ ンが見出された。骨格筋、心筋および肝臓由来のmRNAには、検出し得るハイブリ ダイゼーションは観測されなかった。 リボヌクレアーゼ(RNase)保護分析も行った。ノーザンブロット分析で使用 した組織と同じ組織および副腎から全RNAを単離し、そしてPNI特異的アンチセン スプローブ(pPC12-1)にハイブリダイズさせた。SCG、DRG、脳、脊髄および副 腎由来のmRNAは、PNIプローブの343bpフラグメントを保護した(図4B)。保護さ れなかった塩基は、オリゴヌクレオチドプライマー配列およびプラスミド配列を 表す。PNIプローブは骨格筋および心筋由来のmRNAのいずれによっても保護され なかった。 様々な組織中のPNI mRNAの相対量を測定するために、3つの別個のRNase保護 実験由来のオートラジオグラフをデンシトメトリーによって分析した。試料間の 全RNA量の小さな相違を調節するために、本発明者らはβ-アクチン用のプローブ を含めた。SCGおよびDRGの両方中のPNI mRNAレベルは、脊髄、副腎および脳内よ りも約40倍高かった。 PNI遺伝子は交感ニューロンおよび知覚ニューロンにおいて発現される。PNI遺 伝子が末梢神経節のニューロン中で発現されるかどうかを決定するために、イン サイチュハイブリダイゼーションを用いて、成体ラットのSCGおよびDRGにおける PNI mRNAの細胞分布を調査した。クライオスタット切片を、PNI特異的ジゴキシ ゲニン標識RNAプローブ(pPC12-1)とハイブリダイズさせ、これをアルカリ性ホ スファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて可視化した。図4Aおよび Bに示すように、このPNIアンチセンスプローブは、SCGおよびDRGの両方における ほとんどのニューロン細胞体を標識した。このハイブリダイゼーシヨン信号がPN mRNAに特異的なプローブの結合に起因することを確認するために、本発明者ら は2つの異なるネガティブコントロールを行った。(1)切片を、100倍過剰の非 標識PNIアンチセンスプローブの存在下でジゴキシゲニン標識プローブとハイブ リダイズさせた。(2)以前の実験によって、SCGおよびDRGは極めて低レベルのI I型ナトリウムチャンネルmRNAを含有することが示された(Beckh,S.,FEBS Let t.262:317-322(1990))。そこで、本発明者らは、切片をII型特異的アンチセ ンスプローブともハイブリダイズさせた。図4C-Fに示すように、これらのコント ロール実験の両方は、ハイブリダイゼーション信号を大いに減少させた。また、 ノーザンブロット分析およびRNase保護分析の結果に合致して、本発明者らは成 体ラットの大脳皮質の切片に対する標識PNIプローブのハイブリダイゼーション が、検出し得る染色を生じなかったことを見出した。 PNIプローブはSCGおよびDRGの両方におけるほとんどのニューロン細胞体を染 色したが、本発明者らはPNI mRNAレベルの細胞-細胞間の変動は2つの神経節間 で異なることを見出した。SCGニューロンは、異なる細胞間で反応産物の強度が 比較的一定であるという点で、かなり均質であった。しかしDRGニューロンは、 染色強度が細胞間でかなり変動するという点で、極めて不均質であった。例えば 図4Bにおいて、矢印は直径がほぼ等しい、染色強度が著しく異なる2つのDRGニュ ーロンを示している。 最後に、本発明者らはPN2プローブは衛星細胞およびシュヴァン細胞などの非 ニューロン細胞を染色しないことを見出した。しかし、これらの細胞がこの方法 により検出され得ない極めて低レベルのPNI mRNAを含有する可能性はある。 SCGニューロンはI型ナトリウムチャンネル遺伝子をも発現する。以前のノーザ ンブロット分析により、SCG由来のmRNAが2つの異なるナトリウムチャンネル遺 伝子転写物を含むことが示された。本発明者らが明らかにしたように、より大き な11kbの転写物はPN1ナトリウムチャンネルをコードする。しかし、より小さい 転写物はまだ同定されていない。本発明者らは、他のPNS組織において中程度の レベルの1型mRNAが見出されているので(Beckh,S.,FEBS Lett.262:317-322( 1990))、このより小さい転写物はI型ナトリウムチャンネルをコードするとい う仮説を立てた。この仮説を試験するために、成体ラットから単離したSCG mRNA のノーザンブロットを、I型ナトリウムチャンネル遺伝子に特異的なアンチセン スプローブ(pNach1,上記方法を参照のこと)とハイブリダイズさせた。図5に 示すように、I型特異的プローブは、より小さい転写物に特異的にハイブリダイ ズした。さらに、本発明者らはSCG mRNAがRNase保護アッセイにおいてI型プロー ブを保護することを見出した。 推定PNIαサブユニット遺伝子およびIαサブユニット遺伝子は発生の間にディ ファレンシャルに調節される。I型、II型およびIII型ナトリウムチャンネル遺伝 子は中枢神経系および末梢神経系の両方における発生の間にディファレンシャル に制御されることが、いくつかの研究によって示された。PN1遺伝子およびI型遺 伝子も発生の間に独立して調節されるかどうかを決定するために、本発明者らは 異なる生後齢のラットから単離したSCGにおけるそれらの相対的mRNAレベルを測 定した。両方の転写物を同時に可視化するために、ノーザンブロットを保存され たナトリウムチャンネル遺伝子プローブpRB211とハイブリダイズさせた。図6Aに 示すように、生後7日(P7)に取り出したSCGにおいて、PN1 mRNAおよびI型mRNA のレベルはほぼ等しい。しかし、P14までに、それらの相対量は、PN1 mRNAのレ ベルがI型mRNAのレベルの約*倍を超えるように移行した。このI型mRNAレベルに 対するPNI mRNAレベルの比率の増大は、少なくともこの後の生後4週間は続く。 