DE10054878A1

DE10054878A1 - Natriumkanäle vom Typus der peripheren Nerven

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Publication number: DE10054878A1
Application number: DE2000154878
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2002-05-08
Also published as: WO2002036747A2; AU2002215976A1; WO2002036747A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Zellinien zur Verfügung, die einen oder mehrere rekombinante Natriumkanäle von peripheren Nerven (PN) exprimieren, vorzugsweise einen humanen PN-Natriumkanal. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der genannten Zellinien zur Verfügung. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der genannten Zellinien zur Identifikation von PN-Natriumkanal-Agonisten, -Antagonisten oder -Modulatoren und auf Verfahren zur Identifikation der genannten Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren. Die Erfindung stellt auch Arzneimittelzusammensetzungen zur Verfügung, welche die Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren umfassen. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen Schmerz-Störungen.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der neurologischen Forschung und insbesondere der Ionenkanäle und der Kanäle der peripheren Nerven.

Technischer Hintergrund

Es ist schon längst bekannt, dass spannungsgesteuerte Natriumkanäle von axonalen und somatischen Wirkpotentialen und verstärkenden Synapsenpotentialen in Nerven abhängig sind. Verschiedene Indizienketten legen nahe, dass spannungsgesteuerte Natriumkanäle, die sich in peripheren sensorischen Neuronen befinden, nicht nur bei der anfänglichen Verletzungsentladung eine wichtige Rolle spielen können, sondern auch bei spontanen, andauernden und stimulus-evozierten Schmerz und Dysesthäsie, die für viele Arten von peripheren Neuropathien charakteristisch sind (1, 2). Über die klinische Wirksamkeit von Wirkstoffen, die primär über einen gemeinsamen verwendungsabhängigen Block von Natriumkanälen wirken, wie beispielsweise von lokalen Anästhetika, Antiarrhythmika und Antikonvulsiva, wurde bei der Behandlung von vielen neuropathischen Schmerzen berichtet (2-4). Das analgetische Potential dieser Wirkstoffe war jedoch wegen der zahlreichen nachteiligen Nebenwirkungen einschliesslich der Kardiotoxizität und der mit dem ZNS in Beziehung stehenden Zeichen beschränkt.

Neuere Untersuchungen haben neuartige, Tetrodotoxin(TTX)-sensitive und TTX-resistente Natriumkanäle aufgezeigt, nämlich PN1 bzw. PN3 vom Typus der peripheren Nerven (5-10). Diese werden überall im peripheren Nervensystem, insbesondere in den sensorischen C- und Aδ- Fasern, mit hohen Spiegeln exprimiert, und sie tragen der nozizeptiven Transduktion bei. Die Expression der beiden Kanäle zeigte sich durch den NGF, der während einer Entzündung und Nervenverletzung freigesetzt wird, bei Untersuchungen in vitro und in vivo induziert/erhöht (11, 12). Beim Carrageen-Entzündungs-Schmerzmodell bei Ratten wurde berichtet, dass in Neuronen von dorsalen Wurzelganglien, die sich bis zum entzündeten Glied erstrecken, PN3-mRNA- Spiegel und TTX-resistente Natriumströme erheblich erhöht werden (1). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Natriumkanäle vom Typus der peripheren Nerven an der nozizeptiven Transduktion bei Entzündungs- und neuropathischen Schmerzen mitbeteiligt sind.

Untersuchungen zu den funktionellen Eigenschaften dieser Natriumkanäle erfolgten bisher durch transiente Expression in Xenopus-Oozyten (6, 7, 9, 10) oder in Säuger-Zellinien (5, 13).

Es besteht beim Stand der Technik ein ungedeckter Bedarf, Substanzen zu finden, die fähig sind, Kanäle von peripheren Nerven wie beispielsweise PN1 und PN3 selektiv zu blockieren. Somit besteht das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Problem darin, die Werkzeuge, um solche Substanzen zu finden, und die Substanzen selbst zur Verfügung zu stellen.

Kurzfassung der Erfindung

Das vorgenannte technische Problem wird mit den Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und der Beschreibung gekennzeichnet sind. Die vorgenannten Nachteile des Standes der Technik werden durch die Ansprüche und die Beschreibung der vorliegenden Erfindung überwunden.

Die vorliegende Erfindung stellt Zellinien zur Verfügung, welche einen oder mehrere rekombinante Natriumkanäle von peripheren Nerven (PN) exprimieren, vorzugsweise einen humanen PN-Natriumkanal. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der genannten Zellinien zur Verfügung. Die Erfindung liegt ausserdem auf dem Gebiet der Verwendung der genannten Zellinien zur Identifikation von PT-Natriumkanal-Agonisten, -Antagonisten oder -Modulatoren und der Verfahren zur Identifikation der genannten Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren. Die Erfindung stellt auch Arzneimittelzusammensetzungen zur Verfügung, welche die genannten Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren umfassen. Die Erfindung befasst sich ausserdem mit der Verwendung von Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von neurologischen Störungen.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1 Northern-Blot-Analyse von RNA aus stabilen Transfektanten unter Verwendung von cDNA- Sonden für humane PN1- und PN3-Natriumkanäle

Die Expression des PNI-Transkripts in hPN1-(#21-43)-Zellen (A) und des PN3-Transkripts in hPN3-(#2)-Zellen (B) wurde in Gegenwart von Tetracyclin oder zu den angegebenen Zeitpunkten (24 Std.-72 Std.) nach Entfernung des Tetracyclins aus dem Kulturmedium untersucht. Die Migrationspositionen von RNA-Grössenmarker werden auf der linken Seite angezeigt.

Fig. 2 Elektrophysiologische Eigenschaften eines in hPN1-(#21-43)-Zellen exprimierten humanen PN1- Natriumkanals

A) Repräsentative Stromkennlinien, die von 10-ms-Testpulsen in 10-mV-Schritten von -60 mV bis 70 mV evoziert werden. Haltepotential -100 mV.
B) Die Beziehung zwischen Peak- Stromamplitude und Spannung. Jeder Punkt stellt Mittelwert ± Standardabweichung von 7 Zellen dar.
C) Dosisantwort-Kennlinie von TTX. Jeder Punkt stellt Mittelwert ± Standardabweichung von 5 Zellen dar.

Fig. 3 Elektrophysiologische Eigenschaften eines in hPN3-(#2)-Zellen exprimierten humanen PN3- Natriumkanals

A) Repräsentative Stromkennlinien, die in Gegenwart von 1 µM TTX von 10-ms-Testpulsen in 10-mV-Schritten von -60 mV bis 70 mV evoziert werden. Haltepotential -100 mV.
B) Die Beziehung zwischen Peak-Stromamplitude und Spannung in Gegenwart von 1 µM TTX. Jeder Punkt stellt Mittelwert ± Standardabweichung von 12 Zellen dar.

Offenbarung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung

Vor einer Beschreibung der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist zu bemerken, dass die Einzahl-Formen mit vorangestelltem undefiniertem und definiertem Artikel, wie sie im Vorliegenden und in den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, einen Bezug auf die Mehrzahl einschliessen, es sei denn, vom Zusammenhang werde anderes klar erzwungen. So schliesst beispielsweise der Bezug auf "einen Natriumkanal vom Typus der peripheren Nerven" eine Mehrzahl solcher Natriumkanäle vom Typus der peripheren Nerven ein, der Bezug auf die "Zelle" ist ein Bezug auf eine oder mehrere Zellen und der Fachperson bekannte Äquivalente davon, und so weiter. Sofern sie nicht anders definiert werden, haben alle im Vorliegenden verwendeten technischen und wissenschaftlichen Termini die gleichen Bedeutungen, wie sie herkömmlicherweise von der normalen Fachperson auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden. Obwohl bei der Ausübung oder Untersuchung der Erfindung beliebige Verfahren und Materialien verwendbar sind, die denen, welche im Vorliegenden beschrieben werden, ähnlich oder äquivalent sind, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Alle im Vorliegenden erwähnten Veröffentlichungen werden zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der Zellinien, Vektoren, und Verfahrensweisen, über die in den Veröffentlichungen berichtet wird und welche im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden könnten, durch den Bezug darauf in das Vorliegende aufgenommen. Nichts ist im Vorliegenden als Zugeständnis auszulegen, dass die Erfindung gegenüber einer solchen Offenbarung kein auf früheres Erfindungsdatum beruhendes Vorrecht haben würde.

