CH694428A5

CH694428A5 - GABA-B-Rezeptoren.

Info

Publication number: CH694428A5
Application number: CH02250/00A
Authority: CH
Inventors: Klaus Raming; Mario Mezler; Thomas Mueller
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2005-01-14
Also published as: GB0027773D0; DE19955408A1; FR2801593A1; JP2001186893A; GB2357768A; US20050136511A1; US6794149B1; GB2357768B; BE1015281A5

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide, welche die biologische Aktivität von GABA-B-Rezeptoren ausüben, sowie Nukleinsäuren, die für diese Polypeptide codieren und insbesondere deren Verwendung zum Auffinden von Wirkstoffen für den Pflanzenschutz.

Gamma-amino-buttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Nervensystem von Vertebraten und Invertebraten. Die Rezeptoren für GABA können in 2 Subfamilien aufgeteilt werden, die GABA-A- und GABA-B-Rezeptoren. Unter diesen sind die GABA-A-Rezeptoren Liganden-gesteuerte Ionenkanäle, während die GABA-B-Rezeptoren metabotrope, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind. GABA-B-Rezeptoren beeinflussen die Freisetzung von verschiedenen Neurotransmittern sowie die Aktivität von Ionenkanälen.

GABA-B-Rezeptoren sind vor allem in Wirbeltieren gut untersucht. Hier sind 2 Subtypen (GABA-B1 und GABA-B2) bekannt, die als Heterodimere funktionell aktiv sind (Jones et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; White et al., 1998).

In Insekten ist GABA der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter des zentralen Nervensystems. Dementsprechend lassen sich GABA-Rezeptoren an Präparaten zentraler Ganglien aus Insekten elekt-rophysiologisch nachweisen. Sowohl die GABA-A-Rezeptoren als auch die GABA-B-Rezeptoren sind der molekulare Angriffspunkt wichtiger natürlicher und synthetischer, insektizid wirksamer Verbindungen (Sattelle, 1990; Fukunaga et al., 1999).

Die Proteinsequenz einer Anzahl von GABA-A-Rezeptoren von Insekten ist bereits bekannt. So sind z.B. in Drosophila melanogaster die Sequenzen von drei verschiedenen Untereinheiten beschrieben (ffrench-Constant et al., 1991; Harvey et al., 1994; Henderson et al., 1993).

Es ist daher von grosser praktischer Bedeutung, beispielsweise für die Suche nach neuen Insektiziden, GABA-B-Rezeptoren aus Insekten bereitzustellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit insbesondere die Aufgabe zu Grunde, GABA-B-Rezeptoren von Insekten und darauf aufbauende Testsysteme mit einem hohen Durchsatz an Testverbindungen (High Throughput Screening Assays; HTS-Assays) bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Polypeptiden, welche zumindest eine biologische Aktivität eines GABA-B-Rezeptors ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise eine zumindest 80%ige Identität, besonders bevorzugt eine zumindest 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt eine zumindest 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäss SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mithilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Devereux et al., 1984).

Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus.

Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemässen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile grösserer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.

Die biologische Aktivität der GABA-B-Rezeptoren wird vorzugsweise durch eine Heterodimerisierung der erfindungsgemässen Polypeptide erreicht. Beispielweise können die erfindungsgemässen Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 durch Dimerisierung eine Rezeptoraktivität erreichen.

Die erfindungsgemässen Polypeptide müssen nicht vollständige Rezeptoren darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren aufweisen. Polypeptide, die im Vergleich zu GABA-B-Rezeptoren, die aus den erfindungsgemässen Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 bestehen, eine um 50% höhere oder verminderte Aktivität ausüben, werden noch als erfindungsgemäss betrachtet. Dabei müssen die erfindungsgemässen Polypeptide nicht von GABA-B-Rezeptoren aus Drosophila melanogaster ableitbar sein.

Als erfindungsgemäss werden auch Polypeptide betrachtet, die GABA-B-Rezeptoren beispielsweise der folgenden Invertebraten entsprechen oder Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität dieser Rezeptoren ausüben können: Arthopoden, Nematoden, Mollusken.

