BR112019025097A2 - imunoglobulinas de ligação a mmp13 - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se às imunoglobulinas que especificamente se ligam à MMP13 e, mais particularmente, aos polipeptídeos, ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos; aos métodos para a preparação de tais polipeptídeos; às composições e em particular às composições farmacêuticas que compreendem tais polipeptídeos, para propósitos profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico. Em particular, as imunoglobulinas da presente invenção inibem uma atividade de MMP13 e, de preferência, também são estáveis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNO- GLOBULINAS DE LIGAÇÃO A MMP13".

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se às imunoglobulinas que se ligam a MMP13 e, mais particularmente, aos polipeptídeos que com- preendem ou consistem essencialmente em uma ou mais de tais imu- noglobulinas (também referidas aqui como "imunoglobulinas da inven- ção" e "polipeptídeos da invenção", respectivamente). A invenção também refere-se às construções compreendendo tais imunoglobuli- nas ou polipeptídeos, assim como ácidos nucleicos que codificam tais imunoglobulinas ou polipeptídeos (também referidos aqui como "ácido nucleico da invenção"; aos métodos para a preparação de tais imuno- globulinas, polipeptídeos e construções; às células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais imunoglobulinas ou poli- peptídeos; às composições, e em particular às composições farmacêu- ticas que compreendem tais imunoglobulinas, polipeptídeos, constru- ções, ácidos nucleicos e/ou células hospedeiras; e ao uso de imuno- globulinas, polipeptídeos, construções, ácidos nucleicos, células hos- pedeiras e/ou composições, em particular para propósitos profiláticos e/ou terapêuticos, tais como os propósitos profiláticos e/ou terapêuti- cos aqui mencionados. Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção tornar-se-ão claros a partir da descrição mais adiante nesta invenção.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A osteoartrite (OA) é uma das causas mais comuns de in- capacidade em todo o mundo. Ela afeta 30 milhões de americanos e é o distúrbio das articulações mais comum. Ela deverá, segundo as pro- jeções, afetar mais do que 20 por cento da população dos U.S. perto de 2025. A doença é não sistêmica e é geralmente restrita a poucas articulações. No entanto, a doença pode ocorrer em todas as articula-

ções, mais frequentemente os joelhos, quadris, mãos e espinha. A OA é caracterizada pela erosão progressiva da cartilagem articular (carti- lagem que cobre os ossos) resultando em dor crônica e incapacidade. Eventualmente, a doença leva à destruição total da cartilagem articu- lar, esclerose do osso subjacente, formação de osteófitos, etc., tudo levando à perda de movimento e dor. A dor é o sintoma mais proemi- nente da OA e, com maior frequência, dos pacientes que procuram a ajuda médica. Não há nenhuma cura para a OA; o controle da doença é limitado aos tratamentos que são paliativos na melhor das hipóteses e faz pouco para resolver a causa subjacente da progressão da doen- ça.

[0003] Os fármacos antiosteoartríticos modificadores da doença (DMOADs), que podem ser definidos como fármacos que inibem a progressão da doença estrutural e, idealmente, também melhoram os sintomas e/ou a função, são intensamente procurados. Os DMOADs são prováveis de serem prescritos durante longos períodos nesta en- fermidade crônica de uma população em envelhecimento, portanto, demandando excelentes dados de segurança em uma população alvo com múltiplas comorbidades e o potencial de interações fármaco- fármaco.

[0004] A osteoartrite pode ser definida como um grupo diverso de condições caracterizadas por uma combinação de sintomas de articu- lações, sinais que se originam de defeitos na cartilagem articular e al- terações nos tecidos adjacentes incluindo ossos, tendões e músculos. Os componentes mais abundantes da cartilagem articular são proteo- glicanos e colágeno (em primeiro lugar Colágeno |l). O proteoglicano principal na cartilagem é o Aggrecan (proteoglicano sulfato de condroi- tina 1). Embora o início da doença possa ser multifatorial, a destruição da cartilagem parece ser um resultado da destruição descontrolada da matriz extracelular proteolítica (ECM).

[0005] Como mencionado acima, um componente principal da ma- triz extracelular de cartilagem é o Aggrecan (Kiani et al. 2002 Cell Re- search 12:19-32). Esta molécula é importante no funcionamento apro- priado da cartilagem articular porque fornece uma estrutura de gel hi- dratada que dota a cartilagem com propriedades de sustentação de carga. O Aggrecan é uma molécula grande multimodular (2317 amino- ácidos) expressa por condrócitos. Sua proteína de núcleo é composta de três domínios globulares (G1, G2 e G3) e uma grande região es- tendida entre G2 e G3 para ligação de cadeia de glicosaminoglicano. Esta região estendida compreende dois domínios, um substituído com cadeias de sulfato de queratano (domínio KS) e um com cadeias de sulfato de condroitina (domínio CS). O domínio de CS possui 100 a 150 cadeias de glicosaminoglicano (GAG) ligadas a ele. O Aggrecan forma complexos grandes com Hyaluronan em que 50 a 100 molécu- las de Aggrecan interagem através do domínio G1 e Proteína de liga- ção com uma molécula de Hyaluronan. Após a absorção de água (de- vido ao teor de GAG) estes complexos formam um gel reversivelmente deformável que resiste à compressão. A estrutura, retenção de fluidos e função da cartilagem das articulações, é ligada ao teor de matriz do Aggrecan, e à quantidade de sulfato de condroitina ligada à proteína do núcleo intacta.

[0006] O colágeno tipo Il (Colágeno Il, Col II) constitui 50% da car- tilagem articular. As fibrilas de colágeno formam uma rede que permite que a cartilagem capture o proteoglicano assim como fornece resis- tência ao tecido. O colágeno é uma proteína estrutural que é composta de um feixe dextrogiro de três hélices de poliprolina levógiros paralelas do tipo II (PPII). Devido ao acondicionamento firme das hélices de PPII PPM dentro da hélice tripla, cada terceiro resíduo, que é um aminoáci- do, é Gly (glicina). Visto que a glicina é o menor aminoácido sem ca- deia lateral, ela desempenha um papel único nas proteínas estruturais fibrosas. No colágeno, Gly é requerido em cada terceira posição, por- que a montagem da hélice tripla coloca este resíduo no interior (eixo) da hélice, onde não há espaço para um grupo lateral maior do que o átomo de hidrogênio único da glicina.

[0007] A OA é caracterizada por 1) degradação do Aggrecan, que libera progressivamente os domínios G3 E G2 (resultando na 'defla- ção' da cartilagem) e eventualmente liberação do domínio G1 e 2) de- gradação do colágeno, que destrói irreversivelmente a estrutura da cartilagem.

[0008] Há evidência convincente para demonstrar que as metalo- proteinases da matriz (MMPs) possuem um papel principal na destrui- ção do tecido associado com a OA. As MMPs são uma família de en- dopeptidases dependentes de zinco envolvidas na degradação da ma- triz extracelular e da remodelagem do tecido. Existem cerca de 28 membros da família da MMP, que podem ser classificados em vários subgrupos incluindo colagenases, gelatinases, estromelisinas, MMPs do tipo membrana, matrilisinas, esmalsinas e outros. As colagenases, compreendendo MMP1, MMP8, MMP13 e MMP18, são capazes de degradar colágenos fibrilares de hélice tripla em fragmentos de 3/4 e 1/4 distintos. Além disso, a MMP14 também foi mostrada de clivar o colágeno fibrilar, e existe evidência de que também a MMP?2 é capaz de colagenólise. As MMP's têm sido consideradas como alvos terapêu- ticos atraentes para o tratamento da OA. No entanto, os inibidores de MMP de amplo espectro desenvolvidos para o tratamento de artrite falharam em testes clínicos devido aos efeitos colaterais dolorosos de endurecimento das articulações denominados síndrome musculoes- quelética (MSS). Acredita-se que a MSS é provocada pela inibição não seletiva de múltiplas MMP's.

[0009] Nam et al. (2017 Proc Natl Acad Sci USA 113:14970- 14975) descrevem nanocorpos que são evidentes especificamente di-

recionados contra o sítio ativo de MMP14.

[0010] As intervenções terapêuticas na OA também foram impedi- das pela dificuldade de direcionar os fármacos para a cartilagem arti- cular. Visto que a cartilagem articular é um tecido avascular e alinfáti- Co, as vias tradicionais de liberação de fármaco (oral, intravenosa, in- tramuscular) se baseiam em última análise na transferência transsino- vial de fármacos dos capilares sinoviais para cartilagem através da di- fusão passiva. Assim, na ausência de um mecanismo para o direcio- namento seletivo de um fármaco à cartilagem, necessita-se expor o corpo de forma sistêmica a altas concentrações de fármaco para atin- gir uma dose terapêutica intra-articular prolongada. Como uma conse- quência da alta exposição sistêmica, a maioria das terapias tradicio- nais para OA foi assolada por graves toxicidades.

[0011] Além disso, a maioria dos DMOADs recentemente desen- volvidos possui um curto tempo de permanência na articulação, mes- mo quando administrado de forma intra-ocular Edwards 2011 Vet. J. 190:15-21; Larsen et al. 2008 J Pham Sci 97:4622-4654). A liberação intra-articular (IA) de proteínas terapêuticas tem sido limitada por sua rápida liberação do espaço articular e carece de retenção dentro da cartilagem. O tempo de permanência sinovial de um fármaco na articu- lação é frequentemente menor do que 24 h. Devido à rápida liberação da maioria dos fármacos injetados IA, podem ser necessárias injeções frequentes para manter uma concentração eficaz (Owen et a/. 1994 Br. J. Clin Pharmacol. 38:349-355). Entretanto, as injeções IA frequentes são indesejadas devido à dor e ao desconforto que elas podem provo- car que desafia a cooperação do paciente, assim como o risco de in- trodução de infecções nas articulações.

[0012] Permanece uma necessidade de DMOADs eficazes.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção visa fornecer polipeptídeos contra À

OA com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas, além de outras propriedades vantajosas (tais como, por exemplo, facilidade melhorada de preparação, boa estabilidade, e/ou custos reduzidos de mercadorias), em comparação com as sequências de aminoácido e anticorpos da técnica anterior. Em particular, a pre- sente invenção visa fornecer domínios variáveis únicos de imunoglo- bulina (ISVDs) e polipeptídeos que compreendem os mesmos para inibir as MMP's e especialmente inibir a MMP13.

[0014] Os inventores levantaram a hipótese de que a melhor regi- ão para inibir a atividade enzimática da MMP13 seria elevação dos ISVDs contra a bolsa catalítica. No entanto, isto se tornou um desafio principal. Em particular, a MMP13 é secretada como uma pró-forma inativa (proMMP13), na qual o pró-domínio mascara a bolsa catalítica, por causa de que a bolsão não é acessível para elevação de uma res- posta imunológica. Por outro lado, a MMP13 ativada possui uma meia- vida curta, que é principalmente devido à autoproteólise. Além disso, mesmo depois que os inventores superaram os dois problemas anteri- ores, descobriu-se que a alta conservação em sequência do domínio catalítico entre várias espécies antecede uma resposta imune robusta.

[0015] No final, os inventores foram capazes de satisfazer estes desafios pelo desenvolvimento original de novas ferramentas e méto- dos de triagem não convencionais.

[0016] De diferentes campanhas de triagem, os ISVDs foram iso- lados e ainda planejados com características diversas e favoráveis, incluindo estabilidade, afinidade e atividade inibidora. O fármaco com- parador foi superado em desempenho pelos ISVDs monovalentes da invenção que se ligam à MMP13. Os polipeptídeos biparatópicos, compreendendo um ISVD que foi menos conveniente na inibição da atividade de MMP13, foram ainda mais potentes.

[0017] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos 1 domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) que liga uma matriz metaloproteinase (MMP) e, de preferência, liga a matriz metaloproteinase MMP13. A invenção também inclui um polipeptídeo que compreende dois ou mais ISVDs que individualmente se ligam de forma específica à MMP13, em que a) pelo menos um "primeiro" ISVD se liga especificamente a um pri- meiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação de MMP13; e em que, b) pelo menos um "segundo" ISVD se liga especificamente a um se- gundo determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação de MMP13, diferente do primeiro determinante anti- gênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação, respecti- vamente.

[0018] Também é fornecido um polipeptídeo da invenção que compreende um único domínio variável (ISVD) que se liga a uma ma- triz metaloproteinase (MMP) e um outro domínio variável único (ISVD) que se liga a um proteoglicano de cartilagem e, de preferência, Aggre- can.

[0019] Um outro aspecto refere-se a um polipeptídeo de acordo com a invenção para utilização como um medicamento. Ainda outro aspecto refere-se a um método de tratamento de doenças ou distúr- bios em um indivíduo, por exemplo, no qual a atividade de MMP13 es- tá envolvida, o método compreendendo a administração do polipeptí- deo de acordo com a invenção ao dito indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma da referida doença ou distúr- bio.

[0020] Outros aspectos, vantagens, aplicações e usos dos polipep- tídeos e composições tornar-se-ão claros a partir da divulgação adici- onal nesta invenção. Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (in-

cluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal divulgação em virtude da invenção anterior.

4. LEGENDA DAS FIGURAS Figura 1: Curvas de resposta de dose de Nanocorpos de perfil 1 (gráfi- co esquerdo) e Nanocorpos de perfil 2 (gráfico direito) no ensaio de colágeno fluorogênico. Figura 2: Seletividade de nanocorpos condutores de MMP13. Figura 3: ELISA de competição com 40E09 biotinilado 0,6 nM contra um painel de Nanocorpos de perfil 1 e perfil 2 na MMP13 de compri- mento total humana, revestida por meio de MMP13 anti-humana de camundongo mAb (R&D Systems %MAB511). A MMP13 foi ativada por meio de incubação com APMA durante 90 minutos a 37 ºC. Figura 4: Inibição da degradação da cartilagem por Nanocorpos em um modelo de MMT de rato.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] Permanece uma necessidade de medicamentos seguros e eficazes para a OA. Estes medicamentos devem estar de acordo com os vários e frequentemente opostos requisitos, especialmente quando um formato amplamente aplicável é planejado. Como tal, o formato deve ser de preferência útil em uma ampla faixa de pacientes. O for- mato deve ser preferivelmente seguro e não induzir infecções devido à administração IA frequente. Além disso, o formato deve ser de prefe- rência favorável ao paciente. Por exemplo, o formato deve ter uma meia-vida prolongada nas articulações, de tal modo que o formato não seja removido instantaneamente após a administração. No entanto, a extensão da meia-vida deve de preferência não introduzir atividade fora do alvo e efeitos colaterais ou limitar a eficácia.

[0022] A presente invenção realiza pelo menos um destes requisi- tos.

[0023] Com base nas estratégias de triagem, caracterização e combinatórias não convencionais, os presentes inventores surpreen- dentemente observaram que os domínios variáveis únicos de imuno- globulina (ISVDs) atuaram excepcionalmente bem em experimentos in vitro e in vivo.

[0024] Além do mais, os presentes inventores foram capazes de reprojetar os ISVDs para superar em desempenho o fármaco compa- rador. Em um módulo biparatópico, este desempenho não foi somente retido, mas ainda melhorado.

[0025] Por outro lado, os ISVDs da invenção também demonstra- ram ser significativamente mais eficazes do que as moléculas compa- radoras.

[0026] A presente invenção fornece polipeptídeos que antagoni- zam as MMPs, em particular a MMP13, com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas, incluindo um perfil mais seguro, em comparação com as moléculas comparadoras.

[0027] Consequentemente, a presente invenção refere-se aos ISVDs e polipeptídeos que são direcionados contra/e ou que podem se ligar especificamente (como aqui definido) às MMPs, preferivelmente a dita MMP é selecionada do grupo que consiste em MMP13 (colage- nase), MMP8 (colagenase), MMP1 (colagenase), MMP19 (matriz me- taloproteinase RASI) e MMP20 (enamelisina), de preferência dita MMP é MMP13, e modular uma atividade destes, em particular, um polipep- tídeo compreendendo pelo menos um domínio variável único de imu- noglobulina (ISVD) especificamente ligando a MMP13, em que a liga- ção à MMP13 modula uma atividade de MMP13. Definições

[0028] A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os termos utilizados possuem seu significado usual na técnica, que será evidente para a pessoa versada. Referência é feita, por exemplo, aos manuais padronizados, tais como Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes Il, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old et al. (Prin- ciples of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6*" Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt's Essential Immunology (10! Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001), e Janeway et al. (Immunobiology (6*" Ed.) Garland Science Pub- lishing/Churchill Livingstone, New York, 2005), assim como à técnica antecedente geral citada nesta invenção.

[0029] A não ser que de outra maneira indicada, todos os méto- dos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritas com detalhes podem ser executadas e foram executadas de uma maneira conhecida per se, como ficará evidente para a pessoa versada. Referência é feita novamente, por exemplo, aos manuais pa- dronizados e à técnica antecedente geral mencionada nesta invenção e às outras referências aqui citadas; assim como, por exemplo, às se- guintes análises críticas Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640- 56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz et al. (Pla- centa 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005), que descrevem técnicas para o planejamento de proteínas, tais como maturação por afinidade e outras técnicas para melhorar a especificidade e outras propriedades desejadas de proteí- nas tais como imunoglobulinas.

[0030] Deve ser observado que como aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Assim, por exem- plo, referência a "um reagente" inclui um ou mais desses diferentes reagentes e referência a "o método" inclui referência às etapas e mé- todos equivalentes conhecidos por aqueles de habilidade prática na técnica que podem ser modificados ou substituídos pelos métodos aqui descritos.

[0031] A menos que de outro modo indicado, o termo "pelo me- nos" que precede uma série de elementos deve ser entendido de se referir a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica irão re- conhecer, ou ser capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às modalidades especí- ficas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes destinam-se a ser incluídos pela presente invenção.

[0032] O termo "e/ou" sempre que utilizado nesta invenção inclui o significado de "e", "ou" e "todos ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo referido termo".

[0033] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" como aqui utili- zado significa dentro de 20%, de preferência dentro de 15%, mais pre- ferivelmente dentro de 10% e o mais preferível dentro de 5% de um dado valor ou faixa.

[0034] Por todo este relatório descritivo e reivindicações que se seguem, a não ser que o contexto exija de outra maneira, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreenden- do", serão compreendidos de implicar a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números intei- ros ou etapas. Quando utilizado nesta invenção, o termo "compreen- dendo" pode ser substituído com o termo "contendo" ou "incluindo" ou algumas vezes quando aqui utilizado com o termo "tendo".

[0035] O termo "sequência" como utilizado nesta invenção (por exemplo, em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável", "sequência VHH" ou "sequência de proteína"), deve ser entendido de uma forma geral co- mo incluindo tanto a sequência de aminoácido relevante assim como ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeo que codificam a mes- ma, a menos que o contexto exija uma interpretação mais limitada.

[0036] As sequências de aminoácido são interpretadas de signifi- car um aminoácido isolado ou uma sequência não ramificada de dois ou mais aminoácidos, dependendo do contexto. As sequências de nu- cleotídeo são interpretadas para significar uma sequência não ramifi- cada de 3 ou mais nucleotídeos.

[0037] Os aminoácidos são aqueles L-aminoácidos comumente encontrados em proteínas de ocorrência natural. Resíduos de aminoá- cidos serão indicados de acordo com o código de aminoácido de três letras ou de uma letra padrão. Referência é feita, por exemplo, à Tabe- la A-2 na página 48 da WO 08/020079. Essas sequências de aminoá- cido contendo D-aminoácidos não se destinam a ser incluídas por esta definição. Qualquer sequência de aminoácido que contenha aminoáci- dos pós-translacionalmente modificados pode ser descrita como a se- quência de aminoácido que é inicialmente trasladada utilizando os símbolos mostrados nesta tabela A-2 com as posições modificadas; por exemplo, hidroxilações ou glicosilações, mas estas modificações não devem ser mostradas explicitamente na sequência de aminoácido. Qualquer peptídeo ou proteína que possa ser expressa como uma se- quência modificada, sistemas articulados, reticulações e estruturas fi- nais, ligações de não peptidila, etc., é incluída por esta definição.

[0038] Os termos "proteína", "peptídeo", "proteína/peptídeo" e "po- lipeptídeo" são utilizados de modo trocável em toda a divulgação e ca- da um possui o mesmo significado para os propósitos da presente in-

venção. Cada termo refere-se a um composto orgânico produzido de uma cadeia linear de dois ou mais aminoácidos. O composto pode ter dez ou mais aminoácidos; vinte e cinco ou mais aminoácidos; cinquen- ta ou mais aminoácidos; cem ou mais aminoácidos, duzentos ou mais aminoácidos, e ainda trezentos ou mais aminoácidos. O especialista versado irá observar que os polipeptídeos geralmente compreendem menos aminoácidos do que proteínas, embora não haja qualquer pon- to de interrupção reconhecido na técnica do número de aminoácidos que distinguem um polipeptídeo e uma proteína; que os polipeptídeos podem ser produzidos através da síntese química ou métodos recom- binantes; e que as proteínas são geralmente produzidas in vitro ou in vivo por métodos recombinantes como conhecidos na técnica. Por convenção, a ligação de amida na estrutura primária de polipeptídeos está na ordem em que os aminoácidos são escritos, em que a extre- midade de amina (N-terminal) de um polipeptídeo está sempre na es- querda, enquanto que a extremidade de ácido (terminal C) está na di- reita.

[0039] Um ácido nucleico ou sequência de aminoácido é conside- rado de estar "(na) (forma) (essencialmente) isolada" - por exemplo, comparado com o meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtido - quando ele foi separado de pelo menos um outro componente com o qual ele está geralmente associado em dita fonte ou meio, tal como outro ácido nucleico, outra proteína/polipeptídeo, outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impure- za ou componente minoritário. Em particular, uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido é considerada "(essencialmente) isolada" quando ela foi purificada pelo menos 2 vezes, em particular pelo me- nos 10 vezes, mais particularmente pelo menos 100 vezes, e até 1000 vezes ou mais. Um ácido nucleico ou aminoácido que está "na forma (essencialmente) isolada" é de preferência essencialmente homogê-

neo, conforme determinado utilizando uma técnica adequada, tal como uma técnica cromatográfica adequada, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida.

[0040] Quando uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido é dita de "compreender" outra sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido, respectivamente, ou para "essencial- mente consistir em" outra sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido, isto pode significar que a última sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido foi incorporada na primeira sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido mencionada, respectivamen- te, mas mais habitualmente, isto geralmente significa que a primeira sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido mencionada compreende dentro de sua sequência uma extensão de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido, respectivamente, que possui a mesma se- quência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido, respectivamente, como a última sequência, independente de como a primeira sequência mencionada foi realmente gerada ou obtida (que pode, por exemplo, ser por qualquer método adequado aqui descrito). Por meio de um exemplo não limitativo, quando um polipeptídeo da invenção é dito de compreender um domínio variável único de imunoglobulina ("ISVD"), isto pode significar que dita sequência de domínio variável único de imunoglobulina foi incorporada na sequência do polipeptídeo da inven- ção, mas de uma forma mais habitual, isto geralmente significa que o polipeptídeo da invenção contém dentro de sua sequência a sequência dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina independente de como dito polipeptídeo da invenção foi gerado ou obtido. Da mesma forma, quando uma sequência de ácido nucleico ou nucleotídeo é dita de compreender outra sequência de nucleotídeo, a primeira sequência de ácido nucleico ou nucleotídeo mencionada é preferivelmente de tal modo que, quando ela é expressa em um produto de expressão (por exemplo, um polipeptídeo), a sequência de aminoácido codificada pela última sequência de nucleotídeo forma parte do referido produto de expressão (em outras palavras, que a última sequência de nucleotídeo está na mesma estrutura de leitura como a primeira sequência de áci- do nucleico ou nucleotídeo maior mencionada). Também, quando uma construção da invenção é dita de compreender um polipeptídeo ou ISVD, isto pode significar que dita construção pelo menos abrange dito polipeptídeo ou ISVD, respectivamente, mas de uma forma mais geral, isto significa que a referida construçãoo abrange grupos, resíduos (por exemplo, resíduos de aminoácido), componentes e/ou unidades de ligação além do dito polipeptídeo ou ISVD, independentemente de co- mo dito polipeptídeo ou ISVD é conectado a ditos grupos, resíduos (por exemplo, resíduos de aminoácido), componentes e/ou unidades de ligação e independentemente de como dita construção foi gerada ou obtida.

[0041] Por "essencialmente consistir em" significa que o domínio variável único de imunoglobulina utilizado no método da invenção é exatamente o mesmo que o domínio variável único de imunoglobulina da invenção ou corresponde ao domínio variável único de imunoglobu- lina da invenção que possui um número limitado de resíduos de ami- noácido, tais como de 1 a 20 resíduos de aminoácido, por exemplo, de 1 a 10 resíduos de aminoácido e preferivelmente de 1 a 6 resíduos de aminoácido, tais como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de aminoácido, adici- onados na extremidade amino terminal, na extremidade carbóxi termi- nal, ou tanto na extremidade amino terminal quanto na extremidade carbóxi terminal do domínio variável único de imunoglobulina.

[0042] Para os propósitos de comparar duas ou mais sequências de nucleotídeo, a porcentagem de "identidade de sequência" entre uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo pode ser calculada mediante a divisão do [número de nu-

cleotídeos na primeira sequência de nucleotídeo que são idênticos aos nucleotídeos nas posições correspondentes na segunda sequência de nucleotídeo] pelo [número total de nucleotídeos na primeira sequência de nucleotídeo] e multiplicação por [100%], em que cada deleção, in- serção, substituição ou adição de um nucleotídeo na segunda sequên- cia de nucleotídeo — comparada com a primeira sequência de nucleo- tídeo — é considerada como uma diferença em um único nucleotídeo (posição). Alternativamente, o grau de identidade de sequência entre duas ou mais sequências de nucleotídeo pode ser calculado utilizando um algoritmo de computador conhecido para o alinhamento de se- quência, tal como NCBI Blast v2.0, utilizando as configurações padrão. Algumas outras técnicas, algoritmos de computador e configurações para determinar o grau de identidade de sequência são, por exemplo, descritas nas WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 e GB 2357768. Geralmente, para o propósito de determinar a porcentagem de "identidade de se- quência" entre duas sequências de nucleotídeo de acordo com o mé- todo de cálculo descrito acima, a sequência de nucleotídeo com o maior número de nucleotídeos será considerada como a "primeira" se- quência de nucleotídeo, e a outra sequência de nucleotídeo será con- siderada como a "segunda" sequência de nucleotídeo.

[0043] Para os propósitos de comparar duas ou mais sequências de aminoácido, a porcentagem de "identidade de sequência" entre uma primeira sequência de aminoácido e uma segunda sequência de aminoácido (também referida aqui como "identidade de aminoácido") pode ser calculada pela divisão do [número de resíduos de aminoácido na primeira sequência de aminoácido que são idênticos aos resíduos de aminoácido nas posições correspondentes na segunda sequência de aminoácido] pelo [número total de resíduos de aminoácido na pri- meira sequência de aminoácido] e multiplicação por [100%], em que cada deleção, inserção, substituição ou adição de um resíduo de ami- noácido na segunda sequência de aminoácido - comparada com a primeira sequência de aminoácido - é considerada como uma diferen- ça em um único resíduo de aminoácido (posição), isto é, como uma "diferença de aminoácido" como definido nesta invenção. Alternativa- mente, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido pode ser calculado utilizando um algoritmo de computador conhecido, tal como aqueles mencionados acima para determinar o grau de identidade de sequência para sequências de nucleotídeo, no- vamente utilizando as configurações padrão. Geralmente, para o pro- pósito de determinar a porcentagem de "identidade de sequência" en- tre duas sequências de aminoácido de acordo com o método de cálcu- lo descrito acima, a sequência de aminoácido com o maior número de resíduos de aminoácidos será considerada como a "primeira" sequên- cia de aminoácido, e a outra sequência de aminoácido será considera- da como a "segunda" sequência de aminoácido.

[0044] Da mesma forma, na determinação do grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido, a pessoa versada pode levar em conta as assim chamadas substituições de aminoácido "conservadoras", que podem geralmente ser descritas como substitui- ções de aminoácido em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido de estrutura química semelhante e que possui pouca ou essencialmente nenhuma influência sobre a fun- ção, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. Tais substituições conservadoras de aminoácido são bem conhecidas na técnica, por exemplo, da WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e tipos e/ou combinações (preferíveis) de tais substituições podem ser selecionadas com base nos ensina- mentos pertinentes da, por exemplo, WO 04/037999, assim como da WO 98/49185, e das outras referências citadas nesta invenção.

[0045] Tais substituições conservadoras são preferivelmente subs- tituições em que um aminoácido dentro dos seguintes grupos de (a) a (e) é substituído por outro resíduo de aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) resíduos polares negativamente carregados e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, Glu e Gln; (c) resíduos pola- res positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d) resíduos alifáticos não polares grandes: Met, Leu, Ile, Val e Cys; e (e) resíduos aromáti- cos: Phe, Tyr e Trp. As substituições conservadoras particularmente preferidas são as seguintes: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou em His; Asp em Glu; Cys em Ser; GIn em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; lle em Leu ou em Val; Leu em lle ou em Val; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em lle; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Val, em Ile ou em Leu.

[0046] Quaisquer substituições de aminoácidos aplicadas aos po- lipeptídeos aqui descritos também podem ser baseadas na análise das frequências de variações de aminoácido entre proteínas homólogas de espécies diferentes desenvolvidas por Schulz et al. (“Principles of Pro- tein Structure”, Springer-Verlag, 1978), nas análises de potenciais de formação de estrutura desenvolvidos por Chou and Fasman (Bioche- mistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978), e na análise de padrões de hidrofobicidade em proteínas desenvolvidas por Eisen- berg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984), Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981), e Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986), todos aqui incorporados na sua totalidade por referência. A informação sobre a estrutura primária, secundária e terciária de Nanocorpos é dada na descrição nesta in- venção e na técnica anterior geral citada acima. Também, para este propósito, a estrutura cristalina de um domínio VHH de uma lhama é,

por exemplo, dada por Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996) e Decanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Informações adicio- nais sobre alguns dos resíduos de aminoácidos que em domínios Vn convencionais formam a interface Vx/V. e substituições de cameliza- ção potenciais nestas posições podem ser encontradas na técnica an- terior citada acima.

[0047] As sequências de aminoácido e as sequências de ácido nucleico são ditas serem "exatamente as mesmas" se elas tiverem 100% de identidade de sequência (como definido nesta invenção) so- bre todo o seu comprimento.

[0048] Quando se compara duas sequências de aminoácido, o termo "diferença de aminoácido" refere-se a uma inserção, deleção ou substituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da primeira sequência, em comparação com a segunda sequência; sendo compreendido que duas sequências de aminoácido podem conter uma, duas ou mais dessas diferenças de aminoácido. Mais particular- mente, nos ISVDs e/ou polipeptídeos da presente invenção, o termo "diferença de aminoácido" refere-se a uma inserção, deleção ou subs- tituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da se- quência de CDR especificada em b), d) ou f), em comparação com a sequência de CDR de respectivamente a), c) ou e); sendo entendido que a sequência de CDR de b), d) e f) pode conter uma, duas, três, quatro ou no máximo cinco de tais diferenças de aminoácido em com- paração com a sequência de CDR de respectivamente a), c) ou e).

[0049] A "diferença de aminoácidos" pode ser qualquer uma, duas, três, quatro ou no máximo cinco substituições, eliminações ou inser- ções, ou qualquer combinação destas, que melhora as propriedades do aglutinante de MMP13 da invenção, tal como o polipeptídeo da in- venção ou que pelo menos não deprecie demais as propriedades de-

sejadas ou o equilíbrio ou combinação de propriedades desejadas do aglutinante de MMP13 da invenção, tal como o polipeptídeo da inven- ção. A este respeito, o aglutinante de MMP13 resultante da invenção, tal como o polipeptídeo da invenção, deve pelo menos se ligar ao MMP13 com a mesma, aproximadamente a mesma ou uma afinidade mais elevada em comparação com o polipeptídeo que compreende a uma ou mais sequências de CDR sem a uma, duas, três, quatro ou no máximo cinco substituições, eliminações ou inserções. A afinidade po- de ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica, mas é preferivelmente medida por um método conforme descrito na seção de exemplos.

[0050] A este respeito, a sequência de aminoácido das CDRs de acordo com b), d) e/ou f) pode ser uma sequência de aminoácido que é derivada de uma sequência de aminoácido de acordo com a), c) e/ou e) respectivamente por meio de maturação por afinidade utilizando uma ou mais técnicas de maturação por afinidade conhecidas per se ou como descrito nos exemplos. Por exemplo, e dependendo do orga- nismo hospedeiro utilizado para expressar o polipeptídeo da invenção, tais eliminações e/ou substituições podem ser projetadas de tal manei- ra que um ou mais sítios para modificação pós-translacional (tal como um ou mais sítios de glicosilação) sejam removidos, como estará den- tro da capacidade da pessoa versada na técnica (cfe. Exemplos).

[0051] Como aqui utilizado, "representado por" no contexto de qualquer SEQ ID NO é equivalente a "compreende ou consiste em" dita SEQ ID NO e preferivelmente equivalente a "consiste em" dita SEQ ID NO.

[0052] Uma "família de Nanocorpos", "família VuH" ou "família" conforme utilizado no presente relatório descritivo se refere a um gru- po de Nanocorpos e/ou sequências de VHH que possuem comprimen- tos idênticos (isto é, possuem o mesmo número de aminoácidos den-

tro de sua sequência) e dos quais a sequência de aminoácido entre a posição 8 e a posição 106 (de acordo com a numeração Kabat) possui uma identidade de sequência de aminoácido de 89% ou mais.

[0053] Os termos "epítopo" e "determinante antigênico", que po- dem ser utilizados de modo trocável, referem-se à parte de uma ma- cromolécula, tal como um polipeptídeo ou proteína que é reconhecida por moléculas de ligação ao antígeno, tais como imunoglobulinas, an- ticorpos convencionais, domínios variáveis únicos de imunoglobulina e/ou polipeptídeos da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação ao antígeno de ditas moléculas. Os epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina, e assim representam o alvo de especificidade de uma imunoglobulina.

[0054] A parte de uma molécula de ligação ao antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo convencional, um domínio variável único de imunoglobulina e/ou um polipeptídeo da invenção) que reco- nhece o epítopo é chamada de "parátopo".

[0055] Uma sequência de aminoácido (tal como um domínio variá- vel único de imunoglobulina, um anticorpo, um polipeptídeo da inven- ção, ou de uma forma geral uma proteína de ligação ao antígeno ou polipeptídeo ou um fragmento destes) que pode "ligar a" ou "especifi- camente ligar a", que "possui afinidade para" e/ou que "possui especi- ficidade para" um certo epítopo, antígeno ou proteína (ou para pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo deste) é dito estar "contra" ou "direcionado contra" dito epítopo, antígeno ou proteína ou é uma mo- lécula de "ligação" com relação a esse epítopo, antígeno ou proteína, ou é dito ser "anti-epítopo", anti-antígeno ou "anti-proteína (por exem- plo,"anti"-MMP13).