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Zellinie zur Verfügung, welche an ihrer Oberfläche einen oder mehrere rekombinante Natriumkanäle von peripheren Nerven (PN) stabil exprimieren.

Der Terminus "Natriumkanal vom Typus der peripheren Nerven", "Natriumkanal des peripheren Nervs", oder "PN-Natriumkanal" (die beiden Termini werden untereinander austauschbar verwendet), wie er im Vorliegenden verwendet wird, bezieht sich auf peripher exprimierte Natriumkanäle wie beispielsweise Tetrodotoxin(TTX)-sensitiven PN1 und TTX-resistenten PN3. Diese können von einer beliebigen Wirbeltierspezies deriviert sein, vorzugsweise von Säuger- Spezies wie beispielsweise von Ratte, Maus, Hamster, Schwein, Rind, Hirschwild, Pferd, und am meisten bevorzugt vom Menschen. Primäre Teuronenzellen sind, weil sie post-mitotische Zellen sind und für jedes Experiment frisch bereitgestellt werden müssen, bei vielen Forschungsanwendungen und insbesondere bei industriellen Anwendungen wie beispielsweise HTS nicht gut verwendbar.

Es gibt keine Berichte über das Etablieren von stabilen Zellinien, welche Natriumkanäle exprimieren, was auf Schwierigkeiten bei der konstitutiven Expression unter physiologisch nichtgeregelten Bedingungen zurückzuführen ist. Die vorliegende Erfindung hat dieses sich beim Stand der Technik stellende Problem überwunden. Die vorliegende Erfindung stellt nun Zellinien zur Verfügung, welche PN-Natriumkanäle stabil exprimieren, was ein Forschungswerkzeug darstellt, welches die natürliche Situation am nächsten simuliert und somit die Nachteile des Standes der Technik überwindet, bei welchem nur primäre Neuronenzellen und transient transfizierte Zellinien zur Verfügung stehen.

Zellen, die "stabil transformiert" wurden, weisen rekombinante DNA auf, welche in deren genomische DNA aufgenommen wird. Solch eine stabil aufgenommene DNA wird in den transformierten Zellen zurückgehalten, weil sie in die Zellen mit einem Selektionsmittel aufgenommen wird, welches das Zurückhalten erzwingt, wenn die Zellen in einem Selektionsmedium zum Wachsen gebracht werden. Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise Säuger-Zellinien, die stabil transformiert worden sind.

Die genannte rekombinante DNA unterliegt einer Steuerung durch einen Transkriptions- Initiations-Bereich (oder Promotor), der ein konstitutiver Promotor oder ein induzierbarer oder entwicklungsmässig regulierter Promotor sein kann. Von besonderem Interesse, ohne anderes auszuschliessen, sind die konstitutiven Promotoren des humanen Cytomegalovirus (CMV) und des Rous-Sarcom-Virus (RSV), wie auch die Promotoren des Simian-Virus 40 und des Herpes simplex. Verwendbare induzierbare Promotoren umfassen Antibiotika-resistente Promotoren, Wärmeschock-Promotoren, den Hormon-induzierbare Brusttumor-Promotor und den Metallothionein-Promotor.

Eine geeignete Zelle oder Zellinie, vorzugsweise eine eukaryotische Zelle oder Zellinie, die mit Nucleinsäurekonstrukten zu transformieren ist, um an deren Zelloberfläche einen rekombinanten PN-Natriumkanal zu exprimieren, kann eine beliebige der Fachperson bekannte Zelle oder Zellinie sein, insbesondere Zellen oder Zellinien, die in der neurologischen und neurobiologischen Forschung verwendet werden. Beispiele von solchen Zellen oder Zellinien, die zur Produktion der erfindungsgemässen transformierten Zellinien verwendbar sind, umfassen Säuger-Zellen oder -Zellinien (beispielsweise die Zellinien der humanen Embryo-Niere (HEK) 293, BHK, GH3, H4, U373, NT2, PC12, COS, CHO, Ltk^-, Fibroblaste, Myelome, Neuroblastome, Hybridome, Oozyten, Embryo-Stammzellen), Insekten-Zellinien (beispielsweise die Verwendung von Baculovirus-Vektoren wie pPbac oder pMbac (Stratagene, La Jolla, USA)), Hefe (beispielsweise Pichia pastoris oder die Verwendung von Hefe-Expressionsvektoren wie pYESHIS (Invitrogen, San Diego, USA)), und Pilze.

Bei einer mehr bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, bei welcher der genannte Natriumkanal den Natriumkanal 1 vom Typus der peripheren Nerven (PN1) umfasst.

Bei einer anderen mehr bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, bei welcher der genannte Natriumkanal den Natriumkanal 3 vom Typus der peripheren Nerven (PN3) umfasst.

Bei einer anderen mehr bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, bei welcher der Genannte Natriumkanal ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz wie bei Genbank-Zugangsnummer X82835 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfasst.

Bei einer anderen mehr bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, bei welcher der genannte Natriumkanal ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz wie bei Genbank-Zugangsnummer AF117907 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfasst.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, bei welcher die genannte Zellinie einen rekombinanten Natriumkanal vom Typus der peripheren Nerven vom Menschen exprimiert. Die genannte, einen humanen PN-Kanal stabil exprimierende Zellinie kann ein präziseres Spezieszielgerichtetes Werkzeug zur Identifikation von neuen, bei der Therapie von chronischen Schmerz-Störungen verwendbaren Arzneimitteln darstellen.

Bei einer anderen mehr bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zellinie wie beschrieben, die von der CHO-Zellinie deriviert ist.

Bei einer anderen wichtigen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine CHO-Zellinie, welche an ihrer Oberfläche einen rekombinanten humanen PN1-Natriumkanal stabil exprimiert.

Bei einer anderen wichtigen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine CHO-Zellinie, welche an ihrer Oberfläche einen rekombinanten humanen PN3-Natriumkanal stabil exprimiert.

Die genannten erfindungsgemässen Zellinien, welche einen humanen PN-Natriumkanal wie beispielsweise PN1 oder PN3 (im Beispiel 1 veranschaulicht) exprimieren, sind fähig, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, und können ein präziseres Spezies zielgerichtetes Werkzeug zur Identifikation von neuen, bei der Therapie von chronischen Schmerz-Störungen verwendbaren Arzneimitteln darstellen.

Überraschenderweise haben die genannten erfindungsgemässen Zellinien funktionelle PN- Natriumkanäle, welche, auf Basis von elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften, Kanälen auf primären Neuronenzellen vergleichbar sind, was auch - auf nicht einschränkende Weise - im Beispiel 1 gezeigt wird.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, welche einen rekombinanten humanen PN-Natriumkanal oder rekombinante humane PN1- Natriumkanäle codiert.

Eine andere mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine erfindungsgemässe Nucleinsäure, wobei die genannte Nucleinsäure gekennzeichnet ist durch eine Nucleinsäure-Sequenz, welche die Sequenz der Genbank-Zugangsnummer X82835 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon oder eine auf den degenerierten Code zurückzuführende Variante umfasst.

Eine andere mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine erfindungsgemässe Nucleinsäure, wobei die genannte Nucleinsäure gekennzeichnet ist durch eine Nucleinsäure-Sequenz, welche die Sequenz der Genbank-Zugangsnummer AF117907 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon oder eine auf den degenerierten Code zurückzuführende Variante umfasst.

Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zellinie wie vorstehend beschrieben, umfassend die Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher eine für einen PN-Natriumkanal spezifische DNA umfasst, die Transfektion einer geeigneten Zellinie mit dem genannten Expressionsvektor, und das Screening der genannten Zellinie nach einer stabilen Transfektion unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine für einen PN-Natriumkanal codierende DNA aus einer beliebigen cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es PN-Natriumkanal-mRNA aufweist und diese mit einem feststellbaren Spiegel exprimiert. Beispielsweise ist eine von Gewebe von peripheren und zentrale Menschenneuronen abgeleitete cDNA-Bibliothek, wie beispielsweise diejenige, die in den Beispielen beschrieben wird, eine gute Quelle von PN-Natriumkanal-cDNA. Die Gene des PN-Natriumkanals können auch aus einer Genom-Bibliothek erhalten werden, wie beispielsweise aus einer Menschengenom-Cosmidbibliothek. Die für den PN-Natriumkanal codierende cDNA kann dann für die Ligation in geeigneten Vektoren und die Transformation von geeigneten Zellen oder Zellinien mit dem genannten Vektoren verwendet werden (für ein nicht einschränkendes Beispiel der Erfindung vgl. Beispiel 1).

Verfahren zur Produktion von geeigneten rekombinanten Vektoren, zur Transformation von Zellen mit diesen rekombinanten Vektoren, und zur Identifikation von Transformanten sind beim Stand der Technik wohlbekannt und werden hier nur kurz besprochen (vgl. zum Beispiel: Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, Viren (einschliesslich Phagen) und integrierbare DNA- Fragmente (d. h., in das Wirtsgenom durch Rekombination integrierbar). In der vorliegenden Beschreibung steht "Vektor" generisch für "Plasmid"; Plasmide stellen aber zur Zeit die am häufigsten verwendete Form von Vektoren dar. Jedoch eignen sich zur Verwendung im Vorliegenden alle anderen Formen von Vektoren, die eine äquivalente Funktion erfüllen und beim Stand der Technik bekannt sind oder werden. Geeignete Vektoren enthalten Replicon- und Steuersequenzen, die von Spezies deriviert sind, welche mit dem geplanten Expressionswirt kompatibel sind.

Geeignete Wirtszellen sind beliebige Prokaryonten, Hefen oder höhere Eukaryontenzellen, die mit den erfindungsgemässen Nucleinsäuren derart transformiert oder transfiziert wurden, dass sie zur klonmässigen Ausbreitung dieser Nucleinsäuren und/oder zur Expression der davon codierten Proteine oder Peptide führen. Solche Zellen oder Zellinien sind sowohl bei der Ausbreitung und Produktion der erfindungsgemässen Nucleinsäuren und Proteine wie auch, wie im nachstehenden weiter beschrieben, als Modellsysteme für diagnostische und therapeutische Untersuchungen verwendbar. Wie er im Vorliegenden verwendet wird, ist der Terminus "transformierte Zelle" so zu verstehen, dass er eine beliebige Zelle oder den Abkömmling einer beliebigen Zelle umfasst, in welche(n) beliebige erfindungsgemässe Nucleinsäuren eingeführt wurden, sei es durch Transformation, Transfektion, Infektion oder andere Mittel.

Prokaryotische Zellen, die zur Produktion der erfindungsgemässen transformierten Zellen verwendbar sind, umfassen Mitglieder der Bakterien-Genera Escherichia (beispielsweise E. coli), Pseudomonas (beispielsweise, P. aeruginosa), und Bacillus (beispielsweise B. subtilis, B. stearothermophilus) wie auch viele andere, die wohlbekannt sind und beim Stand der Technik oft verwendet werden.

Prokaryotische Zellen sind besonders zur Produktion von grossen Mengen der erfindungsgemässen Rezeptorproteine (beispielsweise normaler oder mutanter PN- Natriumkanäle oder Untereinheiten davon, Fragmente der genannten Rezeptoren oder Untereinheiten, Fusionsproteine der genannten Rezeptoren oder Untereinheiten) verwendbar. Bakterienzellen (beispielsweise E. coli) können mit einer Vielfalt von Expressionsvektorsystemen verwendet werden, einschliesslich zum Beispiel Plasmide mit dem T7-RNA-Polymerase/Promotor-System, Regulationssequenzen des Bakteriophagen λ, oder M13- Phagen-mGPI-2. Bakterielle Wirtsorganismen können auch mit Fusionsproteinvektoren transformiert werden, die beispielsweise Fusionsproteine mit lacZ, trpE, Maltosebindungsprotein, Poly-His-tags oder Glutathion-S-Transferase erzeugen. Diese alle sind, wie auch viele andere prokaryotische Expressionssysteme, beim Stand der Technik wohlbekannt und im Handel weit verbreitet erhältlich (beispielsweise pGEX-27 (Amrad, USA) für GST- Fusionen).

Zur Produktion der erfindungsgemässen transformierten Zellen verwendbare eukaryotische Zellen und Zellinien werden weiter unten beschrieben.

Zür Erreichung der Expression in eukaryotischen Zellen ist eine breite Vielfalt von Vektoren entwickelt worden und im Handel erhältlich, die unter Steuerung durch ein künstliches Promotorelement die Expression der Nucleotidsequenz von PN-Natriumkanälen-Subeinheiten oder von ganzen Kanälen induzierbar (beispielsweise LacSwitch-Expressionsvektoren, Stratagene, La Jolla, CA) oder wesensverwandt (beispielsweise pcDNA3-Vektoren, Invitrogen, San Diego, USA) ermöglichen. Solche Promotorelemente sind oft von CMV- oder SV40-viralen Genen deriviert, obwohl andere starke Promotorelemente, die in eukaryotischen Zellen aktiv sind, ebenfalls verwendbar sind, um die Transkription der Expression von Nucleotidsequenzen von PN-Natriumkanälen-Subeinheiten oder von ganzen Kanälen zu induzieren. Typisch enthalten diese Vektoren auch eine künstliche Polyadenylationssequenz und 3' UTR, was auch von exogenen Viralgensequenzen oder von anderen eukaryotischen Genen deriviert werden kann. Ausserdem werden in gewissen Konstrukten künstliche nichtcodierende spleissbare Introns und Exons in den Vektor eingeführt, um die Expression der Nucleotidsequenz von Interesse (im vorliegenden Fall der Nucleotidsequenz des PN-Natriumkanals) zu erhöhen. Diese Expressionssysteme sind im Handel leicht erhältlich, als typische Vertreter davon seien Vektoren wie beispielsweise pcDNA3 und pZeoSV (Invitrogen, San Diego, USA) angegeben. Unzählige im Handel wie auch als Einzelfertigung erhältliche Expressionsvektoren sind im Handel erhältlich, welche die Expression jeder beliebig gewünschten Expression eines Transkripts von PN-Natriumkanal in mehr oder weniger jedem gewünschten Zelltypus ermöglichen, entweder konstitutiv oder nach Aussetzung zu einem gewissen exogenen Stimulus (beispielsweise dem Entzug von Tetracyclin oder der Aussetzung zu IPTG).

Recombinante Vektoren können in die Empfänger- oder Wirtszellen nach verschiedenen beim Stand der Technik wohlbekannten Verfahren eingeführt werden, einschliesslich, aber nicht darauf beschränkt, Calciumphosphat-Transfektion, Strontiumphosphat-Transfektion, DEAE- Dextran-Transfektion, Elektroporation, Lipofektion (beispielsweise Dosper Liposomales Transfektionsreagens, Boehringer Mannheim, Germany), Mikroinjektion, ballistische Insertion auf Mikrokügelchen, Protoplastfusion oder, für virale oder Phagenvektoren, durch Infektion mit dem rekombinanten Virus oder Phagen.