Die erfindungsgemässen Polypeptide können im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender GABA-B-Rezeptoren Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;

2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;

3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;

4. Grosse aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und

5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:

<tb><TABLE> Columns = 2 <tb>Head Col 1: Ursprünglicher Rest <tb>Head Col 2: Substitution<ROW> <tb><SEP> Ala<SEP> Gly, Ser <tb><SEP> Arg<SEP> Lys <tb><SEP> Asn<SEP> Gln, His <tb><SEP> Asp<SEP> Glu <tb><SEP> Cys<SEP> Ser <tb><SEP> Gln<SEP> Asn <tb><SEP> Glu<SEP> Asp <tb><SEP> Gly<SEP> Ala, Pro <tb><SEP> His<SEP> Asn, Gln <tb><SEP> Ile<SEP> Leu, Val <tb><SEP> Leu<SEP> Ile, Val <tb><SEP> Lys<SEP> Arg, Gln, Glu <tb><SEP> Met<SEP> Leu, Tyr, Ile <tb><SEP> Phe<SEP> Met, Leu, Tyr <tb><SEP> Ser<SEP> Thr <tb><SEP> Thr<SEP> Ser <tb><SEP> Trp<SEP> Tyr <tb><SEP> Tyr<SEP> Trp, Phe <tb><SEP> Val<SEP> Ile, Leu <tb></TABLE>

Der Ausdruck "biologische Aktivität eines GABA-B-Rezeptors", wie er hierin verwendet wird, bedeutet Bindung von GABA.

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Polypeptide stellen GABA-B-Rezeptoren von Drosophila melanogaster dar, welche die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 besitzen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für die erfindungsgemässen Polypeptide codieren.

Bei den erfindungsgemässen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Nukleinsäuren stellen cDNAs dar, welche eine Nukleotidsequenz gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 besitzen.

Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 hybridisieren, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Insekten als Drosophila melanogaster isoliert werden, welche für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von GABA-B-Rezeptoren codieren.

Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben:

Hybridisierungslösung: 6X SSC/0% Formamid, bevorzugte Hybridisierungslösung: 6X SSC/25% Formamid

Hybridisierungstemperatur: 34 DEG C, bevorzugte Hybridisierungstemperatur: 42 DEG C

1. Waschschritt: 2X SSC bei 40 DEG C,

2. Waschschritt: 2X SSC bei 45 DEG C; bevorzugter 2. Waschschritt: 0,6X SSC bei 55 DEG C; besonders bevorzugter 2. Waschschritt: 0,3X SSC bei 65 DEG C.

Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren umfasst, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise eine zumindest 80%ige Identität, besonders bevorzugt eine zumindest 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt eine zumindest 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.

Der Grad der Identität der Nukleinsäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mithilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen.

Die Sequenzen gemäss Genbank-Zugangsnummern (Acc No.) AC002502, AF145639 und AC004420 sind durch Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemässe Nukleinsäure und einen heterologen Promotor umfassen.

Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich allgemein auf Expressionskontrollsequenzen.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, das lac-System, das trp-System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des alpha -Mating-Faktors der Hefe.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemässe Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemässes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide, Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemässe Nukleinsäure, ein erfindungsgemässes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemässen Vektor enthalten.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemässen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, COS1-, COS7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten.

Weiterhin sind Antikörper Gegenstand der Erfindung, die spezifisch an die vorstehend genannten Polypeptide bzw. Rezeptoren binden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt auf die übliche Weise. Beispielsweise können solche Antikörper produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörperproduktion effektiven Menge eines erfindungsgemässen Polypeptids oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers. Weiterhin lässt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zelllinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert. Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein. Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin.

Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen. Daher erstreckt sich der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, auch auf Teile vollständiger Antikörper, wie Fa-, F(ab') 2 - oder Fv-Fragmente, welche noch die Fähigkeit besitzen, an die Epitope der erfindungsgemässen Polypeptide zu binden.

Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren können insbesondere zur Herstellung transgener Invertebraten verwendet werden. Diese können in Testsysteme eingesetzt werden, die auf einer vom Wildtyp abweichenden Expression der erfindungsgemässen Polypeptide basieren. Ferner kann man auf der Grundlage der hierin offenbarten Informationen transgene Invertebraten herstellen, bei denen durch die Modifikation anderer Gene oder Promotoren eine Veränderung der Expression der erfindungsgemässen Polypeptide eintritt.

Die Herstellung der transgenen Invertebraten erfolgt beispielsweise bei Drosophila melanogaster durch P-Element vermittelten Gentransfer (Hay et al., 1997) oder in Caenorhabditis elegans durch Transposon-vermittelten Gentransfer (z.B. durch Tc1; Plasterk, 1996).