[0056] A afinidade denota a resistência ou a estabilidade de uma interação molecular. A afinidade é geralmente dada como pela Kp, ou constante de dissociação, que possui unidades de mol/litro (ou M). À afinidade também pode ser expressa como uma constante de associa- ção, Ka, que é igual a 1/Kp e possui unidades de (mol/litro)'* (ou M). No presente relatório descritivo, a estabilidade da interação entre duas moléculas será principalmente expressa em termos do valor de Kp de sua interação; ficando claro para a pessoa versada que em vista da relação Ka = 1/Kp, especificando a resistência da interação molecular pelo seu valor de Kp, também pode ser utilizada para calcular o valor de Ka correspondente. O valor de Kp caracteriza a resistência de uma interação molecular também em um sentido termodinâmico quando se refere à mudança de energia livre (AG) de ligação pela relação bem conhecida AG = RTIn(Kp) (equivalentemente AG =-RTIn (KA)), onde R é igual à constante de gás, T é igual à temperatura absoluta e In signi- fica o logaritmo natural.

[0057] A Kp para interações biológicas que são consideradas signi- ficativas (por exemplo, específicas) está tipicamente na faixa de 10? M (0,001 nM) a 10º M (10.000 nM). Quanto mais forte é a interação, tanto mais baixa é a sua Ko.

[0058] A Kp também pode ser expressa como a relação da cons- tante de taxa de dissociação de um complexo, indicada como kof, para a taxa de sua associação, indicada como kon (de modo que Kp = Kkoti/Kon e Ka = kKon/Kos). A constante do índice de dissociação kKor possui unida- des s" (onde s é a notação de unidade SI do segundo). A constante do Índice de associação Kon possui unidades Ms. A constante do índice de associação pode variar entre 10º Ms a cerca de 107 Ms”, apro- ximando-se da constante do índice de associação limitada por difusão para interações bimoleculares. A constante do índice de dissociação está relacionada à meia-vida de uma dada interação molecular pela relação t12=In(2)/Kot. constante do índice de dissociação pode variar entre 108 s* (complexo quase irreversível com um t12 de múltiplos di- as) a 1 s (ti12=0,69 s).

[0059] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antíge- no, tal como um ISVD, a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, in- cluindo, por exemplo, ensaios de ligação de saturação e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição intercalados, e as suas vari- antes diferentes conhecidas per se na técnica; assim como as outras técnicas aqui mencionadas.

[0060] A afinidade de uma interação molecular entre duas molécu- las pode ser medida através de diferentes técnicas conhecidas per se, tais como a técnica de biossensor de ressonância de plásmon de su- perfície (SPR) bem conhecida (ver, por exemplo, Ober et al. 2001, In- tern. Immunology 13: 1551-1559) onde uma molécula é imobilizada sobre o chip biossensor e a outra molécula é passada sobre a molécu- la imobilizada sob condições de fluxo produzindo medições de Kon, Kotr e, consequentemente, valores de Kp (ou Ka). Isto pode, por exemplo, ser executado utilizando os Instrumentos BIACOREGO bem conhecidos (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). O Kinetic Exclusion As- say (KINEXAG) (Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43) mede eventos de ligação em solução sem marcação dos parceiros de ligação e se baseia na exclusão cinética da dissociação de um com- plexo. A análise por afinidade em solução também pode ser executada utilizando o sistema de imunoensaio GYROLABO, que fornece uma plataforma para bioanálise automatizada e movimentação rápida da amostra (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74).

[0061] Também ficará claro para a pessoa versada que a Ko me- dido pode corresponder à Kp aparente se o processo de medição in- fluenciar de alguma forma a afinidade de ligação intrínseca das molé- culas implicadas, por exemplo, por artefatos relacionados com o reves- timento sobre o biossensor de uma molécula. Da mesma forma, uma

Kp aparente pode ser medida se uma molécula contém mais do que um sítio de reconhecimento com relação à outra molécula. Em tal situ- ação, a afinidade medida pode ser afetada pela avidez da interação pelas duas moléculas. Em particular, a medição precisa da Ko pode ser muito trabalhosa e, como consequência, muitas vezes os valores de Kp aparentes são determinados para avaliar a força de ligação de duas moléculas. Deve-se observar que, contanto que todas as medi- ções sejam feitas de maneira consistente (por exemplo, mantendo as condições de ensaio inalteradas), as medições de Kp aparentes po- dem ser utilizadas como uma aproximação da Kp verdadeira e, portan- to, no presente documento a Kp e a Kp aparente devem ser tratadas com importância ou relevância igual.

[0062] O termo "especificidade" refere-se ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma molé- cula de ligação ao antígeno particular ou uma molécula de proteína de ligação ao antígeno (tal como um ISVD ou polipeptídeo da invenção) pode se ligar, por exemplo, como descrito no parágrafo n) nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079. A especificidade de uma proteína de liga- ção ao antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou avidez, conforme descrito nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079 (in- corporada aqui por referência), que também descreve algumas técni- cas preferidas para medir a ligação entre uma molécula de ligação ao antígeno (tal como um polipeptídeo ou ISVD da invenção) e o antígeno pertinente. Tipicamente, as proteínas de ligação ao antígeno (tais co- mo os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção) se ligarão a seu antíge- no com uma constante de dissociação (Kp) de 10º a 10? moles/litro ou menos, e preferivelmente 107 a 10? moles/litro ou menos e mais preferivelmente 10º a 10? moles/litro (isto é, com uma constante de associação (Ka) de 10º a 10º? litros/mol ou mais, e preferivelmente 107 a 10%? litros/mol ou mais e mais preferivelmente 10º a 10? litros/mol).

Qualquer valor de Ko maior do que 10º mol/litro (ou qualquer valor de Ka mais baixo do que 10º litros/mol) é geralmente considerado para indicar ligação não específica. De preferência, um ISVD monovalente da invenção se ligará ao antígeno desejado com uma afinidade menor do que 500 nM, de preferência menor do que 200 nM, mais preferivel- mente menor do que 10 nM, tal como menor do que 500 pM, tal como, por exemplo, entre 10 e 5 pM ou menos.

[0063] Um domínio variável único de imunoglobulina e/ou polipep- tídeo é dito de ser "específico para" um (primeiro) alvo ou antígeno comparado com outro (segundo) alvo ou antígeno quando se liga ao primeiro antígeno com uma afinidade (como descrito acima, e adequa- damente expresso como um valor de Kp, valor de Ka, índice de Korr e/ou índice de Kon) que é pelo menos 10 vezes, tal como pelo menos 100 vezes e preferivelmente pelo menos 1000 vezes ou mais, melhor do que a afinidade com a qual o domínio variável único de imunoglo- bulina e/ou polipeptídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulina e/ou polipeptídeo pode se ligar ao primeiro alvo ou antígeno com um valor de Kp que é pelo menos 10 vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, e preferivelmente pelo menos 1000 vezes menor ou ainda menor do que isso, do que a Kp com a qual dito domínio variável único de imunoglo- bulina e/ou polipeptídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. De pre- ferência, quando um domínio variável único de imunoglobulina e/ou polipeptídeo é "específico para" um primeiro alvo ou antígeno em comparação com um segundo alvo ou antígeno, ele é direcionado con- tra (como definido nesta invenção) dito primeiro alvo ou antígeno, mas não direcionado contra dito segundo alvo ou antígeno.

[0064] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antíge- no a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo,

ensaios de ligação por saturação, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitiva, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoen- saios de enzima (EIA) e ensaios de competição intercalados, e as su- as variantes diferentes conhecidas na técnica; assim como as outras técnicas mencionadas nesta invenção. Como ficará claro para a pes- soa versada, e conforme descrito nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079, a constante de dissociação pode ser a constante de disso- ciação real ou aparente. Os métodos para a determinação da constan- te de dissociação serão evidentes para a pessoa versada, e, por exemplo, incluem as técnicas mencionadas nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079.

[0065] Outra abordagem preferida que pode ser utilizada para ava- liar a afinidade é o procedimento de ELISA de 2 etapas (Ensaio Imu- noenzimático) de Friguet et a/. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19). Este método estabelece uma medição de equilíbrio de ligação de fase de solução e evita possíveis artefatos relacionados à adsorção de uma das moléculas sobre um suporte tal como plástico. Como ficará claro para a pessoa versada, e por exemplo, conforme descrito nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079, a constante de dissociação pode ser a constante de dissociação real ou aparente. Os métodos para a deter- minação da constante de dissociação serão claros para a pessoa ver- sada, e, por exemplo, incluem as técnicas mencionadas nas páginas 53 a 56 da WO 08/020079.

[0066] Em um aspecto, a invenção refere-se a um aglutinante de MMP13 tal como um ISVD e polipeptídeo da invenção, em que dito aglutinante de MMP13 não se liga á MMP1 ou MMP14 (tipo de mem- brana).

[0067] Finalmente, deve-se observar que em muitas situações, o cientista experimentado pode julgar que seja conveniente determinar a afinidade de ligação em relação à alguma molécula de referência. Por exemplo, para avaliar a força de ligação entre as moléculas A e B, po- de-se, por exemplo, utilizar uma molécula de referência C que é co- nhecida de se ligar a B e que é adequadamente marcada com um gru- po de fluoróforo ou cromóforo ou outro componente químico, tal como biotina para fácil detecção em um ELISA ou FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) ou outro formato (o fluoróforo para detecção de fluorescência, o cromóforo para detecção de absorção de luz, a biotina para detecção de ELISA mediada por estreptavidina). Ti- picamente, a molécula de referência C é mantida em uma concentra- ção fixa e a concentração de A é variada para uma dada concentração ou quantidade de B Como um resultado, um valor de IC5o é obtido que corresponde à concentração de A na qual o sinal medido para C na ausência de A é reduzido à metade. Contanto que a Kp res, a Ko da mo- lécula de referência, seja conhecida, assim como a concentração total Crest da molécula de referência, a Kp aparente para a interação A-B po- de ser obtido da seguinte fórmula: Kp =1ICs5o/(1+Cret/ Knrer). Observar que SE Cret << Kp ret, Kb = IC5o. Desde que a medição da IC5o seja executa- da de uma maneira consistente (por exemplo, mantendo a Cres fixa) pa- ra os aglutinantes que são comparados, a diferença na resistência ou estabilidade de uma interação molecular pode ser avaliada mediante a comparação da ICso e esta medição é avaliada como equivalente à Ko ou à Kp aparente por todo este texto.

[0068] A concentração inibidora meia-máxima (IC5o) também pode ser uma medida da eficácia de um composto na inibição de uma fun- ção biológica ou bioquímica, por exemplo, um efeito farmacológico. Esta medida quantitativa indica quanto do polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) é necessário para inibir um dado processo biológico (ou componente de um processo, isto é, uma enzima, célula, receptor celular, quimiotaxia, anaplasia, metástase, invasão, etc.) pela metade. Em outras palavras, é a concentração inibitória (IC) meia-

máxima (50%) de uma substância (IC 50%, ou IC5o). Os valores de IC5o podem ser calculados para um determinado antagonista, tal como o polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) da invenção, através da determinação da concentração necessária para inibir a me- tade da resposta biológica máxima do agonista. A Ko de um fármaco pode ser determinada através da construção de uma curva de dose- resposta e exame do efeito de diferentes concentrações de antagonis- ta tal como o polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) da invenção com a reversão da atividade de agonista.

[0069] O termo concentração eficaz meia-máxima (ECso) refere-se à concentração de um composto que induz uma resposta parcial entre o valor de referência e o máximo após um tempo de exposição especi- ficado. No presente contexto, é utilizado como uma medida de um po- lipeptídeo ou um ISVD (por exemplo, um Nanocorpo) de sua potência. A ECs5o de uma curva de resposta de dose graduada representa a con- centração de um composto onde 50% do seu efeito máximo é obser- vado. A concentração é preferivelmente expressa em unidades mola- res.

[0070] Nos sistemas biológicos, pequenas mudanças na concen- tração do ligante resultam tipicamente em rápidas alterações na res- posta, seguindo uma função sigmoidal. O ponto de inflexão no qual o aumento na resposta com a concentração crescente do ligante come- ça a retardar é a EC5o. Isto pode ser determinado matematicamente pela derivação da linha de melhor ajuste. Contar com um gráfico para a estimativa é conveniente na maioria dos casos. No caso a ECs5o é fornecida na seção de exemplos, os experimentos foram projetados para refletir a Kp tão precisamente quanto possível. Em outras pala- vras, os valores de EC5o podem então ser considerados como valores de KD. O termo "KD média" refere-se ao valor de KD médio obtido em pelo menos 1, mas preferivelmente mais do que 1, tal como pelo me-

nos 2 experimentos. O termo "média" refere-se ao termo matemático "média" (somas de dados divididos pelo número de itens nos dados).

[0071] Também está relacionado à IC5so que é uma medida de um composto de sua inibição (50% de inibição). Para os ensaios de liga- ção competitiva e ensaios de antagonista funcionais, a ICso é a medida de resumo mais comum da curva de dose-resposta. Para os ensaios de agonista/estimulador, a medida de resumo mais comum é à ECso.

[0072] A constante de inibição, Ki, é uma indicação de quão poten- te um inibidor é; é a concentração necessária para produzir a inibição meia-máxima. Ao contrário da ICso, que pode mudar potencialmente dependendo das condições experimentais (mas ver acima), a Ki é um valor absoluto e é frequentemente referida como a constante de inibi- ção de um fármaco. A constante de inibição K; pode ser calculada através do uso da equação de Cheng-Prusoff: — TC50 em que [L] é a concentração fixa do ligante.

[0073] O termo "potência" de um polipeptídeo da invenção, con- forme aqui utilizado, é uma função da quantidade de polipeptídeo da invenção necessária para que ocorra seu efeito específico. É medido simplesmente como o inverso da ICso para esse polipeptídeo. Refere- se à capacidade de dito polipeptídeo da invenção modular e/ou inibir parcial ou completamente uma atividade de MMP13. Mais particular- mente, pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo em redu- zir ou mesmo totalmente inibir a atividade de MMP13 como definido nesta invenção. Como tal, pode se referir à capacidade de dito poli- peptídeo em inibir a proteólise, tal como as atividades de endopeptida- se da atividade de protease, e/ou ligação de um substrato, tal como, por exemplo, Aggrecan, Colágeno |l, Colágeno |, Colágeno Ill, Colá- geno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e gelatina. A potên-

cia pode ser medida por qualquer ensaio adequado conhecido na téc- nica ou aqui descrito.

[0074] A "eficácia" do polipeptídeo da invenção mede a força má- xima do próprio efeito, na saturação de concentrações de polipeptídeo. A eficácia indica a resposta máxima obtenível a partir do polipeptídeo da invenção. Refere-se à capacidade de um polipeptídeo em produzir o efeito desejado (terapêutico).

[0075] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito nesta invenção, em que dito polipeptídeo se liga à MMP13 com uma Kp entre 16º M e 1E3 M, tal como entre 11º M e 1E? M, preferivelmente no máximo 1E” M, preferivelmente mais bai- xo do que 16º M ou 16º M, ou ainda mais baixo do que 1Eº M, tal como 5E** M, 4E=*? M, 3E! M, 2E M, 1,7Eº M, 1E M, ou mesmo 5E? M, 4272? M, 3E? M, 152 M, por exemplo, como determinado por KinExA.

[0076] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito nesta invenção, em que dito polipeptídeo inibe uma atividade do MMP13 com uma ICso entre 16º M e 1E? M, tal como entre 1Eº M e 1E! M, por exemplo, como determinado por ELISA competitivo, um ELISA TIMP-2 competitivo, ensaio de peptídeo fluoro- gênico, ensaio de colágeno fluorogênico ou ensaio colagenolítico, tal como, por exemplo, conforme detalhado na seção de Exemplos.

[0077] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo conforme aqui descrito, em que dito polipeptídeo inibe uma atividade de MMP13 com uma ICs5o de no máximo 1Eº M, preferivelmente 1Eº8 M, 5E-º M, ou 4Eº M, 3Eº M, 2Eº M, tal como 16º M.

[0078] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo como aqui descrito, em que dito polipeptídeo se liga à MMP13 com uma ECso entre 1E-” M e 1E? M, tal como entre 11º M e 112º M, por exemplo, como determinado por ELISA, ELISA TIMP-2 competiti-

vo, ensaio de peptídeo fluorogênico, ensaio de colágeno fluorogênico ou ensaio colagenolítico.

[0079] Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito nesta invenção, em que o referido polipeptídeo se liga à MMP13 com um índice de dissociação menor do que 5Eº (s”), por exemplo, conforme determinado por SPR.

[0080] Uma sequência de aminoácido, tal como um ISVD ou poli- peptídeo, é dita de ser "reativa cruzada" para dois antígenos diferentes ou determinantes antigênicos (tais como, por exemplo, MMP13 de di- ferentes espécies de mamífero, tais como, por exemplo, MMP13 de ser humano, MMP13 de cachorro, MMP13 de bovinos, MMP13 de ra- to, MMP13 de porco, MMP13 de camundongo, MMP13 de coelho, MMP13 de cinomolgo e/ou MMP13 de reso) se for específico para (conforme aqui definido) estes diferentes antígenos ou determinantes antigênicos. Será observado que um ISVD ou polipeptídeo pode ser considerado como de ser reativo cruzado embora a afinidade de liga- ção para os dois antígenos diferentes possa diferir, tal como por um fator, 2, 5, 10, 50, 100 ou ainda mais fornecido é específico para (co- mo aqui definido) estes diferentes antígenos ou determinantes antigê- nicos.

[0081] A MMP13 também é conhecida como CLG3 ou Colagenase 3, MANDP1, MMP-13, matriz metalopeptidase 13, ou MDST.

[0082] A informação estrutural relevante para a MMP13 pode ser encontrada, por exemplo, nos UniProt Accession Numbers como re- presentado na Tabela 1 Abaixo (cf. Tabela B).

Tabela 1 NP 002418.1 MMP13 |H.sapiens 115 XP 0011543611 MMP13 |P.troglodytes 116 XP 001098996.1 MMP13 |M.mulatta 1107 XP 536598.3 MMP13 |C.lupus 118 NP 7768141 MMP13 |B.taurus 119 NP 032633.1 Mmp13 M.musculus 120 NP 598214.1 Mmp13 IR.norvegicus 121 XP 003640635.1 MMP13 jlG.gallus 122

[0083] "MMP13" refere-se à MMP13 que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 115. Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção se liga especificamente à MMP13 de Human sapiens, Mus musculus, Canis lupus, Bos taurus, Macaca mulatta, Rattus norvegi- cus, Gallus gallus e/ou P. troglodytes, preferivelmente MMP13 huma- na, preferivelmente SEQ ID NO: 115.

[0084] Os termos "(cruzado)-bloco", "(cruzado)-bloqueado", "(cru- zado)-bloqueio", "ligação competitiva", "(cruzado)-compete", "(cruza- do)-competindo" e "(cruzado)-competição" são utilizados de modo tro- cável nesta invenção para significar a capacidade de uma imunoglobu- lina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação de inter- ferir com a ligação de outras imunoglobulinas, anticorpos, ISVDs, poli- peptídeos ou agentes de ligação a um dado alvo. A extensão em que uma imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de outra ao alvo, e, portan- to, se pode ser dito de bloco cruzado de acordo com a invenção, pode ser determinada utilizando ensaios de ligação de competição, que são comuns na técnica, tais como, por exemplo, através da triagem de ISVDs purificados contra ISVDs apresentados em fagos em um ELISA de competição conforme descrito nos exemplos. Métodos para deter- minar se uma imunoglobulina, anticorpo, domínio variável único de imunoglobulina, polipeptídeo ou outro agente de ligação direcionado contra um alvo (cruzado)-blocos, é capaz de (cruzado)-bloqueio, com- petitivamente se liga ou é (cruzado)-competitivo como definido nesta invenção são descritos, por exemplo, em Xiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004), Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118—125, 2011) e/ou os métodos aqui descritos (ver, por exemplo, o Exemplo 7).

[0085] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito aqui, tal como representado pelas SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,2,3,4,5, 6, 7 ou 8, em que dito polipeptídeo compete com um polipeptídeo, por exemplo, conforme determinado por ELISA de competição.

[0086] A presente invenção refere-se a um método para a deter- minação de competidores, tais como polipeptídeos, que competem com um polipeptídeo conforme descrito nesta invenção, tal como re- presentado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2,3,4,5,6,7 ou 8, em que o polipeptídeo conforme aqui descrito compete ou bloqueia por cruzamento o competidor, tal como um polipeptídeo, para ligação à MMP13, tal como, por exemplo, MMP13 humana (SEQ ID NO: 115), em que a ligação à MMP13 do competidor é reduzida em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como 80%, 90% ou mesmo 100% (isto é virtualmente não detectável em um dado ensaio) na presença de um polipeptídeo da invenção, em compa- ração com a ligação á MMP13 do competidor na ausência do polipep- tídeo da invenção. A competição e o bloqueio cruzado podem ser de- terminados por qualquer meio conhecido na técnica, tal como, por exemplo, um ELISA de competição. Em um aspecto, a presente inven-

ção refere-se a um polipeptídeo da invenção, em que dito polipeptídeo bloqueia por cruzamento a ligação à MMP13 de pelo menos um dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2,3,4,5,6,7 ou 8 e/ou é bloqueado por cruzamento a partir da ligação à MMP13 em pelo menos um dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,2, 3,4,5,6,7 ou 8.

[0087] A presente invenção também refere-se aos competidores que competem com um polipeptídeo conforme descrito nesta inven- ção, tal como as SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o com- petidor compete ou bloqueia por cruzamento o polipeptídeo conforme descrito nesta invenção para ligação à MMP13, em que a ligação à MMP13 do polipeptídeo da invenção é reduzida em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como 80% ou ainda mais tal como pelo menos 90% ou ainda 100% (isto é virtual- mente não detectável em um dado ensaio) na presença de dito com- petidor, em comparação com a ligação à MMP13 através do polipeptí- deo da invenção na ausência de dito competidor. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma ligação de bloqueio cruzado de po- lipeptídeo à MMP13 por um polipeptídeo da invenção tal como uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 e/ou é bloqueado por cru- zamento à MMP13 em pelo menos uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8, preferivelmente em que dito polipeptídeo compreende pelo menos um VH, VL, dAb, domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) que se liga especificamente à MMP13, em que a ligação à MMP13 modula uma atividade de MMP13.

[0088] A "atividade de MMP13" inclui, mas não é limitada a estas, proteólise, tal como atividade de protease (também chamada atividade de proteinase ou peptidase), e atividades de endopeptidase, por um lado, e ligação do substrato, por exemplo, através do domínio seme- lhante a hemopexina e domínio de ligação de peptidoglicano. Uma ati- vidade de MMP13 inclui a ligação e/ou a proteólise de substratos tais como Aggrecan, Colágeno 1l, Colágeno |, Colágeno Ill, Colágeno |V, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e gelatina. Como aqui utiliza- do, a proteólise é a decomposição de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores através da hidrólise das ligações peptídicas que ligam os aminoácidos entre si em uma cadeia polipeptídica.

[0089] No contexto da presente invenção, "modulação" ou "modu- lar" geralmente significa alterar uma atividade por MMP13, conforme medido utilizando um ensaio in vitro, celular ou in vivo adequado (tal como aqueles mencionados nesta invenção). Em particular, "modula- ção" ou "modular" pode significar reduzir ou inibir uma atividade de, ou alternativamente aumentar uma atividade de MMP13, conforme medi- do utilizando um ensaio in vitro, celular ou in vivo adequado (por exemplo, tal como aqueles aqui mencionados), em pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou pelo menos 25%, por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou 90% ou mais, em comparação com a atividade de MMP13 no mesmo ensaio sob as mesmas condições, mas sem a presença do ISVD ou polipeptídeo da invenção.

[0090] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo conforme aqui descrito, em que dito polipeptídeo modula uma atividade de MMP13, de preferência inibindo uma atividade de MMP13.

[0091] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como descrito nesta invenção, em que dito polipeptídeo inibe a atividade de protease da MMP13, tal como inibe a proteólise de um substrato, tal como Aggrecan, Colágeno 1|l, Colágeno |, Colágeno Il, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e/ou gelati- na.

[0092] Em conformidade, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo conforme aqui descrito, em que dito polipeptídeo bloqueia a ligação de MMP13 a um substrato, tal como Aggrecan, Colágeno Il, Colágeno |, Colágeno Ill, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Co- lágeno XIV e/ou gelatina, em que dito Colágeno é preferivelmente Co- lágeno |l.

[0093] Em um aspecto a invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que dito polipeptídeo bloqueia a ligação de MMP13 ao Colágeno e/ou Aggrecan de pelo menos 20%, tal como pe- lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, por exemplo, conforme determinado por ensaios de competição base- ados em ELISA (cf. Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289:24091- 24101).

[0094] Em um aspecto a invenção refere-se a um polipeptídeo conforme descrito nesta invenção, em que dito polipeptídeo antagoni- za ou inibe uma atividade de MMP13, tal como (i) uma atividade de protease, preferivelmente clivagem de Aggrecan e/ou Colágeno, em que o referido Colágeno é preferivelmente Colágeno Il; (II) ligação de Colágeno ao domínio semelhante a hemopexina.

[0095] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo como aqui descrito, em que dito polipeptídeo inibe a ativi- dade de protease da MMP13, preferivelmente em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, como determinado por qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como, por exem- plo, através de ensaios de competição ou conforme descrito na seção de Exemplos.

ISVD

[0096] A menos que de outro modo indicado, os termos "imuno- globulina" e "sequência de imunoglobulina" — utilizados nesta invenção para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias — são utilizados como um termo geral para incluir tanto o anticorpo de tamanho total, as suas cadeias individuais, assim como todas as partes, domínios ou seus fragmentos (incluindo, mas não limitado aos domínios ou fragmentos de ligação ao antígeno tais como domínios VHH ou domínios VH/V., respectivamente).

[0097] O termo "domínio" (de um polipeptídeo ou proteína) con- forme aqui utilizado, refere-se a uma estrutura de proteína dobrada que possui a capacidade de reter sua estrutura terciária independen- temente do resto da proteína. Geralmente, os domínios são responsá- veis pelas propriedades funcionais discretas das proteínas, e em mui- tos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos a outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domí- nio.

[0098] O termo "domínio de imunoglobulina" como aqui utilizado refere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpos (tal co- mo, por exemplo, uma cadeia de um anticorpo convencional de 4 ca- deias ou de um anticorpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídeo que consiste essencialmente em uma tal região globular. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados pelo fato de que eles retêm a ca- racterística de dobra da imunoglobulina de moléculas de anticorpo, que consiste em uma estrutura em sanduíche de duas camadas de cerca de sete beta-filamentos antiparalelos dispostos em duas beta- lâminas, opcionalmente estabilizadas por uma ligação de dissulfeto conservada.

[0099] O termo "domínio variável de imunoglobulina" como aqui utilizado significa um domínio de imunoglobulina que consiste essenci- almente em quatro "regiões de estrutura" que são referidas na técnica e aqui abaixo como "região estrutural 1" ou "FR1"; como "região estru- tural 2" ou "FR2"; como "região estrutural 3" ou "FR3"; e como "região estrutural 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões estruturais são interrompidas por três "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" que são referidas na técnica e mais abaixo como "região determinante de complementaridade 1" ou "CDR1"; como "região de- terminante de complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "região de- terminante de complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente. As- sim, a estrutura geral ou sequência de um domínio variável de imuno- globulina pode ser indicada como se segue: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. É o domínio variável de imunoglobulina que confere especificidade a um anticorpo com relação ao antígeno a através do transporte do sítio de ligação ao antígeno. Nas modalida- des preferidas de todos os aspectos da invenção, um domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) de acordo com a invenção preferivel- mente consiste ou essencialmente consiste em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de comple- mentaridade CDR1, CDR2 e CDR3 na referida estrutura geral confor- me acima delineado. As sequências estruturais preferidas são deline- adas, por exemplo, na tabela A-2 abaixo e podem ser utilizadas em um ISVD da invenção. De preferência, as CDRs representadas na Tabela A-2 são combinadas com as respectivas regiões estruturais da mesma construção de ISVD.

[00100] O termo "domínio variável único de imunoglobulina" (aqui abreviado como "ISVD" ou "ISV"), e de modo trocável utilizado com "domínio variável único", define moléculas em que o sítio de ligação ao antígeno está presente, e formado, por um único domínio de imuno- globulina. Isto estabelece domínios variáveis únicos de imunoglobulina além das imunoglobulinas "convencionais" ou seus fragmentos, em que dois domínios de imunoglobulina, em particular dois domínios va- riáveis, interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Tipica- mente, nas imunoglobulinas convencionais, um domínio variável de cadeia pesada (Vx) e um domínio variável de cadeia leve (V.) intera- gem para formar um sítio de ligação ao antígeno. No último caso, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) tanto de Vn quanto de V, irão contribuir com o sítio de ligação ao antígeno, isto é, um total de 6 CDRs estará envolvida na formação do sítio de ligação ao antígeno.

[00101] Em vista da definição acima, o domínio de ligação ao antí- geno de um anticorpo convencional de 4 cadeias (tal como uma molé- cula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecida na técnica) ou de um fra- gmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv tal como um Fv ligado por dissulfeto ou um fragmento scFv, ou um diacorpo (todos co- nhecidos na técnica) derivado de tal anticorpo convencional de 4 ca- deias, normalmente não seria considerado como um domínio variável único de imunoglobulina, como, nestes casos, ligando ao respectivo epítopo de um antígeno, normalmente não ocorreria por um domínio de imunoglobulina (único), mas por um par de domínios de imunoglo- bulina (em associação) tais como domínios variáveis de cadeia leve e pesada, isto é, por um par de V4-V.L de domínios de imunoglobulina, que se ligam conjuntamente a um epítopo do respectivo antígeno.

[00102] Em contraste, os ISVDs são capazes de se ligar especifi- camente a um epítopo do antígeno sem pareamento com um domínio variável de imunoglobulina adicional. O sítio de ligação de um ISVD é formado por um único domínio VHH, VnH ou V.. Portanto, o sítio de liga- ção ao antígeno de um ISVD é formado por não mais do que três CDRs.

[00103] Como tal, o domínio variável único pode ser uma sequência de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência V.) ou um fragmento adequado desta; ou uma sequência de domínio vari- ável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VH ou uma se- quência VHH) ou um fragmento adequado desta; contanto que seja ca- paz de formar uma única unidade de ligação ao antígeno (isto é, uma unidade de ligação ao antígeno funcional que consiste essencialmente no domínio variável único, de tal modo que o domínio de ligação ao antígeno único não precisa interagir com outro domínio variável para formar uma unidade de ligação ao antígeno funcional).

[00104] Em uma modalidade da invenção, os ISVDs são sequên- cias de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequên- cia VH); mais especificamente, os ISVDs podem ser sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo de quatro cadeias convencional ou sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo de cadeia pesada.

[00105] Por exemplo, o ISVD pode ser um anticorpo de domínio (único) (ou um peptídeo que é adequado para uso como um anticorpo de domínio (único), um "dAb" ou dAb (ou um peptídeo que é adequado para uso como um dAb) ou um Nanocorpo (como definido nesta in- venção, e incluindo, mas não limitado a um VHH); outros domínios vari- áveis únicos, ou qualquer fragmento adequado de qualquer um destes.

[00106] Em particular, o ISVD pode ser um NanobodyO (conforme aqui definido) ou um fragmento adequado deste. [Nota: NanobodyO e Nanobodies& são marcas registradas da Ablynx N.V.] Para uma des- crição geral de Nanocorpos, referência é feita à descrição adicional abaixo, assim como à técnica anterior aqui citada, tal como, por exem- plo, descrita na WO 08/020079 (página 16).

[00107] Os "domínios VHH", também conhecidos como VHHs, domí- nios VHH, fragmentos de anticorpos VHH e anticorpos VHH, foram ori- ginalmente descritos como o domínio de imunoglobulina de ligação ao antígeno (variável) de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anti- corpos desprovidos de cadeias leves"; Hamers-Casterman et a/. 1993 Nature 363: 446-448). O termo "domínio Vn" foi escolhido para distin- guir estes domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes nos anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos aqui como "domínios VH" ou "domínios VH") e dos domí- nios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos con- vencionais de 4 cadeias (que são referidos aqui como "domínios V." ou "domínios VL"). Para uma descrição adicional de VHH's e Nanocor- pos, é feita referência ao artigo de revisão de Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), assim como aos se- guintes pedidos de patente, que são mencionados como técnica ante- cedente geral: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 da Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 da Algonomics N.V. and Ablynx N.V.; WO 01/90190 pela National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) pelo Institute of Antibodies; assim como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 e WO 06/122825, da Ablynx N.V. e os ou- tros pedidos de patente publicados da Ablynx N.V.

Referência também é feita à outra técnica anterior mencionada nestes pedidos, e em parti- cular à lista de referências mencionadas nas páginas 41 a 43 do pedi- do Internacional WO 06/040153, cuja lista e referências são aqui in- corporadas por referência.

Como descrito nestas referências, os Na- nocorpos (em particular sequências VHH e Nanocorpos parcialmente humanizados) podem, em particular, ser caracterizados pela presença de um ou mais "resíduos Hallmark" em uma ou mais das sequências estruturais. Uma descrição adicional dos Nanocorpos, incluindo huma- nização e/ou camelização de Nanocorpos, assim como outras modifi- cações, partes ou fragmentos, derivados ou "fusões de nanocorpos", construções multivalentes (incluindo alguns exemplos não limitativos de sequências conectoras) e diferentes modificações para aumentar a meia-vida dos Nanocorpos e suas preparações, pode ser encontrada, por exemplo, nas WO 08/101985 e WO 08/142164. Para uma outra descrição geral de nanocorpos, referência é feita à técnica anterior aqui citada, tal como, por exemplo, descrita na WO 08/020079 (página 16).

[00108] Em particular, as sequências estruturais presentes nos aglutinantes de MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou polipep- tídeos da invenção, podem conter um ou mais resíduos Hallmark (por exemplo, conforme definido na WO 08/020079 (Tabelas A-3 a A-8)), de tal modo que o aglutinante de MMP13 da invenção seja um Nano- corpo. Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de (combina- ções adequadas de) tais sequências estruturais se tornarão claros a partir da divulgação adicional nesta invenção (vide, por exemplo, a Ta- bela A-2). Geralmente, os Nanocorpos (em particular, sequências VHn e nanocorpos parcialmente humanizados) podem, em particular, ser caracterizados pela presença de um ou mais "resíduos Hallmark" em uma ou mais das sequências estruturais (como, por exemplo, descritas adicionalmente na WO 08/020079, página 61, linha 24 à página 98, linha 3).