Somit kann eine stabile Transformation einer Säuger-Zellinie unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren erfolgen, um die Zellen zu cotransfizieren mit einem oder mehreren rekombinanten Vektoren, welche Nucleinsäure-Moleküle umfassen, die einen erfindungsgemässen PN-Natriumkanal codieren, und mit einem zweiten Vektor, der Resistenz gegenüber einem Selektionsmittel wie beispielsweise einem Antibiotikum, beispielsweise G418 (Neomycin) oder Zeocin, verleiht. In der Alternative kann die Transformation mit einem einzelnen Vektor erfolgen, der zugleich das genetische Steuerelement und das Selektionsmittelgen enthält. Ebenfalls können recombinante retrovirale Vektoren ein Selektionsmittelgen enthalten, um eine stabile Transformation zu produzieren. Um zur Expression von erfindungsgemässen PN-Natriumkanälen Zellen zu cotransfizieren, kann für jede PN-Natriumkanal-cDNA ein anderes Selektionsmittel verwendet werden.

Somit ist ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren wie beschrieben, bei welchem die genannte Zellinie cotransfiziert ist mit zwei oder mehr der genannten Expressionsvektoren, von denen jeder eine DNA umfasst, die für einen anderen PN- Natriumkanal spezifisch ist.

Die erfindungsgemässen Zellinien, vorzugsweise die Zellinien, welche die humanen PN1- oder PN3-Kanäle exprimieren, stellen für die Fachperson wertvolle Werkzeuge dar. Die genannten erfindungsgemässen Zellinien sind präzisere, Spezies-zielgerichtete Werkzeuge zur Identifikation und Charakterisierung von neuen Modulatoren von chronischem Schmerz.

Somit ist eine andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung zur Identifikation von PN-Natriumkanal- Agonisten.

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung zur Identifikation von PN-Natriumkanal- Antagonisten oder -Modulatoren.

Der Terminus "Agonist", wie er im Vorliegenden verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz oder ein Signal, das die Funktion des PN-Natriumkanals aktiviert; und die Termini "Antagonist" oder "Modulator" beziehen sich auf eine Substanz, die mit der Funktion des PN-Natriumkanals interferiert.

Agonisten umfassen, jedoch ohne Einschränkung darauf, chemische Verbindungen wie beispielsweise kleine organische Moleküle, Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate oder beliebige andere Moleküle, die an die PN-Natriumkanäle binden. Die Termini "Antagonist" oder "Modulator", wie sie im Vorliegenden verwendet werden, beziehen sich auf ein Molekül, welches, wenn es an PN-Natriumkanäle gebunden ist, die biologische oder neurologische Aktivität von PN-Natriumkanälen blockiert oder moduliert, beispielsweise indem es die Aktivation des PN-Natriumkanals durch Agonisten blockiert. Modulatoren, wie sie im Vorliegenden verwendet werden, beziehen sich beispielsweise auf allosterische Modulatoren. Antagonisten oder Modulatoren umfassen kompetitive und nichtkompetitive Antagonisten oder Modulatoren. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) steht in Wechselwirkung mit oder nahe dem Ort, der für den Agonisten für denselben oder einen nahegelegenen Ort spezifisch ist (beispielsweise, ein Ligand des PN-Natriumkanals). Ein nichtkompetitiver Antagonist oder Modulator oder Blocker inaktiviert das Funktionieren des Rezeptors durch Wechselwirkung mit einem anderen Ort als dem Ort, der mit dem Agonisten in Wechselwirkung steht. Antagonisten oder Modulatoren umfassen, jedoch ohne Einschränkung darauf, chemische Verbindungen wie beispielsweise kleine organische Moleküle, Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate oder beliebige andere Moleküle, die an die PN-Natriumkanäle binden.

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung in einem Hochdurchsatzscreening(HTS)- Format. HTS bezieht sich auf eine Experimentierung, bei der eine grosse Anzahl von Verbindungen gleichzeitig untersucht werden. Vorzugsweise kann die genannte HTS- Experimentierung auf Mikroplatten ausgeführt, teilweise oder vollständig automatisiert, und mit elektronischen Einrichtungen verbunden werden, wie beispielsweise Computer zur Speicherung, Analyse und Interpretation von Daten unter Einsatz der Bioinformatik. Vorzugsweise sind an der genannten Automatisierung Roboter mitbeteiligt, die fähig sind, eine grosse Anzahl von Mikroplatten zu behandeln und einige Tausend Untersuchungen pro Tag durchzuführen. Vorzugsweise wird eine zu untersuchende Verbindung, die eine gewünschte Agonisten-, Antagonisten- oder Modulatorfunktion in einem zellfreien System aufweist, auch in einem auf Zellen basierenden System untersucht, wobei eine erfindungsgemässe Zellinie verwendet wird. Der Terminus HTS umfasst auch Ultrahochdurchsatzscreening(UHTS)-Formate. Vorzugsweise können die genannten UHTS-Formate unter Verwendung von 384- oder 1536-Loch- Mikroplatten, von Submikroliter- oder Subnanoliter-Pipettiergeräten, von verbesserten Plattenlesern und von Verfahrensweisen zum Berücksichtigen der Verdampfung ausgeführt werden. HTS-Verfahren sind beispielsweise in US-A-5876946 oder US-A-5902732 beschrieben. Die Fachperson kann das nachstehend beschriebene Verfahren an ein HTS- oder UHTS-Format anpassen, ohne dabei eine erfinderische Tätigkeit aufbringen zu müssen.

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung in einer elektrophysiologischen Untersuchung mit einem Agonisten, Antagonisten oder Modulator eines PN-Natriumkanals, bei welcher Membranströme gemessen werden. Elektrophysiologische Untersuchungen sind der Fachperson bekannt und werden beispielsweise in Hille B (1984), "Ionic channels of excitable membranes", Sinauer Associates Inc., Sunderland, USA offenbart. Ein nicht einschränkendes Beispiel einer solchen Untersuchung ist im Beispiel 1 offenbart.

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung in einer Rezeptorenbindungs-Untersuchung (vgl. die Beschreibung weiter unten).

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zellinie nach der vorangehenden Beschreibung in einer kolorimetrischen oder fluorometrischen Untersuchung, bei welcher die intrazelluläre Menge eines einwertigen Ions gemessen wird.

Unter einem weiteren wichtigen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifikation eines Agonisten, Antagonisten oder Modulators eines PN-Natriumkanals, welches Verfahren die Inkubation einer Zellinie, wie sie vorstehend beschrieben wurde, zusammen mit einer Testsubstanz umfasst.

Unter einem anderen wichtigen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie beschrieben, wobei das Verfahren weiter gekennzeichnet ist durch die Messung eines Membranstroms und den Vergleich des genannten Membranstroms mit dem Membranstrom, der für die genannte Zellinie nach einer Inkubation mit einer bekannten Referenz oder in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.

Wie es die Fachleute verstehen, erfordern Verfahren zur Identifikation eines Agonisten, Antagonisten oder Modulators eines PN-Natriumkanals im allgemeinen den Vergleich mit einer Referenz. Einer der Typen von "Referenz"-Zelle oder "Referenz"-Kultur ist eine Zelle oder Kultur, die im wesentlichen gleich behandelt wird wie die Zelle oder Kultur, die der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wird, ausser dass die Referenzkultur nicht der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wird. Bei Verfahren zum Beispiel, bei denen elektrophysiologische Voltage-Clamp-Verfahrensweisen verwendet werden, kann dieselbe Zelle jeweils in Gegenwart und Abwesenheit der zu untersuchenden Verbindung untersucht werden, indem lediglich die externe Lösung, welche die Zelle umgibt, gewechselt wird. Ein anderer Typus von "Referenz"-Zelle oder "Referenz"-Kultur kann eine Zelle oder eine Kultur von Zellen sein, die den transfizierten Zellen identisch ist, ausser dass die für die Referenzkultur verwendeten Zellen die PN-Natriumkanäle nicht exprimieren, die in den erfindungsgemässen, stabil transfizierten Zellen exprimiert werden. In dieser Situation wird die Antwort der zu untersuchenden Zelle auf die zu untersuchende Verbindung verglichen mit der Antwort (oder dem Fehlen der Antwort) von Rezeptor-negativen (Referenz-)Zellen auf die zu untersuchende Verbindung, wenn Zellen oder Kulturen eines jeden Typus von Zellen im wesentlichen denselben Reaktionsbedingungen in Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt werden. Die vorangehend erwähnten bekannten Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren sind auch als Referenz für die erfindungsgemässen Verfahren verwendbar. In diesem Fall werden Zellen oder Kulturen der erfindungsgemässe Zellinien mit der Testsubstanz inkubiert, in einem parallelen Experiment werden Zellen oder Kulturen der genannten Zellinien mit einem bekannten Agonisten, Antagonisten oder Modulator inkubiert, und es werden die beiden Antworten verglichen.

