JPH08511160A - 形質転換真カビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タンパク質を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プロモーター配列、ターミネーター配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又は類似物からなる群から選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領域の調節下でＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含んでいるような、形質転換されたアスペルギルス属のカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タンパク質を生産する方法を提供する。かかる調節領域はプラスミドｐＡＷ１４Ｂに存在するアスペルギルス・ニガー変種アワモリのエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ遺伝子）から得ることができるし、或いは共にアスペルギルスのグルコアミラーゼ遺伝子から得られるプロモーター配列とシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列及びアスペルギルスのｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター配列の組合わせでってもよい。好ましくは、「カビ分泌タンパク質-（ＫＥＸ２-）ＳｃＦｖ」からなる融合タンパク質を生産する。ＳｃＦｖフラグメント又はその融合産物を含んでなる新規生産物、このようにして生産される従前及び新規な生産物を含んだ組成物（例えば消費製品）も提供される。好ましくは、当該ＳｃＦｖフラグメントは人間の生態系に存在する化合物（微生物や酵素など）を認識する。かかる化合物は、例えば歯垢、虫歯、歯肉炎、歯周病又は口臭の形成に関与しているような口腔に存在するものであってもよいし、或いは例えば悪臭、炎症又は抜け毛の形成に関与しているような人間の皮膚に存在するものであってもよいし、或いはＨＣＧのようなホルモンであってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換真カビによってＳｃＦｖフラグメント を含んでなる融合タンパク質を生産する方法 本発明は形質転換カビによって単鎖抗体フラグメント（ＳｃＦｖフラグメント ）を生産する方法に関する。本明細書中において、ＳｃＦｖフラグメントとは、 重鎖の可変部フラグメントがリンカーペプチドによって軽鎖の可変部フラグメン トに連結したものを表す。 発明の背景 ＳｃＦｖフラグメントを様々な形質転換微生物において生産できることが報告 されているが、その成果の度合いには大きなバラツキがある。例えば、１９９３ 年２月４日公開の公開ＷＯ９３/０２１９８号（ＴＥＣＨ．ＲＥＳ．ＩＮＳＴ． ＦＩＮＬＡＮＤ；Ｔｅｒｒｉ他）から、重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントの 間に特殊なリンカーを用いると、幾つかの宿主生物（ただし、大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について の具体例しか挙げられていない）中でＳｃＦｖフラグメントを生産し、分泌させ ることができることが知られている。そのリンカーは、天然に分泌されるマルチ ドメインタンパク質又はその類似体の可動ヒンジ部を含んでなるものであって、 重鎖フラグメント又は軽鎖フラグメントのいずれとも相同でない。このＷＯ９３ /０２１９８号は文献の援用によって本明細書の内容の一部をなす。ＷＯ９３/０ ２１９８号に開示された方法の重大な短所は記載された生産レベルが低いことで あり、ＳｃＦｖフラグメントを消費製品に妥当な価格で利用するのに必要な生産 レベルにははるかに及ばない。こうした消費製品の具体例には、各種洗剤、食品 並びに化粧石鹸や脇下衛生用品のようなパーソナルケア用品が含まれる。したが って、ＳｃＦｖフラグメントに対するもっと汎用性の高い高収率生産系が必要と されている。細菌である大腸菌中でのＳｃＦｖフラグメントの生産は比較的収率 が低くなり、しかもその菌体内で産生されたタンパク質を可溶 化し、次いで再生（renaturation）する必要があるので、この方法は、比較的大 量に使用する必要のある抗体フラグメントの生産には向いていない（ＷＯ９３/ ０２１９８号の第３頁５〜２３行参照）。消費製品への経済的応用に十分足りる 量で様々な異種酵素群を産生することの判明している発現系を利用して酵母中で 各種ＳｃＦｖフラグメントを生産することを試みたが、本発明者らはＳｃＦｖフ ラグメントが全く或いは極微量でしか分泌されないことを発見した。この結果は ＷＯ９３/０２１９８号第２９〜３１頁の実施例２と符合していると思われる。 その実施例２は酵母中でのＳｃＦｖフラグメントの生産に関するものであるが、その生産量には全く触れられていない 。ＷＯ９３/０２１９８号には、数多くの 代替リンカーが挙げられているものの、ＷＯ９３/０２１９８号第６頁には、「 …分泌可能なリンカーペプチドの解析及び設計についての報文は全くない」並び に「…現在に至るまで、宿主の培養培地に分泌されるような、追加の異種リンカ ー配列をもつ新規融合タンパク質についての報告例はない」と記載されている。 別の最近の刊行物、１９９２年２月６日公開のＷＯ９２/０１７９７号（ＯＹ ＡＬＫＯ ＡＢ）には、カビの一種トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）中 での免疫グロブリンの生産について記載されている。第８３〜８５頁の実施例２ ０及び図２７には、ＣＢＨＩの可動ヒンジ部で連結された軽鎖可変部と重鎖可変 部を含む単鎖抗体をコードする機能的遺伝子の構築及び発現について記載されて いる（ＣＢＨＩは、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅ ｓｅｉ）の培養培地中に大量に存在するセロビオヒドロラーゼＩである；ＷＯ９ ２/０１７９７号第３頁参照）。この遺伝子は、トリコデルマ・レエセイｃｂｈ ｉターミネーターとトリコデルマ・レエセイｃｂｈｉプロモーター（プラスミド ｐＥＮ４０１）又はトリコデルマ・レエセイｃｂｈｉターミネーターとアスペル ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｇｐｄプロモーター（プラスミドｐＥＮ４０ ２）の調節下におかれている。これらのプラスミドでトリコデルマ・レエセイＲ ＵＴ-Ｃ-３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）を形質転換し、形質転換体を２種類の異 なる培地中で増殖させている。免疫反応性単鎖抗体の発現についての試験が培養 液上清で行われているが、その結果については一切触れられていない。 このように、どれくらいの量の単鎖抗体が実際に生成したのか全く実証されてい ない。この結論は、後で発表されたＶＴＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ 関連報文と一致する。後者の報文には、２３.３ｋＤ軽鎖、２３.９ｋＤ重鎖Ｆｄ 及び７３.２ｋＤのＣＢＨＩ-重鎖ＦｄをそれぞれコードするプラスミドｐＥＮ３ ０４、ｐＡＪ２０２及びｐＥＮ２０９（これらのプラスミドはＷＯ９２/０１７ ９７号にも例示されている）を用いた部分的に同一の実験が記載されている。こ の報文には、トリコデルマ・レエセイによる、各々独立した存在としての軽鎖又 は重鎖の生産（そのまま或いは前駆体として）しか記載されておらず、リンカー ペプチドを介して重鎖と軽鎖とが連結したものを含むＳｃＦｖの生産については 記載されていない。 したがって、所望のＳｃＦｖフラグメントを少なくとも妥当な収量で与えるよ うなカビ中でのＳｃＦｖフラグメントの生産及び分泌系に対するヒーズが依然と して存在する。本発明は、アスペルギルス属の形質転換カビを用いてかかる生産 法を提供する。 Ｍ．Ｗａｒｄ他の報文（１９９０）によれば（１９９０年１２月２７日公開の ＧＥＮＥＮＣＯＲのＷＯ９０/１５８６０号も参照されたい）、所望タンパク質 とカビタンパク質を含んでなる融合タンパク質が生産されるようにすると、アス ペルギルス中での所望タンパク質の生産及びその後の分泌を改善することができ る。その具体例として、プロキモシンのＮ末端をアスペルギルス・アワモリ（Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼのＣ末端に融合し たもののが生産されている。しかし、この刊行物には、このようなアプローチが 微生物宿主によってその生産及び分泌を試みたときに多大な困難を伴うことの知 られている化合物であるＳｃＦｖフラグメント（前記ＷＯ９３/０２１９８号参 照）にも適していることを示唆する記載はない。 優先日１９９１年１２月９日を主張して本願優先日後の１９９３年６月２４日 に公開されたＵＮＩＬＥＶＥＲのＷＯ９３/１２２３７号には、形質転換したカ ビによって所望タンパク質を生産及び分泌するための方法が記載されており、そ の発現及び／又は分泌調節領域はプラスミドｐＡＷ１４Ｂ（ＷＯ９３/ １２２３７号の図３参照）に存在するアスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）のエンドキシラナ ーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ遺伝子）から得られている。このプラスミドｐＡＷ１４ Ｂは、ブダペスト条約に基づいてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃ ｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国バールン）に受託番号ＣＢＳ ２３ ７.９０として１９９０年５月３１日付けで寄託された形質転換大腸菌ＪＭ１０ ９株中に存在している。好ましい具体的態様では、所望タンパク質は、当該所望 タンパク質のＮ末端の前にエンドキシラナーゼIIの少なくとも一部がくっついた 融合タンパク質とすることができる。しかし、ＳｃＦｖフラグメントの生産につ いては何等記載されていない。 