FI97549C - Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa - Google Patents
Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa Download PDFInfo
- Publication number
- FI97549C FI97549C FI882059A FI882059A FI97549C FI 97549 C FI97549 C FI 97549C FI 882059 A FI882059 A FI 882059A FI 882059 A FI882059 A FI 882059A FI 97549 C FI97549 C FI 97549C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- sequence
- tendamistat
- fusion protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
97549
Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomyces-soluissa a-amylaasi-inhibiittori tendamistaatin signaalipep-5 tidiä (prepeptidiä) koodaavan DNA:n käyttö jonkin polypepti-din, etenkin tendamistaatin, erittämiseksi Streptomyces-soluissa tunnetaan EP-patenttihakemuksesta julkaisunumero (EP-A) 0 161 629 tai ZA-patenttijulkaisusta 85/3672. Kyseinen DNA voidaan periaatteessa saada mistä tahansa tendamis-10 taattia tuottavasta kannasta, mutta edullisesti kuitenkin käytetään DE-hakemusjulkaisun 3 331 860 esimerkin 3 mukaan saatua DNA:ta.
FI-patenttihakemuksessa nro 880 986 on aiemmin esitetty menetelmä vierasproteiinien erittämiseksi Strepto-15 myces-soluista, jolle oli tunnusomaista haluttua proteiinia koodaavan sekvenssin vieminen mahdollisesti modifioituun tendamistaattigeeniin ja rekombinanttigeenin ilmentäminen Streptomyces-solussa. Tällöin siis tendamistaatin rakenne-geeniä käytetään toisen geenin kantajana ja saadaan fuusio-20 proteiineja, joissa toisen proteiinin aminohapposekvenssi on järjestäytynyt keskelle tendamistaatin aminohapposekvenssiä. Pilkottaessa tätä fuusioproteiinia kemiallisesti tai entsymaattisesti vieraan proteiinin vapauttamiseksi saadaan siten kaksi tendamistaattiosasekvenssiä. Mainittu aikaisem-25 pi patenttihakemus koskee niinikään tendamistaattijohdannaisia, joilla tarkoitetaan mm. myös oleellisesti lyhennetyn aminohappojäännösketjun käsittäviä johdannaisia. Nämä johdannaiset kykenevät reagoimaan reversiibelisti spesifisten reseptorien kanssa kilpailevassa estoreaktiossa.
30 Olemme sittemmin todenneet, että vierasproteiineja voidaan valmistaa Streptomyces-soluissa myös rakentamalla fuusioproteiinigeenejä, joissa halutun proteiinin rakenne-geeni on kytketty mahdollisesti modifioidun tendamistaat-tigeenin (koodaavan säikeen) 3'-päätyyn. Tendamistaatti-35 geenin modifiointi voi käsittää erityisesti ketjun lyhentämisen 3'-päädystä.
2 97549
Tendamistaattin koodaava DNA on esitetty EP-A 0 161 629 -hakemuksessa (jossa se esitetään DNA-sekvenssinä C ja liitteessä taulukossa 1). Tämä rakennegeeni käsittää useita restriktioentsyymikeskuksia, jotka soveltuvat käytet-5 täviksi koodattavien aminohapposekvenssien modifioinnissa. Sopivia kohtia ovat BstEII-restriktiokeskukset triplettien 31 ja 32 alueella, Stul-keskukset triplettien 43 ja 44 alueella sekä Sau3A-keskukset triplettien 52 ja 53 alueella. Sopivien liittäjien avulla voidaan näihin keskuksiin sijoit-10 taa yksi ylimääräinen tai useita ylimääräisiä aminohappo-jäännöksiä, tai poistaa kyseisten restriktiokeskuksien välissä sijaitsevia DNA-segmenttejä tai koodata lyhentyneitä aminohapposekvenssejä lisäämällä ylimääräisiä lopetuskodor neja. Tämän lisäksi voidaan paikkaohjautuvan mutatoinnin 15 avulla lisätä, vaihtaa tai poistaa nimenomaisia aminohappo-jäännöksiä. Näin saadaan proteiineja, jotka omaavat a-amy-laasi-inhibiittoriaktiivisuutta, tai sitten proteiineja, joilta tämä aktiivisuus puuttuu, mutta jotka silti edelleen reagoivat vastaavien reseptorien kanssa.
20 Keksintö koskee edelleen vastaavia geenirakenteita, näitä geenirakenteita sisältäviä vektoreita, näillä vektoreilla transformoituja Streptomyces-soluja, erittyviä fuu-sioproteiineja sekä niiden käyttöä vierasproteiinien ja tendamistaattijohdannaisten valmistamiseksi. Seuraavassa 25 selvitetään tarkemmin keksinnön edullisia muotoja, jotka on samoin määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Kuvioissa 1-4 esitetään eräitä keksinnön mukaisia plasmidirakenteita.
