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Hintergrund der Erfindung
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Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanäle
stellen eine Familie Ligand-gesteuerter
Chlorid-Kanäle
bzw. -Ionenschleusen dar, die einzigartig für Wirbeltiere sind. Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanäle
sind geklont worden aus Caenorhabditis elegans (Cully et al. (1994)
Nature 20371;
US 5,527,703 ),
Drosophila melanogaster (Cully et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:
20187, und
US 5,693,492 ),
Haemonchus contortus (Delany et al. (1998) Mol. Biochem. Parasit.
97: 177), Lucilia cuprina (GenBank-Hinterlegungs-Nr. AAC 31949)
und aus Schistocerca americana (Cohen et al. (1999) 29th Annual
Neuroscience Meeting, S. 199). Die aus C. elegans, D. melanogaster
und S. americana isolierten Klone sind funktionell in Xenopus oocytes
exprimiert worden und haben ergeben, dass sie durch Glutamat und
Avermectin aktiviert werden (Arena et al. (1991) Molecular Pharm.
40: 368; Arena et al. (1992) Molecular Brain Research 15: 339;
US 5,693,492 ;
US 5,527,703 ; Cohen et al., oben).
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Weil
Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle
spezifisch für
Wirbeltiere sind, stellen die Kanäle ein Ziel für Insektizide
dar. Insbesondere sind die Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanäle das Ziel
der Avermectin-Klasse von Insektiziden. Avermectine sind natürlich vorkommende
und synthetische makrocyclische Lactone, die in breitem Umfang bei
der Behandlung von Parasiten und Insekten zur Anwendung gelangen.
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Insekten
der Ordnung Lepidoptera (Schmetterlinge) stellen signifikante Schädlinge und
insbesondere stellen die Larven zerstörerische Entlauber dar. Ferner
sind Schmetterlingsschädlinge
in typischer Weise härter
als Diptera (Zweiflügler)
steuernd zu bekämpfen.
Demzufolge besteht Bedarf, sichere und spezifische Insektizide gegen
Schmetterlingsschädlinge
zu identifizieren und zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung ist auf
diese Bedarfslage gerichtet, wobei isolierte Nucleinsäuren, die
einen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodieren,
rekombinante Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle und ein
Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, die die Kanal-Aktivität modulieren,
bereitgestellt und angegeben werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Durch
die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung
von Mitteln angegeben, die die Aktivität des Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
modulieren.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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In 1 sind
elektrophysiologische Daten aufgetragen, die den Effekt von Glutamat
auf einen in Oocytes exprimierten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal darstellen
und belegen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Für die vorliegende
Erfindung können
isolierte Nucleinsäuren
verwendet werden, die Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle eincodieren.
Eine isolierte Nucleinsäure,
die einen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal eincodiert, ist hierin als eine Nucleinsäure definiert,
die aus einem Insekt der Ordnung Schmetterlinge isolierbar und befähigt ist,
einen funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal einzucodieren.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Nucleinsäure aus
Heliothis isolierbar. In einer noch bevorzugteren Ausgestaltung
ist die Nucleinsäure
aus Heliothis virescens isolierbar. Ein funktioneller Glutamat-gesteuerter
Chlorid-Kanal ist hierin als ein Protein definiert, das die Fähigkeit
aufweist, Glutamat zu binden und dadurch den Chlorid-Fluss in einer
den Kanal exprimierenden Zelle zu mediieren.
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Die
isolierte Nucleinsäure
kann DNA oder RNA sein, einschließlich cDNA und mRNA. In einer
bevorzugten Ausgestaltung weist die isolierte Nucleinsäure eine
Sequenz auf, die die Aminosäure-Sequenz
von SEQ ID NO: 14 eincodiert. Der einschlägige Durchschnittsfachmann
mit Kenntnissen des genetischen Codes vermag DNA- und RNA-Sequenzen
zu bestimmen, die die in SEQ ID NO: 14 festgelegte Aminosäure-Sequenz eincodiert.
Ferner kann die Sequenz ausgewählt
werden, um die Expression in einem besonderen Wirtsorganismus durch
Anwendung bekannter bevorzugter Codons für den Wirtsorganismus der Wahl
zu optimieren.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfasst die isolierte Nucleinsäure die
in SEQ ID NO: 13 festgelegte Sequenz. In einer weiteren bevorzugten
Ausgestaltung umfasst die isolierte Nucleinsäure die Sequenz der Nucleotide
144 bis 1484 von SEQ ID NO: 13. Fragmente einer Nucleinsäure mit
der Sequenz SEQ ID NO: 13, die die Fähigkeit beibehalten, einen funktionellen
Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal einzucodieren,
sind ebenfalls für
die vorliegende Erfindung verwendbar.
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Für die vorliegende
Erfindung können
auch Nucleinsäuren
verwendet werden, die aus Schmetterlingen isolierbar sind und die
Befähigung
zur Hybridisierung unter hohen Stringenzbedingungen zum Komplement
einer Nucleinsäure
mit der Sequenz der Nucleotide 144 bis 1484 von SEQ ID NO: 13 aufweisen.
Nucleinsäure-Hybridisierungsbedingungen
sind den einschlägigen
Durchschnittsfachleuten bekannt und z.B. in Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning – A
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, offenbart.
Hohe Stringenzbedingungen sind hierin als 0,1 × Standard-Salzzitrat (SSC), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
bei 60°C
definiert.
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In
einer weiteren Ausgestaltung sind isolierte Nucleinsäuren mit
mindestens ca. 80%, vorzugsweise mit mindestens ca. 90% und noch
bevorzugter mit mindestens ca. 95% Sequenzidentität zur Nucleinsäure mit der
Sequenz der Nucleotide 144 bis 1484 von SEQ ID NO: 13 für die vorliegende
Erfindung verwendbar. Sequenzidentität wird mit dem Programm Clustal
W, beschrieben von Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673,
bestimmt und kann mit der EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl.html)
berechnet werden. Die Fähigkeit
der isolierten Nucleinsäure
zur erfindungsgemäßen Verwendung
zum Eincodieren eines funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
kann mit den unten beschriebenen Funktionsassayverfahren bestimmt
und ermittelt werden.
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Ein
Protein mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 14 weist Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanal-Aktivität auf. Die
Analyse der Aminosäure-Sequenz
und die Anordnung mit der Sequenz des Drosophila-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
zeigt an, dass die Sequenz von SEQ ID NO: 14 vier Membran-Spannregionen
bei den Aminosäuren
246 bis 268, 274 bis 293, 309 bis 328 und 415 bis 435 enthält. Die
Amino-terminalen 20 bis 30-Aminosäuren codieren
ein Signalpeptid. Aminosäureänderungen
in der Signalpeptiddomäne
sind tolerierbar, solange die Fähigkeit
des Proteins zum Inserieren in eine ausgewählte Zellmembran beibehalten
bleibt. Die Durchschnittsfachleute vermögen geeignete Modifikationen
der Sequenz des Signalpeptids und ebenso die Nucleinsäure-Sequenz
zu bestimmen, die die modifizierte Signalpeptiddomäne eincodiert.
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Die
Nucleinsäuren,
die für
die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind mit einer Nucleinsäure mit
der Sequenz von SEQ ID NO: 13 oder einem Fragment davon erhältlich,
um als Sonde einer Schmetterlings-cDNA-Bibliothek zu fungieren. Solche Bibliotheken
sind durch gut bekannte Verfahren erstellbar, beschrieben z.B. in
Sambrook et al., oben, oder können
im Handel erhalten werden. Die Identität der Nucleinsäure kann
durch Nucleotid-Sequenzierung oder durch Expression und Funktionsanalyse
bestätigt
werden, wie nachfolgend beschrieben.
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Für die vorliegende
Erfindung können
Vektoren verwendet werden, die die oben beschriebenen isolierten
Nucleinsäuren
umfassen. Im Vektor ist die Nucleinsäure, die einen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal eincodiert, operativ mit geeigneten Transkriptions-
und/oder Translations-Regulatorelementen
verbunden, um die Expression des Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
in einer geeigneten Wirtszelle zu bewerkstelligen. Die Regulatorelemente
können
aus Säugetier-,
Mikroben-, Virus- oder Insektengenen abgeleitet sein und z.B. Promotoren,
Verstärker,
Transkriptions- und Translations-Initiierungssequenzen, Terminierungssequenzen,
Replikationsursprünge
und Sequenzen einschließen,
die Führungs-
und Transportsequenzen eincodieren. Geeignete Regulatorelemente
werden zur optimalen Expression in einer gewünschten Wirtszelle selektiert.
Geeignete Expressionsvektoren können
mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren erstellt werden,
und Vektoren, in die gemäß der Erfindung
die Nucleinsäure
inseriert werden können,
sind ebenfalls im Handel verfügbar.
Rekombinante virale Vektoren, einschließlich Retrovirus-, Baculovirus-,
Parvovirus- und Densovirus-Vektoren,
sind besonders bevorzugt.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst der Vektor einen starken
konstitutiven oder induziblen Promotor, der operativ mit einer einen
Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodierenden Nucleinsäure verbunden
wird. Geeignete Promotoren sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt
und ohne Weiteres verfügbar,
wobei sie z.B. den Polyhedrin-Promotor (Kitts et al., 1993, Bio
Techniques 14: 810), den Wärmeschock-Promotor
(Stellar et al., 1985, EMBO J. 4: 167) und den Metallothionein-Promotor
(Kaufman et al., 1989, Cell 59: 359) einschließen. Expressionsvektoren können mit
gut bekannten molekularbiologischen Verfahren erstellt werden, wie
z.B. beschrieben in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., oder in einer Vielzahl von Laborhandbüchern über rekombinante
DNA-Technologie, die in breitem Umfang verfügbar sind. Expressionsvektoren,
in die die oben beschriebenen Nucleinsäuren unter der Steuerung eines
geeigneten Promotors geklont werden können, sind ebenfalls im Handel
verfügbar.
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Für die vorliegende
Erfindung sind Wirtszellen, die die oben beschriebenen Vektoren
enthalten, verwendbar. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch
sein, einschließlich
Bakterien, Hefe, Insekten oder Säugetiere.
Insekten- und Säugetierzellen
sind bevorzugt. Besonders bevorzugte Wirtszellen schließen Insekten-Zelllinien
ein, einschließlich
z.B. Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Wirtszellen können mit
den oben beschriebenen Expressionsvektoren mit dem Durchschnittsfachmann
gut bekannten Verfahren transformiert, transfiziert oder infiziert
werden. Eine Transfizierung kann mit bekannten Verfahren, wie mit
einer Liposom-mediierten Transfizierung, Calciumphosphat-mediierten
Transfizierung, Mikroinjektion und mit einer Elektroporation, durchgeführt werden.
Permanent transformierte Insekten-Zelllinien sind besonders bevorzugt.
Beispielsweise können
Insekten-Zelllinien wie eine Drosophilla-Zelllinie SH1 mit den oben
beschriebenen Expressionsvektoren mit im Handel verfügbarem Lipofectin
(GIBCO-BRL) transformiert werden, um permanent transformierte Zelllinien
zu ergeben, die einen funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal exprimieren.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Vektor so entworfen,
dass die Expression des Proteins induzierbar ist.
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Expressionssysteme
unter Verwendung von Baculovirus-Vektoren und Insekten-Wirtszellen
sind bevorzugt. Die Verwendung von Baculoviren als rekombinante
Expressionsvektoren zur Infizierung von Schmetterlings-Insektenzellen ist
im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in Luckow et al.
(1988) Bio/Technology 6: 47–55,
und Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42: 177–199, beschrieben. Die Baculovirus-Vektoren enthalten
im Allgemeinen einen starken Baculovirus-Promotor, der operativ
mit einer oben beschriebenen Nucleinsäure so verbunden wird, dass
der Promotor die Expression des Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
dirigiert. Baculovirus-Polyhedrin-Promotoren wie der Autographa
californica-Nuclearpolyhydrosis-Virus-Polyhedring-Promotor sind
bevorzugt.
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Die
oben beschriebenen Baculovirus-Expressionsvektoren werden durch
Inserieren der den Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
eincodierenden Nucleinsäure
stromabwärts
vom Polyhedrin-Promotor in einen Baculovirus-Transfervektor, z.B.
in BacPac8, verfügbar
von Clontech, oder in Bac-zu-Bac, verfügbar von Life Technologies,
hergestellt. Baculovirus-Transfervektoren
enthalten ferner flankierende Baculovirus-Sequenzen, die eine homologe
Rekombination zwischen dem Transfervektor und Baculovirus-DNA bei einer
Co-Transfizierung ermöglichen.
Der Transfervektor, der die oben beschriebene Nucleinsäure enthält, und virale
DNA werden zur Co-Transfizierung der Insektenzellen verwendet. In
einer bevorzugten Ausgestaltung sind die Insektenzellen Spodoptera.
Spodoptera frugiperda-Zellen, einschließlich Sf9, werden ganz besonders in
Betracht gezogen. Während
der Co-Transfizierung
resultiert die homologe Rekombination im Transfer einer Expressionskassette,
die den Polyhedrin-Promotor und die oben beschriebene Nucleinsäure enthält, zum
Polyhedrin-Ort der viralen DNA. Das entstandene rekombinante Virus
wird verwendet, um virale Vorräte
mit Standardverfahren zu erzeugen. Insekten-Wirtszellen werden mit
dem rekombinanten Virus infiziert, um Insektenzellen zu produzieren,
die den Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal exprimieren.
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Für die vorliegende
Erfindung ist ein rekombinanter Glutamat-gesteuerter Chlorid-Kanal verwendbar. Der
rekombinante Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanal kann in einer Membran-Zubereitung isoliert werden
oder in der Zellmembran der Wirtszelle vorliegen, worin er rekombinant
produziert worden ist. Gesamtzellen und Membran-Zubereitungen, die
den rekombinanten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
umfassen, werden ganz besonders in Betracht gezogen. Der rekombinante
Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanal eignet sich, z.B.
potenzielle Insektizide durch spezifische Bindungs- oder Funktionsassayverfahren
auszusieben.
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Der
rekombinante Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanal wird
durch Transformieren, Transfizieren oder Infizieren einer geeigneten
Wirtszelle mit einem Expressionsvektor aus einer Nucleinsäure, die
einen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodiert,
durch Kultivieren der Wirtszelle unter zur Expression geeigneten
Bedingungen und gegebenenfalls durch Rückgewinnen des rekombinanten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanals hergestellt. Eine geeignete Wirtszelle ist jede Zelle,
worin die den Transporter eincodierende Nucleinsäure exprimiert werden kann,
um einen funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal zu ergeben.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der rekombinante Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanal in Insektenzellen, vorzugsweise in Spodoptera frugiperda 9
(Sf9), durch Infizieren der Insektenzellen mit einem rekombinanten
Virus, worin die oben beschriebenen Nucleinsäure unter der Steuerung eines
zur Verwendung in Sf9-Zellen
geeigneten Promotors, wie eines Polyhedrin- oder TE1-Promotors,
steht, und durch Kultivieren der Zellen unter Bedingungen hergestellt,
die sich zur Expression des rekombinanten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals
eignen. In einer weiteren Ausgestaltung wird der rekombinante Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanal in permanent transformierten Zelllinien hergestellt,
wie oben beschrieben.
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Der
funktionelle Schmetterlings-Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanal kann
vom Durchschnittsfachmann mit Funktionsassayverfahren identifiziert
werden. Eine erschöpfende Übersicht
von Techniken und Protokollen ist gegeben in Rudy et al., Hrsg.
(1992) Methods in Enzymology 207, Academic Press Inc., San Diego,
CA. Beispielsweise sind 2-Elektroden-Spannung-Klammer-Auftragungen von
Wirtszellen oder Oozyten, die den Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
exprimieren, verwendbar, um einen Chlorid-Fluss bezüglich seiner
Reaktion auf die Anwendung von Glutamat oder Ivermectinphosphat
zu bewerten. Dosis-abhängige Glutamat-verursachte
Stromstärken
zeigen das Vorliegen eines funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals an. Auch zeigt
die Aktivierung einer Membranstromstärke durch ca. 100 μmol Glutamat
oder 1 μmol Ivermectinphosphat
den funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal an.
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Für die vorliegende
Erfindung sind ein Amphibien-Oocyt, umfassend eine Nucleinsäure, die
den funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodiert,
und ein Amphibien-Oocyt verwendbar, der den funktionellen Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal exprimiert. Die Oocyten eignen sich als System zum
Aussieben potenzieller Insektizide, die gegen Insekten der Ordnung
Schmetterling verwendet werden können.
Solche Oocyten sind mit den oben beschriebenen Nucleinsäuren und
im Stand der Technik bekannten Verfahren herstellbar. In einer bevorzugten
Ausgestaltung ist der Oocyt Xenopus laevis-Oocyt. Beispielsweise
können
Expressionsvektoren, die cDNA enthalten, die den Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal eincodieren, unter der Steuerung eines starken Promotors
in die Kerne von Oocyten gespritzt werden, worauf die Oocyten 1
bis mehrere Tage lang inkubiert werden, und es erfolgt dann die
Bewertung hinsichtlich des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von funktionellem
Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal. Alternativ dazu, kann mRNA in
vitro aus cDNA, die den Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodiert,
synthetisiert und in Oocyten gespritzt werden, worauf die Bewertung
bezüglich
des Vorliegens oder Vorhandenseins der funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanäle erfolgt,
wie hierin oben beschrieben.
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Durch
die vorliegende Erfindung werden auch Verfahren zur Identifizierung
von Mitteln angegeben und zur Verfügung gestellt, die die Aktivität eines
Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals modulieren. Das
Mittel kann ein Agonist, d.h., es täuscht die Wirkung von Glutamat
durch Aktivierung des Chlorid-Flusses vor, oder ein Antagonist sein,
d.h., es senkt den Glutamat-aktivierten Glutamat-Fluss ab. Das Mittel
kann eine Nucleinsäure,
ein Peptid, Protein, ein Nicht-Protein-Organomolekül oder jedes
weitere Molekül
sein, das befähigt
ist, die Aktivität
des Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals zu modulieren.
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Das
Verfahren zur Identifizierung eines Agonist umfasst die Anwendung
des vermuteten Agonist auf einen Xenopus-Oocyt, eine Zelle oder
eine Membran, die den Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
exprimieren, in der Gegenwart von Chlorid-Ionen und die Messung
des Chlorid-Flusses, worin der Fluss von Chlorid den Agonist anzeigt.
Das Verfahren zur Identifizierung eines Antagonist umfasst die Anwendung
von Glutamat auf Xenopus-Oocyt oder eine Zelle oder Membran, die
den Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal exprimieren,
in der Gegenwart von Chlorid-Ionen und die Messung des Chlorid-Flusses,
die Anwendung des vermuteten Antagonist und dann z.B. nach ca. 1
min die Anwendung von Glutamat auf die Zelle oder Membran und die
Messung des Chlorid-Flusses und den Vergleich des in der Gegenwart von
Glutamat allein erhaltenen Chlorid-Flusses mit dem unter ähnlichen
Bedingungen in der Gegenwart von sowohl dem vermuteten Antagonist
als auch von Glutamat erhaltenen Fluss, worin ein Absinken des in
der Gegenwart des vermuteten Antagonist beobachteten Chlorid-Flusses
relativ zum in der Gegenwart von Glutamat allein beobachteten Fluss
den Antagonist anzeigt. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird
der Chlorid-Fluss mit Spannung-Klammer-Elektrophysiologie gemessen. In einer
weiteren bevorzugten Ausgestaltung ist die Zelle eine rekombinante
Baculovirus-infizierte Sf9-Zelle oder eine permanent transformierte
Zelllinie. In noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung betragen
die Konzentrationen der Agonisten, Antagonisten und von GABA ca.
0,1 nM bis 1,0 mM.
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Die
Agonisten und Antagonisten gegen den Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
können
auch durch Ligand-Bindungsassayverfahren identifiziert werden. Die
Agonisten und Antagonisten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, radiomarkierte
Liganden zu verschieben, die dafür
bekannt sind, als Agonisten bzw. Antagonisten zu wirken. Der rekombinante
Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanal, der in einem Oocyt, einer Zelle
oder Membran (vorzugsweise in einer Membran) vorliegt, wird mit
radiomarkiertem Ligand und unmarkiertem Kandidat-Agonist oder -Antagonist
inkubiert. Nach Inkubation wird die Inkubationsmischung filtriert,
und es wird die auf den Filtern zurückgehaltene Radioaktivität mit im
Stand der Technik bekannten Verfahren, z.B. mit Flüssig-Szintillationszählung, gemessen.
Die Fähigkeit
der Kandidatverbindung zur Inhibierung der spezifischen Bindung
des radiomarkierten Ligand stellt das Maß für die Agonist- oder Antagonist-Aktivität der Verbindung
dar. Geeignete Liganden schließen
Glutamat und Ivermectinphosphat. ein.
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Mittel,
die durch die vorgenannten Verfahren identifiziert sind, können als
Insektizide verwendet werden. Mittel, die mit den vorliegenden Verfahren
identifiziert sind, können
bezüglich
ihrer insektiziden Aktivität mit
im Stand der Technik bekannten in vitro- und in vivo-Verfahren bewertet
werden.
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Für die vorliegende
Erfindung ist eine Zusammensetzung verwendbar, die einen rekombinanten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal in einer Zellmembran umfasst. Die Zusammensetzung kann
eine Membran-Zubereitung,
einschließlich
einer gefriergetrockneten Membran-Zubereitung, oder eine intakte
Zelle oder ein Oocyt sein, die den funktionellen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal exprimieren. Die Zusammensetzung ist beispielsweise
geeignet, potenzielle Insektizide durch Funktions- oder spezifische
Bindungsassayverfahren auszusieben. Die Zusammensetzung kann ferner
geeignete Träger
oder Verdünnungsmittel,
einschließlich
von z.B. physiologischen Puffern, umfassen.
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Für die vorliegende
Erfindung ist auch ein Kit zur Identifizierung von Mitteln verwendbar,
die die Aktivität
eines Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanals modulieren. Der Kit enthält ein erstes Behältnis, das
einen rekombinanten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
in einer Zellmembran enthält.
Die Membran kann in der Form einer Membran-Zubereitung, einschließlich einer
gefriergetrockneten Membran-Zubereitung, oder einer Insektenzelle
oder eines Oocyt vorliegen, die den funktionellen Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal exprimieren. Der Kit kann ferner gegebenenfalls Glutamat
enthalten. Die oben beschriebenen Zusammensetzungen und Kits eignen
sich zur Identifizierung von Insektiziden.
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Die
nun folgenden nicht-einschränkenden
Beispiele dienen einer weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 1
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RNA-Isolierung
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Heliothis
virescens-Embryo wurde isoliert aus Eiern, kurz vor dem Schlüpfen, erhalten
von Rhone-Poulenc-in-Haus-Insektarium, und Heliothis virescens-Muskel
wurden erhalten durch Aufschneiden von frühen 5. Instar- Heliothis virescens-Larven
(5. Häutungserscheinungsform),
um den Fettkörper,
die Gedärme und
das Zentralnervensystem zu beseitigen. Die Eier und die verbliebenen
Larvenhäute
wurden in flüssigem Stickstoff
gefroren und zu einem Pulver vermahlen. Die Pulver wurden zu Lysepuffer
gegeben und homogenisiert, bevor sie gemäß den Vorschriften des Herstellers
zur Gesamt-RNA-Isolierung
mit einem Poly(A) PureTM-Kit von Ambion
den weiteren Verfahrensstufen unterzogen wurden. Poly A+-RNA
wurde mit zweimaligem Durchlauf durch eine Oligo-dT-Säule selektiert.
Die aus der Säule
gewonnene RNA wurde in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser
aufgelöst.
Die RNA wurde mit Spektrofotometrie quantitativ bestimmt und an
einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt, um ihre Integrität vor Anwendung
in einer RT-PCR- und cDNA-Bibliothek-Konstruktion zu überprüfen.
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PCR mit Degenerat-Primern:
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2
Degenerat-Oligonucleotide mw01 und mw02 wurden entworfen und aus
hoch konservierten Regionen, die in Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanalfamilien
vorzufinden sind, gemäß der Aminosäure-Sequenz
für Drosophila
melanogaster GluCl (Cully et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 20187),
Caenorhabditis elegans GluCl-α und
für C.
elegans GluCl-β (Cully
et al. (1994) Nature 20: 371) synthetisiert. Der Primer mw01 weist
die Sequenz 5'-GGATGCC(ATGC)GA(TC)(TC)T(ATGC)TT(TC)TT-3' (SEQ ID NO: 1) auf.
Der Primer mw02 weist die Sequenz 5'-T(ATGC)A(AG)CCA(AG)AA(ATGC)(GC)(AT)(ATGC)ACCC-3' (SEQ ID NO: 2) auf.
Der Primer mw01 wurde stromaufwärts
der Transmembran (TM)-Domäne
1 angeordnet, während
stromabwärts
der Primer mw02 in der TM-Domäne
1 angeordnet wurde. Der Primer mw02 wurde verwendet, um die Erststrang-cDNA
aus mRNA, isoliert aus Heliothis-Embryo, mit einem Boehringer Mannheim-1.
Strang-cDNA-Synthesekit zur RT-PCR zu synthetisieren. Die cDNA wurde
als Templat für
einen Heißstart-PCR-Mix
(100 μL)
verwendet, enthaltend: 0,8 mM dNTP's, 2 mM MgCl2,
1,2 pmol/μL
Degenerat-Primer
und 5 E Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Amplifikation wurde
mit 35 Denaturierungszyklen 1 min lang, durch Verschmelzen bei 53°C 1 min lang
und durch Verschmelzen bei 72°C
1 min lang durchgeführt.
Die Denaturierungsstufe des ersten Zyklus dauerte 5 min und die
Verlängerungsstufe
des letzten Zyklus dauerte 10 min (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler
480) (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
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PCR
erzeugte ein 451-Basenpaar (bp)-Fragment, das in dem pCR-Blunt-Vektor (Invitrogen)
geklont wurde, um pE6 zu produzieren, worauf sequenziert wurde.
Das amplifizierte Fragment wies die folgende Sequenz auf:
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Schnelle Amplifikation
von cDNA-Enden (RACE-PCR):
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RACE-Reaktionen
(Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998), angewandt
zum Erhalt der 5'-
und 3'-Enden der
Heliothis virescens-mRNA, wurden mit synthetisierter doppelsträngiger cDNA
als das Templat durchgeführt.
2 μg PolyA-mRNA
aus entweder Heliothis virescens-Embryo
oder -Muskel wurden verwendet, um cDNA mit einem Marathon-cDNA-Amplifikationskit
(CLONTECH) gemäß den Vorschriften
des Herstellers zu synthetisieren. Spezifischer Primer mw03, abgeleitet
aus 451-bp-Fragment, mit der Sequenz
5'-CCTGCACCGGGTCGCCTTCCTTCC-3' (SEQ ID NO: 4) zusammen
mit dem Adaptor-Primer
(AP1, 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3') (SEQ ID NO: 5),
welche im Kit bereitgestellt waren, wurden zur Amplifikation des
5'-CDNA-Endes verwendet.
Der Primer mw04, abgeleitet aus 451-bp-Fragment, mit der Sequenz
5'-TACAGCATCCGAA
TCTCCTTGACGC (SEQ ID NO: 6) zusammen mit dem Primer AP1 wurden zur Amplifikation
des 3'-cDNA-Endes
verwendet. Die PCR-Reaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie
im obigen Abschnitt durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass "touchdown
PCR" angewandt wurde,
welche mit 5 Denaturierungszyklen bei 94°C 30 s lang, durch Verschmelzen
und Verlängern
bei 72°C
4 min lang, mit 5 Denaturierungszyklen bei 94°C 30 s lang, durch Verschmelzen
und Verlängern
bei 70°C
4 min lang und mit 25 Denaturierungszyklen bei 94°C 20 s lang
und durch Verschmelzen und Verlängern
bei 68°C
4 min lang durchgeführt
wurden. Die Denaturierungsstufe des ersten Zyklus dauerte 1 min
bei 94°C.
1/10 der PCR-Reaktion (10 μL)
wurde an einem 1,2%-Agarosegel, enthaltend 1 μg/mL Ethidiumbromid, aufgetrennt.
Die amplifizierten Fragmente aus sowohl 5'RACE als auch aus 3'RACE wurden in pCR2.1-Vektor (Invitrogen)
geklont, um Plasmide zu produzieren, die mit p5'E4 bzw. p3'M5 bezeichnet sind. Das Fragment in
p5'E4 weist die
folgende Sequenz auf:
-
Das
Fragment in p3'M5
weist die folgende Sequenz auf:
-
Erzeugung einer Voll-Länge-cDNA
durch PCR:
-
Die
5'- und 3'-Ende-genspezifischen
Primer (GSP) wurden auf der Grundlage der aus den vorherigen 5'- und 3'-RACE-Produkten erhaltenen
Sequenz entworfen. 5'-GSP1
weist die folgenden Sequenzen auf:
5'-GCTGAGCATTGCGAACTACGCTTCAAC-3' (SEQ ID NO: 9) und
3'-GSP2 weist die
folgenden Sequenzen auf: 5'-TAACACCGCGTGGATCCAAGCTACG-3' (SEQ ID NO: 10).
Voll-Länge-cDNAs
aus sowohl Heliothis-Embroy als auch -Muskel wurden mit 5'-GSP1 und 3'-GSP2 in einer Langdistanz-PCR-Reaktion
erzeugt, wobei die folgenden Zyklusbedingung angewandt wurde: 1
Denaturierungszyklus bei 94°C
1 min lang und 25 Denaturierungszyklen bei 94°C 30 s lang und Verschmelzen
und Verlängern
bei 72°C
5 min lang mit pfu als Polymerase. Die amplifizierten Fragmente
aus sowohl Heliothis-Embryo als auch -Muskel wurden in pCR2.1-TOPO-Vektor
(Invitrogen) geklont, um die Plasmide HEG3E(4)-2 und HEGM(1)-3 zu
erzeugen. HEG3E(4)-2 weist die folgenden Sequenzen (SEQ ID NO: 11)
auf:
-
HEGM(1)-3
weist die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 12) auf:
-
Beispiel 2
-
Isolierung eines Voll-Länge-Klons
durch Sieben einer cDNA-Bibliothek:
-
Verglichen
mit den Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal-Klonen aus Drosophila
und C. elegans weist der Klon HEG3(E)-2 einen Stopp-Codon in der
M4-Transmembrandomäne
auf, wogegen der Klon HEGM(1)-3 eine ungewöhnlich lange 3'-Sequenz nach der
M4-Transmembrandomäne
aufweist. Es ist unklar, ob diese 2 Klone aus unterschiedlicher
RNA-Spleißung
oder wegen Fehlern resultierten, die durch PCR-Polymerase während der
RACE-Reaktion eingeführt wurden.
cDNA-Bibliotheken von Heliothis virescens-Embryo und -Muskel wurden mit 7,5 μg jeder isolierten
polyA-mRNA mit einem cDNA-Synthesekit von Stratagene erstellt. Die
cDNAs wurden gemäß den Vorschriften
des Herstellers hergestellt und dann in den λ-ZAP-Expressionskloniervektor geklont und
mit Gigapack III Gold-Packungssystem (Stratagene) gemäß den Vorschriften
des Herstellers gepackt. So wurden 2 nicht-amplifizierte Bibliotheken
von 5 × 105 Rekombinanten hergestellt und dann amplifiziert.
-
Klon-HEG3(E)-2-Insert
wurde aus seinem Vektor durch SacI-Enzym geschnitten und mit
32P mit einem Random Primed DNA-Markierungskit
von Boehringer Mannheim (Kat. #1004760) markiert. Ein Teil der amplifizierten
Heliothis virescens-Embryo-Bibliothek wurde auf 10 große 150-mm-NZY-Agarplatten
mit 50.000 pfu/Platte plattiert. Phagenpartikel wurden auf Nitrocellulose-Membranen übertragen.
Die Membranen wurden in einer 1,5 M NaCl- und 0,5 M NaOH-Denatuierungslösung 5 min
lang denaturiert, in einer 1,5 M NaCl- und 0,5 M Tris-Cl-(pH = 8,0)-Neutralisationslösung 5 min
lang neutralisiert und in einem 0,2 Tris-Cl-(pH = 7,5)- und 2 × SSC-Puffer
2 min lang gespült.
DNA wurde an den Membranen mit einem Stratalinker UV-Vernetzer (CL-100
Ultraviolet Crosslinker, UVP) vernetzt. Eine Vorhybridisierung wurde
in 50 mL-Lösungen,
enthaltend: 25 mL Formamid, 12,5 mL 20 × SSC, 0,5 mL 10% SDS und 5
mL Derhardt-Lösung,
bei 42°C
3 bis 4 h lang durchgeführt.
Markierte Sonden wurden zur Vorhybridisierungslösung bei 1,84 × 10
5 dpm/mL
32P gegeben
und die Hybridisierung bei 42°C
24 h lang fortgesetzt. Die Membranen wurden 2 × 15 min lang unter niedrigen
Stringenzbedingungen (2 × SSC/0,1%
SDS, Raumtemperatur), 2 × 15
min lang unter hohen Stringenzbedingungen (0,2 × SSC/0,1% SDS, 42°C) und 1
Mal 15 min lang unter höheren
Stringenzbedingungen (0,1 × SSC/0,1% SDS,
42°C) gewaschen.
10 positive Klone wurden identifiziert und die Beläge gereinigt,
und sekundäre
und tertiäre
Siebungen wurden mit dem gleichen Primer mit positiven Klonen durchgeführt, um
sicherzustellen, dass jeder positive Belag sehr gut abgetrennt wurde.
Die Phagemiden, enthaltend die Inserte, wurden gemäß der Vorschrift
des Herstellers (Stratagene) herausgeschnitten. 2 Klone, die die
gleichen Voll-Länge-Sequenzen von
Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanälen
aufweisen, wurden mit HEGE2 bezeichnet. Die folgende DNA-Sequenz (SEQ ID NO:
13) für
den Klon HEGE2 wurde bestimmt:
-
Die
Sequenzierung zeigte an, dass HEGE2 einen Voll-Länge-Heliothis virescens-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal-Klon eincodierte, der direktional in die EcoRI- und
XhoI-Stellen von Phagemid pBluescript SK (+/–) geklont wird. Die Codiersequenz
startet bei 144 bp und endet bei 1484 bp, und codiert ein Polypeptid von
444 Aminosäuren
mit der vorausgesagten Sequenz (SEQ ID NO: 14):
-
BLAST-Recherche
-
BLAST-Recherche
(http://www.ncbi.nlm.gov) und Aminosäuresequenz-Vergleich wurden angewandt, um Glutamat-gesteuerte
Chlorid-Kanal-artige Fragmente aus den mit Degenerat-Primern amplifizierten PCR-Produkten,
den PCR-Produkten, erhalten aus RACE und aus aus Embryo-cDNA-Bibliothek
ausgesiebten Klonen, zu identifizieren. BLAST wurde auch angewandt,
um die Orientation und die Position der amplifizierten Produkte
im Vergleich mit der gesamten cDNA-Sequenz zu bestimmen.
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Beispiel 3
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Expression von Nucleinsäure, die
Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal eincodiert, in
Xenopus-Oocyten:
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Messenger-RNA
wurde aus dem cDNA-Templat von HEGE2 durch in vitro-Transkription mit
dem Ambion mMESSAGE mMACHINE IN VITRO TRANSCRIPTION KIT (Ambion
Inc.) produziert. Die mRNA wurde in Oocyten mit dem folgenden Verfahren
gespritzt.
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Frösche wurden
in einer 2 g/L Lösung
von 3-Aminobenzoesäureethylester
30 min lang betäubt,
worauf Oocyten chirurgisch aus der Magenhöhle entfernt wurden. Follikel
wurden mit Kollagenase-Behandlung unter sterilen Bedingungen mit
Standardverfahren abgebaut. Die Oocyten wurden mit 50 nL 1 μg/μL-mRNA mit Glas-Elektroden
gespritzt.
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Nach
einer Inkubation von 24 h wurden 2-Elektroden-Spannung-Klammer-Auftragungen vorgenommen.
Die Auftragungen wurden mit einem Dagan, TEV200-Spannung-Klammer, mit zwischengeschaltetem MacLab4-Datenerwerbssystem
durchgeführt,
das mit der MacLab Chart-Datenerwerbs/Analysen-Software abläuft. Die
Oocyten wurden unter ein Dissektionsskop unter konstanter Verwirbelung
mit Frosch-Saline (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2,
1,8 mM CaCl2 und 10 mM HEPES, pH = 7,5)
mit einer Razel-Spritze-Verwirbelungspumpe, Modell A99-FY, bei 93,9
cc/h positioniert. Glas-Elektroden (A-M Systems Inc., 1,5 mm × 0,86 mm)
wurden mit 3 M KCl befüllt
und der widerstand (als Funktion des Durchmessers und der Kanalöffnung)
zwischen 0,7 und 1,5 Megaohm gemessen. Beide Elektroden wurden in
den Oocyt an gegenüberliegenden
Seiten eingeführt.
Das sich ergebende Potenzial wurde aufgetragen und die Spannungsklammer
aufgedreht. Die Oocyten wurden bei einem Ruhepotenzial bei –80 mV gehalten.
Vergleichsreaktionen von Glutamat wurden durch Anhalten der Verwirbelung
von Saline und Verwirbeln mit einer bekannten Konzentration von Glutamat
in Frosch-Saline erhalten. Der Durchschnittswert mehrerer Glutamat-Anwendungen
wurde als maximale Chlorid-Stromstärke für diese
besondere Glutamat-Dosis herangezogen. Der Effekt von 100 μmolarem Glutamat
auf den in Xenopus-Oocyten exprimierten Schmetterlings-Glutamat-gesteuerten
Chlorid-Kanal ist in 1 dargestellt. Die Glutamat-Anwendung
ist mit dem "an" markierten Pfeil
angezeigt. Die Daten in 1 zeigen an, dass 100 μM Glutamat
eine Membran-Stromstärke
in Xenopus-Oocyten, gespritzt mit 50 ng HEGE2-mRNA, aktivieren.
Dieses Beispiel belegt, dass die Expression von mRNA, entsprechend
der cDNA in HEGE2, einen funktionellen Glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanal
in Oocyten ergibt. 1 μmolares
Ivermectinphosphat aktivierte ebenfalls langsam und irreversibel
die Stromstärke
in Oocyten.
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