発明の概要 本発明は、形質転換したカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合 タンパク質を生産する方法にして、（a）カビがアスペルギルス属に属するもの であり、かつ（b）当該アスペルギルスが、プロモーター配列、ターミネーター 配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又 は類似物からなる群から選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は 分泌調節領域の調節下でＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含ん でおり、生産後の任意段階として上記融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント 部分を切り離すためのタンパク分解による開裂段階を含むことを特徴とする方法 を提供する。一つの具体的態様において、「少なくとも１つのカビ由来の発現及 び／又は分泌調節領域」は、アスペルギルスのグルコアミラーゼ遺伝子から得ら れるプロモーター配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにアスペ ルギルスのｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター配列又は少なくとも１つのこれらの 機能的誘導体又は類似物を含んでなる。別の具体的態様において、「少なくとも １つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領域」は、アスペルギルスのエンドキ シラナーゼ遺伝子、特に上記プラスミドｐＡＷ１４Ｂに存在するアスペルギルス ・ニガー変種アワモリのエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ遺伝子）から得 られるプロモーター、シグナル配列のコードされたＤＮＡ配列及びターミネータ ー配 列、又は少なくとも１つのこれらの機能的誘導体又は類似物から選択される。 本発明の好ましい具体的態様では、上記ＳｃＦｖフラグメントのコードされた ＤＮＡ配列は融合タンパク質のコードされたキメラ遺伝子の一部を形成していて 、当該ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列の５′末端の前に、カビ の分泌タンパク質の成熟部分（特にアスペルギルスの成熟型タンパク質、例えば 成熟型グルコアミラーゼ又は成熟型エンドキシラナーゼ）をコードする構造遺伝 子の少なくとも一部分が存在する。かかる融合タンパク質においてＳｃＦｖフラ グメントがタンパク分解開裂部位（例えばＫＥＸ２様部位など）によって上記カ ビ分泌タンパク質又はその一部分と連結又は結合していれば、ＳｃＦｖフラグメ ントから上記カビタンパク質又はその一部分を取り除いて、得られる抗体フラグ メントをできるだけ小さくすることができ、応用に際して格段の利点をもつ。こ の場合、本発明の方法には、ＳｃＦｖフラグメント含有融合タンパク質の生産後 、当該融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント部分を切り離すためのタンパク 分解による開裂段階が含まれる。振盪フラスコでの培養によって、少なくとも４ ０ｍｇ/ｌ又は６０ｍｇ/ｌ以上及び最高収量として９０ｍｇ/ｌを僅かに上回る ＳｃＦｖの生産レベルが得られたが（後記の表２参照）、さらに至適化すれば少 なくとも１５０ｍｇ/ｌの生産レベルを達成することができると考えられる。さ らに、１５０ｍｇ/ｌを超えるＳｃＦｖフラグメントの生産レベルが発酵槽中で の培養によって既に得られており、さらに至適化すれば、少なくとも２５０ｍｇ /ｌ、さらには５００ｍｇ/ｌ以上、おそらくは１ｇ/ｌ以上の生産レベルに達す ると考えられる。 本発明は、また、本発明の方法によって得ることのできるＳｃＦｖフラグメン ト又はその融合産物を含んでなる新規生産物に関する。このような新規生産物は 、上記ＳｃＦｖフラグメントが、下等真核生物（特にアスペルギルス属のカビ） によって十分に発現・分泌される別のＳｃＦｖフラグメントの可変部フラグメン トのフレームワーク領域に相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植した修飾ＳｃＦｖフ ラグメントであるようなものであってもよい。本発明は、また、本発明の方法に よって生産される生産物又は上記の新規生産物を含む組成物、特に上記に具体例 を挙げた消費製品を提供する。本発明の特定の具体的態様によれば、ＳｃＦｖフ ラグメントは人間の生態系に存在する化合物を認識するが、かかる化合物は微生 物、酵素その他のタンパク質であり得る。好ましいものの一つは、口腔に存在す る化合物、さらに好ましくは、歯垢、虫歯、歯肉炎、歯周病又は口臭の形成に関 与する化合物である。別の好ましいものは、人間の皮膚に存在する化合物、さら に好ましくは、悪臭、炎症又は抜け毛の形成に関与する化合物である。本発明の 別の特定の具体的態様は、診断目的に使用し得る組成物であり、化合物がホルモ ン、特にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）であるような組成物である。 本発明の別の具体的態様によれば、ＳｃＦｖフラグメントは家畜の生態系に存 在する化合物を認識するが、かかる化合物は、動物用飼料、酵素その他のタンパ ク質、又は病原体であり得る。 本発明のさらに別の具体的態様によれば、ＳｃＦｖフラグメントが病気又は疾 患と肯定的又は否定的な関係をもつ化合物を認識し、例えば検出及び／又はター ゲッティングに用いることのできる組成物が提供される。 本発明は、また、本発明の組成物にして、化学産業、石油産業又は医薬品産業 において触媒として又は検出のために使用することのできる組成物に関する。 本発明は後記の実施例に例示されている通り、アスペルギルス属のカビの中で のＳｃＦｖフラグメントの生産に基づいて開発されたものであるが、本発明が他 のカビ、特に、ムーコル（Ｍｕｃｏｒ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属から選択されるカビ、につい ても適用可能であると考えられる。 図面の簡単な説明 図１は、ｐＡＮ５２-１０の概略図である。 図２は、ｐＵＲ４１５５及びｐＵＲ４１５７の概略図である。 図３は、ｐＡＮ５６-７の概略図である。 図４は、ｐＵＲ４１５９及びｐＵＲ４１６１の概略図である。 図５は、ウエスタンブロットである。１２.５％のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上でゲ ル電気泳動した後、Ｆｖ-リゾチーム抗血清と反応するタンパクを視覚化した。 レーン１はＳｃＦｖ-リゾチームを含んだ大腸菌抽出液であり、レーン２はＦｖ- 抗リゾチームであり、レーン３〜レーン８はＡＷＣ（Ｍ）４１系形質転換株及び アスペルギルス・ニガー変種アワモリ変異株＃４０の培地試料であって、レーン ３及び４は形質転換株ＡＷＣ（Ｍ）４１６１（プレプロ-“ｇｌａＡ２”-ＫＥＸ -ＳｃＦｖ-ＨＣＧ）、レーン５はＡＷＣ（Ｍ）４１５９（プレプロ-“ｇｌａＡ ２”-ＫＥＸ-ＳｃＦｖ-ＬＹＳ）、レーン６は変異株＃４０、レーン７はＡＷＣ （Ｍ）４１５７（１８ａａ ｇｌａＡ−ＳｃＦｖ-ＨＣＧ）、レーン８はＡＷＣ （Ｍ）４１５５（１８ａａ ｇｌａＡ-ＳｃＦｖ-ＬＹＳ）である。 図６は、アスペルギルス・ニガー変種アワモリのｅｘｌＡ遺伝子が含まれてい る５.３ｋｂ ＳａｌＩフラグメントをｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入して得た プラスミドｐＡＷ１４Ｂの地図である。 図７は、クーマシーブリリアントブルー染色したポリアクリルアミドゲルであ り、ｐＵＲ４４６２で形質転換したアスペルギルス・ニガー変種アワモリの培養 培地中に存在するタンパク質を示す。（i）放出ＳｃＦｖ-ＬＹＳフラグメント及 び（ii）ｇｌａＡ-ＫＥＸ２-ＳｃＦｖ-ＬＹＳ融合タンパク質及び／又はトラン ケート型ｇｌａＡタンパク質のバンドが示してある。 発明の詳細な説明 Ｍ．Ｗａｒｄ他の報文（１９９０）及びＷＯ９０/１５８６０号（その記載に よれば、所望タンパク質のコードされた遺伝子はグルコアミラーゼのコードされ た遺伝子をさらに含んでなるキメラ遺伝子の一部を形成する）に記載された成果 並びに上記の本願出願後に公開されたＵＮＩＬＥＶＥＲのＷＯ９３/１２２３７ 号に記載された発明の上述の好ましい具体的態様（所望タンパク質をコードする 遺伝子はエンドキシラナーゼの少なくとも一部がコードされた遺伝子をさらに含 んでなるキメラ遺伝子の一部を形成する）が、上記所望タンパク質をＳｃＦｖフ ラグメントとしたＳｃＦｖフラグメントの生産に有益に利用することができるこ とを今回発見した。これは、特に、融合タンパク質においてタンパク分解開裂部 位がカビ分泌タンパク質部分又はそのフラグメントとＳｃＦｖ部分の間に存在し ている場合に当てはまる。好ましい開裂部位はＦｕｌｌｅｒ他の報文（１９８８ ）、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ他の報文（１９９１）及びＣａｌｍｅｌｓ他の報文（１ ９９１） に記載されたＫＥＸ２様部位であるが、ＳｃＦｖフラグメントに存在していない 開裂部位であればその他の開裂部位を使用することもできる。他の開裂部位は、 Ｍａｔｔｈｅｗｓ及びＷｅｌｌｓの報文（１９９３）に記載された方法に基づい て選択することができる。以下に示す実施例では、プレプログルコアミラーゼの プロ部分にＫＥＸ２型認識部位が含まれている。実施例２.４（i）参照。 口腔内又は人間の皮膚に存在する微生物を認識するＳｃＦｖフラグメントは、 かかる微生物の増殖又は代謝を阻害する能力をもつので、本発明の枠組において 重要である。口腔内に存在するある種の微生物は歯垢、虫歯、歯肉炎又は歯周病 の形成に関与していると考えられており、人間の皮膚に存在する微生物はなかで も悪臭の発生に関与していると考えられている。本発明にしたがって製造される ＳｃＦｖフラグメントは、そのままでも、或いは上記微生物に対する阻害効果を もつ化合物と結合した形でも、その作用を発揮し得る。 本発明によれば、アスペルギルスにおいて十分に発現・分泌されるＳｃＦｖフ ラグメントの可変部フラグメントのフレームワーク領域に相補性決定領域（ＣＤ Ｒ）を移植することによって修飾ＳｃＦｖフラグメントを製造することもできる と考えられる。