Kuviossa 1 esitetään, miten valmistimme hybridi-30 plasmidin pKK310, joka koodaa fuusioproteiinia, jossa osaa tendamistaatin aminohapposekvenssistä seuraa seitsemän aminohappojäännöksen muodostama siltasekvenssi, jota puolestaan seuraa apinaproinsuliinin aminohapposekvenssi.
Kuviossa 2 esitetään plasmidin pKK310 siirtäminen 35 ilmentämisplasmidiin pTFl.
3 97549
Kuviossa 3 esitetään, miten rakensimme plasmidin pRSlO, jossa osaa tendamistaattigeenistä seuraa pUC18:sta peräisin oleva polyliittäjä, sekä miten plasmidi siirrettiin ilmentämisplasmidiin pTFlO. Merkinnällä "mcs" tarkoite-5 taan pUC18:n polyliittäjäaluetta (monikloonauskeskus, engl. multiple cloning site).
Lopuksi kuviossa 4 esitetään, miten rakensimme plamidin pKK400, joka koodaa fuusioproteiinia, jossa täydellistä tendamistaatin aminohapposekvenssiä seuraa 11 10 aminohappojäännöksen muodostama siltasekvenssi, jota puo lestaan seuraa apinaproinsuliinin aminohapposekvenssi, sekä miten plasmidi siirrettiin ilmmentämisplsmidiin pGFl.
Kuvioita ei ole piirretty erityisessä mittakaavassa.
Keksinnön mukaisesti saadut, solusta uloskuljettuneet 15 fuusioproteiinit ovat sikäli edullisia, että ne ovat helposti viljelmäsuodoksesta eristettävissä. Eristäminen voi tapahtua sinänsä tunnettuun tapaan, edullisesti adsorptio-tai ioninvaihtokromatografiaa ja/tai geelisuodatusta käyttäen.
20 Halutun vierasproteiinin (fuusiopartnerin) vapaut taminen entsymaattisesti tai kemiallisesti lohkomalla suoritetaan samoin sinänsä tunnetulla tavalla.
Tällöin lohkomistapa määräytyy ensi sijaisesti halutun proteiinin aminohapposekvenssin perusteella. Useissa 25 tapauksissa on tarkoituksen mukaista liittää tendamistaat-tisekvenssin ja halutun proteiinin aminohapposekvenssin väliseen restriktiokeskukseen liittosekvenssi eli silta-sekvenssi. Esimerkiksi ellei haluttu proteiini sisällä me-tioniinia, voidaan liittävänä sekvenssinä käyttää Met-jään-30 nöstä, jolloin suoritettava lohkominen tapahtuu kemiallisesti kloori- tai bromisyaanin avulla. Jos liittävä sekvenssi käsittää karboksyylipäädyssään kysteiinijäännöksen, tai jos liittosekvenssi muodostuu Cys-jäännöksestä, voidaan suoritettavassa lohkomisessa käyttää entsymaattista 35 kysteiinispesifistä lohkomista tai esimerkiksi spesifistä S-syanylointia seuraavaa kemiallista lohkomista. Siltasek- 4 97549 venssin käsittäessä karboksyylipäädyssään tryptofaanijäännöksen tai sen muodostuessa Trp-jäännöksestä voidaan suorittaa kemiallinen lohkominen N-bromisukkiini-imidin avulla.
5 Halutut proteiinit, jotka aminohapposekvenssissään eivät sisällä Asp-Pro-sekvenssiä ja ovat lisäksi riittävän happostabiileja, voidaan tämän siltasekvenssin käsittävistä fuusioproteiineista lohkaista proteolyyttisesti sinänsä tunnetulla tavalla. Tällöin saadaan proteiineja, jotka kä-10 sittävät N-päädyssään proliini- tai C-päädyssään aspara- giinihappojäännäksen. Täten voidaan siis syntetisoida myös modifioituja proteiineja.
Asp-Pro-sidos saadaan vielä helpommin hapolla katkeavaksi käyttämällä siltasekvenssinä rakennetta (Asp) -Pro 15 tai Glu-(Asp)n~Pro, jossa n = 1 - 3.
Tunnettuja ovat samoin esimerkit entsymaattisesta pilkkomisesta, jossa voidaan käyttää myös paremmin spesifisyyden omaavia modifioituja entsyymejä (vrt. C.S.Craik et.ai., Science 228 (1985) 291 - 297). Kun haluttu eukary-20 oottinen peptidi on proinsuliini, on tarkoituksenmukaista valita peptidisekvenssi, jossa proinsuliinin N-päätyamino-happojäännökseen (Phe) on sitoutunut trypsiinillä lohkeava aminohappojäännös (Arg, Lys), esimerkiksi sekvenssi Ala-Ser-Met-.