Gegenstand der Erfindung sind somit auch transgene Invertebraten, die zumindest eine der erfindungsgemässen Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise transgene Invertebraten der Arten Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans, sowie deren transgene Nachkommen. Vorzugsweise enthalten die transgenen Invertebraten die erfindungsgemässen Polypeptide in einer vom Wildtyp abweichenden Form.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemässen Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den erfindungsgemässen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die eine der erfindungsgemässen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann die zu exprimierende Nukleinsäure an die "Codon Usage" der Wirtszellen angepasst werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in In-vitro-Systemen hergestellt werden.

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemässen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemässen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemässen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschliesst, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren.

Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Da GABA-B-Rezeptoren Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergensextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiärstrukturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien.

Die Reinigung der erfindungsgemässen Polypeptide kann die Isolierung von Membranen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemässen Nukleinsäuren exprimieren, umfassen. Vorzugsweise exprimieren solche Zellen die erfindungsgemässen Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, sodass die Menge der Polypeptide in einer Membranfraktion mindestens 10-fach höher ist als diejenige, die in vergleichbaren Membranen von Zellen gefunden wird, die GABA-B-Rezeptoren natürlicherweise exprimieren; besonders bevorzugt ist die Menge mindestens 100-fach, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000-fach höher.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemässen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemässen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemässen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mithilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Ferner sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemässen Nukleinsäuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemässen Sequenzen chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Insekten-mRNA hergestellte cDNA-Banken oder ausgehend von genomischer Insekten-DNA hergestellte genomische Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt.

Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemässen Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA-Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.

Mithilfe der erfindungsgemässen Nukleinsäuren bzw. Polypeptide können neue Wirkstoffe für den Pflanzenschutz bzw. pharmazeutische Wirkstoffe für die Behandlung von Mensch und Tier, wie chemische Verbindungen, welche als Modulatoren, insbesondere als Agonisten oder Antagonisten, die Eigenschaften der erfindungsgemässen GABA-B-Rezeptoren verändern, identifiziert werden. Dazu wird ein rekombinantes DNA-Molekül, das zumindest eine erfindungsgemässe Nukleinsäure umfasst, in eine geeignete Wirtszelle eingebracht. Die Wirtzelle wird in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl von Verbindungen umfasst, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der erfindungsgemässen Rezeptoren erlauben. Eine Veränderung der Rezeptoreigenschaften kann beispielsweise wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben detektiert werden.

Auf diese Weise ist es möglich, beispielsweise insektizide Substanzen aufzufinden.

GABA-B-Rezeptoren verändern vorzugsweise nach Aktivierung die Konzentration von intrazellulärem cAMP über eine Interaktion mit G-Proteinen. Veränderungen der Rezeptoreigenschaften durch chemische Verbindungen können deshalb nach heterologer Expression zum Beispiel durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen direkt über ELISA-Assaysysteme (Biomol, Hamburg, Deutschland) oder RIA-Assaysysteme (NEN, Schwalbach, Deutschland) im HTS-Format gemessen werden. Eine indirekte Messung der cAMP-Konzentration ist mithilfe von Reportergenen (z.B. Luziferase) möglich, deren Expression von der cAMP-Konzentration abhängig ist (Stratowa et al., 1995). Die Koexpression von GABA-B-Rezeptoren mit besonderen G-Proteinen, z.B.

G alpha 15, G alpha 15 oder auch chimären G-Proteinen, in heterologen Systemen und die Messung des Anstiegs von Calcium, z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen oder äquorin, ist eine alternative Screeningmöglichkeit (Stables et al., 1997; Conklin et al., 1993).

Weiterhin kann die Bindung von GTP an das aktivierte G-Protein als read-out-System für die Prüfung von Substanzen herangezogen werden. Auch Bindungsexperimente mit markiertem GABA können zum Screening eingesetzt werden.

Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das GABA-B-Rezeptoren aktiviert.

Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das einen Agonisten von seiner Bindungsstelle verdrängt.

Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemässen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemässen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können Mimetika von natürlichen Substraten und Liganden darstellen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.

Die Bindung der Modulatoren an die erfindungsgemässen Polypeptide kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Insekten führt.

Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Modulatoren der erfindungsgemässen Polypeptide als Insektizide.

Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren bzw. Polypeptide ermöglichen auch das Auffinden von Verbindungen, die an die erfindungsgemässen Rezeptoren binden. Diese können ebenfalls als Insektizide auf Pflanzen angewandt werden. Beispielsweise werden Wirtszellen, die die erfindungsgemässen Nukleinsäuren enthalten und die entsprechenden Rezeptoren bzw. Polypeptide exprimieren oder die Genprodukte selbst mit einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung zumindest einer Verbindung mit den Wirtszellen, den Rezeptoren oder den einzelnen Polypeptiden erlauben.

Unter Verwendung von Wirtszellen oder transgenen Invertebraten, die die erfindungsgemässen Nukleinsäuren enthalten, ist es auch möglich, Substanzen aufzufinden, welche die Expression der Rezeptoren verändern.

Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Nukleinsäuren, Vektoren und regulatorischen Regionen können ausserdem zum Auffinden von Genen verwendet werden, die für Polypeptide codieren, welche am Aufbau von funktionell ähnlichen GABA-B-Rezeptoren in Insekten beteiligt sind. Unter funktionell ähnlichen Rezeptoren werden gemäss der vorliegenden Erfindung Rezeptoren verstanden, die Polypeptide umfassen, welche sich zwar hinsichtlich der Aminosäuresequenz von den hierin beschriebenen Polypeptiden unterscheiden, aber im Wesentlichen dieselben Funktionen haben.

Erläuterungen zum Sequenzprotokoll und zu den Abbildungen;

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der isolierten GABA-B-cDNAs. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 zeigen ferner die Aminosäuresequenzen der von den GABA-B-cDNA-Sequenzen abgeleiteten Proteine.

Die Abbildung 1 zeigt eine Dosis-Wirkungskurve von GABA und 3-APMPA auf den Drosophila GABA-B-Rezeptor bestehend aus den erfindungsgemässen Polypeptiden mit Aminosäuresequenzen gemäss SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4, exprimiert in Xenopus-Oocyten.

Die Abbildung 2 zeigt die funktionelle Kopplung der koexprimierten D-GABA-B-Rezeptoren R1/R2 bestehend aus den erfindungsgemässen Polypeptiden mit Aminosäuresequenzen gemäss SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 an das intrazelluläre cAMP-System. Stabil mit D-GABA-B R1/R2 transfizierte HEK293 Luc Zellen (D-GABA R1/2) und untransfizierte Kontroll-Zellen (Kontrolle) wurden mit Forskolin, Forskolin und GABA, als auch allein mit GABA stimuliert und die intrazelluläre cAMP-Konzentration gemessen. Die D-GABA-B R1/2 transfizierten Zellen zeigen eine deutliche Reduktion der Forskolin-induzierten cAMP-Antwort, wohingegen die Kontroll-Zellen nicht reagieren. Beispiele: Beispiel 1 Isolierung der beschriebenen Polynukleotidsequenzen

Die Manipulation von Polynukleotiden erfolgte nach Standardmethoden der rekombinanten DNA-Technologie (Sambrook et al., 1989). Die bioinformatische Bearbeitung von Nukleotid- und Proteinsequenzen erfolgten mit dem Programmpaket GCG Version 9.1 (GCG Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, USA). Beispiel 2 Generierung der Expressionskonstrukte

Mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden die Sequenzbereiche der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 amplifiziert und in den Vektor pcDNA3.1/Neo (Invitrogen, Groningen) einkloniert. Heterologe Expression

HEK293-Zellen wurden in Dulbeccos Modified Eagles Medium und 10% fötalem Kälberserum bei 5% CO 2 und bei 37 DEG C kultiviert. Für den Gentransfer wurde MBS (Stratagene, La Jolla, USA) nach Angaben des Herstellers verwendet. 24 h bis 48 h nach dem Gentransfer wurden die Zellen in verschiedenen Dichten in Mikrotiterplatten ausgesät. Gentechnisch veränderte Zellen wurden durch Wachstum in Dulbeccos Modified Eagles Medium und 10% fötalem Kälberserum und 700 mu g/ml Geneticin (G418, Life Technologies, Karlsruhe) als Selektionsmarker während 3 bis 4 Wochen selektioniert. Resistente Einzelklone wurden wie unten beschrieben analysiert.