例えばＪｏｎｅｓ他の報文（１９８６）に記載のヒト免疫グロブ リンにおけるＣＤＲの移植法を参照。こうしたＣＤＲは共通の抗体から得ること ができる。あるＣＤＲとＳｃＦｖの残りの部分の結合特性はランダム又は部位特 異的変異によって至適化することができる。したがって、本発明の方法において は、ある抗体に由来するＣＤＲを、別のＳｃＦｖフラグメントの可変部フラグメ ントのフレームワーク領域に移植することができる。 本発明の方法で生産されるＳｃＦｖフラグメント又はその融合タンパク質には 従前のものも含まれているが、大半のＳｃＦｖフラグメント又はその融合タンパ ク質は新規な産物である。したがって、本発明は、また、本発明の方法で得るこ とのできる新規なＳｃＦｖフラグメント又はその融合タンパク質も提供する。か かる方法で得られる産物は様々な用途向けの組成物に使用することができる。し たがって、本発明は、また、本発明の方法で生産される産物を含んだ組成物にも 関する。これは従前の産物及び新規な産物双方に適用される。 実施例３及び実施例５に例示されているｅｘｌＡプロモーターとｅｘｌＡシグ ナル配列のコードされたＤＮＡ配列とｅｘｌＡターミネーターの組合せの代わり に、他の組合せも使用することができ、例えば、実施例７に例示されているｅｘ ｌＡプロモーターとｇｌａＡシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列とｅｘｌＡ ターミネーターなどであるが、一般に、発現及び／又は分泌調節領域としてはカ ビ由来のプロモーター、カビ由来のシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列及び カビ由来のターミネーター配列から選択できる。特定の具体的態様は、アスペル ギルスのグルコアミラーゼ遺伝子から得られるプロモーター配列とシグナル配列 のコードされたＤＮＡ配列とアスペルギルスのｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター 配列である。 本発明による融合タンパク質の一部を形成するカビ分泌タンパク質は、実施例 に例示されているアスペルギルス・ニガー変種アワモリのエンドキシラナーゼII （実施例３及び実施例５参照）及びアスペルギルスのグルコアミラーゼ（実施例 ７参照）の他にも、一般に、どんなカビ分泌タンパク質に由来するものであって もよい。 実施例２.６.１ｂの表２は、カビタンパク質がそのプレプロ部分とその成熟型 タンパク質のかなりの部分で構成されていて、それがＫＥＸ２様開裂部位を含ん だカビタンパク質のプレプロ部分によってＳｃＦｖフラグメントに連結している ときに、最高の発現及び分泌収量が得られることを示している。小リンカーペプ チドがＳｃＦｖフラグメントとＫＥＸ２様開裂部位の間に置かれていてもよいし （プラスミドｐＵＲ４１５９及びｐＵＲ４１６３及び誘導体参照）、或いはＫＥ Ｘ２様開裂部位と成熟型カビタンパク質部分の間に置かれていてもよい。したが って、本発明は、最も広義には、形質転換されたカビによってＳｃＦｖフラグメ ントを含んでなる融合タンパク質を生産する方法にして、カビがアスペルギルス 属に属するものであり、かつ当該アスペルギルスが、プロモーター配列、ターミ ネーター配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的 誘導体又は類似物からなる群から選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及 び／又は分泌調節領域の調節下でＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配 列を含んでいることを特徴とする方法を提供する。 以下、本発明を実施例によって例示する。 実施例１ Ｖ_H及びＶ_L領域のコードされた抗体遺伝子フラグメントの単離並びに ＳｃＦｖ遺伝子の構築 ハイブリドーマ細胞系統からのＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの調製並びに抗体の重 鎖可変部（Ｖ_H）及び軽鎖可変部（Ｖ_L）をコードする遺伝子フラグメントのＰＣ Ｒ法による増幅は、文献記載の公知の常法にしたがって行った。例えばＯｒｌａ ｎｄｉ他の報文（１９８９）参照。実施例に記載された標準的手法は、特記しな い限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の成書に記載された方法にしたがって行った。 Ｖ_H及びＶ_L遺伝子フラグメントをクローニングして塩基配列を決定した後、そ れらを、Ｆｖ又はＳｃＦｖ抗体フラグメントなどのコードされた発現プラスミド の構築に使用した。ＳｃＦｖ抗体フラグメントでは、Ｖ_HとＶ_Lがペプチドリンカ ーで連結している。かかる構成は、Ｖ_H鎖及びＶ_L鎖各々をコードする遺伝子フラ グメントがリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列で連結されているよ うな（キメラ）遺伝子を構築することによって達成した。可変部ペプチド鎖の順 序はＶ_H-リンカー-Ｖ_LでもＶ_L-リンカー-Ｖ_Hでもよい。以下の試験では（ＧＧＧ ＧＳ）₃の配列（配列番号：１）のペプチドリンカーを使用した。 １.１ 抗リゾチームＳｃＦｖの構築 プラスミドｐＳｃＦｖ-ＬＹＳ-ｍｙｃはＧ．Ｗｉｎｔｅｒ氏から入手したもの で、Ｓ．Ｗａｒｄ他の報文（１９８９）に記載されているものである。このプラ スミドはｐＵＣ１９由来のプラスミドであって、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体 Ｄ１.３のＶ_H及びＶ_Lフラグメントのコードされた遺伝子フラグメントを含んで いる。そのＶ_Hフラグメントの前にはＰｅｌＢ分泌シグナル配列があり、Ｖ_Hフラ グメントとＶ_Lフラグメントは（ＧＧＧＧＳ）₃ペプチドリンカー（配列番号：１ ）を介して連結されており、Ｖ_Lフラグメントの後には１１アミノ酸残基のｍｙ ｃタグがくっついている。ＰｅｌＢシグナル配列が前方に、かつｍｙｃテールが 後方についたモノクローナル抗リゾチーム抗体のＳｃＦｖフラグメントのコード されたＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩフラグメントの塩基配列（配列番号：２）及び推 定アミノ酸配列（配列番号：３）を以下に示す。 ｐＵＣ１９由来ｐＳｃＦｖ-ＬＹＳ-ｍｙｃのｍｙｃタグを取り除くため、Ｘｈ ｏＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントを次の配列の別の合成フラグメントで置換して、 Ｖ_L遺伝子フラグメントの後にＴＡＡ翻訳終止コドンを導入した。 得られたプラスミドをｐＵＲ４１２１と名付けた。次に、ＳｃＦｖ-ＬＹＳの コードされた約８２０ｂｐのＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩフラグメントを単離して、 同じ酵素で切断しておいたｐＥＭＢＬ９由来プラスミド（Ｄｅｎｔｅ他の報文（ １９８３））にクローニングしてプラスミドｐＵＲ４１２９を得た。 １.２ 抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンＳｃＦｖのコードされた遺伝子の構築 ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）は妊娠ホルモンである。モノクローナ ル抗体による尿中ＨＣＧの検出を基準にした妊娠判定テストがＵｎｉｌｅｖｅｒ 社によって開発され、Ｃｌｅａｒｂｌｕｅ（登録商標）という商品名でＵＮＩＰ ＡＴＨ社から市販されている。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンに対するモノクロー ナル抗体由来の重鎖及び軽鎖フラグメント各々の可変部のコードされた遺伝子フ ラグメントを、上述の通り、ハイブリドーマ細胞系統から得た。次に、これらの ＨＣＧ Ｖ_H及びＶ_L遺伝子フラグメントのプラスミドｐＵＲ４１２９へ のクローニングを、対応ＰｓｔＩ-ＢｓｔＥII及びＳａｃＩ-ＸｈｏＩ抗リゾチー ム遺伝子フラグメントの置換によって行い、プラスミドｐＵＲ４１３８を得た。 抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（抗ＨＣＧ）抗体のＳｃＦｖフラグメントをコー ドするＰｓｔＩ-ＸｈｏＩ遺伝子フラグメントの塩基配列（配列番号：７）及び 推定アミノ酸配列（配列番号：８）を以下に示す。 実施例２ ｇｌａＡプロモーター系を用いたＳｃＦｖ発現カセットの構築並びに アスペルギルスへの導入 ２.１ グルコアミラーゼの１８アミノ酸残基のシグナル配列を用いたＳｃＦｖ 発現カセットの構築（ｐＵＲ４１５５及びｐＵＲ４１５７） ｐＥＭＢＬ９の多重クローニング部位（ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄIII部位まで の範囲）を以下の塩基配列の合成ＤＮＡフラグメントで置換した。 上記塩基配列の５′部分はｇｌａＡシグナル配列（アミノ酸１〜１８）とそれ に続く抗体重鎖可変分の最初の５残基のアミノ酸をコードしている。その３′部 分は抗体軽鎖可変分の最後の５残基のアミノ酸をコードしている。得られたプラ スミドをｐＵＲ４１５３と名付けた。 プラスミドｐＵＲ４１５４とｐＵＲ４１５６を次のようにして得た。プラスミ ドｐＵＲ４１２９（実施例１.１）をＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで切断し、アガロー スゲルから約０.７ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントは 、Ｎ末端アミノ酸５残基とＣ末端アミノ酸５残基のコードされたＤＮＡ配列が失 われたトランケート型ＳｃＦｖ-ＬＹＳフラグメントをコードしている。同様に 、プラスミドｐＵＲ４１３８（実施例１.２）から約０.７ｋｂのＰｓｔＩ-Ｘｈ ｏＩフラグメントを単離したが、このフラグメントも同様のトランケート型Ｓｃ Ｆｖ-ＨＣＧフラグメントをコードしている。 これらＳｃＦｖのコードされたフラグメントをｇｌａＡ分泌シグナル配列のコ ード配列と融合するため、上記で得られたフラグメントをｐＵＲ４１５３にクロ ーニングした。そのため、プラスミドｐＵＲ４１５３をＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで 切断し、しかる後にアガロースゲルから約４.