25 Ellei haluttuun proteiiniin sisälly aminohapposek venssiä
Ile-Glu-Gly-Arg, voidaan mainitun sekvenssin siltasekvenssinä sisältävä 30 fuusioproteiini pilkkoa Xa-tekijällä (EP-A 0 025 190 ja 0 161 973).
Pilkkomistuotteiden eristämistapa määräytyy kyseisten proteiinien ominaisuuksien perusteella. Tendamistaatin sekä sen johdannaisten eristyksen osalta viittaamme DE-hakemus-35 julkaisussa 3 331 860 referoituun kirjallisuuteen.
- 97549 5
Seuraavissa esimerkeissä keksintöä kuvataan tarkemmin. Ellei toisin mainittu, ovat prosenttiluvut painoprosentteja.
Esimerkkejä havainnollistaa vastaavalla järjestys-5 numerolla varustettu kuva. Kuvioissa plasmideja ja geeni-fragmentteja ei ole esitetty mittakaavassa, erityisesti po-lyliittäjäsekvenssien kohdalla on mittakaavaa suhteessa laajennettu.
Esimerkki 1 10 Lähtöaineena käytetään plasmidia pKAI650, jota kuva taan DE-hakemusjulkaisussa 3 536 182 sekä EP-A-patenttihakemuksessa 0 218 204. Tämä plasmidi voidaan saada eristämällä DE-hakemusjulkaisussa 3 331 860 kuvatusta plasmidista pKAIl 650 bp:n HincII-Sstl-fragmentti ja kloonaamalla se 15 em. entsyymeillä avattuiin plasmidiin pUCl9. Kyseisestä plasmidista poistetaan yksittäiset Hindlll-restriktiokes-kukset (leikkaamalla kyseisellä entsyymillä, täyttämällä päätyjatkeet ja ligatoimalla) ja saadaan näin plasmidi pKAI650a (1).
20 Pilkotaan 2 ^ug:aa CsCl-gradienttisentrifugoinnin avulla puhdistettua plasmidi-(1)-DNA:ta 2 tunnin aikana täydellisesti 50 ^,ul:n reaktiolisäyksellä Stulrtä entsyymi valmi s ta jän ohjeiden mukaan ja poistetaan entsyymi fenolilla uuttamalla. Saostetaan linearisoitu DNA etanolilla, 25 uudelleenliuotetaan ja siirretään se sitten ligatointiseok-seen, johon toiseksi reaktantiksi lisätään 0,1 ^ug kemiallisesti syntetisoitua, 5'-päädyssään fosforyloitua kaksi-juosteista oligonukleotidiä (2)
Hindlll 30 5' C C C A A G C T T G G G 3' (2) 3' GGGTTCGAACCC 5'
Transformoidaan ligatointiseoksella E.coli-kantaa JM109 ja eristetään rekombinanttiplasmidin pKK3a (3) sisäl-35 tävät kloonit. Eristetyssä plasmidi-DNA:ssa esiintyy tun-• nusomaisesti restriktioentsyymi Hindlll-keskus, joka mah- . 97549 6 elollistaa tunnistuksen restriktioentsymaattisen analyysin avulla. pKK3a (3) on 12 emäsparin verran suurempi kuin pKAl650 (1) ja omaa nukleotidisekvenssin, jonka vaikutuksesta aminohapposekvenssi pitenee 4 aminohappojäännöksel-5 lä seuraavasti: 42 43 (44)
Glu Gly Pro Ser Leu Gly Leu 5' GAA GG C CCA AGC TTG GG C CTG 3’ 3' CTT CC G GGT TCG AAC CC G GAC 5'
Hindlll
Toisena lähtöaineena käytetään plasmidia pYE24 (4).
15 Tämä plasmidi saadaan avaamalla vektori pUCl8 EcoRI:lla ja HindIII:lla ja ligatoimalla saatuun lineaarisoituun plas-midiin apinaproinsuliinigeeni (taulukko 2; vrt. Wetekam et.ai., Gene 19 (1982) 179 - 183).
