NO851308L - Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid - Google Patents

Description

Det har i flere år vært interesse for genetisk ekspressjon av peptidet somatostatin 14 (SS14) via et E. coli/ plasmid-system fremstilt ved genteknikk. Den lille størrelse til somatostatin tillater konstruksjon og fremstilling av et syntetisk gen som koder for somatostatin.

Aminosyresekvensen til og virkningen av somatostatin

er beskrevet i US patentskrift nr. 3 904 594.

I Science, Vol. 198, 9. desember 1977, sider 1056 -

1063, rapporterte Keichi ITAKURA et al om ekspressjon av et kjemisk syntetisert gen for hormonet somatostatin i Escne-richia coli. Ved dette arbeidet ble et gen for somatostatin,

et peptidhormon hos pattedyr, syntetisert ved hjelp av kjemiske fremgangsmåter. Dette gen ble bundet til (3-galakto-sidasegenet fra Escherichia coli i plasmidet pBr322. Transformasjon av E. coli med det kimæriske plasmid-DNA førte til syntese av et polypeptid som omfattet aminosyresekvensen svarende til somatostatin. In vitro ble aktivt somatostatin spesifikt avspaltet fra det store kimæriske protein ved behandling med cyanbromid. På tilsvarende måte er det i EP patent-søknad nr. 1929 rapportert om syntese og kloning av et somato-statingen i 3~galaktosidasegenet som bæres av en plasmidvektor. Det rekombinante plasmidet innført i en stamme av E.

coli via genetisk transformasjon gir ekspressjon av et hybrid-protein mellom 3~galaktosidase og SS14. Somatostatin 14 ble avledet fra hybridproteinet ved hjelp av CNBr-spalting i Met-resten som knyttet somatostatin til resten av proteinet.

EP patentsøknad med publikasjonsnummer 36776 beskriver et annet E. coli/plasmid-system hvor det tilveiebringes ekspres-sjonsplasmider for fremstilling av heterologe polypeptidprodukter i E. coli, deriblant SS14.

Hjelpemidlene som ble brukt ifølge disse publikasjoner har en Trp promoter/operator, nucleotider som koder for det ribosomale bindingssete for Trp-leder, og nucleotider som koder for initiering av translasjon for ekspressjon av strukturelle gener som koder for aminosyresekvensen til de heterologe polypeptider. De inneholder ikke et Trp attenuator-område eller nucleotider som koder for det ribosomale bindingssete for TrpE.

Det uttrykte polypeptid er et spesifikt spaltbart, sammensatt protein som omfatter 6 aminosyrer av Trp-leder-peptidet pluss den siste tredjedel av TrpE-polypeptidet og somatostatin 14 peptidet. Hemmingen av Trp-operatoren oppheves ved tryptofanbegrensning og det oppstår høyeffektiv ekspressjon av det heterologe polypeptid, uhindret av atten-uering ettersom attenuatorområdet er blitt fjernet fra sys-temet. Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av somatostatin som et hybrid med et plasmidkodet polypeptid ved hjelp av en fremgangsmåte som er basert på bruken av E.coli Trp promoter/operator etterfulgt av Trp lederen og attenuatoren, det TrpE ribosomale bindingssete, det strukturelle genet for ca. de første to tredjedeler av TrpE-polypeptidet og det strukturelle genet for peptidet somatostatin 14, i nevnte rekkefølge.

Ifølge oppfinnelsen er en E.coli stamme med en ut-strykning i det kromosomale Trp operon blitt transformert med ekspressjonsplasmidet og cellene er blitt dyrket under lav konsentrasjon av tryptofan eller dens forløperforbindelse, indol. Når disse celler av E. coli Trp dyrkes i nærvær av tryptofan, utnytter de en del av den tilstedeværende amino-syre i mediet og etterlater, etter få timer, en Trp-konsentrasjon som er tilstrekkelig høy til å la cellene vokse videre, og lav nok til å opprettholde opphevelsen av hemmingen av Trp operatoren. Et brukbart konsentrasjonsområde er 3 til 8 ug tryptofan pr. ml dyrkningsmedium.