P42まで、PNIは主要なナトリウムチャンネル遺伝子転写物であり、そのPN1 mRNA レベルはI型mRNAのmRNAレベルより数倍高い。 mRNAレベルの発生変化を定量化するために、3つの別個の実験由来のオートラ ジオグラフをデンシトメトリーによって分析した。レーン間の全RNA量の相違を 制御するために、続いてブロットを内部コントロールのシクロフィリン用のプロ ーブとハイブリダイズさせた。最大mRNA百分率を生後齢に対してプロットした図 6Bに示すように、2つの転写物の相対量の移行は、I型ナトリウムチャンネルmRN Aレベルの発生上の減少に大いに起因する。P7からP42までに、I型mRNAのレベル は、ほぼ80%減少する。 実施例2: PN-1アンタゴニストについての薬物スクリーニング PNS SCPリガンド(例えば、アンタゴニストおよびアゴニスト)がPNS SCPの活 性を阻害または増強する能力は、少なくとも1つのPNC SCPを発現する細胞を用い て評価される。そのような細胞中のPNS SCP活性についてのアッセイを用いて、 アンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得る少なくとも1つの薬剤の存在 下でPNS SCPタンパク質の機能性を測定し、従ってPNS SCPの活性を妨害または増 強する薬剤を同定する。2以上の細胞株(それぞれが異なるPNS SCPを発現する )を用い、そして任意にCNS特異的ナトリウムチャンネルを発現する1以上の細胞 株をコントロールとして用いる。 これらの薬剤は(1)無作為に、(2)合理的な選択によって、および/または (3)例えばコンピューターモデリング技術を用いる設計によって、選択され、 そしてスクリーニングされる。 当業者が、PNS SCPの調節薬剤を単離するために、過度の実験を必要とするこ となく使用し得るアッセイの多数の改変が存在する。薬剤決定法には、既知の方 法による、コンピューター支援分子設計(CAMD)、PNS SCP−薬剤結合、洗練さ れた化学合成および試験、標的化スクリーニング、ペプチド結合ライブラリー技 術、アンチセンス技術および/または生物学的アッセイが含まれる。例えば、Rap akaら編,「薬物開発:薬物の発見、データベースおよびコンピューター支援薬 物 設計」,NIDA Research Monograph 134,NIH Publication第93-3638号,U.S.Dept. of Health and Human Services,Rockville,MD(1993);Langone,Methods in E nzymology,第203巻,「分子設計およびモデリング:概念および応用,パートB, 抗体および抗原、核酸、多糖および薬物」,第III項,587-702頁,Academic Pre ss,New York(1991)を参照のこと。 あるいは、本発明のPNS SCP核酸を使用することによってPNS SCPを発現し、そ して提示するように選択または遺伝子操作されている細胞発現ライブラリーまた は他の細胞を用いることが、このような方法では好ましい。ここで、関連する受 容体を欠く宿主細胞株が選択され得る。Rapaka,下記(1993)58-65頁。 本発明に関する限りPNS SCP薬剤とは、インビトロ、インサイチュまたはイン ビボでPNS SCPに結合する任意の化学的または生物学的分子をいうが、それは合 成、組換えまたは天然由来の化合物および組成物、例えば、有機化合物、核酸、 ペプチド、炭化水素、ビタミン誘導体、ホルモン、神経伝達物質、ウイルスまた はそのレセプター結合ドメイン、オプシン、ロドプシン、ヌクレオシド、ヌクレ オチド、凝固カスケード因子、臭気物質またはフェロモン(pheremone)、毒素、 成長因子、血小板活性化因子、神経活性ペプチド、神経液あるいは薬物または天 然化合物などの生物学的に活性な化合物などであり得るが、これらに限定される わけではない。 薬剤は無作為に選択され、そしてスクリーニングされるか、あるいはコンピュ ーターモデリング技術を用いて合理的に選択または設計される。無作為スクリー ニングのためには、潜在的薬剤を選択し、そしてそれらのPNS SCPまたはそのフ ラグメントに結合する能力についてアッセイする。あるいは、薬剤を合理的に選 択または設計し得る。本明細書において用いられる場合、少なくとも1つの特定 のPNS SCP(例えば、図11に示されるような)の立体配置に基づいて薬剤が選択 されるときに、その薬剤は「合理的に選択または設計された」という。例えば当 業者は、特定のペプチド配列に結合し得る薬剤を生成するための現在利用可能な 手順を、合理的に設計された化合物(例えば、化合物、核酸またはペプチドなど )を生成するために、容易に適合させ得る。例えばRapaka,下記(1993);Hurby ら,「合成ペプチドの応用:アンチセンスペプチド」,Synthetic Peptides:A User's Guide,W.H.Freeman,New York(1992),289-307頁;およびKaspczak ら,Biochemistry 28:9230-2938(1989)を参照のこと。 少なくとも1つのPNS SCPの活性を調節する薬剤についてスクリーニングする 方法は以下の工程を包含する: (a)少なくとも1つのPNS SCPを発現する少なくとも1つの細胞株を試験しよう とする薬剤と共にインキュベートする工程、および (b)PNS SCP結合またはPNS SCP活性に対する薬剤の影響を測定することによっ て、少なくとも1つの細胞を、少なくとも1つのPNS SCPタンパク質の活性につ いてアッセイする工程。そのアッセイは好ましくは、別のPNS SCPに対する薬剤 の影響を識別し、そしてその薬剤が、CNSナトリウムチャンネルに対する効果を ほとんど有さないか、または全く有さないか、あるいはCNSナトリウムチャンネ ルに対して相対的にわずかな効果しか有さないことを決定する。 