Pilkotaan 2 ^ug:aa plasmidia pYE24 (4) restriktio- 20 entsyymeillä EcoRI ja Hindlll, eristetään apinaproinsulii nigeeni elektroeluution avulla ja ligatoidaan nämä puhdistuksen sekä konsentroinnin etanolisaostuksen avulla jälkeen synteettisen DNA-liittäjän 25 5' AGC TTG ATG GCG 3' 3' AC TAC CGC TTA A 5' (5) (Hindlll) (EcoRI) 30 avulla. Sitten ligatointituote (6) viedään Hindlll:11a avattuun plasmidiin pKK3a (3), jolloin saadaan plasmidi pKK31 (7). Tämän rakenteen avulla muodostuu seuraava, ten-damistaattigeenin aminohappojäännöksen Gly 43 kodoniin liittyvä siltasekvenssi: • ,
II
- 97549 7 43 B 1
Gly Pro Ser Leu Met Ala Asn Ser Fhe
GGC CCA AGC TTG ATG GCG AAT TCT TTT 5 CCG GGT TCG AAC TAC CGC TTA AGA AAA
HindiII EcoRI
B 1 merkitsee tässä, samoin kuin taulukossa 2, apinapro-insuliinin B-ketjun alkukohtaa.
10 Plasmidissa (7) proinsuliinisekvenssi sijaitsee tendamistaattigeenissä. Tämän plasmidin muuttamiseksi keksinnön mukaiseksi plasmidiksi pilkotaan plasmidia (7)
Sphl:llä ja Sall:llä ja eristetään fragmentti (8). Avataan plasmidi pUC19 Sphl:llä ja Sall:llä ja ligatoidaan näin 15 linearisoitu plasmidi fragmenttiin (8). Näin saatu plasmidi pKK310 (9) koodaa fuusioproteiinia, jossa lyhennettyä ten-damistaattisekvenssiä ja edellä esitettyä liittäjää seuraa vielä proinsuliinisekvenssi.
Rakentaminen kokonaisuudessaan on esitetty kuvios- 20 sa 1.
Esimerkki 2
Plasmidin pKK310 (9) siirtämiseksi ilmentämisplasmidiin pilkotaan plasmidia (9) Sstl:llä ja Sphl:llä ja eristetään fragmentti (10).
25 Avataan kaupallisesti saatavana oleva ilmentämisvektori pIJ702 (11) (saatavana valmistajalta John Innes Foundation, Norwich, Englanti) Sphltllä ja Sstlillä ja ligatoidaan linearisoitu plasmidi (12) fragmenttiin (10). Transformoidaan kantaa Streptomyces lividans TK 24 (John Innes Foundation), 30 jolloin halutut kloonit tunnistetaan valikoimalla tiostrep-toniresistenssin suhteen. Tiostreptoniresistenteistä klooneista eristetään plasmidi-DNA ja varmistetaan rakenne rest-riktioentsyymianalyysin avulla. Geenin halutun mukaisesti suuntautuneena sisältävät plasmidit nimetään plasmideiksi 35 pTFl (13). Tämän rekombinanttiplasmidin sisältävät kloonit ' erittävät kasvualustaan proteiinia, jonka molekyylipaino on 8 97549 16 kD:tä. Tämä proteiini reagoi blot-immuunimäärityksessä positiivisesti insuliinivasta-aineiden kanssa. (Vrt. esimerkki 5).
pTFl:n (13) rakentaminen on esitetty kuviossa 2.
5 Esimerkki 3
Avataan plasmidi pKK3a (3) ja vektori pUC18 erikseen HindIII:lla ja ligatoidaan toisiinsa. Transformoidaan ligatointireaktiotuotteella E.coli-kantaa JM109, jossa onnistunut kloonaus ilmenee isopropyyli-8-tiogalaktopyranosi-10 din (IPTG:n) ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-8-D-galaktopy-ranosidin (X-Gal:n) läsnäollessa värittömien kolonioiden muodostumisena. Eristetään muodostunut rekombinanttiplas-midi pRSl (14) sinänsä tunnettuun tapaan. Pilkkomalla 1 yug:aa plasmidia restriktioentsyymillä SstI ja sen jälkeen 15 uudelleenligatoimalla deletoituu pUCl8-osuus polyliittäjä- sekvenssiin (mcs) asti sekä loppuosa tendamistaattigeenistä. Saadaan plasmidi pRSlO (15).
Plasmidi (15) soveltuu polyliittäjäosuutensa ansiosta erilaisten rakennegeenien kloonaukseen, jolloin saadaan 20 lyhentyneen tendamistaattisekvenssin omaavia vastaavia fuusioproteiineja koodaavia plasmideja.
Jos pilkotaan pRS10:tä (15) Sphl:llä ja Sstl:llä ja eristetään muodostuvista fragmenteista pienempi, voidaan tämä ligatoida esimerkissä 2 esitettyyn nähden analogisesti 25 ilmentämisvektoriin pIJ702. Näin saadaan ilmentämisvektori pTFIO (16) , joka niinikään polyliittäjäosuutensa ansiosta mahdollistaa useiden erilaisten rakenteiden luomisen.
pTFIO:n (16) rakentaminen on esitetty kuviossa 3.