[00109] Mais particularmente, a invenção fornece aglutinantes de MMP13 compreendendo pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina que é uma sequência de aminoácido com estrutura (geral) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 em que FR1 a FR4 referem-se às regiões estruturais de 1 a 4, respec- tivamente, e em que CDR1 a CDR3 referem-se às regiões determinan- tes de complementaridade de 1 a 3, respectivamente, e que dito ISVD: i) possui pelo menos 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais pre- ferivelmente 95% de identidade de aminoácido com pelo menos uma das sequências de aminoácido da SEQ ID NOs: 111, 11,112, 12,109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2,3,4,5,6,7 ou 8 (ver a Tabela A-1), em que para os propósitos de determinar o grau de identidade de aminoácido, os resíduos de aminoácido que formam as sequências de CDR são desconsiderados. A este respeito, referência também é feita à Tabela A-2, que lista as sequências estruturais 1 (SEQ ID NOs: 67 a 79), sequências estruturais 2 (SEQ ID NOs: 80 a 87 e 108), sequências estruturais 3 (SEQ ID NOs: 88 a 99 e 113 a 114) e sequências estruturais 4 (SEQ ID NOs: 100 a 104) dos domí- nios variáveis únicos de imunoglobulina das SEQ ID NOs: 1 a 22 e 109 a 112; ou ii) combinações de sequências estruturais como descritas na Tabela A-2; e em que: iii) de preferência um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posi- ções 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 e 108 de acordo com a nume- ração Kabat são selecionados dos resíduos Hallmark tais como men- cionados na Tabela A-3 até a Tabela A-8 da WO 08/020079.

[00110] Os aglutinantes de MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, também podem conter as mu- tações especíificas/resíduos de aminoácido descritos nos seguintes pedidos provisórios US copendentes, todos intitulados "Improved Immunoglobulin variable domains": US 61/994552 depositado em 16 de maio de 2014; US 61/014.015 depositado em 18 de junho de 2014; US 62/040.167 depositado em 21 de agosto de 2014; e US

62/047 .560, depositado em 8 de setembro de 2014 (todos designados para Ablynx N.V.).

[00111] Em particular, os aglutinantes de MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, podem adequada- mente conter (i) um K ou Q na posição 112; ou (ii) um K ou Q na posi- ção 110 em combinação com um V na posição 11; ou (iii) um T na po- sição 89; ou (iv) um L na posição 89 com um K ou Q na posição 110; ou (v) um V na posição 11 e um L na posição 89; ou qualquer combi- nação adequada de (i) a (v).

[00112] Como também descritos nos pedidos provisórios US co- pendentes, quando o aglutinante de MMP13 da invenção, tal como o ISVD e/ou polipeptídeo da invenção, contiver as mutações de acordo com um de (i) a (v) acima (ou uma combinação adequada destes): - o resíduo de aminoácido na posição 11 é preferivelmente escolhido de L, V ou K (e é mais preferível V); e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 14 é de preferência adequada- mente selecionado de A ou P; e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 41 é de preferência adequada- mente selecionado de A ou P; e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 89 é de preferência adequada- mente selecionado de T, V ou L; e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 108 é de preferência adequa- damente selecionado de Q ou L; e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 110 é de preferência adequa- damente selecionado de T, K ou Q; e/ou - o resíduo de aminoácido na posição 112 é de preferência adequa- damente selecionado de S, K ou Q.

[00113] Como mencionado em ditos pedidos provisórios US copen- dentes, ditas mutações são eficazes na prevenção ou redução da liga- ção dos assim chamados "anticorpos pré-existentes" às imunoglobuli-

nas e compostos da invenção. Para este propósito, os aglutinantes de MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou polipeptídeos da inven- ção, também podem conter (opcionalmente em combinação com ditas mutações) uma extensão C-terminal (X)n (em que n é de 1 a 10, prefe- rivelmente de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 (e preferivelmente 1 ou 2, tal como 1); e cada X é um resíduo de aminoácido (preferivelmente de ocorrência natural) que é independentemente selecionado, e de prefe- rência independentemente selecionado do grupo que consiste em ala- nina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (1)), para os quais é feita referência novamente aos ditos pedidos provisórios US assim como para a WO 12/175741. Em particular, um aglutinante de MMP13 da invenção, tal como um ISVD e/ou polipeptídeo da inven- ção, pode conter uma tal extensão C-terminal quando forma a extre- midade C-terminal de uma proteína, polipeptídeo ou outro composto ou construção compreendendo a mesma (novamente, conforme ainda descrito nos referidos pedidos provisórios US assim como a WO 12/175741).

[00114] Um aglutinante de MMP13 da invenção pode ser uma imu- noglobulina, tal como um domínio variável único de imunoglobulina, derivada de qualquer maneira adequada e de qualquer fonte adequa- da, e pode, por exemplo, ser sequências VHu de ocorrência natural (is- to é, de uma espécie adequada de Camelídeo) ou sequências de ami- noácido sintéticas ou semi-sintéticas, incluindo, mas não limitadas às sequências de nanocorpos "humanizadas" (como aqui definido) ou VHH, sequências de imunoglobulina "camelizadas" (como definidas nesta invenção) (e em particular sequências de domínio variável de cadeia pesada camelizadas), assim como nanocorpos que foram obti- dos por técnicas tais como maturação por afinidade (por exemplo, par- tindo de sequências de imunoglobulina sintéticas, aleatórias ou de ocorrência natural), fragmentos de enxerto, aparência, combinação de

CDR derivados de diferentes sequências de imunoglobulina, monta- gem de PCR utilizando iniciadores sobrepostos, e técnicas similares para o planejamento de sequências de imunoglobulina bem conheci- das da pessoa versada; ou qualquer combinação adequada de qual- quer um dos precedentes conforme descrito mais acima. Da mesma forma, quando uma imunoglobulina compreende uma sequência VHn, dita imunoglobulina pode ser adequadamente humanizada, como aqui descrito mais adiante, de modo a fornecer uma ou mais imunoglobuli- nas humanizadas adicionais (parcial ou completamente) da invenção. Similarmente, quando uma imunoglobulina compreende uma sequên- cia sintética ou semi-sintética (tal como uma sequência parcialmente humanizada), dita imunoglobulina pode opcionalmente ser ainda ade- quadamente humanizada, novamente como descrito nesta invenção, maus uma vez de modo a fornecer uma ou mais imunoglobulinas hu- manizadas adicionais (parcial ou completamente) da invenção.

[00115] Os "anticorpos de domínio", também conhecidos como "Dab's", "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" (os termos "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" sendo utilizados como marcas comerciais pelo gru- po GlaxoSmithKline de companhias), foram descritos, por exemplo, na EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) e WO 03/002609 assim como, por exemplo, WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 e outros pedidos de patente publicados da Domantis Ltd. Os anticorpos de domínio correspondem essencialmente aos domínios VH ou VL de mamíferos não cemelídeos, em particular anticorpos humanos de 4 cadeias. A fim de ligar um epítopo como um único domínio de ligação ao antígeno, isto é, sem ser pareado com um domínio VL ou VH, res- pectivamente, uma seleção específica para tais propriedades de liga- ção ao antígeno é necessária, por exemplo, mediante o uso de biblio- tecas de sequências de domínio VH ou VL isoladas humanas. Os anti-

corpos de domínio possuem, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa e, se derivados de sequências completamente humanas, não requerem humanização, por exemplo, para uso terapêutico em seres humanos.

[00116] Deve-se também ser observado que, embora menos prefe- ríveis no contexto da presente invenção porque eles não são de ori- gem mamífera, os domínios variáveis únicos podem ser derivados de certas espécies de tubarão (por exemplo, os assim chamados "domí- nios I9INAR", ver, por exemplo, a WO 05/18629).

[00117] A presente invenção refere-se particularmente aos ISVDs, em que ditos ISVDs são selecionados do grupo que consiste em VHHs, VHHs Humanizados e VHs camelizados.

[00118] Os resíduos de aminoácido de um domínio VHH são nume- rados de acordo com a numeração geral para domínios Vx fornecida por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), con- forme aplicada aos domínios VHH de Camelídeos, como mostrado, por exemplo, na Figura 2 de Riechmann and Muyldermans (J. Immu- nol. Methods 231: 25-38, 1999). Métodos alternativos para a numera- ção dos resíduos de aminoácidos de domínios Vn, cujos métodos tam- bém podem ser aplicados de uma maneira análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. No entanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat aplicada aos domínios VHH como descrito acima será seguida, a menos que de outro modo indicado.

[00119] Deve ser observado que — como é bem conhecido na técni- ca para domínios Vx e para domínios VHH — o número total de resí- duos de aminoácido em cada uma das CDRs pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicados pela numeração Kabat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a numeração Kabat podem não estar ocupadas na sequência real, ou a sequência real pode conter mais resíduos de aminoácido do que o número levado em conta pela numeração Kabat). Isto significa que, de uma forma geral, a numeração de acordo com Kabat pode ou não cor- responder à numeração real dos resíduos de aminoácido na sequência real. O número total de resíduos de aminoácido em um domínio VH e um domínio VHH geralmente estará na faixa de 110 a 120, frequente- mente entre 112 e 115. Deve, no entanto, ser observado que sequên- cias menores e maiores também podem ser adequadas para os pro- pósitos aqui descritos.

[00120] Com relação às CDRs, como é bem conhecido na técnica, existem múltiplas convenções para definir e descrever as CDRs de um fragmento VH ou VHH, tal como a definição de Kabat (que é baseada na variabilidade de sequência e é a mais comumente utilizada) e a de- finição de Chothia (que é baseada no local das regiões de alça estrutu- rais). Referência é feita, por exemplo, ao site da Internet http://www .bioinf.org.uk/abs/. Para os propósitos do presente relatório descritivo e reivindicações, as CDRs são mais preferivelmente defini- das com base na definição de Abm (que é baseada no software de modelagem de anticorpo ADM da Oxford Molecular), já que isto é con- siderado como um compromisso ideal entre as definições de Kabat e Chothia (cf. http://www.bioinf.org.uk/abs/). Como aqui utilizado, FR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 1 a 25, CDR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 26 a 35, FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36 a 49, CDR2 compreen- de os resíduos de aminoácido nas posições 50 a 58, FR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 59 a 94, CDR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 95 a 102 e FR4 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 103 a 113.

[00121] No significado da presente invenção, o termo "domínio vari-

ável único de imunoglobulina" ou "domínio variável único" compreende polipeptídeos que são derivados de uma fonte não humana, de prefe- rência uma camelídeo, de preferência um anticorpo de cadeia pesada de camelídeo. Eles podem ser humanizados, conforme descrito nesta invenção. Além do mais, o termo compreende polipeptídeos derivados de fontes não camelídeos, por exemplo, camundongo ou ser humano, que foram "camelizados", como aqui descrito.

[00122] —Consequentemente, os ISVDs tais como anticorpos de do- mínio e nanocorpos (incluindo domínios VHH) podem ser submetidos à humanização. Em particular, os ISVDs humanizados, tais como na- nocorpos (incluindo domínios VHH) podem ser ISVDs que são como geralmente definidos nesta invenção, mas em que pelo menos um re- síduo de aminoácido esteja presente (e em particular, em pelo menos um dos resíduos estruturais) que é e/ou que corresponde a uma subs- tituição de humanização (conforme definido nesta invenção). As subs- tituições de humanização potencialmente úteis podem ser determina- das pela comparação da sequência das regiões estruturais de uma sequência VHH de ocorrência natural com a sequência estrutural cor- respondente de uma ou mais sequências Vx humanas intimamente relacionadas, após o que uma ou mais das substituições de humani- zação potencialmente úteis (ou suas combinações) assim determina- das podem ser introduzidas na referida sequência VxH (de qualquer maneira conhecida per se, como ainda descrita nesta invenção) e as sequências VHH humanizadas resultantes podem ser testadas quanto à afinidade com relação ao alvo, para estabilidade, para facilidade e ní- vel de expressão e/ou com relação às outras propriedades desejadas. Deste modo, por meio de um grau limitado de tentativa e erro, outras substituições de humanização adequadas (ou suas combinações ade- quadas) podem ser determinadas pela pessoa versada com base na divulgação desta invenção. Da mesma forma, com base no preceden-

te, (as regiões estruturais de) um ISVD, tal como um Nanocorpo (inclu- indo domínios VHH), pode ser parcialmente humanizado ou totalmente humanizado.

[00123] Outra classe particularmente preferida de ISVDs da inven- ção compreende ISVDs com uma sequência de aminoácido que cor- responde à sequência de aminoácido de um domínio Vu de ocorrência natural, mas que foi "camelizada", isto é, pela substituição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido de um do- mínio Vu de ocorrência natural a partir de um anticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais dos resíduos de aminoácido que ocorrem nas posições correspondentes em um domínio VHa de um anticorpo de cadeia pesada. Isto pode ser executado de uma maneira conhecida per se, que será clara para a pessoa versada, por exemplo, com base na descrição nesta invenção. Tais substituições de "camelização" são preferivelmente inseridas nas posições de aminoácido que formam e/ou estão presentes na interface Vu4-V., e/ou nos assim chamados resíduos de marca característica Camelidae, como aqui definido (ver também, por exemplo, a WO 94/04678 e Davies and Riechmann (1994 e 1996)). De preferência, a sequência Vx que é utilizada como um ma- terial de partida ou ponto de partida para gerar ou projetar os domínios variáveis únicos de imunoglobulina camelizados é preferivelmente uma sequência Vx de um mamífero, mais preferivelmente a sequência Vy de um ser humano, tal como uma sequência VH3. Entretanto, deve ser observado que tais domínios variáveis únicos de imunoglobulina ca- melizados da invenção podem ser obtidos de qualquer maneira ade- quada conhecida per se e assim não são estritamente limitados aos polipeptídeos que foram obtidos utilizando um polipeptídeo que com- preende um domínio Vn de ocorrência natural como um material de partida. Referência é, por exemplo, feita a Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng.

9: 531-537, 1996) e a Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Me- thods 231: 25-38, 1999).

[00124] Por exemplo, novamente como ainda aqui descrito, tanto a "humanização" quanto a "camelização" podem ser executadas pelo fornecimento de uma sequência de nucleotídeo que codifica um domí- nio VHH ou domínio Vn de ocorrência natural, respectivamente, e de- pois alteração, de uma maneira conhecida per se, de um ou mais có- dons em dita sequência de nucleotídeo de tal maneira que a nova se- quência de nucleotídeo codifica um ISVD "humanizado" ou "cameliza- do" da invenção, respectivamente. Este ácido nucleico pode então ser expresso de uma maneira conhecida per se, de modo a fornecer os ISVDs desejados da invenção. Alternativamente, com base na se- quência de aminoácido de um domínio VHxH ou domínio Vx de ocorrên- cia natural, respectivamente, a sequência de aminoácido dos ISVDs humanizados ou camelizados desejados da invenção, respectivamen- te, pode ser projetada e depois sintetizada novamente utilizando técni- cas para a síntese de peptídeos conhecidas per se. Também, com ba- se na sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo de um domínio VHH ou domínio Vx de ocorrência natural, respectivamente, uma sequência de nucleotídeo que codifica os ISVDs humanizados ou camelizados desejados da invenção, respectivamente, pode ser proje- tada e depois sintetizada de novo utilizando técnicas para a síntese de ácido nucleico conhecida per se, após o que o ácido nucleico assim obtido pode ser expresso de uma maneira conhecida per se, de modo a fornecer os ISVDs desejados da invenção.

[00125] Os ISVDs tais como anticorpos de domínio e nanocorpos (incluindo domínios VHH e domínios VHH humanizados), também po- dem ser submetidos à maturação por afinidade através da introdução de uma ou mais alterações na sequência de aminoácido de uma ou mais CDRs, cujas alterações resultam em uma afinidade melhorada do

ISVD resultante para zeu respectivo antígeno, em comparação com a respectiva molécula de origem. As moléculas de ISVD amadurecidas por afinidade da invenção podem ser preparadas por métodos conhe- cidos na técnica, por exemplo, conforme descrito por Marks et a/. (Bio- technology 10:779-783, 1992), Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins et al. (J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996).

[00126] O processo de projetar/selecionar e/ou preparar um poli- peptídeo, partindo de um ISVD tal como um VHn, V., VHyH, anticorpo de domínio ou um Nanocorpo, é também referido aqui como "formatação" do dito ISVD; e um ISVD que faz parte de um polipeptídeo é dito de ser "formatado" ou estar "no formato de" dito polipeptídeo. Exemplos de meios nos quais um ISVD pode ser formatado e exemplos de tais formatos serão evidentes para a pessoa versada com base na divul- gação nesta invenção; e tal domínio variável único de imunoglobulina formatado forma um outro aspecto da invenção.

[00127] As CDRs preferidas são representadas na Tabela A-2.

[00128] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que dito ISVD se liga especificamente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementari- dade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em (a) SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 24; e

(b) sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 dife- renças de aminoácido com as SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36 e 24; (ii) a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em (c) SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51,38e39;e (d) sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 dife- renças de aminoácido com SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 388 e 39; e (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64,65, 66 e 53; e (f) sequências de aminoácido que possuem 1, 2, 3 ou 4 di- ferenças de aminoácido com SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 e 53.

[00129] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como descrito nesta invenção, em que o dito ISVD se liga especifica- mente se liga à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estru- turais (FR1 a FRA4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em (a) SEQ ID NO: 23; e (b) sequência de aminoácido que possui 1 diferença de aminoácidos com a SEQ ID NO: 23, em que na posição 7 o Y foi alte- rado em R; (ii) a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em (c) SEQ ID NO: 37; e (d) sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 dife- renças de aminoácido com a SEQ ID NO: 37, em que - na posição 4 o V foi alterado em T;

- na posição 5 o G foi alterado em A; e/ou - na posição 9 o N foi alterado em H; (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQ ID NO: 52; e (f) sequência de aminoácido que possui 1 diferença de aminoácido com a SEQ ID NO: 52, em que na posição 6, o Y foi alte- rado em S.

[00130] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como descrito nesta invenção, em que dito ISVD se liga especifica- mente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de comple- mentaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) a CDR1 é SEQ ID NO: 26; (ii) a CDR2 é SEQID NO: 41; e (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQ ID NO: 55; e (f) sequência de aminoácido que possui 1 ou 2 diferenças de aminoácido com a SEQ ID NO: 55, em que - na posição 8 o N foi alterado em Q ou S; e/ou - na posição 19 o N foi alterado em V ou Q.

[00131] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que dito ISVD se liga especificamente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementari- dade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais (i) a CDR1 é SEQ ID NO: 28; (ii) a CDR2 é SEQ ID NO: 43 (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste da (e) SEQ ID NO: 57; e

(f) sequência de aminoácido que possui 1, 2, 3 ou 4 dife- renças de aminoácido com a SEQ ID NO: 57, em que - na posição 10 o D foi alterado em E, G, A, P, T R, M, W ouY; - na posição 16 o M foi alterado em A, R ND, E, Q, Z,G,,LK,F,P,S,W,YouV; - na posição 17 o D foi alterado em A, R N, C, E, Q, Z, G, HI, L, K, M, S,T, W, Y ou V; e/ou - na posição 18 o Y foi alterado em A, R, N, D, C, E, Q, 7, G, H, I, L, K, M, EF, P, S, T, WouV.

[00132] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que dito ISVD se liga especificamente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões de estrutura (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementari- dade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais - a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 24; - a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 388 e 39; e - CDR3 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 e 53.

[00133] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como descrito nesta invenção, em que dito ISVD se liga especifica- mente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões de estrutura (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de comple- mentaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), em que dito ISVD é selecionado do grupo de ISVDs, em que: - CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 42, e CDR3 é SEQ ID NO: 56; - CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 43, e CDR3 é SEQ ID NO: 107;

- CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 43, e CDR3 é SEQ ID NO: 57;

- CDR1 é SEQ ID NO: 25, CDR2 é SEQ ID NO: 40, e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

- CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41, e CDR3 é SEQ ID NO: 106;

- CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41, e CDR3 é SEQ ID NO: 55;

- CDR1 é SEQ ID NO: 23, CDR2 é SEQ ID NO: 37, e CDR3 é SEQ ID NO: 52;

- CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 48, e CDR3 é SEQ ID NO: 62;

- CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41, e CDR3 é SEQ ID NO: 63;

- CDR1 é SEQ ID NO: 29, CDR2 é SEQ ID NO: 44, e CDR3 é SEQ ID NO: 58;

- CDR1 é SEQ ID NO: 30, CDR2 é SEQ ID NO: 45, e CDR3 é SEQ ID NO: 58;

- CDR1 é SEQ ID NO: 31, CDR2 é SEQ ID NO: 46, e CDR3 é SEQ ID NO: 59;

- CDR1 é SEQ ID NO: 32, CDR2 é SEQ ID NO: 47, e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

- CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 41, e CDR3 é SEQ ID NO: 61;

- CDR1 é SEQ ID NO: 34, CDR2 é SEQ ID NO: 49, e CDR3 é SEQ ID NO: 64;

- CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 50, e CDR3 é SEQ ID NO: 65;

- CDR1 é SEQ ID NO: 36, CDR2 é SEQ ID NO: 51, e CDR3 é SEQ ID NO: 66; - CDR1 é SEQ ID NO: 23, CDR2 é SEQ ID NO: 39, e CDR3 é SEQ ID NO: 53; e - CDR1 é SEQ ID NO: 24, CDR2 é SEQ ID NO: 38, e CDR3 é SEQ ID NO: 52.

[00134] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como aqui descrito, em que dito ISVD se liga especificamente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementari- dade (CDR1 a CDR3, respectivamente), em que a CDR1 é SEQ ID NO: 27, a CDR2 é SEQ ID NO: 42 e a CDR3 é SEQ ID NO: 56.

[00135] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD como descrito nesta invenção, em que dito ISVD se liga especifica- mente à MMP13 e consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de comple- mentaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), em que dito ISVD é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2, 3,4,5,6,7 e.

[00136] Será observado que, sem limitação, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da presente invenção podem ser utilizados como um "bloco de construção" para a preparação de um polipeptídeo, que pode opcionalmente conter um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina adicionais que podem servir como um bloco de construção (isto é, contra o mesmo ou outro epítopo em MMP13 e/ou contra um ou mais outros antígenos, proteínas ou alvos do que a MMP13).

POLIPEPTÍDEO

[00137] O polipeptídeo da invenção compreende pelo menos um ISVD que se liga à MMP, preferiveimente MMP13, tal como dois

ISVDs que se ligam à MMP13 e, de preferência, também pelo menos no ISVD que se liga ao Aggrecan, mais preferivelmente dois ISVDs que se ligam ao Aggrecan. Em um polipeptídeo da invenção, os ISVDs podem ser ligados diretamente ou ligados através de um ligador. Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo da invenção compreende uma extensão C-terminal. Como será detalhada abaixo, a extensão C- terminal essencialmente impede/remove a ligação de anticorpos/fato- res pré-existentes na maioria das amostras de indivíduos/pacientes humanos. A extensão C-terminal está presente C-terminalmente do último resíduo de aminoácido (geralmente um resíduo de serina) do último (o mais C-terminalmente localizado) ISVD.

[00138] Como ainda elaborado nesta invenção, os ISVDs podem ser derivados de um domínio VHH, Vr ou Vr, entretanto, os ISVDs são selecionados de tal modo que eles não formem pares complementares de domínios Vx e VL nos polipeptídeos da invenção. O Nanocorpo, VHH, e Vu humanizado são incomuns pelo fato de que eles são deri- vados de anticorpos naturais de camelídeo que não possuem cadeias leves e, de fato, estes domínios não são capazes de associar-se com cadeias leves de camelídeo para formar pares de VHH e Vi comple- mentares. Assim, os polipeptídeos da presente invenção não compre- endem os ISVDs complementares e/ou formam pares de ISVD com- plementares, tais como, por exemplo, pares de Vx/V. complementares.

[00139] Geralmente, os polipeptídeos ou construções que compre- endem ou essencialmente consistem em um único bloco de constru- ção, por exemplo, um único ISVD ou nanocorpo isolado, serão referi- dos nesta invenção como polipeptídeos "monovalentes" e "constru- ções monovalentes", respectivamente. Os polipeptídeos ou constru- ções que compreendem dois ou mais blocos de construção (tais como, por exemplo, ISVDs) também serão referidos aqui como polipeptídeos ou construções "multivalentes", e os blocos de construção/ISVDs pre-

sentes em tais polipeptídeos ou construções também serão referidos aqui como estando em um "formato multivalente". Por exemplo, um polipeptídeo "bivalente" pode compreender dois ISVDs, opcionalmente ligados através de uma sequência de ligador, enquanto que um poli- peptídeo "trivalente" pode compreender três ISVDs, opcionalmente conectados por meio de duas sequências de ligador; enquanto que um polipeptídeo "tetravalente" pode compreender quatro ISVDs, opcio- nalmente conectados através de três sequências de ligador, etc.

[00140] Em um polipeptídeo multivalente, os dois ou mais ISVDs podem ser iguais ou diferentes, e podem ser direcionados contra o mesmo antígeno ou determinante antigênico (por exemplo, contra a mesma parte ou epítopo ou contra diferentes partes ou epítopos) ou podem, alternativamente, ser direcionados contra diferentes antígenos ou determinantes antigênicos; ou qualquer combinação adequada des- tes. Os polipeptídeos e construções que contêm pelo menos dois blo- cos de construção (tais como, por exemplo, ISVDs) em que pelo me- nos um bloco de construção é direcionado contra um primeiro antígeno (isto é, MMP13) e pelo menos um bloco de construção é direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de MMP13), também serão referidos como polipeptídeos e construções "multiespecíficos", e os blocos de construção (tais como, por exemplo, ISVDs) presentes em tais polipeptídeos e construções também serão referidos aqui co- mo estando em um "formato multiespecífico". Assim, por exemplo, um polipeptídeo "biespecífico" da invenção é um polipeptídeo que com- preende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antíge- no (isto é, MMP13) e pelo menos um outro ISVD direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de MMP13), enquanto que um polipeptídeo "triespecífico" da invenção é um polipeptídeo que com- preende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antíge- no (isto é, MMP13), pelo menos um outro ISVD direcionado contra um

Segundo antígeno (isto é,, diferente de MMP13) e pelo menos um ou- tro ISVD direcionado contra um terceiro antígeno (isto é, diferente tan- to do MMP13 quanto do segundo antígeno); etc.

[00141] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo que compreende dois ou mais ISVDs que se ligam especifi- camente à MMP13, em que a) pelo menos um "primeiro" ISVD se liga especificamente a um pri- meiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou confirmação de MMP13; preferivelmente dito "primeiro" ISVD que es- pecificamente se liga à MMP13 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22; e em que, b) pelo menos um "segundo" ISVD se liga especificamente a um se- gundo determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou confirmação de MMP13, diferente do primeiro epítopo determinante antigênico, parte, domínio, subunidade ou confirmação, respectiva- mente, de preferência dito "segundo" ISVD que especificamente se liga à MMP13 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6,7e8.

[00142] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo que compreende dois ou mais ISVDs que se ligam especifi- camente à MMP13, selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 160 a 165, preferivelmente SEQ ID NO: 160 (cf. Tabela A-3).

[00143] Os polipeptídeos "multiparatópicos" e as construções "mul- tiparatópicas", tais como, por exemplo, polipeptídeos ou construções "biparatópicas" e polipeptídeos ou construções "triparatópicas", com- preendem ou essencialmente consistem em dois ou mais blocos de construção, em que cada um possui um parátopo diferente.

[00144] —“Consequentemente, os ISVDs da invenção que se ligam à MMP13 podem estar na forma essencialmente isolada (conforme aqui definido), ou podem fazer parte de uma construção ou polipeptídeo, que pode compreender ou consistir essencialmente em um ou mais ISVDs que se ligam à MMP13 e que podem opcionalmente compreen- der ainda uma ou mais sequências adicionais de aminoácido (todas opcionalmente conectadas através de um ou mais ligadores adequa- dos). A presente invenção refere-se a um polipeptídeo ou construção que compreende ou essencialmente consiste em pelo menos um ISVD de acordo com a invenção, tal como um ou mais ISVDs da invenção (ou seus fragmentos adequados), que se ligam à MMP13.

[00145] O um ou mais!SVDs da invenção podem ser utilizados co- mo um bloco de construção em tal polipeptídeo ou construção, de mo- do a fornecer um polipeptídeo ou construção monovalente, multivalen- te ou multiparatópico da invenção, respectivamente, tudo como des- crito nesta invenção. A presente invenção desse modo também se re- fere a um polipeptídeo que é um constructo monovalente que compre- ende ou essencialmente consiste em um polipeptídeo monovalente ou ISVD da invenção.

[00146] A presente invenção assim também se refere a um polipep- tídeo ou construção que é um polipeptídeo multivalente ou construção multivalente, respectivamente, tal como, por exemplo, um polipeptídeo ou construção bivalente ou trivalente compreendendo ou essencial- mente consistindo em dois ou mais ISVDs da invenção (para polipep- tídeos multivalentes e multiespecíficos contendo um ou mais domínios VHH e sua preparação, referência, por exemplo, também é feita a Con- rath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001), assim como, por exemplo, às WO 96/34103, WO 99/23221 e WO 2010/115998).

[00147] Emum aspecto, em sua forma mais simples, o polipeptídeo ou construção multivalente da invenção é um polipeptídeo ou constru- ção bivalente da invenção que compreende um primeiro ISVD, tal co- mo um Nanocorpo, direcionado contra a MMP13, e um segundo ISVD idêntico, tal como um Nanocorpo, direcionado contra a MMP13, em que dito primeiro e dito segundo ISVDs, tais como Nanocorpos, podem opcionalmente ser ligados através de uma sequência de ligador (con- forme aqui definido). Em sua forma mais simples, um polipeptídeo ou construção multivalente da invenção pode ser um polipeptídeo ou construção trivalente da invenção, compreendendo um primeiro ISVD, tal como Nanocorpo, direcionado contra a MMP13, um segundo ISVD idêntico, tal como Nanocorpo, direcionado contra a MMP13 e um ter- ceiro ISVD idêntico, Tal como um Nanocorpo, direcionado contra a MMP13, em que ditos primeiro, segundo e terceiro ISVDs, tais como nanocorpos, podem opcionalmente ser ligados por meio de uma ou mais, e em particular duas, sequências de ligador. Em um aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo ou construção que compreende ou essencialmente consiste em pelo menos dois ISVDs de acordo com a invenção, tais como 2, 3 ou 4 ISVDs (ou seus fragmentos adequa- dos), que se ligam à MMP13. Os dois ou mais ISVDs podem opcio- nalmente ser ligados através de um ou mais ligadores peptídicos.

[00148] Em outro aspecto, o polipeptídeo ou construção multivalen- te da invenção pode ser um polipeptídeo ou construção biespecífico da invenção, compreendendo um primeiro ISVD, tal como um nanocorpo, direcionado contra a MMP13, e um segundo ISVD, tal como um nano- corpo, direcionado contra um segundo antígeno, tal como, por exem- plo, Aggrecan, em que ditos primeiro e segundo ISVDs, tais como Na- nocorpos, podem opcionalmente ser ligados através de uma sequên- cia de ligador (conforme aqui definido); enquanto que um polipeptídeo ou construção multivalente da invenção também pode ser um polipep- tídeo ou construção triespecífica da invenção, compreendendo um primeiro ISVD, tal como um Nanocorpo, direcionado contra a MMP13, um segundo ISVD, tal como um Nanocorpo, direcionado contra um segundo antígeno, tal como por exemplo um Aggrecan, e um terceiro

ISVD, tal como um Nanocorpo, direcionado contra um terceiro antíge- no, em que ditos primeiro, segundo e terceiro ISVDs, tais como Nano- corpos, podem opcionalmente ser ligados através de uma ou mais, e em particular duas, sequências de ligador.

[00149] A invenção refere-se ainda a um polipeptídeo multivalente que compreende ou (essencialmente) consiste em pelo menos um ISVD (ou seus fragmentos adequados) que se liga à MMP13, preferi- velmente à MMP13 de ser humano, e pelo menos um ISVD adicional, tal como um ISVD que se liga ao Aggrecan.

[00150] Os polipeptídeos biespecíficos trivalentes particularmente preferidos de acordo com a invenção são aqueles mostrados nos Exemplos aqui descritos e na tabela A-3.

[00151] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo ou construção da invenção compreende ou consiste essencialmente em pelo menos dois ISVDs, em que os ditos pelo menos dois ISVDs podem ser iguais ou diferentes, mas dos quais pelo menos um ISVD é direcionado con- tra a MMP13.

[00152] Os dois ou mais ISVDs presentes no polipeptídeo ou cons- trução multivalente da invenção podem consistir em uma sequência de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência V.) ou em uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exem- plo, uma sequência Vn); eles podem consistir em uma sequência de domínio variável de cadeia pesada que é derivada de um anticorpo convencional de quatro cadeias ou de uma sequência de domínio vari- ável de cadeia pesada que é derivada do anticorpo de cadeia pesada. Em um aspecto preferido, eles consistem em um anticorpo de domínio (ou um peptídeo que é adequado para uso como um anticorpo de do- mínio), de um anticorpo de domínio único (ou um peptídeo que é ade- quado para uso como um anticorpo de domínio único), de um "dAb" (ou um peptídeo que é adequado para uso como um dAb), de um Na-

nobody& (incluindo mas não limitado ao VxH), de uma sequência VHr humanizada, de uma sequência Vn camelizada; ou de uma sequência VHH que foi obtida através da maturação por afinidade. Os dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem consistir em um Nanocorpo parcial ou completamente humanizado ou um VHm par- cial ou completamente humanizado.

[00153] Em um aspecto da invenção, o primeiro ISVD e o segundo ISVD presentes no polipeptídeo ou construção multiparatópico (prefe- rivelmente biparatópico ou triparatópico) da invenção não competem (cruzados) entre si para ligação à MMP13 e, como tais, pertencem a diferentes famílias. Consequentemente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo ou construção multiparatópico (preferivelmente bipa- ratópico) compreendendo dois ou mais ISVDs em que cada ISVD per- tence a uma família diferente. Em um aspecto, o primeira ISVD deste polipeptídeo ou construção multiparatópico (preferivelmente biparató- pico) da invenção não bloqueia por cruzamento a ligação à MMP13 do segundo ISVD deste polipeptídeo ou construção multiparatópico (pre- ferivelmente biparatópico) da invenção e/ou o primeiro ISVD não é bloqueado por cruzamento a partir da ligação à MMP13 pelo segundo ISVD. Em outro aspecto, o primeiro ISVD de um polipeptídeo ou cons- trução multiparatópico (preferivelmente biparatópico) da invenção blo- queia por cruzamento a ligação à MMP13 do segundo ISVD deste po- lipeptídeo ou construção multiparatópico (preferivelmente biparatópico) da invenção e/ou o primeiro ISVD é bloqueado por cruzamento a partir da ligação à MMP13 pelo segundo ISVD.