Tryptofanet i mediet kan erstattes med sin forløper-forbindelse, indol, i et konsentrasjonsområde fra ca. 2 til 6 ug/ml dyrkningsmedium. I dette tilfellet omdanner cellene av E. coli Trp forløperforbindelsen for Trp til Trp, som sannsynligvis nesten utelukkende utnyttes til cellevekst. Trp-konsentrasjonen i miljøet forblir tilstrekkelig lavt til å opprettholde opphevelsen av hemmingen av Trp operatoren.

Det heterologe polypeptid uttrykkes kontinuerlig opp til et maksimalt nivå som oppnåes etter 22 - 25 timers vekst.

Det er særlig overraskende at den "strategiske" fremgangsmåte som denne oppfinnelse er basert på , fører til et så godt resultat, mens læren ifølge teknikkens stand er at

Trp attenuatoren ikke bør være tilstede.

På den annen side gjør den samtidige tilstedeværelse av Trp lederen og attenuatoren i ekspressjonsplasmidet ifølge oppfinnelsen at den optimale Trp-konsentrasjon oppnåes uten å endre dyrkingsmediet under hele dyrkingstiden for cellene. Nettoresultatet er en kontinuerlig fremgangsmåte hvorved celler dyrkes mens det heterologe polypeptid uttrykkes. Genet som koder for SS14 er blitt fremstilt ved hjelp av kjemisk syntese som beskrevet i Fig. IA.

Tegningene illustrerer aspekter ved de foretrukne ut-førelsesformer av oppfinnelsen. Fig. IA Nucleotidsekvens til det kjemisk synteti-serte SS14-gen og aminosyresekvens for det samme SS14. Hindlll og BamHI angir gjenkjenningssteder for restriksjons-endonuclease. Nucleotidsekvensene innenfor pilene utgjør de forskjellige avsnittene, fra Sl til S8, som må syntetiseres kjemisk. Fig. IB. Fremgangsmåten for å få det kodende gen for SS14 til å oppstå fra de forskjellige avsnitt er vist. Den kjemiske syntese av oligonucleotider ble utført ved hjelp av fosfotriesterfremgangsmåten i fast fase ved å bruke dinucleo-tider som "byggestener" og polystyren som den faste bærer. De fleste kodonene ble valgt ut for å uttrykkes bedre i E. coli. Det fullstendige gen ble erholdt ved ligering av oligonucleo-tidene S-l til S-8 med T4-DNA-ligase. SS14-genet var også angitt å være i korrekt avlesningsramme med TrpE-genet. Fig. 2. Restriksjonskart for pSP2 plasmidvektor konstruert som beskrevet i teksten. Den tynne linje representerer pBR322 DNA, den tykke linje representerer E. coli kromosomal DNA som bærer Trp promoteren/operatoren, Trp ledersekvensen (TrpL), det hele TrpE strukturelle gen og en del av TrpD

R R

strukturelt gen (A TrpD).Ap og Tc : angir genene som tilfører resistens mot henholdsvis ampicillin og tetracyklin. "Ori" er opprinnelsesstedet for replikasjon av dette plasmid. Fig. 3. Konstruksjon av pSP2del og pSP3 plasmider utført som beskrevet i teksten. Se beskrivelsen av fig. 2. AE angir ufullstendig TrpE strukturelt gen. Fig. 4. Kloning av det syntetiske DNA-molekyl som koder for SS14 i plasmidvektoren pSP3, slik at plasmidet pSP4

dannes. Tc angir følsomhet overfor tetracyklin.

Fig. 5. Aminosyresekvens for hybridpolypeptidet TrpE-SS14.

Beskrivelsen nedenunder illustrerer konstruksjonen av plasmidvektoren pSP4 som er i stand til å uttrykke hybridpolypeptidet TrpE-SS14.