Esimerkki 4 30 Avataan plasmidi pYE24 (4) EcoRI:lla, lisätään liit- täjä 5' AAT TCA AGC TTG 3' 3' GT TCG AAC TTA A 5’ 35 (EcoRI) Hind III (EcoRI) 9 97549 ja saadaan plasmidi pYE241. Pilkkomalla HindIII:lla ja ligatoimalla HindIII:lla leikattuun plasmidiin pKK3a (3) saadaan esimerkin 1 mukaan analogisesti plasmidi pKK32.
Tämä koodaa fuusioproteiinia, jossa tendamistaattisekvenssi 5 on sidottu proinsuliinisekvenssiin seuraavan siltasekvens-sin välityksellä: 43
Gly Pro Ser Leu Äsn Phe Ala Arg
GGC CCA AGC TTG AAT TCT GCA AGA TTT
10
CCG GGT TCG AAC TTA AGA CCT TCT AAA
Samoin kuin esimerkissä 1, pilkotaan plasmidia pKK32 Sphl:llä ja Sstl:llä ja alakloonataan saatu noin 650 bp:n fragmentti mainituilla entsyymeillä edeltä käsin avattuun 15 pUC19:ään. Saatava plasmidi pKK320 vastaa plasmidia pKK310 (9) edellä esitettyyn siltasekvenssiin asti (jossa liittäjän avulla viety sekvenssi on osoitettu lihavalla kirjasinlajilla) .
Analogisesti esimerkkiin 2 nähden alakloonataan 20 rekombinanttigeenin sisältävä Sstl-Sphl-fragmenttiplasmi-dista pKK320 plasmidiin pIJ702, jolloin saadaan ilmaisu-plasmidi pTF2. Kannassa S.lividans TK24 ilmentyy ja erittyy 16 kD:n fuusioproteiini, joka reagoi insuliinivasta-ainei-den kanssa (vrt. esimerkki 5).
25 pTF2:n rakentamisen ollessa oleellisesti samankal tainen kuin pTFl:n (13), kuviot 1 ja 2, tyydyttiin yhteen kuvalliseen esitykseen.
Esimerkki 5
Pilkotaan plasmidi pKK310 (9) osittain EcoRI:lla 30 siten, että ainoastaan toinen kahdesta EcoRI-keskuksesta leikkautuu auki. Päätyjatkeet täytetään Klenow-polymeraasin avulla, minkä jälkeen plasmidi uudelleenligatoidaan ja varmistutaan tuotteiden rakenteesta restriktioanalyysin avulla. Haluttu plasmidi, jossa proinsuliinigeenin päässä si-35 jainnut EcoRI-keskus on eliminoitunut, nimetään plasmidiksi pKK310a (17). Tämä sisältää siis enää vain yhden EcoRI- 10 97549 restriktiokeskuksen, joka sijaitsee lyhennetyn tendamis-taattigeenin ja proinsuliinigeenin välissä sijaitsevalla liittoalueella.
Plasmidin rakentamiseksi, joka koodaa täydellisen 5 tendamistaattisekvenssin sisältävää fuusioproteiinia, viedään tendamistaattia koodaavaan DNA-sekvenssiin (taulukko 1) aminohappojäännösten 68/69 kodonialueelle yksi Kpnl-keskus. Tätä varten pilkotaan eristettyä pKAI650a- (1) DNA:ta Sstl:llä ja Sphl:llä ja alakloonataan 650 bp:n suu-10 ruinen fragmentti niinikään kyseisillä entsyymeillä kak-soispilkottuun Ml3mpl8-faagin rengas-DNA:han ja valmistetaan yksijuoste-DNA:ta tunnettujen menetelmien mukaan. Käytetään 1 ^,ug tätä yksi juoste-DNA: ta sekä 0,1 ^ug muta-tointipohjustetta.
15 5'C GAG GTA CCG GGC GT 3' paikkaohjautuvassa mutatoinnissa (M.J. Zoller ja J.Smith, Nucleic Acid Res. 10 (1982) 6487 - 6500).
Mutanttigeenin sisältävistä eristetyistä M13-kloo- 20 neista, jotka saadaan esiinvalikoiduiksi lisätyn Kpnl-kes- kuksen avulla, eristetään rengas-DNA ja varmistutaan emäs- 6 8 vaihdosta (C vaihtuu G:ksi Arg -kodonin 3. asemassa). Nukleotidivaihto ei siis aiheuta mitään muutosta aminohapposekvenssiin mahdollistaen kuitenkin halutun yhden uuden 25 restriktiokeskuksen viennin tendamistaatin rakennegeeniin.
66 67 68 69 70
His Ala Arg Tyr Leu 30 CAC GCC CGC TAC CTC
GTC CGG GCC ATC GAG
Kpnl
Mutatoitu sekvenssi alakloonataan Sstl-Sphl-lohkomi- sen avulla M13mpl8-rengas-DNA:sta plasmidiin pUCl9, jolloin 35 saadaan plasmidi pKAI651 (18).