Die genannten erfindungsgemässen Verfahren können biochemische, molekularbiologische oder immunologische Verfahren sein. Biochemische oder molekularbiologische Verfahren sind der Fachperson bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Reportergen-Untersuchungen wie beispielsweise β-gal-, CAT-, SEAP-, GFP-, BFP- oder Luciferase-Untersuchungen, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), RT-PCR, Northern- oder Southern-Blot-Untersuchungen, die beispielsweise veröffentlicht sind in: Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; und Bertram S und Gassen HG (1991), "Gentechnische Methoden", G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. Immunologische Verfahren sind der Fachperson bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ELISAs (enzyme-linked immuno-sorbent assay) oder Sandwich-ELISAs, Dot- Blot-Untersuchungen, Immuno-Blot-Untersuchungen, Radioimmuno-Untersuchungen (Radioimmunoassay RIA), auf Diffusion beruhende Ouchterlony-Untersuchungen, rocket- Immunofluoreszenz-Untersuchungen oder Western-Blot-Untersuchungen. Beispiele von immunologischen Verfahren sind beispielsweise beschrieben in: "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1986); Bullock et al., "Techniques in Immunocytochemistry", Academic Press, Orlando, FL, Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande (1985).

Ausserdem umfassen die erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise elektrophysiologische Verfahren oder Untersuchungen wie vorstehend beschrieben, beispielsweise ein Patch-Clamp- Verfahren (vgl. auch beispielsweise Mayer ML, Vyklicky L Jr, Westbrook GL (1989), "Modulation of excitatory amino acid receptors by group DB metal cations in cultured mouse hippocampal neurones", J. Physiol. 415, 329-350). Die Fachperson kennt zahlreiche Verfahren, die zur Identifikation von Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren von PN-Natriumkanälen verwendbar sind, und sie kann diese anpassen, um sie auf eine erfindungsgemässe Zellinie anzuwenden, ohne dabei eine erfinderische Tätigkeit aufbringen zu müssen (vgl. beispielsweise Hille B (1984), "Ionic channels of excitable membranes", Sinauer Associates Inc., Sunderland, USA). Testverbindungen, beispielsweise kleine organische Moleküle enthaltende Bibliotheken, sind im Handel weitverbreitet erhältlich und können bei den erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden.

Unter einem anderen bevorzugten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie beschrieben, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zellinie, wie sie vorstehend beschrieben wurde, mit einem bekannten Agonisten inkubiert wird, der mit einem Reporter gekoppelt ist, die genannte Zellinie mit einer Testsubstanz inkubiert wird, und die Verdrängung des mit dem Reporter gekoppelten Agonisten durch die Testsubstanz gemessen wird. Alle vorerwähnten bekannten Agonisten sind bei diesem bevorzugten Verfahren verwendbar und können ohne erfinderische Tätigkeit mit einem Reporter gekoppelt werden. Ein Reporter, wie er im Vorliegenden verwendet wird, kann ein beliebiger der Fachperson bekannter Reporter sein und ist vom verwendeten Verfahrenstypus abhängig. Beispiele von verwendbaren Reportern umfassen beispielsweise Radiomarkierer wie ³²P, ¹²⁵I, ³H und ¹⁴C; fluoreszierende Reporter wie Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl und Umbelliferon sowie chemilumineszente Stoffe wie die verschiedenen Luciferinverbindungen. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren eine Rezeptorenbindungs-Untersuchung sein, bei welcher beispielsweise der bekannte Agonist an den Reporter Tritium [³H] gekoppelt und die Verdrängung des [³H]-Agonisten gemessen wird.

Unter einem anderen bevorzugten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren wie beschrieben, wobei das genannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zellinie, wie sie vorstehend beschrieben wurde, mit einer Testsubstanz inkubiert wird, die intrazelluläre Menge eines einwertigen Kations gemessen wird, die genannte Menge des intrazellulären einwertigen Ions (beispielsweise Natrium, Kalium) mit der Menge des intrazellulären einwertigen Ions verglichen wird, welche der für die genannte Zellinie nach einer Inkubation mit einer bekannten Referenz oder in Abwesenheit der Testsubstanz gemessen wird. Die vorangehend erwähnten bekannten Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren sind auch als Referenz für dieses bevorzugte erfindungsgemässe Verfahren verwendbar. Das genannte Verfahren kann ein elektrophysiologisches Verfahren sein, bei dem beispielsweise elektrophysiologische Änderungen gemessen werden, die zufolge einer Aktivation oder Hemmung der PN-Natriumkanäle beobachtet werden.

Unter einem anderen bevorzugten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren wie beschrieben, wobei das genannte Verfahren eine Hochdurchsatzscreening- Untersuchung ist (HTS; vgl. die Beschreibung weiter oben).

Eine noch andere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Agonist, Antagonist oder Modulator eines PN-Natriumkanals, der mit einem erfindungsgemässen Verfahren identifizierbar ist. Beispiele von PN-Natriumkanal-Antagonisten oder -Modulatoren sind Lidocain, Mexiletin und TTX, die bei den erfindungsgemässen Verfahren als Referenz dienen können. Vorzugsweise wird der genannte erfindungsgemässe Agonist, Antagonist oder Modulator nicht aus der Gruppe Lidocain, Mexiletin und TTX ausgewählt.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Arzneimittelzusammensetzung, die einen Agonisten, Antagonisten oder Modulator eines PN- Natriumkanals, der mit einem Verfahren wie vorstehend beschrieben identifizierbar ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Vorzugsweise umfasst die genannte Arzneimittelzusammensetzung einen erfindungsgemässen Agonisten, Antagonisten oder Modulator, der nicht aus der Gruppe Lidocain, Mexiletin und TTX ausgewählt ist.

Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann physiologisch annehmbare Verbindungen enthalten, die beispielsweise wirken, indem sie die Absorption eines PN-Natriumkanal- Agonisten, -Antagonisten oder -Modulators stabilisieren oder erhöhen. Solche physiologisch annehmbare Verbindungen umfassen beispielsweise Kohlenhydrate wie Glucose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine von niederem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren oder Corrigenzien (vgl. beispielsweise auch "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), 18. Ausgabe, Mack Publ., Easton). Eine Fachperson wird wissen, dass die Wahl eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, einschliesslich einer physiologisch annehmbaren Verbindung, beispielsweise von dem Verabreichungsweg der Zusammensetzung abhängig ist.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Agonisten oder Antagonisten eines PN-Natriumkanals, der mit einem Verfahren wie vorstehend beschrieben identifizierbar ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen Schmerz-Störungen. Vorzugsweise umfasst die genannte erfindungsgemässe Verwendung eines Agonisten, Antagonisten oder Modulators ein Agonisten, Antagonisten oder Modulator, der nicht aus der Gruppe Lidocain, Mexiletin und TTX ausgewählt ist. Chronische Schmerz-Störungen umfassen, jedoch ohne Einschränkung darauf, Störungen im Zusammenhang mit der Entwicklung und dem Andauern von chronischem Schmerz wie chronische Entzündungserkrankungen, neuropathischen Schmerz, diabetische Neuropathie, Krebs und dergleichen.

Das nachfolgende Beispiel dient der weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung; es ist aber nicht als Einschränkung des Umfangs der im Vorliegenden offenbarten Erfindung zu verstehen.

Beispiel 1 - Bereitstellung von die humanen PN1- und PN3-Natriumkanäle exprimierenden stabilen Transfektanten MATERIALIEN UND VERFAHREN 1. Klonierung und Expressionskonstrukte 1-1. Konstruktion von humane PN1-cDNA enthaltenden Expressionsplasmiden

Humanen PN1 codierende komplementäre DNA wurde aus RT-PCR deriviert. Ein µg humane Nebennierendrüsen-poly(A)+-RNA (Clontech, Tokyo, Japan) wurde mit Random-Primers der RNase H-Reverse Transkriptase des Virus der Moloney-Mäuse-Leukämie (Toyobo, Osaka, Japan) ausgesetzt. Der erste synthetisierte cDNA-Strang wurde mit einem DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) gemäss den Anweisungen des Herstellers (TaKaRa LA PCR kit, Shiga, Japan) amplifiziert.

Die Primer-Paare waren die folgenden synthetischen 25-Nucleotid-Oligomere:
1-25 (ST; flussaufwärts gelegener Primer) und 2266-2290 (B; flussabwärts gelegener Primer),
2276-2300 (A; flussaufw. gel. Primer) und 3914-3938 (D; flussabw. gel. Primer),
3902-3926 (C; flussaufw. gel. Primer) und 5120-5144 (F; flussabw. gel. Primer), und
5109-5133 (E; flussaufw. gel. Primer) und 6091-6115 (ED; flussabw. gel. Primer).

Die Nummerierung der Nucleotide erfolgt entsprechend der aus der GenBank abgeleiteten Sequenz (Zugangsnummer X82835). Die Produkte der Reverse Transkriptase PCR der vorerwähnten Primer-Paare wurden in den Vektor pCR^TM 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert, was pHPN1(ST/B)/pCR^TM2.1, pHPN1(A/D)/pCR^TM2.1, pHPN1(C/F)/pCR^TM2.1 bzw. pHPN1(E/ED)/pCR^TM2.1 ergab. Das Plasmid pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA) wurde mit SpeI und XhoI gespalten und mit dem 1.6-kb-XhoI(Vektor)/SpeI(Vektor)-Fragment aus pHPN1(A/D)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN1(A/D)/pZeoSV ergab. Das pHPN1(A/D)/pZeoSV wurde mit DraI(2283) und NotI(Vektor) gespalten und mit dem 2.3-kb-NotI(Vektor)/DraI(2282)- Fragment aus pHPN1(ST/B)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN1(ST/D)/pZeoSV ergab. Das Plasmid pBluescriptII KS(-) (Stratagene, La Jolla, CA) wurde mit SpeI und NotI gespalten und mit dem 1.0-kb-NotI(Vektor)/SpeI(Vektor)-Fragment aus pHPN1(E/ED)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN1(E/ED)/pBluescriptII KS(-) ergab. Das pHPN1(E/ED)/pBluescriptII KS(-) wurde mit NotI(Vektor) und NheI(5125) gespalten und mit dem 1.2-kb-NotI(Vektor)/NheI(5124)-Fragment aus pHPN1(C/F)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN1(C/ED)/pBluescriptII KS(-) ergab. Das pHPN1(C/ED)/pBluescriptII KS(-) wurde mit NotI(Vektor) und XbaI(3120) gespalten und mit dem 3.9-kb-NotI(Vektor)/XbaI(3919)-Fragment aus pHPN1(ST/D)/pZeoSV ligiert, was pHPN1/pBluescriptII KS(-) ergab, welches die gesamte codierende Sequenz für den humanen PN1 enthielt.

Das 6.1-kb-NotI(Vektor)/SpeI(Vektor)-Fragment aus pHPN1/pBluescriptll KS(-) wurde in den XbaI/NotI-Ort des tTA-abhängigen Expressionsvektors pAHygTet1 ligiert, der einen CMV- minimalen Promotor und 7 tet-Operatoren unter der Steuerung von tTA und Tetracyclin (14) enthielt, was schliesslich das induzierbare, humane PN1-cDNA tragende Expressionsplasmid pHPN1/pAHygTet1 ergab.

1-2. Konstruktion von humane PN3-cDNA enthaltenden Expressionsplasmiden

Humanen PN3 codierende komplementäre DNA wurde nach dem vorstehend beschriebenen RT- PCR-Verfahren aus humaner Herz-poly(A)⁺-RNA (Clontech, Tokyo, Japan) deriviert. Die Primer-Paare waren die folgenden synthetischen 25-Nucleotid-Oligomere:
1-25 (ST; flussaufwärts gelegener Primer) und 1289-1313 (B; flussabwärts gelegener Primer),
1279-1303 (A; flussaufw. gel. Primer) und 3350-3374 (D; flussabw. gel. Primer),
3339-3363 (C; flussaufw. gel. Primer) und 4131-4155 (F; flussabw. gel. Primer), und
4121-4145 (E; flussaufw. gel. Primer) und 5850-5874 (ED; flussabw. gel. Primer).

Die Nummerierung der Nucleotide erfolgt entsprechend der aus der GenBank abgeleiteten Sequenz (Zugangsnummer AF117907). Die Produkte der Reverse Transkriptase PCR der vorerwähnten Primer-Paare wurden in den Vektor pCR^TM2.1 oder den Vektor pCR4Blunt- TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert, was pHPN3(ST/B)/pCR^TM2.1, pHPN3(A/D)/pCR4Blunt-TOPO, pHPN3(C/F)/pCR^TM2.1 bzw. pHPN3(E/ED)/pCR^TM2.1 ergab. Das Plasmid pBluescriptII SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) wurde mit HindIII und XbaI gespalten und mit dem 1.3-kb-HindIII(Vektor)/XbaI(Vektor)-Fragment aus pHPN3(ST/B)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN3(ST/B)/pBluescriptII SK(-) ergab. Das pHPN3(ST/B)/pBluescriptII SK(-) wurde mit NheI(1293) und NsiI(Vektor) gespalten und mit dem 2.1-kb-NheI(1294)/NsiI(3358)-Fragment aus pHPN3(A/D)/pCR4Blunt-TOPO ligiert, was pHPN3(ST/D)/pBluescriptII SK(-) ergab. Das pHPN3(C/F)/pCR^TM2.1 wurde mit SpeI(Vektor) und XmaI(4136) gespalten und mit dem 1.7-kb-XmaI(4137)/SpeI(Vektor)-Fragment aus pHPN3(E/ED)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN3(C/ED)/pCR^TM2.1 ergab. Das Plasmid pBluescriptII SK(-) wurde mit XhoI und SpeI gespalten und mit dem 2.5-kb- XhoI(Vektor)/SpeI(Vektor)-Fragment aus pHPN3(C/ED)/pCR^TM2.1 ligiert, was pHPN3(C/ED)/pBluescriptII SK(-) ergab. Das pHPN3(ST/D)/pBluescriptII SK(-) wurde mit NsiI(3358) und NotI(Vektor) gespalten und mit dem 2.5-kb-NsiI(3359)/NotI(Vektor)-Fragment aus pHPN3(C/ED)/pBluescriptII SK(-) ligiert, was pHPN3/pBluescriptII SK(-) ergab, welches die gesamte codierende Sequenz für den humanen PN3 enthielt.

Das 5.9-kb-KpnI(Vektor)/NotI(Vektor)-Fragment aus pHPN3/pBluescriptII SK(-) wurde mit dem NotI/KpnI-Ort von pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA) weiter ligiert, was pHPN3/pcDNA3.1/Zeo(+) ergab. Die synthetischen Oligodeoxyribonucleotid-Primer
5'-CATACAGGATGAAAAGATGG-3' und
5'-AATTCCATCTTTTCATCCTGTATGGTAC-3'
wurden reassoziiert, um das doppelsträngige DNA-Fragment zu ergeben, das die Sequenz des 5'- nichttranslatierten Bereiches der humanen PN1-cDNA, aus der GenBank (Zugangsnummer X82835) derivierte Nucleotidreste 34-48 und den Translations-Initiations-Ort der humanen PN3- cDNA enthält. Das daraus resultierende Fragment erzeugte KpnI- und EcoRI-Orte am 5'- bzw. 3'-Ende. Diese synthetisierte DNA wurde mit dem EcoRI(5)/KpnI(Vektor)-Ort von pHPN3/pcDNA3.1/Zeo(+) ligiert, was pHPN3-5' UTRPN1/pcDNA3.1/Zeo(+) ergab.

Der pAHygTet1-Vektor wurde mit XhoI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase (glattendig) behandelt und mit NotI gespalten. Das pHPN3-5'UTRPN1/pcDNA3.1/Zeo(+) wurde mit KpnI glattendig gespalten und mit NotI gespalten. Das resultierende 5.9-kb-glattendig- (Vektor)/NotI(Vektor)-Fragment aus pHPN3-5'UTRPN1/pcDNA3.1/Zeo(+) wurde mit dem NotI/glattendigen Ort von pAHygTet1 ligiert, was das induzierbare, humane PN3-cDNA tragende Expressionsplasmid pHPN3-5'UTRPN1/pAHygTet1 ergab.

Alle Produkte der Reverse Transkriptase PCR wurden nach dem Verfahren der Dideoxy-Ketten- Terminierung sequenziert.

2. Isolierung von stabilen Transfektanten

Ovarienzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) wurden durch Elektroporation bzw. mittels LipofectAMINE PLUS^TM (Life Technologies, Rockville, MD) mit den Plasmiden pHPN1/pAHygTet1 und pUHD15-1_NEO bzw. pHPN3-5'UTRPN1/pAHygTet1 und pUHD15-1_NEO cotransfiziert. Die Zellen wurden in einem 10% fetales Rinderserum, 100 µg/ml Hygromycin, 500 µg/ml G418 und 2 µg/ml Tetracyclin enthaltenden α-Minimum Essential Medium selektioniert.

3. Northern-Blot-Analyse

Zur Analyse der induzierbaren Expression von humanen PN1- und PN3-Natriumkanälen wurde eine Northern-Blot-Analyse im wesentlichen wie bereits beschrieben (15) durchgeführt. Vollständige RNA (20 µg) aus rekombinanten Zellinien wurde in 15 mM 9% Glyoxal und 75% Dimethylsulfoxid enthaltendem Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) inkubiert und dann mittels Elektrophorese durch ein 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) enthaltendes 1,5%iges Agarose-Gel fraktioniert. Die fraktionierte RNA wurde auf eine Biodyne-Nylonmembran (Pall BioSupport, East Hills, NY) übertragen. Nach einem Trocknen bei 80°C während 2 Stunden wurde das Filter bei 42°C während 2 Stunden in 50 mM 5x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 0,25 mg/ml denaturierter Heringsperma-DNA und 50% Formamid enthaltendem Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) vorhybridisiert. Das Filter wurde mit Hybridisierungssonden bei 42°C während 16 Stunden hybridisiert. Die verwendeten Sonden bestanden aus dem jeweiligen HindIII(779)/HindIII(3600)-Fragment bzw. EcoRI(Vektor)/EcoRI(Vektor)-Fragment, das aus dem Plasmid pHPN1/pAHygTet1 bzw. pHPN3(A/D)/pCR4Blunt-TOPO excisiert und mit Hilfe des Oligolabelling Kit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) mit [α-³²P]dCTP markiert worden war. Eine Autoradiographie erfolgte mit einem Intensifikationsschirm bei -80°C während 16 Stunden.

4. Elektrophysiologie

Na⁺-Ströme wurden mit einem EPC-9 Patch-Clamp-Verstärker (HEKA, Lambrecht, Germany) bei Raumtemperatur (22-25°C) unter Verwendung des Vollzellenmodus des Patch-Clamp- Verfahrens aufgezeichnet. Die Patch-Pipetten waren aus Aluminosilicatglas (1,6 mm Aussendurchmesser, 1,2 mm Innendurchmesser, Hilgenberg, Malsfeld, Germany) gefertigt. Die Patch-Elektroden waren feuerpoliert. Der Widerstand der Pipetten lag im Bereich von 1 bis 1,5 MΩ, wenn diese mit den weiter unten beschriebenen Pipettenlösungen gefüllt waren. Der Serienwiderstand wurde elektronisch zu <80% kompensiert, und es wurden sowohl der Stromverlust wie auch die Restkapazität nach dem -P/6-Verfahren abgezogen. Die externe Lösung enthielt (in mM): 135 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 Glucose und 10 HEPES (pH 7,4 mit NaOH). Die Pipettenlösung enthielt (in mM): 70 CsF, 60 CsCl, 12 NaF, 5 HEPES, 0,1 BAPTA, 2 ATP und 2 GTP (pH 7.4 with CsOH). Der Einsatz der Verbindungen erfolgte nach einem modifizierten "Y-Röhrchen"-Verfahren. Ströme wurden bei 100 kHz nach einer Tiefpass- Filterung bei 10 kHz (-3 dB) digitalisiert. Die Daten wurden erfasst und mit der Pulse- und PulseFit-Software (HEKA, Lambrecht, Germany) und Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, ODER) analysiert. Die Parameter für die Abhängigkeit der Aktivation von der Spannung wurden auf Basis der Gleichung: I = G_max × (V-V_rev)/(1 + exp(-(V-V_m)/a_m)), worin I für die Peak- Stromamplitude, G_max für die maximale Leitfähigkeit, V für das Untersuchungspotential, V_rev für das Umkehrpotential, V_m für den Mittelpunkt der Aktivation und a_m für einen Neigungsfaktor stehen, aus dem Strom-Spannungs-Verhältnis geschätzt. Die Dosis-Antwort- Kennlinie wurde mit Hilfe der Hill-Gleichung I = I_max × 1/(1 + (c/IC₅₀)ⁿ) angepasst, worin IC₅₀ die Konzentration zur Blockierung von 50% der Kanäle und n der Hill-Koeffizient ist.

RESULTATE 1. Klonierung von die humanen PN1- und PN3-Natriumkanäle codierender cDNAs

Unter Verwendung der RT-PCR-Klonierungsstrategie wurden die humanen PN1- und PN3- cDNAs aus jeweiligen Nebennierendrüsen- und Herzen-poly(A)⁺-RNAs erhalten. Die Aminosäuresequenz der erhaltenen Klone erwies sich als identisch mit den humanen PN1 (5) und PN3 (10). Im PN1-Klon wurden stille Mutationen der Nucleotid-Sequenz bei Position 222 (A → G), 492 (G → A), 978 (A → G), 1314 (A → G), 1335 (T → A) und 4806 (T → C) erkannt. Im PN3-Klon wurden Mutationen auch bei Position 3393 (C → G) und 5205 (T → C) festgestellt.

2. Etablieren von stabilen, die humanen PN1- und PN3-Natriumkanäle exprimierenden Transfektanten

Es gibt keine Berichte über das Etablieren von stabilen Zellinien, welche humane Natriumkanäle exprimieren, was auf Schwierigkeiten bei der konstitutiven Expression unter physiologisch nichtgeregelten Bedingungen zurückzuführen ist. Um dieses sich beim Stand der Technik stellende Problem zu überwinden, wurde als Weg zur Erzeugung von stabilen, PN1- und PN3- Natriumkanäle vom Typus der peripheren Nerven exprimierenden Transfektanten die Verwendung von induzierbaren Expressionssystemen gewählt.

Stabil transfizierte Zellinien, welche die humanen PN1- und PN3-Natriumkanäle hPN1(#21-43) bzw. hPN3(#2) exprimieren, wurden in CHO-Zellen unter Verwendung eines Tet-off- induzierbaren Expressionssystems etabliert. Die Expression von humanen PN1- und PN3- Natriumkanälen wurde durch Northern-Blot-Analyse untersucht (Fig. 1). In den beiden Transfektanten wurde ein starkes Signal von Grösse ~7.5 kb 24 Stunden nach Entfernung des Tetracyclins vom Kulturmedium, jedoch nicht in Gegenwart davon festgestellt. Die hybridisierbaren RNA-Spezies entsprachen der erwarteten Grösse, um die cDNA für den humanen PN1 oder PN3 zu enthalten. Deren Expressionsspiegel erwiesen sich als am zweiten und dritten Tag nach Entfernung des Tetracyclins allmählich erhöht.

3. Elektrophysiologische Versuchsanordnung zur Untersuchung der Transfektanten

Vollzellen-Ströme wurden untersucht, um das Vorhandensein von funktionellen spannungsgesteuerten Natriumkanälen in den rekombinanten Zellinien am zweiten und dritten Tag nach Entfernung des Tetracyclins aus dem Kulturmedium zu bestätigen. In Zellen hPN1(#21-43) wurden schnell aktivierende und inaktivierende einwärts gerichtete Ströme aufgezeichnet (Fig. 2A). PN1-Ströme wurden beim Potential -40 mV aktiviert, und maximale Ströme wurden bei -10 mV beobachtet (Fig. 2B). Der Mittelwert der Peak-Stromamplituden betrug 3.2 ± 0.8 nA (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 7), und der Mittelwert der Stromdichten betrug 0.32 ± 0.07 nA/pF. Die Halbwerte der maximalen Aktivation (V_1/2) und des Neigungsfaktors betrugen -21.3 ± 1.5 mV bzw. 6.3 ± 0.5 mV (n = 7). Der PN1-Strom wurde durch TTX mit einem IC₅₀ von 32.6 ± 5.3 nM blockiert (Hill-Koeffizient 1.06 ± 0.05; n = 5) (Fig. 2C).

Es ist wichtig zu bemerken, dass die Zellinie hPN1(#21-43) während einer Zeitdauer von mindestens sechs Monaten funktionell stabil blieb (Daten nicht dargestellt).

Die PN3 exprimierenden Zellen hPN3(#2) erzeugten einen einwärts gerichteten Strom, der im Vergleich zu PN1 sogar in Gegenwart von 1 µM TTX langsam inaktiviert wurde (Fig. 3A). Die Schwelle für die Kanalaktivation betrug -20 mV, und maximale Ströme wurden bei +20 mV beobachtet (Fig. 3B). Der Mittelwert der Peak-Stromamplituden betrug 0.87 ± 0.13 nA (n = 12) und der Mittelwert der Stromdichten betrug 0.055 ± 0.012 nA/pF. Die Parameter V_1/2 und Neigung betrugen für PN3 2.50 ± 1.58 mV bzw. 11.3 ± 0.5 mV (n = 12). Die funktionelle Expression des humanen PN3-Natriumkanals in dieser Zellinie erfuhr keine Änderung nach mindestens acht Zellen-Subkultivierungen.

Obwohl bekannt ist, dass CHO-Zellen eine endogene Na⁺-Kanalaktivität aufweisen, welche TTX-sensitiv ist, betrug die Peak-Stromamplitude der endogenen Na⁺-Kanalaktivität selten mehr als 0.2 nA, was zeigt, dass die beobachteten Ströme grösstenteils von den rekombinanten Na⁺- Kanälen vermittelt wurden.

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Claims

1. Zellinie, die an ihrer Oberfläche einen oder mehrere rekombinante Natriumkanäle von peripheren Nerven (PN) stabil exprimiert.

2. Zellinie nach Anspruch 1, bei welcher der genannte Natriumkanal den Natriumkanal 1 vom Typus der peripheren Nerven (PN1) umfasst.

3. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei welcher der genannte Natriumkanal den Natriumkanal 3 vom Typus der peripheren Nerven (PN3) umfasst.

4. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher der genannte Natriumkanal ein Protein mit der Aminosäure-Sequenz wie bei Genbank-Zugangsnummer X82835 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfasst.

5. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher der genannte Natriumkanal ein Protein mit der Aminosäure-Sequenz wie bei Genbank-Zugangsnummer AF117907 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon umfasst.

6. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher die genannte Zellinie einen rekombinanten humanen Natriumkanal vom Typus der peripheren Nerven exprimiert.

7. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die von der CHO-Zellinie deriviert ist.

8. CHO-Zellinie, die an ihrer Zelloberfläche einen rekombinanten humanen PN1-Natriumkanal stabil exprimiert.

9. CHO-Zellinie, die an ihrer Zelloberfläche einen rekombinanten humanen PN3-Natriumkanal stabil exprimiert.

10. Nucleinsäure, welche einen rekombinanten humanen PN-Natriumkanal oder rekombinante humane PN1-Natriumkanäle codiert.

11. Nucleinsäure nach Anspruch 10, bei welcher die genannte Nucleinsäure gekennzeichnet ist durch eine Nucleinsäure-Sequenz, welche die Sequenz der Genbank-Zugangsnummer X82835 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon oder eine auf den degenerierten Code zurückzuführende Variante umfasst.

12. Nucleinsäure nach Anspruch 10, bei welcher die genannte Nucleinsäure gekennzeichnet ist durch eine Nucleinsäure-Sequenz, welche die Sequenz der Genbank-Zugangsnummer AF117907 oder ein funktionelles Derivat oder Fragment davon oder eine auf den degenerierten Code zurückzuführende Variante umfasst.

13. Verfahren zur Herstellung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

a) Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher eine für einen PN-Natriumkanal spezifische DNA umfasst;
b) Transfektion einer geeigneten Zellinie mit dem genannten Expressionsvektor;
c) Screening der genannten Zellinie nach einer stabilen Transfektion unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem die genannte Zellinie cotransfiziert ist mit zwei oder mehr der genannten Expressionsvektoren, von denen jeder eine DNA umfasst, die für einen anderen PN-Natriumkanal spezifisch ist.

15. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Identifikation von PN- Natriumkanal-Agonisten.

16. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Identifikation von PN- Natriumkanal-Antagonisten oder -Modulatoren.

17. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem Hochdurchsatz screening(HTS)-Format.

18. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einer elektrophysiologischen Untersuchung mit einem Agonisten, Antagonisten oder Modulator eines PN-Natriumkanals, bei welcher Membranströme gemessen werden.

19. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einer Natriumkanal- Bindungs-Untersuchung.

20. Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einer elektrophysiologischen Untersuchung, bei welcher die intrazelluläre Menge eines einwertigen Ions gemessen wird.

21. Verfahren zur Identifikation eines Agonisten, Antagonisten oder Modulators eines PN- Natriumkanals, bei welchem eine Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einer Testsubstanz inkubiert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, weiter gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) es wird ein Membranstrom gemessen;
b) der genannte Membranstrom wird mit dem Membranstrom verglichen, der für die genannte Zellinie nach einer Inkubation mit einer bekannten Referenz oder in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, bei welchem das genannte Verfahren gekennzeichnet ist durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) eine Zellinie wird nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem bekannten Agonisten inkubiert, der mit einem Reporter gekoppelt ist;
b) die genannte Zellinie wird mit einer Testsubstanz inkubiert;
c) es wird die Verdrängung des mit dem Reporter gekoppelten Agonisten durch die Testsubstanz gemessen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, bei welchem das genannte Verfahren eine Hochdurchsatzscreening-Untersuchung (HTS) ist.

25. Agonist, Antagonist oder Modulator eines PN-Natriumkanals, der mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24 identifizierbar ist.

26. Agonist, Antagonist oder Modulator nach Anspruch 25, bei welchem der genannte Agonist, Antagonist oder Modulator nicht aus der Gruppe Lidocain, Mexiletin und TTX ausgewählt ist.

27. Arzneimittelzusammensetzung, die einen Agonisten, Antagonisten oder Modulator eines PN- Natriumkanals nach Anspruch 25 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

28. Verwendung eines Agonisten, Antagonisten oder Modulators eines PN-Natriumkanals nach Anspruch 25 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen Schmerz- Störungen.