[00154] Em um aspecto particularmente preferido, o polipeptídeo ou construção da invenção compreende ou essencialmente consiste em três ou mais ISVDs, dos quais pelo menos dois ISVDs são direciona- dos contra a MMP13. Será observado que ditos pelo menos dois ISVDs direcionados contra a MMP13 podem ser iguais ou diferentes,

podem ser direcionados contra o mesmo epítopo ou diferentes epíto- pos de MMP13, podem pertencer ao mesmo depósito de epítopo ou a diferentes depósitos de epítopo, e/ou podem se ligar aos mesmos ou diferentes domínios de MMP13.

[00155] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo ou construção da invenção compreende ou consiste essencialmente em pelo menos dois ISVDs que se ligam à MMP13, em que ditos pelo menos dois ISVDs podem ser iguais ou diferentes, os quais são independentemen- te selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22 e SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5,6, 7 e 8, mais preferivelmente ditos pelo menos dois ISVDs são independentemente selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9 e 1 e/ou pelo me- nos um ISVD é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21 e 22 e pelo menos um ISVD é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5,6,7e8.

[00156] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptí- deo ou construção multiparatópico (de preferência biparatópico) com- preendendo dois ou mais ISVDs direcionados contra a MMP13 que se ligam aos mesmos epítopos como é ligado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22 ou ligado por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,2,3,4,5, 6,7e8.

[00157] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um poli- peptídeo conforme descrito nesta invenção, em que dito polipeptídeo possui pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% (mais preferivelmente pelo menos 95% e o mais preferível 100%) de identidade de sequên- cia com qualquer uma das SEQ ID NOs: 160 a 165 (isto é,160, 161, 162, 163, 164 ou 165) e 176 a 192 (isto é 176, 177, 178, 179, 180,

181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 ou 192), preferi- velmente a SEQ ID NO: 192.

RETENÇÃO

[00158] A técnica está com necessidade de terapias mais eficazes para distúrbios que afetam a cartilagem das articulações, tais como a osteoartrite. Mesmo quando administrado intra-articularmente, o tempo de permanência da maioria dos fármacos para o tratamento da cartila- gem afetada é insuficiente. Os presentes inventores formularam uma hipótese de que a eficácia de um fármaco terapêutico, tal como uma construção, polipeptídeo e ISVD da invenção, pode ser aumentada significativamente através do acoplamento do fármaco terapêutico a um componente que "fixaria" o fármaco na articulação e consequen- temente aumentaria a retenção do fármaco, mas que não deve inter- romper a eficácia de dito fármaco terapêutico (este componente é aqui também indicado como "proteína de fixação de cartilagem" ou "CAP"). Este conceito de fixação não somente aumenta a eficácia do fármaco, mas também a especificidade operacional com relação a uma articula- ção doente, através da diminuição da toxicidade e efeitos colaterais, desse modo ampliando o número de possíveis fármacos úteis.

[00159] Foi antecipado que o formato final de uma molécula para uso clínico compreende um ou dois blocos de construção, tais como ISVDs, que se ligam à MMP13, e um ou mais blocos de construção, por exemplo, ISVDs, com um tal modo de ação de retenção, e possi- velmente outros componentes. Na seção de Exemplos, é demonstrado que tais formatos retêm tanto a ligação de MMP13 quanto o efeito te- rapêutico, por exemplo, atividade inibidora, assim como as proprieda- des de retenção. O um ou mais blocos de construção, tais como ISVDs, com um modo de ação de retenção, podem ser qualquer bloco de construção que possui um efeito de retenção ("bloco de construção de CAP") em doenças nas quais a MMP13 está envolvida, tais como doença artrítica, osteoartrite, displasia espongioepimetafiseal, doença de degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articula- ções, artrite reumatóide, osteocondrite dissecante, aggrecanopatias e metástases de malignidades.

[00160] Um "bloco de construção de CAP" deve ser utilizado para o direcionamento, fixação e/ou retenção de outros, por exemplo, blocos terapêuticos de construção, tais como os ISVDs que se ligam à MMP13 em um local desejado, tal como, por exemplo, em uma articu- lação, em que dito outro, por exemplo, bloco de construção terapêutico é para exercer seu efeito, por exemplo, ligação e/ou inibição de uma atividade de MMP13.

[00161] Os presentes inventores formularam ainda uma hipótese de que os aglutinantes de Aggrecan, tais como os ISVDs que se ligam ao Aggrecan, podem potencialmente funcionar como um tal agente de fixação, embora o Aggrecan seja fortemente glicosilado e degradado em vários distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações. Além disso, em vista dos custos e testes extensivos em vários modelos ani- mais requeridos antes de um fármaco poder entrar na clínica, tais aglutinantes de Aggrecan devem preferivelmente ter uma ampla reati- vidade cruzada de espécies, por exemplo, os aglutinantes de Aggre- can devem se ligar ao Aggrecan de várias espécies.

[00162] Utilizando vários métodos de imunização, triagem e carac- terização engenhosos, os presentes inventores foram capazes de identificar vários aglutinantes de Aggrecan com seletividade, estabili- dade e características de especificidade superiores, que permitiram retenção prolongada e atividade na articulação.

[00163] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do para reduzir e/ou inibir o efluxo de uma composição, um polipeptí- deo ou uma construção de uma articulação, em que dito método com- preende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, uma cons- trução de acordo com a invenção, ou uma composição de acordo com a invenção a uma pessoa com sua necessidade.

[00164] Na presente invenção, o termo "reduzir e/ou inibir o efluxo" significa reduzir e/ou inibir o fluxo externo da composição, polipeptídeo ou construção de dentro de uma articulação para fora. De preferência, o efluxo é reduzido e/ou inibido em pelo menos 10%, tal como pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50% ou ainda mais, tal como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100%, em comparação com o efluxo da composição, polipeptídeo ou construção anteriormente mencionada em uma articulação sob as mesmas condições, mas sem a presença do aglutinante de Aggrecan da invenção, por exemplo, ISVDs que se ligam ao Aggrecan.

[00165] — Ao lado das doenças em que a MMP13 está envolvida, tais como doença artrítica, osteoartrite, displasia espongioepimetafiseal, doença de degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações, artrite reumatóide, osteocondrite dissecante, aggrecano- patias e metástases de malignidades, antecipa-se que os aglutinantes de Aggrecan da invenção também podem ser utilizados em várias ou- tras doenças que afetam a cartilagem, tais como artrópatias e condro- distrofias, doença artrítica (tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumática ou descolamento), acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafiseal, hérnia de disco espinhal, doença de degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente (comumente indicada aqui como "doenças associadas ao Aggrecan").

[00166] O bloco de construção de CAP, por exemplo, ISVDs que se ligam ao Aggrecan, preferivelmente se liga ao tecido cartilaginoso, tal como cartilagem e/ou menisco. Em um aspecto preferido, o bloco de construção de CAP é reativo por cruzamento com relação às outras espécies e se liga especificamente a um ou mais de Aggrecan humano (SEQ ID NO: 105), Aggrecan de cachorro, Aggrecan de bovinos, Aggrecan de rato; Aggrecan de porco; Aggrecan de camundongo, Aggrecan de coelho; Aggrecan de cinomolgo e/ou Aggrecan de reso. À informação estrutural relevante para o Aggrecan pode ser encontrada, por exemplo, em números de acesso (UniProt) conforme representado na Tabela 2 abaixo.

[00167] Um bloco de construção de CAP preferido é um ISVD que se liga ao Aggrecan, preferivelmente um Aggrecan humano, de prefe- rência representado pela SEQ ID NO: 105 como representado na Ta- bela B. Tabela 2

[00168] A presente invenção refere-se assim a um polipeptídeo ou construção de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo menos um bloco de construção de CAP.

[00169] A presente invenção desse modo refere-se a um polipeptí- deo ou construção de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo menos um ISVD que especificamente se liga ao Aggrecan, tal como mostrado na Tabela E, e preferivelmente selecionado dos ISVDs representados pelas SEQ ID NOs: 166 a 168.

[00170] Em particular, a presente invenção refere-se a um ISVD que especificamente se liga ao Aggrecan, em que dito ISVD consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FRA, respectivamen- te) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), em que dito ISVD é selecionado do grupo de ISVDs, em que (a) CDR1 é SEQ ID NO: 169, CDR2 é SEQ ID NO: 170 e CDR3 is SEQ ID NO: 171; e (b) CDR1 é SEQ ID NO: 172, CDR2 é SEQ ID NO: 173 e CDR3 és SEQ ID NO: 174.

[00171] Em um aspecto a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo conforme descrito nesta invenção, que compreende pelo me- nos 2 ISVDs que especificamente se liga ao Aggrecan.

[00172] Em um aspecto a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo como aqui descrito, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente se liga ao Aggrecan, em que ditos pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan podem ser iguais ou diferentes.

[00173] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo como aqui descrito, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan, em que ditos pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan são independen- temente selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 166 a

168.

[00174] Em um aspecto a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo como descrito nesta invenção, compreendendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan, em que ditos pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan são Re- presentados pelas SEQ ID NOs: 166 a 168.

[00175] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo como aqui descrito, compreendendo um ISVD que especifi- camente se liga ao Aggrecan, em que dito ISVD que especificamente se ligam ao Aggrecan, se liga especificamente ao Aggrecan humano [SEQ ID NO: 105].

[00176] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo conforme descrito nesta invenção, em que dito ISVD que es- pecificamente se liga ao Aggrecan, se liga especificamente ao Aggre- can humano (SEQ ID NO: 105), ao Aggrecan de cachorro, ao Aggre- can de bovinos, ao Aggrecan de rato; ao Aggrecan de porco; ao Aggrecan de camundongo, ao Aggrecan de coelho; ao Aggrecan de cinomolgo e/ou ao Aggrecan de reso.

[00177] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo como aqui descrito, em que dito ISVD que especificamente se liga ao Aggrecan, de preferência se liga ao tecido cartilaginoso tal como cartilagem e/ou menisco.

[00178] Será observado que o ISVD, polipeptídeo e construção da invenção são preferivelmente estáveis. A estabilidade de um polipeptí- deo, construção ou ISVD da invenção pode ser medida por ensaios rotineiros conhecidos pela pessoa versada na técnica. Ensaios típicos incluem (sem limitação) ensaios em que a atividade de dito polipeptí- deo, construção ou ISVD é determinada, seguido pela incubação em Fluido Sinovial durante um período de tempo desejado, após o que a atividade é determinada novamente, por exemplo, como detalhado na seção de Exemplos.

[00179] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ISVD, polipeptídeo ou construção da invenção tendo uma estabilidade de pe- lo menos 7 dias, tal como pelo menos 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 me- ses ou mesmo 3 meses em fluido sinovial (SF) a 37 ºC.

[00180] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ISVD, polipeptídeo ou construção da invenção que penetra na cartilagem em pelo menos 5 um, tal como pelo menos 10 um, 20 um, 30 um, 40 um, 50 um ou ainda mais.

[00181] A atividade desejada do bloco de construção terapêutico, por exemplo, o ISVD que se liga à MMP13 no polipeptídeo ou constru- ção multivalente da invenção, pode ser medida por ensaios rotineiros conhecidos da pessoa versada na técnica. Ensaios típicos incluem (sem limitação) um ensaio de liberação de GAG como detalhado na seção de Exemplos.

[00182] As afinidades relativas podem depender da localização dos ISVDs no polipeptídeo. Será observado que a ordem dos ISVDs em um polipeptídeo da invenção (orientação) pode ser escolhida de acor- do com as necessidades da pessoa versada na técnica. A ordem dos ISVDs individuais assim como se o polipeptídeo compreende um liga- dor é uma questão de escolha de projeto. Algumas orientações, com ou sem ligadores, podem fornecer características de ligação preferidas em comparação com outras orientações. Por exemplo, a ordem de um primeiro ISVD (por exemplo, ISVD 1) e um segundo ISVD (por exem- plo, ISVD 2) no polipeptídeo da invenção pode ser (a partir do N- terminal para o C-terminal): (i) ISVD 1 (por exemplo, Nanocorpo 1)- [ligador] - ISVD 2 (por exemplo, Nanocorpo 2) - [extensão C-terminall]; ou (ii) ISVD 2 (por exemplo, Nanocorpo 2)- [ligador] - ISVD 1 (por exemplo, Nanocorpo 1) - [extensão C-terminal]l; (em que os compo- nentes entre os colchetes, isto é, o ligador e a extensão C-terminal, são opcionais). Todas as orientações são incluídas pela invenção. Os polipeptídeos que contêm uma orientação de ISVDs que fornece ca- racterísticas de ligação desejadas podem ser facilmente identificados por triagem de rotina, por exemplo, como exemplificado na seção de exemplos. Uma ordem preferida é a partir do N-terminal para C- terminal: ISVD que se liga à MMP13 - [ligador] — ISVD que se liga ao Aggrecan - [extensão C-terminal], em que os componentes entre os colchetes são opcionais. Uma outra ordem preferida é a partir do N- terminal para o C-terminal: o ISVD que se liga à MMP13 - [ligador] —

ISVD que se liga ao Aggrecan - [ligador] — ISVD que se liga ao Aggre- can - [extensão C-terminal], em que os componentes entre colchetes são opcionais. Ver, por exemplo, a Tabela F.

MEIA-VIDA

[00183] Em um aspecto específico da invenção, uma construção ou polipeptídeo da invenção pode ter um componente que confere meia- vida aumentada, em comparação com a construção ou polipeptídeo correspondente da invenção sem dito componente. Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de tais construções e polipeptídeos da invenção se tornarão claros para a pessoa versada com base na di- vulgação adicional nesta invenção, por exemplo, compreendem ISVDs ou polipeptídeos da invenção que foram quimicamente modificados para aumentar a sua meia-vida (por exemplo, por meio de PEGilação); os aglutinantes de MMP13 da invenção, tais como os ISVDs e/ou poli- peptídeos da invenção que compreendem pelo menos um sítio de li- gação adicional para a ligação em uma proteína de soro (tal como al- bumina de soro); ou polipeptídeos da invenção que compreendem pelo menos um ISVD da invenção que é ligado a pelo menos um compo- nente (e em particular pelo menos uma sequência de aminoácido) que aumenta a meia-vida da sequência de aminoácido da invenção. Exemplos de construções da invenção, tais como polipeptídeos da in- venção, que compreendem tais componentes ou ISVDs de extensão da meia-vida se tornarão evidentes para a pessoa versada com base na divulgação adicional nesta invenção; e, por exemplo, incluem, sem limitação, polipeptídeos em que o um ou mais ISVDs da invenção são adequadamente ligados a uma ou mais proteínas de soro ou seus fra- gmentos (tais como albumina de soro (humano) ou seus fragmentos) ou a uma ou mais unidades de ligação que podem se ligar ás proteí- nas de soro (tais como, por exemplo, anticorpos de domínio, domínios variáveis únicos de imunoglobulina que são adequados para uso como anticorpo de domínio, anticorpos de domínio único. domínios variáveis únicos de imunoglobulina que são adequados para uso como um anti- corpo de domínio único, dAbs, domínios variáveis únicos de imunoglo- bulina que são adequados para uso como um dAb, ou Nanocorpos que podem se ligar às proteínas de soro tais como albumina de soro (tal como albumina de soro humano), imunoglobulinas de soro tais como IgG, ou transferrina; referência é feita à descrição adicional e referências aqui mencionadas); polipeptídeos em que uma sequência de aminoácido da invenção é ligada a uma parte Fc (tal como um Fc humano) ou uma parte adequada ou seu fragmento; ou polipeptídeos em que um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção são adequadamente ligados a uma ou mais pequenas prote- íÍnas ou peptídeos que podem se ligar às proteínas de soro, tais como, por exemplo, as proteínas e peptídeos descritos nas WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO2008/068280, WO2009/127691 e PCT/EP2011/051559.

[00184] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma constru- ção da invenção ou um polipeptídeo, em que dita construção ou dito polipeptídeo ainda compreende um componente de ligação de proteí- na de soro ou uma proteína de soro. De preferência, dito componente de ligação de proteína de soro se liga à albumina de soro, tal como albumina de soro humano.

[00185] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um poli- peptídeo conforme descrito nesta invenção, compreendendo um ISVD que se liga à albumina de soro.

[00186] Geralmente, as construções ou polipeptídeos da invenção com meia-vida aumentada possuem preferivelmente uma meia-vida que é pelo menos 1,5 vezes, preferivelmente pelo menos 2 vezes, tal como pelo menos 5 vezes, por exemplo, pelo menos 10 vezes ou mais do que 20 vezes, maior do que a meia-vida das construções ou poli-

peptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem o compo- nente que confere a meia-vida aumentada. Por exemplo, as constru- ções ou polipeptídeos da invenção com meia-vida aumentada podem ter uma meia-vida, por exemplo, em seres humanos que é aumentada com mais do que 1 hora, preferivelmente mais do que 2 horas, mais preferivelmente mais do que 6 horas, tal como mais do que 12 horas, ou ainda mais do que 24, 48 ou 72 horas, em comparação com as construções ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem o componente que confere a meia-vida aumentada.

[00187] Em um aspecto preferido, mas não limitativo, da invenção, as construções da invenção e polipeptídeos da invenção possuem uma meia-vida no soro, por exemplo, em seres humanos, que é au- mentada em mais do que 1 hora, preferivelmente mais do que 2 horas, mais preferivelmente mais do que 6 horas, tal como mais do que 12 horas, ou ainda mais do que 24, 48 ou 72 horas, em comparação com as construções ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é, sem o componente que confere a meia-vida aumentada.

[00188] Em outro aspecto preferido, mas não limitativo, da inven- ção, tais construções da invenção, tais como polipeptídeos da inven- ção, apresentam uma meia-vida no soro em seres humanos de pelo menos cerca de 12 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmente pelo menos 48 horas, ainda mais preferivelmente pelo menos 72 horas ou mais. Por exemplo, as construções ou polipeptí- deos da invenção podem ter uma meia-vida de pelo menos 5 dias (tal como ao redor de 5 a 10 dias), preferivelmente pelo menos 9 dias (tal como ao redor de 9 a 14 dias), mais preferivelmente pelo menos ao redor de 10 dias (tal como ao redor de 10 a 15 dias), ou pelo menos cerca de 11 dias (tal como ao redor de 11 a 16 dias), mais preferivel- mente pelo menos cerca de 12 dias (tal como ao redor de 12 a 18 dias ou mais), ou mais do que 14 dias (tal como ao redor de 14 a 19 dias).

[00189] Em um aspecto particularmente preferido, mas não limitati- vo, da invenção, a invenção fornece uma construção da invenção e um polipeptídeo da invenção, compreendendo além de um ou mais blocos de construção que se ligam à MMP13 e possivelmente o um ou mais blocos de construção de CAP, por exemplo, ISVDs que se ligam ao Aggrecan, pelo menos um bloco de construção que se liga à albumina de soro, tal como um ISVD que se liga à albumina de soro, tal como albumina de soro humano como descrito nesta invenção. Preferivel- mente, dito ISVD que se liga à albumina de soro compreende ou con- siste essencialmente em 4 regiões de estrutura (FR1 a FRA4, respecti- vamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDRS3, respectivamente), em que a CDR1 é SFGMS, a CDR?2 é SIS- GSGSDTLYADSVKG e a CDR3 é GGSLSR. Preferivelmente, dito ISVD que se liga à albumina de soro humano é selecionado do grupo consistindo em AIb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, AIb82, AIb82-A, AILb82-AA, AILb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82- GGG, Alb92, Alb135 ou Alb223 (cf. Tabela D).

[00190] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se às construções da invenção, tal como um polipeptídeo que compreende um componente de ligação de proteína de soro, em que dito compo- nente de ligação de proteína de soro é um polipeptídeo à base de não anticorpo.

OUTROS COMPONENTES

[00191] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um cons- tructo como descrito nesta invenção, compreendendo um ou mais de outros grupos, resíduos, componentes ou unidades de ligação. O um ou mais outros grupos, resíduos, componentes ou unidades de ligação são preferivelmente selecionados do grupo que consiste em uma mo- lécula de polietileno glicol, proteínas de soro ou seus fragmentos, uni- dades de ligação que podem se ligar às proteínas de soro, uma parte

Fc, e proteínas ou peptídeos pequenos que podem se ligar às proteí- nas de soro, outros resíduos de aminoácidos, marcas ou outros com- ponentes funcionais, por exemplo, toxinas, marcadores, produtos radi- oquímicos, etc.

[00192] Em uma modalidade, conforme mencionado infa, a presen- te invenção refere-se a uma construção da invenção, tal como um po- lipeptídeo que compreende um componente que confere extensão de meia-vida, em que dito componente é um PEG. Portanto, a presente invenção refere-se também a uma construção ou polipeptídeo da in- venção compreendendo PEG.

[00193] Os resíduos de aminoácidos adicionais podem ou não mu- dar, alterar ou de outra forma influenciar outras propriedades (biológi- cas) do polipeptídeo da invenção e podem ou não adicionar funcionali- dade adicional ao polipeptídeo da invenção. Por exemplo, tais resí- duos de aminoácido: a) podem compreender um resíduo Met N-terminal, por exemplo, como resultado da expressão em uma célula hospedeira ou organismo hos- pedeiro heterólogo. b) podem formar uma sequência de sinal ou sequência líder que dire- ciona a secreção do polipeptídeo a partir de uma célula hospedeira após a síntese (por exemplo, para fornecer uma pré-, pró- ou prépro- forma do polipeptídeo da invenção, dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar o polipeptídeo da invenção). Os peptídeos lí- der secretórios adequados serão evidentes para a pessoa versada, e podem ser como descritos mais adiante nesta invenção. Geralmente, uma tal sequência líder será ligada ao N-terminal do polipeptídeo, em- bora a invenção no seu sentido mais amplo não seja limitada à mes- ma; c) podem formar uma "marca", por exemplo, uma sequência de ami- noácido ou resíduo que permite ou facilite a purificação do polipeptí-

deo, por exemplo, utilizando técnicas de afinidade direcionadas contra dita sequência ou resíduo. Depois disso, dita sequência ou resíduo pode ser removido (por exemplo, por clivagem química ou enzimática) para fornecer o polipeptídeo (para este propósito, a marca pode opcio- nalmente ser ligada à sequência de aminoácido ou sequência de poli- peptídeo através de uma sequência de ligador clivável ou conter um motivo clivável). Alguns exemplos preferidos, mas não limitativos, de tais resíduos são resíduos de histidina múltiplos, resíduos de glutatio- na, uma marca myc tal como ARMAEQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO: 175), uma marca MYC-HIS (SEQ ID NO: 123) ou uma marca FLAG- HIS6 (SEQ ID NO: 124) (ver a Tabela B); d) podem ser um ou mais resíduos de aminoácido que foram funciona- lizados e/ou que possam servir como um sítio para ligação de grupos funcionais. Resíduos de aminoácido e grupos funcionais adequados serão evidentes para a pessoa versada e incluem, mas não são limita- dos a estes, os resíduos de aminoácidos e grupos funcionais aqui mencionados para os derivados dos polipeptídeos da invenção.

[00194] “Também estão incluídas na presente invenção as constru- ções e/ou polipeptídeos que compreendem um ISVD da invenção e ainda compreendem outros componentes funcionais, por exemplo, to- xinas, marcações, produtos radioquímicos, etc.

[00195] Os outros grupos, resíduos, componentes ou unidades de ligação podem, por exemplo, ser grupos químicos, resíduos, compo- nentes, que podem ou não por si próprios ser biológica e/ou farmaco- logicamente ativos. Por exemplo, e sem limitação, tais grupos podem ser ligados a um ou mais ISVDs ou polipeptídeos da invenção de mo- do a fornecer um "derivado" do polipeptídeo ou construção da inven- ção.

[00196] Consequentemente, a invenção no seu sentido mais amplo também compreende construções e/ou polipeptídeos que são deriva-

dos das construções e/ou polipeptídeos da invenção. Tais derivados podem geralmente ser obtidos através da modificação e, em particular, através da modificação química e/ou biológica (por exemplo, enzimáti- ca), das construções e/ou polipeptídeos da invenção e/ou de um ou mais dos resíduos de aminoácido que formam um polipeptídeo da in- venção.

[00197] Exemplos de tais modificações, assim como exemplos de resíduos de aminoácido dentro das sequências de polipeptídeo que podem ser modificadas de uma tal maneira (isto é, na cadeia principal da proteína, mas preferivelmente em uma cadeia lateral), que os mé- todos e técnicas que podem ser utilizados para introduzir tais modifi- cações e os usos e vantagens potenciais de tais modificações, serão evidentes para a pessoa versada (ver também Zangi et a/., Nat Bio- technol 31(10):898-907, 2013).

[00198] Por exemplo, uma tal modificação pode envolver a introdu- ção (por exemplo, através da ligação covalente ou de qualquer outra maneira adequada) de um ou mais grupos (funcionais), resíduos ou componentes no ou sobre o polipeptídeo da invenção, e em particular de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou componentes que con- ferem uma ou mais propriedades ou funcionalidades desejadas à construção e/ou polipeptídeo da invenção. Exemplos de tais grupos funcionais serão evidentes para a pessoa versada.

[00199] Por exemplo, tal modificação pode compreender a introdu- ção (por exemplo, através da ligação covalente ou de qualquer outra maneira adequada) de um ou mais componentes funcionais que au- mentam a meia-vida, a solubilidade e/ou a absorção da construção ou polipeptídeo da invenção, que reduzem a imunogenicidade e/ou a toxi- cidade da construção ou polipeptídeo da invenção, que eliminam ou atenuam quaisquer efeitos colaterais indesejáveis da construção ou polipeptídeo da invenção e/ou que conferem outras propriedades van-

tajosas e/ou reduzem as propriedades indesejadas da construção ou polipeptídeo da invenção; ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Exemplos de tais componentes funcionais e de téc- nicas para a sua introdução serão evidentes para a pessoa versada, e podem, em geral, compreender todos os componentes funcionais e as técnicas mencionadas na técnica antecedente geral citada mais acima, assim como os componentes funcionais e as técnicas conhecidas per se para a modificação de proteínas farmacêuticas, e, em particular, para a modificação de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (inclu- indo os ScFv's e anticorpos de domínio único), para os quais é feita referência, por exemplo, a Remington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980). Tais componentes funci- onais podem, por exemplo, ser ligados diretamente (por exemplo, co- valentemente) a um polipeptídeo da invenção, ou opcionalmente por meio de um ligador ou espaçador adequado, como será novamente claro para a pessoa versada.

[00200] Um exemplo específico é um polipeptídeo ou construção derivado da invenção em que o polipeptídeo ou construção da inven- ção foi quimicamente modificado para aumentar a sua meia-vida (por exemplo, por meio de PEGilação). Esta é uma das técnicas mais am- plamente utilizadas para aumentar a meia-vida e/ou reduzir a imuno- genicidade de proteínas farmacêuticas e compreende a fixação de um polímero farmacologicamente aceitável adequado, tal como po- lifetilenoglicol) (PEG) ou seus derivados (tais como, metoxipo- lifetilenoglicol) ou mPEG). Geralmente, qualquer forma adequada de PEGilação pode ser utilizada, tal como a PEGilação utilizada na técni- ca para anticorpos e fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não |i- mitado a anticorpos de domínio (único) e ScFv's); referência é feita a, por exemplo, Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002), Verone- se and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003), Harris and

Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003) e WO 04/060965. Vários reagentes para a PEGilação de proteínas também são comer- cialmente disponíveis, por exemplo, da Nektar Therapeutics, USA.

[00201] De preferência, a PEGilação direcionada ao sítio é utilizada, em particular através de um resíduo de cisteína (ver, por exemplo, Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003). Por exemplo, pa- ra este propósito, o PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que ocorre naturalmente em um polipeptídeo da invenção, uma construção ou polipeptídeo da invenção pode ser modificada de modo a introduzir adequadamente um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de aminoácido que compreende um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG pode ser fundida ao terminal N e/ou C de uma construção ou polipeptídeo da invenção, tudo usando técnicas de planejamento de proteínas conhecidas per se da pessoa versada.

[00202] De preferência, para as construções ou polipeptídeos da invenção, um PEG é utilizado com um peso molecular maior do que 5000, tal como maior do que 10.000 e menor do que 200.000, tal como menor do que 100.000; por exemplo, na faixa de 20.000 a 80.000.

[00203] “Outra modificação geralmente menos preferida compreen- de glicosilação ligada a N ou ligada a O, geralmente como parte da modificação cotranslacional e/ou pós-translacional, dependendo da célula hospedeira utilizada para a expressão do polipeptídeo da inven- ção.

[00204] — Ainda outra modificação pode compreender a introdução de um ou mais marcadores detectáveis ou outros grupos ou componentes de geração de sinal, dependendo do uso pretendido do polipeptídeo ou da construção da invenção. Os marcadores adequados e técnicas para a sua fixação, uso e detecção serão evidentes para a pessoa versada, e, por exemplo, incluem, mas não são limitados a estes, mar-

cadores fluorescentes (tais como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldeído e fluoresceína e metais fluorescentes, tais como *ºº2Eu ou outros metais da série dos lantanídeos), marcadores fosforescentes, marcadores quimilumines- centes ou marcadores bioluminescentes (tais como luminal, isololumi- nol, éster de acridínio termomático, imidazol, sais de acridínio, éster de oxalato, dioxetano ou GFP e seus análogos), isótopos de rádio (tais como ?H, 1251, 32pP, 358, 14C, S1Cr, Cl, "Co, Co, *º*Fe e Se), metais, quelatos de metal ou cátions metálicos (por exemplo, cátions metálicos tais como *º Te, 1231, Mn, 131, ºRu, Cu, ºGa e Ga ou outros me- tais ou cátions metálicos que são particularmente adequados para uso em diagnóstico in vivo, in vitro ou in situ e formação de imagem, tais como (*5"Gd, Mn, 16ºDy, 5ºCr, e 5Fe)), assim como cromóforos e en- zimas (tais como malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta- V-esteróide isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa- glicerofosfato desidrogenase, fosfato isomerase de triose, peroxidase de biotinavidina, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, asparagi- nase, glicose oxidase, B-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-Vl-fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolina esterase). Outros marcadores adequados serão claros para a pessoa versada, e, por exemplo, incluem componentes que podem ser detectadas utili- zando espectroscopia RMN ou ESR.

[00205] Tais polipeptídeos e construções marcados da invenção podem, por exemplo, ser utilizados para ensaios in vitro, in vivo ou in situ (incluindo imunoensaios conhecidos per se tais como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios intercalados", etc.) assim como diagnóstico in vivo e propósitos de formação de imagem, dependendo da escolha do marcador específico.

[00206] “Como ficará evidente para a pessoa versada, outra modifi- cação pode envolver a introdução de um grupo quelante, por exemplo,

para quelar um dos metais ou cátions metálicos referidos acima. Gru- pos quelantes adequados, por exemplo, incluem, sem limitação, ácido dietil-enetriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminatetraacé- tico (EDTA).

[00207] Ainda outra modificação pode compreender a introdução de um componente funcional que é uma parte de um par de ligação espe- cífica, tal como o par de ligação de biotina-(strept)avidina. Um tal com- ponente funcional pode ser utilizado para ligar o polipeptídeo da inven- ção a outra proteína, polipeptídeo ou composto químico que é ligado à outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, uma construção ou polipeptídeo da invenção pode ser conjugado à biotina, e ligado a outra proteína, polipeptídeo, composto ou veículo conjugado à avidina ou estreptavidina. Por exemplo, uma tal construção ou polipeptídeo conjugado da invenção pode ser utilizado como um repórter, por exemplo, em um sistema de diagnóstico onde um agente de produção de sinal detectável é conju- gado com a avidina ou estreptavidina. Tais pares de ligação podem, por exemplo, ser utilizados para ligar a construção ou polipeptídeo da invenção a um veículo, incluindo veículos adequados para propósitos farmacêuticos. Um exemplo não limitativo é as formulações lipossômi- cas descritas por Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000). Tais pares de ligação também podem ser utilizados para ligar um agente terapeuticamente ativo ao polipeptídeo da invenção.

[00208] “Outras modificações químicas e enzimáticas potenciais se- rão claras para a pessoa versada. Tais modificações podem também ser introduzidas para propósitos de pesquisa (por exemplo, para estu- dar as conexões de função-atividade). Referência é feita, por exemplo, a Lundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997).

[00209] —Preferivelmente, as construções, polipeptídeos e/ou deriva-

dos são tais que eles se ligam à MMP13, com uma afinidade (adequa- damente medida e/ou expressa como um valor de Kp (real ou aparen- te), um valor de Ka (real ou aparente), um índice Kon e/ou um índice Korr, ou alternativamente como um valor de ICs5o, conforme aqui descrito que é como definido nesta invenção (isto é, como definido para os po- lipeptídeos da invenção).

[00210] Tais construções e/ou polipeptídeos da invenção e seus derivados também podem estar na forma essencialmente isolada (con- forme aqui definido).

[00211] Emum aspecto, a presente invenção refere-se a uma cons- trução da invenção, que compreende ou consiste essencialmente em um ISVD de acordo com a invenção ou um polipeptídeo de acordo com a invenção, e que compreende ainda um ou mais de outros gru- pos, resíduos, componentes ou unidades de ligação, opcionalmente ligados através de um ou mais ligadores peptídicos.

[00212] Emum aspecto, a presente invenção refere-se a uma cons- trução da invenção, em que um ou mais de outros grupos, resíduos, componentes ou unidades de ligação são selecionados do grupo que consiste em uma molécula de polietileno glicol, proteínas de soro ou seus fragmentos, unidades de ligação que podem se ligar ás proteínas de soro, uma parte Fc, e proteínas ou peptídeos pequenos que podem se ligar ás proteínas de soro.

LIGADORES

[00213] Nas construções da invenção, tais como os polipeptídeos da invenção, os dois ou mais blocos de construção, tais como, por exemplo, ISVDs e, opcionalmente, um ou mais DE outros grupos, fár- macos, agentes, resíduos, componentes ou unidades de ligação, po- dem ser ligados diretamente entre si (como, por exemplo, descrito na WO 99/23221) e/ou podem ser ligados entre si por meio de um ou mais espaçadores ou ligadores adequados, ou qualquer combinação destes. Os espaçadores ou ligadores adequados para uso em polipep- tídeos multivalentes e multiespecíficos serão evidentes para a pessoa versada, e podem geralmente ser qualquer ligador ou espaçador utili- zado na técnica para ligar as sequências de aminoácido. De preferên- cia, dito ligador ou espaçador é adequado para uso na montagem de construções, proteínas ou polipeptídeos que se destinam ao uso far- macêutico.

[00214] Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode, por exem- plo, ser um polipeptídeo trivalente, triespecífico, que compreende um bloco de construção, tal como um ISVD, ligação de MMP13, um bloco de construção de CAP, tal como um ISVD que se liga ao Aggrecan, e potencialmente outro bloco de construção, tal como um terceiro ISVD, no qual ditos primeiro, segundo e terceiro blocos de construção, tais como ISVDs, podem opcionalmente ser ligados por meio de uma ou mais sequências de ligador, e em particular 2. Também, a presente invenção fornece uma construção ou polipeptídeo da invenção com- preendendo um primeiro ISVD que se liga à MMP13 e possivelmente um segundo ISVD que se liga ao Aggrecan e/ou possivelmente um terceiro ISVD e/ou possivelmente um quarto ISVD, em que dito primei- ro ISVD e/ou dito segundo ISVD e/ou possivelmente dito terceiro ISVD e/ou possivelmente dito quarto ISVD são ligados por meio de ligado- res, em particular 3 ligadores.