Il u 97549
Kontrollin vuoksi siirretään plasmidin (18) 650 bp:n Sstl-SphI-insertti esimerkin 2 menettelyä vastaavasti plas-midiin pIJ702, jolloin saadaan plasmidi pAX651. Transformoitaessa tällä plasmidilla Streptomyces lividans-kantaa TK 5 24 saadaan tendamistaatille sama ilmaisutaajuus kuin alku peräisen tendamistaattigeenin käsittävällä plasmidilla pAX650 (DE-hakemusjulkaisu 3 536 182, kuvio 3).
Keksinnön mukaisen plasmidin valmistamiseksi ten-damistaatin aminohapposekvenssin kokonaisuudessaan käsit-10 tävää fuusioproteiinia silmälläpitäen pilkotaan seuraavaksi plasmidia pKAI651 (18) Sphl:llä ja Kpnlillä ja ligatoidaan keskenään saatava pienempi fragmentti, liittäjä (19) 69 70 71 72 73 74 15 (Tyr)Leu Ala Arg Cys Leu Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly 3'
5' CTC GCT CGC TGC CTT TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG
3' C ATG GAG CGA GCG ACG GAA AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TTA A 5' (Kpnl) (ig) (EcoRI) 20 sekä Sphl:llä ja EcoRI:11a avattu plasmidi pKK310a (17).
Ligatointiseoksella transformoidaan E.coli-kantaa JM109, eristetään plasmidi-DNA ja varmistutaan oikeanlaisesta fuusioitumisesta DNA-sekvenssoinnin avulla. Oikean 25 sekvenssin omaava plasmidi nimetään plasmidiksi pKK400 (20).
Liittäjä 19 ei koodaa ainoastaan loppuja tendamis-taattiaminohappojäännöksiä, vaan myös varsisekvenssiosuut-ta, joka erottaa toisistaan tendamistaatin ja proinsuliini-geenin koodaaman sekvenssin ja joka käsittää kaikkiaan, 30 mukaanlukien geenin 5'-päätykodoneja vastaavat jäännökset taulukosta 2, seuraavat 11 aminohappojäännöstä:
Phe-Asn-AIa-Met-AIa-Thr-G1y-Asn-Ser-AIa-Arg 35 Fuusioproteiini sisältää siis tässä varsisekvenssissä mm.
aminohappoja metioniini ja arginiini, jotka mahdollistavat pilkkomisen halogeenisyaanilla tai trypsiinillä.
12 97549
Eristetään plasmidista pKK400 (20) kaksoispilkkomi-sen Sstltllä ja Sphlsllä avulla noin 1090 bp:n insertti ja ligatoidaan DNA samoilla entsyymeillä avattuun plasmidi pIJ702- (12) DNA:han. Saadaan plasmidi pGFl (21). Transfor-5 moidaan ligatointiseoksella S. lividans-kantaa TK 24 ja eristetään tendamistaattiaktiivisuutta osoittavista tios-treptoniresistenteistä transformanteista plasmidi-DNA. Kaikki positiiviset kloonit sisältävät 1090 bp:n Sstl-Sphl-fragmentin pGFl:stä.
10 Plasmidin pGFl (21) rakentaminen on esitetty kuvios sa 4.
Tendamistaattiaktiivisuus määritetään maljoitusko-keen avulla, joka on kuvattu sekä EP-Al-julkaisun 0 161 629 esimerkissä 3 että DE-hakemusjulkaisussa 3 536 182, esi-15 merkki 2.
Plasmidin pGFl koodaamat fuusioproteiinit voidaan ilmentää menettelemällä tavalliseen tapaan. Jos inkuboidaan transformoitua S. lividans-TK 24 kantaa 4 vrksta 28°C:ssa ravistelukolveissa ja erotetaan myseeli viljelmäliuoksesta 20 sentrifugoimalla, voidaan fuusioproteiini todeta kirkkaasta supernatantista seuraavasti:
Lisätään 10 - 100 ^,ul:aan viljelmäsupernatanttia 20 - 200 ^ul 15 %:sta trikloorietikkahappoa, rikastetaan saostunut proteiini sentrifugoimalla, pestään se ja liuote-25 taan SDS:ää sisältävään määrityspuskuriin (U.Laemmli, Natu re 227 (1970) 680 - 685). Kaksi minuuttia kestävän inku-boinnin 90°C:ssa jälkeen suoritetaan elektroforeettinen erotus 10 - 17 %:sessa SDS-polyakryyliamidigeelissä. Saadaan proteiini, jonka molekyylipaino on 19 kD:tä, eli odo-30 tusten mukaisella molekyylipainoalueella tendamistaatin ja proinsuliinin muodostamalle fuusioproteiinille. Niinikään saatu fuusioproteiini reagoi sekä tendamistaatin että insuliinin vasta-aineiden kanssa.