Die funktionelle Expression der GABA-B-Rezeptoren aus Insekten erfolgte auch in Xenopus-Oocyten. Dazu wurden G-Protein aktivierbare Kalium-Kanäle (GIRK1 und GIRK4) koexprimiert, um die Aktivierung der GABA-B-Rezeptoren zu messen (White et al., 1998). cAMP-Messungen

Zur Bestimmung der cAMP-Konzentration wurden HEK293-Zell-Stämme verwendet. Zum einen koexprimierten HEK293-Zellen stabil die beiden Drosophila melanogaster Rezeptoren D-GABA-B R1 und D-GABA-B R2 (D-GABA R1/2). Zum anderen wurden untransfizierte Kontroll-Zellen in den Test mit einbezogen (Kontrolle). Die Zellen wurden jeweils in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Kavität in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Kontroll-Zellen wurden in Kultur Medium (DMEM, 10% FCS, Penicillin und Streptomycin, 50 U/ml und 50 mu g/ml (Life Technologies)) und D-GABA R1/2 exprimierende Zellen in Selektions-Medium (Kultur-Medium mit 0,5 mg/ml Geneticin (G418, Life Technologies)) für 48 Stunden bei 37 DEG C bis zu einer Zell-Dichte von ca. 80% inkubiert. Daraufhin wurde das Medium entfernt und die Zellen einmal mit DMEM ohne Zusätze gewaschen.

Nach einer 30-minütigen Inkubation mit IBMX (300 mu M) bei 37 DEG C erfolgte eine 30-minütige Stimulation mit GABA (100 mu M) und/oder Forskolin (10 mu M) bei 37 DEG C. Alle Inkubationsschritte wurden in DMEM (Life Technologies) ohne Zusätze durchgeführt. Im Anschluss erfolgte ein Entfernen des Stimulationsmediums und eine Lyse der Zellen mit 50 mu l HC1 (0,1 N) pro Kavität. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln lysiert und die cAMP-Konzentration der Zell-Lysate in dreifacher Ausführung mit dem Enzym-Immuno-Assay (EIA) Kit AK-200 (Biomol, Hamburg, Deutschland) unter Befolgung der Beschreibung des Herstellers bestimmt. Oocyten-Messungen

1. Präparation der Oocyten

Die Oocyten stammen von einem adulten weiblichen Xenopus laevis-Frosch (Firma Horst Kähler, Hamburg, Deutschland). Die Frösche wurden in grossen Tanks mit zirkulierendem Wasser bei einer Wassertemperatur von 20-24 DEG C gehalten. Teile des Frosch-Ovars wurden unter vollständiger Anästhesie durch einen kleinen Schnitt im Abdomen (ca. 1 cm) entnommen; Anschliessend wurde das Ovar unter ständigem Schütteln für ca. 140 Minuten in 25 ml Kollagenase (Typ I, C-0130, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Deutschland; 355U/ml, angesetzt in Barth's Lösung ohne Calcium in mM: NaCl 88, KC1 1, MgSO 4 0,82, NaHCO 3 2,4, Tris/HCl 5, pH7,4) behandelt. Die Oocyten wurden dann mit Barth's Lösung ohne Calcium gewaschen. Nur Oocyten im Reifestadium V (Dumont, 1972) wurden für die weitere Behandlung ausgewählt und in Mikrotiterplatten (Nunc MicroWell <TM> Platten, Kat.

Nr. 245128 + 263339 (Deckel), Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland), gefüllt mit Barth's-Lösung (in mM: NaCl 88, KC1 1, MgSO 4 0,82, Ca(NO 3 ) 2 0,33, CaCl 2 0,41, NaHCO 3 2,4, Tris/HCl 5, pH7,4) sowie Gentamicin (Gentamicin Sulfate, G-3632, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Deutschland; 100 U/ml), überführt. Die Oocyten wurden dann bei 19,2 DEG C in einem Kühl-Brutschrank (Typ KB 53, WTB Binder Labortechnik GmbH, Tuttlingen, Deutschland) aufbewahrt. 2. Injektion der Oocyten

Injektionselektroden, mit einem Durchmesser von 10-15 mu m, wurden mit einem Pipetten-Puller (Typ L/M-3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Deutschland) hergestellt. Vor der Injektion wurden Aliquots mit der D-GABA-B-DNA bzw. GIRK1/4-DNA aufgetaut und mit Wasser auf eine Endkonzentration von 10 ng/ mu l verdünnt. Die DNA-Proben wurden mit 3200g für 120 Sekunden zentrifugiert (Typ Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Deutschland). Anschliessend wurde ein ausgezogener PE-Schlauch als Transferschlauch benutzt, um die Pipetten von hinten zu befüllen. Die Injektionselektroden wurden an einer X,Y,Z-Verfahreinheit (Bearbeitungszentrum EP 1090, isel-automation, Eiterfeld, Deutschland) befestigt.

