JPS615788A - ソマトスタチン雑種ポリペプチド遺伝子 - Google Patents
ソマトスタチン雑種ポリペプチド遺伝子Info
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- JPS615788A JPS615788A JP60065088A JP6508885A JPS615788A JP S615788 A JPS615788 A JP S615788A JP 60065088 A JP60065088 A JP 60065088A JP 6508885 A JP6508885 A JP 6508885A JP S615788 A JPS615788 A JP S615788A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
プロモーター、オにレータ−、リーダー及びアテヌエー
ターを含む完全なＴｐｒ制御系を含有する新規なベクタ
ー、及びＥ、コリ中での雑種ポリペプチドの発現のため
の方法が提供される。この雑種ポリペプチドはソマトス
タチンの異種 （ｈａｔａｒｏｌｏｇｏｕｓ ）配列を含有することが
できる。
ターを含む完全なＴｐｒ制御系を含有する新規なベクタ
ー、及びＥ、コリ中での雑種ポリペプチドの発現のため
の方法が提供される。この雑種ポリペプチドはソマトス
タチンの異種 （ｈａｔａｒｏｌｏｇｏｕｓ ）配列を含有することが
できる。
数年来、遺伝子操作されたＥ−１’）／グラスミド系に
よるペグチドソマトスタチン１４（ＳＳ１４）の遺伝子
的発現に興味が持たれている。小サイズのソマトスタチ
ンは合成ソマトスタチンコード遺伝子の設計及び製造を
許容する。
よるペグチドソマトスタチン１４（ＳＳ１４）の遺伝子
的発現に興味が持たれている。小サイズのソマトスタチ
ンは合成ソマトスタチンコード遺伝子の設計及び製造を
許容する。
ソマトスタチンのアミノ酸配列及び効果は米国特許第３
，９０４．５９４号に記載されている。
，９０４．５９４号に記載されている。
サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ ）、Ｖｏｌ １９８．１
９７７年１２月９日において、イタクラ等はホルモンソ
マトスタチ／の化学合成遺伝子のＥ、コリにおける発現
を報告した。この研究においては、哺乳動物ホルモンで
あるツマスタチンの遺伝子が化学的方法により合成され
た。この遺伝子がプラスミドｐＢＲ３２２上のエタ」β
−−ガラストシダーゼ伝子に融合された。このキメラノ
ラスミドにょる見ヨ」の形質転換が、ソマトスタチンに
対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成をもた
らした。イン−ビトロにおいて、ンアノダンプロミドを
用いる処理によって大キメラ蛋白質から活性なソマトス
タチンが特異的に切シ出された。ヨーロッパ特許出願第
１９２９号は同様に、ソマトスタチン遺伝子の合成、及
びプラスミドベクターに担持されるβ−ガラストシダー
ゼ遺遺伝円内のクローニングについて報告している。遺
伝的形質転換によ込旦ヨフに挿入された組換シラスミド
は、β−ガラストンダーゼと８８１４との雑種蛋白質の
発現を可能にする。ソマトスタチン１４は、ソマトスタ
チンを残りの部分と連結するＭ＠を残基におけるＣＮＢ
ｒ切断によ９８種蛋白質から誘導される。ヨーロン・
ぐ特許出願公開第３６７７６号は、５Ｓ−１４を含む異
種ポリペプチド生成物の尤チリでの産生なもたらす他の
Ｅ、コリ／ｆラスミド系を開示している。
９７７年１２月９日において、イタクラ等はホルモンソ
マトスタチ／の化学合成遺伝子のＥ、コリにおける発現
を報告した。この研究においては、哺乳動物ホルモンで
あるツマスタチンの遺伝子が化学的方法により合成され