13 97549
Taulukko 1
Tendamistaatin DNA-sekvenssi (koodijuoste) ja aminohapposekvenssi
_ 5'-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GTG
5 NH -Asp Thr Thr Vai Ser Glu Pro Ala Pro Ser Cys Vai 2
ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGC TAC TCA CAG GCC GAC
Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp 10 ts *« js
AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC
Asn Gly Cys Ala Glu Thr Vai Thr Vai Lys Vai Vai
TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC
^ Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Vai
GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC
Ala Pro Gly Gin Ile Thr Thr Vai Gly Asp Gly Tyr
ATC GGC TCG CAC GGC CAC CCG CGC TAC CTG GCT CGC
Ile Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Arg TGC CTT TAG-3'
Cys Leu Lopetuskodoni 14 97549
Taulukko 2
5' AAT TCT GCA AGA 3' GA CGT TCT
(Asn)Ser Ala Arg 5 (EcoRI) B 1
TTT GTG AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA GTG GAA GCT CTC
AAA CAC TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG GAT CAC CTT CGA GAG
Fhe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser Hls Leu Vai Glu Ala Leu 10
TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC
ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCT CCG AAG AAG ATG TGT GGG TTC TGG
Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Fhe Fhe Tyr Thr Fro Lys Thr C 1
15 CGC CGG GAG GCA GAG GAC CCT CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC
GCG GCC CTC CGT CTC CTG GGA GTC CAC CCC GTC CAC CTC GAC CCG
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Fro Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly
GGG GGC CCT GGC GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCG CT G GAG GGG
CCC CCG GGA CCG CGT CCG TCG GAC GTC GGG AAC CGC GAC CTC CCC
20 Gly Gly Fro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Fro Leu Ala Leu Glu Gly A 1
TCC CTG CAG AAG CGC GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGC ACC AGC ATC
AGG GAC GTC TTC GCG CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACG TGG TCG TAG
Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile 25
TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TAA TAG TCG ACC
ACG AGG GAG ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACG TTG ATT ATC AGC TGG
Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Sali 30 TGC AGC CA 3' ACG TCG GTT CGA 5'
FstI (Hindlll)
Bl, Cl ja Ai osoittavat apinaproinsuliinin B-, C- ja A-ketjun alkukohdan.
ti
Claims (8)
1. Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että halutun proteiinin rakenne- 5 geeni kytketään mahdollisesti modifioidun tendamistaatti-geenin koodaavan säikeen 3'-päätyyn, joka geeni koodaa taulukossa 1 esitetyn tendamistaatin tai sen modifikaation, joka edelleen kykenee reagoimaan reversiibelisti spesifisten reseptoreiden kanssa, ilmennetään tämä gee-10 nirakenne Streptomyces-isäntäsoluissa ja eristetään erittynyt fuusioproteiini viljelmäsupernatantista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tendamistaattigeeniä on lyhennetty koodaavan säikeen 3'-päädystä.
3. Geenirakenne, tunnettu siitä, että sen käsittämään mahdollisesti modifioidun tendamistaattigeenin koodaavan säikeen 3'-päätyyn, joka geeni koodaa taulukossa 1 esitetyn tendamistaatin tai sen modifikaation, joka edelleen kykenee reagoimaan reversiibelisti spesifisten 20 reseptoreiden kanssa, on kytketty muun proteiinin rakenne-geeni .
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen geenirakenne, tunnettu siitä, että tendamistaattigeeniä on lyhennetty koodaavan säikeen 3'-päädystä.