Mithilfe eines Macintosh Computer wurde die Oocyten in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten angefahren und durch kurze Druckapplikation (0,5-3,0 bar, 3-6 Sekunden) ca. 50 nl der DNA-Lösung in die Oocyte injiziert. 3. Elektrophysiologische Messungen

Für die elektrophysiologischen Messungen wurde eine Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem TURBO TEC-10CD (npi electronic GmbH, Tamm, Deutschland) Verstärker durchgeführt. Die hierfür notwendigen Mikropipetten wurden aus Aluminiumsilikatglas (Kapillarrohr, Art.-Nr. 14 630 29, 1=100 mm, Oa=1,60 mm, Oi=1,22 mm, Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Deutschland) in zwei Zügen gezogen (Hamill et al., 1981). Strom- und Spannungselektroden hatten einen Durchmesser von 1-3 mu m und wurden mit 1.5 M KCl und 1,5 M Kaliumacteat gefüllt. Die Pipetten hatten einen kapazitiven Widerstand von 0,2-0,5 MW. Für die elektrophysiologischen Messungen wurden die Oocyten in eine kleine Kammer überführt, die kontinuierlich mit normaler Rimland-Lösung (in mM: KCl 90, MgCl 2 3, HEPES 5, pH 7,2) gespült wurde.

Für eine Substanzapplikation wurde die Perfusionslösung durch eine Substanzlösung mit gleicher Zusammensetzung und zusätzlich der gewünschten Substanzkonzentration ausgetauscht. Bei einem Klemmpotenzial von -60 mV wurde die erfolgreiche Expression der D-GABA-B-DNA nach einer Woche überprüft. Nicht reagierende Oocyten wurden verworfen. Alle weiteren wurden für die Substanztestung verwendet. Die Daten wurden mittels eines YT-Schreibers (YT-Schreiber, Model BD 111, Kipp & Zonen Delft BV, AM Delft, Niederlande) dokumentiert. Wenn Testsubstanzen in Konzentrationsreihen untersucht wurden, sind diese Messungen an mindestens zwei verschiedenen Oocyten und an mindestens fünf verschiedenen Konzentrationen durchgeführt worden.

Die Substanzen sind direkt und ohne Vorinkubation in Gegenwart von GABA (Gamma-Amino-N-butyric acid, A2129, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Deutschland) auf ihren Antagonismus geprüft worden. Die einzelnen Werte wurden in Origin (Auswertesoftware Microcal Origin, Microcal Software, Inc., Northampton, MA 01060-4410 USA) (Additive GmbH, Friedrichsdorf/Ts, Deutschland) eingegeben. Mittelwerte, Standardabweichung, IC 50 -Werte und IC 50 -Kurven wurden mit Origin berechnet. Diese Messungen wurden mindestens zweimal durchgeführt. Literatur:

Conklin et al. (1993) Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq alpha to that of Gi alpha, Nature 363, 274-276

Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387

Dumont, J. N. (1972) Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). 1. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals, J. Morphol. 136, 153-180

Fukunaga, A. et al. (1999) Insecticidal properties of 3-aminopropyl-(methyl)phosphinic acid and its effect on K+-evoked release of acetylcholine from cockroach synaptosomes, Comp. Biochem. and Physiol. Part C 122, 283-286

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Hamill, O.P. et al. (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches, Pfügers Arch. 391, 85-100

Harvey, R. J. et al. (1994) Sequence of a Drosophila ligand-gated ion-channel polypeptide with an unusual amino-terminal extracellular domain, J. Neurochem. 62, 2480-2483

Hay et al. (1997) P element insertion-dependent gene activation in the Drosophila eye, Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America 94 (10), 5195-5200

Henderson, J. E. et al. (1993) Characterization of a putative gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor beta subunit gene from Drosophila melanogaster, Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 474-482

Jones K. A. et al. (1998) GABA(B) receptors function as a heteromeric assembly of the subunits GABA(B)R1 and GABA(B)R2, Nature 396, 674-679