た。この遺伝子がプラスミドｐＢＲ３２２上のエタ」β
−−ガラストシダーゼ伝子に融合された。このキメラノ
ラスミドにょる見ヨ」の形質転換が、ソマトスタチンに
対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成をもた
らした。イン−ビトロにおいて、ンアノダンプロミドを
用いる処理によって大キメラ蛋白質から活性なソマトス
タチンが特異的に切シ出された。ヨーロッパ特許出願第
１９２９号は同様に、ソマトスタチン遺伝子の合成、及
びプラスミドベクターに担持されるβ−ガラストシダー
ゼ遺遺伝円内のクローニングについて報告している。遺
伝的形質転換によ込旦ヨフに挿入された組換シラスミド
は、β−ガラストンダーゼと８８１４との雑種蛋白質の
発現を可能にする。ソマトスタチン１４は、ソマトスタ
チンを残りの部分と連結するＭ＠を残基におけるＣＮＢ
ｒ切断によ９８種蛋白質から誘導される。ヨーロン・
ぐ特許出願公開第３６７７６号は、５Ｓ−１４を含む異
種ポリペプチド生成物の尤チリでの産生なもたらす他の
Ｅ、コリ／ｆラスミド系を開示している。
この公報中に記載されているベクターはＴｒｐプロモー
ターオペレーター、 Ｔｒｐリーダーリボゾーム結合部
位をコードするヌクレオチド、及び異種ポリペプチドの
アミノ酸配列をコードする構造遺伝子の発現のための翻
訳開始をコードするヌクレオチドを有する。これらはＴ
ｒｐアテヌエーター領域又はＴｒｐ Ｅ リｇシーム結
合部位をコードするヌクレオチドを含有しない。発現さ
れたポリ ａゾチドは、Ｔｒｐリーダーベゾチド＋Ｔｒ
ｐ Ｅポリ−（′ゾテドの最後の３個からなる６アミノ
酸、及びソマトスタチン１４−２ゾチドを含んで成る切
断可能な蛋白質である。トリシト７アンの制限によＦ）
Ｔｒｐオペレーターが抑制解除され、そして異種ポリ
ペプチドの非常に効率的な発現が生じ、アテヌエーター
領域が系から除去されているためにこの発現は妨害され
ない。
ターオペレーター、 Ｔｒｐリーダーリボゾーム結合部
位をコードするヌクレオチド、及び異種ポリペプチドの
アミノ酸配列をコードする構造遺伝子の発現のための翻
訳開始をコードするヌクレオチドを有する。これらはＴ
ｒｐアテヌエーター領域又はＴｒｐ Ｅ リｇシーム結
合部位をコードするヌクレオチドを含有しない。発現さ
れたポリ ａゾチドは、Ｔｒｐリーダーベゾチド＋Ｔｒ
ｐ Ｅポリ−（′ゾテドの最後の３個からなる６アミノ
酸、及びソマトスタチン１４−２ゾチドを含んで成る切
断可能な蛋白質である。トリシト７アンの制限によＦ）
Ｔｒｐオペレーターが抑制解除され、そして異種ポリ
ペプチドの非常に効率的な発現が生じ、アテヌエーター
領域が系から除去されているためにこの発現は妨害され
ない。
本発明はグラスミドによりコードされたポリ被ゾチドと
の雑種としてのソマトスタチンの製造に関し、このグラ
スミドはＥ、コリＴｒｐ ７’ロモータ−／オペレータ
ー、 Ｔｒｐリーダー及びアテヌエーター、ＴｒｐＥリ
ゾシーム結合部位、ＴｒｐＥポリペプチドの最初の約２
／３の構造遺伝子、及びソマトスタチン１４ペプチドの
構造遺伝子をこの順序で含んで成る。
の雑種としてのソマトスタチンの製造に関し、このグラ
スミドはＥ、コリＴｒｐ ７’ロモータ−／オペレータ
ー、 Ｔｒｐリーダー及びアテヌエーター、ＴｒｐＥリ
ゾシーム結合部位、ＴｒｐＥポリペプチドの最初の約２
／３の構造遺伝子、及びソマトスタチン１４ペプチドの
構造遺伝子をこの順序で含んで成る。
染色体Ｔｒｐオペーロン内に欠失を有するｐ２．１９株
をこの発明の発現ｆ２スミドにより形質転換し、そして
細胞を中程度の濃度のトリプトファン又はその前駆体で
あるインドールのもとて増殖せしめた。これらのＥ、コ
リＴｒｐ−細胞は、トリプトファンの存在下で増殖せし