上記のアッセイにおいて、その細胞が機能的な形態のPNS SCPタンパク質を発 現し、かつそのPNS SCP活性が測定可能である限り、どのような細胞でも使用で きる。好ましい発現細胞は真核細胞または真核生物である。そのような細胞は、 当該技術で公知の日常的な手順を用いて、PNS SCPタンパク質をコードするDNA配 列を含むように改変され得る。あるいは、当業者は、PNS SCPタンパク質をコー ドするmRNAを細胞中に直接導入することもできる。 別の実施態様において、機能的なPNS SCPイオンチャンネルを発現するように 、ニューロン細胞またはグリア細胞のいずれかについての幹細胞集団を、遺伝子 操作することができる。PNS SCPイオンチャンネルを発現するそのような細胞を 、哺乳動物の神経系の疾患領域または損傷領域に移植することができる(Neural Transplantation.A Practical Approach,DonnetおよびDjorklund編,Oxford University Press、New York,NY(1992))。別の実施態様において、胚組織ま たは胎児ニューロンを機能的なPNS SCPイオンチャンネルを発現するように遺伝 子操作し、そしてそれを哺乳動物の大脳辺縁系の疾患領域または損傷領域に移植 することができる。パーキンソン病患者に胎児ドーパミンニューロンを移植する ことの実施可能性は立証されている(Lindvallら,Archives of Neurology 46:6 15-631(1989))。 機能的チャンネルタンパク質を生成するために、現在少なくとも2種類のアプ ローチを用いて、電圧依存性ナトリウムチャンネルクローンを発現させている。 1つのアプローチにおいては、クローン化cDNAをコードするmRNAを、Xenopus卵 母細胞内で発現させる。ナトリウムチャンネルcDNAをpGEM組換えプラスミド(Me ltonら,1984)などの細菌発現ベクター中にクローン化する。SP6ポリメラーゼ またはT7ポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼをM7G(5')ppp(5')Gなどのキャ ッピングアナログとともに用いて、クローン化cDNAの転写を行う。得られたRNA (例えば、約50nl,2〜5ngに相当する)を、Xenopusから単離したV期およびVI期 の卵母細胞に注入し、そして19℃で3〜5日間インキュベートする。二微小電極 電圧クランプを用いて、卵母細胞をナトリウムチャンネル発現について試験する (Trimmerら,Neuron 3:33-49,1989)。 別のアプローチにおいて、電圧依存性ナトリウムチャンネルをコードするcDNA を、多数の哺乳動物発現ベクターのいずれかにクローン化し、そして内因性の電 圧依存性ナトリウムチャンネルを発現しない哺乳動物細胞(例えば、繊維芽細胞 株など)にトランスフェクトする。トランスフェクトされたクローンを、クロー ン化され、トランスフェクトされたcDNAの発現で選択する。パッチ電極を用いる 全細胞電圧クランプ技術を用いて、ナトリウムチャンネル発現を測定する(D'Ar cangeloら,J.Cell Biol.122:915-921(1993))。 薬物スクリーニングに有用な細胞株およびPNS SCPの供給源。PNS SCPを(天然 に、誘導によって、または組換え発現によって)発現する任意の細胞株を、薬物 スクリーニングに使用することができる。非限定的な例として、PC12細胞はPNI ナトリウムチャンネルおよびII型ナトリウムチャンネルの両方を発現する。A126 -IB2細胞は、プロテインキナーゼA(PKA)活性が欠損した変異体であり、そして PNIを発現するが、II型ナトリウムチャンネルを発現しないことがここに明らか になった。PKI-4は、PKAのペプチドインヒビターをコードするcDNAでトランスフ ェクトされたPC12細胞株である。これらの細胞株はいずれも、本発明のPNS SCP の一供給源として、または薬物スクリーニングに使用される細胞株そのものとし て使用することができる。PC12細胞のNGFでの処理は、PNS SCP(PNI)ナトリウ ムチャンネルおよびII型ナトリウムチャンネルの両方を減少させるが、A126-182 細胞においてはNGFがPN1のみを誘導する。PKI-4細胞は、NGF処理なしでPNS SCP (PNI)を発現する(D'Arcangeloら,J.Cell Biol.122:915-921(1993))。 さらに、またはあるいは、異種発現系も使用できる。ここで、細胞株(チャイ ニーズハムスター卵巣細胞(CHO)など)をPN-IをコードするcDNAで安定にトラ ンスフェクトする。異種細胞株を形成させるためにcDNAをトランスフェクトし、 そしてそれを安定に発現させる方法工程は、当該技術分野で周知である。トラン スフェクト細胞を使用する利点は、非常に高レベルのPNS SCP(PN-Iなど)を発 現するクローンが得られることにある。 アンタゴニストまたはアゴニストとしてのPNS SCP調節物質をスクリーニング するためには、薬剤をその薬物の以下の能力について調べる: (a)PNS SCPに対する放射性リガンドの結合を阻害または増強する能力(標識リ ガンド結合反応)、および/または (b)PNS SCPを発現する細胞株においてPNS SCPのチャンネルを通過するイオン 流を阻害または増強する能力。 標識リガンド結合性神経毒を用いて、PNSナトリウムチャンネルを特徴づける ことができる。例えば、以前の研究によって、少なくとも6つの異なる神経毒結 合部位が、以前に特徴づけられた非PNSナトリウムチャンネル上に同定されてい る(Lombertら,FEB 219(2):355-359(1987)に概説されている)。これらの 部位の多くは、互いにアロステリック的に結合していると考えられている(総説 として、Strichartzら,Ann.Rev.Neurosci.10:237-267(1987)およびそこで 引用されている文献を参照のこと)。