[00215] Alguns ligadores particularmente preferidos incluem os |i- gadores que são utilizados na técnica para ligar fragmentos de anti- corpos ou domínios de anticorpos. Estes incluem os ligadores mencio- nados na técnica anterior geral citada acima, assim como, por exem- plo, ligadores que são utilizados na técnica para construir os diacorpos ou fragmentos ScFv (a este respeito, entretanto, deve-se observar que, embora nos diacorpos e nos fragmentos ScFv a sequência de ligador utilizada deva ter um comprimento, um grau de flexibilidade e outras propriedades que permitem que os domínios Vr e V. pertinen- tes reúnam-se para formar o sítio de ligação ao antígeno completo, não há limitação particular sobre o comprimento ou a flexibilidade do ligador utilizado no polipeptídeo da invenção, visto que cada ISVD, tal como Nanocorpos, por si só forme um sítio de ligação ao antígeno completo).

[00216] Por exemplo, um ligador pode ser uma sequência de ami- noácido adequada, e em particular sequências de aminoácido entre 1 e 50, preferivelmente entre 1 e 30, tal como entre 1 e 10 resíduos de aminoácido. Alguns exemplos preferidos de tais sequências de amino- ácido incluem os ligadores gly-ser, por exemplo, do tipo (glyxsery)z, tal como (por exemplo, (glyaser);3 ou (gly3ser2)s, como descrito na WO 99/42077 e os ligadores GS30, GS15, GS9 e GS7 descritos nos pedi- dos de Ablynx aqui mencionados (ver, por exemplo, a WO 06/040153 e a WO 06/122825), assim como as regiões semelhantes a dobradiça, tais como as regiões de dobradiça de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural ou sequências semelhantes (tais como as descritas na WO 94/04678). Os ligadores preferidos são representados na Ta- bela C.

[00217] — Alguns outros ligadores particularmente preferidos são poli- alanina (tal como AAA), assim como os ligadores GS30 (SEQ ID NO: 85 na WO 06/122825) e GS9 (SEQ ID NO: 84 na WO 06/122825).

[00218] Outros ligadores adequados geralmente compreendem compostos orgânicos ou polímeros, em particular aqueles adequados para uso em proteínas para uso farmacêutico. Por exemplo, compo- nentes de poli(etilenoglicol) foram utilizados para ligar os domínios de anticorpos, ver, por exemplo, a WO 04/081026.

[00219] É incluído dentro do escopo da invenção que o comprimen- to, o grau de flexibilidade e/ou outras propriedades dos ligadores (em- bora não crítico, como geralmente é para os ligadores utilizados em fragmentos ScFv) podem ter alguma influência sobre as propriedades da construção final da invenção, tal como o polipeptídeo da invenção, incluindo, mas não limitado à afinidade, especificidade ou avidez para a MMP13, ou para um ou mais dos outros antígenos. Com base na presente invenção, a pessoa versada será capaz de determinar os |i- gadores ideais para uso em uma construção específica da invenção, tais como o polipeptídeo da invenção, opcionalmente após alguns ex- perimentos de rotina limitados.

[00220] Por exemplo, nos polipeptídeos multivalentes da invenção que compreendem blocos de construção, os ISVDs ou Nanocorpos direcionados contra a MMP13 e outro alvo, o comprimento e a flexibili- dade do ligador são preferivelmente tais que permite que cada bloco de construção, tal como um ISVD, da invenção presente no polipeptí- deo se ligue a seu alvo cognato, por exemplo, o determinante antigê- nico em cada um dos alvos. Novamente, com base na presente inven- ção, a pessoa versada será capaz de determinar os ligadores ideais para uso em uma construção específica da invenção, tais como um polipeptídeo da invenção, opcionalmente após alguns experimentos de rotina limitados.

[00221] “Também está dentro do escopo da invenção que os ligado- res possam conferir uma ou mais de outras propriedades favoráveis ou funcionalidade às construções da invenção, tais como os polipeptídeos da invenção, e/ou fornecer um ou mais sítios para a formação de deri- vados e/ou para a fixação de grupos funcionais (por exemplo, confor- me descrito nesta invenção para os derivados dos ISVDs da inven- ção). Por exemplo, os ligadores contendo um ou mais resíduos de aminoácidos carregados podem fornecer propriedades hidrófilas me- lhoradas, enquanto que os ligadores que formam ou contêm pequenos epítopos ou marcas podem ser utilizados para os propósitos de detec- ção, identificação e/ou purificação. Mais uma vez, com base na pre-

sente invenção, a pessoa versada será capaz de determinar os ligado- res ideais para uso em um polipeptídeo específico da invenção, opcio- nalmente após alguns experimentos de rotina limitados.

[00222] Finalmente, quando dois ou mais ligadores são utilizados nas construções, tais como os polipeptídeos da invenção, estes ligado- res podem ser iguais ou diferentes. Novamente, com base na nesta invenção, a pessoa versada será capaz de determinar os ligadores ideais para uso em uma construção ou polipeptídeo específico da in- venção, opcionalmente após alguns experimentos de rotina limitados.

[00223] Geralmente, para facilidade de expressão e produção, uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, será um polipeptídeo linear. Entretanto, a invenção no seu sentido mais amplo não é limitada a isso. Por exemplo, quando uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, compreende três ou mais blocos de construção, ISVDs ou Nanocorpos, é possível ligá-los pelo uso de um ligador com três ou mais "acessórios", com cada "acessório" sendo ligado a um bloco de construção, ISVD ou Nanocor- po, de modo a fornecer uma construção "em forma de estrela". Tam- bém é possível, embora geralmente menos preferível, utilizar constru- ções circulares.

[00224] —“Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que ditos ISVDs são ligados diretamente entre si ou são ligados por meio de um ligador.

[00225] —“Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que um primeiro ISVD e/ou um segundo ISVD e/ou possivelmente um ISVD que se liga à albumina do soro são ligados através de um liga- dor.

[00226] Em consequência, a presente invenção refere-se a uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que dito ligador é selecionado do grupo que consiste em ligadores de A3, 5GS, 7GS, 8GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS, 40GS, dobradiça G1, dobradiça 9GS-G1, região de dobradiça longa superior de lhama e dobradiça G3, tal como, por exemplo, apre- sentado na Tabela C.

[00227] —“Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma construção da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que dito polipeptídeo é selecionado do grupo mostrado na Tabela A-3 e Tabela F, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 164 a 165, 160, 161, 162, 163, e SEQ ID NOs: 176, 192 e 175 a 191 (isto é, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 ou 191).

PREPARAÇÃO

[00228] A invenção refere-se ainda aos métodos para a preparação das construções, polipeptídeos, ISVDs, ácidos nucleicos, células hos- pedeiras e composições aqui descritas.

[00229] Os polipeptídeos multivalentes da invenção podem de uma forma geral ser preparados por um método que compreende pelo me- nos a etapa de adequadamente ligar o ISVD e/ou o polipeptídeo mo- novalente da invenção a um ou mais ISVDs adicionais, opcionalmente por meio de um ou mais ligadores adequados, de modo a fornecer o polipeptídeo multivalente da invenção. Os polipeptídeos da invenção também podem ser preparados por um método que de uma forma ge- ral compreende pelo menos as etapas de fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, expressar dito ácido nuclei- co de uma maneira adequada, e recuperar o polipeptídeo expresso da invenção. Tais métodos podem ser executados de uma maneira co- nhecida per se, que será evidente para a pessoa versada, por exem- plo, com base nos métodos e técnicas aqui descritos.

[00230] “Um método para a preparação de polipeptídeos multivalen- tes da invenção pode compreender pelo menos as etapas de ligação de dois ou mais ISVDs da invenção e, por exemplo, um ou mais liga- dores juntos de uma maneira adequada. Os ISVDs da invenção (e li- gadores) podem ser acoplados por qualquer método conhecido na técnica e como também descrito nesta invenção. As técnicas preferi- das incluem a ligação das sequências de ácido nucleico que codificam os ISVDs da invenção (e ligadores) para preparar uma construção ge- nética que expressa o polipeptídeo multivalente. As técnicas para a ligação de aminoácidos ou ácidos nucleicos serão claras para a pes- Soa versada, e referência é novamente feita aos manuais padroniza- dos, tais como Sambrook et al. and Ausubel et al., mencionados aci- ma, assim como os Exemplos abaixo.

[00231] —“Consequentemente, a presente invenção também refere-se ao uso de um ISVD da invenção na preparação de um polipeptídeo multivalente da invenção. O método para a preparação de um polipep- tídeo multivalente irá compreender a ligação de um ISVD da invenção a pelo menos um outro ISVD da invenção, opcionalmente através de um ou mais ligadores. O ISVD da invenção é então utilizado como um domínio de ligação ou bloco de construção para fornecer e/ou preparar o polipeptídeo multivalente compreendendo 2 (por exemplo, em um polipeptídeo bivalente), 3 (por exemplo, em um polipeptídeo trivalente), 4 (por exemplo, em um polipeptídeo tetravalente) ou mais (por exem- plo, em um polipeptídeo multivalente). A este respeito, o ISVD da in- venção pode ser utilizado como um domínio de ligação ou unidade de ligação no fornecimento e/ou preparação de um polipeptídeo multiva- lente, tal como bivalente, trivalente ou tetravalente da invenção com- preendendo 2, 3, 4 ou mais blocos de construção.

[00232] —“Consequentemente, a presente invenção também refere-se ao uso de um polipeptídeo de ISVD da invenção (conforme aqui des-

crito) na preparação de um polipeptídeo multivalente. O método para a preparação do polipeptídeo multivalente compreenderá a ligação do ISVD da invenção a pelo menos um outro ISVD da invenção, opcio- nalmente através de um ou mais ligadores.

[00233] Os polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro para a pessoa versada a partir da presente descrição. Por exemplo, os poli- peptídeos da invenção podem ser preparados de qualquer maneira conhecida per se para a preparação de anticorpos e, em particular, para a preparação de fragmentos de anticorpos (incluindo, mas não limitados a estes, anticorpos de domínio (único) e fragmentos ScFv). Alguns métodos preferidos, mas não limitativos, para a preparação dos polipeptídeos e ácidos nucleicos incluem os métodos e técnicas aqui descritos.

[00234] O método para a produção de um polipeptídeo da invenção pode compreender as seguintes etapas: - a expressão, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado (também referida aqui como um "hospedeiro da invenção") ou em outro sistema de expressão adequado de um ácido nucleico que codifica dito polipeptídeo da invenção (também aqui referido como um "ácido nucleico da invenção"), opcionalmente seguido por: - isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obti- do.

[00235] Em particular, um tal método pode compreender as etapas de: - cultivo e/ou manutenção de um hospedeiro da invenção sob condi- ções que são tais que dito hospedeiro da invenção expressa e/ou pro- duz pelo menos um polipeptídeo da invenção; opcionalmente seguido por:

- isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obti- do.

[00236] Consequentemente, a presente invenção também refere-se a um ácido nucleico ou sequência de nucleotídeo que codifica um poli- peptídeo, ISVD ou construção da invenção (também referido como "ácido nucleico da invenção").

[00237] Um ácido nucleico da invenção pode estar na forma de DNA ou RNA de fita simples ou dupla. De acordo com uma modalida- de da invenção, o ácido nucleico da invenção está na forma essenci- almente isolada, conforme definido nesta invenção. O ácido nucleico da invenção também pode estar na forma de, estar presente em e/ou fazer parte de um vetor, por exemplo, vetor de expressão, tal como, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou YAC, que novamente pode estar na forma essencialmente isolada. Como consequência, a presen- te invenção também refere-se a um vetor de expressão que compre- ende uma sequência de ácido nucleico ou nucleotídeo da invenção.

[00238] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se, com base nas informações sobre os polipeptídeos da invenção aqui fornecidas, e/ou podem ser isolados de uma fonte natural adequada. Da mesma forma, como fica- rá claro para a pessoa versada, para se preparar um ácido nucleico da invenção, também várias sequências de nucleotídeo, tais como pelo menos dois ácidos nucleicos que codificam ISVDs da invenção e, por exemplo, ácidos nucleicos que codificam um ou mais ligantes, podem ser ligados entre si de uma maneira adequada. As técnicas para a ge- ração dos ácidos nucleicos da invenção serão evidentes para a pes- soa versada e podem, por exemplo, incluir, mas não são limitadas a estas, a síntese automatizada de DNA; a mutagênese direcionada ao sítio; a combinação de duas ou mais sequências de ocorrência natural e/ou sintéticas (ou duas ou mais de suas partes), a introdução de mu-

tações que levam à expressão de um produto de expressão truncado; a introdução de um ou mais sítios de restrição (por exemplo, para criar cassetes e/ou regiões que podem ser facilmente digeridas e/ou ligadas usando enzimas de restrição adequadas) e/ou a introdução de muta- ções por meio de uma reação PCR utilizando um ou mais iniciadores "mal combinados". Estas e outras técnicas ficarão claras para a pes- Soa versada, e a referência é feita novamente aos manuais padroniza- dos, tais como Sambrook et al. and Ausubel et al., mencionados aci- ma, assim como aos Exemplos abaixo.

[00239] Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, uma construção genética da invenção compreende a) pelo menos um ácido nucleico da invenção; b) de maneira operável conectada a um ou mais elementos regulado- res, tais como um promotor e opcionalmente um terminador adequado; e opcionalmente também Cc) um ou mais de outros elementos de construções genéticas conheci- das per se; em que os termos "elemento regulador", "promotor", "terminador" e "de maneira operável conectada" possuem seu significado comum na téc- nica.

[00240] As construções genéticas da invenção podem de uma for- ma geral ser fornecidas pela ligação adequada das sequências de nu- cleotídeo da invenção ao um ou mais elementos adicionais descritos acima, por exemplo, utilizando as técnicas descritas nos manuais ge- rais tais como Sambrook et al. e Ausubel et a/., mencionados acima.

[00241] Os ácidos nucleicos da invenção e/ou as construções gené- ticas da invenção podem ser utilizados para transformar uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro, isto é, para expressão e/ou pro- dução do polipeptídeo da invenção. Os hospedeiros adequados ou cé- lulas hospedeiras serão evidentes para a pessoa versada e podem,

por exemplo, ser qualquer célula ou linhagem celular fúngica, procarió- tica ou eucariótica adequada, ou qualquer organismo fúngico, procarió- tico ou eucariótico (não humano) assim como todas as outras células hospedeiras ou hospedeiros (não humanos) conhecidos per se para a expressão e produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos (inclu- indo, mas não limitados aos anticorpos de domínio (único) e fragmen- tos ScFv), os quais serão evidentes para a pessoa versada.

Referên- cia também é feita à técnica antecedente geral citada mais acima, as- sim como, por exemplo, as WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998); Riech- mann and Muyldermans (1999), supra; van der Linden (J.

Biotechnol. 80: 261-70, 2000); Joosten et al. (Microb.

Cell Fact. 2: 1, 2003); Joos- ten et al. (Appl.

Microbiol.

Biotechnol. 66: 384-92, 2005); e as outras referências citadas nesta invenção.

Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem ser expressos e/ou produzidos em sistemas de expressão livres de células, e os exemplos adequados de tais sis- temas serão evidentes para a pessoa versada.

Técnicas adequadas para transformar um hospedeiro ou célula hospedeira da invenção se- rão claras para a pessoa habilitada e podem depender da célula hos- pedeira/organismo hospedeiro planejado e da construção genética a ser utilizada.

Referência é feita novamente aos manuais e pedidos de patente mencionados acima.

A célula hospedeira transformada (que pode estar na forma de uma linhagem celular estável) ou organismo hospedeiro (que pode estar na forma de uma linhagem ou cepa mu- tante estável) forma outros aspectos da presente invenção.

Em con- formidade, a presente invenção refere-se a um hospedeiro ou célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com a in- venção, ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

Preferi- velmente, estas células hospedeiras ou organismos hospedeiros são tais que eles expressam, ou são (pelo menos) capazes de expressar

(por exemplo, sob condições adequadas), um polipeptídeo da inven- ção (e no caso de um organismo hospedeiro: em pelo menos uma cé- lula, parte, tecido ou órgão deste). A invenção também inclui outras gerações, progênie e/ou descendência da célula hospedeira ou orga- nismo hospedeiro da invenção que podem, por exemplo, ser obtidas pela divisão celular ou pela reprodução sexual ou assexuada.

[00242] Para produzir/obter a expressão dos polipeptídeos da in- venção, a célula hospedeira transformada ou organismo hospedeiro transformado pode geralmente ser retido, mantido e/ou cultivado sob condições tais que o polipeptídeo (desejado) da invenção é expres- so/produzido. As condições adequadas serão claras para a pessoa versada e geralmente dependerão da célula hospedeira/organismo hospedeiro utilizado, assim como dos elementos reguladores que con- trolam a expressão da sequência de nucleotídeo (relevante) da inven- ção. Novamente, é feita referência aos manuais e pedidos de patente mencionados acima nos parágrafos sobre as construções genéticas da invenção.

[00243] O polipeptídeo da invenção pode então ser isolado da célu- la hospedeira/organismo hospedeiro e/ou do meio no qual dita célula hospedeira ou organismo hospedeiro foi cultivada, utilizando técnicas de isolamento e/ou purificação de proteína conhecidas per se, tais co- mo cromatografia (preparativa) e/ou técnicas de eletroforese, técnicas de precipitação diferencial, técnicas de afinidade (por exemplo, utili- zando uma sequência de aminoácido clivável específica fundida com o polipeptídeo da invenção) e/ou técnicas imunológicas preparatórias (isto é, utilizando anticorpos contra o polipeptídeo a ser isolado).

[00244] Em um aspecto, a invenção refere-se aos métodos para produzir uma construção, polipeptídeo ou ISVD de acordo com a in- venção compreendendo pelo menos as etapas de: (a) expressar, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado ou em ou-

tro sistema de expressão adequado, uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção; opcionalmente seguido por (b) isolamento e/ou purificação da construção, polipeptídeo, ISVD de acordo com a invenção.

[00245] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende uma construção, polipeptídeo, ISVD ou ácido nuclei- co de acordo com a invenção. Medicamentos (Uso dos ISVDs, polipeptídeos, construções da in- venção)

[00246] “Como mencionado nesta invenção, permanece uma neces- sidade de medicamentos para a OA seguros e eficazes. Com base nas estratégias de triagem, caracterização e combinatórias não convencio- nais, os presentes inventores identificaram os ISVDs que se ligam e inibem a MMP13. Estes aglutinantes de MMP13 atuaram excepcio- nalmente bem nas experiências in vitro e in vivo. Além do mais, os ISVDs da invenção também demonstraram ser significativamente mais eficazes do que as moléculas do comparador. A presente invenção fornece assim ISVDs e polipeptídeos que antagonizam as MMPs, em particular a MMP13, com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas, incluindo um perfil mais seguro, em com- paração com as moléculas do comparador. Além disso, estes agluti- nantes de MMP13 quando ligados aos blocos de construção de CAP tiveram por um lado uma retenção aumentada na articulação, assim como a atividade retida por outro lado.

[00247] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma com- posição de acordo com a invenção, um ISVD de acordo com a inven- ção, um polipeptídeo de acordo com a invenção e/ou uma construção de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[00248] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um ISVD, polipeptídeo e/ou construção da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de pe- lo menos uma doença associada com a MMP13; e/ou para uso em um ou mais dos métodos de tratamento aqui mencionados.

[00249] A invenção refere-se também ao uso de um ISVD, polipep- tídeo, composto e/ou construção da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio que pode ser evitado e/ou tratado pe- la modulação de uma atividade de uma MMP, preferivelmente MMP13, por exemplo, que inibe a degradação de Aggrecan e/ou Colágeno.

[00250] A invenção refere-se também ao uso de um ISVD, polipep- tídeo, composto e/ou construção da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença, distúrbio ou condição que pode ser evitada e/ou tratada pela administração de um ISVD, polipeptídeo, composto e/ou construção da invenção a um paciente.

[00251] A invenção refere-se ainda a um ISVD, polipeptídeo, com- posto e/ou construção da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo-os para uso na prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença associada com a MMP13.

[00252] —Antecipa-se que os aglutinantes de MMP13 da invenção podem ser utilizados em várias doenças que afetam a cartilagem, tais como artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoar- trite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumá- tica ou descolamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espon- diloepimetafiseal, hérnia de disco espinhal, doença da degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente, osteocondrite dissecante, aggrecanopatias (comumente indicadas aqui como "doenças associadas com a MMP13").

[00253] Em um aspecto a presente invenção refere-se a uma com- posição, um ISVD, um polipeptídeo e/ou uma construção de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção de um sintoma de uma doença associada à MMP13, tal como, por exemplo, artropati- as e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumática ou des- colamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafi- seal, hérnia de disco espinhal, doença da degeneração do disco lom- bar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente, osteocondrite dissecante e aggrecanopatias. Mais preferivelmente, dita doença ou distúrbio é uma doença artrítica e mais preferivelmente os- teoartrite.

[00254] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um méto- do para a prevenção ou o tratamento de artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumática ou descolamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafiseal, hérnia de disco espi- nhal, doença da degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente em que dito método com- preende a administração, a um indivíduo com sua necessidade, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos uma compo- sição, imunoglobulina, polipeptídeo ou construção de acordo com a invenção a uma pessoa com sua necessidade. Mais preferivelmente, dita doença é uma doença artrítica e o mais preferível osteoartrite.

[00255] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um ISVD, polipeptídeo, composição ou construção de acordo com a invenção, na preparação de uma composição farmacêutica para o tra- tamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio, tal como artropati- as e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumática ou des- colamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafi- seal, hérnia de disco espinhal, doença da degeneração do disco lom-

bar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente, osteocondrite dissecante e aggrecanopatias. Mais preferivelmente, dita doença ou distúrbio é uma doença artrítica e o mais preferível osteoar- trite.

[00256] Ao se ligar ao Aggrecan, as construções e/ou polipeptídeos da invenção podem reduzir ou inibir a atividade de um membro da fa- mília de serina protease, catepsinas, metalo-proteinases da matriz (MMPs)/Matrixinas ou A Desintegrina e Metaloproteinase com motivos Trombospondina (ADAMTS), MMP20, ADAMTSS5 (Aggrecanase-2), ADAMTSA4 (Aggrecanase-1) e/ou ADAMTS11 na degradação de Aggrecan.

[00257] No contexto da presente invenção, o termo "prevenção e/ou tratamento" não apenas compreende prevenir e/ou tratar a doença, mas também compreende de uma forma geral prevenir o início da do- ença, retardar ou reverter o progresso da doença, prevenir ou retardar o início de um ou mais sintomas associados com a doença, reduzir e/ou aliviar um ou mais sintomas associados com a doença, reduzir a gravidade e/ou a duração da doença e/ou de quaisquer sintomas as- sociados com a mesma e/ou prevenir um aumento adicional na gravi- dade da doença e/ou de quaisquer sintomas associados, prevenir, re- duzir ou reverter qualquer dano fisiológico provocado pela doença, e geralmente qualquer ação farmacológica que seja benéfica ao pacien- te que está sendo tratado.

[00258] O regime de dosagem será determinado pelo médico aten- dente e fatores clínicos. Como é bem conhecida nas técnicas médicas, a dosagem para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluin- do o tamanho, peso, área de superfície corporal, idade do paciente, o composto particular a ser administrado, a atividade do polipeptídeo empregado (incluindo anticorpos), tempo e via de administração, saú- de geral, e combinação com outras terapias ou tratamentos. O material farmaceuticamente ativo proteináceo pode estar presente em quanti- dades entre 1 g e 100 mg/kg de peso corporal por dose; no entanto, doses abaixo ou acima desta faixa exemplar também são previstas. Se o regime for uma infusão contínua, ele pode estar na faixa de 1 pg a 100 mg por quilograma de peso corporal por minuto.

[00259] Um ISVD, polipeptídeo ou construção da invenção pode ser empregado em uma concentração de, por exemplo, 0,01, 0,1, 0,5, 1,2, 5, 10, 20 ou 50 pg/ml a fim de inibir e/ou neutralizar uma função bioló- gica da MMP13 em pelo menos cerca de 50%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90%, 95% ou até 99%, e o mais preferível apro- ximadamente 100% (essencialmente de forma completa) como anali- sado por métodos bem conhecidos na técnica.

[00260] Um ISVD, polipeptídeo ou construção da invenção pode ser empregado em uma concentração de, por exemplo, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 250 ou 500 ng/mg de cartilagem a fim de ini- bir e/ou neutralizar uma função biológica da MMP13 em pelo menos cerca de 50%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90%, 95% ou até 99%, e o mais preferível aproximadamente 100% (essencial- mente de forma completa) como analisado por métodos bem conheci- dos na técnica.

[00261] Geralmente, o regime de tratamento irá compreender a administração de um ou mais ISVDs, polipeptídeos e/ou construções da invenção, ou de uma ou mais composições compreendendo-os, em uma ou mais quantidades ou doses farmaceuticamente eficazes. As quantidades ou doses específicas a serem administradas podem ser determinadas pelo clínico, mais uma vez com base nos fatores citados acima. As dosagens úteis das construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser determinadas através da comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo em modelos animais. Métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em camundongos, e outros ani-

mais, para seres humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, ver a US 4.938.949.

[00262] Geralmente, dependendo da doença, distúrbio ou condição específica a ser tratada, a potência do ISVD, polipeptídeo e/ou cons- trução específica da invenção a ser utilizada, a via específica de admi- nistração e a formulação farmacêutica específica ou composição utili- zada, o médico será capaz de determinar uma dose diária adequada.

[00263] A quantidade das construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção requeridas para uso no tratamento variará não apenas com a imunoglobulina, polipeptídeo, composto e/ou construção particular se- lecionada, mas também com a via de administração, a natureza da condição sendo tratada e a idade e condição do paciente e será por fim na discrição do médico ou clínico atendente. Da mesma forma, a dosagem das construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção va- ria dependendo da célula, tecido, enxerto, articulação ou órgão alvo.

[00264] A dose desejada pode convenientemente ser apresentada em uma única dose ou como doses divididas administradas em inter- valos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub- doses por dia. A subdose em si pode ser dividida ainda mais, por exemplo, em um número de administrações discretas imprecisamente espaçadas. De preferência, a dose é administrada uma vez por sema- na ou ainda menos frequente, tal como uma vez a cada duas sema- nas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês ou mesmo uma vez a cada dois meses.

[00265] Um regime de administração pode incluir tratamento a lon- go prazo. Por "longo prazo" entenda-se pelo menos duas semanas e, de preferência, várias semanas, meses ou anos de duração. As modi- ficações necessárias nesta faixa de dosagem podem ser determinadas por uma pessoa de habilidade prática na técnica utilizando apenas ex- perimentação de rotina dada pelos ensinamentos nesta invenção. Ver

Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no evento de qualquer complicação.

[00266] Geralmente, no método acima, um ISVD, polipeptídeo e/ou construção da invenção será utilizado. No entanto, está dentro do es- copo da invenção o uso de dois ou mais ISVDs, polipeptídeos e/ou construções da invenção em combinação.

[00267] Os!ISVDs, polipeptídeos e/ou construções da invenção po- dem ser utilizados em combinação com um ou mais de outros compos- tos ou princípios farmaceuticamente ativos adicionais, isto é, como um regime de tratamento combinado, que pode ou não levar a um efeito sinérgico.

[00268] A composição farmacêutica também pode compreender pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, um ou mais anticor- pos adicionais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e inorgânicas.

[00269] Novamente, o médico será capaz de selecionar tais outros compostos ou princípios, assim como um regime de tratamento com- binado adequado, com base nos fatores citados acima e sua avaliação experiente.

[00270] Em particular, os ISVDs, polipeptídeos e/ou construções da invenção podem ser utilizados em combinação com outros compostos ou princípios farmaceuticamente ativos que são ou podem ser utiliza- dos para a prevenção e/ou tratamento das doenças, distúrbios e con- dições citadas nesta invenção, como um resultado de que um efeito sinérgico pode ou não ser obtido. Exemplos de tais compostos e prin- cípios, assim como vias, métodos e formulações farmacêuticas ou composições para a sua administração serão evidentes para o médico.

[00271] “Quando duas ou mais substâncias ou princípios devem ser usadas como parte de um regime de tratamento combinado, elas po-

dem ser administradas através da mesma via de administração ou através de vias de administração diferentes, essencialmente ao mes- mo tempo ou em momentos diferentes (por exemplo, essencialmente de forma simultânea, consecutiva ou de acordo com um regime alter- nado). Quando as substâncias ou princípios devem ser administrados simultaneamente através da mesma via de administração, elas podem ser administradas como formulações ou composições farmacêuticas diferentes ou parte de uma formulação ou composição farmacêutica combinada, como será evidente para a pessoa versada.

[00272] Também, quando duas ou mais substâncias ou princípios ativos devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, cada uma das substâncias ou princípios pode ser adminis- trada na mesma quantidade e de acordo com o mesmo regime como utilizado quando o composto ou o princípio é utilizado sozinho, e tal uso combinado pode ou não levar a um efeito sinérgico. Entretanto, quando o uso combinado das duas ou mais substâncias ou princípios ativos leva a um efeito sinérgico, também pode ser possível reduzir a quantidade de uma, mais ou todas as substâncias ou princípios a se- rem administrados, ao mesmo tempo em que alcança a ação terapêu- tica desejada. Isto pode, por exemplo, ser útil para evitar, limitar ou reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados que estejam associa- dos ao uso de uma ou mais das substâncias ou princípios quando eles são utilizados em suas quantidades habituais, enquanto ainda obtém o efeito farmacêutico ou terapêutico desejado.

[00273] A eficácia do regime de tratamento utilizado de acordo com a invenção pode ser determinada e/ou seguida de qualquer maneira conhecida per se para a doença, distúrbio ou condição envolvida, co- mo será evidente para o médico. O médico também será capaz, onde apropriado e em uma base de caso a caso, de mudar ou modificar um regime de tratamento particular, de modo a conseguir o efeito terapêu-

tico desejado, evitar, limitar ou reduzir os efeitos colaterais indesejados e/ou obter um equilíbrio apropriado entre a obtenção do efeito terapêu- tico desejado por um lado e evitar, limitar ou reduzir os efeitos colate- rais indesejados por outro lado.

[00274] Geralmente, o regime de tratamento será seguido até que o efeito terapêutico desejado seja alcançado e/ou contanto que o efeito terapêutico desejado seja mantido. Outra vez, isto pode ser determi- nado pelo clínico.

[00275] Assim, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma constru- ção da invenção, pelo menos um polipeptídeo da invenção, pelo me- nos um ISVD da invenção, ou pelo menos um ácido nucleico da inven- ção e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente uma ou mais subs- tâncias ativas adicionais. Em um aspecto particular, a invenção refere- se a uma composição farmacêutica que compreende uma construção, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção, prefe- rivelmente pelo menos uma das SEQ ID NOs: 111, 11,112, 12,109,9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 160 a 165 (isto é, SEQ ID NO: 160, 161, 162, 163, 164 ou 165) e 176 a 192 (isto é, SEQ ID NO: 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 ou 192) e pelo menos um veículo, diluen- te ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente uma ou mais substâncias ativas adicionais.

[00276] O indivíduo a ser tratado pode ser qualquer animal de san- gue quente, mas é em particular um mamífero, e, mais particularmente um ser humano. Em aplicações veterinárias, o indivíduo a ser tratado inclui qualquer animal criado para propósitos comerciais ou mantido como um animal de estimação. Como ficará claro para a pessoa ver- sada, o indivíduo a ser tratado será em particular uma pessoa que so-

fre de, ou em risco de, doenças, distúrbios e condições aqui mencio- nadas. Portanto, em uma modalidade preferida da invenção, as com- posições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo da invenção são para uso em medicina ou diagnóstico. De preferência, as compo- sições farmacêuticas são para uso na medicina humana, mas elas também podem ser utilizadas para propósitos veterinários.

[00277] Maisuma vez, em uma tal composição farmacêutica, a uma ou mais imunoglobulinas, polipeptídeos, compostos e/ou construções da invenção, ou nucleotídeo que as codificam, e/ou uma composição farmacêutica compreendendo-as, também podem ser combinadas adequadamente com um ou mais outros princípios ativos, tais como aqueles aqui mencionados.

[00278] A invenção refere-se também a uma composição (tal como, sem limitação, uma composição ou preparação farmacêutica conforme ainda aqui descrita) para uso, in vitro (por exemplo, em um ensaio in vitro ou celular) ou in vivo (por exemplo, em uma célula isolada ou or- ganismo multi-celular, e em particular em um mamífero, e mais particu- larmente em um ser humano, tal como em um ser humano que está em risco ou sofre de uma doença, distúrbio ou condição da invenção).

[00279] Deve ficar entendido que a referência ao tratamento inclui tanto o tratamento de sintomas estabelecidos quanto o tratamento pro- filático, a menos que explicitamente mencionado de outra forma.

[00280] Geralmente, para uso farmacêutico, as construções, poli- peptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser formulados como uma preparação ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma construção, polipeptídeo e/ou ISVD da invenção e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente acei- tável, e opcionalmente um ou mais polipeptídeos e/ou compostos far- maceuticamente ativos. Por meio de exemplos não limitativos, uma tal formulação pode estar em forma adequada para administração oral,

para administração parenteral (tal como por injeção intravenosa, in- tramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administra- ção tópica (tal como a administração intra-articular), para administra- ção por inalação, através de um emplastro de pele, através de um im- plante, através de um supositório, etc., em que a administração intra- articular é preferida. Tais formas de administração adequadas - que podem ser sólidas, semi-sólidas ou líquidas, dependendo do modo de administração - assim como métodos e veículos para uso na sua pre- paração, serão evidentes para a pessoa versada, e são ainda aqui descritos. Uma tal preparação ou composição farmacêutica será de uma forma geral referida nesta invenção como uma "composição far- macêutica".