Konstruksjon av plasmidet pSP2

Plasmidet pSP2 ble konstruert ved å gå ut fra pBR322 (Bolivar et al, Gene, 2, 95, 1977) og Å EDlOf (Armstrong et al, Science, 196, 172, 1977 og Helsinki et al, i Recombinant Molecules, Tenth Miles International Symposium, Raven Press, 1977, sider 151-165), som ble brukt som kilde for E. coli Trp operon-DNA som strekker seg fra promoter til TrpD strukturelt gen. pBR322 og A EDlOf ble spaltet med restriksjons-enzymene EcoRI og Hindlll. Fragmentet EcoRI-Hindlll fra AEDlOf som bærer Trp operon regulatorfunksjonene, TrpE strukturelt gen og 5'-enden av TrpD strukturelt gen, ble ligert med det større fragment Hindlll-EcoRI fra pBR322 ved å bruke T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere celler av E. coli W3110ATrpE5 (Nichols ana Yanofsky, Methods in En.zymology, 101, 155, 1983). De transformerte celler ble utplatet på plater av minimumsmedium som manglet tryptofan. Som kilde for plasmidet med rekombinant DNA, pSP2, ble det brukt en Trp +-klon. Celler av denne klonen ble dyrket og lagret i rikt medium (dvs. NB, Difco) som inneholdt 50 ug/ml ampicillin (Ap). Restriksjonskartet for pSP2

er vist i fig. 2.

Konstruksjon av plasmidet pSP2del

Plasmid-DNA fra pSP2 ble spaltet med endonucleasen

Bgl II og det største fragment ble renset ved agarosegel-elektroforese og ligert til seg selv med T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen ble brukt til å transformere celler av W3110ATrpE5. Ap -transformanter ble valgt ut på "wutrient Agar" (Difco) som inneholdt 50 ug/ml Ap. En Ap -klon ble brukt som kilde for pSP2del-DNA hvis restriksjonskart er vist i fig. 3. Fjerningen av Bgl II fragmentet fra TrpE strukturelle gen forårsaket ekspressjon av et partielt TrpE-polypeptid,

med tap av dets enzymatiske virkning. Cellene av W3110 ATrpE5

med pSP2del må derfor dyrkes i nærvær av tryptofan.

Sammenknytningen av Bgl II seter i pSP2del frembringer et nytt stoppcodon for translasjon (Nichols et al, J.Moi. Biol. 146, 45-54 1981).

Det TrpE som kodes for av pSP2del (ATrPE) er sammensatt av 342 aminosyrer, i motsetning til de 520 i det fullstendige TrpE-protein som kodes for av plasmidet pSP2 (se på nytt fig. 3).

Konstruksjon av plasmidet pSP3

pSP2del-DNA ble spaltet med restriksjonsenzymet Bgl

II og deretter ligert med en omdannelsessekvens Bgl II-HindIII (fig. 3). Nucleotidrekkefølgen i omdannelsessekvensen var slik at restriksjonssetene for Bgl II ikke ble regenerert. Ligeringsblandingen ble spaltet med Hindlll, religert til

seg selv og brukt til å transformere W3110 ATrpE-celler idet man selekterte for Ap . I noen avledede rekombinante plasmider syntes DNA-kjeden mellom Hindlll i omdannelsessekvensen i TrpE og Hindlll som gir forbindelse med pBR322-DNA, å være blitt fjernet (se fig. 3).

Det aktuelle stoppcodon til det fjernede TrpE-gen befinner seg nu noen få codoner nedstrøms for Hindlll-setene. Det nye TrpE-protein er 328 aminosyrer langt.

Analyse av TrpE og avledede produkter hvor TrpE er fjernet

I våre foreløpige forsøk ble de plasmidholdige W3110A TrpE5 celler dyrket i LB (Luria-Bertani) medium som inneholder pr. liter vandig oppløsning, 10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gjærekstrakt og 10 g NaCl, supplert med 5 ug/ml ampicillin. Under slike betingelser tilføres tryptofanet fra mediet og Trp-operonet i både kromosom og plasmider hemmes derfor.

For opphevelse av hemmingen og for ekspressjon, ble cellene som var dyrket over natten i LB-mediet (ca. 2 OD,

590 nm) samlet opp ved sentrifugering og fortynnet 20 ganger med SMM (Spizizen Minimal Medium), som pr. liter vandig opp-løsning inneholder:

Etter autoklavering tilsettes:

Konsentrasjonen av Trp er tilstrekkelig til å la veksten av cellene skje og til å holde hemmingen av Trp-operonet lett opphevet. TrpE og derivater med utstrykninger ble etter 4 til 5 timer analysert ved å inkorporere radioaktive aminosyrer.