１ｋｂのベクターフラグメントを 単離した。これを上記の約０.７ｋｂのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントの各々と 連結することにより、それぞれプラスミドｐＵＲ４１５４（ＳｃＦｖ-ＬＹＳ） とｐＵＲ４１５６（ＳｃＦｖ-ＨＣＧ）を得た。 ２．２ ｐＡＮ５２-１０の構築 ｐＡＮ５２-１０（図１）を、アスペルギルス発現カセットの構築のための出 発ベクターとして使用した。このプラスミドは次の通り構築した。 ｐＡＮ５２-６ＮｏｔＩ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ他の報文（１９９１） ）において、アスペルギルス・ニガーＮ４０２株のｇｌａＡプロモーター中に位 置するＮｃｏＩ部位（ＡＴＧの約２.７ｋｂ上流）をＮｃｏＩ切断で除去し、ク レノウポリメラーゼでフィリング・イン（一本鎖突出端を埋めること）し、ｐＡ Ｎ５２-６ＮｏｔＩｄｅｌｔａＮｃｏＩを得た。ｐＡＮ５２-６ＮｏｔＩｄｅｌｔ ａ ＮｃｏＩをＮｏｔＩで切断し、ＸｍｎＩで限定分解した後、約４.０ｋｂのＮ ｏｔＩ-ＸｍｎＩ ｇｌａＡプロモーターフラグメントを単離した。このｐＡＮ ５２-６ＮｏｔＩｄｅｌｔａＮｃｏＩフラグメント（1）と、アスペルギルス・ニ デュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣターミネーター （Ｐｕｎｔ，Ｊ.Ｐ.他の報文（１９９１））及びｐＵＣ１８配列が含まれている ｐＡＮ５２-１ＮｏｔＩ（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ他の報文（１９９１）） の約３.４ｋｂのＮｏｔＩ-ＮｃｏＩフラグメント（2）と、ｇｌａＡプロモータ ーの３′末端からＡＴＧ開始コドンまでを含んだ合成ＸｍｎＩ-ＮｃｏＩフラグ メント（3）の３フラグメント間の連結を行って、プラスミドｐＡＮ５２-７Ｎｏ ｔＩを得た。上記の合成ＸｍｎＩ-ＮｃｏＩフラグメントの塩基配列（配列番号 ：１３〜１４）を次に示す。 ｐＡＮ５２-７ＮｏｔＩから約４ｋｂのＮｏｔＩ-ＮｃｏＩフラグメント（ｇｌ ａＡプロモーターが含まれる）と約３.４ｋｂのＮｏｔＩ-ＢａｍＨＩフラグメン ト（ｐＵＣ１８ベクター及びｔｒｐＣターミネーターが含まれる）を単離し、Ｅ ｃｏＲＶ部位とＨｉｎｄIII部位を含む下記塩基配列（配列番号：１５〜１６） のＮｃｏＩ-ＢａｍＨＩリンカーを用いてこれら２つのフラグメントを連結した 。 上記の連結によってプラスミドｐＡＮ５２-９が得られた。ｐＡＮ５２-９の約 ４.０ｋｂ ＮｏｔＩ-ＨｉｎｄIII ｇｌａＡプロモーターフラグメントとｐＡＮ ５２-６ＮｏｔＩの約３.３ｋｂ ＨｉｎｄIII-ＮｏｔＩフラグメント（ｐＵＣ１ ８配列及びアスペルギルス・ニデュランスの約０.７ｋｂ ｔｒｐＣターミネータ ーフラグメントが含まれている）との連結によってｐＡＮ５２-１０（図１）を 得た。 ２.３ ｐＵＲ４１５５及びｐＵＲ４１５７の構築 プラスミドｐＡＮ５２-１０をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、約７.５ｋ ｂの脱リン酸化ベクターフラグメントを単離した。そのＮｃｏＩ部位はｇｌａＡ プロモーターの下流に位置していてＡＴＧ開始コドンと同じ場所にある。プラス ミドｐＵＲ４１５４とｐＵＲ４１５６（実施例２.１）の各々をＮｃｏＩ及びＨ ｉｎｄIIIで切断して、ｓｓ-ｇｌａＡ及びＳｃＦｖのコードされた約０.８ｋｂ フラグメントを単離した。得られたフラグメントを連結して、それぞれプラスミ ドｐＵＲ４１５５及びｐＵＲ４１５７（図２）を得た。これらのプラスミドにお いて、ＳｃＦｖフラグメントの発現は、アスペルギルス・ニガーｇｌａＡプロモ ーター、１８残基のアミノ酸からなるグルコアミラーゼのシグナル配列及びアス ペルギルス・ニデュランスのｔｒｐＣターミネーターの調節下に置かれている。 ２.４ 分泌キャリヤーとしてグルコアミラーゼの一部を利用したＳｃＦｖ発現 28カセットの構築 ｉ） ｐＵＲ４１５９及びｐＵＲ４１６１の構築 ｇｌａＡプレプロ部分と成熟型グルコアミラーゼＧ１（“ｇｌａＡ２”タンパ ク質）の最初の５１４残基のアミノ酸とＳｃＦｖフラグメントとからなる融合タ ンパク質をコードする発現カセットを構築した。これらのカセットにおいて、“ ｇｌａＡ２”タンパク質とＳｃＦｖフラグメントの間にはグルコアミラーゼのペ プチド（Ａｓｎ-Ｖａｌ-Ｉｌｅ-Ｓｅｒ-Ｌｙｓ-Ａｒｇ；配列番号：４５）をコ ードする配列が存在する。このペプチドにはＫＥＸ２型認識部位（Ｌｙｓ-Ａｒ ｇ）が含まれている。これらのベクターを得るため、ｐＡＮ５２-１０の約７.５ ｋｂ Ｎｃｏｌ-ＥｃｏＲＶフラグメントにｐＡＮ５６-４の１.９ｋｂ ＮｃｏＩ- ＥｃｏＲＶフラグメント（アスペルギルス・ニガーのｇｌａＡ遺伝子の一部が含 まれている）を挿入することにより、プラスミドｐＡＮ５６-７（図３）を構築 した。プラスミドｐＡＮ５６-４は、本願優先日前には公開されていなかったが 、本願出願時にはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１，Ｎｏ .２（１９９３）１３５-１４５のＭ.Ｐ．Ｂｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ，Ｉ.Ｅ．Ｍａ ｔｔｅｒｎ，Ｒ．Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｊ.Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ 及びＣ.Ａ.Ｍ.Ｊ.Ｊ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌの報文に記載されていた。上 記刊行物は文献の援用によって本発明の内容の一部をなす。また、その原稿は優 先権書類に添付した。 “ｇｌａＡ２”タンパク質とＳｃＦｖフラグメントのインフレーム（同一枠内 ）での融合を行うため、プラスミドｐＵＲ４１５４及びｐＵＲ４１５６の各々を ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、しかる後にアガロースゲルから約４.８ｋｂ のベクターフラグメントを単離した。このベクターに、下記塩基配列（配列番号 ：１７〜１９）の合成ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを連結した。 このＥｃｏＲＩ-ＰｓｔＩフラグメントを使用して、ｇｌａＡシグナル配列の コードされたフラグメント（実施例２.１参照）を置換し、“ｇｌａＡ２”遺伝 子とのインフレーム融合を行った。得られたプラスミドｐＵＲ４１５８及びｐＵ Ｒ４１６０からＥｃｏＲＶ-ＨｉｎｄIIIフラグメント（約０.７５ｋｂ）を単離 して、ｐＡＮ５６-７のＥｃｏＲＶ-ＨｉｎｄIIIフラグメント（約９.３ｋｂ）に 連結し、ｐＵＲ４１５９及びｐＵＲ４１６１（図４、ただし、ＮｃｏＩ部位の近 くにあるアミノ酸２４残基からなるプレプロｇｌａＡ部分のコードされたＤＮＡ は示していない）を得た。このタンパク質においては、“ｇｌａＡ２”部分とＳ ｃＦｖ部分はＫＥＸ２開裂部位を含んだペプチドで連結されている。 ii） ｐＵＲ４１６３の構築 同様にして、“ｇｌａＡ２”タンパク（そのプレプロ部分が前方に存在するも の）とＳｃＦｖ-リゾチームがＸａ因子認識部位を介して融合した融合タンパク 質をコードする発現カセットをもつベクターを構築した。ｐＵＲ５１５４のＥｃ ｏＲＩ-ＰｓｔＩベクターフラグメント（約４.８ｋｂ）に、下記塩基配列（配列 番号：２０〜２２）の合成ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを連結した。 このＥｃｏＲＩ-ＰＳｔＩフラグメントを使用して、ｇｌａＡシグナル配列の コードされたフラグメントを置換し、“ｇｌａＡ２”遺伝子とのインフレーム融 合を行った。得られるタンパク質においては、“ｇｌａＡ２”部分とＳｃＦｖ部 分がＸａ因子開裂部位を含んだペプチドで連結されている。得られたプラスミド ｐＵＲ４１６２からＥｃｏＲＶ-ＨｉｎｄIIIフラグメント（約０.７５ｋｂ）を 単離して、ｐＡＮ５６-７ベクターフラグメント（約９.３ｋｂ）に連結し、ｐＵ Ｒ４１６３を得た。 ２.５ アスペルギルスの形質転換 構築したベクターには慣用の選択マーカー（例えば、ａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、 ハイグロマイシンなど）を与えることができ、得られたベクターでカビを形質転 換して所望のタンパク質を生産することができる。 一例として、５.０ｋｂ ＮｏｔＩフラグメントに位置するアスペルギルス・ニ デュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ他の報文（１９８３））をＳｃＦｖ発現 ベクターｐＵＲ４１５５、ｐＵＲ４１５７、ｐＵＲ４１５９、ｐＵＲ４１６１及 びｐＵＲ４１６３に導入して、それぞれ、ｐＵＲ４１５５ＮＯＴ、ｐＵＲ４１５ ７ＮＯＴ、ｐＵＲ４１５９ＮＯＴ、ｐＵＲ４１６１ＮＯＴ及びｐＵＲ４１６３Ｎ ＯＴを得た（表１）。ａｍｄＳＮｏｔＩフラグメントは、ｐＧＷ３２５（Ｗａｒ ｎａｒｓ Ｋの博士論文（１９８６））のＥｃｏＲＩフラグメントのフランキン グ配列として下記の合成オリゴヌクレオチドを与えることによって得た。 こうして構築したベクターｐＵＲ４１_…ＮＯＴ（ｐＵＲ４１５５ＮＯＴ、ｐＵ Ｒ４１５７ＮＯＴ、ｐＵＲ４１５９ＮＯＴ、ｐＵＲ４１６１ＮＯＴ及びｐＵＲ４ １６３ＮＯＴ）の各々をアスペルギルス・ニガー変種アワモリＡＴＣＣ１１３５ ８株及びアスペルギルス・ニガー変種アワモリ＃４０株（ＷＯ９１/１９７８２ ；アスペルギルス・ニガー変種アワモリの変異によって得られたもの）に導入し た。これらのプラスミドｐＵＲ４１_…ＮＯＴによる形質転換は、 ＷＯ９１/１９７８２に記載の方法、或いはＰｕｎｔ Ｐ.Ｊ.及びＶａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ Ｃ.Ａ.Ｍ.Ｊ.Ｊ.の報文（１９９２）記載のプラスミドｐＡＮ７- １との同時形質転換によって行った。ｐＡＮ７-１は、大腸菌のハイグロマイシ ン耐性遺伝子をアスペルギルス発現シグナルのフランキング配列として含んでい る。アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（変異株＃４０）プロトプラストの収 量は１〜５×１０⁷/ｇミセリウムで、生存率は３〜８％であった。１回の形質転 換につき、３〜８×１０⁵個の生菌プロトプラストを、キアゲン法で精製したプ ラスミドＤＮＡ １０μｇとインキュベートした。アセトアミド又はアクリルア ミドを唯一の窒素源とした最少培地を用いた平板上でアスペルギルス・ニガー変 種アワモリの変異株＃４０ ａｍｄＳ⁺を選択・精製した。直接選択によって、１ μｇのＤＮＡ当り最高０.０２個の＃４０変異株が得られた。アスペルギルス・ ニガー変種アワモリの形質転換株は得られなかった。変異株＃４０の同時形質転 換は、プラスミドｐＵＲ４１_…ＮＯＴのいずれかとｐＡＮ７-１ ＤＮＡの重量比 ７：３の混合物を用いて実施した。ｐＡＮ７-１の同時形質転換株は、最初に１ ００〜１５０ｐｇ/ｍｌのハイグロマイシン含有最少培地平板上で選択し、次い でアセトアミドを添加した平板状で選択した。Ｈｍ^Rコロニーの頻度は約２形質 転換株/μｇであったが、アセトアミド添加平板上で十分に増殖したのはＨｍ^Rコ ロニーのたった５％であった。 アセトアミド添加平板上での直接選択によって得られたアスペルギルス・ニガ ー変種アワモリ＃４０形質転換株をＡＷＣと呼ぶ。アセトアミド添加平板上で十 分に増殖した変異株＃４０の同時形質転換株をＡＷＣＭと呼ぶ。 以下に示す数の（同時）形質転換株をさらに解析した。 ２.６ アスペルギルス形質転換株によるＳｃＦｖの生産 ＳｃＦｖフラグメントのコードされた配列を含むアスペルギルス・ニガー変種 アワモリ変異株＃４０の形質転換株の解析を、誘導物質としてマルトデキストリ ンを含んだ培地中で培養した後で行った。 ５％マルトデキストリン（Ｓｉｇｍａ社のデキストリンコーン・タイプＩ；Ｄ -２００６）を添加した最少培地（０.０５％ＭｇＳＯ₄、０.６％ＮａＮＯ₃、０. ０５％ＫＣｌ、０.１５％ＫＨ₂ＰＯ₄及び微量元素）中でＡＷＣ及びＡＷＣＭ系 形質転換株を増殖させた。培地は１２０℃で３０分間滅菌した。５０ｍｌ培地（ ３００ｍｌ振盪フラスコ）に４×１０⁵個の胞子を接種して、３０℃のインキュ ベーター（３００ｒｐｍ）内で様々な期間培養した。４５〜５０時間後に培地試 料を採取して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した後ウエスタンブロッティング法で分 析した。さらに、ピン-ＥＬＩＳＡアッセイにより定量的機能試験を実施した。 ２.６.１ ＳｃＦｖ-ＬＹＳ及びＳｃＦｖ-ＨＣＧ形質転換株の培地 ２.６.１ａ ウエスタンブロッティング解析及びクーマシーブリリアントブルー 染色ゲル ＡＷＣ（Ｍ）４１５５（１８ ａ.ａ．ｇｌａＡシグナル配列-ＳｃＦｖ-ＬＹＳ ）（同時）形質転換株の培地試料のウエスタンブロッティング（Ｆｖ-ＬＹＳに 対する抗血清を使用）で、変異株＃４０の培地中には存在しない分子量約３１ｋ Ｄａのバンドが観察された（図５）。予想通りの大きさのタンパク質の位置に泳 動されたこのバンドの存在は、培地中にＳｃＦｖ-ＬＹＳが分泌されたことを示 している。 幾つかのＡＷＣ（Ｍ）４１５９（プレプロ-“ｇｌａＡ２”-ＫＥＸ２-ＳｃＦ ｖ-ＬＹＳ）（同時）形質転換株の培地でも、同様の格段に濃いバンドがみつか り、これらの形質転換株によってＳｃＦｖ-ＬＹＳがさらに効率的に分泌される ことを示していた。このタンパクバンドはクーマシーブリリアントブルー染色ゲ ルでも視認された。 ＡＷＣ（Ｍ）４１５７（１８ ａ.ａ．ｇｌａＡシグナル配列＋ＳｃＦｖ-ＨＣ Ｇ）の培地試料では非常に弱いバンドが観察されたが、ＡＷＣ（Ｍ）４１６１（ プレプ ロ-“ｇｌａＡ２”-ＫＥＸ２-ＳｃＦｖ-ＨＣＧ）（同時）形質転換株の培地では バンドがはっきりと視認できた（分子量約３１ｋＤａ）。非特異的なバンドはＳ ｃＦｖ-ＬＹＳ形質転換株で得られたものと同一であった。結果の幾つかを図５ に示す（ウエスタンブロッティング）。方法 ：ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製のＰｈａ ｓｔシステムを用いた８〜２５％濃度勾配ゲル又は自家製の均一１２.５％ＳＤ Ｓ-ゲル上で実施した。ウエスタンブロッティング分析は、ＳｃＦｖ-ＬＹＳ及び ＳｃＦｖ-ＨＣＧ双方の検出用に、Ｆｖ-ＬＹＳに対するポリクローナル抗血清を 使用した（１：１５００）。 ２.６.１ｂ ピン-ＥＬＩＳＡ法による分析 ＡＷＣ（Ｍ）形質転換株中の機能的ＳｃＦｖ-ＬＹＳの量（ピン-ＥＬＩＳＡア ッセイで測定）を表２に示す。 ＡＷＣ（Ｍ）４１５５（１８ａ.ａ．ｇｌａＡ）形質転換株の培地中のＳｃＦ ｖ-ＬＹＳの量は２〜２２ｍｇ/ｌであった。ＡＷＣ（Ｍ）４１５９（同時）形質 転換株（プレプロ-“ｇｌａＡ２”-ＫＥＸ２-構築体）は最高約９０ｍｇ/ｌを培 地中 に分泌するが、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ変異株＃４０では全く生産 されなかった。ＳｃＦｖ-ＨＣＧの測定のための定量的ピン-ＥＬＩＳＡアッセイ で、ＡＷＣ（Ｍ）４１６１（同時）形質転換株（“ｇｌａＡ２”-ＫＥＸ２-構築 体）が最高４ｍｇ/ｌの機能的ＳｃＦｖ-ＨＣＧを培地中に分泌することが判明し た。しかし、ＡＷＣ４１５７（１８ａ.ａ.-ｇｌａＡ-シグナル配列）形質転換株 の培地では、ＳｃＦｖ-ＨＣＧは全く検出されなかった。方法 ：リゾチーム又はＨＣＧでコートしたピンを（稀釈）培地試料とインキュベ ートした。続いて、これらのピンを各々Ｆｖ-ＬＹＳ及びＦｖ-ＨＣＧに対する抗 血清とインキュベートし、次いでアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体 とインキュベートした。最終的に、リン酸ｐ-ニトロ-フェニルエステルとインキ ュベートして４０５ｎｍの光学密度を測定することによって、アルカリホスファ ターゼ活性を求めた。Ｆｖ-ＬＹＳ及びＦｖ-ＨＣＧ各々の標準溶液を用いて、機 能的ＳｃＦｖ-ＬＹＳ及びＳｃＦｖ-ＨＣＧの量を計算した。 実施例３ エンドキシラナーゼのプロモーター及びターミネーター並びにエンド キシラナーゼの分泌シグナル及び成熟型エンドキシラナーゼのコード されたＤＮＡ配列を用いた、ＳｃＦｖフラグメント生産用のアスペル ギルス・ニガー変種アワモリ組込みベクターの構築 この実施例では、成熟型エンドキシラナーゼとＳｃＦｖフラグメントとの融合 タンパク質をコードする発現プラスミドの構築について説明するが、エンドキシ ラナーゼの一部だけを用いてほぼ同様にして別の発現プラスミドを構築できるこ とは明らかである。 ３.１ ｐＵＲ４１５８-Ａの構築 プラスミドｐＳｃＦｖＬＹＳｍｙｃ（実施例１.１参照）をＰｓｔＩ及びＸｈ ｏＩで切断すると、アガロースゲルから約０.７ｋｂのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグ メントを単離することができた。このフラグメントは、Ｎ末端アミノ酸５残基と Ｃ末端アミノ酸５残基のコードされたるＤＮＡ配列が失われたトランケート型単 鎖Ｆｖ-ＬＹＳフラグメント（配列番号：２５の塩基配列参照）をコードしてお り、モノクローナル抗リゾチーム抗体Ｄ１.３のＳｃＦｖフラグメント （ＳｃＦｖ-ＬＹＳ）をコードする約７００ｂｐのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメン トの推定アミノ酸配列（配列番号：２６）を下記に示す。 プラスミドｐＥＭＢＬ９（Ｄｅｎｔｅ他の報文（１９８３））の多重クローニ ング部位（ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄIII部位までの範囲）は以下の塩基配列（配 列番号：２７〜３０）の合成ＤＮＡフラグメントで置換できる。 このＤＮＡフラグメントを使用して、プラスミドｐＥＭＢＬ９の多重クローニ ング部位（ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄIII部位までの範囲）を置換することができ る。この合成ＤＮＡフラグメントのコーディング鎖の５′部分はＫＥＸ２部位（ ＩＳＫＲ）をコードしており、続いてスペーサー（ＧＧＳ）、次に抗体重鎖可変 部の最初の５残基のアミノ酸をコードしている。このコーディング鎖の３′部分 は抗体軽鎖可変部の最後の８残基のアミノ酸をコードしている。得られたプラス ミドをＰｓｔＩ及びＸｈｏＩで切断すると約４ｋｂのベクターフラグメントを得 ることができる。 上記のｐＳｃＦｖＬＹＳｍｙｃの約０.７ｋｂのＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメン トを上記の４ｋｂベクターフラグメントと連結すると、Ｖ_H及びＶ_L抗体フラグメ ントをコードする修復遺伝子を含んだｐＵＲ４１５８-Ａを得ることができる。 ３.２ ｐＸＹＬ２の構築 ｅｘｌＡ発現シグナル及びＳｃＦｖフラグメントのコードされた遺伝子を含ん だ一連の発現プラスミドの構築の出発ベクターとしてプラスミドｐＡＷ１４Ｂを 使用した。このプラスミドは、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ染色体の５ .２ｋｂ ＳａｌＩフラグメントを含んでおり、この５.２ｋｂ ＳａｌＩフラグメ ントには０.７ｋｂのｅｘｌＡ遺伝子が２.５ｋｂの５′-フランキング配列及び ２.０ｋｂの３′-フランキング配列と共に位置している（図６参照；この図は本 願優先日以降に出願されたＵＮＩＬＥＶＥＲのＷＯ９３/１２２３７号の図３ と同一である）。 ｐＡＷ１４ＢをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断すると、ｅｘｌＡプロモーター 、ｅｘｌＡ構造遺伝子及びｅｘｌＡターミネーター領域の一部を含んだ約３.２ ｋｂのＸｂａＩ-ＢａｍＨＩフラグメントを単離することができる。このフラグ メントは、同一酵素対で切断しておいたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にクローニングすることができ、プラスミドｐＸＹＬ １が得られる。 下記に示す第１（アンチセンス）プライマー（Ａ）及び同じく下記に示すＳｃ ａＩ部位（ｅｘｌＡ遺伝子内に位置する）の上流に位置する第２（センス）プラ イマー（Ｂ）を用いて、上記の約３.２ｋｂのＸｂａＩ-ＢａｍＨＩフラグメント に対してＰＣＲ法を適用することによって、ｅｘｌＡ構造遺伝子の３′末端のセ リン及び終止コドンＴＡＡを、ＢａｍＨＩ部位ＧＧＡ ＴＣＣとそれに続く別の ８つのコドン（ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩ部位を含む）で改変することができる 。このセンスプライマーは、本願優先日以降に出願されたＵＮＩＬＥＶＥＲのＷ Ｏ９３/１２２３７号の図１のヌクレオチド８２４〜８４３（ｅｘｌＡ遺伝子の 一部を形成する）に対応する。得られたＰＣＲ生成物をＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩ で消化すると、約１７５ｂｐのＳｃａＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントを単離するこ とができる。ｐＸＹＬ１をＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩで共に限定分解すると、無傷 のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来ＤＮＡとｅｘｌＡプロモーター領域とｅｘｌＡ構 造遺伝子の大半が含まれた約６ｋｂのＳｃａＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントを単離 することができる。 上記の約１７５ｂｐのＳｃａＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントを上記のｐＸＹＬ由 来の約６ｋｂのＳｃａＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントと連結すると、ｐＸＹＬ２と 呼ばれるプラスミドが得られる。このｐＸＹＬ２は、ｅｘｌＡ遺伝子の３′末端 及びターミネーターフラグメントが新たに得られたＳｃａＩ-ＥｃｏＲＩ ＰＣＲ フラグメントで置換されている点でｐＸＹＬ１と異なる。 ３.３ ｐＵＲ４４５５及びｐＵＲ４４５６の構築 ｐＡＷ１４Ｂから出発して、ｐＵＣ１９由来のＥｃｏＲＩ部位を除去してＮｏ ｔＩ部位を導入することによってｐＡＷ１４Ｂ-１０を構築した。 これは、ｐＡＷ１４ＢをＥｃｏＲＩで限定分解して脱リン酸化した後、７.９ ｋｂのＥｃｏＲＩプラスミドを単離して下記“ＥｃｏＲＩ”-ＮｏｔＩリンカー の存在下で再連結することによって遂行した。 ｅｘｌＡ構造遺伝子の上流領域にＥｃｏＲＩ部位を依然として含んでいるプラ スミドを選択して、ｐＡＷ１４Ｂ-１０を得た。かかる選択法は当業者には周知 である。 次に、ＡｆｌIIでｐＡＷ１４Ｂ-１０を限定分解し、その付着末端をフィリン グインした後、単離された線状化プラスミドを再連結することによって、ｅｘｌ Ａターミネーターの下流に位置しているＡｆｌII部位を取り除き、ｅｘｌＡ遺伝 子の終始コドンの近くにＡｆlII部位を依然として含んでいるプラ スミドを選択することによってプラスミドｐＡＷ１４Ｂ-１１を得た。かかる選 択法は当業者には周知である。このプラスミドｐＡＷ１４Ｂ-１１は、エンドキ シラナーゼ又はその一部とＳｃＦｖフラグメントからなる融合タンパク質をコー ドするＤＮＡフラグメントを含む一連の発現プラスミドの構築に使用することが できる。好ましくは、上記２つのタンパクフラグメントはプロテアーゼ認識部位 （例えばＫＥＸ２開裂部位など）で連結される。 （ｉ） ｐＡＷ１４Ｂ-１１をＮｏｔＩ及びＡｆｌIIで切断すると、ｐＵＣ１ ９ベクターとｅｘｌＡターミネーターの一部を含んだ約４.７ｋｂフラグメント が単離できる。 （ii） ｐＸＹＬ２をＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶで切断すると、約３.２ｋｂの フラグメントが単離できる。別法では、ほぼ同じ鎖長のＮｏｔＩ-ＢａｍＨＩフ ラグメントを単離することもできる。 （iii） ｐＵＲ４１５８-ＡをＥｃｏＲＶ及びＡｆｌIIで切断すると、ＫＥＸ ２開裂部位とスペーサー（ＧＧＳ）を含んだ短い（リンカー）ペプチドが前方に 付いたＳｃＦｖ-ＬＹＳをコードする約０.８ｋｂのフラグメントが単離できる。 別法では、ほぼ同じ鎖長のＢａｍＨＩ-ＡｆｌIIフラグメントを単離することが できるが、このフラグメントにはＫＥＸ２開裂部位のコードされたＤＮＡフラグ メントは含まれていない。 Ａ） 成熟型エンドキシラナーゼとＳｃＦｖ-ＬＹＳからなる融合タンパク質 をコードする発現プラスミドの構築には、ｐＡＷ１４Ｂ-１１の約４.７ｋｂ Ｎ ｏｔＩ-ＡｆｌIIとｐＸＹＬ２の約３.２ｋｂ ＮｏｔＩ-ＢａｍＨＩフラグメント とｐＵＲ４１５８-Ａの約０.７５ｋｂ ＢａｍＨＩ-ＡｆｌIIフラグメントを連結 して、ｐＵＲ４４５５を得る。 Ｂ） ＫＥＸ２開裂部位で連結された成熟型エンドキシラナーゼとＳｃＦｖ- ＬＹＳからなる融合タンパク質をコードする発現プラスミドの構築には、ｐＡＷ １４Ｂ-１１の約４.７ｋｂ ＮｏｔＩ-ＡｆｌIIとｐＸＹＬ２の約３.２ｋｂ Ｎｏ ｔＩ-ＥｃｏＲｖフラグメントとｐＵＲ４１５８-Ａの約０.７５ｋｂ ＥｃｏＲＶ -ＡｆｌIIフラグメントを連結して、ｐＵＲ４４５６を得る。 このようにして構築された発現ベクターは従来の同時形質転換法を用いてカビ （例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ、ア スペルギルス・ニデュランスなど）に導入することができ、エンドキシラナーゼ IIプロモーターの誘導によって所望ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ 配列を含むキメラ遺伝子を発現させることができる。上記構築ベクターには、対 応遺伝子を非反復ＮｏｔＩ制限部位に導入することなどによって従来の選択マー カー（例えば、ａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、ハイグロマイシンなど）を与えることも でき、本願優先日以降に公開されたＵＮＩＬＥＶＥＲのＷＯ９３/１２２３７号 の実施例２に記載された方法と基本的に同じ方法で、得られたベクターでカビを 形質転換して所望タンパク質を生産することもできる。 実施例４ （口腔）微生物に対する抗体の遺伝子フラグメントの単離 口腔微生物に対するモノクローナル抗体は文献（Ｄｅ Ｓｏｅｔ他（１９９０ ））に記載されており、その一例は連鎖球菌に対するＯＭＶＵ１０である。これ らのモノクローナル抗体に由来するＳｃＦｖフラグメントを生産するためには、 重鎖及び軽鎖の可変部をコードする遺伝子フラグメントを単離する必要がある。 ハイブリドーマ細胞系統からのＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの調製並びに抗体の可変 部をコードする遺伝子フラグメントのＰＣＲ法による増幅は、文献記載の公知の 常法にしたがって行った。例えばＯｒｌａｎｄｉ他の報文（１９８９）参照。Ｐ ＣＲ増幅には、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。 重鎖フラグメントのＰＣＲ増幅には次のオリゴヌクレオチド対を使用した。 軽鎖フラグメント（κ）のＰＣＲ増幅には次のオリゴヌクレオチド対を使用し た。 こうして得られた重鎖ＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIで切断し て、約０.３３ｋｂのＰｓｔＩ-ＢｓｔＥIIフラグメントを単離した。こうして得 られたフラグメントはｐＵＲ４１５８-Ａにクローニングすることができる。そ れには、ｐＵＲ４１５８-ＡをＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIで切断して、約４.４ｋｂ のベクターフラグメントを単離すればよい。上記のＯＭＶＵ１０重鎖フラグメン トと約４.４ｋｂベクターフラグメントを連結すればｐＵＲ４１５８-Ａ１０Ｈが 得られる。このプラスミドにおいては、当初存在していたリゾチーム抗体の重鎖 フラグメントがＯＭＶＵ１０抗体の重鎖フラグメントによって置換されている。 同様にして得られた軽鎖ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断し て、約０.３ｋｂのＳａｃＩ-ＸｈｏＩフラグメントを単離した。ｐＵＲ４１５８ -Ａ１０ＨをＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断すると、約４.４ｋｂのベクターフラグ メントが得られる。このベクターフラグメントを上記のＯＭＶＵ１０軽鎖フラグ メントと連結すれば、ｐＵＲ４４５７が得られる。このプラスミドにおいては、 リゾチーム抗体の重鎖フラグメント及び軽鎖フラグメントが共にＯＭＶＵ１０抗 体の適切な重鎖及び軽鎖フラグメントによって置換されている。こうして得られ たＯＭＶＵ１０のＳｃＦｖフラグメントをコードする遺伝子を含むｐＵＲ４４５ ７に存在するＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントの塩基配列（配列番号：４１）及 び推定アミノ酸配列（配列番号：４２）を下記に示す。最初の５つのコドン及び 最後の５つのコドンは上述の実施例３.１で示したものであり、ＰｓｔＩ及びＸ ｈｏＩ部位と重複している。 実施例５ ＯＭＶＵ１０ ＳｃＦｖフラグメントの生産のための発現カセットの 構築 ｐＵＲ４４５７（実施例４参照）をＥｃｏＲＶ及びＡｆｌIIで切断すると、Ｋ ＥＸ２開裂部位及びＧＧＳスペーサーを含んだ短い（リンカー）ペプチドが前に 付いたＳｃＦｖ-ＯＭＶＵ１０をコードした約０.８ｋｂのフラグメントが単離で きる。別法では、ＫＥＸ２開裂部位を含まない融合タンパク質をコードした発現 プラスミドの構築用に、約０.７５ｋｂのＢａｍＨＩ-ＡｆｌIIフラグメントを単 離することができる。 このようにして得られるフラグメントを、上記３．３の（i）及び（ii）で得 られたフラグメントと上記３.３のＢ）及びＡ）に記載された方法と同様にして 連結する と、エンドキシラナーゼとＳｃＦｖＯＭＶＵ１０フラグメントを含んでなる融合 タンパク質のコードされたＤＮＡ配列を含む発現プラスミドでＫＥＸ２開裂部位 を含むプラスミド（ｐＵＲ４４６０）とＫＥＸ２開裂部位を含まないプラスミド （ｐＵＲ４４５９）を得ることができる。 実施例３記載の方法と同様にして、得られたプラスミド（場合によって選択マ ーカーを追加したもの）をアスペルギルスに導入することができる。 実施例６ ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）に対する抗体の遺伝子フラグ メントの単離 実施例４とほぼ同様にして、抗ＨＣＧ抗体の重鎖可変部及び軽鎖可変部をコー ドする遺伝子フラグメントを単離したが、これらのフラグメントはプラスミドｐ ＵＲ４１５８-Ａにクローニングしてプラスミド４４５８を得ることができる。 ＳｃＦｖ-ＨＣＧフラグメントのコードされたＰｓｔＩ-ＸｈｏＩフラグメントの 塩基配列（配列番号：７）及び推定アミノ酸配列（配列番号：８）は実施例１. ２に記載した。 実施例７ エンドキシラナーゼのプロモーター及びターミネーター並びにプレプ ロ-“ｇｌａＡ２”をコードするＤＮＡ配列を使用したＳｃＦｖフラ グメントの生産のための発現カセットの構築 ７.１ ｐＡＷ１４Ｂ-１２の構築 ｐＡＷ１４Ｂ-１１（実施例３.３参照）を出発材料としてプラスミドｐＡＷ１ ４Ｂ-１２を構築した。ｐＡＷ１４Ｂ-１１をＡｆｌII（ｅｘｌＡ終止コドンに位 置）及びＢｇｌII（ｅｘｌＡプロモーター内に位置）で切断して、ｅｘｌＡプロ モーターの一部及びｅｘｌＡ遺伝子を含む２.４ｋｂのＡｆｌII-ＢｇｌIIフラグ メントを単離した。このフラグメントをＢｓｐＨＩ（ｅｘｌＡプロモーター内及 びｅｘｌＡ開始コドンに位置）で限定分解した後、単離された１.８ｋｂのＢｇ ｌII-ＢｓｐＨＩ ｅｘｌＡプロモーターフラグメント（ＡＴＧまで）を、下記合 成オリゴヌクレオチドの存在下で、ｅｘｌＡターミネーターを含んだｐＡＷ１４ Ｂ-１１の５.５ｋｂＡｆｌII-ＢｇｌIIフラグメントと連結し て、ｐＡＷ１４Ｂ-１２を得た。 ７.２ 発現カセットの集成 （i） ｐＡＷ１４Ｂ-１２をＢｂｓＩ（限定分解）及びＡｆｌIIで切断した後、 約７.３ｋｂのＢｓｐＨＩ-ＡｆｌIIベクターフラグメントを単離した。 （ii） プラスミドｐＡＮ５６-４（上述のＭ.Ｐ．Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ他 の報文）から、ＡＴＧ開始コドン（ＮｃｏＩ部位と同じ位置にある）で始まるｇ ｌａＡ遺伝子の一部を含み、かつグルコアミラーゼプレプロ部分と成熟型グルコ アミラーゼの最初の５１４残基のアミノ酸（“ｇｌａＡ２”）のコードされた約 １.９ｋｂのＮｃｏＩ-ＥｃｏＲＶフラグメントを単離した。 （iii）プラスミドｐＵＲ４１５８-Ａ（ＫＥＸ２認識部位とＧＧＳスペーサーが 前に付いたＳｃＦｖ-ＬＹＳフラグメントをコードする；実施例３.１参照）、ｐ ＵＲ４４５７（ＫＥＸ２認識部位とＧＧＳスペーサーが前に付いたＳｃＦｖ-Ｏ ＭＶＵ１０フラグメントをコードする；実施例４参照）、及びｐＵＲ４４５８（ ＫＥＸ２認識部位とＧＧＳスペーサーが前に付いたＳｃＦｖ-ＨＣＧフラグメン トをコードする；実施例６参照）の各々から、約０.８ｋｂのＥｃｏＲＶ-Ａｆｌ IIフラグメントを単離した。 （i）ＢｓｐＨＩ-ＡｆｌIIベクターフラグメントと（ii）ＮｃｏＩ-ＥｃｏＲ ＶｇｌａＡフラグメント（ＮｃｏＩ付着末端はＢｓｐＨＩ付着末端と結合し得る ）と（iii）上記ＥｃｏＲＶ-ＡｆｌII ＳｃＦｖフラグメントのいずれかとを連 結すると、次の一群の発現プラスミドを得ることができる。 pUR4462 PexlA-プレプロ-“glaA2”-KEX2-ScFv-LYS pUR4463 PexlA-プレプロ-“glaA2-KEX2”-ScFv-HCG pUR4464 PexlA-プレプロ-“glaA2-KEX2”-ScFv-OMVU10 それらのＮｏｔＩ部位にａｍｄＳ選択マーカーを挿入した後、得られたプラス ミドを実施例３と同様にしてアスペルギルスに導入した。 ７.３ ＳｃＦｖ-ＬＹＳの生産 ｐＵＲ４４６２で形質転換したアスペルギルス・ニガー変種アワモリを１０ｌ 発酵槽で増殖させ、培養培地をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。図 ７にクーマシーブリリアントブルーで染色したゲルを示す。図中の矢印は分泌さ れたＳｃＦｖ-ＬＹＳフラグメントと融合タンパク質及び／又はトランケート型 ｇｌａＡタンパク質を示す。「活性」ＳｃＦｖ-ＬＹＳの量は約２５０ｍｇ/ｌと 測定された。発酵条件又は生産菌株の変異をさらに至適化するとさらに高い生産 レベルが得られることは明白である。参照文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年３月２３日 【補正内容】 請求の範囲 １．形質転換されたカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タンパ ク質を生産する方法にして、 （a）カビがアスペルギルス属に属するものであり、かつ （b）当該アスペルギルスが、プロモーター配列、ターミネーター配列及びシ グナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又は類似物か らなる群から選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領 域の調節下でＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含んでおり、 生産後の任意段階として上記融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント部分を 切り離すためのタンパク分解による開裂段階を含むことを特徴とする方法。 ２．請求項１記載の方法において、上記「少なくとも１つのカビ由来の発現及び ／又は分泌調節領域」が、アスペルギルスのグルコアミラーゼ遺伝子から得られ るプロモーター配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列の両方並びにア スペルギルスのｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター配列の組合わせであることを特 徴とする方法。 ３．請求項１記載の方法において、上記「少なくとも１つのカビ由来の発現及び ／又は分泌調節領域」が、プラスミドｐＡＷ１４Ｂに存在するアスペルギルス・ ニガー変種アワモリのエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ遺伝子）から得ら れることを特徴とする方法。 ４．請求項１記載の方法において、上記ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤ ＮＡ配列が融合タンパク質のコードされたキメラ遺伝子の一部を形成していて、 当該ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列の５′末端の前にカビの分 泌タンパク質の成熟部分をコードする構造遺伝子の少なくとも一部分が存在して いることを特徴とする方法。 ５．請求項４記載の方法において、上記構造遺伝子がエンドキシラナーゼ又はグ ルコアミラーゼをコードしていることを特徴とする方法。 ６．請求項４記載の方法において、上記融合タンパク質において、上記 ＳｃＦｖフラグメントがタンパク分解開裂部位によって上記カビの分泌タンパク 質又はその一部と結合していることを特徴とする方法。 ７．請求項６記載の方法において、上記開裂部位がＫＥＸ２様部位であること を特徴とする方法。 ８．請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法において、上記カビを、 ＳｃＦｖフラグメントの収量が４０ｍｇ/ｌ以上、好ましくは６０ｍｇ/ｌ以上、 さらに好ましくは９０ｍｇ/ｌ以上、さらに一段と好ましくは１５０ｍｇ/ｌ以上 となるような条件下で培養することを特徴とする方法。 ９．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で得られたＳｃＦｖフラ グメント又はその融合タンパク質を含んでなる新規生産物。 １０．請求項９記載の新規生産物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが、下等 真核生物によって十分に発現・分泌される別のＳｃＦｖフラグメントの可変部フ ラグメントのフレームワーク領域に相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植したものか らなる修飾ＳｃＦｖフラグメントであることを特徴とする新規生産物。 １１．請求項１０記載の新規生産物において、上記下等真核生物がアスペルギル ス属のカビであることを特徴とする新規生産物。 １２．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で生産される生産物又は 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項記載の新規生産物を含んだ組成物。 １３．請求項１２記載の組成物において、当該組成物が消費製品であることを特 徴とする組成物。 １４．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが人間の生 態系に存在する化合物を認識する（当該化合物は微生物、酵素その他のタンパク 質であってもよい）ことを特徴とする組成物。 １５．請求項１４記載の組成物において、上記化合物が口腔に存在するものであ ることを特徴とする組成物。 １６．請求項１５記載の組成物において、上記化合物が歯垢、虫歯、歯肉炎、歯 周病又は口臭の形成に関与するものであることを特徴とする組成物。 １７．請求項１４記載の組成物において、上記化合物が人間の皮膚に存在するも のであることを特徴とする組成物。 １８．請求項１７記載の組成物において、上記化合物が悪臭、炎症又は抜け毛の 形成に関与するものであることを特徴とする組成物。 １９．請求項１４記載の組成物において、上記化合物がホルモンであって、当該 組成物が診断目的に使用し得ることを特徴とする組成物。 ２０．請求項１９記載の組成物において、上記ホルモンがヒト絨毛性性腺刺激ホ ルモン（ＨＣＧ）であることを特徴とする組成物。 ２１．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが家畜の生 態系に存在する化合物を認識する（当該化合物は、動物用飼料、酵素その他のタ ンパク質、又は病原体であってもよい）ことを特徴とする組成物。 ２２．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが病気又は 疾患と肯定的又は否定的な関係をもつ化合物を認識するものであって、検出及び ／又はターゲッティングに使用し得るものであることを特徴とする組成物。 ２３．請求項１２記載の組成物において、当該組成物が化学産業、石油産業又は 医薬品産業において触媒として又は検出のために使用することができるものであ ることを特徴とする組成物。 ２４．形質転換されたカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タン パク質を生産する方法にして、 （a）カビがムーコル属、ノイロスポラ属及びペニシリウム属のうちの１種 であり、かつ （b）カビが、プロモーター配列、ターミネーター配列及びシグナル配列の コードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又は類似物からなる群から 選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領域の調節下で ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含んでおり、 生産後の任意段階として上記融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント部分 を切り離すためのタンパク分解による開裂段階を含んでおり、 所望により、上記カビを、ＳｃＦｖフラグメントの収量が４０ｍｇ/ｌ以上 、 好ましくは６０ｍｇ/ｌ以上、さらに好ましくは９０ｍｇ/ｌ以上、さらに一段と 好ましくは１５０ｍｇ/ｌ以上となるような条件下で培養する ことを特徴とする方法。 ２５．請求項２４記載の方法で得られたＳｃＦｖフラグメント又はその融合タン パク質を含んでなる新規生産物。 ２６．請求項２４記載の方法で生産される生産物又は請求項２５記載の新規生産 物を含んだ組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (31)優先権主張番号 ９３２０１７０６．４ (32)優先日 1993年６月14日 (33)優先権主張国 欧州特許機構（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フレンケン、レオン・ゲラルダス・ジョゼ フ オランダ国、エヌエル―3011 エムピー、 ロッテルダム、ゲルダースストラート 90 (72)発明者 ヴァン・ゴルコム、ロバート・エフ・エム オランダ国、エヌエル―2622 ディーイ ー、デルフト、リベリアストラート ７ (72)発明者 ヘッシング、ヨハンナ・ジー・エム オランダ国、エヌエル―2624 ピージー、 デルフト、アデマ・ヴァン・シュルテマプ レーン 38 (72)発明者 ヴァン・デン・ホンデル、コルネリウス・ アントニウス・エム・ジェイ・ジェイ オランダ国、エヌエル―2804 ピーゼッ ト、ゴーダ、ヴァテルレリー 124 (72)発明者 ムスエルス、ヴーター オランダ国、エヌエル―3141 アールディ ー、マースルイス、ヴィッペルスパルク 138 (72)発明者 ヴェルバケル、ヨハネス・マリア・エー オランダ国、エヌエル―3155 ジーシー、 マースランド、インゲランド ９ (72)発明者 ヴェルリップス、コルネリス・テオドラス オランダ国、エヌエル―3142 ケイビー、 マースルイス、ハーグドルン 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．形質転換されたカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タンパ ク質を生産する方法にして、 （a）カビがアスペルギルス属に属するものであり、かつ （b）当該アスペルギルスが、プロモーター配列、ターミネーター配列及びシ グナル配列のコードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又は類似物か らなる群から選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領 域の調節下でＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含んでおり、 生産後の任意段階として上記融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント部分を 切り離すためのタンパク分解による開裂段階を含むことを特徴とする方法。 ２．請求項１記載の方法において、上記「少なくとも１つのカビ由来の発現及び ／又は分泌調節領域」が、アスペルギルスのグルコアミラーゼ遺伝子から得られ るプロモーター配列及びシグナル配列のコードされたＤＮＡ配列の両方並びにア スペルギルスのｔｒｐＣ遺伝子のターミネーター配列の組合わせであることを特 徴とする方法。 ３．請求項１記載の方法において、上記「少なくとも１つのカビ由来の発現及び ／又は分泌調節領域」が、プラスミドｐＡＷ１４Ｂに存在するアスペルギルス・ ニガー変種アワモリのエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ遺伝子）から得ら れることを特徴とする方法。 ４．請求項１記載の方法において、上記ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤ ＮＡ配列が融合タンパク質のコードされたキメラ遺伝子の一部を形成していて、 当該ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列の５′末端の前にカビの分 泌タンパク質の成熟部分をコードする構造遺伝子の少なくとも一部分が存在して いることを特徴とする方法。 ５．請求項４記載の方法において、上記構造遺伝子がエンドキシラナーゼ又はグ ルコアミラーゼをコードしていることを特徴とする方法。 ６．請求項４記載の方法において、上記融合タンパク質において、上記 ＳｃＦｖフラグメントがタンパク分解開裂部位によって上記カビの分泌タンパク 質又はその一部と結合していることを特徴とする方法。 ７．請求項６記載の方法において、上記開裂部位がＫＥＸ２様部位であること を特徴とする方法。 ８．請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法において、上記カビを、 ＳｃＦｖフラグメントの収量が４０ｍｇ/ｌ以上、好ましくは６０ｍｇ/ｌ以上、 さらに好ましくは９０ｍｇ/ｌ以上、さらに一段と好ましくは１５０ｍｇ/ｌ以上 となるような条件下で培養することを特徴とする方法。 ９．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で得ることのできるＳｃ Ｆｖフラグメント又はその融合タンパク質を含んでなる新規生産物。 １０．請求項９記載の新規生産物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが、下等 真核生物によって十分に発現・分泌される別のＳｃＦｖフラグメントの可変部フ ラグメントのフレームワーク領域に相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植したものか らなる修飾ＳｃＦｖフラグメントであることを特徴とする新規生産物。 １１．請求項１０記載の新規生産物において、上記下等真核生物がアスペルギル ス属のカビであることを特徴とする新規生産物。 １２．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法で生産される生産物又は 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項記載の新規生産物を含んだ組成物。 １３．請求項１２記載の組成物において、当該組成物が消費製品であることを特 徴とする組成物。 １４．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが人間の生 態系に存在する化合物を認識する（当該化合物は微生物、酵素その他のタンパク 質であってもよい）ことを特徴とする組成物。 １５．請求項１４記載の組成物において、上記化合物が口腔に存在するものであ ることを特徴とする組成物。 １６．請求項１５記載の組成物において、上記化合物が歯垢、虫歯、歯肉炎、歯 周病又は口臭の形成に関与するものであることを特徴とする組成物。 １７．請求項１４記載の組成物において、上記化合物が人間の皮膚に存在するも のであることを特徴とする組成物。 １８．請求項１７記載の組成物において、上記化合物が悪臭、炎症又は抜け毛の 形成に関与するものであることを特徴とする組成物。 １９．請求項１４記載の組成物において、上記化合物がホルモンであって、当該 組成物が診断目的に使用し得ることを特徴とする組成物。 ２０．請求項１９記載の組成物において、上記ホルモンがヒト絨毛性性腺刺激ホ ルモン（ＨＣＧ）であることを特徴とする組成物。 ２１．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが家畜の生 態系に存在する化合物を認識する（当該化合物は、動物用飼料、酵素その他のタ ンパク質、又は病原体であってもよい）ことを特徴とする組成物。 ２２．請求項１２記載の組成物において、上記ＳｃＦｖフラグメントが病気又は 疾患と肯定的又は否定的な関係をもつ化合物を認識するものであって、検出及び ／又はターゲッティングに使用し得るものであることを特徴とする組成物。 ２３．請求項１２記載の組成物において、当該組成物が化学産業、石油産業又は 医薬品産業において触媒として又は検出のために使用することができるものであ ることを特徴とする組成物。 ２４．形質転換されたカビによってＳｃＦｖフラグメントを含んでなる融合タン パク質を生産する方法にして、 （a）カビがムーコル属、ノイロスポラ属及びペニシリウム属のうちの１種 であり、かつ （b）カビが、プロモーター配列、ターミネーター配列及びシグナル配列の コードされたＤＮＡ配列並びにこれらの機能的誘導体又は類似物からなる群から 選択される少なくとも１つのカビ由来の発現及び／又は分泌調節領域の調節下で ＳｃＦｖフラグメントのコードされたＤＮＡ配列を含んでおり、 生産後の任意段階として上記融合タンパク質からＳｃＦｖフラグメント部分 を切り離すためのタンパク分解による開裂段階を含んでおり、 所望により、上記カビを、ＳｃＦｖフラグメントの収量が４０ｍｇ/ｌ以上 、 好ましくは６０ｍｇ/ｌ以上、さらに好ましくは９０ｍｇ/ｌ以上、さらに一段と 好ましくは１５０ｍｇ/ｌ以上となるような条件下で培養することを特徴とする 方法。 ２５．請求項２４記載の方法で得ることのできるＳｃＦｖフラグメント又はその 融合タンパク質を含んでなる新規生産物。 ２６．請求項２４記載の方法で生産される生産物又は請求項２５記載の新規生産 物を含んだ組成物。