[00281] Como excipientes exemplares, os desintegrantes, agluti- nantes, cargas e lubrificantes podem ser mencionados. Exemplos de desintegrantes incluem ágar-ágar, alginas, carbonato de cálcio, celulo- se, dióxido de silício coloidal, gomas, silicato de magnésio alumínio, metilcelulose e amido. Exemplos de aglutinantes incluem celulose mi- cro-cristalina, hidroximetil celulose, hidroxipropilcelulose e polivinilpirro- lidona. Exemplos de cargas incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio tribásico, carboximetilcelulose de cálcio, celu- lose, dextrina, dextrose, frutose, lactitol, lactose, carbonato de magné- sio, óxido de magnésio, maltitol, maltodextrinas, maltose, sorbitol, ami- do, sacarose, açúcar e xilitol. Exemplos de lubrificantes incluem ágar, oleato de etila, laureato de etila, glicerina, palmitoestearato de glicerila, óleo vegetal hidrogenado, óxido de magnésio, estearatos, manitol, po- loxâmero, glicóis, benzoato de sódio, lauril sulfato de sódio, estearila sódica, sorbitol e talco. Estabilizantes habituais, conservantes, agentes umectantes e emulsificantes, agentes de melhora da consistência, agentes de melhora do sabor, sais para variar a pressão osmótica, substâncias tamponantes, solubilizantes, diluentes, emolientes, coran-

tes e agentes de mascaramento e antioxidantes são levados em con- sideração como adjuvantes farmacêuticos.

[00282] Veículos adequados incluem, mas não são limitados a es- tes, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lac- tose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, car- boximetilcelulose sódica, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e similares.

[00283] Geralmente, as construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção podem ser formulados e administrados de qualquer maneira adequada conhecida per se. Referência é feita, por exemplo, à técnica anterior geral citada acima (e em particular às WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 e WO 08/020079) assim como aos manuais padronizados, tais como Remington's Pharmaceu- tical Sciences, 18" Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Re- mington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippin- cott Williams and Wilkins (2005); ou o Handbook of Therapeutic Anti- bodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (ver, por exemplo, as páginas 252 a 255).

[00284] Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma construção, polipeptí- deo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção, e que com- preende ainda pelo menos um veículo, diluente ou excipiente e/ou ad- juvante farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente compreende um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos adicionais.

[00285] As construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção po- dem ser formuladas e administradas de qualquer maneira conhecida per se para anticorpos e fragmentos de anticorpos convencionais (in- cluindo ScFv's e diacorpos) e outras proteínas farmaceuticamente ati- vas. Tais formulações e métodos para a sua preparação serão eviden-

tes para a pessoa versada e, por exemplo, incluem preparações prefe- ríveis para a administração parenteral (por exemplo, administração in- travenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraluminal, in- tra-arterial, intratecal, intranasal ou intrabronquial), mas também para a administração tópica (por exemplo, intra-articular, transdérmica ou in- tradérmica).

[00286] As preparações para administração tópica ou parenteral podem, por exemplo, ser soluções, suspensões, dispersões ou emul- sões estéreis que são adequadas para infusão ou injeção. Veículos ou diluentes adequados para tais preparações, por exemplo, incluem aqueles mencionados na página 143 da WO 08/020079. Geralmente, soluções ou suspensões aquosas serão preferidas.

[00287] As construções, polipeptídeos e/ou ISVDs da invenção também podem ser administradas utilizando métodos de liberação co- nhecidos da terapia genética, ver, por exemplo, a Patente U.S. No.

5.399.346, que é incorporada por referência para seus métodos de li- beração de terapia genética. O uso de um método de terapia genética de liberação, as células primárias transfectadas com o gene que codi- fica uma construção, polipeptídeo e/ou ISVD da invenção podem adi- cionalmente ser transfectadas com promotores específicos do tecido para direcionar órgãos, tecidos, enxertos, articulações ou células es- pecíficas e podem adicionalmente ser transfectadas com sequências de sinal e estabilização para a expressão subcelularmente localizada.

[00288] “De acordo com outros aspectos da invenção, o polipeptídeo da invenção pode ser utilizado em aplicações adicionais in vivo e in vitro. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem ser emprega- dos para propósitos de diagnóstico, por exemplo, em ensaios projeta- dos para detectar e/ou quantificar a presença de MMP13 e/ou para purificar a MMP13. Os polipeptídeos também podem ser testados em modelos animais de doenças particulares e para a condução de estu-

dos de toxicologia, segurança e dosagem.

[00289] Finalmente, a invenção refere-se a um kit compreendendo pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica ditos componentes, o vetor ou sistema de vetores da invenção e/ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção. Contempla-se que o kit pode ser oferecido em diferentes formas, por exemplo, como um kit para diagnóstico.

[00290] A invenção será agora ainda descrita por meio dos seguin- tes aspectos, exemplos e figuras preferidos não limitativos.

[00291] Os conteúdos inteiros de todas as referências (incluindo referências de literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publi- cados e pedidos de patente copendentes) citadas por todo este pedido são aqui expressamente incorporados por referência, em particular para o ensinamento que é referido mais acima.

[00292] As sequências são divulgadas no corpo principal da descri- ção e em uma listagem de sequências separada de acordo com o pa- drão WIPO ST25. Uma SEQ ID especificada com um número específi- co deve ser a mesma no corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada. A título de exemplo, a SEQ ID NO: 1 deve defi- nir a mesma sequência tanto no corpo principal da descrição quanto na listagem de sequências separada. Deve haver uma discrepância entre uma definição de sequência no corpo principal da descrição e a listagem de sequências separada (se, por exemplo, SEQ ID NO: 1 no corpo principal da descrição erroneamente corresponde à SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências separada), então uma referência a uma sequência específica no pedido, em particular de modalidades especí- ficas, deve ser entendida como uma referência à sequência no corpo principal do pedido e não na listagem de sequências separada. Em outras palavras, uma discrepância entre uma definição/designação de sequência no corpo principal da descrição e a listagem de sequências separada deve ser resolvida pela correção da listagem de sequências separada para as sequências e sua designação divulgada no corpo principal do pedido que inclui a descrição, exemplos, figuras e reivindi- cações.

6. EXEMPLOS

[00293] Os seguintes exemplos ilustram os métodos e produtos da invenção. Modificações e adaptações adequadas das condições e pa- râmetros descritos normalmente encontrados na técnica de biologia molecular e celular que são evidentes para aqueles versados na técni- ca estão dentro do espírito e escopo da presente invenção.

6.1. Métodos

6.1.1. Imunização de lhama

[00294] A imunização de lhamas foi executada de acordo com pro- cedimentos padrão, com variações na quantidade de antígeno, tipo de adjuvante e método de injeção utilizado. Estas variações são descritas com detalhes nas respectivas seções abaixo. Todos os experimentos de imunização foram aprovados pelo comitê ético.

6.1.2. Construção de biblioteca

[00295] O cDNA foi preparado utilizando o rNA total extraído das amostras de sangue de todas as lhamas/alpacas imunizadas com MMP13. As sequências de nucleotídeo que codificam Nanocorpos fo- ram amplificadas a partir do CDNA em uma reação RT-PCR de uma etapa e ligadas nos sítios de restrição correspondentes do vetor de fagomídeos pAX212, seguido pela transformação da cepa de E. coli TG-1 com o produto de ligação por meio de eletroporação.

[00296] As bibliotecas de NNK foram geradas por meio de PCR de extensão por sobreposição com um iniciador degenerado. Os produtos da PCR foram clonados em um vetor de expressão (pAX129) e trans- formados em células competentes TG-1 de E. coli. Na estrutura com a sequência de codificação de Nanocorpos, os códigos de vetor para um

FLAG;- e Hiss-tag C-terminal.

[00297] Os Clones de interesse foram verificados em sequência.

6.1.3. Seleções

[00298] As bibliotecas de apresentação em fagos foram sondadas utilizando a MMP13 recombinante. Diferentes antígenos foram utiliza- dos em diferentes rodadas de seleção conforme descrito em detalhes na seção de Resultados, isto é, o Exemplo 6.2 e os seguintes.

[00299] As seleções consistiram em incubação de antígeno com as partículas em fagos da biblioteca durante 2 horas (em PBS suplemen- tado com Marvel a 2% e Tween 20 a 0,05%). Os antígenos biotinilados foram capturados utilizando glóbulos magnéticos revestidos com es- treptavidina (Invitrogen, 112-05D). Os antígenos não biotinilados foram revestidos em placas MaxiSorp (Nunc, 430341). Os bacteriófagos não ligados foram lavados em outro lugar (com PBS suplementado com Tween 20 a 0,05%; os bacteriófagos ligados foram eluídos pela adição de tripsina (1 mg/ml em PBS) durante 15 min.

[00300] Os bacteriófagos eluídos foram utilizados para infectar célu- las TG-1 de E. coli exponencialmente crescentes para a recuperação de fagos. O fago preparado a partir de saídas selecionadas foi utiliza- do como entrada nas rodadas de seleção subsequentes.

6.1.4. ELISA Antígenos diretamente revestidos

[00301] Placas MaxiSorp (Nunc, 430341) foram revestidas durante a noite com proMMP13 humana a 4 ºC seguido por um bloqueio de uma hora (PBS, caseína 1%) na RT. Após uma etapa de lavagem em PBS + Tween 20 0,05%, diluições de 10 vezes de extratos periplasmá- ticos em PBS, caseína 0,1%, Tween 20 0,05% foram adicionadas du- rante uma hora na RT. Nanocorpos ligados foram detectados com anti- FLAG-HRP de camundongo (Sigma (A8592)). Antígenos capturados - ELISA de MMP13 de ser humano ativada

- ELISA de MMP13 de rato ativada - ELISA de MMP13 de cachorro ativada

[00302] Placas MaxiSorp (Nunc, 430341) foram revestidas durante a noite com anticorpo de MMP13 humano mAb511 a 4 ºC seguido por um bloqueio de uma hora (PBS, caseína 1%) na RT. Após uma etapa de lavagem em PBS + Tween 20 a 0,05%, 20 nM de MMP13 ativada de ser humano, rato ou cachorro foram adicionados durante uma hora na RT. Após uma segunda etapa de lavagem, diluições de 10 vezes de extratos periplasmáticos ou séries de diluição de nanocorpos purifi- cados em PBS, caseína a 0,1%, Tween 20 a 0,05% foram adicionadas durante uma hora na RT. Nanocorpos ligados foram detectados com anti-FLAG-HRP de camundongo (Sigma (A8592)).

6.1.5. Ensaio de peptídeo fluorogênico

[00303] A configuração de ensaios de peptídeo fluorogênico de MMP13 de ser humano, cinomolgo, rato, cachorro e bovino, assim como os ensaios de peptídeo fluorogênico de MMP1 e MMP14 de ser humano, é resumida como se segue: a MMP ativada foi incubada com o substrato de peptídeo fluorogênico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems %ES001) e uma diluição de 1/5 de extrato periplasmático ou uma série de diluição de Nanocorpo/controle positivo (volume total = 20 ul em tampão de ensaio Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 MM, Tween 20 0,01%), durante 2 h a 37ºC. O aumento linear de fluorescência (vO- entre 15 e 45 min de incubação) foi utilizado como uma medida para a atividade enzimática e a inibição % foi calculada com a fórmula 100 — 100 (vO na presença de nanocorpo/v0 de teste na presença de Nanocorpo de controle negativo (Cablys)).

6.1.6. Ensaio colagenolítico

[00304] A configuração deste ensaio está em resumo como segue: 250 ng/ml de Colágeno Il humano de grau de imunização Il (Chondrex 420052) foram incubados com MMP13 ativada 5 nM em 100 ul de tampão de ensaio (Tris-Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 10 MM, Tween 20 0,01%). Após 1,5 h de incubação a 35ºC, a reação foi neutralizada com EDTA (10 uM de reserva 30 mM). O colágeno cliva- do com MMP13 Foi ainda degradado com elastase durante 20 minutos a 38ºC para evitar o reanelamento do Colágeno Il degradado (10 ul de reserva diluída 1/3 fornecida no kit Type Il Collagen Detection (Chon- drex t%6009)). O Colágeno intacto remanescente foi detectado através de ELISA (reagentes fornecidos no kit Type Il Collagen Detection (Chondrex t6009)).

6.1.7. Ensaio de Colágeno Fluorogênico

[00305] Em resumo, a configuração deste ensaio é como se segue: 100 ug/ml de DQG Collagen, tipo | da pele bovina (conjugado de fluo- resceína; Molecular Probes *%D-12060 lot 1149062) foram incubados com MMP13 ativada 10 nM e uma série de diluição de Nanocorpo puri- ficado/controle positivo, durante 2 h a 37ºC em 40 ul de tampão de en- saio (Tris-Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCI2 10 mM, Tween 20 0,01%). O aumento linear de fluorescência (vO- entre 15 e 45 min de incubação) foi utilizado como uma medida para a atividade enzimática e a inibição % foi calculada com a fórmula 100 — 100 (vO na presença de Nanocorpo de teste/vO0 na presença de um Nanocorpo de controle negativo (Cablys)).

6.1.8. Ensaio de competição TIMP-2

[00306] 50 ul de TIMP-2 (0,63 nM; R&D Systems t971-TM) foram capturados (1 h na RT) em uma placa revestida com anticorpo TIMP-2 anti-humano (R&D Systems %MAB9711) (2 ug/ml em PBS; durante a noite). Durante esta captura, a MMP-13-biotina ativada 1,26 nM foi pré-incubada com uma série de diluição de Nanocorpo/TIMP- 3/MSC2392891A em 70 ul de tampão de ensaio (Tris-Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween 20 0,01%). 50 ul desta mis- tura foram adicionados ao TIMP-2 capturado e incubados durante 1 h na temperatura ambiente. A MMP13-biotina foi detectada com 50 uM de Estreptavidina-HRP (1:5000 DakoCytomation tPO0397).

6.1.9. Ensaio de troca térmica (TSA)

[00307] OTSA foirealizado com 5 ul de Nanocorpos monovalentes purificados em essência de acordo com Ericsson et al. (2006 Anals of Biochemistry, 357: 289-298).

6.1.10. Cromatografia de exclusão por tamanho analítica (SEC Analíti- ca)

[00308] Experimentos de SEC analítica foram executados em uma máquina Ultimate 3000 (Dionex) em combinação com uma coluna Bi- osep-SEC-3 (Agilent).

6.1.11. Oxidação forçada

[00309] — Amostras de Nanocorpos (1 mg/ml) foram submetidas du- rante quatro horas na RT e no escuro em H2O02 10 mM em PBS, em paralelo com as amostras de controle sem H2O>2, seguido por comuta- ção de tampão em PBS utilizando colunas de centrifugação de dessa- linização Zeba (0,5 ml) (Thermo Scientific). As amostras de tensão e de controle foram então analisadas por meio de RPC em uma máquina Series 1200 ou 1290 (Agilent Technologies) sobre uma coluna Zorbax 300SB-C3 (Agilent Technologies) a 70ºC. A oxidação de Nanocorpos foi quantificada pela determinação da área máxima % de pré-picos que ocorrem como resultado do estresse oxidativo, em comparação com o pico de proteína principal.

6.1.12. Tensão de temperatura

[00310] Amostras de Nanocorpos (1 a 2 mg/ml) foram armazenadas em PBS durante quatro semanas a -20ºC (controle negativo) 25 e 40ºC. Após este período de incubação, os Nanocorpos foram digeridos com Tripsina ou LysC. Os peptídeos de amostras de tensão e controle foram então analisados por meio de RPC em uma máquina Series 1290 (Agilent Technologies) sobre uma coluna Acquity UPLC BEH300-

C18 (Agilent Technologies) a 60ºC acoplada a um espectrômetro de massa Q-TOF (6530 Accurate Mass Q-TOF (Agilent)).

6.2. Imunizações

[00311] A MMP13 é secretada como uma pró-forma inativa (pro- MPP13). Ela é ativada assim que o pró-domínio é clivado, deixando uma enzima ativa composta de um domínio catalítico, que forma a bol- sa catalítica, e um domínio semelhante a hemopexina (PDB: 1PÉX), que é descrito de funcionar como um domínio de ancoragem/Interação do substrato Colágeno II (Col Il).

[00312] Foi formulada uma hipótese de que a melhor região para inibir a atividade enzimática de MMP13 seria a bolsa catalítica. Entre- tanto, a elevação de uma resposta imune contra a bolsa catalítica re- presenta diversos problemas importantes.

[00313] Em primeiro lugar, na proMP13, o pró-domínio mascara a bolsa catalítica, devido ao fato de que a bolsa não é acessível para a elevação de uma resposta imune.

[00314] Em segundo lugar, a MMP13 ativada possui uma meia-vida curta, que é principalmente devido à autoproteólise. Esta meia-vida curta impede o desenvolvimento de uma resposta imune forte.

[00315] Em terceiro lugar, a sequência do domínio catalítico é alta- mente conservada através das espécies. Portanto, a resposta imune esperada seria fraca, se elevada de qualquer modo.

6.2.1. Estratégia de imunização

[00316] Afim de lidar com estes problemas e aumentar as chances de sucesso na obtenção de inibidores de MMP13 que se ligam à bolsa catalítica, estratégias de imunização sofisticadas e elaboradas foram desenvolvidas compreendendo vários formatos de MMP13. Eventual- mente, as seguintes imunizações foram realizadas: (a) 3 lhamas foram imunizadas com uma variante de MMP13 truncada que consiste no domínio catalítico e contendo mutação F72D, que pro-

tege a MMP13 da autoproteólise; (b) 3 lhamas foram imunizadas com a mesma variante de MMP13 truncada como em (a), que, além da mutação F72D, continha mutação E120A que inativa a função enzimática; (c) mais 3 lhamas foram imunizadas com proteína proMMP13 de com- primento total; e (d) 3 lhamas foram imunizadas com uma mistura de plasmídeos que codificou uma variante de proMMP13 secretada (V123A) ou uma vari- ante de proMMP13 fixada por GPI (V123A). A mutação V123A é des- crita com relação à MMP13 para provocar uma interação fraca de Cys104 com o fon de zinco catalítico que leva à auto-ativação espon- tânea.

6.2.2. Títulos de soro

[00317] Os títulos de soro foram determinados em direção à pro- MMP13 e ao domínio catalítico (F72D).

[00318] Em geral, os animais imunizados com a proteína pro- MMP13 (c) ou o DNA que codifica a proMMP13 V123A (d) apresenta- ram uma boa resposta imune contra a proMMP13, mas responderam apenas fracamente ao domínio catalítico (F72D). Os animais imuniza- dos com o domínio catalítico (F72D) (a) ou domínio catalítico inativo (F72D, E120A) (b) não apresentaram nenhuma ou somente uma fraca resposta imune contra o domínio catalítico.

6.2.3. Construção de biblioteca

[00319] A despeito dos baixos títulos de soro contra o domínio cata- lítico, os inventores foram convencidos que a triagem extensiva permi- tiria a identificação de aglutinantes inibidores para a bolsa catalítica.

[00320] O RNA foi extraído de PBLs (linfócitos de sangue primários) e utilizado como modelo para a RT-PCR para amplificar os fragmentos de genes de codificação de Nanocorpos. Estes fragmentos foram clo- nados no vetor de fagomídeos pAX212 que permite a produção de partículas de bacteriófagos que apresentam Nanocorpos fundidos com His6- e FLAG3-tags. Os bacteriófagos foram preparados e armazena- dos de acordo com protocolos padrão (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual 1*' Edition, Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty, Academic Press, 1996).

[00321] O tamanho médio das 18 bibliotecas imunes eventualmente obtidas foi ao redor de 5 * 108º clones individuais.

6.3. Triagem primária

[00322] As seleções de apresentação em fagos foram executadas com 18 bibliotecas imunes e duas bibliotecas de Nanocorpos sintéti- cas. As bibliotecas foram submetidas de duas a quatro rodadas de en- riquecimento contra diferentes combinações de proMMP13 humana, MMP13 ativada de ser humano, rato e cachorro, assim como domínio catalítico de MMP13 de ser humano (F72D) utilizando diferentes for- matos de apresentação de antígenos. Os clones individuais das saídas de seleção foram submetidos à triagem para ligação em ELISA (utili- zando extratos periplasmáticos de células de E. coli que expressam os Nanocorpos) contra a MMP13 de ser humano e rato e para a atividade inibidora em um ensaio de peptídeo fluorogênico que mede um au- mento na fluorescência após a hidrólise do peptídeo utilizando um substrato de peptídeo fluorogênico de MMP de amplo espectro. Os Nanocorpos que apresentaram ligação no ELISA, mas não apresenta- ram atividade inibidora no ensaio de peptídeo fluorogênico, foram ain- da submetidos à triagem em um ensaio colagenolítico. O ensaio cola- genolítico utiliza o substrato natural em vez de um peptídeo substituto. Visto que o Colágeno possui uma superfície de interação muito maior com a MMP13 do que com o peptídeo fluorogênico, foi formulada uma hipótese de que os nanocorpos iriam interferir com a degradação do Colágeno, mas não com a degradação do peptídeo. O ensaio colage- nolítico foi, no entanto, não compatível com os extratos periplasmáti-

cos e exigiu o uso de Nanocorpos purificados.

6.3.1. Campanha 1

[00323] Na primeira campanha de seleção, a MMP13 foi apresenta- da como antígeno diretamente revestido. Isto produziu altas taxas de sucesso no ELISA de MMP13 de ser humano e rato (ensaio de liga- ção), incluindo uma boa diversidade de Nanocorpos que se ligam à MMP13 humana com uma ampla faixa de sinais de ligação no ELISA. A maioria dos Nanocorpos foi verificada como sendo de reação cruza- da com a MMP13 de rato. Entretanto, taxas de sucesso extremamente baixas no ensaio de peptídeo fluorogênico (ensaio de inibição) foram obtidas. Além do mais, a inibição observada foi incompleta e alguns destes Nanocorpos não apresentaram reatividade cruzada de rato.

[00324] Visto que nenhum Nanocorpo monovalente completamente inibidor foi obtido, os inventores formularam uma hipótese de que o epítopo correto não estava sendo direcionado e as condições utiliza- das durante as seleções não foram ideais. No entanto, as condições de seleção de testes foram impedidas pela ausência de um controle positivo.

[00325] Eventualmente, descobriu-se que o revestimento direto in- terfere com a atividade enzimática.

6.3.2. Campanha 2

[00326] Na campanha 2, seleções foram executadas em solução com a MMP13 biotinilada. Utilizando a MMP13 de ser humano e de rato ativada capturada por meio de um anticorpo não neutralizante ao invés de proMMP13 diretamente revestida, as taxas de sucesso de ELISA foram, no entanto, muito menores do que para a campanha 1. As taxas de sucesso também foram novamente muito baixas no en- saio de peptídeo fluorogênico. No entanto, um Nanocorpo que inibe totalmente o ensaio colagenolítico foi observado. Como a pró-forma da enzima foi utilizada para o enriquecimento do aglutinante, formulou-se uma hipótese de que os epítopos críticos foram mascarados pelo pró- peptídeo.

6.3.3. Campanha 3

[00327] Em vista dos resultados de desapontamento das campa- nhas 1 e 2, os inventores optaram otimizar a apresentação dos epíto- pos críticos no domínio catalítico através do uso de MMP13 ativada capturada por um anticorpo não neutralizante. O mesmo formato de captura também foi utilizado para o ELISA. Isto resultou em taxas de sucesso mais elevadas no ELISA para a MMP13 tanto de ser humano quanto de rato. Entretanto, embora as taxas de sucesso no ensaio de peptídeo fluorogênico tenham sido ligeiramente mais elevadas em comparação com as campanhas anteriores, os Nanocorpos ainda for- neceram apenas inibição incompleta e apresentaram reatividade cru- zada de rato fraca ou nenhuma, sugerindo que a apresentação captu- rada de MMP13 foi ainda subideal.

[00328] Três clones, incluindo CO101040E09 ("40E09"), apesar de fornecer inibição incompleta no ensaio de peptídeo fluorogênico, foram observados positivos no ensaio colagenolítico. Membros da família de 40E09 foram clonados e sequenciados: CO101PMPO40E08, CO101PMPO042A04, CO101PMPO40B05, CO101PMPO042D12, CO101PMPO042A03, CO101PMPO024A08 e CO101PMPO40DO1 (cf. Ta- belas A-1 e A-2). A variabilidade de sequência das regiões CDR é re- presentada nas Tabelas 6.3.3A, 6.3.3B e 6.3.3C abaixo. As sequên- cias de aminoácido das CDRs do clone 40E09 foram utilizadas como referência contra as quais as CDRs dos membros da família foram comparadas (CDR1 começa na posição Kabat 26, CDR2 começa na posição Kabat 50 e CDR3 começa na posição Kabat 95).

Tabela 6.3.3A (40E09 CDR1) numeração 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Kabat numeração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 absoluta sequência do |G Ss T F Ss R Y Ss M N tipo selvagem mutações R * Até 1 mutação de CDR1 em um clone (SEQ ID NO: 23) Tabela 6.3.3B (CDR2) numeração 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Kabat numeração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 absoluta sequência do | G | Ss MM G R 7 T N tipo selvagem Mutações T A H * Até 3 mutações de CDR2 em um clone (SEQ ID NO: 37) Tabela 6.3.3C (40E09 CD3) numeração Kabat e e n o o 8 & 8 3% 8 8 ST numeração | 1 2 3 4 5 6

ERA sequência | G G L Q G Y do tipo selvagem mutações Ss * Até 1 mutação de CDR em um clone (SEQ ID NO: 52)

6.3.4. Campanha 4

[00329] —“Na4º campanha, além das bibliotecas de apresentação em fagos de Nanocorpos imunes derivadas de estratégias de imunização (a) e (c), também as bibliotecas derivadas de estratégias de seleção (b) e (d) foram exploradas (cf. Exemplo 6.2.1). A estratégia de seleção foi focalizada no domínio catalítico de MMP13 (F72D), que foi utilizado em solução. As taxas de sucesso no ensaio de peptídeo fluorogênico aumentaram através de bibliotecas e muitos Nanocorpos apresenta- ram inibição completa. Os Nanocorpos inibidores mostraram apenas ligação deficiente no ELISA, confirmando que também a apresentação capturada de MMP13 utilizada na campanha 3 foi subideal para a acessibilidade de epítopos críticos. Consequentemente, um ensaio de peptídeo fluorogênico de rato foi utilizado em vez do ELISA para avali- ar a reatividade cruzada de rato. Os representantes da família de Na- nocorpos com potencial inibidor confirmado foram todos de reação cruzada de rato sugerindo que os epítopos reconhecidos por este con- junto particular de clones situam-se dentro da bolsa catalítica de MMP13 conservada.

[00330] Em suma, descobriu-se que qualquer manipulação de roti- na de MMP13 interferiu com a atividade da enzima e com a ligação de TIMP-2 (dados não mostrados). Após a variação e avaliação de vários parâmetros, incluindo antígenos diferentes (por exemplo, proMMP13, domínio catalítico (F72D), MMP13 humana ativada, MMP13 de rato ativada, MMP13 de cachorro ativada, ensaios diferentes, incluindo ELISA, ensaio de peptídeo fluorogênico humano, ensaio de peptídeo fluorogênico de rato e ensaio colagenolítico humano, diferentes confi- gurações de ensaio, incluindo variações nas condições de revestimen- to, em solução e captura de MMP13), descobriu-se que as únicas es- tratégias bem sucedidas para a identificação de Nanocorpos comple- tamente inibidores foram as seleções utilizando o domínio catalítico (F72D) ou as espécies de MMP13 ativadas (campanha 4).

6.3.5. Painel de Orientação

[00331] — Nanocorpos inibidores identificados no peptídeo fluorogêni- co ou ensaios colagenolíticos foram sequenciados. Com base na in- formação de sequência, os Nanocorpos podem ser classificados em várias famílias. As 4 famílias derivadas das campanhas de triagem 2 e

3 mostraram inibição completa no ensaio colagenolítico, mas não apresentaram atividade no ensaio de peptídeo fluorogênico, aqui indi- cadas como clones de "perfil 1" (cf. 40E09 e membros da família). As famílias derivadas da campanha de triagem 4 mostraram atividade inibidora tanto no ensaio colagenolítico quanto no ensaio de peptídeo fluorogênico, aqui indicadas como clones de "perfil 2".

[00332] Um clone representativo por família de Nanocorpo foi sele- cionado, totalizando em 14 representantes. As sequências dos clones representativos são representadas na Tabela A-1.

6.4. Caracterização in vitro de painel de orientação monovalente

[00333] Afim de caracterizar ainda mais os clones de Nanocorpos representativos funcionalmente, eles foram divididos em pAX129, transformados em E. coli e expressos e purificados de acordo com protocolos padrão (por exemplo, Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288(41): 29562-72). Subsequentemente, estes clones foram submeti- dos a vários ensaios funcionais in vitro.

6.4.1. Ensaios enzimáticos

[00334] A potência/eficácia dos Nanocorpos foi testada no ensaio de peptídeo fluorogênico, configurado para diferentes ortólogos de MMP13, e no ensaio colagenolítico humano (ambos os ensaios tam- bém foram utilizados durante a triagem, ver o Exemplo 6.3). Além dis- so, um segundo ensaio baseado em colágeno (ensaio de colágeno fluorogênico) utilizando concentrações mais elevadas de Colágeno em comparação com o ensaio colagenolítico foi estabelecido para simular as condições de alta concentração de Colágeno na cartilagem em que se espera que o inibidor de MMP13 seja ativo. Neste ensaio, a fluores- cência do substrato de Colágeno marcado com FITC intacto é baixa devido ao efeito de extinção recíproco dos fluoróforos. Após a cliva- gem, a extinção é perdida e a fluorescência aumenta.

[00335] “Uma visão geral das potências nos ensaios enzimáticos é dada na Tabela 6.4.1. ensaio de ensaio de ensaio de ensaio de ensaio de peptídeo peptídeo — peptídeo — peptídeo —peptídeo fluorogê- ensaio de fluorogê- fluorogê- fluorogê- fluorogê- nico de ensaio cola- colágeno nico nico de nico de nico cinomol- genolítico fluorogêni- clone humano rato cachorro — bovino go humano co humano Nenhuma — Nenhuma — Nenhuma Nenhuma Nenhuma perfl1 32B08 inibição inibição inibição inibição inibição 974 inibição parcial Nenhuma — Nenhuma — Nenhuma Nenhuma Nenhuma perfl1 40E09 inibição inibição inibição inibição inibição 10,2 inibição parcial Nenhuma — Nenhuma — Nenhuma Nenhuma Nenhuma perfl1 43E10 inibição inibição inibição inibição inibição 201 inibição parcial Nenhuma — Nenhuma — Nenhuma Nenhuma Nenhuma perfl1 43B05 inibição inibição inibição inibição inibição 7266 inibição parcial MSC239 2891A 3,7 0,7 07 8,5 3,0 4,7 inibição parcial Tabela 6.4.1. Potência do painel de orientação nos ensaios enzimáti- cos de MMP13. As potências são relatadas apenas quando a eficácia for de -100%.

[00336] As curvas de dose-resposta para inibição da MMP13 hu- mana ativada quando se utiliza concentrações elevadas de Colágeno bovino | (ensaio de Colágeno fluorogênico) são descritas na Figura 1. Figura 1: Curvas de dose-resposta de Nanocorpos de perfil 1 (gráfico esquerdo) e Nanocorpos de perfil 2 (gráfico direito) no ensaio de Colá- geno fluorogênico.

[00337] “Embora os Nanocorpos de perfil 1 apresentaram eficácia total no ensaio colagenolítico sob condições de baixa concentração de Colágeno, sua eficácia caiu no ensaio de Colágeno fluorogênico sob condições de alta concentração de Colágeno (Figura 1, painel esquer- do).

[00338] Da mesma forma, o fármaco comparador MSC2392891A mostrou eficácia mais fraca no ensaio de Colágeno fluorogênico (Figu- rei).

[00339] Os Nanocorpos representativos de perfil 2 foram potentes e completamente eficazes tanto no ensaio colagenolítico quanto no en- saio de colágeno fluorogênico. A maioria dos Nanocorpos foi mais ati- va do que o fármaco comparador neste ensaio. Estes representantes do perfil 2 apresentaram potências comparáveis (cf. Tabela 6.4.1) e eficácias (Figura 1, painel direito) em ensaios de peptídeo fluorogênico de ser humano, cinomolgo, rato, cachorro e bovino.

6.4.2. Ensaios de ligação

[00340] “Uma configuração de ELISA foi utilizada para avaliar a afi- nidade de ligação. No entanto, observou-se que este ensaio só foi adequado para avaliar a afinidade dos Nanocorpos de perfil 1, mas não os Nanocorpos de perfil 2 (cf. Exemplo 6.3).

[00341] Os resultados são apresentados na Tabela 6.4.2A.

ER clone ser humano (EC50) — (EC50) (EC50) Tabela 6.4.2A: Afinidades de ligação (EC50) avaliadas por ELISA para Nanocorpos de perfil 1

[00342] Em conclusão, a afinidade de ligação dos Nanocorpos de perfil 1 é comparável para as três espécies testadas (isto é, menos do que 10 vezes de diferença). Embora o clone 40E09 tenha apenas a segunda melhor afinidade de ligação para a MMP13 humana, ele apresenta a melhor afinidade através das espécies.

[00343] Como foi observado que os Nanocorpos de perfil 2 compe- tiam com TIMP-2 para ligação a MMP13, um ELISA de competição de TIMP-2 foi configurado e utilizado para avaliar as afinidades de Nano- corpos de perfil 2. Notavelmente, os Nanocorpos de perfil 1 não com- petem com TIMP-2.

[00344] Os resultados são apresentados na Tabela 6.4.2B. Eee ep core Jeusneo comento mes [oo [eus cocos mea eos seis LSPOETa OA Pete

ES CE LL LSTTAOT Re 52ocoa Ra en jer legs sig — gemeas A assenlag — SE Bet Tabela 6.4.2B: Potências (IC50) avaliadas por ELISA de competição TIMP-2 para Nanocorpos de perfil 2

[00345] Em conclusão, a classificação foi similar às potências obti- das nos ensaios enzimáticos, com Nanocorpos 516G8, 529C12 e 62C02 apresentando o melhor potencial inibidor, enquanto que os Na- nocorpos 59F06, 525C04 e 63F01 foram secundários a estes.

6.4.3. Ensaios de seletividade

[00346] A fim de determinar a seletividade dos Nanocorpos para MMP13 sobre MMP1 e MMP14, ensaios de peptídeo fluorogênico fo- ram utilizados. MMP1 e MMP14 são dois membros da família de MMP intimamente relacionados. Visto que os Nanocorpos de perfil 1 não apresentaram inibição no ensaio de peptídeo fluorogênico de MMP13, somente os Nanocorpos de perfil 2 puderam ser testados. TIMP-2, um inibidor de MMP não seletivo, foi utilizado como controle positivo nes- tes ensaios.

[00347] Os resultados são apresentados na Figura 2.

Figura 2. Seletividade de Nanocorpos de orientação de MMP13

[00348] “Todos os Nanocorpos foram altamente seletivos. Eles não apresentaram inibição de MMP1 e apenas uma inibição muito menor foi observada em altas concentrações de MMP14 para alguns Nano- corpos.

6.4.4. Categorização de epítopos

[00349] Para a categorização de epítopos um painel de Nanocorpos monovalentes derivados do perfil 1 e perfil 2 foi testado em um ELISA de competição contra o Nanocorpo purificado 40E09 (perfil 1).

[00350] Os resultados do ELISA de competição são mostrados na Figura 3.