Kloning av SS- 14- gen og dets ekspressjon

pSP3-DNA ble spaltet med Hindlll- og BamHI-restrik-sjonsenzymer og det større fragment renset fra agarosegel. Denne DNA ble tilsatt til syntetisk SS14-DNA og ligert med

T4 DNA-ligase (se fig. 4). Ligeringsblandingen ble brukt til transformere W3110 ATrpE5-celler og det ble selektert for Ap -transformanter på plater som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. Det rekombinante plasmid som inneholdt SS14-gen ble isolert

og kalt pSP4.

Nucleotidsammensetningen av SS14-genet gir fremstilling av et hybridpolypeptid som inneholder det partielle TrpE og somatostatin. Foran somatostatinpeptidet i hybridproteinet befinner det seg en methioninrest som lar seg avspalte mea CNBr. Hybridpolypeptidet som uttrykkes av plasmidet pSP4 har den aminosyresekvensen som er vist i fig. 5 og kalles van-ligvis TrpE-SS14. De 323 første aminosyrene utgjør de første to tredjedeler av TrpE, mens de fire aminosyrene som er av-grenset med bindestreker, kodes for av omdannelsessekvensen Bgl II-HindIII (se fig. 3). Aminosyrene i omdannelsessekvensen etterfølges av de 14 spesifikke SS14-aminosyrer.

Fremstilling av s omatostatin hybridpolypeptid

W3110ATrpE (pSP4)-celler ble dyrket over natten i

300 ml minimumsmedium hvortil det var blitt tilsatt glukose og tryptofan slik som beskrevet ovenfor. Denne kultur (4,3 x 10 g celler/ml) ble fortynnet i 10 liter av det samme medium

og cellene fikk vokse under omrøring med skovlhjul (300 rpm) og med injeksjon av 3 til 4 liter luft ved 1 atm pr. minutt. Etter dyrking i 22 til 25 timer, nådde kulturen en OD (590 nm) på ca. 2. Cellene ble høstet og behandlet med CNBr slik som beskrevet av Itakura et al (Science, 198, 1056-1063, 1977). Det frigjorte somatostatin ble testet ved hjelp av RIA. Den gjennomsnittlige, iakttatte SS14-konsentrasjon var 300 ug/l bakteriekultur. Det ble iakttatt en økning opp til 400 ug/l sluttkonsentrasjon av SS14 når Trp i mediet ble erstattet med sin forløperforbindelse, indol (3,5 ug/ml). Det antas at det tryptofan som avledes fra omdannelsen av indol ved hjelp av bakteriene, nesten utelukkende utnyttes til selve bakterie-veksten. Disse betingelser er derfor ideelle for å opprettholde opphevelsen av hemmingen av Trp-operonet. Når cellene W3110ATrpE5 (pSP4) ble dyrket i 10 liter minimumsmedium, slik som tidligere beskrevet, som inneholdt 3,5 ug/ml indol i stedet for Trp, under omrøring med skovlhjul og innolåsing av bare 1 liter luft ved 1 atm pr. minutt, er den optiske tetthet som ble oppnådd etter dyrking i 22 til 2 5 timer, ca. 3 ved 590 nm. Reduksjonen av luftmengde injisert i mediet under dyrkingen resulterte i en 50% økning av bakteriemasse uten at den relative konsentrasjon av polypeptidet TrpE-SS14 ble endret. Konsentrasjonen av SS14, påvist ved hjelp av RIA etter CNBr-behandling, var ca. 600 ug/l bakteriekultur.

Minskningen i lufting synes derfor å fremme bakterie-veksten og synes, uten å endre Trp-operon regulatorsystemet,

å åpne muligheten for utvinnelse av en større mengde bakterie-proteiner, deriblant TrpE-SS14, fra det samme volum bakteriekultur .

Karakterisering av polypeptidet TrpE- SS14

SS14-konsentrasjonen påvist ved hjelp av RIA ble funnet å være lavere enn forventet etter innholdet i hybridpolypeptidet. Det var mulig at en bestemt strukturell konforma-sjon av TrpE-SS14-proteinet i noen grad kunne være ansvarlig for den observerte forskjell og egenskapene til proteinet ble derfor undersøkt på følgende måte. Det ble fremstilt proteinekstrakt av W3110ATrpE5 (pSP4) celler og Trp-SS14 polypeptidet ble delvis renset ved utfelling med ammonium- sulfat ogkarakterisert vedhjelp av kromatografering på Sepharose 4B. Det ble derved påvist at det meste av TrpE-SS14 utvinnes fra bakteriene som komplekser med stor molekylvekt som kan oppløses ved hjelp av reduksjonsmidler.

Videre bestemmes slike aggregater både ved hjelp av inter- og intramolekylære disulfidbindinger. At slike komplekser inneholder TrpE-SS14-polypeptidet, påvises ved hjelp av et immunblottingsforsøk som viser immunreaktivitet mot SS14-antistoffer.

Det konkluderes med at den lavere SS14-konsentrasjon som ble påvist kan ha minst to årsaker: 1) Uspesifikke disulf idbindinger kan fange inn SS14-resten i polypeptidet til TrpE-SS14 og derved hindre CNBr-fri-gjørelsen av kvantitative mengder immunreagerende SS14-pep-tid (ringformen). 2) Aggregater med TrpE-SS14 som kan være tilstede inne i cellene, er mindre sensitive overfor CNBr-spalting og fører derved til en minskning i mengde frigjort ringformet SS14.

Celler av E. coli W3110ATrpE5 som inneholder de her beskrevne plasmider er deponert ved ATCC (Rockville, Maryland, USA) og har fått følgende deponeringsbetegnelser:

Claims (15)

1. Plasmidvektor for ekspressjon i E. coli av et hybridpolypeptid som inneholder en homolog TrpE-sekvens og en heterolog sekvens, karakterisert ved at den inneholder hele Trp-regulatorsystemet med promoter, operator, Trp leder og Trp attenuator.

2. Plasmidvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den inneholder minare enn alt DNA som koder for TrpE.

3. Plasmidvektor ifølge krav 2, karakterisert ved at den i rekkefølge inneholder E. coli Trp promoter/operator, Trp leder og attenuator, TrpE ribosomalt bindingssete, DNA som koder for de første to tredjedeler av TrpE, og gen som koder for somato-statinpeptid.

4. Plasmid pSP4, karakterisert ved at det er som beskrevet i krav 3.

5. Plasmid, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av pSP2, pSP2del og pSP3.

6. Fremgangsmåte for å uttrykke et polypeptid fra bakterier , karakterisert ved at det anvendes bakterier transformert med plasmidvektoren ifølge krav 1.

7. Fremgangsmåte for å uttrykke et polypeptid fra E.coli, karakterisert ved at det anvendes bakterier transformert med plasmidvektoren ifølge krav 3.

8. Fremgangsmåte for å uttrykke et polypeptid fra E. coli, karakterisert ved at det anvendes bakterier transformert med plasmidvektoren ifølge krav 4.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 8, karakterisert ved at de transformerte bakterie-celler dyrkes i nærvær av en tryptofankonsentrasjon som er tilstrekkelig for cellevekst, mens hemmingen av Trp-operonet i noen grad oppheves.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 8, karakterisert ved at de transformerte bakterie-celler dyrkes i nærvær av en konsentrasjon av indol som er tilstrekkelig for cellevekst, mens hemmingen av Trp-operonet i noen grad oppheves.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bakteriecellene dyrkes under lufting med et luftvolum som er tilstrekkelig til delvis å inaktivere tryptofan eller indol.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at bakteriecellene dyrkes under lufting med luftvolum som er tilstrekkelig til delvis å inaktivere tryptofan eller indol.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bakteriecellene dyrkes i nærvær av en tryptofan- eller indolkonsentrasjon som er tilstrekkelig for cellevekst, mens hemmingen av Trp-operonet i noen grad oppheves, og under lufting med et luftvolum som er tilstrekkelig til delvis å inaktivere tryptofanet eller indolet.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at det fremstilte polypeptid spaltes med cyanbromid og at det derved fremstilte somatostatin utvinnes.

15. Hybridpolypeptidet TrpE-SS14, karakterisert ved at det har aminosyresekvensen som er vist i fig. 5.