Kaupmann K. et al. (1998) GABA(B)-receptor subtypes assemble into functional heteromeric complexes, Nature 396, 683-687

Plasterk (1996) The Tc1/mariner transposon family, Transposable Elements/Current Topics in Micro-bio-logy and Immunology 204,125-143

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Press

Sattelle D. B. (1990) GABA Receptors of Insects, Advances in Insect Physiology 22, 1-113

Stables et al. (1997) A Bioluminescent Assay for Agonist Activity at Potentially Any G-protein coupled Receptor, Analytical Biochemistry 252, 115-126

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White J. H. et al. (1998) Heterodimerization is required for the formation of a functional GABA(B) receptor, Nature 396, 679-682

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Claims

1. Polypeptid, welches die biologische Aktivität eines GABA-B-Rezeptors ausübt und eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine zumindest 70%ige Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 aufweist.

2. Polypeptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz einer Sequenz gemäss SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 entspricht.

3. Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 codiert.

4. Nukleinsäure gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.

5. Nukleinsäure gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.

6.

Nukleinsäure gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz einer Sequenz gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 entspricht.

7. Nukleinsäure gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 hybridisiert.

8. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7 und einen heterologen Promotor.

9. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7 oder ein DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 8.

10. Vektor gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.

11.

Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7, ein DNA-Konstrukt gemäss Anspruch 8 oder einen Vektor gemäss Anspruch 9 oder 10.

12. Wirtszelle gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle, insbesondere um E. coli, handelt.

13. Wirtszelle gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere um eine Säuger- oder Insektenzelle, handelt.

14. Antikörper, welcher spezifisch an ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 bindet.

15. Transgener Invertebrat enthaltend eine Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7.

16. Transgener Invertebrat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans handelt.

17. Transgene Nachkommen eines Invertebraten gemäss Anspruch 15 oder 16.

18.

Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids gemäss Anspruch 1, umfassend (a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13 unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7 gewährleisten, oder (b) das Exprimieren einer Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7 in einem In-vitro-System, und (c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem In-vitro-System.

19.

Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7, umfassend die folgenden Schritte: (a) Vollständige chemische Synthese, oder (b) chemische Synthese von Oligonukleotiden, Markieren der Oligonukleotide, Hybridisieren der Oligonukleotide an DNA einer genomischen oder cDNA-Bank, die ausgehend von genomischer DNA bzw. mRNA aus Insektenzellen hergestellt wurde, Selektieren von positiven Klonen und Isolieren der hybridisierenden DNA aus positiven Klonen, oder (c) chemische Synthese von Oligonukleotiden und Amplifizierung der Ziel-DNA mittels PCR.

20. Verfahren zum Herstellen eines transgenen Invertebraten gemäss Anspruch 15 oder 16, umfassend das Einbringen einer Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7 oder eines Vektors gemäss Anspruch 9 oder 10.

21.

Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe für den Pflanzenschutz, insbesondere von Verbindungen, welche die Eigenschaften von Polypeptiden gemäss Anspruch 1 verändern, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13, (b) Kultivieren der Wirtszelle in der Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl von chemischen Verbindungen umfasst, und (c) Detektieren veränderter Eigenschaften.

22.

Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die an ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 bindet, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen eines Polypeptids gemäss Anspruch 1 oder einer Wirtszelle gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und (b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Polypeptid bindet.

23.

Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung, die die Expression eines Polypeptids gemäss Anspruch 1 verändert, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13 oder eines transgenen Invertebraten gemäss Anspruch 15 oder 16 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen, (b) Bestimmen der Konzentration des Polypeptids gemäss Anspruch 1, und (c) Bestimmen der chemischen Verbindung, die die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.

24.

Verwendung eines Polypeptids gemäss Anspruch 1, einer Nukleinsäure gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7, eines Vektors gemäss Anspruch 9 oder 10, einer Wirtszelle gemäss einem der Ansprüche 11 bis 13, eines Antikörpers gemäss Anspruch 14 oder eines transgenen Invertebraten gemäss Anspruch 15 oder 16 zum Auffinden neuer Wirkstoffe für den Pflanzenschutz oder zum Auffinden von Genen, die für Polypeptide codieren, welche am Aufbau von funktionell ähnlichen GABA-B-Rezeptoren in Insekten beteiligt sind.

25. Verwendung eines Modulators eines Polypeptids gemäss Anspruch 1 als Insektizid.