Figura 3. ELISA de competição de 40E09 0,6 nM biotinilado contra um painel de Nanocorpos de perfil 1 e perfil 2 em MMP13 humana de comprimento total, capturado por meio de mAb de MMP13 anti- humano (R&D Systems %&MAB511). A MMP13 Foi ativada através de incubação com APMA durante 1h30 a 37ºC.

[00351] Os Nanocorpos de perfil 1 32B08, 43B05, 43E10 e 40E09 (controle positivo), todos competem com 40E09. Por outro lado, nem os Nanocorpos de perfil 2 59FO06, 62C02, 63F01, 513C04, 516G8 e 517A01 nem os controles negativos cAblys competem com 40E09.

[00352] — Portanto, os Nanocorpos de perfil 1 parecem pertencer a uma categoria diferente de epítopo (temporariamente chamada "cate- goria 1") do que os Nanocorpos de perfil 2 (temporariamente chama- dos "categoria 2"), que também refletirá as estratégias de imunização e seleção.

6.5. Construções bivalentes

[00353] “Como demonstrado no Exemplo 6.4.1 acima, os Nanocor- pos de perfil 1 não apresentaram nenhuma inibição nos ensaios de peptídeo fluorogênico (cf. Tabela 6.4.1). Os inventores começaram a investigar o efeito de uma combinação de Nanocorpos de perfil 1 e Nanocorpos de perfil 2.

[00354] “Como o melhor aglutinante de reação cruzada da espécie (cf. Exemplo 6.4.2), o Nanocorpo 40E09 foi selecionado como repre- sentativo de Nanocorpos de perfil 1. Para o perfil 2, três Nanocorpos foram selecionados: 516G08, 62C02 e 517A01. Os Nanocorpos de perfil 1 e perfil 2 foram combinados em um formato bivalente com um ligador 35GS (ver a Tabela 6.5; Nb(A)-35GS-Nb(B)). Os Nanocorpos bivalentes foram clonados em pAX205, transformados em P. pastoris, expressos e purificados de acordo com procedimentos padrão.

[00355] Para avaliar a potência destas construções bivalentes, o ensaio de peptídeo fluorogênico de rato foi utilizado, mas com uma concentração mais baixa de MMP13 em comparação com a configura- ção de triagem (0,15 nM em vez de 1,33 nM) para melhorar a sensibi- lidade do ensaio. Construções bivalentes foram testadas neste ensaio de peptídeo fluorogênico adaptado assim como no ensaio de colágeno fluorogênico humano.

[00356] Os dados resultantes são resumidos na Tabela 6.5. 1C50 [nv] ensaio de peptídeo fluorogê- ensaio de colágeno fluoro- clone Descrição nico de rato (adapted) gênico humano TIMP-2 0,18 2,402 516G08 4,98 3,777 62C02 2,88 8,317 MSC2392891A 4,86 Parcial 517A01 2,64 10,85 80 517A01-40E09 — 0,13 4,06 76 516G08-40E09 — 0,16 3,55 72 62C02-40E09 0,1 2,4 71 40E09-517A01 0,11 6,5 70 40E09-516G08 — 0,12 2,9 69 40E09-62C02 1,12/parcial baixa eficácia Tabela 6.5: Potência de Nanocorpos bivalentes no ensaio de peptídeo fluorogênico de rato (adaptado para ser mais sensível) e no ensaio de colágeno fluorogênico humano

[00357] Os resultados indicam que as construções bivalentes con- sistindo em um Nanocorpo de perfil 1 combinado com um Nanocorpo de perfil 2 são mais potentes do que seus blocos de construção mono- valentes no ensaio de peptídeo fluorogênico de rato adaptado com melhorias de potência de até 40 vezes. Da mesma forma foram obser- vadas melhorias de potência de ensaio de colágeno fluorogênico hu- mano (até 4 vezes). Em ambos os ensaios, as construções bivalentes foram igualmente potentes ao controle positivo não seletivo de TIMP-2.

[00358] “Portanto, embora os Nanocorpos de perfil 1 não sejam par- ticularmente inibidores por conta própria, eles melhoraram a potência dos Nanocorpos de perfil 2 quando combinados em uma construção bivalente.

6.6. Caracterização biofísica

[00359] Para facilitar a conveniência do paciente, uma baixa fre- quência de administração e alta retenção do composto terapêutico são favoráveis. Portanto, é preferível que os Nanocorpos tenham uma alta estabilidade.

[00360] Afim de testar a estabilidade, 5 Nanocorpos de perfil 2 re- presentativos e um Nanocorpo de perfil 1 representativo foram subme- tidos à caracterização biofísica.

6.6.1. Ensaio de troca térmica

[00361] A estabilidade térmica dos Nanocorpos anti-MMP13 do tipo selvagem foi investigada em um ensaio de troca térmica (TSA).

[00362] Os resultados são representados na Tabela 6.6.1.

Tabela 6.1.1: Tm em pH 7 para Nanocorpos monovalentes

[00363] Os valores de Tm no pH 7 variam de 65ºC a 83ºC, indicati- vos de características de estabilidade boas a muito boas.

6..6.2. SEC Analítica

[00364] A tendência para a multimerização e agregação de um pai- nel selecionado de 5 Nanocorpos anti-MMP13 representativos foi in- vestigada por cromatografia de exclusão por tamanho analítica (aSEC).

[00365] — Um resumo dos resultados é mostrado na Tabela 6.6.2. retenção [min] tiva [%] ração geral da aSEC Tabela 6.6.2: Parâmetros analíticos de SEC para Nanocorpos de ori- entação de MMP13

[00366] Os 5 Nanocorpos representativos tiveram tempos de reten- ção dentro da faixa esperada para Nanocorpos monovalentes (7,6 a 8,2 minutos) e a área relativa do pico principal e recuperação global foi acima de 90% para todos os Nanocorpos.

[00367] As propriedades biofísicas baseadas em TSA e aSEC fo- ram consideradas adequadas para o desenvolvimento adicional para todos os Nanocorpos testados.

6.7. Seleção de clones para o desenvolvimento adicional e otimização de sequências

[00368] Com base nas características funcionais e biofísicas dos Nanocorpos representativos e construções bivalentes, 4 Nanocorpos de orientação exemplares: 62C02, 529C12, 80A01 e construção biva- lente C01010080 ("0080", consistindo do Nanocorpo de perfil 2 517A01 e Nanocorpo de perfil 1 40E09) foram selecionados para de- senvolvimento adicional.

[00369] Os presentes inventores começaram a otimizar a sequência de aminoácido ("Otimização da Sequência" ou "SO") do painel de ori- entação. No processo de otimização da sequência, tenta-se (1) tornar inoperante os sítios para modificações pós-translacionais (PTM); (2) humanizar o Nanocorpo de origem; assim como (3) tornar inoperante os epítopos para anticorpos pré-existentes potenciais. Ao mesmo tem- po, as características funcionais e biofísicas dos Nanocorpos devem, de preferência, ser mantidas ou mesmo melhoradas.

6.7.1. Modificações pós-translacionais (PTM)

[00370] As modificações pós-translacionais (PTM) que foram avali- adas são: Met-oxidação, Asn-desamidação, Asp-isomerização, Asn- glicosilação e formação de piroglutamato.

[00371] Embora a mutação E1D (geralmente incorporada para pre- venir a formação de piroglutamato) não tenha sido analisada durante a otimização da sequência, ela foi incluída nos Nanocorpos formatados. A mutação foi aceita para todos os Nanocorpos de orientação de MMP13, exceto 62C02, para o qual foi observada uma queda de po- tência de 12 vezes. Portanto, foi decidido não incorporar a mutação E1D no bloco de construção 62C02.

[00372] Afim de avaliar a PTM potencial, a oxidação forçada e a tensão de temperatura foram aplicadas sobre o painel de orientação. Com exceção de C0101517A01 ("517A01") e CO101080A01 ("80AO1") nenhuma modificação foi observada para o painel de orientação.

[00373] Sob as condições de oxidação forçada e tensão de tempe- ratura, a C0101080A01 foi propensa à Asp-isomerização e Met- oxidação. No entanto, o grau de isomerização e oxidação diferiu nas condições avaliadas e estava logo abaixo ou acima do limite aplicado em cada caso. Eventualmente, os resíduos de aminoácido 54-55, 100d-100e, M100j e 101-102 foram identificados como os resíduos responsáveis pela PTM. Notavelmente, todos estes resíduos estão lo-

calizados nas regiões CDR2 ou CDR3 e, portanto, potencialmente en- volvidos na ligação alvo. A fim de tentar acomodar as diferentes exi- gências, bibliotecas de NKK foram construídas nas quais estes resí- duos foram submetidos à mutação, e subsequentemente submetidos à triagem no ensaio de peptídeo fluorogênico para avaliar as possíveis perdas de potência assim como submetidos à triagem com relação às propriedades biofísicas (Tm). Foi observado, de modo inesperado, que várias posições poderiam ser submetidas à mutação nestas CDRs sem qualquer perda significativa de potência, isto é, retendo mais do que 80% de inibição. m= Para a biblioteca D100dX, as 9 substituições de aminoácido ("AA") mostraram uma inibição de > 80% (E, G, A, P, TR M, WeY). m Para a biblioteca M100jX, 16 substituições de AA mostraram inibição de > 85% (todos exceto T, Ce H). m Para a biblioteca D101X, 16 substituições de AA mostraram inibição de > 90% (todos exceto para D, Fe P). = Para a biblioteca Y102X, a maioria dos clones apresentou uma inibi- ção de > 90%. Portanto, acredita-se que a posição de aminoácido 102 pode ser submetida à mutação em qualquer resíduo.

[00374] As seguintes mutações conservadas foram particularmente preferidas: D100dE e M100jL.

[00375] “Uma visão geral das mutações preferidas nas regiões CDR é fornecida nas Tabelas 6.7.1A, 6.71B e 6.7.1C abaixo. As sequências de aminoácido das CDRs do clone 80A01 foram utilizadas como refe- rência contra a qual as CDRs dos membros da família foram compara- das. A CDR1 começa no resíduo de aminoácido 26, a CDR2 começa no resíduo de aminoácido 50, a CDR3 começa no resíduo de aminoá- cido 95 de acordo com a numeração Kabat.

Tabela 6.7.1A (80A018SO CDR1) numeração | 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Kabat numeração | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 absoluta sequência | G F T L A Y Y Ss | G do tipo selvagem Mutações * Até O mutações de CDR1 em um clone SEQ ID NO: 28 Tabela 6.7.1B6 (80A01SO CDR2) soros TERRE Numeração 50 51 52 53 854 55 56 57 58/59 Kabat Numeração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | absoluta Sequência do | C | Ss Ss G | D G Ss T Y tipo selvagem Mutações * Até O mutações de CDR2 em um clone SEQ ID NO: 43 Tabela 6.7.1C (80A01SO CDR3) nume- ração o 3 8 8 3 gs 38 5 õS-a Kabat 6 ey tm &» g& oO SO S o o o o o o o sos oo 8 &8& 5 3 8 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 SS nume- ração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 absolu- Beco se- quência do tipo | D Ss P H Y Y Ss E Y D Cc GY Y G M OD Y selva- gem muta- - x1 x2 X3 X4 ções * Até 4 mutações de CDR em um clone (SEQ ID NO: 57) X1=E,G,A,P, TR M,W,Y X2=A,RN,D,E,Q,Z,G,I, L,K F,P,S,W,YeV X3=A,R N,C,E,Q,Z,G, HI, L KM,S,T,W,YeV

X4=A,R,N,D,C, E, Q, Z, G, Hs, , L KM, EF, P, S, T We V

[00376] Sob as condições de oxidação forçada e estresse de tem- peratura, a CO101517A01 foi propensa à desamidação. Eventualmen- te, resíduos de aminoácidos N100b e N101 foram identificados como resíduos sensíveis à desamidação através de experimentos de estres- se de temperatura. Entretanto, estes resíduos estão localizados na re- gião CDR3, e potencialmente envolvidos na ligação alvo. Assim, a neutralização dos sítios de desamidação pode ter um impacto sobre a ligação. Também neste caso as bibliotecas de NKK foram construídas nas quais os resíduos propensos à desamidação foram submetidos à mutação, e subsequentemente submetidos à triagem no ensaio de peptídeo fluorogênico para avaliar as possíveis perdas de potência as- sim como submetidos à triagem com relação às propriedades biofísi- cas (Tm).

[00377] Foitotalmente de modo inesperado mostrado que a muta- ção N100b para Q ou S ou a mutação N101 para Q ou V anulou a de- samidação, mas ao mesmo tempo resultou em uma Tm aumentada de 1 a 3ºC em comparação com o Nanocorpo de origem C0101517A01, enquanto que a potência foi comparável. 4 variantes preferidas são mostradas na Tabela 6.7.1D, que também resume os resultados do ensaio de TSA e peptídeo fluorogênico. Uma visão geral das mutações preferidas nas CDRs é apresentada nas tabelas abaixo. Tabela 6.7.1D. Resumo de dados da 2º rodada de variantes de otimi- zação da sequência CO101517A01

[00378] Uma visão geral das mutações preferidas nas regiões CDR é fornecida nas Tabelas 6.7.1E, 6.7.1F e 6.7.1G abaixo. As sequên- cias de aminoácido das CDRs do clone 517A01 foram utilizadas como referência contra a qual as CDRs dos outros clones foram compara- das. A CDR1 começa no resíduo de aminoácido 26, a CDR2 começa no resíduo de aminoácido 50, a CDR3 começa no resíduo de aminoá- cido 95 de acordo com a numeração Kabat. Tabela 6.7.1E (517A1SO CDR1) sequência dotipo sedvagem | GR T F S S Y A NM G Ima co SÓ * Até O mutações de CDR1 em um clone (SEQ ID NO: 26) Tabela 6.7.1F (517A01SO CDR2) sequência do tipo selvagem A S W SS GG 6 ST Y gua o OS SS SO) * Até O mutações de CDR2 em um clone (SEQ ID NO: 41) Tabela 6.7.1G (517A01SO CDR3) 517A0 ração Kat | 2 2 5 g gq 8 8 Se 8SsSêssó e ss ta

E “oo so A L A Vv Y G P N R Y R Y G P v G E Y N Y selva- gem muta- = o v ções Ss o * Até 2 mutações de CDR em um clone (SEQ ID NO: 55)

6.7.2. Humanização

[00379] Para humanização, a sequência de Nanocorpos torna-se mais homóloga à sequência de consenso da linha germinativa IGHV3- IGHJ humana. Com exceção dos resíduos de "marca característica" de Nanocorpos, os aminoácidos específicos nas regiões estruturais que diferem entre o Nanocorpo e a sequência de consenso da linha germi- nativa IGHV3-IGHJ humana foram alterados com a contraparte huma- na de tal maneira que a estrutura, a atividade e a estabilidade da pro- teína foram mantidas intactas.

6.7.3. Anticorpos pré-existentes e anticorpos antifármacos

[00380] Os inventores efetuaram uma avaliação de risco precoce com relação às consequências clínicas relacionadas à imunogenicida- de guiando a estratégia de otimização da sequência. A avaliação inclu- iu tanto o potencial imunogênico do fármaco candidato assim como o possível impacto de anticorpos antifármacos com base no modo de ação e da natureza da eventual molécula bioterapêutica. Para isto, a sequência do Nanocorpo foi avaliada a fim de potencialmente (i) mini- mizar a ligação de quaisquer anticorpos pré-existentes de ocorrência natural e (ii) reduzir o potencial de evocar uma resposta de imunogeni- cidade emergente do tratamento.

[00381] As mutações L11V e V89L foram introduzidas em todos os Nanocorpos de MMP13

6.7.4. Clones de SO preferidos

[00382] Nas Tabelas A-1 e A-2, as sequências são representadas com base na Otimização da Sequência do painel de orientação, no qual as sequências foram elaboradas em vista de PTM, humanização e epítopos para anticorpos pré-existentes potenciais e anticorpos anti- fármacos.

6.8. Construções biespecíficas

[00383] Os Nanocorpos anti-MMP13 devem preferivelmente ser ati-

vos nos sítios de interesse, tais como as articulações, a fim de inibir a função de degradação da cartilagem de MMP13. O Aggrecan está abundantemente presente nas articulações e no proteoglicano princi- pal na matriz extracelular (ECM) que é responsável por ca. 50% do teor total de proteínas. Portanto, pelo menos em teoria, a ancoragem dos Nanocorpos anti-MMP13 a um Aggrecan permitiria direcionar o Nanocorpo anti-MMP13 para o tecido relevante e melhorar a sua re- tenção.

[00384] Foi estabelecido combinar os aglutinantes anti-MMP13 da presente invenção com estes aglutinantes Aggrecan, e testar a potên- cia das construções biespecíficas resultantes em um ensaio de peptí- deo fluorogênico humano e um ensaio ELISA de competição. Uma va- riedade de construções biespecíficas, compreendendo os aglutinantes Aggrecan e inibidores de MMP13, foi gerada e testada conforme indi- cado nas tabelas.

[00385] O formato e a potência de resultados típicos são apresen- tados na Tabela 6.8A e Tabela 6.8B. Ensaio de peptídeo fluorogênico humano (MMP13) ID Formato potência Nanocorpos Bispecíficos formatados com 62C02 C010100689 62C02%-114F08%º 1,91E-09 C010100683 62C02%º-114F08%º-114F08Sº 9,53E-10 C010100692 62C02*º-604F02%º 8,28E-10 Referência monoespeciífica C010100280 62C02-FLAGHIis 1,01E-09 Nanocorpos Bispecíficos formatados com 80A01 Co10100687 80A01-114F08*º 1,57E-09 Co010100681 80A01-114F08$º-114FO8Sº 1,08E-09 Co10100690 80A01-604F02%º 2,42E-09 Referência monoespeciífica Co10100101 80A01-FLAGHis 3,92E-09

Nanocorpos Bispecíficos formatados com 517A01-40E09 Co10100729 517º015º-40E09%º-604F02%º-A 5,41E-10 Co10100700 517º015º-40E 095 a-114F08Sº 3,18E-11 Co10100702 517º015º-40E095 “a -114FO8Sº-114FO8BSº — 7,71E-11 C010100696 517º015º-40E09S**-604F02%º 1,07E-10 Co10100726 517º015º-40E 0950 a 6,71E-11 Co10100727 517º015º-40E09% 1,34E-10 Referência monoespecífica Co10100080 517º01-40E09-FLAGHIs 4,88E-10 Nanocorpos Biespecíficos formatados com 529C12 Co010100724 529C12ºº-604F02%º9-A 6,97E-10 C010100688 529C12$º-114F08%º 9,27E-10 C010100682 529C128º-114F08%º-114F08*º 5,51E-10 Co10100691 529C12$º-604F02%º 4,84E-10 Referência monoespecífica Co10100170 529C12ºº-FLAGHis 6,08E-10 Referências internas MSC2392891A 5,80E-09 hTIMP-2 2,09E-10 Tabela 6.8A: Nanocorpos de MMP13-CAP Biespecíficos foram testa- dos no ensaio de peptídeo fluorogênico humano.

As potências foram comparadas com sua respectiva contraparte monoespecífica.

TIMP-2 e MSC2392891 serviram como referências internas em cada ensaio individual.

SO: Sequência otimizada, excluindo as mutações de pré- Ab.

SOvar: Variante de SO não final.

ELISA de Competição de IC5so (CAP) Nanocorpos Biespecíficos com 114F08 Aggrecan C010100683 62C02%º-114FO8S-114FO8Sº 2,3E-10 C010100682 529C128º-114FO8Sº-114FO8Sº 4,5E-10 C010100702 517A015º-40E09Sva--114FOBSO-114FO8Sº —1,2E-10 C010100681 80A01-114FO8S-114FO08SO 9,9E-10 Referência monoespecífica

Tabela 6.8B: Nanocorpos de MMP13-CAP Biespecíficos foram testa- dos em um ensaio ELISA de competição. As potências foram compa- radas com sua respectiva contraparte monoespecífica (fusão ALB26). SO: Sequência otimizada (excluindo as mutações de pré-Ab). SOvar: Variante de SO não final.

[00386] Os resultados mostrados na Tabela 6.8A e 6.8B demons- tram que a combinação de um aglutinante Aggrecan com inibidores de MMP13 não possui nenhum efeito negativo sobre a potência do inibi- dor de MMP13. Notavelmente, na maioria dos casos, os inibidores de MMP13 do painel de orientação possuem a mesma potência que o ini- bidor de MMP não seletivo TIMP-2. Exemplo 6.9. Estudo de DMOAD em modelo MMT de rato in vivo

[00387] Afim de demonstrar ainda mais a eficácia in vivo dos inibi- dores de MMP13 fundidos a um aglutinante de CAP da invenção, um modelo Medial Meniscal Tear (MMT) cirurgicamente induzido em ratos foi utilizado. Em resumo, um nanocorpo anti-MMP13 foi acoplado a um aglutinante de CAP ("754" ou C010100754). Ratos foram operados em um joelho para induzir sintomas semelhantes à OA. O tratamento co- meçou 3 dias após a cirurgia através de injeção IA. A histopatologia foi executada no dia 42 após a cirurgia. Amostras de soro intermediário e no final foram tomadas para análise de biomarcador exploratório. À amplitude da degeneração da cartilagem medial e total foi determina- da, assim como a redução percentual da degeneração da cartilagem. animais foram utilizados por grupo.

[00388] A inibição da degradação da cartilagem na tíbia medial é mostrada na Figura 4.

[00389] Os resultados demonstram que a amplitude da cartilagem foi substancialmente reduzida pela construção de MMP13-CAP após 42 dias em comparação com o veículo. Estes resultados sugerem que (a) o componente de CAP não teve impacto negativo sobre a atividade do Nanocorpo anti-MMP13 (754) consistente com os resultados do Exemplo 6.8; (b) o componente de CAP permite a retenção do Nanocorpo anti- MMP13; e (c) o Nanocorpo anti-MMP13 possui um efeito positivo sobre a ampli- tude da cartilagem. Figura 4: inibição da degradação da cartilagem por Nanocorpos em um modelo MMT de rato.

[00390] Os conteúdos inteiros de todas as referências (incluindo referências de literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publi- cados e pedidos de patente copendentes) citadas por todo este pedido são aqui expressamente incorporados por referência, em particular para o ensinamento que é referido mais acima.

Tabela A-1: Sequências de aminoácido de inibidores anti-MMP13 ("ID" refere-se à SEQ ID NO como aqui utili- zada)

FE TETE A OOODLDIDDODO CO101PM 1 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- Lemaeto | ms rtrmSRoMeESTEYL uns ueEr Tomas aemelerames CO101PM 2 KVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRRSMNWYRQAPGKQREFVAGISTGRIT- Cm caem | CO101PM 3 EVOLVESGRGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRRSMNWYRQAPGKQREFVAGISTGRIT- E recem | CO101PM EVOLVESGGGSVOTGGSLRLSCAASGSTFSRRSMNWYRQAPGKQREFVAGISTGRIT- Lentes | | vovenanmsnoveere name ueEomvnvamesaemearames SR CO101PM 5 EVOLVESEGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- 2 Lenaora | wvwsrenmsoesTeYi aneis mmonaaaemeterames | CO101PM EVOLVESRGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- CN eee meet | CO101PM 7 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- Leczencs | vovenarmsnovecrarameuceoTamomesaemetaTames CO101PM EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPRKQREFVAGISTA- Lemon | mae venmSRoMeGTOnameLeEomoWssassmatemimas CO101PM DVOLVESGGGLVQOPGGSLRLSCVASGSIFSINAMGWYRQAPGKORELVAAIS- [esmcra | | scesmrvmosvRmsToNS amas RPeT YommaASReLereimisasTmves 529C12 109 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQORELVAAIS- [E Tr Errar | CO101PM 10 DVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQOAPGKERE- [esmo | "| vavsnecesTrvanSveGRETSToNSNTV VLW RPEOTAVOTAMLAvGPNVRGPVGENAMINGASTTVSS

517A01 110 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERE- PT EEE aeee — CO101PM EE) EVOLVESGGALVRPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGRGLEWVSSISDD- SSIS Ss rotndacaa astros a 62C02 SO 111 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDD- RS fr Esses me mena | CO101PM 12 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFRQAPGKEREGVSCISSGID- EE] Eae meme | 80A01 SO 112 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFRQAPGKEREGVSCISSGID- AS Tr sean teem | CO101PM 13 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGSIFRINVMAWYRQAPGKQRELVAAITSGG- = o feat | CO101PM 14 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRINAMGWYRQAPGKQRELVAAIISGG- Z EE seara ae O] CO101PM 15 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRYVMGWFRQAPGKERE- SS IES aaa: A CO101PM 16 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGLTFSSYAMGWFRQAPGKERE- a] Raia aeee emerene CO101PM 17 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGPTFSDYAMGWFRQAPGKERE- FE] Err rea arac ada remeecemaenêêeAA CO101PM 18 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWGGGSTYYS- mo] eee | CO101PM 19 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYS- So ame | CO101PM 20 DVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGSIFSGNAMGWYRQAPGKQREL- Eq Arre eaamanmnnn |

CO101PM 21 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASTGIFRINTMGWHRQOAPGKQRDLVATFTSDDNT-

[sro enosanmervemvrameurem vu mmanosteronmaatames CO101PM 22 EVOLVESEGGTVEPGESLRLACAAPGPGIRTNFMAWYRQAPEKEREMVASISRD-

[msi | | esnvesraenssVrsmmiaINSLaVEnTarrrovana apena mas Co101002 | 194 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDD- 80 GSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGOQG- (62C028SO- TLVTVSSAAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH FLAGHIis) Co101001 195 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFRQAPGKEREGVSCISSGID- 01 80A01- GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNNLKPEDTGVYYCAADPSHYYSEYDCGYYG- = FLAGHIis MDYWGKGTLVTVSSGAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH S Co101000 | 196 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERE- br 80 FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPN- n 517A01- RYRYGPVGEYNYWGQGTLVTVSSGGGESCEGESCEGESCEGESCCEGSCGEGSCGGGGSEVAL- 40E09- VESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- FLAGHIis NYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLQOGYWGLGTLVTVSSGAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH Co101001 197 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAIS- 7O SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAVDASRGL- 529C12SO0 PYELYYYWGQGTLVTVSSAAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH -FLAGHIis

Tabela A-2: Sequências para CDRs e estruturas, acrescidas das combinações preferidas conforme fornecido na fórmula |, a saber FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (os seguintes termos: “ID” refere-se à SEQ ID NO dada; a primeira coluna refere-se à ID da totalidade ISVD) Pa o em ee e e be mo - ICDR1 ICDR2 CDR3 IFR4 rução 1 40E09 7 EVOLVESGGGSVOAGGS- 23 GSTFSRYSMNBBO WYR- B7 GISVGRITN B8 YAVSVRGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, LRLSCAAS QAPGKQRE- TGYLQMNSLKPEDTAVYYCNA|

FVA 40E08 68 KVOLVESGGGSVOAGGS- 24 GSTFSRRSMNIBBO WYR- B8 GISTGRITN B9 YAVSVKGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, TETE mm EEE EE FVA & B 42A04 69 EVOLVESGRGSVOAGGS- 24 GSTFSRRSMNIBBO WYR- B8 GISTGRITN B9 YAVSVKGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, = TETE [TES ee

FVA 4 40B05 |O EVOLVESGGGSVOTGGS- 24 GSTFSRRSMNIBBO WYR- B8 GISTGRITN B9 YAVSVKGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, LRLSCAAS QAPGKQRE- TGYLQMNSLKPEDTAVYYCNA|

FVA Bb 42D12 71 EVOLVESEGGSVOAGGSL- 23 GSTFSRYSMN BO —WYR- B7 GISVGRITN B8 YAVSVRGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, RLSCAAS QAPGKQRE- TGYLQMNSLKPEDTAVYYCNA|

FVA 6 42A03 2 EVOLVESRGGSVOAGGS- 23 GSTFSRYSMNBO WYR- B7 GISVGRITN B9 YAVSVKGRFTISRDNAEG- 2 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, LRLSCAAS QAPGKQRE- TGYLQMNSLKPEDTAVYYCNA|

FVA 7 24A08 |7 EVOLVESGGGSVOAGGS- P3 GSTFSRYSMNIBO WYR- B7 GISVGRITN Bo YAVSVKGRFTISRDNAEGTG- 52 GGLQOGY [100 WGLGTOVTVSS, LRLSCAAS QAPGKQRE- FLOMNGLKPEDTAVYYCNA

FVA

B 40D01 67 —EVOLVESGGGSVOAGGS- P3 GSTFSRYSMNIB1 WYRQA- B9 GISTARITH B9 YAVSVKGRFTISRDNAEG- 3 GGLOGS /101 WGLGTLVTVSS [IE perene TIE | E mam E eso ren P 529C12 73 DVOLVESGGGLVOPGGS- P5 GSIFSINAMG 82 WYR- MO AISSGGSTY BP1 YADSVKGRFTIS- 4 AVDAS- —j102 WGOQOGTLVTVSS; LRLSCVAS QAPGKQREL- RDNSKNTVYLQMNSLR- RGL-

VA PEDTAVYYCNA PYELYYY 109 529C12 76 EVOLVESGGGLVOPGGSL- 25 GSIFSINAMG B2 WYR- MO AISSGGSTY BP1 YADSVKGRFTIS- 4 AVDAS- —j102 WGOQOGTLVTVSS; so RLSCAAS QAPGKQREL- RDNSKNTVYLQMNSLR- RGL-

VA PEDTAVYYCNA PYELYYY NO 517A01 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- P6 GRTFSSYAMGIB3 WFROAPGKE-W141 AISWSGGSTYO2 YADSVKGRFTIS- 5 ALAVYG- 1102 WGOQOGTLVTVSS; LRLSCAAS REFVA RDNSKNTVYLQMNSLR- PNRYRYG a

PEDTAVYYCTA PVGEYNY E 110 517A01 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- P6 GRTFSSYAMG 83 WFROAPGKE-W141 AISWSGGSTYO2 YADSVKGRFTIS- nos ALAVYG- 1102 WGOQOGTLVTVSS; = so LRLSCAAS REFVA RDNSKNTVYLQMNSLR- PSRYRYG NA

PEDTAVYYCTA PVGEYQY 1 62C02 |75 EVOLVESGGALVRPGGSL- P7 GFAFSAAYMS B4 WVR- 12 SISDDGSKTYP3 YADSVKGRFTISRD- 6 GYGATT- [103 WGOGT- RLSCAAS QAPGRGLEWNV| NAKNTVYLQMNNLKPDDTA- TRPGRY QVTVSS Ss VYYCNT 111 62C02 76 EVOLVESGGGLVOPGGSL- 27 GFAFSAAYMS 108 WVR- 12 SISDDGSKTY/113 YADSVKGRFTIS- 6 GYGATT- [102 WGOQOGTLVTVSS; so RLSCAAS QAPGKGLEWNV| RDNSKNTVYLQMNSLR- TRPGRY Ss PEDTAVYYCNT 12 80A01 76 EVOLVESGGGLVOPGGSL- P8 GFTLAYYSIG B5 WFROAPGKE-4143 CISSGID- p4 — YADSVKGRFTISRD- 7 DPSHYY- [104 WGKGTLVTVSS RLSCAAS REGVS GSTY NAKNTMYLQMNNLK- SEY- PEDTGVYYCAA DCGYYG-

MDY 112 80A01 76 EVOLVESGGGLVOPGGSL- P8 GFTLAYYSIG B5 WFROAPGKE-4143 CISSGID- 114 YADSVKGRFTIS- no7 DPSHYY- [102 WGOQOGTLVTVSS; so RLSCAAS REGVS GSTY RDNSKNTLYLQMNSLR- SEY- PEDTAVYYCAA ECGYYG-

MDY

13 516G08 7 DVOLVESGGGLVOPGGS- 29 GSIFRINVNMA B2 WYR- M4 AITSGGTTN B5 YADSVKGRFTIS- E) DIGWPY- [102 WGOGTLVTVSS) LRLSCAGS QAPGKQREL- RDNSKNTVYLQMNSLR- VLDYDF

VA PEDTAVYYCYA 14 529G11 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- BO GSIFRINAMG B2 WYR- M5 AISGGTTY B5 YADSVKGRFTIS- 8 DIGWPY- [102 WGOGTLVTVSS) LRLSCAAS QAPGKQREL- RDNSKNTVYLQMNSLR- VLDYDF

VA PEDTAVYYCYA 513CO4 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- B1 GRTFSRYVMGI8B3 WFROQAPGKE-/6 AINWSSGSTYB6 YADSVKGRFTIS- 9 DRRVYYD [102 WGOGTLVTVSS) LRLSCAAS REFVA RDNSKNTVYLQMNSLR- TYPNL-

PEDTAVYYCAA RGYDY 16 521F02 73 DVOLVESGGGLVOPGGS- B2 GLTFSSYAMG 3 WFROQAPGKE-/7 AISWSGGRT 92 YADSVKGRFTIS- 6o ARG- 102 WGOGTLVTVSS) LRLSCVAS REFVA Y RDNSKNTVYLQMNSLR- PGSVG-

PEDTAVYYCTA PSEEYNY 17 519E04 73 DVOLVESGGGLVOPGGS- B3 GPTFSDYAMG B3 WFROQAPGKE-/1 AISWSGGSTY92 YADSVKGRFTIS- 61 AR- 102 WGOGTLVTVSS) LRLSCVAS REFVA RDNSKNTVYLQMNSLR- GGGYRAS R PEDTAVYYCTA GGPL- [Sa SEYNY &K 18 520B06 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- 26 GRTFSSYAMG 83 WFROQAPGKE-/8 AISWGGGST 97 YSDSVKGRFTIS- 62 AL- 102 WGOGTLVTVSS) Cn LRLSCAAS REFVA Y RDNSKNTVYLQMNSLR- GSTGSGS PEDTAVYYCTA TPV-

PEYRY 19 520CO4 74 DVOLVESGGGLVOPGGS- 26 GRTFSSYAMG B3 WFROQAPGKE-/1 AISWSGGSTYS7 YSDSVKGRFTIS- 63 AR- 102 WGOGTLVTVSS) LRLSCAAS REFVA RDNSKNTVYLQMNSLR- GGVAG- PEDTAVYYCTA TDGPL-

GDYNY o 525CO4 77 DVOLVESGGGLVOPGGS- B4 GSIFSGNAMG B2 WYR- M9 AITSGGVTN B6 YADSVKGRFTIS- 64 DIRYPTGL 102 WGOGTLVTVSS) LRLSCAGS QAPGKQREL- RDNSKNTVYLQMNSLR- VGDY

VA PEDTAVYYCAA 1 63F01 8 EVOLVESGGGLVOPGGSL-B5 TGIFRINIMG B6 WHR- O TFTSDDNTK p8 YADSVKGRFTISRDNA- 65 TTVMYDS [103 WGOGT- RLSCSAS QAPGKQRDLV ENTVYLQMNDLKPEDTA- NSPDY QVTVSS

A VYYCHA 2 59F06 |/9 EVOLVESEGGTVEPGESL- B6 GPGIRTNFMA 7 WYRQAPEKE- 51 SISRDGSTH B9 YADSVKGRFTISSDNATST- 666 DPHILHN- [103 WGOGT- RLACAAP REMVA FYLQMNSLQVEDTAVYYCAT DRAGA- QVTVSS FLVE-

DYDH

Tabela A-3: Sequências de aminoácido de construções anti-MMP13 (“ID” refere-se à SEQ ID NO conforme aqui utilizado) 517A01-40E09 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERE- clone 80 FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPN- RYRYGPVGEYNYWGQGTLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESGEGGESEVAL-

VESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRITNYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLGTLVTVSS 516G08-40E09 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAGSGSIFRINVMAWYRQAPGKQRELVAAITSGG- clone 76 TTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYADIGWPYVLDYDFWGQG- TLVTVSSGGGGSCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGSVOQAGGSLRLS-

CAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRITNYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLGTLVTVSS 62C02-40E09 162 EVOLVESGGALVRPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGRGLEWVSSISDD- clone 72 GSKTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPDDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGQG- TLVTVSSGGGGSCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGSVOQAGGSLRLS- = CAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRITNYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLGTLVTVSS s 40E09-517A01 163 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- = clone 71 NYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLQOGYWGLG- & TLVTVSSGGGGSCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS-

CAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPNRYRYGPVGEYNYWGQGTLVTVSS 40E09-516G08 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- clone 70 NYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLQOGYWGLG- TLVTVSSGGGGSCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS-

CAGSGSIFRINVMAWYRQAPGKQRELVAAITSGGTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCYADIGWPYVLDYDFWGQGTLVTVSS 40E09-62C02 165 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- clone 69 NYAVSVRGRFTISRDNAEGTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGLQOGYWGLG- TLVTVSSGGGGSCEGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGALVRPGGSLRLS-

CAASGFAFSAAYMSWVRQAPGRGLEWVSSISDDGSKTY YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPDDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGQGTLVTVSS a Aggrecan Humano 105 — | MTTLLWVFVTLRVITAAVTVETSDHDNSLSVSIPQPSPLRVLLGTSLTIPCYFIDPMHPVT- TAPSTAPLAPRIKWSRVSKEKEVVLLVATEGRVRVNSAYQDKVSLPNYPAIPSDATLEVOSL- RSNDSGVYRCEVMHGIEDSEATLEVVVKGIVFHYRAISTRYTLDFDRAQRACLON- SAIIATPEQLOAAYEDGFHQCDAGWLADOTVRYPIHTPREGCYGDKDE- FPGVRTYGIRDTNETYDVYCFAEEMEGEVFYATSPEKFTFQEAANECRRLGARLA- TTGHVYLAWQAGMDMCSAGWLADRSVRYPISKARPNCGGNLLGVRTVYVHANQTGYPDPSS- RYDAICYTGEDFVDIPENFFGVGGEEDITVATVTWPDMELPLPRNITEGEARGSVILTVKPI- FEVSPSPLEPEEPFTFAPEIGATAFAEVENETGEATRPWGFPTPGLGPATAFTSE- DLVVOVTAVPGQPHLPGGVVFHYRPGPTRYSLTFEEAQQACPGTGAVIASPEQLOAAYEA- GYEQCDAGWLRDOTVRYPIVSPRTPCVGDKDSSPGVRTYGVRPSTETYDVYCFVDRLEGEVF- FATRLEQFTFQEALEFCESHNATATTGQLYAAWSRGLDKCYAGWLADGSLRYPIVTPR- PACGGDKPGVRTVYLYPNQTGLPDPLSRHHAFCFRGISAVPSPGEEEGGTPTSPSGVEE- WIVTQVVPGVAAVPVEEETTAVPSGETTAILEFTTEPENQTEWEPAYTPVGTSPLPGILPTW- PPTGAETEESTEGPSATEVPSASEEPSPSEVPFPSEEPSPSEEPFPSVRPFPSVEL- FPSEEPFPSKEPSPSEEPSASEEPYTPSPPEPSWTELPSSGEESGAP- DVSGDFTGSGDVSGHLDFSGQLSGDRASGLPSGDLDSSGLTSTVGSGLTVESGLPSGDEER!- EWPSTPTVGELPSGAEILEGSASGVGDLSGLPSGEVLETSASGVGDLSGLPSGEVLETTA- PGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVE- = DISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGL- PD PSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGL- N PSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGL- = PSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGL- o PSGEVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETTAPGVDEISGLPSGEVLETTAPGVEEISGL- o PSGEVLETSTSAVGDLSGLPSGGEVLEISVSGVEDISGLPSGEVVETSASGIEDVSEL- PSGEGLETSASGVEDLSRLPSGEEVLEISASGFGDLSGVPSGGEGLETSASEVGTDLSGLPS- GREGLETSASGAEDLSGLPSGKEDLVGSASGDLDLGKLPSGTLGSGOAPETSGLPSG- FSGEYSGVDLGSGPPSGLPDFSGLPSGFPTVSLVDSTLVEVVTASTASELEGRGTIGISGA- GEISGLPSSELDISGRASGLPSGTELSGOASGSPDVSGEIPGLFGVSGQOPSGFP- DTSGETSGVTELSGLSSGQPGVSGEASGVLYGTSQPFGITDLSGETSGVPDLSGQPSGLPGFS- GATSGVPDLVSGTTSGSGESSGITFVDTSLVEVAPTTFKEEEGLGSVELSGLPSGE- ADLSGKSGMVDVSGQFSGTVDSSGFTSQTPEFSGLPSGIAEVSGESSRAEIGSSLPS- GAYYGSGTPSSFPTVSLVDRTLVESVTQAPTAQEAGEGPSGILELSGAHSGAPDMSGEHSG- FLDLSGLOSGLIEPSGEPPGTPYFSGDFASTTNVSGESSVAMGTSGEASGL- PEVTLITSEFVEGVTEPTISQELGARPPVTHTPOLFESSGKVSTAGDISGATPVL- PGSGVEVSSVPESSSETSAYPEAGFGASAAPEASREDSGSPDLSETTSAFHEANLERSSGL- GVSGSTLTFQEGEASAAPEVSGESTTTSDVGTEAPGLPSATPTASGDRTEISGDLSGHTSOQL- GVVISTSIPESEWTOQTORPAETHLEIESSSLLYSGEETHTVETATSPTDASIPASPEWKRE- SESTAAAPARSCAEEPCGAGTCKETEGHVICLCPPGYTGEHCNID- QEVCEEGWNKYQGHCYRHFPDRETWVDAERRCREQOSHLSSIVTPEEQEFVNNNAQDYQW!- GLNDRTIEGDFRWSDGHPMQFENWRPNQPDNFFAAGEDCVVMIWHEKGEWNDVPCNYHL-

PFTCKKGTVACGEPPVVEHARTFGOQKKDRYEINSLVRYQCTEGFVQRHMPTIRCAPSGHWEEPRITCTDATTYKRRLOKRSSRHPRRSRPSTAH

MMP13 humana 115 — T MHPGVLAAFLFLSWTHCRALPLPSGGDEDDLSEEDLQFAERYLRSYYHPTNLAGILKENAAS- NP 0024181 SMTERLREMQSFFGLEVTGKLDDNTLDVMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKMNLTYRI- VNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTRLHDGIADIMISFGIKEHGDFYPFDGPSGL- LAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPNPKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMI- FKDRFFWRLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIFRGRKFWALNGYDILE-

GYPKKISELGLPKEVKKISAAVHFEDTGKTLLFSGNQVWRYDDTNHIMDKDYPRLIEEDFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPANSILWC MMP13 P.trogiodytes | 116 | MHPGVLAAFLFLSWAHCRALPLPSGGDEDDLSEEDLQFAERYLRSYYHPTNLAGILKENAAS- SMTERLREMQSFFGLEVTGKLDDNTLDVMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKMNLTYRI- VNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTRLHDGIADIMISFGIKEHGDFYPFDGPSGL- LAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPNPKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMI- R FKDRFFWRLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIFRGRKFWALNGYDILE- oo GYPKKISELGLPKEVKKISATVHFEDTGKTLLFSGNQVWRYDDTNHIMDKDYPRLIEEEFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPANSILWC br MMP13 M.mulatta 117 | MHPGVLAAFLFLSWTHCRALPLPSGGDEDDLSEEDLOFAERYLRSYYYPTNLAGILKENAAS- o SMTDRLREMOSFFGLEVTGKLDDNTLDVMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKMNLTYRI- VNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTRLHDGIADIMISFGTKEHGDFYPFDGPSGL- LAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPNPKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMI- FKDRFFWRLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIFRGRKFWALNGYDILE-

GYPKKISELGFPKEVKKISAAVHFEDTGKTLLFSGNQVWRYDDTNHIMDKDYPRLIEEDFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPANSILWC MMP13 C-lupus 118 — | MSHHCRSIKVKVLVWERQOAPGTTTKMLPGILAAFLCLSWTQCWSLPLPSDGDDDL- SEEDFQLAERYLKSYYYPLNPAGILKKSAAGSVADRLREMOSFFGLEVTGKLDDNTLDIMKK- PRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKTNLTYRIVNYTPDLTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTR- LHDGTADIMISFGTKEHGDFYPFDGPSGLLAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYN- LFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALMFPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPN- PRHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETMIFKDRFFWRLHPQQVDAELFLTKSFWPELPNRIDAA- YEHPSRDLIFIFRGRKYWALNGYDILEGYPOKISELGFPKEVKKISAA-

VHFEDTGKTLFFSGNQVWSYDDTNQIMDKDYPRLIEEDFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYNIWSKRIVRVMPANSLLWC

MMP13 B.taurus 119 MHPRVLAGFLFFSWTACWSLPLPSDGDSEDLSEEDFQFAESYLKSYYYPQNPAGILKKTAASS- VIDRLREMOSFFGLEVTGRLDDNTLDIMKKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSKMNLTYRI- VNYTPDLTHSEVEKAFRKAFKVWSDVTPLNFTRIHNGTADIMISFGTKEHGDFYPFDGPSGL- LAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPYSKHPKTPDKCDPSLSLDAITSLRGETLI- FKDRFFWRLHPQQVEAELFLTKSFGPELPNRIDAAYEHPSHDLIFIFRGRKFWALSGYDILE-

DYPKKISELGFPKHVKKISAALHFEDSGKTLFFSENQVWSYDDTNHVMDKDYPRLIEEVFPGIGDKVDAVYQKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMTTNSLLWC MMP13 M.musculus 120 MHSAILATFFLLSWTPCWSLPLPYGDDDDDDLSEEDLVFAEHYLKSYYHPATLAGILK- KSTVTSTVDRLREMOSFFGLEVTGKLDDPTLDIMRKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSOQTN- LTYRIVNYTPDMSHSEVEKAFRKAFKVWSDVTPLNFTRIYDGTADIMISFGTKEHGDFYPFD- GPSGLLAHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFIVAAHELGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIQFLYGPGDEDPNPKHPKTPEKCDPALSLDAITSLRGETMI- FKDRFFWRLHPQQVEAELFLTKSFWPELPNHVDAAYEHPSRDLMFIFRGRKFWALNGYDILE- GYPRKISDLGFPKEVKRLSAAVHFENTGKTLFFSENHVWSYDDVNQTMDKDYPRLIEEEFPGIGNKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPTNSILWC —- MMP13 R.norvegicus 121 MHSAILATFFLLSWTHCWSLPLPYGDDDDDDLSEEDLEFAEHYLKSYYHPVTLAGILK- & KSTVTSTVDRLREMOSFFGLDVTGKLDDPTLDIMRKPRCGVPDVGEYNVFPRTLKWSOQTN- = LTYRIVNYTPDISHSEVEKAFRKAFKVWSDVTPLNFTRIHDGTADIMISFGTKEHGDFYPFD- NA GPSGLLAHAFPPGPNLGGDAHFDDDETWTSSSKGYNLFIVAAHELGHSLGLDHSKDPGALM- FPIYTYTGKSHFMLPDDDVQGIOSLYGPGDEDPNPKHPKTPEKCDPALSLDAITSLRGETMI- FKDRFFWRLHPQQVEPELFLTKSFWPELPNHVDAAYEHPSRDLMFIFRGRKFWALNGYDIME-

GYPRKISDLGFPKEVKRLSAAVHFEDTGKTLFFSGNHVWSYDDANQTMDKDYPRLIEEEFPGIGDKVDAVYEKNGYIYFFNGPIQFEYSIWSNRIVRVMPTNSLLWC MMP13 G.gallus 122 MOQPRLSAVFFFLLGLSFCLTVPIPLDDSHEFTEEDLRFAERYLRTHYDLRPNPTGIMKKSANT- MASKLREMQAFFGLEVTGKLDEETYELMQKPRCGVPDVGEYNFFPRKLKWSNTN- LTYRIMSYTSDLRRAEVERAFKRAFKVWSDVTPLNFTRIRSGTADIMISFGTKEHGDFYPFD- GPSGLLAHAFPPGPDYGGDAHFDDDETWSDDSRGYNLFLVAAHEFGHSLGLEHSRDPGALM- FPIYTYTGKSGFVLPDDDVQGIQELYGAGDRDPNPKHPKTPEKCAADLSIDAITKLR- GEMLVFKDRFFWRLHPQMVEAELVLIKSFWPELPNKIDAAYENPIKDLVFMFKGKKVWAMNGY-

DIVEGFPKKIYEMGFPKEMKRIDAVVHIDDTGKTLFFTGNKYWSYDEETEVMDTGYPKFIEDEFAGIGDRVDAVYHRNGYLYFFNGPLOFEYSIWSKRIVRILHTNSLFWC

Tabela C: Várias sequências de ligador (“ID” refere-se à SEQ ID NO conforme aqui utilizado eme O o [SegRERdEaRRR Região de dobradiça| 140 EPKTPKPQPAAA forae sperm Dobradiça G3 141 ELKTPL-

GDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCD

TPPPCPRCP Tabela D: Sequências de ISVD de ligação a albumina do soro (“ID” refere-se à SEQ ID NO conforme aqui utilizado), incluindo as se- quências da CDR Fer O ea Fo ar Alb8 142 EVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- Cn O | guvesnoereoumnaImGLTEoTAmmonosRDaamAmSs

DTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQOGTLVTVSS Alb129 144 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS-

AE AR ÇA

DTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb135 193 EVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- | | ervesmamteoumTtamsLTEoTAmencsanSsdoTmas |

DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVTVSS DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOGTLVKVSSA DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQOGTLVTVSS

Alb82-A 149 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- [PT EEE, | AIlb82-AA 150 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- e | | erovosroNTSOUTUTaINS TED onecseRsamimast | AIlb82-AAA 151 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- [E [EEE Eça raca | Alb82-G 152 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- se IS | grovosnammeouTInans ITED onecsarsamimss Alb82-GG 153 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- [5 E [EEE ça AacSe | Alb82-GGG 154 EVOLVESGGGVVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- o | | ervestawTeouTtansEraomOnonecseRsaemimascos| Alb92 155 EVOLVESGGGVVOPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGS- [orowosaRSToNSOmILANSUTEDTA VonGesiSRESGaTA mas Alb223 156 EVOLVESGGGVVOPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGS- a ETSSTORTSTONSOmoLaImNSLIEDTA Ne nosrSsdoTimvasA Tabela E: Sequência de ISVD de ligação a Aggrecan (“ID” refere- se à SEQ ID NO conforme aqui utilizado), incluindo as sequências da CDR sequences [Nome e Sequência de amino deito 00269 114F08SO EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGG- NANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYG-

PYWGQOGTLVTVSS 00745 114FO08PEA 167 EVOLVESGGGVVOQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGG- NANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYG- orar ago SETE 00747 604FO02PEA EVOLVESGGGVVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKERE- FVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAYRRR-

RASSNRGLWDYWGQGTLVTVSSA [STR TR ERR O DOI XX

Tabela F: Construções multivalentes (“ID” refere-se à SEQ ID NO conforme aqui utilizado), incluindo as se- quências da CDR FR O OO gggge dai — CEE» Co10100689 62C028SO-114F08SO 176 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDD- GSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGQG- TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSSGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS Co10100683 62C028SO-114F08SO-114F08SO 1177 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDD- GSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGQG- TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSSGNANYVDSVRGRFTIS- RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG- br TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS- Mm CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSSGNANYVDSVRGRFTIS- a RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS o Co10100692 62C028SO0-604F02SO 178 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVRQAPGKGLEWVSSISDD- GSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNTGYGATTTRPGRYWGQG- TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESCEGESEVALVESGGGLVQPGGSLRLS- CAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGQGTLVTVSS Co10100687 80A01-114F08SO 179 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFRQAPGKEREGVSCISSGID- GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNNLKPEDTGVYYCAADPSHYYSEYDCGYYG- MDYWGKGTLVTVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESGGGGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYV-

DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS

Co10100681 B0AO1-114FOSSO-114FOSSO 180 EVOLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFROAPGKEREGVSCISSGID- GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNNLKPEDTGVYYCAADPSHYYSEYDCGYYG- MDYWGKGTLVTVSSGGEGSCEGESCCEGSCEGESCECEESCEGESGEGGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYV- DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG- TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS Co10100690 B0AO1-604FO2SO 181 EVOLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTLAYYSIGWFROAPGKEREGVSCISSGID- GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNNLKPEDTGVYYCAADPSHYYSEYDCGYYG- MDYWGKGTLVTVSSGGEGSCEGESCCEGSCEGESCECEESCEGESGEGGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKERE-

FVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGOGTLVTVSS Co10100729 517A01SO-40E09SO-604F02SO- | 182 DVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERE- A FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- a RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- o VESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKOREFVAGISVGRIT- Ss NYAVSVKGRFTISRDNSKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGQG- o TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- n CAASGRTFSSYTMGWFROAPGKEREFVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGOQGTLVTVSSA Co1o100700 517A01SO-40E09SOvar- 183 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFROAPGKERE- 114F08SO FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- VESGGGSVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- NYAVSVRGRFTISRDNSEGTGYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLG- TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS

Co10100702 517A01SO-40E09SOvar- 184 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFROAPGKERE- 114F08SO-114F08SO FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- VESGGGSVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- NYAVSVRGRFTISRDNSEGTGYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLG- TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS- RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGAQG- TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS Co10100696 517A01SO-40E09SOvar- 185 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFROAPGKERE- 604F02SO FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- VESGGGSVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKQREFVAGISVGRIT- a NYAVSVRGRFTISRDNSEGTGYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGLG- a TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- E CAASGRTFSSYTMGWFROAPGKEREFVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTIS- o RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGOQGTLVTVSS mn Co10100726 517A01SO-40E09SOvar 186 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFROAPGKERE- FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- VESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKOREFVAGISVGRIT-

NYAVSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGAQGTLVTVSS Co1o100727 517A01SO-40E09SO 187 EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFROAPGKERE- FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTAALAVYGPS- RYRYGPVGEYQYWGQOGTLVTVSSGGGESCEEGSCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVAL- VESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSTFSRYSMNWYRQAPGKOREFVAGISVGRIT-

NYAVSVKGRFTISRDNSKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCNAGGLOGYWGOGTLVTVSS

Co10100724 529C1280-604FO2SO-A 188 DVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAIS- SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAVDASRGL- PYELYYYWGAQGTLVTVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCGEGESCEGEGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKERE-

FVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGOGTLVTVSSA Co10100688 529C1280-114FOSSO 189 EVOLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKORELVAAIS- SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAVDASRGL- PYELYYYWGAQGTLVTVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCGEGESCEGEGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYV-

DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGOGTLVTVSS Co10100682 529C128O-114FOSSO-114FOSSO | 190 EVOLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKORELVAAIS- SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAVDASRGL- = PYELYYYWGAQGTLVTVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCGEGESCEGEGSEVALVES- NS GGGLVAPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKORELVATISSGGNANYV- = DSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG- NA TLVTVSSGGGESCGEGSCEGESCCEGSCEGESCEEGSCEGESEVALVESGGGLVAQPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSS Co10100691 529C1280-604F02SO 191 EVOLVESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKORELVAAIS- SGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAAVDASRGL- PYELYYYWGAQGTLVTVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESCEGESCGEGESCEGEGSEVALVES- GGGLVAPGGSLRLSCAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKERE-

FVAAISWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYRRRRASSNRGLWDYWGOGTLVTVSS 00754 MMP13-CAP 192 EVOLVESGGGVVAPGGSLRLSCAASGFAFSAAYMSWVROAPGKGLEWVSSISDD- GSKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNTGYGATTTRPGRYWGQG- TLVTVSSGGGESCGGEGSCEGESCCEGSCEGESCEGESCEGESEVALVESGEGVVAPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS- RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQG- TLVTVSSGGGESCGGEGSCEGESCCEGSCEGESCEGESCEGESEVALVESGEGVVAPGGSLRLS- CAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATISSGGNANYVDSVRGRFTIS-

RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHYGGVYYGPYWGQGTLVTVSSA

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 1 domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) que se liga a uma metaloproteinase da matriz (MMP).

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que dita MMP é selecionada do grupo que consiste em MMP13 (colagenase), MMP8 (colagenase), MMP1 (colagenase), MMP19 e MMP20 (enamelisina), preferivelmente dita MMP é MMP13.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zado pelo fato de que dito ISVD que se liga à MMP13 não se liga à MMP1 ou MMP 14 (tipo de membrana).

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zado pelo fato de que dito ISVD que se liga à MMP13 compreende 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respec- tivamente), em que (i) a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e€ 24; e sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 diferenças de ami- noácido com as SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 24; (ii) a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 38 € 39; e sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 diferenças de ami- noácidos com as SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 38 e 39; e (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 e 53; e sequências de aminoácido que possuem 1, 2, 3 ou 4 diferenças de aminoácido com as SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 e 53.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que (i) a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em (a) SEQIDNO0:23;e (b) sequência de aminoácido que possui 1 diferença de aminoácido com a SEQ ID NO: 23, em que - na posição 7 o Y foi alterado em R; (ii) a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em (c) SEQ ID NO: 37; e (d) sequências de aminoácido que possuem 1, 2 ou 3 dife- renças de aminoácido com a SEQ ID NO: 37, em que as diferenças de aminoácido são definidas como se segue: - na posição 4 o V foi alterado em T; e/ou - na posição 5 o G foi alterado em A; e/ou - na posição 9 o N foi alterado em H; e (iii) a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQIDNO:52;e (f) sequência de aminoácido que possui 1 diferença de aminoácido com a SEQ ID NO: 52, em que na posição 6, o Y foi alte- rado em S.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que (i) CDR1 é a SEQ ID NO: 26; (li) COR2 é a SEQ ID NO: 41; e (iii) CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQID NO: 55; e (f) sequência de aminoácido que possui 1 ou 2 diferenças de aminoácido com a SEQ ID NO: 55, em que as diferenças de aminoácido são definidas como se segue: - na posição 8 o N foi alterado em Q ou S; e/ou - na posição 19 o N foi alterado em V ou Q.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que (i) CDR1 é a SEQ ID NO: 28; (li) CDOR2 é a SEQ ID NO: 43; e (iii) CDR3 é selecionada do grupo que consiste em (e) SEQIDNO:57;e (f) sequência de aminoácido que possui 1, 2, 3 ou 4 dife- renças de aminoácido com a SEQ ID NO: 57, em que as diferenças de aminoácido são definidas como segue: - na posição 10 o D foi alterado em E, G, A, P, TR, M, W ou Y; e/ou - na posição 16 o M foi alterado em A, R, N, D,/ E, Q,Z, G, |, L,K,F,P,S,W,Y ou V; e/ou - na posição 17 o D foi alterado em A, R, N, C, E, Q, Z, G, H, 1, L,K,M,S,T,W,Y ou V; e/ou - na posição 18 o Y foi alterado em A, R, N, D, C, E, Q, Z, G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W ouvV.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que: - a CDR1 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 27, 28, 25, 26, 23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 24; - a CDR2 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42, 43, 40, 41, 37, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 38 € 39; e

- a CDR3 é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56, 107, 57, 54, 106, 55, 52, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 e

53.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 17, caracterizado pelo fato de que dito ISVD compreende uma combinação de CDR1, CDR2 e CDR3 que é selecionada do grupo que consiste em: - CDR1 é a SEQ ID NO: 27, CDR2 é a SEQ ID NO: 42, e CDR3 é a SEQ ID NO: 56; - CDR1 é a SEQ ID NO: 28, CDR2 é a SEQ ID NO: 43, e CDR3 é a SEQ ID NO: 107; - CDR1 é a SEQ ID NO: 28, CDR2 é a SEQ ID NO: 43, e CDR3 é a SEQ ID NO: 57; - CDR1 é a SEQ ID NO: 25, CDR2 é a SEQ ID NO: 40, e CDR3 é a SEQ ID NO: 54; - CDR1 é a SEQ ID NO: 26, CDR2 é a SEQ ID NO: 41, e CDR3 é a SEQ ID NO: 106; - CDR1 é a SEQ ID NO: 26, CDR2 é a SEQ ID NO: 41, e CDR3 é a SEQ ID NO: 55; - CDR1 é a SEQ ID NO: 23, CDR2 é a SEQ ID NO: 37, e CDR3 é a SEQ ID NO: 52; - CDR1 é a SEQ ID NO: 26, CDR2 é a SEQ ID NO: 48, e CDR3 é a SEQ ID NO: 62; - CDR1 é a SEQ ID NO: 26, CDR2 é a SEQ ID NO: 41, e CDR3 é a SEQ ID NO: 63; - CDR1 é a SEQ ID NO: 29, CDR2 é a SEQ ID NO: 44, e CDR3 é a SEQ ID NO: 58; - CDR1 é a SEQ ID NO: 30, CDR2 é a SEQ ID NO: 45, e CDR3 é a SEQ ID NO: 58; - CDR1 é a SEQ ID NO: 31, CDR2 é a SEQ ID NO: 46, e

CDR3 é a SEQ ID NO: 59; - CDR1 é a SEQ ID NO: 32, CDR2 é a SEQ ID NO: 47, e CDR3 é a SEQ ID NO: 60; - CDR1 é a SEQ ID NO: 33, CDR2 é a SEQ ID NO: 41, e CDR3 é a SEQ ID NO: 61; - CDR1 é a SEQ ID NO: 34, CDR2 é a SEQ ID NO: 49, e CDR3 é a SEQ ID NO: 64; - CDR1 é a SEQ ID NO: 35, CDR2 é a SEQ ID NO: 50, e CDR3 é a SEQ ID NO: 65; - CDR1 é a SEQ ID NO: 36, CDR2 é a SEQ ID NO: 51, e CDR3 é a SEQ ID NO: 66; - CDR1 é a SEQ ID NO: 23, CDR2 é a SEQ ID NO: 39, e CDR3éaSEQIDNO:53;e - CDR1 é a SEQ ID NO: 24, CDR2 é a SEQ ID NO: 38, e CDR3 é a SEQ ID NO: 52.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito ISVD consiste ou consiste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, res- pectivamente) e ditas 3 regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3.

11. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo é a SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

12. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4, 8,9 e 10, caracterizado pelo fato de que a CDR1 é SEQ ID NO: 27, a CDR2 é SEQ ID NO: 42 e a CDR3 é SEQ ID NO: 56.

13. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 a 10 e 12, caracterizado pelo fato de que dito ISVD é seleci- onado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109,

9,110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,2,3,4,5,6,7e8.

14. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo se liga à MMP13 com uma Kp entre 1E- M e 1E3 M, tal como entre 1Eº* M e 1E*” M, preferivelmente no máximo 1E” M, de preferência mais baixa do que 1E-º8 M ou 1E-º M, ou ainda mais baixa do que 1E*ºº M, tal como 5E*! M, 4Eº M, 3EV! M, 2E7 M, 1,7E7 M, 1E7 M, ou mesmo 5E!? M, 416? M, 3E2 M, 1EP M, por exemplo, como determi- nado por um KinExA.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo inibe uma atividade de MMP13 com uma IC5o entre 1E” M e 1E”º M, tal como entre 1E-º M e 1E*! M, por exemplo, como determinado por ELISA de competição, ELISA de competição TIMP-2, ensaio de peptí- deo fluorogênico, ensaio de colágeno fluorogênico ou ensaio colage- nolítico.

16. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 15, caracte- rizado pelo fato de que dito polipeptídeo inibe uma atividade de MMP13 com uma IC5o de no máximo 1E” M, preferivelmente 16º M, SE M, ou 4Eºº M, 3Eº M, 2Eº M, tal como 1Eº M.

17. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo se liga à MMP13 com uma ECrso entre 1E-” M e 1E”? M, tal como entre 1E% M e 1E*! M, por exemplo, conforme determinado por ELISA.

18. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo se liga à MMP13 com um índice de dissociação menor do que 5Eº s*!, por exemplo, conforme determinado por SPR.

19. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que dita MMP13 é a MMP13 de ser humano, a MMP13 de rato, a MMP13 de cachorro, a MMP13 de bovino, a MMP13 de cinomolgo, de preferência a MMP13 de ser hu- mano, preferivelmente a SEQ ID NO: 115.

20. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo anta- goniza uma atividade de MMP13, tal como (i) uma atividade de pro- tease, preferivelmente clivagem de Aggrecan e/ou Colágeno, em que dito Colágeno é preferivelmente Colágeno Il; (ii) ligação de Colágeno ao domínio semelhante à hemopexina.

21. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracte- rizado pelo fato de que dito polipeptídeo bloqueia a ligação de MMP13 ao Colágeno e/ou Aggrecan de pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais.

22. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo inibe a atividade de protease de MMP13, tal como inibe a proteólise de um substrato, tal como Aggrecan, Colágeno Il, Colágeno |, Colágeno III, Colágeno IV, Colágeno IX, Colágeno X, Colágeno XIV e/ou gelatina, em que dito Colágeno é preferivelmente Colágeno tipo Il.

23. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos 1 ISVD se especificamente se liga à MMP, preferivelmente à MMP13.

24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, caracte- rizado pelo fato de que pelo menos 2 ISVDs especificamente se ligam à MMP, preferivelmente à MMP13.

25. Polipeptídeo compreendendo dois ou mais ISVDs que cada um individualmente de modo específico se liga à MMP13, carac- terizado pelo fato de que a) pelo menos um "primeiro" ISVD se liga especificamente a um primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subu- nidade ou conformação de MMP13; e em que, b) pelo menos um "segundo" ISVD se liga especificamente a um segundo determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subu- nidade ou conformação de MMP13, diferente do primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação, res- pectivamente.

26. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizado pelo fato de que dito "primeiro" ISVD que especificamente se liga à MMP13 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111, 11, 110, 10, 112, 12, 109, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e

22.

27. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que dito "segundo" ISVD que especifica- mente se liga à MMP13 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO:s 1, 2,3,4,5,6,7e8.

28. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um ISVD que especificamente se liga ao Aggrecan, preferivel- mente selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 166, 167 e

168.

29. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan.

30. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, caracte- rizado pelo fato de que pelo menos 2 ISVDs que especificamente se ligam ao Aggrecan podem ser iguais ou diferentes.

31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos 2 ISVDs que especifi- camente se ligam ao Aggrecan são independentemente selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 166 a 168.

32. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que dito ISVD que especifi- camente se liga ao Aggrecan, especificamente se liga ao Aggrecan de ser humano [SEQ ID NO: 105].

33. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 28 a 32, caracterizado pelo fato de que dito ISVD que especifi- camente se liga ao Aggrecan, especificamente se liga ao Aggrecan de cachorro, Aggrecan de bovino, Aggrecan de rato; Aggrecan de porco; Aggrecan de camundongo, Aggrecan de coelho; Aggrecan de cinomo- Igo e/ou Aggrecan de reso.

34. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que dito ISVD que especifi- camente se liga ao Aggrecan de preferência se liga ao tecido cartilagi- noso, tal como cartilagem e/ou menisco.

35. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo possui uma estabilidade de pelo menos 7 dias, tal como 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 meses ou mesmo 3 meses em fluido sinovial (SF) a 37ºC.

36. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ISVD que se liga à albumina do soro.

37. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 36, caracte- rizado pelo fato de que dito ISVD que se liga à albumina do soro con- siste essencialmente em 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respecti- vamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), em que a CDR1 é SEQ ID NO: 157, a CDR2 é SEQID NO: 158 e a CDR3 é SEQ ID NO: 159.

38. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracte- rizado pelo fato de que dito ISVD que se liga à albumina do soro é se-

lecionado do grupo que consiste em ALB135 (SEQ ID NO: 193), ALB129 (SEQ ID NO: 144), ALB8 (SEQ ID NO: 142), ALB23 (SEQ ID NO: 143) e ALB132 (SEQ ID NO: 145).

39. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 23 a 38, caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos dois ISVDs são ligados diretamente entre si ou são ligados por meio de um ligador.

40. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, caracte- rizado pelo fato de que dito ligador é selecionado do grupo que consis- te em SEQ ID NOs: 125 a 141, preferivelmente SEQ ID NO: 129.

41. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma extensão C-terminal.

42. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 41, caracte- rizado pelo fato de que dita extensão C-terminal é uma extensão C- terminal (X)n, em que n é de 1 a 10, preferivelmente de 1 a 5, tal como 1,2,3,4 ou 5 (e preferivelmente 1 ou 2, tal como 1); e cada X é um resíduo de aminoácido (preferivelmente de ocorrência natural) que é independentemente selecionado, e de preferência independentemente selecionado do grupo que consiste em alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (1).

43. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo possui pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 109, 110, 111, 112, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 ou 192.

44. Método de tratamento de doenças ou distúrbios em um indivíduo, por exemplo, nos quais a atividade de MMP13 está envolvi-

da, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do po- lipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 43 ao dito indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma de dita doença ou distúrbio.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que ditas doenças ou distúrbios são selecionados do grupo que consiste em artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriáti- ca, ruptura traumática ou descolamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafiseal, hérnia de disco espinhal, doença da degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente, osteocondrite dissecante, aggrecanopatias.

46. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

47. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamen- to ou prevenção de um sintoma que consiste em artropatias e condro- distrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatóide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura traumática ou descolamento, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafiseal, hérnia de disco espinhal, doença da degeneração do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite reincidente, osteocondrite dissecante, aggrecanopatias.

48. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo blo- queia por cruzamento a ligação à MMP13 de pelo menos um dos poli- peptídeos de acordo com qualquer um das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,2,3,4,5, 6,7 e 8, e/ou é bloqueado por cruzamento a partir da ligação à

MMP13 em pelo menos um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22,2,3,4,5,6,7e8.

49. Polipeptídeo que bloqueia por cruzamento a ligação à MMP13 por um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,2,3,4,5,6,7 e 8, e/ou é bloqueado por cruzamento a par- tir da ligação à MMP13 em pelo menos um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 111, 11, 112, 12, 109, 9, 110, 10, 1,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, caracteriza- do pelo fato de que dito polipeptídeo compreende pelo menos um VH, VL, dAb, domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) que especi- ficamente se liga à MMP13, em que a ligação à MMP13 modula uma atividade de MMP13.

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