言い換えれば、特定の神経毒部位への薬物 または毒素の結合は、その部位における薬物結合のみならず、そのチャンネル上 の他の部位での薬物結合に対しても感受性であり得る。このことは、所定の標識 リガンドについて、PNS SCPに優先的に結合する薬剤を同定する可能性が増大す るという点で、薬物スクリーニングプログラムにとって有利である。 懸濁状態のインタクトな細胞(例えば、PC12 PKIまたはPNS SCP発現異種細胞 株)中での本発明のPNS SCPへの標識リガンドの結合を測定するための本明細書 中に記載の技術は、脳シナプトソーム調製物中の他のナトリウムチャンネルに対 する放射性リガンドの結合に関して以前に記述されている技術と類似している (例えば、Cattcrallら,J.Biol.Chem.256(17):8922-8927(1981)を参照の こと)。しかし、これらの技術が、本明細書に示される教示および指導に基づい て、基質付着細胞または破壊細胞調製物を使用するために日常的に改変されるこ とは、当業者が十分に認識するところである。 A126-1B2、PC12、PKI-4あるいはPNS SCPを発現する他の細胞は、標準的な技術 を用いて増殖させられるが、そしてPN-1発現を誘導するために、任意にNGFで1 日〜2日間処理される。細胞を収集し、そして別の潜在的薬剤を用いてイオン流 活性について試験する。 両方の放射性リガンドについて、結合反応を、例えば37℃で行い、次いで停止 する。試料をすばやく減圧ろ過し、氷冷緩衝液で洗浄し、そして結合した放射活 性をシンチレーション計数によって測定する。 イオン流は、PNS SCPを通過するイオントレーサーの流入を阻害または増強す る潜在的PNS SCP剤の能力によって、PNS SCP機能の活性を阻害または増強するそ れらの能力を直接的に試験する。 以前のナトリウムチャンネル研究のほとんどが、22Naをトレーサーとして使用 している(例えば、Catterallら,J.Biol.Chem.256(17):8922-8927(1981 )を参照のこと)。しかし、22Naの高い毒性は、高処理量薬物スクリーニングで の使用にとっては不利であり得る。毒性のより低い代替物は、(14C)グアニジ ニウムイオンであり、その流入はナトリウムチャンネル開口の信頼できる指標で あることが示されている(Reith,Europ.J.Pharmacol.188:33-41(1990)) 。従って、少なくとも1つのPNS SCPを発現するインタクトな細胞を用い、日常 的な方法を用いて、PNS SCPイオンチャンネル活性(例えば(14C)グアニジニウ ムイオン流)を調節するための化合物をスクリーニングすることができる。さら に、これらの方法は、22Naを使用するように容易に改良できることが周知である 。同様に、これらの既知の方法工程は、基質付着細胞または破壊細胞から調製し た小胞を使用するように、公知の方法工程により、改良することができる。 グアニジニウム流アッセイのためには、22Naのための方法をReith(Europ.J. Pharmacol.188:33-41(1990)、脳シナプトソームについて)の方法から、例え ば以下の実施例2に記述するように改変する。少なくとも1つのPNSS CPを発現 する異種細胞を含む細胞懸濁液のアリコートを、100μM(0.20mg〜0.25mgタンパ ク質)の総容積中、チャンネル開口物質(opener)(代表的には100μMベラトリジ ン)および試験薬物の存在下で、37℃で10分間インキュベートする。4mM塩酸グ アニジン(最終)および1000dpm/nmol(14C)グアニジンも含有するHEPES/TRIS 溶液の添加によって、イオン流を開始させる。反応を30秒間続け、そして氷冷イ ンキュベーション緩衝液を添加して反応を停止し、その後Whatman GF/Cフィルタ ーを通してすばやくろ過する。フィルターを氷冷インキュベーション緩衝液です ばやく洗浄し、そしてシンチレーション計数によって放射活性を測定する。プレ インキュベーションおよび取り込みの両方の間に1mMテトロドトキシンを含める ことによって、非特異的な取り込みを並行して測定する。 グアニジニウム流アッセイを用いて、いくつかのメチル/ハロフェニル置換化 合物(リドフラジンなど(例えば、Merck Index Monograph 5311および米国特許 第3,267,104号、これらの両方はその全体が参考として本明細書に援用される) を参照のこと)を試験し、そしてこれらが少なくとも1つのPNS SCPを発現する 細株中で少なくとも1つの本発明PNS SCPのナトリウムチャンネル活性を阻害す ることが見出された。ここで、PKI-4細胞に対するリドフラジンについてのpIC50 は6.51であった。したがって、本発明はメチル/ハロフェニル置換ピペリジンの ようなPNS SCP調節薬剤を提供する。 実施例3: ヒト末梢神経系cDNAライブラリーからのヒトPNS SCP配列の同定 実施例1に提供される手順と同様に、ヒト末梢神経系cDNAライブラリー(ヒト DRGライブラリーとして)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のために用いた。 このPCRには、配列番号2のアミノ酸604〜611をコードするDNAに対応する5'プラ イマー、および配列番号2のアミノ酸723〜731をコードする対応する3'プライマ ーを使用した。 PCR反応混合物は、0.1M KCl、0.1M TRIS HCl(pH8.3)およびゼラチン(1mg/m l)からなる緩衝液中で5%のcDNA、1mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.5mM各プライマー 、Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer)からなった。反応はPerkin-Elmerサーモサ イ クラー中で以下のように行った:変性(94℃、1分)、アニーリング(37℃、1 分)および伸長(72℃、1分)を5サイクルの後、変性(94℃、1分)、アニー リング(50℃、1分)および伸長(72℃、1分)を25サイクル。 得られたPCR産物は、図11A〜Eに示すように、配列番号2のアミノ酸646〜658 をコードするヒト増幅cDNAを与えた。 実施例4: ヒト後根神経節cDNAライブラリーからのヒトPN-I配列の クローニングおよび配列決定 上記実施例1および3のように、1以上の本発明のヒトPNS SCPの全コード領 域を含むクローンをヒトDRG cDNAライブラリーから単離するために、配列番号1 に対応するさらなるPCRプライマーを使用する。5'プライマーは、配列5'TTTGTGC CCCACAGACCCCAG3'(配列番号13)を含み、そして3'プライマーは、配列5'ACACAA ATTCTTGATCTGGAATTGCT3'(配列番号14)または5'CAACCTCAGACAGAGAGCAATGA3'( 配列番号15)(これはネステッドPCRのために使用する)を含む。上記実施例1 および3に従って、PCRを行って、ヒトPNS SCPをコードするcDNAを得る。 上記PCR産物に対応する配列の5'側または3'側の「ウォーキング」によって、 さらなるPCRを行う。この方法において、1以上のヒトPNS SCPの全コード領域を 含むcDNAが提供される。 得られたさらなるcDNAクローンまたはPCR産物(全ヒトPNS SCPをコードする) を、適切な制限部位で予め制限しておいたプラスミドベクター中にサブクローニ ングする。これらのクローンをミニプレップ(Sambrookら、下記)によりcDNA挿 入物についてスクリーニングし、そしてジデオキシ鎖終結法(Sequenase 2.0キ ッド,United States Biochemical)によって両方向に配列決定する。配列デー タをGene Worksソフトウェア(IntelliGenetics,Inc.,Mountain View,CA)を 用いて編集および分析する。ヒトPN1配列について予想される別のアミノ酸配列 を、図11A〜Dに、そして配列番号7、11および12として示す(ここで、Xaaは0、 1、2または3アミノ酸を表す)。 次に、得られたヒトPNS SCPのサイズの転写物が、ヒトPNS mRNAまたはcDNA (図11A〜Eの1970〜1990アミノ酸配列をコードする)中に存在することを確認す る。しかし、実施例1におけるように、そのような転写物は脳由来のmRNA中に検 出されるとは予想されない。この予想される結果は、ナトリウムチャンネル遺伝 子ファミリーの新たなメンバー(ヒト末梢神経I型(図11A〜EのHUMPNIA(ATCC番 号 として寄託)およびHUMPNIB(ATCC番号 として寄託);ここでXは0、 1、2または3個の同じアミノ酸または異なるアミノ酸を表す)と命名)を確認 する。 次に新規のヒトPNIの完全なDNA配列およびアミノ酸配列を確認する。これらは 哺乳動物電圧ゲートナトリウムチャンネルのαサブユニットに特有な構造および 機能ドメインのすべてを含むと予想される。 本明細書で引用した文献は、雑誌の記事または抄訳、刊行されたあるいは対応 する米国または外国特許出願、発行された米国または外国特許、あるいは他のす べての文献を含めてすべて、引用した文献に示されるすべてのデータ、表、図お よび本文を含めて、参考として本明細書中に援用される。特定の実施態様に関す る上述の記載は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするので、当該分野の技 術内の知識(本明細書中に引用した文献の内容を含む)を適用することによって 、過度の実験を行うことなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、その ような特定の実施態様の様々な応用のために、容易に改変および/または適応し 得る。したがって、そのような適応および改変は、本明細書中に示される教示お よび指導に基づいて、開示した実施態様の等価物の意味および範囲内にあると意 図される。本明細書における言い回しまたは用語は説明のためになされたもので あって、限定的なものではないと理解すべきであり、したがって当業者は、当業 者の知識と共に本明細書中に示される教示および指導に照らして、本明細書の用 語または言い回しを解釈すべきである。
【手続補正書】 【提出日】1998年6月29日(1998.6.29) 【補正内容】 6.1 明細書を以下の通り補正する。 (1)明細書6頁29行〜7頁1行に「図8A〜8Dは、PN1(配列番号2の1〜988) および脳II/IIA型αサブユニット(配列番号)の推定一次アミノ酸配列の比較を 示す。」とあるのを、「図8A〜8Dは、PN1(配列番号2の1〜988)および脳II/I IA型αサブユニット(配列番号7)の推定一次アミノ酸配列の比較を示す。コン センサス配列もまた示す(配列番号8)。」に補正する。 (2)明細書7頁5行に「(配列番号12)」とあるのを、「(配列番号16)」に 補正する。 (3)明細書7頁6行に「(配列番号7)」とあるのを、「(配列番号15)」に 補正する。 (4)明細書7頁6行に「(配列番号)」とあるのを、「(配列番号12)」に補 正する。 (5)明細書44頁10行に「10-3」とあるのを、「10-8」に補正する。 (6)明細書56頁7行に「FWLIFSIM」とあるのを、「FWLIFSIM(配列番号4)」 に補正する。 (7)明細書56頁10行に「GVIIDNFN」とあるのを、「GVIIDNFN(配列番号6)」 に補正する。 (8)明細書71頁13行に「(配列番号13)」とあるのを、「(配列番号17)」に 補正する。 (9)明細書71頁14行に「(配列番号14)」とあるのを、「(配列番号18)」に 補正する。 (10)明細書71頁15行に「(配列番号15)」とあるのを、「(配列番号19)」に 補正する。 (11)明細書の配列表(配列番号1〜14)を、添付の配列表(配列番号1〜19 )に補正する。 【補正内容】 【提出日】1998年9月7日(1998.9.7) 【手続補正書】 6.1 明細書を以下の通り補正する。 (1)明細書第5頁19行に「図1」とあるのを、「図1A-1B」に補正する。 (2)明細書第7頁2行に「図9A〜9D」とあるのを、 「図9A〜9C」に補正する。 (3)明細書第7頁4行に「図11A〜11E」とあるのを「図11A〜11F」に補正する。 (4)明細書第7頁11行に「図13A〜13B」とあるのを、 「図13A〜13D」に補正す る。 (5)明細書第7頁13行に「図14A〜14B」とあるのを、「図14A〜14D」に補正する 。 (6)明細書第9頁27行に「図11A〜11E」とあるのを、「図11A〜11F」に補正する 。 (7)明細書第10頁22行に「図11A〜11D」とあるのを、「図11A〜11F」に補正する 。 (8)明細書第37頁2行に「図11A-D」とあるのを、 「図11A〜11F」に補正する。 (9)明細書第53頁26行に「図11A〜11E」とあるのを、「図11A〜11F」に補正する 。 (10)明細書第61頁9行に「図9A-D」とあるのを、 「図9A〜9C」に補正する。 (11)明細書第61頁10行に「図11A-E」とあるのを、 「図11A〜11F」に補正する 。 (12)明細書第71頁4行に「図11A〜E」とあるのを、 「図11A〜11F」に補正する 。 (13)明細書第71頁27行に「図11A〜D」とあるのを、 「図11A〜11F」に補正する 。 (14)明細書第72頁1行および4行に「図11A〜E」とあるのを、「図11A〜11F」に 補正する。 6.2 図面を別紙の通り補正する。 【図1】【図1】【図2】【図3】【図4】【図5】【図6】 【図6】 【図7】【図7】【図7】【図7】【図8】【図8】【図8】【図8】【図9】【図9】【図9】【図10】【図11】【図11】【図11】【図11】【図11】【図11】【図12】【図13】【図13】【図13】【図13】【図14】【図14】【図14】【図14】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 45/00 A61K 45/00 48/00 48/00 C07K 14/47 C07K 14/47 14/705 14/705 16/28 16/28 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 7/00 7/00 C12Q 1/68 A C12Q 1/68 G01N 33/15 Z G01N 33/15 33/53 D 33/53 C12N 5/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U G),AL,AM,AT,AU,BB,BG,BR,B Y,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE,ES ,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LK,LR,LS,LT,LU,L V,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI, SK,TJ,TM,TT,UA,UG,US,UZ,V N (71)出願人 ザ リサーチ ファウンデーション オブ ステート ユニバーシティ オブ ニュ ーヨーク アメリカ合衆国 ニューヨーク 11794− 3366,ストーニー ブルック,メルビル メモリアル ライブラリー ダブリュー 5510,サニー オブ ストーニー ブルッ ク (72)発明者 マンデル,ゲイル アメリカ合衆国 ニューヨーク 11794, ストーニー ブルック,エメット ウェイ 7 (72)発明者 ホールゴウア,サイモン アメリカ合衆国 ニューヨーク 11777, ベル テレ,クレセント ロード 1 (72)発明者 ボーデン,ローレンス エイ. アメリカ合衆国 ニュージャージー 07601,ハッケンサック,オーバールック アベニュー 160,アパートメント 7 エフ (54)【発明の名称】 末梢神経系特異的ナトリウムチャンネル、それをコードするDNA、結晶化、X線回折、コンピ ューター分子モデリング、合理的薬物設計、薬物スクリーニング、ならびにその製造法および使 用法

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.少なくとも1つの末梢神経系特異的(PNS)ナトリウムチャンネルペプチド( SCP)に相当するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、または該ペプチドに 相補的な単離された核酸分子、ここで該SCPはナトリウムチャンネル(SC)生物学 的活性を有する。 2.前記分子が、緊縮条件下で、配列番号1の少なくとも30の連続ヌクレオチ ドの少なくとも1つの部分またはその相補配列にハイブリダイズする、請求項1 に記載の単離された核酸分子、ここで該部分は前記PNS SCPの少なくとも1つの ドメインをコードする。 3.前記ドメインが、配列番号2のアミノ酸1〜17、229〜258、268〜272、30 4〜325、330〜393、474〜478、501〜505、550〜559、589〜593、611〜615、619 〜646、676〜682、689〜694および779〜805の少なくとも1つからなる群から選 択される、請求項2に記載の単離された核酸分子。 4.5'から3'で以下を含む組換え核酸分子: (A)宿主細胞で転写を開始するために有効なプロモーター;および (B)請求項1に記載の単離された核酸分子。 