5. Vektori, tunnettu siitä, että se sisäl tää patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen geenirakenteen.
6. Streptomyces-solu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen vektorin.
7. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että 30 se sisältää N-päätyosuuden taulukossa I esitetyn tendamistaatin sekvenssistä tai sen modifikaatiosta joka edelleen kykenee reagoimaan reversiibelisti spesifisten reseptoreiden kanssa.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen tai patenttivaa-35 timuksen 1 tai 2 mukaisesti saatavan fuusioproteiinin käyttö, tunnettu siitä, että se tapahtuu mahdollisesti modifioidun tendamistaatin ja/tai sen fuusiopart-nerin valmistamiseksi. 97549
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873714866 DE3714866A1 (de) | 1987-05-05 | 1987-05-05 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3714866 | 1987-05-05 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI882059A0 FI882059A0 (fi) | 1988-05-03 |
FI882059A FI882059A (fi) | 1988-11-06 |
FI97549B FI97549B (fi) | 1996-09-30 |
FI97549C true FI97549C (fi) | 1997-01-10 |
Family
ID=6326841
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI882059A FI97549C (fi) | 1987-05-05 | 1988-05-03 | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0289936B1 (fi) |
JP (1) | JP2671260B2 (fi) |
KR (1) | KR970001235B1 (fi) |
CN (1) | CN1029989C (fi) |
AR (1) | AR241658A1 (fi) |
AT (1) | ATE94905T1 (fi) |
AU (1) | AU612144B2 (fi) |
CA (1) | CA1338338C (fi) |
DE (2) | DE3714866A1 (fi) |
DK (1) | DK175525B1 (fi) |
ES (1) | ES2045004T3 (fi) |
FI (1) | FI97549C (fi) |
HU (1) | HU204094B (fi) |
IE (1) | IE62522B1 (fi) |
IL (1) | IL86277A0 (fi) |
NO (1) | NO178036C (fi) |
NZ (1) | NZ224464A (fi) |
PT (1) | PT87400B (fi) |
ZA (1) | ZA883168B (fi) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
ATE132531T1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung eines insulin- vorprodukts in streptomyceten |
DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
DE3418274A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
ATE63757T1 (de) * | 1985-03-28 | 1991-06-15 | Chiron Corp | Expression durch verwendung von fusionsgenen fuer proteinproduktion. |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
ATE132531T1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung eines insulin- vorprodukts in streptomyceten |
-
1987
- 1987-05-05 DE DE19873714866 patent/DE3714866A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-28 DE DE88106786T patent/DE3884261D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 ES ES88106786T patent/ES2045004T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 EP EP88106786A patent/EP0289936B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 AT AT88106786T patent/ATE94905T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 AR AR88310742A patent/AR241658A1/es active
- 1988-05-03 NZ NZ224464A patent/NZ224464A/xx unknown
- 1988-05-03 KR KR1019880005131A patent/KR970001235B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 FI FI882059A patent/FI97549C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 IL IL86277A patent/IL86277A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 HU HU882276A patent/HU204094B/hu unknown
- 1988-05-04 PT PT87400A patent/PT87400B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 CA CA000565869A patent/CA1338338C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-04 ZA ZA883168A patent/ZA883168B/xx unknown
- 1988-05-04 IE IE133888A patent/IE62522B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 DK DK198802416A patent/DK175525B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 NO NO881942A patent/NO178036C/no unknown
- 1988-05-04 AU AU15559/88A patent/AU612144B2/en not_active Expired
- 1988-05-04 CN CN88102568A patent/CN1029989C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-06 JP JP63110295A patent/JP2671260B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bernan et al. | The nucleotide sequence of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus and characterization of the gene product | |
AU638277B2 (en) | Fusion proteins, their preparation and use | |
Kaster et al. | Analysis of a bacterial hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and by DNA sequencing | |
AU630450B2 (en) | Fusion proteins containing n-terminal fragments of human serum albumin | |
AU2002231784B2 (en) | Fusion protein for the secretion of a protein of interest into the supernatant of the bacterial culture | |
JPH01501283A (ja) | 新規な型のコロニー刺激因子―1 | |
US5573929A (en) | Secretion vector for hirudin or hirudin analog production | |
Nicolas et al. | High mobility group I (Y)-like DNA-binding domains on a bacterial transcription factor. | |
FI97549C (fi) | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa | |
WO1993003152A1 (en) | Igf-ii analogues | |
Paluh et al. | Characterization of Neurospora CPC1, a bZIP DNA-binding protein that does not require aligned heptad leucines for dimerization | |
Sprinkle et al. | Amino acid sequence requirements for the association of apocytochrome c with mitochondria. | |
US6194200B1 (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
Benner-Luger et al. | The mglB sequence of Salmonella typhimurium LT2; promoter analysis by gene fusions and evidence for a divergently oriented gene coding for the mgl repressor | |
US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
US6331421B1 (en) | DNA construct comprising a vector for expression of human cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase in E. coli and method of use of same | |
CA2002062A1 (en) | Process for the preparation of an insulin precursor in streptomycetes | |
AU618011B2 (en) | Preparation of novel protein sweeteners-monellin type | |
FI84362C (fi) | Foeraendring av dna-sekvensen mellan shine-dalgarno-sekvensen och startcodon av trp-operon foer foerbaettring av proteinproduktionen. | |
NO851308L (no) | Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid | |
JPH09299079A (ja) | 組換え単純ヘルペスウイルス1型プロテアーゼおよびその製造方法 | |
JPH04258294A (ja) | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 | |
JPH0723788A (ja) | 神経栄養因子の生産方法及びそのためのべクター | |
JPH0691833B2 (ja) | 利尿作用を有するポリペプチドの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |