FI114870B - Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella - Google Patents

Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella Download PDF

Info

Publication number
FI114870B
FI114870B FI955446A FI955446A FI114870B FI 114870 B FI114870 B FI 114870B FI 955446 A FI955446 A FI 955446A FI 955446 A FI955446 A FI 955446A FI 114870 B FI114870 B FI 114870B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ser
scfv
fragment
gly
thr
Prior art date
Application number
FI955446A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI955446A0 (fi
FI955446A (fi
Inventor
Cornelis Theodorus Verrips
Leon Gerardus Joseph Frenken
Gorcom Robert F M Van
Johanna G M Hessing
Den Hondel Cornelis Antoni Van
Wouter Musters
Johannes Maria A Verbakel
Original Assignee
Unilever Nv
Tno
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv, Tno filed Critical Unilever Nv
Publication of FI955446A0 publication Critical patent/FI955446A0/fi
Publication of FI955446A publication Critical patent/FI955446A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI114870B publication Critical patent/FI114870B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1 1U870
Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi TRANSFORMOIDULLA HOMEELLA
5 Tämä keksintö koskee yksiketjuisen vasta-ainefragmentin (ScFv-frag-mentin) valmistusta transformoidulla homeella. Tässä hakemuksessa ScFv-fragmentti merkitsee raskaan ketjun muuttuvaa fragmenttia, joka on yhdistetty liitospeptidin avulla kevyen ketjun muuttuvaan fragmenttiin.
10
Keksinnön taustaa
On kuvattu, että ScFv-fragmentteja voidaan valmistaa erilaisissa transformoiduissa mikro-organismeissa, toisissa paremmin kuin toisis-15 sa. Esimerkiksi julkaisusta WO 93/02198 (VTT, Suomi; Teeri ym.), joka on julkaistu 4.2.1993, on tunnettua, että ScFv-fragmentteja voidaan tuottaa ja erittää useissa isäntäorganismeissa (vaikka näistä on esitetty esimerkkinä ainoastaan E. coli ja S. cerevisiae) sillä edellytyksellä, että raskaan ketjun ja kevyen ketjun fragmenttien välillä käytetään erityistä 20 liittäjää. Tämä liittäjä käsittää luonnollisesti erittyneen moni- alueproteiinin tai sen analogin muodostaman joustavan sarana-alueen, joka ei ole homologinen raskaan eikä kevyen ketjun fragmenttien kanssa. Tämä julkaisu WO 93/02198 on liitetty tähän viitteeksi. Julkaisussa WO 93/02198 esitetyn menetelmän huomattavana 25 rajoituksena on siinä esitetty alhainen valmistusaste, joka on huomattavasti heikompi kuin kuluttajille kohtuulliseen hintaan käytettä-! : väksi tarjottavien ScFv-fragmenttien vaadittava valmistusaste. Tällaisia kulutushyödykkeitä ovat esimerkiksi puhdistusaineet, elintarvikkeet ja henkilökohtaiseen puhtauteen tarkoitetut tuotteet, kuten saippua ja kai-30 nalohygieniatuotteet. Näin ollen tarvitaan yleisempää suurituottoista ScFv-fragmenttien valmistusmenetelmää. ScFv-fragmenttien valmistus E. coli -bakteereissa antaa suhteellisen heikon tuoton ja vaatii bakteerien sisällä muodostuneiden proteiinien liukoistamista ja tämän jälkeen uudelleennaturointia, mistä syystä tämän menetelmän avulla on hanka-35 la valmistaa vasta-ainefragmentteja, joita on käytettävä suhteellisen suuria määriä (ks. julkaisu WO 93/02198, s. 3, r. 5—23). Yritettäessä valmistaa erilaisia ScFv-fragmentteja hiivoissa käyttämällä ilmentä-mismenetelmiä, joilla on tuotettu erilaisia heterologisia entsyymejä hit- 2 114870 tävän suuria määriä käytettäväksi kaupallisesti kulutushyödykkeissä tämän keksinnön yhteydessä on havaittu, että ScFv-fragmentteja ei erittynyt lainkaan tai niitä erittyi vain hyvin pieniä määriä. Tämä on johdonmukaista julkaisun WO 93/02198 sivuilla 29—31 esitetyn esimer-5 kin 2 kanssa, joka liittyy ScFv-fragmentin valmistukseen hiivassa ilman, että on esitetty valmistettua määrää. Vaikka julkaisussa WO 93/02198 on mainittu useita vaihtoehtoisia liittäjiä, sivulla 6 esitetään, että '•erittyvistä liitospeptideistä ei ole julkaistuja analyysi- tai rakenne-raportteja" ja "tähän mennessä ei ole julkaistu esimerkkejä uusista fuu-10 sioproteiineista, joissa on lisättyjä heterologisia liitos sekvenssejä, joita erittyy isäntäorganismin kasvualustaan".
Toisessa uudehkossa julkaisussa, nimittäin WO 92/01797 (Oy Alko Ab), joka on julkaistu 6.2.1992, on kuvattu immunoglobuliinien valmis-15 tus Trichoderma-homeessa. Sivuilla 83—85 esitetyssä esimerkissä 20 ja kuvassa 27 kuvataan sellaisen toiminnallisen geenin rakennetta ja ilmentymistä, joka koodaa yksiketjuista vasta-ainetta, joka sisältää muuttuvia alueita sekä kevyessä että raskaassa ketjussa, jotka on liitetty toisiinsa joustavalla CBHI:n sarana-alueella (CBHI on cellobio-20 hydrolaasi I, jota esiintyy suurina määrinä Trichoderma reesei:n kasvualustassa; ks. julkaisu WO 92/01797, s. 3). Geeni oli T. reesei cbhi -lopettajan ja joko T. reesei cbhi -promoottorin (plasmidi pEN401) tai Aspergillus gpd -promoottorin (plasmidi pEN402) ohjauksessa. Trichoderma reesei -kanta RUT-C-30 (ATCC 56765) transformoitiin 25 plasmideilla, ja muunnoksia kasvatettiin kahdessa eri kasvualustassa, i' Immunoreaktiivisten yksiketjuisten vasta-aineiden ilmentymistä i testattiin kasvualustan supematanteissa, mutta tuloksia ei ole mainittu.
Näin ollen ei osoitettu, että mitään määriä yksiketjuisia vasta-aineita itse asiassa muodostui. Tämä päätelmä on yhdenmukainen 30 myöhemmän Nyyssösen ym. julkaisun kanssa, VTT Biotekniikan
Laboratorio, Suomi (1993), jossa kuvataan osittain samoja kokeiluja plasmideilla pEN304, pAJ202 ja pEN209, jotka koodaavat vastaavasti 23,3 kD kevyttä ketjua, 23,9 kD raskasta Fd-ketjua ja 73,2 kd CBHI-raskasta Fd-ketjua, ja jotka plasmidit on myös esitetty esimerkkeinä 35 julkaisussa WO 92/01797. Tässä julkaisussa kuvataan vain yksittäisen kevyen ketjun tai yksittäisen raskaan ketjun valmistus sellaisenaan tai esiasteena Trichoderma reesei -kannan avulla, mutta ei kuvata 3 114870 sellaisen ScFv-fragmentin valmistusta, joka sisältää kevyen ketjun, joka on yhdistetty liitospeptidin avulla raskaaseen ketjuun.
Näin ollen tarvitaan vielä vaihtoehtoinen menetelmä ScFv-frag-5 menttien valmistamiseksi ja erittämiseksi hiivassa, joka antaa halutun ScFv-fragmentin ainakin kohtuullisen tuoton. Tässä keksinnössä esitetään tällainen valmistus käyttämällä Aspergillus -suvun transformoitua hometta.
10 M. Wardin ym. mukaan (1990), ks. myös Genencorin hakemusjulkaisua WO 90/15860, joka on julkaistu 27.12.1990, halutun proteiinin valmistusta Aspergilluksessa ja sen erittymistä sen jälkeen voidaan parantaa valmistamalla fuusioproteiini, joka käsittää halutun proteiinin ja home-proteiinin. Esimerkkinä valmistettiin prochymosiinia, jonka aminopää 15 yhdistettiin A. awamori -glukoamylaasin karboksyylipäähän. Julkaisussa ei kuitenkaan esitetä, että tällainen menetelmä soveltuisi myös ScFv-fragmenttien valmistukseen, jotka yhdisteet ovat tunnetusti vaikeasti valmistettavia ja erittyviä mikrobi-isännässä (ks. em. julkaisu WO 93/02198).
20
Unileverin kansainvälisessä ei aikaisemmin julkaistussa hakemuksessa, joka on julkaistu 24.6.1993 numerolla WO 93/12237 ja jossa pyydetään etuoikeutta päivämäärältä 9.12.1991, kuvataan menetelmä halutun proteiinin valmistamiseksi ja erittämiseksi '·’ 25 transformoidulla homeella, jossa menetelmässä ilmentymistä ja/tai erittymistä säätelevät alueet saadaan Aspergillus niger var. awamorin endoksylanaasi II -geenistä (exM-geeni), joka esiintyy plasmidissa pAW14B (ks. julkaisun WO 93/12237 kuva 3), joka esiintyy transformoidussa E. coli -kannassa JM109, joka on Budapestin sopi-30 muksen mukaisesti 31.5.1990 talletettu numerolla CBS 237.90 laitokseen Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, Alankomaat.
, :.' Edullisessa suoritusmuodossa haluttu proteiini voi olla osa fuusio- proteiinia, joka käsittää halutun proteiinin, jonka NH2-pään edellä on ai- • · nakin osa endoksylanaasi ll-proteiinia. ScFv-fragmenttien valmistuk-35 sesta ei ole mainintaa.
4 1U870
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa menetelmän ScFv-fragmentteja käsittävien fuu-sioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella, jossa 5 (a) home kuuluu Aspergillus -sukuun ja (b) Aspergillus käsittää DNA- sekvenssin, joka koodaa ScFv-fragmenttia ainakin yhden ilmentymistä ja/tai erittymistä säätelevän homeesta peräisin olevan alueen ohjaamana, joka on valittu ryhmästä, joka muodostuu promoottorisekvensseistä, lopetussekvensseistä ja signaalisekvenssejä 10 koodaavista DNA-sekvensseistä ja näiden toiminnallisista joh dannaisista tai niiden analogeista, minkä jälkeen mahdollisesti seuraa proteolyyttinen katkaisuvaihe ScFv-fragmenttiosan erottamiseksi fuusioproteiinista. Yhdessä suoritusmuodossa "ainakin yksi homeesta peräisin oleva ilmentymistä ja/tai erittymistä säätelevä alue" käsittää 15 Aspergilluksen glukoamylaasigeenistä saadun sekä promoottorisekvenssin että signaalisekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin, ja Aspergilluksen frpC-geenin lopetussekvenssin yhdistelmän tai ainakin yhden sen toiminnallisen johdannaisen tai analogin. Toisessa suoritusmuodossa "ainakin yksi homeesta peräisin 20 oleva ilmentymistä ja/tai erittymistä säätelevä alue" on valittu promoottorista, signaalisekvenssiä koodaavasta DNA-sekvenssistä ja lopetussekvenssistä, joka on saatu Aspergilluksen en-doksylanaasigeenistä, erityisesti Aspergillus niger var. awamorin en-doksylanaasi ll-geenistä (exIA-geeni), joka esiintyy em. plasmidissa 25 pAW14B, tai ainakin yhdestä niiden toiminnallisesta johdannaisesta tai analogista.
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa ScFv-fragmenttia koodaava DNA-sekvenssi muodostaa osan fuusioproteiinia koodaavasta kimee-30 risestä geenistä, jolloin mainitun ScFv-fragmenttia koodaavan DNA-sekvenssin edellä sen 5-päässä on ainakin osa rakennegeeniä, joka koodaa erittyneen homeproteiinin kypsää osaa, erityisesti kypsää Aspergillus-jproXemia, kuten kypsää glukoamylaasiproteiinia tai kypsää endoksylanaasiproteiinia. Jos fuusioproteiinin ScFv-fragmentti on 35 liittyneenä tai sitoutuneena mainittuun erittyneeseen homeproteiiniin tai sen osaan proteolyyttisessä katkaisukohdassa, kuten KEX2:n kaltaisessa kohdassa, on mahdollista poistaa homeproteiini tai sen osa ScFv-fragmentista siten, että saatu vasta-ainefragmentti on mahdolli- 5 1T 4870 simman pieni, mikä voi olla hyvin edullista sovellusten kannalta. Tässä tapauksessa keksinnön mukainen menetelmä käsittää proteolyyttisen katkaisuvaiheen ScFv-fragmenttiosan erottamiseksi fuusioproteiinista ScFv-fragmentin käsittävän fuusioproteiinin valmistuksen jälkeen. On 5 havaittu, että voidaan saada valmistusmääriä, jotka ovat vähintään 40 mg ScFv-fragmenttia litraa kohti, tai jopa vähintään 60mg/l, maksimissaan jopa jonkin verran yli 90 mg/l (ks. taulukko 2 jäljempänä), mutta voidaan ennakoida, että lisäoptimoinnin jälkeen voidaan saada vähintään 150 mg/l kasvattamalla ravistelupulloissa.
10 Edelleen saatiin jo yli 150mg:n valmistusmääriä ScFv-fragmenttia litraa kohti kasvattamalla käymisastioissa; näin ollen voidaan olettaa, että lisäoptimoinnilla voidaan saada vähintään 250 ml/l tai jopa vähintään 500 mg/l ja todennäköisesti vähintään 1 g/l.
15 Keksintö tarjoaa myös uusia ScFv-fragmentin tai sen fuusiotuotteen sisältäviä valmisteita, joita voidaan saada keksinnön mukaisella menetelmällä. Tällaisessa uudessa tuotteessa ScFv-fragmentti voi olla modifioitu ScFv-fragmentti, joka käsittää täydentäviä määritysalueita (CDR), joita on siirretty sellaisen toisen ScFv-fragmentin muunnos-20 fragmenttien kehysalueille, jota ilmenee ja erittyy alemmassa eukaryootissa, etenkin Aspergillus -suvun homeessa. Keksintö tarjoaa myös koostumuksen, erityisesti kulutushyödykkeitä, joista edellä on annettu esimerkkejä, joka sisältää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun tuotteen tai edellä kuvatun uuden tuotteen. Keksinnön I · • 25 erityisen suoritusmuodon mukaan ScFv-fragmentti tunnistaa ihmisen ekosysteemissä olevan yhdisteen, joka voi olla mikro-organismi, entsyymi tai muu proteiini. Yhden edullisen suoritusmuodon mukaan , ; j kyseessä ovat yhdisteet, joita esiintyy suuontelossa, erityisesti V; yhdisteet, jotka osallistuvat plakin, karieksen, ientulehduksen, hammas- 30 sairauksien tai pahanhajuisen hengityksen syntymiseen. Toisen : edullisen suoritusmuodon mukaan kyseessä oevat yhdisteet, joita esiintyy ihmisen ihossa, erityisesti yhdisteet, jotka osallistuvat pahan > I 1 hajun, tulehdusten tai hiustenlähdön syntymiseen. Keksinnön yksi eri-. ·; tyinen suoritusmuoto koskee koostumusta, jota voidaan käyttää diag- •’ i 35 nosointitarkoituksiin ja jossa yhdiste on hormoni, erityisesti ihmisen korioninen gonadotropiini (HCG).
» > * * I » 6 114870
Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaan ScFv-fragmentti tunnistaa yhdisteen, jota esiintyy kotieläinten tai karjan ekosysteemissä ja joka voi olla eläinrehun komponentti, entsyymi tai muu proteiini, tai sairauksia aiheuttava tekijä.
5
Vielä yhden suoritusmuodon mukaan keksintö tarjoaa koostumuksen, jossa ScFv-fragmentti tunnistaa yhdisteen, jolla on myönteinen tai kielteinen suhde sairauteen tai häiriöön ja jota voidaan käyttää esimerkiksi tunnistus- ja/tai kohdistustarkoituksiin.
10
Keksintö koskee myös keksinnön mukaista koostumusta, jota voidaan käyttää kemian-, öljy- tai lääketeollisuudessa katalyyttinä tai tunnistus-tarkoituksiin.
15 Vaikka keksintö kehitettiin sillä perusteella, että ScFv-fragmentteja valmistetaan Aspergillus -suvun homeessa, kuten jäljempänä esimerkeissä selostetaan, on ennakoitavissa, että keksintöä voidaan soveltaa myös muissa homeissa, jotka on valittu erityisesti suvuista Mucor, Neu-rospora ja Penicillium.
20
Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuva 1 on kaaviokuva plasmidista pAN52-10, 25 kuva 2 on kaaviokuva plasmideista pUR4155 ja pUR4157, kuva 3 on kaaviokuva plasmidista pAN56-7, kuva 4 on kaaviokuva plasmideista pUR4159 ja pUR4161, /;·! 30 kuva 5 esittää Western blot -analyysiä, jossa näkyy geeliektroforeesissa 12,5%:isessa SDS-PAGE -geelissä proteiineja, jotka reagoivat Fv-lysotsymin antiseerumin ‘ kanssa. Juova 1: E. coli -uute, joka sisältää ScFv- 35 lysotsymiä; juova 2: Fv-lysotsymi; juovat 3—8 sisältävät AWC(M)41-muunnosten ja A. niger var. awamori -mutantti #40 -kannan väliainenäytteitä; juovat 3 ja 4: AWC(M)4161-muunnos (prepro-"glaA2"-KEX-ScFv-HCG); juova 5: 7 114870 AWC4159 (prepro-"glaA2"-KEX-ScFv-LYS); juova 6: mutantti #40; juova 7: AWC4157 (18aa glaA-ScFv-HCG); juova 8: AWC4155 (18aa glaA-ScFv-LYS).
5 Kuva 6 on kartta plasmidista pAW14B, joka on saatu lisäämällä 5,3 kb Sa/l-fragmentti, joka käsittää Aspergillus niger var. awamorin ex/A-geenin pUC19:n Sa/l-kohdassa.
Kuva 7 esittää Coomassie Brilliant Blue -värjättyä polyakrylamidi-10 geeliä, jossa on proteiineja plasmidilla pUR4462 transfor moidun Aspergillus niger var. awamorin kasvualustassa. Kuvassa näkyvät lisäksi juovat, jotka edustavat (i) vapautunutta ScFv-LYS-fragmenttia ja (ii) glaA-KEX2-ScFv-LYS-fuusioproteiinia ja/tai katkaistua glaA-proteiinia.
15
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Nyt on havaittu, että edellä mainituissa julkaisuissa M. Ward ym. (1990) ja WO 90/15860 (jossa haluttua proteiinia koodaava geeni muodostaa 20 osan kimeeristä geeniä, joka käsittää lisäksi glukoamylaasiproteiinia koodaavan geenin) samoin kuin edellä kuvatussa keksinnön edullisessa suoritusmuodossa, joka on kuvattu Unileverin em. ei aikaisemmin julkaistussa julkaisussa WO 93/12237 (jossa haluttua proteiinia koodaava geeni muodostaa osan kimeeristä geeniä, joka 25 käsittää lisäksi ainakin osani endoksylanaasiproteiinia koodaavan geenin), esitettyjä kehityskulkuja voidaan edullisesti soveltaa ScFv-fragmenttien valmistukseen siten, että haluttu proteiini on ScFv-fragmentti. Tämä pätee erityisesti silloin, kun tuloksena saatavassa fuusioproteiinissa esiintyy proteolyyttinen katkaisukohta erittyneen 30 homeproteiiniosan tai sen fragmentin ja ScFv-osan välillä. Edullinen katkaisukohta on KEX2:n kaltainen kohta, jonka ovat kuvanneet Fuller ym. (1988), Contreras ym. (1991) ja Calmels ym. (1991), mutta myös muita katkaisukohtia voidaan käyttää edellyttäen, että ne eivät ole ScFv-fragmentissa. Muut katkaisukohdat voidaan valita Matthewsin ja 35 Wellsin (1993) esittämän menetelmän perusteella. Jäljempänä esitettävissä esimerkeissä prepro-glukoamylaasiproteiinin pro-osa käsittää KEX2-tyyppisen tunnistuskohdan, ks. esimerkki 2.4 (i).
8 114870
ScFv-fragmentit, jotka tunnistavat suuontelossa tai ihmisen ihossa olevia mikro-organismeja, ovat tärkeitä tämän keksinnön puitteissa, koska ne voivat mahdollisesti estää näiden mikro-organismien kasvun tai aineenvaihdunnan. Tiettyjen suuontelossa olevien mikro-organismien ar-5 vedaan liittyvän plakin, karieksen, ientulehduksen tai hammassairauksien ym. syntyyn, kun taas ihmisen iholla olevat mikro-organismit liittyvät mm. pahan hajun muodostumiseen. Keksinnön mukaisesti valmistetut ScFv-fragmentit voivat vaikuttaa joko sellaisenaan tai sitoutuneina muihin yhdisteisiin, joilla on mainittuihin mikro-organismeihin estävä 10 vaikutus.
Voidaan myös ennakoida, että tämän keksinnön mukaisesti muita muunnettuja ScFv-fragmentteja voidaan valmistaa siirtämällä täydentävä määritysalue (CDR) sellaisen ScFv-fragmentin muuttuvien 15 fragmenttien kehysalueille, joka ilmenee ja erittyy hyvin
Aspergilluksessa; vrt. CDR:ien siirto ihmisen immunoglobuliineihin, jonka ovat kuvanneet esimerkiksi Jones ym. (1986). Nämä CDR:t voidaan saada yleisistä vasta-aineista. Sekä CDR:n sitoutumisominaisuudet että ScFv-fragmentin jäännös voidaan 20 optimoida satunnaisella tai kohdistetulla mutageneesillä. Tällöin keksinnön mukaisessa menetelmässä yhdestä vasta-aineesta peräisin olevat CDR:t voidaan siirtää toisen ScFv-fragmentin muuttuvien fragmenttien kehysalueille.
25 Jotka keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut ScFv-fragmentit tai niiden fuusiotuotteet voivat olla vanhoja, mutta useat ScFv-fragmentit tai niiden fuusiotuotteet ovat uusia tuotteita. Näin ollen keksintö tarjoaa myös uusia ScFv-fragmentteja tai niiden i fuusiotuotteita, joita voidaan saada keksinnön mukaisella menetelmällä.
30 Tällaisella menetelmällä saatavia tuotteita voidaan käyttää erilaisiin sovelluksiin tarkoitetuissa koostumuksissa. Näin ollen keksintö koskee myös koostumuksia, jotka sisältävät keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun tuotteen. Tämä koskee sekä vanhoja että uusia tuotteita.
V·: 35
Esimerkeissä 3 ja 5 mainitun ex/A-promoottorin, exlA:n signaali-sekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin ja ex/A-lopettajan yhdistelmän asemesta voidaan käyttää myös muita yhdistelmiä, kuten esimerkissä 7 9 1U870 mainittua ex/A-promoottorin, glaA.n signaalisekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin ja ex/A-lopettajan yhdistelmää, mutta yleensä valinta voidaan tehdä mistä tahansa homeperäisestä promoottorista, homeperäisestä signaalisekvenssiä koodaavasta DNA-sekvenssistä ja 5 homeperäisestä lopetussekvenssistä ilmentymää ja/tai eritystä säätelevinä alueina. Erityisenä suoritusmuotona on yhdistelmä, jossa sekä promoottorisekvenssi että signaalisekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi on peräisin Aspergillusin glukoamylaasigeenistä ja Aspergillusin trpC-geenin lopetussekvenssi.
10
Erittynyt homeproteiini, joka muodostaa osan keksinnön mukaisesta fuusioproteiinista, voidaan yleisesti saada mistä tahansa erittyneestä homeproteiinista esimerkeissä esitettyjen Aspergillus niger var. a iva-morin endoksylanaasi ll-proteiinin (ks. esimerkit 3 ja 5) ja Aspergillusin 15 glukoamylaasin (ks. esimerkki 7) lisäksi.
Esimerkin 2.6.1b taulukossa 2 on esitetty, että suurin ilmentymä ja eri-tystuotos saatiin, kun homeproteiini muodostettiin sen prepro-osasta, jota seurasi huomattava osa sen kypsästä proteiinista, joka liittyi ScFv-20 fragmenttiin jälleen homeproteiinin pro-osalla, joka sisälsi KEX2 -tyyppisen katkaisukohdan. Pieni yhdistinpeptidi voi sijaita ScFv-fragmentin ja KEX2:n kaltaisen lohkeamiskohdan välillä (ks. plasmidit pUR4159 ja pUR4163 ja johdannaiset) tai viimemainitun ja kypsän homeproteiinin osan välillä. Tällöin keksintö tarjoaa laajimmassa 25 merkityksessään menetelmän ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien tuottamiseksi transformoidulla homeella, joka kuuluu ;·’ Aspergillus-sukuun, ja Aspergillus käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa ScFv-fragmenttia ainakin yhden sellaisen ilmentymää ja/tai erittymistä säätelevän homeesta saadun alueen ohjauksessa, joka on 30 valittu ryhmästä, joka koostuu promoottorisekvensseistä, lopetussekvensseistä ja signaalisekvenssiä koodaavista DNA-sekvensseistä tai niiden toiminnallisista johdannaisista tai analogeista.
Keksintöä havainnollistetaan seuraavissa esimerkeissä.
i\i 35 10 1 1 4870
Esimerkki 1 VH- ja VL-alueita koodaavien vasta-ainegeenifrag-menttien eristäminen ja ScFv-geenien muodostaminen.
5 RNA:n eristäminen hybridoomasolulinjoista, cDNA:n valmistus ja raskaiden (VH) ja kevyiden (VL) vasta-aineketjujen muuttuvia alueita koodaavien geenifragmenttien vahvistaminen PCR:llä suoritettiin kirjallisuudesta tunnetun tekniikan tason mukaisilla standardimenetelmillä (ks. esim. Orlandi ym., 1989). Esimerkeissä 10 kuvatut yleismenetelmät suoritettiin Sambrookin ym. menetelmällä, ellei muuta ole osoitettu.
VH- ja VL-geenifragmenttien kloonauksen ja nukleotidisekvenssin määrityksen jälkeen niitä voidaan käyttää sellaisten ilmentymisplasmi-15 dien rakennusaineina, jotka koodaavat esim. Fv- tai ScFv-vasta-aine-fragmentteja. ScFv-vasta-ainefragmenteissa VH- ja VL-ketjut yhdistetään peptidiliittäjän avulla. Tämä saadaan aikaan konstruoimalla (kimeerinen) geeni, jossa VH- ja VL-ketjuja koodaavat geenifragmentit yhdistetään liitospeptidiä koodaavalla nukleotidisekvenssillä.
20 Muuttuvien ketjujen järjestys voi olla VH-liittäjä-VL tai VL-liittäjä-VH. Seuraavissa kokeissa käytetään peptidiliittäjää, jonka sekvenssi on (GGGGS)3 (sekvenssi nro 1).
1.1 ScFv-anti-lysotsymin muodostaminen v 25 . Plasmidi pScFv-LYS-myc saatiin G. VVinteriltä ja sen on kuvannut S.
;:· Ward ym. (1989). Tämä pUC19:stä saatu plasmidi sisältää geenifrag- mentin, joka koodaa kananmunanvalkuaisen lysotsyymin vasta-ai-! neen D1.3 VH- ja VL-fragmentteja. VH-fragmentin edellä on PelB-erityk- 30 sen signaalisekvenssi, VH- ja VL-fragmentit on liitetty (GGGGS)3-pep-tidiliittäjän avulla (sekvenssi nro 1) ja VL-fragmentin jatkona on 11 aminohapon myc-merkitsin. Seuraavassa esitetään monoklonaali-sen anti-lysotsyymi-vasta-aineen D1.3 PelB -signaalisekvenssin edeltämää ja myc-hännän seuraamaa ScFv-fragmenttia koodaavan 35 H/ndlll-EcoRI-fragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssi nro 2) ja : · ·: päätetty aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 3).
n 114870
ScFv-LYS-myc:n nukleotidi- ja päätelty aminohapposekvenssi
Jiindlll .....
1 AAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATACCT 50 M K Y L > PelB ss 51 ATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGA 100
LPTAAAGLLLLAAQPA
. PstI ....
101 TGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCA 150 MAQVQLQESGPGLVAPS > Vh * · * · · 151 CAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTA 200
QSLSITCTVSGFSLTGY
> • · · · · 201 TGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGG 250 GVNWVRQPPGKGLEWL CDR I < • · · * · 251 GAATGATTTGGGGTGATGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCC 300 GMIWGDGNTDYNSALKS > CDR II < 301 AGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAAT 350
RLSISKDNSKSQVFLKM
351 GAACAGTCTGCACACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAGA 400
·· NSLH TDDTARYY CARE
>
, ... BstEII
M · 401 GAGATTATAGGCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCC 450 RDYRLDYWGQGTTVTVS : CDR III < 451 TCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGA 500
SGGGGSGGGGSGG GGSD
: > Linker < > * 12 1 1 4870
SacI .....
501 CATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGTCTGTGGGAGAAA 550
IELTQSPASLSASVGE VI
• · · · · 551 CTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCA 600
TVTITCRASGNIHNYLA
> CDR I < • · · · · 601 TGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATTATAC 650
WYQQKQGKSPQLLVYYT
> 651 AACAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAG 700 TTLADGVPSRFSGSGS CDR II < 701 GAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGGG 750
GTQY SLKINSLQPEDFG
751 AGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCTCGGACGTTCGGTGGAGG 800 SYYCQHFWSTPRTFGGG > CDR III <
Xhol ....
801 CACCAAGCTCGAGATCAAACGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATC 850 TKLEIKREQKLISEED : > myc tail
! . Bel I . BamUl EcoRI
I* 851 TGAATTAATAATGATCAAACGGTAATAAGGATCCAGCTCGAATTC 895 ί L N * * * 5 13 1 1 4870 10 _
Plasmidista pUC19 peräisin olevan pScFv-LYS-myc:n myc-merkitsimen poistamiseksi ΧΛοΙ-EcoRI-fragmentti korvattiin uudella synteettisellä fragmentilla, jolla on seuraava sekvenssi: 15 E I K R * * (SEQ. ID. NO: 6) 5'- TC GAG ATC AAA CGG TAA TGA G -3' (SEQ. ID. NO: 4) 3'- C TAG TTT GCC ATT ACT CTT AA -5' (SEQ. ID. NO: 5)
Xhol EcoRI
viemällä TAA-translaationlopetuskoodoni VL-geenifragmentin perään.
20 Näin saadulle plasmidille annettiin nimitys pUR4121. Tämän jälkeen noin 820emäsparin H/ndlll-EcoRI-fragmentti, joka koodaa ScFv-LYS:iä, erotettiin ja kloonattiin pEMBL9 -johdettuun plasmidiin (Dente ym. 1983), joka käsiteltiin samoilla entsyymeillä, jolloin saatiin plasmidi PUR4129.
25 1.2 Anti-ihmisen korioninen gonadotropiini -ScFv:ä koodaavan geenin rakentaminen
Ihmisen korioninen gonadotropiini (HCG) on raskaushormoni. Unilever 30 on kehittänyt raskaustestin, joka perustuu HCG:n tunnistamiseen virtsassa monoklonaalisten vasta-aineiden avulla, ja Unipath markkinoi sitä tavaramerkillä Clearblue®. Geenifragmentteja, jotka koodaavat ihmisen korionisen gonadotropiinin monoklonaalisen vasta-aineen raskaiden ja kevyiden ketjufragmenttien muuttuvia alueita, saatiin 35 hybridoomasolulinjasta edellä kuvatulla tavalla. Tämän jälkeen nämä HCG:n VH- ja VL-geenifragmentit kloonattiin plasmidin pUR4129 korvaamalla vastaavat Pst\-BstE\\- ja Sac\-Xho\-an\\-lysotsyymigeenifragmentit, jolloin saatiin plasmidi pUR4138.
14 1 1 4870
Seuraavassa esitetään antMhmisen korionisen gonadotropiinin (anti-HCG) vasta-aineen ScFv-fragmenttia koodaavan Pst\-Xho\-geenifragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssi nro 7) ja päätetty aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 8).
5
ScFv-HCG:n nukleotidisekvenssi ja siitä päätelty aminohappo-sekvenssi
PstI .....
1 CTGCAGGAGTCTGGGGGACACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACT 50
LQESGGHLVKPGGSLKL
« « · · · 51 CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTTTGACATGTCTTGGA 100
SCAASGFAFSSFDMSW
> CDR I < 101 TTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAAGCATTACTAAT 150
IRQTPEKRLEWVASITN
> 151 GTTGGTACTTACACCTACTATCCAGGCAGTGTGAAGGGCCGATTCTCCAT 200 VGTYTYYPGSVKGRFSI CDR II < 201 CTCCAGAGACAATGCCAGGAACACCCTAAACCTGCAAATGAGCAGTCTGA 250
SRDNARNTLNLQMSSL
251 GGTCTGAGGACÄCGGCCTTGTATTTCTGTGCAAGACAGGGGACTGCGGCA 300
; j' RSEDTALYFCARQGTAA
Λ >
·'· .... BstEII
301 CAACCTTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT 350
:: QPYWYFDVWGQGTTVTV
CDR III < * · · · · · ‘; I. * 351 CTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAT 4 00
.·: SSGGGGSGGGGSGGGG
> Linker ,; Sad ....
; 401 CGGACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATCCATGTCCATGTCCGTAGGA 450
SDIELTQSPKSMSMSVG ; ‘ : < > VI
. i . » * 114870 15
451 GAGAGGGTCACCTTGAGCTGCAAGGCCAGTGAGACTGTGGATTCTTTTGT 500 ERVTLSCKASETVDSFV
> CDR I
501 GTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAACAGTCTCCTAAATTGTTGATATTCG 550
5 SWYQQKPEQSPKLLIF
< > 551 GGGCATCCAACCGGTTCAGTGGGGTCCCCGATCGCTTCACTGGCAGTGGA 600 GASNRFSGVPDRFTGSG CDR II < 10 • · · ♦ ♦ 601 TCTGCAACAGACTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACTT 650
SATDFTLTISSVQAEDF
651 TGCGGATTACCACTGTGGACAGACTTACAATCATCCGTATACGTTCGGAG 700 ADYH'CGQTYNHPYTFG 15 > CDR III < . Xhol 701 GGGGGACCAAGCTCGAG 717
G G T K L E
Esimerkki 2 ScFv-ilmentymäkasettien muodostaminen käyttäen 20 g/aA-promoottorijärjestelmää ja siirtämällä se As- pergiIIukseen 2.1 ScFv-ilmentymäkasettien muodostaminen käyttäen glukoamylaasin 18 aminohapon signaalisekvenssiä (pl)R4155 ja pUR4157) 25
Plasmidin pEMBL9 monikloonauskohta (alkaen EcoRkstä ja päättyen H/ndlll-kohtaan) korvattiin synteettisellä DNA-fragmentilla, jolla on seu-raava nukleotidisekvenssi.
30 Synteettisen EcoRI-H/ndlll-fragmentin nukleotidisekvenssi, joka kloonattiin pEMBL9:ssä ja jota käytettiin pUR4153:n valmistamiseksi ; ; _18 amino acid signal sequence of MGFRSLLALSGLV : AAT TCC ATG GGC TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC — ; GG TAC CCG AAG GCT AGA GAT GAG CGG GAC TCG CCG GAG CAG — i : EcoRI Ncol . · > i » 16 1 1 4870 alucoamvlase_ N-term ScFv_ _C-terro CTGLAQVQLQ *VTK — TGC ACA GGG TTG GCA CAG GTG CAG CTG CAG TAA GTG ACT AAG — 5 — ACG TGT CCC AAC CGT GTC CAC GTC GAC GTC ATT CAC TGA TTC —
PstI
ScFv_ L E I K R * * (SEQ. ID. NO: 11-12) — CTC GAG ATC AAA CGG TGA TA (SEQ. ID. NO: 9) 10 — GAG CTC TAG TTT GCC ACT ATT CGA (SEQ. ID. NO: 10)
Xhol Hindlll
Nukleotidisekvenssin 5’-osa koodaa glaA-signaalisekvenssiä (amino-15 hapot 1—18), jota seuraa vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvan osan ensimmäiset 5 aminohappoa. 3'-osa koodaa vasta-aineen kevyen ketjun muuttuvan osan 5 viimeistä aminohappotähdettä. Näin saadulle plasmidille annettiin nimitys pUR4153.
20 Plasmidit pUR4154 ja pUR4156 saatiin seuraavasti: Plasmidi pUR4129 (esimerkki 1.1) käsiteltiin Psfkllä ]aXho\:\\ä, minkä jälkeen noin 0,7 kb:n DNA-fragmentti erotettiin agaroosigeelistä. Tämä fragmentti koodaa katkaistua ScFv-LYS-fragmenttia, josta puuttuvat DNA-sekvenssit, jotka koodaavat 5 N-pään ja 5 C-pään aminohappoa. Samalla tavalla ero- » ·' 25 tettiin noin 0,7 kb:n Psfl-X/70l-fragmentti plasmidista pUR4138 (esi- |* merkki 1.2), joka koodaa samoin katkaistua ScFv-HCG-fragmenttia.
• ScFv.tä koodaavien fragmenttien liittämiseksi glaA-erityksen signaali- koodaussekvenssiin saadut fragmentit kloonattiin pUR4153:een. Tätä 30 tarkoitusta varten plasmidi pUR4153 käsiteltiin Psfkllä ja Xho\:\\ä, minkä jälkeen noin 4.1 kb:n vektorifragmentti erotettiin agaroosigeelis-tä. Yhdistäminen noin 0.7 kb:n Psfl-X/?ol-fragmentteihin johti vastaa-‘ j.; vasti plasmideihin pUR4154 (ScFv-LYS) ja pUR4156 (ScFv-HCG).
» » » s
) I · I
»
I H M
17 1 1 4870 2.2. pAN52-10:n muodostaminen
Aspergillus-ilmentymäkasettien muodostamisen lähtövektorina käytettiin plasmidia pAN52-10 (kuva 1). Tämä plasmidi muodostettiin seuraa-5 vasti:
Plasmidista pAN52-6A/ofl (Van den Hondel ym. 1991) poistettiin A. nigerin N402 g/aA-promoottorissa oleva A/col-kohta (noin 2,7 kb ennen ATG:tä) katkaisemalla A/col:llä ja täyttämällä Klenowin poly-10 meraasilla, jolloin saatiin pAN52-6A/ofl delta Λ/col. pAN52-6A/ofl delta Nco\ pilkottiin Not\.Mä ja pilkottiin osittain Xmn\:\\ä, minkä jälkeen erotettiin noin 4,0 kb:n Not\-Xmn\ g/aA-promoottorifragmentti. Tämän ρΑΝ52-6Λ/οίΙ delta Nco\ -fragmentin (1) kolmitieligaatio ρΑΝ52-1Λ/οΑ:η noin 3,4 kb:n pituisen A/ofl-A/col-fragmentin (2) kanssa (Van den 15 Hondel, C.A.M.J.J. ym. 1991), joka käsittää A. nidulans trpC -lopettajan (Punt, P.J. ym. 1991) ja pUC18-sekvenssejä, ja synteettisen Xmnl-A/col-fragmentin (3) kanssa, joka käsittää ATG-aloituskoodoniin liittyvän g/aA-promoottorin 3-pään, tuotti plasmidin pAN52-7A/ofl. Tämän synteettisen Xmnl-A/col-fragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssit 20 nro 13—14) esitetään seuraavassa.
5·- _GCT TCC TCC CTT TTA GAC GCA ACT GAG AGC CTG --- 3'- CGA AGG AGG GAA AAT CTG CGT TGA CTC TCG GAC ---
XmnI
25 --- agg ttc atc ccc AGC ATC ATT aca cct gag c
---TCG AAG TAG GGG TGG TAG TAA TGT GGA GTC GGT AC
Ncol 30 Kun noin 4kb:n Λ/οίΙ-Λ/col-fragmentti (joka käsittää g/aA-promoottorin) ja noin 3,4 kb:n A/ofl-SamHI-fragmentti Qoka käsittää pUC18-vektorin ja : f/pC-lopettajan) oli erotettu pAN52-7A/ofl:stä, fragmentit liitettiin yhteen A/col-SamHI-liittäjillä, jotka käsittävät EcoRV-kohdan ja H/ndlll-kohdan ja joilla on seuraavat nukleotidisekvenssit (sekvenssit nro 15—16): :Λ: 35 5'- CAT GGC CGA TAT CGC AAG CTT CCG -3' 3'- CG GCT ATA GCG TTC GAA GGC CTAG -5'
·;··: Ncol EcoRV HindIJI Bam HI
18 1 1 4870 Tästä syntyi plasmidi pAN52-9. Noin 4,0 kb:n pituinen pAN52-9:n Λ/ofl-H/ndlll g/aA-promoottori fragmentti liitettiin noin 3,3 kb:n pituiseen pAN52-6/Vofl:n Hind 11Ι-Λ/ofl-fragmentti in, joka sisältää sekä pUC18-sekvenssejä että A. nidulansin noin 0,7 kb:n pituisen frpC-5 lopetusfragmentin, mistä syntyi pAN52-10 (kuva 1).
2.3 pUR4155:n ja pUR4157:n muodostaminen
Plasmidi pAN52-10 pilkottiin Nco\:llä ja Hind\\\:\\ä, ja siitä erotettiin noin 10 7,5 kb:n defosforoitu vektorifragmentti. Λ/col-kohta sijaitsee g/aA- promoottorin jälkeen samassa kohdassa kuin ATG-aloituskoodoni. Plasmidit pUR4154 ja pUR4156 (ks. esimerkki 2.1) pilkottiin Nco\:\\ä ja Hind\\\:\\ä, ja niistä erotettiin noin 0,8 kb:n fragmentit, jotka koodaavat ss-glaA:ta ja ScFv:tä. Näin saatujen fragmenttien yhdistämisen 15 tuloksena saatiin plasmidit pl)R4155 ja pUR4157 (kuva 2). Näissä plasmideissa ScFv-fragmenttien ilmentymä on A. niger glaA -promoottorin, glukoamylaasin 18 aminohapon signaalisekvenssin ja A. nidulans f/pC-lopettajan ohjauksessa.
20 2.4 ScFv-ilmentymäkasettien muodostaminen käyttäen glukoamylaasin osaa erityskantajana.
i) pUR4159:n ja pUR4161:n muodostaminen.
Muodostettiin ilmentymäkasettejä, jotka koodaavat fuusioproteiinia, jo-25 ka käsittää glaA prepro-osan, kypsän glukoamylaasi G1-proteiinin f ("glaA2"-proteiinin) ensimmäiset 514 aminohappoa ja ScFv-fragment- teja. Näissä kaseteissa "glaA2"-proteiinia ja ScFv-fragmenttiä leikkasi sekvenssi, joka koodaa glukoamylaasin propeptidiä (Asn-Val-lle-Ser-Lys-Arg; sekvenssi nro 45) ja joka käsittää KEX2-tyyppisen tunnistin-30 kohdan (Lys-Arg). Näiden vektorien aikaansaamiseksi muodostettiin plasmidi pAN56-7 (kuva 3) lisäämällä pAN56-4:n 1,9 kb Λ/col-EcoRV-fragmentti, joka käsittää osan A. niger glaA -geeniä, pAN52-10:n noin 7,5 kb Λ/col-EcoRV-fragmenttiin. Plasmidia pAN56-4 ei ole aikaisemmin julkaistu, mutta sen kuvaus on nyt saatavissa julkaisusta 35 M.P. Broekhuijsen, I.E. Mattem, R. Contreras, J.R. Kinghom & C.A.M.J.J. van den Hondel, Journal of Biotechnology 31, No. 2, (1993) 135—145, joka on liitetty tähän viitteeksi; kopio tämän artikkelin luonnoksesta on liitetty etuoikeusasiakirjoihin. "glaA2"-proteiinin ja 19 1 1 4870
ScFv-fragmenttien kehysfuusioiden aikaansaamiseksi plasmidit pUR4154 ja pUR4156 pilkottiin £coRi:llä ja Psflillä, minkä jälkeen erotettiin noin 4,8 kb:n pituinen vektorifragmentti agaroosigeelistä. Vektori liitettiin synteettiseen EcoRI-Psfl-fragmenttiin, jolla on seuraava 5 nukleotidisekvenssi (sekvenssit nro 17—19).
_KEX2_ spacer N-term ScFv
ISKRGGSQVQLQ AAT TCG ATA TCG AAG CGC GGC GGA TCC CAG GTG CAG CTG CA
_GC TAT AGC TTC GCG CCG CCT AGG GTC CAC GTC G
EcoRI EcoRV BamHI Pst I
10 Tällä EcoRI-Psfl-fragmentilla korvattiin glaA-signaalisekvenssiä koo-daava fragmentti (ks. esimerkki 2.1), jolloin oli mahdollista kevysfuusiointi "g/aA2"-geeniin. Saaduista plasmideista pUR4158 ja pUR4160 erotettiin EcoRV-H/ndlll-fragmentit (n. 0,75 kb) ja ne 15 yhdistettiin plasmidin pAN56-7 EcoRV-H/ndlll-fragmenttiin (n. 9,3 kb), jolloin saatiin pUR4159 ja pl)R4161 (kuva 4, jossa ei ole esitetty DNA:ta, joka koodaa 24 aminohapon prepro-glaA-osaa A/col-kohdan läheisyydessä). Tuloksena saadussa proteiinissa ”glaA2"-osa ja ScFv-osa on liitetty peptidillä, joka käsittää KEX2-katkaisukohdan.
20 ii) pUR4163:n muodostaminen.
Samaan tapaan muodostettiin vektori ilmentymiskasetilla, joka koodaa fuusioproteiinia, joka koostuu MglaA2"-proteiinista (jonka edellä on sen 25 prepro-osa), joka on fuusioitu ScFv-lysotsymiin ja joka leikkaa :* Xa-tekijän tunnistinkohtaa. pUR4154:n EcoRi-Psfl-vektorifragmentti (n.
4,8 kb) liitettiin synteettiseen EcoRI-Psfl-fragmenttiin, jolla on seuraava ’ i nukleotidisekvenssi (sekvenssit nro 20—22).
oo factor Xa spacer — V ; JU ISIEGRGGS — AAT TCG ATA TCG ATC GAA GGT CGA GGC GGA TCC — _GC TAT AGC TAG CTT CCA GCT CCG CCT AGG —
; EcoRI EcoRV BamHI
: — N-term ScFv
-- Q V Q L Q
35 — CAG GTG CAG CTG CAG
— GTC CAC GTC G
PstI
- > * i * on 1 1 4870 20 Tällä EcoRi-Psfl-fragmentilla korvattiin glaA-signaalisekvenssiä koo-daava fragmentti, jolloin oli mahdollista kevysfuusiointi "glaA2"-geeniin. Koodatussa proteiinissa "glaA2"-osa ja ScFv-osa on yhdistetty peptidillä, joka käsittää X-tekijän lohkaisukohdan. Näin saadusta plasmidista 5 pUR4162 erotettiin EcoRV-H/nd11l-osa (n. 0,75 kb) ja se liitettiin pAN56-7 vektorifragmenttiin (n. 9,3 kb), jolloin saatiin pUR4163.
2.5 Aspergillluksen transformoi nti 10 Muodostettuihin vektoreihin voidaan järjestää tavanomaiset valinta-merkitsimet (esim. amdS tai pyrG, hygromysiini, jne.), ja sieni voidaan transformoida näin saaduilla vektoreilla halutun proteiinin valmistamiseksi.
15 _
Taulukko 1 llmentymävektorit ScFv-anti-lysotsyymin ja ScFv-anti-ihmisen korioninen gonadotropiinin tuotantoa varten A. niger g/aA-promoottorin 20 ja A. nidulans frpc-terminaattorin ohjauksessa A. nidulans amdS:n ollessa valintamerkitsin_
Plasmidit ScFv-vasta- erityskantaja ScFv-vasta-ai- _aine_neen katkaisija pUR4155 ScFv-LYS 18 aminohappoa ss glaA signaalipeptidaasi PUR4159 ScFv-LYS prepro-"glaA2M KEX2-entsyymi f pUR4163 ScFv-LYS prepro-"glaA2" Xa-tekijä , : : pUR4157 ScFv-HCG 18 aminohapon ss glaA signaalipeptidaasi if: pUR4161 ScFv-HCG prepro-"glaA2"_KEX2-entsyymi
Esimerkkinä siirrettiin 5,0 kb:n Λ/ofl-fragmentissa oleva Aspergillus nidulans amdS -geeni (Hynes M.J. ym. 1983) ScFv-ilmentymävektorien 25 pUR4155, pUR4157, pUR4159, pUR4161 ja pUR4163 uniikkeihin Not\- kohtiin, jolloin saatiin vastaavasti pUR4155NOT, pUR4157NOT, pUR4159NOT, pUR4161NOT ja pUR4163NOT (taulukko 1). AmdS Λ/ofl-fragmentti saatiin pGW325:n EcoRI-fragmentin sivustoinnilla (Wemars K., tohtorinväitöskirja 1986) seuraavilla synteettisillä oligo-30 nukleotideilla.
21 1 1 4870 5'- GGCCGCTGTGCAG -3' (SEQ. ID. NO: 23) 3'- CGACACGTCTTAA -5' (SEQ. ID. NO: 24)
NotI EcoRI
5
Muodostetut pUR41..NOT-vektorit (pUR4155NOT, pUR4157NOT, PUR4159NOT, pUR4161NOT ja pUR4163NOT) siirrettiin tämän jälkeen Aspergillus niger var. awamoriiin ATCC 11358 (= CBS 115.52) ja Aspergillus niger var. awamori#40 -mutanttikantaan (WO 91/19782), 10 joka on saatu A. niger var. awamorin mutageneesillä. Transformointi pUR41NOT-plasmidilla suoritettiin julkaisussa WO 91/19782 kuvatulla tavalla tai transformoimalla yhdessä plasmidin pAN7-1 kanssa P.J. Puntin ja C.A.M.J.J. Van den Hondelin (1992) kuvaamalla tavalla. pAN7-1 käsittää E. colin hygromysiiniresistanssigeenin, joka on 15 sivustoitu Aspery///us-ilmentymäsignaaleilla. A. niger var. awamorin (mutantti #40) protoplastien tuotos oli 1—5x 107/g sienirihmastoa, ja elinkelpoisuus oli 3—8 %. Transformaatiota kohti inkuboitiin 3—8 x 105 elinkelpoisia protoplasteja 10 j_ig:lla Qiagen-menetelmällä puhdistettua plasmidi-DNA:ta. A. niger var. awamori mutantti #40 AmdS+ 20 -transformantteja valittiin ja puhdistettiin levyillä, joissa oli minimikasvuväliaine ja asetamidia tai akryylamidia ainoana typpilähteenä. Suoran valinnan tuloksena saatiin jopa 0,02 mutantti #40 -transformanttia yhtä DNA-pg:aa kohti. A. niger var. awamori -transformantteja ei saatu. Mutantti #40 -kannan yhteistransformointi > 25 suoritettiin seoksen kanssa, jossa oli yhtä pUR41..NOT-plasmidia ja pAN7-1 DNA:ta painosuhteessa 7:3. pAN7-1-yhteistransformantit !' valittiin pääasiassa minimikasvuväliainelevyillä, joissa ja 100—150 μ l i g/ml hygromysiiniä, minkä jälkeen valinta suoritettiin levyillä, joissa oli j f: asetamidia. HmR-viljelmien tiheys oli noin 2 transformanttia yhtä μg:aa il*: 30 kohti, mutta kuitenkin vain 5% HmR-viljelmistä kasvoi hyvin levyillä, joissa oli asetamidia.
A. niger var. awamori mutantin #40 transformanteille, jotka on saatu suoralla valinnalla asetamidilevyillä, on annettu nimitys AWC. Mutantti 35 #40 -yhteistransformanteille, jotka kasvavat hyvin asetamidissa, on an- nettu nimitys AWCM.
I I I f * 22 1 1 4870
Seuraavat määrät (yhteis-)transformantteja otettiin jatkoanalyysiin:
Transformanttien määrä Yhteistransformanttien määrä AWC4155* 3 AWCM4155 3 AWC4157 7 AWCM4157 1 AWC4159 2 AWCM4159 5 AWC4161 2 AWCM4161 2 AWCM4163 2 *4155 osoittaa plasmidin pUR4155NOT olemassaoloa mutantti #40 -kannassa.
2.6 ScFv:n muodostus Asperg/V/us-transformanteilla.
5
ScFv-fragmentteja koodaavia sekvenssejä sisältävien Aspergillus niger var. awamori mutantti #40 -transformanttien analyysi sen jälkeen, kun niitä on viljelty väliaineessa, jossa indusoijana on maltodekstriini.
10 AWC- ja AVVCM-transformantteja kasvatettiin minimiväliaineessa (0,05% MgS04, 0,6% NaN03, 0,05% KCI, 0,15% KH2P04 ja hivenalkuaineita), jossa oli 5 % maltodekstriiniä (Sigma Dextrin Com type I; D-2006). Väliaineita steriloitiin 30 min ajan 120°C:ssa. 50 ml:aan väliainetta (ravistuspullo 300 ml) istutettiin 4 x 105 itiötä/ml, minkä 15 jälkeen niitä viljeltiin ilmainkubaattorissa (300 rpm) 30°C:ssa eri aikoja. Väliainenäytteet otettiin 45 ja 50 tunnin kuluttua ja niille tehtiin SDS-PAGE -analyysi ja sen jälkeen Western blot -analyysi. Lisäksi suoritettiin kvantitatiivinen toiminnallinen testi suorittamalla Pin-ELISA-määritys.
f: 20 2.6.1 ScFv-LYS ja ScFv-HCG-transformanttien väliaine 2.6.1a Western blot -analyysi ja Coomassie Brilliant Blue -värjätyt geelit » · 25 AWC(M)4155:n (18 aminohapon glaA -signaalisekvenssi-ScFv-LYS) (yhteis-)transformanttien — väliainenäytteiden Western blot -analyysi jossa käytettiin antiseerumia Fv-LYS:iä vastaan — paljasti juovan, ·:··: jonka molekyylipaino on noin 31 kDa, joka puuttuu mutanttikannan #40 väliaineesta (kuva 5). Tämän juovan, joka kulkee oletetun kokoisen t I < I * 23 1 1 4870 proteiinin kohdalla, olemassaolo viittaa ScFv-LYS:n erittymiseen kasvualustassa.
Useiden AWC(M)4159 (prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-LYS) (yhteis-)trans-5 formanttien väliaineesta löydettiin samankaltainen, paljon voimak kaampi juova, joka osoitti ScFv-Lys:in tehokkaampaa erittymistä näillä transformanteilla. Tämä proteiinijuova oli myös näkyvissä Coomassie Brilliant Blue -värjätyissä geeleissä.
10 AWC(M)4157 (18 aminohapon glaA signaalisekvenssi + ScFv-HCG) -väliainenäytteistä löydettiin heikko juova, kun taas AWC(M)4161 (prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-HCG) (yhteis-)transformanttien väli aineessa juova oli selvästi näkyvissä (molekyylipaino noin 31 kDa). Epäspesifit signaalit olivat samat kuin ScFv-LYS-transformanteilla 15 saadut. Osa tuloksista on esitetty kuvassa 5 (Western blot). Menetelmä: SDS-PAGE suoritettiin 8—25 % gradienttigeeleillä käyttäen Pharmacia Phast -menetelmää tai homogeenisillä 12,5 % kotitekoisilla SDS-geeleillä. Western blot -analyysia varten käytettiin polyklonaalista anti-seerumia Fv-LYS:iä vastaan (1:1500) sekä ScFv-LYS:in että ScFv-20 HCG:n tunnistamiseksi.
2.6.1b PIN-ELISA-analyysi
Toiminnallisen ScFv-LYS:n määrä (PIN-ELISA-analyysillä määriteltynä) • : 25 AWC(M) -transformanttien väliaineessa on esitetty taulukossa 2.
» · I » * 1 » » » » 1 * » l t i 1 » 24 1 1 4 8 7 0
Taulukko 2
Transformantti: rakenne ScFv- fragmentti _rng/l_ AWCM4155 #102 18 aminohapon ss-glaA-ScFv-LYS 15 - 22 - 11 AWCM4155 #105 sama 3 AWC4155 #4 sama 10 AWC4155 #5 sama 2 AWCM4159 #101 prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-LYS 91 -66 - 67 AWCM4159 #608 sama 3 AWCM4159 #610 sama 16 A WC 4159 #701 sama 40 AWCM4161 #612 prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-HCG 4 A WC 4161 #2 sama 1 A. niger var. awamori mutantti #40 0
ScFv-LYS:n määrä AWC(M)4155 (18 aminohapon glaA) -transformanttien väliaineessa vaihteli 2—22mg/l. AWC(M)4159 5 (yhteis-)transformantit (prepro-"glaA2"-KEX2-rakenne) erittävät jopa I » noin 90mg/l väliaineeseen, kun taas tuotosta ei havaittu lainkaan i A. niger var. awamori mutantti #40 -kannassa. Kvantitatiivisessa PIN- , i ELISA-määrityksessä ScFv-HCG:n tunnistamiseksi havaittiin, että : AWC(M)4161 (yhteis-)transformantit ("glaA2"-KEX2-rakenne) erittivät 10 jopa 4mg/l toiminnallista ScFv-HCG:tä väliaineeseen. Kuitenkin AWC4157:n (18 aminohapon glaA signaalisekvenssi) transformanttien väliaineessa ei tunnistettu ScFv-HCG:tä. Menetelmä: Joko lysotsyymillä tai HCG:llä päällystettyjä PIN.ejä inkuboitiin (laimennetuissa) väliainenäytteissä. Tämän jälkeen PIN.ejä inkuboitiin 15 Fv-LYS:n ja Fv-HCG:n vastaisilla antiseerumeilla, sitten vuohi-anti-kaniini-konjugaatilla emäksisen fosfataasin kanssa. Lopuksi emäksisen • · I J · 25 1 1 4 8 7 0 fosfataasin entsyymiaktiivisuus määritettiin p-nitrofenyylifosfaatilla inkuboinnin jälkeen, ja optinen tiheys mitattiin 405 nm:ssä. Käyttäen Fv-LYS:n ja Fv-HCG:n standardinmukaisia liuoksia laskettiin toiminnallisen ScFv-LYS:n ja ScFv-HCG:n määrä.
5
Esimerkki 3 Aspergillus niger var. awamori -in teg raati o vektorien muodostaminen ScFv-fragmenttien valmistamiseksi käyttäen endoksylanaasipromoottoria ja -lopettajaa sekä DNA-sekvenssiä, joka koodaa 10 endoksyianaasin erittymissignaalia ja kypsää endoksylanaasiproteiinia.
Vaikka tässä esimerkissä kuvataan sellaisten ilmentymisplasmidien muodostamista, jotka koodaavat kypsän endoksylanaasiproteiinin ja 15 ScFv-fragmentin välisiä fuusioproteiineja, on selvää, että myös vaihtoehtoisia ilmentymisplasmideja voidaan muodostaa hyvin samalla tavalla käyttäen vain osaa endoksylanaasiproteiinista.
3.1 pUR4158-A:n muodostaminen.
20
Kun plasmidi pScFvLYSmyc (ks. esimerkki 1.1) on pilkottu Pst\:Mä ja Xho\:\\ä, oli mahdollista eristää n. 0.7 kb:n Psfl-Xöol-fragmentti aga-roosigeelistä. Tämä fragmentti koodaa katkaistua yksiketjuista Fv-Lys-fragmenttia, josta puuttuvat ensimmäiset 5 ja viimeiset 5 aminohappoa : 25 (ks. nukleotidisekvenssi nro 25) ja päätelty aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 26) noin 700emäsparin Psfl-X/7ol-fragmentista, joka ·’ koodaa monoklonaalisen anti-lysotsymi-vasta-aineen D1.3 ScFv- fragmenttia (ScFv LYS), joka esitetään seuraavassa.
______ ____ _ _ _____ 30 ScFv-LYS:n nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi
PstI .....
: · 1 CTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCAT 50
LQESGPGLVAPSQSLSI
.1 51 CACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTGTAAACTGGG 100
; TCTVSGFSLTGYGVNW
> CDR I < lii» » t » 26 1 1 4870 101 TTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATTTGGGGT 150
VRQPPGKGLEWLGMIWG
> 151 GATGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAG 200 DGNTDY. NSALKSRLSIS CDR II < 201 CAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCACA 250
KDNSKSQVFLKMNSLH
251 CTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAGAGAGATTATAGGCTT 300
TDDTA RYY CARERDYRL
> CDR III
BstEII.
301 GACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGG 350 DYWGQGTTVTVSSGGGG < >
.SacI
351 TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTC 400
SGGGGSGGGGSDIELT
Linker < > VI
401 AGTCTCCAGCCTCCCTTTCTGCGTCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACA 450
QSPASLSASVGETVTIT
:, 451 TGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAA 500 CRASGNIHNYLAWYQQK : > CDR I < 501 ACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATTATACAACAACCTTAGCAG 550
v‘ QGKSPQLLVYYTTTLA
> CDR II
551 ATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCT 600
DGVPSRFSGSGSGTQYS
; < 601 CTCAAGATCAACAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCA 650
•.••I LKINSLQPEDFGSYYCQ
> 27 1U870
Xhol 651 ACATTTTTGGAGTACTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAG 699 HFWSTPRTFGGGTKLE CDR III < 5
Plasmidin pEMBL9 monenkertainen kloonauskohta (Dente ym. 1983), joka alkaa EcoRLstä ja päättyy /-//ndlll-kohtaan, voidaan korvata synteettisellä DNA-fragmentilla, jolla on seuraava nukleotidisekvenssi (sekvenssit nro 27—30).
10 KEX2_ Spacer ScFv N-term.
ISKRGGSQVQLQ*
AAT TCG ATA TCG AAG CGC GGC GGA TCC CAG GTG CAG CTG CAG TAA -GC_TAT_AGC TTC GCG CCG CCT AGG GTC CAC GTC GAC GTC ATT -EcoRI EcoRV BarnHI PstI
15 _ScFv C-term._ VTKLEIKR* *
- GTG ACT AAG CTC GAG ATC AAA CGG TGA TAA GCT CGC TTA
- CAC TGA TTC GAG CTC TAG TTT GCC ACT ATT CGA GCG AAT TCG A
Xhol Af 111 Hindlll 20 Tällä DNA-fragmentilla voidaan korvata plasmidin pEMBL9 monenkertainen kloonauskohta (joka alkaa EcoRkstä ja päättyy H/ndlll-koh-taan). Synteettisen DNA-fragmentin koodaussäikeen 5'-osa koodaa KEX2-tunnistuskohtaa (ISKR), välikettä (GGS), jonka jälkeen tulevat 25 vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvan osan ensimmäiset 5 aminohappoa. Koodaussekvenssin 3'-osa koodaa vasta-aineen kevyen ketjun muuttuvan osan viimeistä 8 aminohappotähdettä. Pilkkomalla saatu plasmidi Psfl:Mä ja Xhokllä voidaan erottaa noin 4 kb:n vektorifragmentti.
:7: 30
Liittämällä pScFvLYSmyc:in noin 0,7 kb:n pituinen Pst\-Xho\ -fragmentti noin 4 kb:n pituiseen vektorifragmenttiin voidaan saada pUR4158A, joka käsittää palautetut geenit, jotka koodaavat VH- ja VL-vasta-aine-fragmentteja.
35 28 1 1 4 8 7 0 3.2 pXYL2:n muodostaminen.
Plasmidia pAW14B käytettiin lähtövektorina muodostettaessa sarja il-mentämisplasmideja, jotka sisältävät ex/A-ilmentämissignaaleja ja gee-5 nejä, jotka koodaavat ScFv-fragmentteja. Plasmidi käsittää Aspergillus nigerMar. awamoitn kromosomaalisen 5,2 kb Sa/l-fragmentin, jossa on 0,7 kb exIA-geeni yhdessä 2,5 kb 5'-sivustasekvenssin ja 2,0 kb 3'-sivustasekvenssin kanssa (ks. kuva 6 = kuva 3 Unileverin julkaisussa WO 93/12237).
10
Pilkkomalla plasmidia pAW14B Xbal:llä ja BamHVMä voidaan erottaa noin 3,2 kb Xbal-BamHI-fragmentti, joka käsittää ex/A-promoottorin, ex/A-rakennegeenin ja osan ex/A-lopetusalueesta. Tämä fragmentti voidaan kloonata plasmidiksi pBluescript (ex Stratagene), joka on pilkottu 15 samoilla entsyymeillä, jolloin saadaan plasmidi pXYL1.
Soveltamalla PCR-tekniikkaa noin 3,2 kb:n Xbal-BamHI-fragmenttiin on mahdollista muuttaa ex/A-rakennegeenin 3'-päätä korvaamalla viimeinen, seriiniä koodaava koodoni ja pysäytyskoodoni TAA BamHI-20 kohdalla GGA TCC, minkä jälkeen tulee 8 muuta koodonia, jotka käsittävät EcoRV-kohdan ja EcoRI-kohdan, käyttämällä ensimmäistä (anti-sense) aluketta (A), joka on annettu jäljempänä (sekvenssit nro 31—34) ja toista (sense) aluketta (B), joka on myös annettu jäljempänä, ennen Scal-kohtaa (ex/A-geenissä). Tämä sense-aluke 25 vastaa nukleotideja 824—843, jotka on esitetty Unileverin ei aikaisemmin julkaistussa julkaisussa WO 93/12237 kuvassa 1 ja jotka muodostavat osan ex/A-geeniä. Näin saatu PCR-valmiste pilkotaan . * - Scalillä ja EcoRMIä, minkä jälkeen voidaan erottaa noin 175 emäsparin
Scal-EcoRI-fragmentti. Pilkkomalla pXYL1 Scalillä (osittain) ja 30 EcoRlillä (osittain) voidaan erottaa noin 6 kb Scal-EcoRI-fragmentti, joka käsittää intaktin pBluescript DNA:N ja ex/A-promoottorialueen sekä suurimman osan ex/A-rakennegeeniä.
Kun noin 175 emäsparin Scal-EcoRI-fragmentti yhdistetään pXYL1:stä 35 saatuun noin 6 kb Scal-EcoRI-fragmenttiin, saadaan plasmidi pXYL2, joka eroaa plasmidista pXYL1 sikäli, että ex/A-geenin 3'-osa ja lopetusfragmentti on korvattu juuri saadulla Scal-EcoRI PCR-fragmentilla.
29 1 1 4 8 7 0
Oligonukleotideja, joita käytetään ex/A-rakennegeenin 3'-pään muuttamiseen PCR-tekniikalla.
5 A. anti-sense -aluke V T I s s * 5'-T GTC ACG ATC TCC TCT TAA GGGATAAGTGCCTTGGTAGTC-3'
I III III III III I III III III III
3'-A CAG TGC TAG AGG
\gsanvisnst 1U CCTAGGCGATTACACTATAGCTTAAGCTGA-5'
BamKI EcoRV EcoRl
Huom. PCR-oligonukleotidi on merkitty vahvennettuna; vastaavat aminohapot on merkitty pienillä kirjaimilla.
15 B. sense-aluke (20-oligomeeri) 5'-GA ACT AAC GAA CCG TCC ATC-3' (SEQ. ID. NO: 35) 20 3.3 pUR4455:n ja pUR4456:n muodostaminen.
Lähtien pAW14B:stä muodostettiin pAW14B-10 poistamalla pUC19-moniliittäjästä peräisin oleva EcoRI-kohta ja lisäämällä Λ/ofl-kohta. Tämä saatiin aikaan pilkkomalla plasmidi pAW14B osittain EcoRlillä, ja 25 defosforglaation jälkeen lineaariset 7,9 kb EcoRI-plasmidit erotettiin ja . sidottiin uudelleen "EcoRr-/Vofl-liittäjän läsnäollessa: 5'-AATTGCGGCCGC-3' (SEQ. ID. NO: 36).
Notl 30 Valittiin plasmidi, joka sisälsi vielä EcoRI-kohdan ex/A-rakennegeenin edellä olevalla alueella, minkä jälkeen saatiin pAW14B-10. Tällainen : .valintamenetelmä on alan asiantuntijalle tunnettu.
Tämän jälkeen poistettiin ex/A-lopettajan jälkeen tuleva A//ll-kohta 35 katkaisemalla plasmidi pAW14B-10 osittain Aflll:lla ja uudelleenliittämällä erotettu, linearisoitu plasmidi tarttuvien päiden täyttämisen jälkeen, jolloin saatiin plasmidi pAW14B-11, kun oli valittu plasmidi, joka sisälsi vielä Aflll-kohdan lähellä exIA-geenin 30 1 1 4 8 7 0 pysäytyskoodonia. Tällainen valintamenetelmä on alan asiantuntijalle tunnettu. Tätä plasmidia pAW14B-11 voidaan käyttää muodostettaessa sarja ilmentämisplasmideja, jotka käsittävät DNA-fragmentin, joka koodaa fuusioproteiinia, joka koostuu endoksylanaasiproteiinista tai sen 5 osasta ja ScFv-fragmentistä. Nämä kaksi proteiinifragmenttia liitetään sopivimmin yhteen proteaasin tunnistuskohdassa, esim. KEX2-katkaisukohdassa.
(i) Pilkkomalla plasmidi pAW14B-11 /Vofkllä ja AflW.Wa voidaan 10 erottaa noin 4,7 kb fragmentti, joka käsittää pUC19-vektorin ja osan ex/A-lopettajaa.
(ii) Pilkkomalla plasmidi pXYL2 Not\:\\ä ja EcoRV:llä voidaan erottaa noin 3,2 kb:n fragmentti. Vaihtoehtoisesti voidaan 15 erottaa noin saman pituinen A/ofl-BamHI-fragmentti.
(iii) Pilkkomalla plasmidi pUR4158-A EcoRV:llä ja Afl\\:\\a voidaan erottaa noin 0,8 kb:n fragmentti, joka koodaa ScFv-LYS:iä, jota edeltää lyhyt (liittäjä-)peptidi, joka käsittää 20 KEX2-katkaisukohdan ja välikkeen (GGS). Vaihtoehtoisesti voidaan erottaa noin saman pituinen BamH\-AfI\ l-fragmentti, joka ei sisällä DNA-fragmenttia, joka koodaa KEX2-katkai-sukohtaa.
25 A) Kypsästä endoksylanaasista ja ScFv-LYS:istä muodostuvaa fuusioproteiinia koodaavien ilmentämisplasmidien muodostamiseksi sidotaan yhteen plasmidin pAW14B-11 noin 4.7 kb Not\-Afl\\, plasmidin pXYL2 noin 3,2 kb Not\-BamH\-fragmentti ja plasmidin pUR4158-A noin 0,75 kb BamHI- 30 Afl\l-fragmentti, jolloin saadaan pUR4455.
B) KEX2-katkaisukohdan yhdistämästä kypsästä endoksylanaasista ja ScFv-LYS:istä muodostuvaa fuusio-proteiinia koodaavien ilmentämisplasmidien muodos-35 tamiseksi sidotaan yhteen plasmidin pAW14B-11 noin 4.7 kb /Vofl-A/7ll, plasmidin pXYL2 noin 3,2 kb Λ/ofl-EcoRV-fragmentti ja plasmidin pUR4168-A noin 0,75 kb EcoRV-Aff\l-fragmentti, jolloin saadaan pUR4456.
31 1U870
Muodostetut ilmentämisvektorit voidaan tämän jälkeen siirtää homeisiin (esimerkiksi Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus nidulans jne) tavanomaisilla yhteistransformaatiotekniikoilla, ja ki-5 meerinen geeni, joka käsittää haluttua ScFv-fragmenttia koodaavan DNA-sekvenssin, voidaan tämän jälkeen ilmentää endoksylanaasi II-promoottorin indusoinnin avulla. Muodostettuun vektoriin voidaan myös järjestää tavanomaisia valintamerkitsimiä (esim. amdS tai pyrG, hygromysiini jne), esim. viemällä vastaavat geenit uniikkiin A/ofl-10 restriktiokohtaan, ja home voidaan transformoida saadulla vektorilla halutun proteiinin tuottamiseksi, oleellisesti kuten on kuvattu Unileverin ei aikaisemmin julkaistussa julkaisussa WO 93/12237 esimerkissä 2.
Esimerkki 4 (Suun) mikro-organismien vasta-aineiden geeni-15 fragmenttien erottaminen.
Suun mikro-organismien monoklonaalisia vasta-aineita on kuvattu aiemmin (De Soet ym. 1990), ja niistä on esimerkkinä streptokokkien vasta-aine OMVU10. Näistä monoklonaalisista vasta-aineista saatavien 20 ScFv-fragmenttien valmistamiseksi on erotettava geenifragmentit, jotka koodaavat raskaiden ja kevyiden ketjujen muuttuvia alueita. RNA:n erottaminen hybridoomasolulinjoista, cDNA:n valmistus ja vasta-aineiden muuttuvia alueita koodaavien geenifragmenttien laajentaminen PCR:llä suoritettiin alalla tunnetun tekniikan standardinmukaisilla mene-25 telmillä (ks. esimerkiksi Orlandi ym. 1989). PCR-laajennusta varten on • käytetty erilaisia oligonukleotidialukkeita, nimittäin raskaan ketjun fragmenttia varten: : : A: 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3' (SEQ ID NO· 37)
ft/I
:*;.· 30 (sekvenssi nro 37) , jossa S on C tai G, M on A tai C, R on A tai G, ja W on A tai T, ja J · i': B· 5'-TGA GGA G AC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3' - ‘ BstEU (SEQ. ID. NO: 38) :. ’i 35 (sekvenssi nro 38), ja kevyen ketjun fragmenttia varten (Kappa): .: ’ - C: 5-'GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3' (SEQ. ID. NO: 39)
Sacl » t · »» 32 114870 (sekvenssi nro 39) ja D: 5'-GTT TGA TCT CGA G CT TGG TCC C-3' (SEQ. ID. NO: 40) XIiol 5 (sekvenssi nro 40).
Näin saatu raskaan ketjun PCR-fragmentti pilkottiin Pstl:llä ja esfEllillä, ja siitä erotettiin noin 0,33 kb:n pituinen Psfl-SsfEII-fragmentti. Näin saatu fragmentti voidaan kloonata plasmidiin p(JR4158-A. Tätä 10 tarkoitusta varten pUR4158-A pilkotaan Psfl.llä ja SsfEllllä, minkä jälkeen voidaan erottaa noin 4,4kb:n vektorifragmentti. Kun edellä kuvattu OMVU10:n raskaan ketjun fragmentti sidotaan noin 4,4 kb vektorifragmenttiin, saadaan pUR4158-A10H. Tässä plasmidissa lysotsyymivasta-aineen raskaan ketjun fragmentti, joka siinä oli alun-15 perin, on korvattu OMVU10 -vasta-aineen vastavalla fragmentilla.
Samaan tapaan saatu kevyen ketjun PCR-fragmentti pilkottiin Sackllä ja Xftokllä, ja siitä erotettiin noin 0,3 kb Sacl-Xbol-fragmentti. Kun pUR4158-A10H on pilkottu Sacl.llä ja X/?ol:llä, siitä voidaan erottaa 20 noin 4,4 kb:n vektorifragmentti. Kun tämä vektorifragmentti sidotaan yllämainittuun OMVU10:n kevyen ketjun fragmenttiin, saadaan pUR4457. Tässä plasmidissa lysotsyymivasta-aineen sekä raskaan ketjun fragmentti että kevyen ketjun fragmentti korvataan OMVU10:n asianmukaisilla raskaan ja kevyen ketjun fragmenteilla. Seuraavassa 25 esitetään pUR4457:n Psfl-Xhol-fragmentin nukleotidisekvenssi ·’ (sekvenssi nro 41) ja päätetty aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 42), joka fragmentti sisältää näin saadun geenin, joka koodaa OMVU10:n ScFv-fragmenttia. Edellä on esimerkin 3.1 yhteydessä esitetty ensimmäiset 5 koodonia ja viimeiset 5 koodonia, joissa ilmenee 30 päällekkäisyys Psfl-ja Xhol-kohtien kanssa.
OMVU10:n ScFv-fragmentin nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi psti .....
: 1 CTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACT 50
LQESGGGLVQPGGSRKL
·:·; 51 CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGGAATGCACTGGG 100
SCAASGFTFSNFGMHW
> CDR I < 32α 114870 101 TTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGT 150
VRQAPEKGLEWVAYISS
> 151 GGCGGTACTACCATCTACTATTCAGACACAATGAAGGGCCGATTCACCAT 200 GGTTIYYSDTMKGRFTI CDR II < 201 CTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAA 250
SRDNPKNTLFLQMTSL
• # · * · 251 GGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTGCAAGATCCTGGGCCTATGCT 300
RSEDTAMYFCARSWAYA
> CDR III
BstEII
301 ATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGG 350 MDYWGQGTTVTVSSGGG < >
SacI
351 CGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCA 400
GSGGGGSGGGGSDIEL Linker < > VI
• ♦ · · ♦ 401 CCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAATCATTACTATT 450
TQSPSYLAASPGEI ITI
451 AATTGCAGGGCAAGTAAGAGTATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGA 500 NCRASKSISKYLAWYQE > CDR I < * ♦ * · · · 501 GAAACCTGGAAAAACAAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCATTTTGC 550
KPGKTNKLLIYSGSIL ; : : > CDR II
; : : 551 AATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTC 600
QSGIPSRFSGSGSGTDF
< t t * V : 601 ACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTG 650
TLTISSLEPEDFAMYYC
f I » . . . . Xhol ’ 651 TCAÄCAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAG 702 QQHNEYPWTFGGGTKLE ‘ * > CDR III < 33 1 1 4 8 7 0
Esimerkki 5 llmentämiskasetin muodostaminen OMVU10:n ScFv-fragmentin valmistusta varten.
Kun pUR4457 (ks. esimerkki 4) on pilkottu EcoRV:llä ja Afl\\:\\ä, siitä 5 voidaan erottaa noin 0,8 kb fragmentti, joka koodaa ScFv-OMVU10:tä, jota edeltää lyhyt (liittäjä-)peptidi, joka käsittää KEX2-katkaisukohdan ja GGS-välikkeen. Vaihtoehtoisesti voidaan erottaa noin 0,75 kb Ba/nHI->4/711-fragmentti sellaisia fuusioproteiineja koodaavien ilmentä-misplasmidien muodostamiseksi, jotka eivät sisällä KEX2-katkaisu-10 kohtaa.
Sidottaessa näin saadut fragmentit esimerkissä 3.3 (i) ja (ii) saatuihin fragmentteihin samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkin 3.3. kohdissa B) ja A), voidaan saada ilmentymisplasmidi, joka sisältää DNA-15 sekvenssin, joka koodaa fuusioproteiinia, joka käsittää endoksylanaa-siproteiinin ja OMVU10:n ScFv-fragmentin, jossa joko on (pUR4460) tai ei ole (pUR4459) KEX2-katkaisukohtaa.
Analogisesti esimerkissä 3 kuvatun menetelmän kanssa tuloksena 20 saatavat plasmidit (joissa joko on tai ei ole lisättyä valintamerkitsintä) voidaan siirtää Aspergillukseerr.
Esimerkki 6 Ihmisen raskaushormonin (HCG) vasta-aineen geenifragmenttien erottaminen.
!·: 25
Hyvin paljon samaan tapaan, kuin esimerkissä 4 on kuvattu, erotettiin HCG:n vasta-aineiden kevyen ja raskaan ketjun muuttuvia alueita koo-daavia geenifragmentteja, jotka voidaan kloonata piasmidiin pUR4158-A, mistä syntyy plasmidi pUR4458. ScFv-HCG-fragmenttia 30 koodaavan Psfl-Xhol-fragmentin nukleotidisekvenssi (sekvenssi nro 7) ja vastaava aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 8) on esitetty edellä esimerkin 1.2 yhteydessä.
> » » · t · »»» • » I »
34 11487 O
Esimerkki 7 llmentymäkasettien muodostaminen ScFv-frag-menttien muodostamista varten käyttäen endoksy-ianaasipromoottori ja -lopettajan ja DNA-sekvenssiä, joka koodaa prepro-"glaA2,,-proteiinia.
5 7.1 pAW14B-12:n muodostaminen
Plasmidi pAW14B-12 muodostettiin käyttäen pAW14B-11:a (ks. esimerkki 3.3) lähtökohtana. Kun pAW14B-11 oli pilkottu Auliilla (joka sijaitsee ex/A-pysäytyskoodonin kohdalla) ja Bg/ll:lla (joka sijaitsee 10 ex/A-promoottorin kohdalla), erotettiin 2,4kb:n pituinen Afl\\-Bgl\\- fragmentti, joka sisältää osan ex/A-promoottoria ja ex/A-geenin. Kun tämä fragmentti oli pilkottu osittain SspHUIä (joka sijaitsee ex/A-promoottorissa ja ex/A-aloituskoodonissa), erotettu 1.8 kb Bg/ll-BspHI:n ex/A-promoottorifragmentti (ATG:hen asti) sidottiin pAW14B-11:n 15 5.5 kb A/7I l-Bgr/l l-fragmenttiin, joka sisältää ex/A-lopettajan, synteettisten DNA-oligonukleotidien läsnäollessa: (BspHI) Af111 5'- CAT GCA GTC TTC GGG C -3' (SEQ. ID. NO: 43) 3 ' - ' GT CAG AAG CCC GAA TT -5* (SEQ. ID. NO: 44)
BJbsI
20 jolloin saatiin pAW14B-12.
7.2 llmentymäkasettien järjestäminen.
(i) Kun plasmidia pAW14B-12 pilkottiin BbslMä (osittain) ja 25 A/7ll:llä, erotettiin noin 7,3 kb BsfHI-A/7ll-vektorifragmentti.
t : t ;·’ (ii) Plasmidista pAN56-4 (joka on kuvattu em. M.P. Broekhuij- ; : senin ym. julkaisussa) erotettiin noin 1,9 kb Λ/col-EcoRV- fragmentti, joka käsittää osan g/aA-geenistä alkaen ATG-30 aloituskoodonista (joka on samassa kohtaa kuin Nco\- kohta), joka geeni koodaa glukoamylaasin prepro-osaa ja kypsän glukoamylaasin ("glaA2") ensimmäistä 514 aminohappoa.
i i * i < i k ’ i 35 (iii) Plasmideista pUR4158-A (joka koodaa ScFv-LYS-fragment- •i“\ tia, jota edeltää KEX2-tunnistuskohta ja GGS-välike; ks.
: esimerkki 3.1), pUR4457 Goka koodaa OMVU10:n ScFv- ! fragmenttia, jota edeltää KEX2-tunnistuskohta ja GGS-vä- » « 35 1 1 4 8 7 0 like; ks. esimerkki 4), ja pUR4458 (joka koodaa ScFV-HCG-fragmenttia, jota edeltää KEX2-tunnistuskohta ja GGS-väli-ke; ks. esimerkki 6) erotettiin noin 0,8 kb EcoRV-Aflll-frag-mentit.
5
Sidottaessa (i)BspHI-A/fll-vektorifragmentti, (ii) Λ/col-EcoRV glaA-irag-mentti (Ncol.n tarttuvat päät ovat yhteensopivia BspH\:n tarttuvien päiden kanssa), ja jompikumpi EcoRV-A/7ll:ta koodaavista ScFv-fragmen-teista voidaan saada joukko ilmentämisplasmideja:
10 PUR4462 Pex/A-prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-LYS
PUR4463 PexIA-prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-HCG PUR4464 Pex/A-prepro-"glaA2"-KEX2-ScFv-OMVU 10
Kun amcfS-valintamerkitsin oli lisätty Λ/ofl-kohtaan, tuloksena saadut 15 plasmidit siirrettiin Aspergillukseen, kuten esimerkissä 3 on kuvattu.
7.3 ScFv-LYS:n valmistus.
Kun pUR4462:lla transformoitua tuloksena saatua Aspergillus niger var.
20 awamoria kasvatettiin 101 käymisastiassa, kasvuväliaine analysoitiin polyakryylamidigeelielektroforeesilla. Kuvassa 7 on esitetty geeli sen jälkeen, kun se värjättiin Coomassie Brilliant Blueilla, ja nuolilla on osoitettu vapautunutta ScFv-LYS-fragmenttia ja fuusioproteiinia ja/tai katkaistua glaA-proteiinia. "Aktiivisen" ScFv-LYS:in määräksi mitattiin 25 noin 250mg/l. On selvää, että käymisolosuhteiden lisäoptimointi tai !. valmistuskannan mutageneesi johtaa jopa suurempiin tuotantomääriin.
i * · f I · ! I I · f t » · 36 1 1 4 8 7 0
Viitejulkaisut - WO 90/15860 (GENENCOR INC. / V.B. Lawlis; published 27 Dec. 1990; DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi) 5 - WO 91/19782 (UNILEVER / R.F.M. Van Gorcom, J.G.M. Hessing, J. Maat, M. Roza & J.M.A. Verbakel; published 26 Dec. 1991; Xylanase production) - WO 92/01797 (OY ALKO AB / E. Nyyssönen, S. Keränen, M. Penttilä, K. Takkinen & J.K.C. Knowles; published 6 Feb. 1992; Immunoglobulin production by Trichoderma) 10 - WO 93/02198 (TECH. RES. INST. FINLAND / T.T. Teeri, K. Takkinen, M-L.
Laukkanen, K. Alithan, D. Sizmann, J.K. Knowles; published 4 Feb. 1993; Recombinant secretable fusion proteins) - not prior-published PCT application PCT/EP92/02896, filed 9 December 1992 and claiming a priority date of 9 December 1991, published during the priority 15 year as WO 93/12237 on 24 June 1993 (UNILEVER / R.J. Gouka, C.A.MJ.J.
Van den Hondel, W. Musters, H. Stam & J.M.A. Verbakel; Process for produ-cing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from an Aspergillus endoxylanase II gene - Broekhuijsen, M.P., Mattem, I.E., Contreras, R., Kinghorn, J.R., and Van den 20 Hondel, C.A.MJJ.; J. Biotechnology H, No.2 (1993) 135-145; Secretion of heterologous proteins by Aspergillus niger. Production of active human interleukin-6 in a protease-deficient mutant by KEX2-like processing of a j glucoamylase-hIL6 fusion protein ,·. - Calmels, T.P.G., Martin, F., Durand, H., and Tiraby, G.; J. Biotechnol. 17 (1991) ; 25 51-66; Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi . : ·. - Contreras, R., Carrez, D., Kinghorn, J.R., Van den Hondel, C.A.M.J.J., and
Fiers, W.; Bio/Technology 9 (1991) 378-381; Efficient KEX2-like processing of a ; ;'; glucoamylase-interleukin-6 fusion protein by Aspergillus nidulans and secretion of ::: mature interleukin-6 : 30 - De Soet, JJ., Van Dalen, P.J., Russell, R.R.B., and De Graaff, J.; Antonie van
Leeuwenhoek 58 (1990) 219-225; Identification of mutants streptococci with ,, ,; monoclonal antibodies 37 1 1 4870 - Dente, L., Cesareni, G. and Cortese, R.; Nucleic Acids Research 11 (1983) 1645-1655; pEMBL: a new family of single stranded plasmids - Fuller, R.S., Sterne, R.E., and Thorner J.; Ann. Rev. Physiol. 50 (1988) 345-362; Enzymes required for yeast prohormone processing 5 - Hynes MJ., Corrick C.M., and King J.A.; Mol. Cell Biol. 3 (1983) 1430-1439;
Isolation of genomic clones containing the amd-s, gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of structural and regulatory mutations - Jones, P.T.; Dear P.H.; Foote J.; Neuberger, M.S., and Winter, G.; Nature 321 (1986) 522-525; Replacing the complementary determining regions in a human 10 antibody with those from a mouse - Matthews, J.D. and Wells, J.A.; Science 260 (21 May 1993) 1113-1117; Substrate Phage: Selection of Protease Substrates by Monovalent Phage Display - Nyyssönen, E., Penttilä, M., Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J.K.C., and Keränen, S.; BIO/TECHNOLOGY Π (May 1993) 591-595; Efficient Production 15 of Antibody Fragments by the Filamentous Fungus Trichodemia reesei - Orlandi, R., Giissow, D.H., Jones, P.T., and Winter, G.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction - Punt, PJ., Zegers, N.D., Busscher, M., Pouwels, P.H. and Van den Hondel, 20 C.A.MJJ.; J. Biotech 17 (1991) 19-34; Intracellular and extracellular production of proteins in Aspergillus under the control of expression signals of the highly expressed Aspergillus nidulans gpd-z gene ”! - Punt, PJ. and Van den Hondel, C.A.MJ.J.; Transformation of filamentous fungi ; ’·, based on hygromycin B and phleomycin resistance markers. In: Methods in I * · ; .·. 25 Enzymology Vol. 216. Eds: J.N. Abelson and M.I. Simon. Academic Press, Inc.,
Orlando, Florida, (1992) pp. 447-457 - Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory : Manual 2nd Edn (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).
::: - Van den Hondel, C.A.MJJ., Punt, PJ., and Van Gorcom, R.F.M.; Heterologous : 30 gene expression in filamentous fungi. In: More gene manipulation in fungi (Eds.
t · ·;··*: J.W. Bennett amd L.L. Lasure), Academic Press, (1991) pp 396-428 114870 38 - Ward, M., Wilson, L.J., Kodama, K.H., Rey, M.W., and Berka, R.M.; Bio/Technology 8 (May 1990) 435-440; Improved production of chymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion - Ward, S., Gussow. D., Griffiths, A.D., Jones, P.T., and Winter, G.; Nature 341 5 (1989) 544-546; Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from E. coli - Wernars, K.; "DNA mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans"; thesis (1986); Landbouw Hogeschool Wageningen.
t · » · 39 1 1 4870
Sekvenssilistaus (1) Yleisiä tietoja: 5 (i) Hakija: (A) Nimi: Unilever N.V.
(B) Katuosoite: Weena 455 (C) Kaupunki: Rotterdam (E) Maa: Alankomaat
10 (F) Postinumero: NL-3013 AL
(A) Nimi: Unilever PLC
(B) Katuosoite: Unilever House Blackfriars (C) Kaupunki: Lontoo 15 (E) Maa: Iso-Britannia
(F) Postinumero: EC4P 4BQ
(A) Nimi: Nederlandse organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO 20 (B) Katuosoite: Schoemakersstraat 97 (C) Kaupunki: Delft (E) Maa: Alankomaat
(F) Postinumero: NL-2628 VK
25 (A) Nimi: Leon Gerardus Joseph Frenken (B) Katuosoite: Geldersestraat 90 (C) Kaupunki: Rotterdam (E) Maa: Alankomaat (F) Postinumero: NL-3011 MP 30 (A) Nimi: Robert F.M. van Gorcom (B) Katuosoite: Liberiastraat 7 (C) Kaupunki: Delft (E) Maa: Alankomaat
35 (F) Postinumero: NL-2622 DE
40 1 1 4870 (A) Nimi: Johanna G.M. Hessing (B) Katuosoite: Adema van Scheltemaplein 38 (C) Kaupunki: Delft (E) Maa: Alankomaat
5 (F) Postinumero: NL-2624 PG
(A) Nimi: Cornells Antonius M.J.J. van den Hondel (B) Katuosoite: Waterlelie 124 (C) Kaupunki: Gouda 10 (E) Maa: Alankomaat
(F) Postinumero: NL-2804 PZ
(A) Nimi: Wouter Musters (B) Katuosoite: Wipperspark 138 15 (C) Kaupunki: Maassluis (E) Maa: Alankomaat
(F) Postinumero: NL-3141 RD
(A) Nimi: Johannes Maria A. Verbakel 20 (B) Katuosoite: Ingeland 9 (C) Kaupunki: Maasland (E) Maa: Alankomaat
(F) Postinumero: NL-3155 GC
: 25 (A) Nimi: Cornells Theodorus Verrips (B) Katuosoite: Hagedoorn 18 (C) Kaupunki: Maassluis (E) Maa: Alankomaat
(F) Postinumero: NL-3142 KB
j 30 (ii) Keksinnön nimitys:
Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella 35 (iii) Sekvenssien määrä: 45 41 1 1 4870 (iv) Tietokoneella luettava muoto: (A) Väline: Levyke (B) Tietokone: IBM PC -yhteensopiva
(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS
5 (D) Ohjelmisto: Patentin Release #1.0,
Versio #1.25 (EPO) (2) Tiedot sekvenssistä nro 1: 10 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 15 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 15 (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: sekvenssi nro 1: on Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 2: 25 (!) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 895 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen :/ 30 ; : (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) ; : (ix) Ominaisuus:
; T: (A) Nimi/Avain: CDS
. 35 (B) Sijainti: 1..855 42 114870 48 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 2:
AA G CTT GCA TGC AAA TTC TAT TTC AAG GAG ACA GTC ATA ATG AAA TAC
Lys Leu Ala Cys Lys Phe Tyr Phe Lys Glu Thr Vai Ile Met Lys Tyr 15 10 15 96
CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA
Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gin Pro 20 25 30 144
GCG ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG
Ala Met Ala Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala 35 40 45 192
CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGC ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA
Pro Ser Gin Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu 50 55 60 240
ACC GGC TAT GGT GTA AAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG
Thr Gly Tyr Gly Vai Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 65 70 75 80 288
GAG TGG CTG GGA ATG ATT TGG GGT GAT GGA AAC ACA GAC TAT AAT TCA
Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser 85 90 95 336
; GCT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA
: Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin 100 105 110 384
GTT TTC TTA AAA ATG AAC AGT CTG CAC ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC
Vai Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr 115 120 125 432 TAC TGT GCC AGA GAG AGA GAT TAT AGG CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC :* Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 130 135 140 : 480
ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC
Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly i · 145 150 155 160 528
TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCC TCC
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 165 170 175 : : 576
,J CTT TCT GCG TCT' GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT
·' ’ Leu Ser Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser ·, : 180 185 190 624 43 114870
GGG AAT ATT CAC AAT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA
Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys 195 200 205 672
TGT CCT CAG CTC CTG GTC TAT TAT ACA ACA ACC TTA GCA GAT GGT GTG
Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val c 210 215 220 5 720
CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAT TCT CTC AAG
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys 225 230 235 240 768
ATC AAC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT
lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His 10 245 250 255 816
TTT TGG AGT ACT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTC GAG ATC
Phe Trp Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 260 265 270 865 AAA CGG GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAATAATGAT ac Lys Arg Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 275 280 285 CAAACGGTAA TAAGGATCCA GCTCGAATTC 895 20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 3: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 285 aminohappoa 25 (B) Tyyppi: aminohappo .(D) Topologia: lineaarinen '·, (ii) Molekyylityyppi: proteiini 30 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 3:
Lys Leu Ala Cys Lys Phe Tyr Phe Lys Glu Thr Vai Ile Met Lys Tyr 15 10 15
Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gin Pro . ‘; 20 25 30
Ala Met Ala Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala ’ : 35 40 45 ' , Pro Ser Gin Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu 50 55 60 »
Thr Gly Tyr Gly Vai Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 65 70 75 80 44 114870
Glu Trp Leu Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser 85 90 95
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin 100 105 110
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr 115 120 125 c
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 130 135 140
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 10 165 170 175
Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 180 185 190
Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys 195 200 205 1*5
Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val 210 215 220
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys 225 230 235 240 lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His 20 245 250 255
Phe Trp Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 260 265 270
Lys Arg Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 275 280 285 :'; 25 (2) Tiedot sekvenssistä nro 4: 1 * ;, (i) Sekvenssin ominaisuudet: \\ (A) Pituus: 21 emäsparia : (B) Tyyppi: nukleiinihappo / 30 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen : « (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 35 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 4: - ·
i I
• i * i
tili I
’MM
45 114870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 5: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 21 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 5: AATTCTCATT ACCGTTTGAT Q 21 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 6: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 4 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo 20 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 25 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 6: ;· Glu Ile Lys Arg : 1 ,: (2) Tiedot sekvenssistä nro 7: j 30 : (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 717 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen 35 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 46 1 1 4870 (ix) Ominaisuus:
(A) Nimi/Avain: CDS
(B) Sijainti: 1..717 5 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 7: 48
CTG CAG GAG TCT GGG GGA CAC TTA GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA
Leu Gin Glu Ser Gly Gly His Leu Vai Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys 15 10 15 96
CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC GCT TTC AGT AGC TTT GAC ATG TCT
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe Asp Met Ser 20 25 30 144
TGG ATT CGC CAG ACT CCG GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA AGC ATT
Trp Ile Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai Ala Ser Ile 35 40 45 192
ACT AAT GTT GGT ACT TAC ACC TAC TAT CCA GGC AGT GTG AAG GGC CGA
Thr Asn Vai Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Vai Lys Gly Arg 50 55 60 240
TTC TCC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AGG AAC ACC CTA AAC CTG CAA ATG
Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Asn Leu Gin Met 65 70 75 80 288
AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC TTG TAT TTC TGT GCA AGA CAG
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Arg Gin 85 90 95 336
GGG ACT GCG GCA CAA CCT TAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC CAA GGG
Gly Thr Ala Ala Gin Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly
100 105 HO
384
T ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC
Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 432
V TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA AAA TCC
: i Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gin Ser Pro Lys Ser 130 135 140 480
ATG TCC ATG TCC GTA GGA GAG AGG GTC ACC TTG AGC TGC AAG GCC AGT
Met Ser Met Ser Vai Gly Glu Arg Vai Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser .! : 145 150 155 160 528
* GAG ACT GTG GAT TCT TTT GTG TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAA CAG
: Glu Thr Vai Asp Ser Phe Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin · 165 170 175 * · 576 47 1 1 4 8 7 0
TCT CCT AAA TTG TTG ATA TTC GGG GCA TCC AAC CGG TTC AGT GGG GTC
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 180 185 190 624
CCC GAT CGC TTC ACT GGC AGT GGA TCT GCA ACA GAC TTC ACT CTG ACC
5 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 200 205 672
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAG GAC TTT GCG GAT TAC CAC TGT GGA CAG
lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin 210 215 220 717
10 ACT TAC AAT CAT CCG TAT ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAG
Thr Tyr Asn His Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 15 20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 8: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 239 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo 25 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 'V (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 8:
Leu Gin Glu Ser Gly Gly His Leu Vai Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys 15 10 15 !;, Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe Asp Met Ser V : 20 25 30 *: Trp Ile Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai Ala Ser Ile 35 40 45
Thr Asn Vai Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Vai Lys Gly Arg 50 55 60 48 1 1 4870
Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Asn Leu Gin Met 65 70 75 80
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Arg Gin 85 90 95
Gly Thr Ala Ala Gin Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly 5 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Lys Ser 130 135 140 10
Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160
Glu Thr Val Asp Ser Phe Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin 165 170 175
Ser Pro Lys Leu Leu lie Phe Gly Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 180 185 190
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr 195 . 200 205 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin 210 215 220 20
Thr Tyr Asn His Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 (2) Tiedot sekvenssistä nro 9: ; : 25 (i) Sekvenssin ominaisuudet: ·;. (A) Pituus: 107 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 30 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 9: ·’ ‘ AATTCCATGG GCTTCCGATC TCTACTCGCC CTGAGCGGCC TCGTCTGCAC 50 : 35 AGGGTTGGCA CAGGTGCAGC TGCAGTAAGT GACTAAGCTC GAGATCAAAC 100 GGTGATA 107 ) M t t 49 1 1 4870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 10: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 107 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 10: AGCTTATCAC CGTTTGATCT CGAGCTTAGT CACTTACTGC AGCTGCACCT 50 GTGCCAACCC TGTGCAGACG AGGCCGCTCA GGGCGAGTAG AGATCGGAAG 100 CCCATGG 107 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 11: (i) Sekvenssin ominaisuudet: 20 (A) Pituus: 23 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 25 (ii) Molekyylityyppi: proteiini :, (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 11: ; Met Gly Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Vai Cys Thr 30 l 5 10 15 < > ♦
Gly Leu Ala Gin Vai Gin Leu Gin 20 50 1 1 4 8 7 0 (2) Tiedot sekvenssistä nro 12: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 8 aminohappoa 5 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 12:
Vai Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 13: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 64 emäsparia 20 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 25 .. (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 13: GCTTCCTCCC TTTTAGACGC AACTGAGAGC CTGAGGTTCA TCCCCAGCAT 50 ,·; CATTACACCT GAGC 64 30 (2) Tiedot sekvenssistä nro 14: , · i (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 68 emäsparia 35 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen «lii» e„ 1 1 4870 51 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 14: 5 CATGGCTGAG GTGTAATGAT GGTGGGGATG AAGCTCAGGC TCTCAGTTGC 50 GTCTAAAAGG GAGGAAGC 68 (2) Tiedot sekvenssistä nro 15: 10 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 24 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 15 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 15:
CATGGCCGAT ATCGCAAGCT TCCG
20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 16: 25 (i) Sekvenssin ominaisuudet: .. (A) Pituus: 24 emäsparia •, (B) Tyyppi: nukleiinihappo : (C) Säikeisyys: yksinkertainen V (D) Topologia: lineaarinen J 30 ' : (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) ,· - (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 16:
25 GATCCGGAAG CTTGCGATAT CGGC
» 52 1 1 4870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 17: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 41 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 17:
AATTCGATAT CGAAGCGCGG CGGATCCCAG GTGCAGCTGC A
15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 18: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 33 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo 20 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 25 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 18:
: GCTGCACCTG GGATCCGCCG CGCTTCGATA TCG
$ * » : (2) Tiedot sekvenssistä nro 19: }} 30 • : (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 12 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen . 35 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 19: 53 1 1 4870
Ile Ser Lys Arg Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu Gin 15 10 5 (2) Tiedot sekvenssistä nro 20: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 48 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo 10 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 15 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 20:
AATTCGATAT CGATCGAAGG TCGAGGCGGA TCCCAGGTGC AGCTGCAG
(2) Tiedot sekvenssistä nro 21: 20 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 39 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen ·. 25 (D) Topologia: lineaarinen » ·’, (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) t (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 21: i 30
GCTGCACCTG GGATCCGCCT CGACCTTCGA TCGATATCG
s * (2) Tiedot sekvenssistä nro 22: : (i) Sekvenssin ominaisuudet: 35 (A) Pituus: 14 aminohappoa j (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen » II»» 54 1 1 4 87 0 (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 22: 5
Ile Ser Ile Glu Gly Arg Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu Gin 1 5 10 (2) Tiedot sekvenssistä nro 23: 10 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 13 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 15 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 23: 2Q ggccgctgtg cag (2) Tiedot sekvenssistä nro 24: (i) Sekvenssin ominaisuudet: 25 (A) Pituus: 13 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen j f: 30 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 24:
:: AATTCTGCAC AGC
\ ’ 35 55 1 1 4870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 25: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 699 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (ix) Ominaisuudet:
(A) Nimi/Avain: CDS
(B) Sijainti: 1..699 15 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 25: 48
CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG CCC TCA CAG AGC CTG TCC
Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin Ser Leu Ser 15 10 15 96
ATC ACA TGC ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA ACC GGC TAT GGT GTA AAC
Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Vai Asn 20 25 30 144
TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA ATG ATT
Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile 35 40 45 192 TGG GGT GAT GGA AAC ACA GAC TAT AAT TCA GCT CTC AAA TCC AGA CTG . .· Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu .. 50 55 60 " ; 240
:· AGC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTA AAA ATG AAC
·. Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn i 65 70 75 80 ; 288 AGT CTG CAC ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC TAC TGT GCC AGA GAG AGA ::: Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg 85 90 95 336
; GAT TAT AGG CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC
Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser V : 100 105 110 ’· . 384
TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG
' ! Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 432 56 1 1 4 8 7 0
GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTT TCT GCG TCT GTG GGA
Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 130 135 140 480
GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT CAC AAT TAT
c Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr 145 150 155 160 528
TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 165 170 175 576
TAT TAT ACA ACA ACC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC
10 Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 180 185 190 624
AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAT TCT CTC AAG ATC AAC AGC CTG CAA CCT
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 195 200 205 672
15 GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG AGT ACT CCT CGG
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Arg 210 215 220 699
ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTC GAG
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 26: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 233 aminohappoa 25 (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 30 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 26: V ' Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser Gin Ser Leu Ser 15 10 15 57 114870
Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg 85 90 95
Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser 100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 5
Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 130 135 140
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr 145 150 155 160 10
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 165 170 175
Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro 15 195 200 205
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Arg 210 215 220
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 27: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 84 emäsparia 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen I (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 30 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 27: , . AATTCGATAT CGAAGCGCGG CGGATCCCAG GTGCAGCTGC AGTAAGTGAC 50 ; TAAGCTCGAG ATCAAACGGT GATAAGCTCG CTTA 84 ‘ 35 » · a a > 58 1 1 4870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 28: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 84 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 28: AGCTTAAGCG AGCTTATCAC CGTTTGATCT CGAGCTTAGT CACTTACTGC 50 AGCTGCACCT GGGATCCGCC GCGCTTCGAT ATCG 84 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 29: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 12 aminohappoa 20 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 25 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 29:
Ile Ser Lys Arg Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu Gin ; i 5 ίο 30 : (2) Tiedot sekvenssistä nro 30: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 8 aminohappoa 35 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 59 1 1 4870 (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 30: c Vai Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg ° 1 5 (2) Tiedot sekvenssistä nro 31: 10 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 40 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 15 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 31: 2Q tgtcacgatc tcctcttaag ggataagtgc cttggtagtc (2) Tiedot sekvenssistä nro 32: (i) Sekvenssin ominaisuudet: 25 (A) Pituus: 43 emäsparia • : (B) Tyyppi: nukleiinihappo , i ’ (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen » » s:': 30 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 32: * I >
’II,* AGTCGAATTC GATATCACAT TAGCGGATCC GGAGATCGTG ACA
\ ’ 35 t »
IMU
60 1 1 4870 (2) Tiedot sekvenssistä nro 33: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 5 aminohappoa 5 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 33:
Vai Thr Ile Ser Ser 1 5 15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 34: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 10 aminohappoa 20 (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: proteiini 25 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 34: '*> Gly Ser Ala Asn Vai Ile Ser Asn Ser Thr 15 10 i #
- < I
; 30 ' i'; (2) Tiedot sekvenssistä nro 35: .·. (i) Sekvenssin ominaisuudet: ; ' (A) Pituus: 20 emäsparia 35 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 61 1 1 48 70 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 35:
GAACTAACGA ACCGTCCATC
5 (2) Tiedot sekvenssistä nro 36: (i) Sekvenssin ominaisuudet: 10 (A) Pituus: 12 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 15 (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 36:
AATTGCGGCC GC
20 (2) Tiedot sekvenssistä nro 37: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 22 emäsparia 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo -: (C) Säikeisyys: yksinkertainen ,i i' (D) Topologia: lineaarinen j ; (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) li! 30 . *;1. (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 37
AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG
! < » > I i s ä ! * f
» I I
(2) Tiedot sekvenssistä nro 38: 62 1 1 4 8 7 0 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 32 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 38:
TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CC
15 (2) Tiedot sekvenssistä nro 39: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 24 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo 20 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 25 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 39:
GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA
:: (2) Tiedot sekvenssistä nro 40: 30 ’·· (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 22 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo . (C) Säikeisyys: yksinkertainen . 35 (D) Topologia: lineaarinen : (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 63 1 1 4870 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 40:
GTTTGATCTC GAGCTTGGTC CC
5 (2) Tiedot sekvenssistä nro 41: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 702 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo 10 (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 15 (ix) Ominaisuus:
(A) Nimi/Avain: CDS
(B) Sijainti: 1..702 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 41: 48
CTG CAG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG CAG CCT GGA GGG TCC CGG AAA
Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Arg Lys 15 10 15 96
CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AAC TTT GGA ATG CAC
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His 20 25 30 144
:· TGG GTT CGT CAG GCT CCA GAG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA TAC ATT
! Trp Vai Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Tyr Ile T 35 40 45 192
• t: AGT AGT GGC GGT ACT ACC ATC TAC TAT TCA GAC ACA ATG AAG GGC CGA
Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Met Lys Gly Arg 50 55 60 V : 240
TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT CCC AAG AAC ACC CTG TTC CTG CAA ATG
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gin Met 65 70 75 80 114870 288 64
ACC AGT CTA AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TTC TGT GCA AGA TCC
Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg Ser 85 90 95 336
TGG GCC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC
Trp Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val 100 105 110 5 384
TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 432
TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA TCT TAT CTT GCT GCA TCT CCT
Ser Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro 10 130 135 140 480
GGA GAA ATC ATT ACT ATT AAT TGC AGG GCA AGT AAG AGT ATT AGC AAA
Gly Glu lie lie Thr lie Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser lie Ser Lys 145 150 155 160 528
TAT TTA GCC TGG TAT CAA GAG AAA CCT GGA AAA ACA AAT AAG CTT CTT
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu 15 165 170 175 576
ATC TAC TCT GGA TCC ATT TTG CAA TCT GGA ATT CCA TCA AGG TTC AGT
lie Tyr Ser Gly Ser lie Leu Gin Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser 180 185 190 624
GGC AGT GGA TCT GGT ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGT AGC CTG GAG
20 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 195 200 205 672
CCT GAA GAT TTT GCA ATG TAT TAC TGT CAA CAG CAT AAT GAA TAC CCG
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro 210 215 220 702
__ TGG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTC GAG
; 20 Trp Thr phe G1y Qly Gly Thr Lys 225 230 : : 30 (2) Tiedot sekvenssistä nro 42: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 234 aminohappoa : (B) Tyyppi: aminohappo / . 35 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyyiityyppi: proteiini 65 1 1 4 8 7 0 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 42:
Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Arg Lys 15 10 15
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His 20 25 30
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Tyr Ile 35 40 45
Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Met Lys Gly Arg 50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gin Met 65 70 75 80
Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg Ser 85 90 95
Trp Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai 100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125
Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro 130 135 140
Gly Glu Ile Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys 145 150 155 160
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu 165 170 175
Ile Tyr Ser Gly Ser Ile Leu Gin Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu ; 195 200 205 '·[ Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro i i 210 215 220 • Trp Thr ρίιβ G1y G1y Gly Thr LyS Leu Glu 225 230 » · (2) Tiedot sekvenssistä nro 43: 66 1 1 4 87 0 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 16 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 43:
CATGCAGTCT TCGGGC
(2) Tiedot sekvenssistä nro 44: 15 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 16 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen 20 (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 44:
·, 25 TTAAGCCCGA AGACTG
(2) Tiedot sekvenssistä nro 45: i (i) Sekvenssin ominaisuudet: • 30 (A) Pituus: 6 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen * · 35 (ii) Molekyylityyppi: proteiini (xi) Sekvenssin kuvaus: Sekvenssi nro 45: *:'*! Asn Vai Ile Ser Lys Arg 1 5

Claims (9)

  1. 67 1 1 4870
  2. 1. Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella, tunnettu siitä, että 5 (a) home kuuluu Aspergillus-sukum, ja (b) Aspergillus sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa ScFv- fragmenttia ainakin yhden sellaisen ilmentymistä ja/tai eritystä säätelevän, homeesta peräisin olevan alueen ohjauksessa, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu 10 promoottorisekvensseistä, lopetussekvensseistä ja signaali- sekvenssejä koodaavista DNA-sekvensseistä, ja näiden toiminnallisista johdannaisista tai analogeista, minkä jälkeen mahdollisesti seuraa proteolyyttinen katkaisuvaihe ScFv-fragmenttiosan erottamiseksi fuusioproteiinista. 15
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu "ainakin yksi homeesta peräisin oleva ilmentymistä ja/tai eritystä säätelevä alue" on Aspergilluksen glukoamylaasigeenistä peräisin oleva promoottorisekvenssin ja signaalisekvenssiä koodaavan DNA- 20 sekvenssin sekä Aspergilluksesta saadun frpC-geenin lopetus- sekvenssin yhdistelmä. > · ;;· 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että i - mainittu "ainakin yksi homeesta peräisin oleva ilmentymistä ja/tai eri- 25 tystä säätelevä alue" on saatu Aspergillus niger var. awamorin en- .·. doksylanaasi ll-geenistä (ex/A-geeni), joka esiintyy plasmidissa ·*. pAW14B, joka esiintyy transformoidussa E. coli -kannassa JM 109 (talletus nro CBS 237.90).
  4. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ScFv-fragmenttia koodaava DNA-sekvenssi muodostaa osan fuusioproteiinia koodaavaa kimeeristä geeniä, jolloin mainittua ScFv-: fragmenttia koodaavaa DNA-sekvenssiä edeltää sen 5-päässä ainakin osa rakennegeeniä, joka koodaa erittyneen homeproteiinin kypsää ’ ] 35 osaa.
  5. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu rakennegeeni koodaa endoksylanaasia tai glukoamylaasia. 68 1 1 4870
  6. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fuusioproteiinissa oleva ScFv-fragmentti on sitoutunut mainittuun erittyneeseen homeproteiiniin tai sen osaan proteolyytti- 5 sessä katkaisukohdassa.
  7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu katkaisukohta on KEX2-tyyppinen kohta.
  8. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1—7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hometta viljellään sellaisissa olosuhteissa, että ScFv-fragmentin tuotos on vähintään 40 mg/l, edullisesti vähintään 60 mg/l, edullisimmin vähintään 90 mg/l ja sopivimmin vähintään 150 mg/l.
  9. 9. Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella, tunnettu siitä, että (a) home kuuluu yhteen suvuista Mucor, Neurospora ja Penicil-lium, ja (b) home sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa ScFv-frag- 20 menttia ainakin yhden sellaisen homeesta peräisin olevan, ilmentymistä ja/tai eritystä säätelevän alueen ohjauksessa, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu promoottorisekvens-seistä, lopetussekvensseistä ja signaalisekvenssejä :· koodaavista DNA-sekvensseistä, ja näiden toiminnallisista 25 johdannaisista tai analogeista, » · minkä jälkeen mahdollisesti seuraa proteolyyttinen katkaisuvaihe :·! ScFv-fragmenttiosan erottamiseksi fuusioproteiinista, jolloin hometta mahdollisesti viljellään sellaisissa olosuhteissa, että ScFv-fragmentin tuotos on vähintään 40 mg/l, edullisesti vähintään 60 mg/l, ; 30 edullisemmin vähintään 90 mg/l ja sopivimmin vähintään 150 mg/l. I · 69 114870
FI955446A 1993-06-09 1995-11-13 Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella FI114870B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93201661 1993-06-09
EP93201660 1993-06-09
EP93201660 1993-06-09
EP93201661 1993-06-09
EP93201706 1993-06-14
EP93201706 1993-06-14
PCT/EP1994/001906 WO1994029457A2 (en) 1993-06-09 1994-06-09 Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
EP9401906 1994-06-09

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI955446A0 FI955446A0 (fi) 1995-11-13
FI955446A FI955446A (fi) 1995-12-11
FI114870B true FI114870B (fi) 2005-01-14

Family

ID=27235312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI955446A FI114870B (fi) 1993-06-09 1995-11-13 Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0702721B1 (fi)
JP (1) JPH08511160A (fi)
AT (1) ATE198490T1 (fi)
AU (1) AU7123494A (fi)
CA (1) CA2162878A1 (fi)
DE (1) DE69426527T2 (fi)
DK (1) DK0702721T3 (fi)
ES (1) ES2155854T3 (fi)
FI (1) FI114870B (fi)
WO (1) WO1994029457A2 (fi)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9504344D0 (en) * 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
EP0826054B1 (en) * 1995-05-18 2003-12-17 Genencor International, Inc. Expression of glycosyltransferase in aspergillus
TR199903037T2 (xx) 1997-06-13 2000-06-21 Unilever N.V. A�art�c� enzimler.
ATE535154T1 (de) 1998-03-12 2011-12-15 Vhsquared Ltd Produkten die inaktivierte hefen oder schimmel enthalten, die auf ihrer aussenoberfläche aktive antikörper haben
EP0954978B1 (en) 1998-03-12 2011-11-30 VHsquared Limited New products comprising inactivated yeasts or moulds provided with active antibodies
BR0012711A (pt) 1999-07-27 2002-04-09 Unilever Nv Composição detergente enzimática, e, processos para aumentar a atividade e / ou a estabilidade de uma oxidorredutase dependente de co-fator e para branquear manchas presentes em tecidos
DE60139811D1 (de) 2000-12-19 2009-10-15 Unilever Nv Stabilisierung von schwerkettigen Kamelantikörpern durch Kaliumsalze
NZ534687A (en) * 2002-01-28 2007-10-26 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen (PSMA) seq id 54
HUE045710T2 (hu) 2005-05-18 2020-01-28 Ablynx Nv Javított, alfa tumor nekrózis faktor elleni nanobodies
BRPI0609797B8 (pt) 2005-05-20 2021-05-25 Ablynx Nv nanocorpos melhorados para o tratamento de desordens mediadas por agregação
EP2115004A2 (en) 2006-12-19 2009-11-11 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
WO2008074840A2 (en) 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the adam family and polypeptides comprising the same for the treatment of adam-related diseases and disorders
US20100062491A1 (en) * 2007-01-05 2010-03-11 Novozymes A/S Overexpression of the Chaperone BIP in a Heterokaryon
EP2260058A2 (en) 2008-04-07 2010-12-15 Ablynx N.V. Single variable domains against the notch pathways
EP2417163B1 (en) 2009-04-10 2019-02-27 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
DK2427486T3 (en) 2009-05-07 2015-05-26 Novozymes Biopharma Dk As A process for purifying albumin
CN102459332B (zh) 2009-06-05 2015-08-19 埃博灵克斯股份有限公司 用于预防和/或治疗呼吸道感染的单价、二价和三价抗人呼吸道合胞病毒(hrsv)纳米抗体构建体
EP2507262A1 (en) 2009-11-30 2012-10-10 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
WO2011073180A1 (en) 2009-12-14 2011-06-23 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use
WO2011083140A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
EP2552962B1 (en) 2010-03-26 2016-03-23 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7
AU2011254557B2 (en) 2010-05-20 2015-09-03 Ablynx Nv Biological materials related to HER3
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
AU2011328246B2 (en) 2010-11-08 2016-06-30 Ablynx N.V. CXCR2 binding polypeptides
US20150158948A9 (en) 2011-03-28 2015-06-11 Francis Descamps Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
EP2723772A1 (en) 2011-06-23 2014-04-30 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against ige
CA2850261C (en) 2011-09-30 2021-04-20 Ablynx Nv C-met immunoglobulin single variable domains
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2014087010A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ablynx N.V. IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE
AU2014272024B2 (en) 2013-05-29 2018-03-15 Vybion, Inc. Single chain intrabodies that alter huntingtin mutant degradation
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
CN107406497A (zh) 2014-12-19 2017-11-28 埃博灵克斯股份有限公司 半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体
EP4345112A2 (en) 2015-05-13 2024-04-03 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on cd3 reactivity
US10927186B2 (en) 2015-05-13 2021-02-23 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on TCR alpha/beta reactivity
WO2017013270A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Universite De Strasbourg Use of leptin signaling inhibitor for protecting kidneys from patients having ciliopathy
MX2018010485A (es) 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).
EP3526253A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 Institut Curie New anti-lsp1 antibody
KR102665596B1 (ko) 2016-11-16 2024-05-14 아블린쓰 엔.브이. Cd123 및 tcr 알파/베타에 결합할 수 있는 t 세포 동원 폴리펩티드
EP3624854A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Université de Strasbourg Protein-drug conjugates and their use in the treatment of cancers
TWI826376B (zh) 2017-06-02 2023-12-21 德商麥克專利有限公司 與ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３及聚集蛋白聚醣結合的多肽
MX2019014400A (es) 2017-06-02 2020-02-10 Merck Patent Gmbh Inmunoglobulinas que se unen a adamts.
BR112019025097A2 (pt) 2017-06-02 2020-07-28 Merck Patent Gmbh imunoglobulinas de ligação a mmp13
WO2018220225A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Ablynx Nv Aggrecan binding immunoglobulins
US20200371105A1 (en) 2017-07-28 2020-11-26 Institut Curie New subpopulations of cancer associated fibroblasts as prognosis markers for immunotherapy treatments
JP7266611B2 (ja) 2018-02-26 2023-04-28 アブリンクス・エヌ・フェー ペプチドリンカーをコードする改良されたヌクレオチド配列
KR101875564B1 (ko) * 2018-05-24 2018-07-09 국민대학교산학협력단 포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정
EP3636657A1 (en) 2018-10-08 2020-04-15 Ablynx N.V. Chromatography-free antibody purification method
WO2020245663A1 (en) 2019-06-01 2020-12-10 Institut Pasteur Nanobody-based ns1 assay for the specific diagnosis of acute zika virus infection
MX2022015157A (es) 2020-06-02 2023-01-16 Arcus Biosciences Inc Anticuerpos para tigit.
MX2023007299A (es) 2020-12-18 2023-07-04 Ablynx Nv Polipeptidos de reclutamiento de celulas t basados en la reactividad de tcr alfa/beta.
EP4337691A1 (en) 2021-05-12 2024-03-20 Université de Strasbourg Single domain antibody specific for phosphorylated h2ax and its uses
WO2023151894A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Henkel Ag & Co. Kgaa Process for the synthesis of alpha-methylene-gamma-butyrolactone
US20240132624A1 (en) 2022-07-27 2024-04-25 Ablynx N.V. Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024083843A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Confo Therapeutics N.V. Amino acid sequences directed against the melanocortin 4 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of mc4r-related diseases and disorders

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0539395A1 (en) * 1990-07-16 1993-05-05 Alko Group Ltd. IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION BY $i(TRICHODERMA)
WO1993008300A1 (en) * 1991-10-18 1993-04-29 The University Of Calgary Expression-secretion vectors for the production of biologically active fv fragments
IT1270866B (it) * 1993-03-10 1997-05-13 Eniricerche Spa Vettore ricombinante e suo impiego per la preparazione esocellulare di anticorpi in forma di singola molecola da bacillus subtilis

Also Published As

Publication number Publication date
ATE198490T1 (de) 2001-01-15
DK0702721T3 (da) 2001-05-21
WO1994029457A3 (en) 1995-03-09
EP0702721B1 (en) 2001-01-03
CA2162878A1 (en) 1994-12-22
DE69426527D1 (de) 2001-02-08
ES2155854T3 (es) 2001-06-01
WO1994029457A2 (en) 1994-12-22
AU7123494A (en) 1995-01-03
FI955446A0 (fi) 1995-11-13
JPH08511160A (ja) 1996-11-26
FI955446A (fi) 1995-12-11
EP0702721A1 (en) 1996-03-27
DE69426527T2 (de) 2001-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI114870B (fi) Menetelmä ScFv-fragmentteja käsittävien fuusioproteiinien valmistamiseksi transformoidulla homeella
JP3691055B2 (ja) 特異的結合力をもつ固定化タンパク質並びに各種プロセス・物品におけるそれらの使用
US6590078B2 (en) DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi
AU693569B2 (en) Synthetic leader peptide sequences
JP3542604B2 (ja) Ｙａｐ３シグナルペプチドをコードするｄｎａ構築体
Frenken et al. Recent advances in the large-scale production of antibody fragments using lower eukaryotic microorganisms
US5965384A (en) Methods for producing Humicola lipases in aspergillus
CZ284251B6 (cs) Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce
EP2607486B1 (en) KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
HUT68751A (en) A method of constructing synthetic leader sequences
JPH10501695A (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
US5612198A (en) Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
JP4180112B2 (ja) 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター
CA2146240C (en) Increased production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells
US5171673A (en) Expression of heterologous dna using the bacillus coagulans amylase gene
AU734541B2 (en) Increased production of secreted proteins by recombinant yeast cells
JPH04229188A (ja) 融合タンパク質の試験管内プロセシング
FI97549C (fi) Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa
AU620568B2 (en) The expression of antibody fragments in protease deficient bacterial host cells

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 114870

Country of ref document: FI

MA Patent expired