5.請求項4に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主。 6.配列番号2に相当するアミノ酸配列と少なくとも91%の相同性を有する少 なくとも20のアミノ酸のアミノ酸配列を含む末梢神経系特異的(PNS)ナトリウム チャンネルペプチド(SCP)を含む、単離されたナトリウムチャンネルペプチド。 7.前記SCPがナトリウムチャンネル(SC)生物学的活性を有する、請求項6に 記載の単離されたペプチド。 8.前記単離されたペプチドが、PNS SCの少なくとも1つのドメインに相当す る、請求項6に記載の単離されたペプチド。 9.前記ドメインが、配列番号2のアミノ酸1〜17、229〜258、268〜272、30 4〜325、330〜393、474〜478、501〜505、550〜559、589〜593、611〜615、619 〜646、676〜682、689〜694および779〜805の少なくとも1つからなる群から選 択される、請求項8に記載の単離されたペプチド。 10.試料中のPNSS CPコードDNAの存在を検出するための単離された核酸プロ ーブであって、該PNS SCPコードDNAに対して、該試料中の請求項1に記載の単離 された核酸の存在を高度に緊縮なハイブリダイゼーション条件下で特異的に検出 するに十分相補的である核酸分子を含む、プローブ。 11.前記プローブが、検出可能な標識プローブとして検出可能に標識される 、請求項10に記載の単離されたプローブ。 12.試料中のPNS SCPコード核酸を検出する方法であって、以下の工程を包 含する方法: (A)該試料を、ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、請求項11 に記載の検出可能に標識されたプローブと接触させる工程、および (B)PNS SCP核酸に結合した該標識されたプローブの存在を検出する工程。 13.請求項6に記載のペプチドに特異的なエピトープに結合する抗体。 14.前記抗体が、検出可能に標識されたまたは検出可能な標識に結合した検 出可能な抗体である、請求項13に記載の抗体。 15.請求項13に記載の抗体を産生する、宿主細胞。 16.以下の工程を包含する生物学的試料中のPNS SCPペプチドを検出する方 法: (A)該試料を、請求項14に記載の検出可能な抗体と、免疫複合体が形成され るような条件下で接触させる工程;および (B)標識され、かつ該ペプチドに結合している該検出可能な抗体の存在を検出 する工程。 17.以下の工程を包含するPNS SCPの調節候補剤を評価するためのバイオア ッセイ: (A)候補剤を、細胞の細胞膜中でPNS SCPを発現する細胞株と接触させる工程; および (B)該候補剤の該接触工程により仲介される、該細胞のSC生物学的活性の調節 を評価する工程。 18.前記細胞株が、請求項1に記載の単離された核酸分予を有するPC12細胞 またはその組換え形態から選択される、請求項17に記載の方法。 19.請求項17に記載の方法により同定される、PNS SCP調節剤。 20.前記剤が、メチルフェニル/ハロフェニル置換ピペリジン化合物である 、請求項19に記載のPNS SCP調節剤。 21.前記ピペリジン化合物が、リドフラジン(Merck Index Monograph 5311) またはその誘導体である、請求項20に記載のPNS SCP調節剤。 22.哺乳動物におけるナトリウムチャンネル関連病状または傷害の処置方法 であって、遺伝子送達ベクター中に提供される、請求項1に記載の核酸分子また はこれに相補的なアンチセンス核酸を含む、治療に有効な量の治療核酸を該哺乳 動物に投与する工程を包含する、方法。 23.前記処置が痛みのためであり、そして前記治療核酸が前記アンチセンス 核酸である、請求項22に記載の方法。 24.請求項1に記載の単離された核酸またはこれに相補的なアンチセンス核 酸、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 25.請求項1に記載の単離された核酸またはこれに相補的なアンチセンス核 酸を有する発現ベクターを含む、組換えビリオン。 26.PNS SCPの異常に低いレベルの発現または機能により仲介される疾患ま たは状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、請求項 1に記載の単離された核酸の有効量を投与する工程を包含する、方法。 27.請求項6に記載のナトリウムチャンネルペプチドに結合し、かつ該ペプ チドのSC活性を調節し得る化合物。 28.請求項27に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、 薬学的組成物。 29.PNS SCPの存在により仲介される疾患または状態を処置する方法であっ て、そのような処置を必要とする患者に、請求項19に記載のPNS SCP調節剤ま たはその薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 30.以下の工程を包含するPNS SCPの分子モデルを提供する方法: (a)少なくとも1つのPNS SCPのアミノ酸またはヌクレオチド配列、または少な くとも1つのそのドメインを含む、PNS SCPのコード配列、相同アミノ酸または 核酸配列、構造的ドメインまたは機能的ドメインに相当するデータを有するコン ピューター読み出し可能な媒体を提供する工程; (b)結晶形態にある該PNS SCPの記録されたX線回折データを有するコンピュー ター読み出し可能な媒体を必要に応じて提供する工程であって、該データが該PN S SCPの三次元構造をモデルするに十分である、工程; (c)コンピューター上で(a)からアミノ酸またはヌクレオチド配列データを、そ して必要に応じて(b)からX線回折データを分析し、少なくとも1つのPNS SCP、 または少なくとも1つのそのドメインの分子モデルを規定するデータ出力を提供 する工程であって、該分析が、データ処理および編集整理、自動インデックス、 強度スケーリング、強度マージ、振幅変換、トランケーション、分子置換、分子 アラインメント、分子精密化、電子密度マップ計算、電子密度修正、電子マップ 可視化、モデル構築、剛直体精密化および位置精密化からなる群から選択される 計算サブルーチンを利用する、工程;および (d)該PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメインの三次元構造を規定する 原子モデル出力データを得る工程。 31.請求項30に記載の方法により生成されるモデル出力データとして、PN S SCPの記録された分子モデルデータを有するコンピューター読み出し可能な媒 体。 32.以下の要素を備える、PNS SCPの分子モデルを提供するためのコンピュ ーターを基礎にしたシステム: (a)少なくとも1つのPNS SCPのアミノ酸またはヌクレオチド配列、または少な くとも1つのそのドメインに相当する記録されたデータを有するコンピューター 読み出し可能な媒体; (b)必要に応じて、該少なくとも1つのPNS SCPまたは少なくとも1つのそのド メインの記録されたX線回折データを有するコンピューター読み出し可能な媒体 ; (c)コンピューター上で(a)からアミノ酸配列データを、そして必要に応じて(b )からX線回折データを分析し、PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメイ ンの分子モデルを規定するデータ出力を提供する少なくとも1つの計算サブルー チンであって、該分析が、データ処理および編集整理、自動インデックス、強度 スケーリング、強度マージ、振幅変換、トランケーション、分子置換、分子アラ インメント、分子精密化、電子密度マップ計算、電子密度修正、電子マップ可視 化、モデル構築、剛直体精密化および位置精密化からなる群から選択される計算 サブルーチンを利用する、サブルーチン;および (d)該PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメインの三次元構造を規定する モデル出力データを得るための修正手段。 33.請求項32に記載の方法により生成される少なくとも1つのPNS SCPの 分子モデルデータを含む、コンピューター読み出し可能な媒体。 34.以下の工程を包含する、PNS SCPのリガンドのコンピューター分子モデ ルを提供する方法: (a)PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメインの分子モデルデータを含む 、請求項33に記載のコンピューター読み出し可能な媒体を提供する工程; (b)該PNS SCPの潜在的リガンドの分子モデルを生成するに十分な記録された分 子モデルデータを有するコンピューター読み出し可能な媒体を提供する工程; (c)コンピューター上で(a)から分子モデルデータを、そして(b)からリガンド データを分析し、該PNS SCPの結合部位を決定し、かつ該PNS SCPのリガンドの分 子モデルを規定するデータ出力を提供し、該分析が、データ処理および編集整理 、自動インデックス、強度スケーリング、強度マージ、振幅変換、トランケーシ ョン、分子置換、分子アラインメント、分子精密化、電子密度マップ計算、電子 密度修正、電子マップ可視化、モデル構築、剛直体精密化および位置精密化から なる群から選択される計算サブルーチンを利用する、工程;および (d)PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメインの少なくとも1つのリガン ドの分子モデルを規定するモデル出力データを得る工程。 35.請求項34に記載の方法により生成される記録されたモデル出力データ を有する、コンピューター読み出し可能な媒体を含む、PNS SCPリガンド分子モ デル。 36.請求項34に記載の方法により生成されるリガンドモデルの分子モデル の物質的分子に相当する、単離されたPNS SCPリガンド。 37.以下の要素を備える、PNS SCPのリガンドの分子モデルを提供するため のコンピューターを基礎にしたシステム: (a)PNS SCP、または少なくとも1つのそのドメインの記録された分子モデルデ ータを有するコンピューター読み出し可能な媒体; (b)該PNS SCPの潜在的リガンドの分子モデルを生成するに十分な記録された分 子モデルデータを有するコンピューター読み出し可能な媒体; (c)コンピューター上で(a)から該PNS SCPの分子モデルデータを、そして(b)か らリガンドデータを分析し、PNS SCPの結合部位を決定し、かつPNS SCPの潜在的 リガンドの分子モデルを規定するデータ出力を提供するための少なくとも1つの 計算サブルーチンであって、該分析が、データ処理および編集整理、自動インデ ックス、トランケーション、分子置換、分子アラインメント、分子精密化、分子 変換、R因子決定、電子密度修正、電子密度マッピング、マップ密度平均化、マ ップ可視化、モデル構築、剛直体精密化、位置精密化、結晶学的水添加、幾何学 的分析およびB因子平均化からなる群から選択される少なくとも1つの計算サブ ルーチンを利用する、サブルーチン;および (d)該PNS SCPの潜在的リガンドの分子モデルを規定するモデル出力データを得 るための修正手段。 38.該PNS SCPの潜在的リガンドの分子モデル出力データを含むコンピュー ター読み出し可能な媒体であって、該データが請求項37に記載の方法により生 成される、媒体。 39.請求項37に記載のコンピューターシステムにより生成されるリガンド の分子モデルの物質的分子に相当する、単離されたPNS SCPリガンド。
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