めた場合培地中に存在するこのアミノ酸を部分的に利用
し、数時間後、このアミノ酸の濃度は細胞をさらに増殖
せしめるためには十分高いがＴｒｐオペレーターの抑制
解除を維持するためには十分低い濃度となる。トリプト
ファンの有効な濃度範囲は３〜８μｌｉｔ／ｒｌＬｌ培
地である。
をこの発明の発現ｆ２スミドにより形質転換し、そして
細胞を中程度の濃度のトリプトファン又はその前駆体で
あるインドールのもとて増殖せしめた。これらのＥ、コ
リＴｒｐ−細胞は、トリプトファンの存在下で増殖せし
めた場合培地中に存在するこのアミノ酸を部分的に利用
し、数時間後、このアミノ酸の濃度は細胞をさらに増殖
せしめるためには十分高いがＴｒｐオペレーターの抑制
解除を維持するためには十分低い濃度となる。トリプト
ファンの有効な濃度範囲は３〜８μｌｉｔ／ｒｌＬｌ培
地である。
培地中のトリノ・トファンは、約２〜６μＶＴｄ培地の
濃度範囲の前駆体インドールにより置き代えることがで
きる。午の場合、Ｅ、 ：ｉ ９ Ｔｒｐ−細胞がトリ
プトファンの前駆体をトリプトファンに転換し、これが
おそらくほとんど細胞増殖のためのみに使用される。環
境中のトリプトファン濃度はＴｒｐオペレーターの抑制
解除を維持するために十分に低く保持される。
濃度範囲の前駆体インドールにより置き代えることがで
きる。午の場合、Ｅ、 ：ｉ ９ Ｔｒｐ−細胞がトリ
プトファンの前駆体をトリプトファンに転換し、これが
おそらくほとんど細胞増殖のためのみに使用される。環
境中のトリプトファン濃度はＴｒｐオペレーターの抑制
解除を維持するために十分に低く保持される。
異種ポリ−！プチドが、２２〜２５時間の増殖の後に最
高レベルに達するまで連続的に発現される。
高レベルに達するまで連続的に発現される。
従来技術がＴｒｐアテヌエーターは存在すべきでないと
教示しているにもかかわらず、この発明の方法がこのよ
うな良好な結果をもたらすことは特に驚くべきことであ
る。
教示しているにもかかわらず、この発明の方法がこのよ
うな良好な結果をもたらすことは特に驚くべきことであ
る。
従来技術の教示にもかかわらず、この発明の発現シラス
ミド中のＴｒｐリーダー及びアテヌエーターの同時的存
在が、細胞の完全な増殖中に培地を変えることなく最適
Ｔｒｐ濃度を達成することを可能にする。この結果、細
胞が増殖し、他方異種ポリペプチドが発現される連続過
程が得られる。
ミド中のＴｒｐリーダー及びアテヌエーターの同時的存
在が、細胞の完全な増殖中に培地を変えることなく最適
Ｔｒｐ濃度を達成することを可能にする。この結果、細
胞が増殖し、他方異種ポリペプチドが発現される連続過
程が得られる。
８８１４をコードする遺伝子は、第１Ａ図に示すように
して化学合成により調製した。
して化学合成により調製した。
図面はこの発明の好ましい態様を例示している。
ｐｓＰ２ ｆラスミドの造成
ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ等、ジーン（Ｇｏｎｏ
）、 ２＋９５．１９７７）及びλＥＤ１０ｆ（Ａｒｍ
口ｙｏｎｇ等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ ）、Ｌリ
ド１７２，１９７７：及ヒＨｓｌｓｉｎｋｉ等、リコン
ビナントモレキャラス、第１０回マイルス国際シンポジ
ウム、ラペンプレス、１９７７．１５１−１６５頁〕か
らｐｓｐ ２プラスミドを造成した。λＥＤ１０ｆは、
ブローモーターからＴｒｐ Ｄ構造遺伝子に延びるＥ、
＊ ＋７ Ｔｒｐオペ−ロンＤＮＡの入手源として使用
した。ｐＢＲ３２２及びλＥＤ１０ｆをＥｃｏＲＩ及び
Ｈｌｎｄ［ｌ制限鑓素によ）消化した。Ｔｒｐオペ−ロ
ン制御機能部、ＴｒｐＥ構造遺伝子及びＴｒｐＤ構造遺
伝子の５′端を担持するλＥＤｌＯｆからのＥｃｏＲｒ
−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を、ｐＢＲ３２２のＨｌｎｄ Ｉ
ＩＩ−ＥｅｏＲＩ大断片と、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した。この連結混合物を用いて、旦１」Ｗ３
１１０ΔＴｒｐＥ５細胞（Ｎｉｃｈｏｌ＠及びＹａｎｏ
ｆ＋ｋｙ、メンッズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） １０１ 、１
５５ ｙ １９８３ ）を形質転換した。形質転換され
た細胞を、トリプトファンを欠く最少プレート培地上に
プレートした。シラスミド組換体ＤＮＡｐＳＰ２の分離
源としてＴｒｐ＋クローンを使用した。このクローンの
細胞を、アンピシリン（Ａｐ） ５０μ籠を含有する富
培地（すなわちＮＢ、ディフコ）中で増殖せしめそして
貯蔵した。ｐｓｐ ２の制限地図を第２図に示す。
）、 ２＋９５．１９７７）及びλＥＤ１０ｆ（Ａｒｍ
口ｙｏｎｇ等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ ）、Ｌリ
ド１７２，１９７７：及ヒＨｓｌｓｉｎｋｉ等、リコン
ビナントモレキャラス、第１０回マイルス国際シンポジ
ウム、ラペンプレス、１９７７．１５１−１６５頁〕か
らｐｓｐ ２プラスミドを造成した。λＥＤ１０ｆは、
ブローモーターからＴｒｐ Ｄ構造遺伝子に延びるＥ、
＊ ＋７ Ｔｒｐオペ−ロンＤＮＡの入手源として使用
した。ｐＢＲ３２２及びλＥＤ１０ｆをＥｃｏＲＩ及び
Ｈｌｎｄ［ｌ制限鑓素によ）消化した。Ｔｒｐオペ−ロ
ン制御機能部、ＴｒｐＥ構造遺伝子及びＴｒｐＤ構造遺
伝子の５′端を担持するλＥＤｌＯｆからのＥｃｏＲｒ
−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を、ｐＢＲ３２２のＨｌｎｄ Ｉ
ＩＩ−ＥｅｏＲＩ大断片と、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて連結した。この連結混合物を用いて、旦１」Ｗ３
１１０ΔＴｒｐＥ５細胞（Ｎｉｃｈｏｌ＠及びＹａｎｏ
ｆ＋ｋｙ、メンッズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） １０１ 、１
５５ ｙ １９８３ ）を形質転換した。形質転換され
た細胞を、トリプトファンを欠く最少プレート培地上に
プレートした。シラスミド組換体ＤＮＡｐＳＰ２の分離
源としてＴｒｐ＋クローンを使用した。このクローンの
細胞を、アンピシリン（Ａｐ） ５０μ籠を含有する富
培地（すなわちＮＢ、ディフコ）中で増殖せしめそして
貯蔵した。ｐｓｐ ２の制限地図を第２図に示す。
グラスミドｐｓＰ２ｄｅｌの造成
ｐｓＰ２ｆラスミドＤＮＡをＢｇｌ ＩＩエンドヌクレ
アーゼで分解し、そして大断片をアガロースダル電気泳
動によりＭ製し、そしてＴ ４ ＤＮＡリガーゼを用い
て自ら連結した。連結混合物を用いてＷ３１１０ＪＴｒ
ｐＥ５細胞を形質転換した。５０μ、！ｉ’／ｄのＡｐ
を含有するＮｕｔｒｌｅｎｔ Ａｇａｒ （７ｊイフコ
）上でＡｐ形質転換体を選択した。ｐｓＰ ２ ｄｅ
ｌの分離源トしてＡＰＲクローンを使用した。このプラ
スミドの制限地図を第３図に示す。ＴｒｐＥ構造遺伝子
からのＢｇｌｌｌ断片の除去が、酵素活性を喪失し゛た
部分的ＴｒｐＥポリペプチドの発現を惹起した。
アーゼで分解し、そして大断片をアガロースダル電気泳
動によりＭ製し、そしてＴ ４ ＤＮＡリガーゼを用い
て自ら連結した。連結混合物を用いてＷ３１１０ＪＴｒ
ｐＥ５細胞を形質転換した。５０μ、！ｉ’／ｄのＡｐ
を含有するＮｕｔｒｌｅｎｔ Ａｇａｒ （７ｊイフコ
）上でＡｐ形質転換体を選択した。ｐｓＰ ２ ｄｅ
ｌの分離源トしてＡＰＲクローンを使用した。このプラ
スミドの制限地図を第３図に示す。ＴｒｐＥ構造遺伝子
からのＢｇｌｌｌ断片の除去が、酵素活性を喪失し゛た
部分的ＴｒｐＥポリペプチドの発現を惹起した。
従りて、ｐＳＰ ２ ｄｅ １を有するＷ３１１０ Ｔ
ｒｐＥ ５細胞はトリプトファンの存在下で増殖させな
ければならない。
ｒｐＥ ５細胞はトリプトファンの存在下で増殖させな
ければならない。
ｐＳＰ ２ ｄｅ １中のＢｇｌ １１部位の連結にょ
シ新たな翻訳終止コドンが作り出される［： Ｎｉｅｈ
ｏｌｇ等、ツヤ−ナル・オツ・モしＩキャラ−・バイオ
ロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）１４６ 、４５−
５４．１９８１］。
シ新たな翻訳終止コドンが作り出される［： Ｎｉｅｈ
ｏｌｇ等、ツヤ−ナル・オツ・モしＩキャラ−・バイオ
ロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）１４６ 、４５−
５４．１９８１］。
ｐｓＰ ２ ｄ’ｅ ｌ によりコードされたＴｒｐＥ
（ΔＴｒｐＥ）は３４２個のアミノ酸から成シ、これに
対してｐｓｐ ２プラス。ドによりコードされる完全Ｔ
ｒｐＫ蛋白質は５２０個のアミノ酸から成る（第３図を
参照のこと）。
（ΔＴｒｐＥ）は３４２個のアミノ酸から成シ、これに
対してｐｓｐ ２プラス。ドによりコードされる完全Ｔ
ｒｐＫ蛋白質は５２０個のアミノ酸から成る（第３図を
参照のこと）。
以下余白
ＳＰ３ノラスミドの造成
ｐｓＰ ２ ｄａ Ｉ ＤＮＡをＢｇｌ ｌ制限硅素で
開裂し、そして次にＢｇｌ １１− Ｈｉｎｄ ｌｌコ
ンバーターにより連結した（第３図）。コンバーターの
ヌクレオチド配列はＢｇｌ ＩＩ部位が再形成されない
ものとした。浬結混合物Ｈ１ｎｄｎｌで消化し、自ｇ連
結し、そしてこれを用いてＷ３１１０ΔＴｒｐＥ細胞を
形質転換しＡｐについて選択した。幾つかの誘導体組換
プラスミドにおいては、Ｔｒｐ Ｅ 中のコンバーター
ノＨ１ｎｄｌ［［とｐＢＲ３２２ＤＮＡと結合している
Ｈｌｎｄｌｌｌとの間のＤＮＡが除去されていることが
明らかである（第３図）。
開裂し、そして次にＢｇｌ １１− Ｈｉｎｄ ｌｌコ
ンバーターにより連結した（第３図）。コンバーターの
ヌクレオチド配列はＢｇｌ ＩＩ部位が再形成されない
ものとした。浬結混合物Ｈ１ｎｄｎｌで消化し、自ｇ連
結し、そしてこれを用いてＷ３１１０ΔＴｒｐＥ細胞を
形質転換しＡｐについて選択した。幾つかの誘導体組換
プラスミドにおいては、Ｔｒｐ Ｅ 中のコンバーター
ノＨ１ｎｄｌ［［とｐＢＲ３２２ＤＮＡと結合している
Ｈｌｎｄｌｌｌとの間のＤＮＡが除去されていることが
明らかである（第３図）。
除去されたＴｒｐＥ遺伝子の実際の終止コドンは今やＨ
ｉｎｄ［１部位から下流の少数のコドンである。
ｉｎｄ［１部位から下流の少数のコドンである。
この新しいＴｒｐＥ蛋白質は３２８個のアミノ酸の長さ
を有する。
を有する。
ＴｒｐＥ、及びＴｒｐＥ除去誘導体生成物の分析発明者
等の予備的実験において、プラスミド含有Ｗ３１１０Ｔ
ｒｐ ｐＦ、５細胞を、１ｔの水溶液ａｂ１０ｇのバク
トートリグトン、５ｇのバクトー酵母エキス及び１０１
１のＮａＣ４を含有し５μＷのアンピシリンが補充され
たＬＢ （Ｌｕｒｉａ −Ｂｅｒｔａｎｉ ）培地中に
増殖せしめた。このような条件下では培地によＪ））リ
プトファンが補給され、従って染色体及びグラスミドの
両者のＴｒｐオペ−ロンは抑制下にある。
等の予備的実験において、プラスミド含有Ｗ３１１０Ｔ
ｒｐ ｐＦ、５細胞を、１ｔの水溶液ａｂ１０ｇのバク
トートリグトン、５ｇのバクトー酵母エキス及び１０１
１のＮａＣ４を含有し５μＷのアンピシリンが補充され
たＬＢ （Ｌｕｒｉａ −Ｂｅｒｔａｎｉ ）培地中に
増殖せしめた。このような条件下では培地によＪ））リ
プトファンが補給され、従って染色体及びグラスミドの
両者のＴｒｐオペ−ロンは抑制下にある。
抑制解除及び発現のため、ＬＢ培地中に一夜増殖した細
胞（ＯＤ約２，５９０ ｎｍ）を遠心により集め、そし
て次の組成を有するＳＭＭ（ＳｐｉｚｉｚｓｎＭｉｎｌ
ｍｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ）で２０倍に稀釈する。
胞（ＯＤ約２，５９０ ｎｍ）を遠心により集め、そし
て次の組成を有するＳＭＭ（ＳｐｉｚｉｚｓｎＭｉｎｌ
ｍｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ）で２０倍に稀釈する。
（ＮＨ４）２ＳＯ４２１Ｉ
Ｋｆ（２ＰＯ４６ｇ
Ｋ２）ＩＰＯ４１４！！
クエン酸ナトリウム・２Ｈ２ｏ １ｇＭｇ５
Ｏ４Ｑ、 ２ ｇ オートクレーブ殺菌した後、 ４０％グルコース １ｏｇトリプトファ
ン ５μｖｒを加える。
Ｏ４Ｑ、 ２ ｇ オートクレーブ殺菌した後、 ４０％グルコース １ｏｇトリプトファ
ン ５μｖｒを加える。
Ｔｒｐのこの濃度は、細胞の増殖を可能にし、そしてＴ
ｒｐオ被−ロンのわずかな抑制解除を維持するために十
分である。４〜５時間後、放射性アミノ酸の導入によ、
！２ ＴｒｐＥ及び除去誘導体を分析した。
ｒｐオ被−ロンのわずかな抑制解除を維持するために十
分である。４〜５時間後、放射性アミノ酸の導入によ、
！２ ＴｒｐＥ及び除去誘導体を分析した。
５Ｓ−１４遺伝子のクローニング及びその発現ｐｓＰ３
ＤＮＡをＨｌｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩ制限師素で消化し
、そして大断片をアガロースゲルにより精製した。この
ＤＮＡを８８１４合成りＮＡに加え、そしてＴ ４ Ｄ
ＮＡ ＩＪガーゼを用いて連結した（第４図）。
ＤＮＡをＨｌｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩ制限師素で消化し
、そして大断片をアガロースゲルにより精製した。この
ＤＮＡを８８１４合成りＮＡに加え、そしてＴ ４ Ｄ
ＮＡ ＩＪガーゼを用いて連結した（第４図）。
この連結混合物を用いてＷ３１１０ΔＴｒｐＥ ５細胞
を形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するプレート上でＡ ｐＲ形質転換体を選択した。
を形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含有するプレート上でＡ ｐＲ形質転換体を選択した。
５Ｓ１４遺伝子を含有する組換プラスミドを分離し、そ
してｐｓｐ ４と称した。
してｐｓｐ ４と称した。
５Ｓ１４遺伝子のヌクレオチド組成は部分的ＴｒｐＥ及
びソマトスタチンを含有する雑種ポリペプチドの産生を
可能にする。ソマトスタチンベゾチドはく・イブリド蛋
白質中でメチオニンにより置換されておシ、このメチオ
ニンはＣＮＢ ｒによｐ開裂され得る。ｐｓｐ ４によ
り発現された雑種ポリペグチドは第５図に示すアミノ酸
配列を示し、そしてＴｒｐＥ−８Ｓ１４と称する。最初
の３２３個のアミノ酸はＴｒ’ｐＥの最初の２７３を示
し、ハイホンで囲んだ４個のアミノ酸はＢｇ！ｎ −Ｈ
ｉｎｄ Ｉｌｌコンバーター（第３図参照のこと）によ
りコードされる。
びソマトスタチンを含有する雑種ポリペプチドの産生を
可能にする。ソマトスタチンベゾチドはく・イブリド蛋
白質中でメチオニンにより置換されておシ、このメチオ
ニンはＣＮＢ ｒによｐ開裂され得る。ｐｓｐ ４によ
り発現された雑種ポリペグチドは第５図に示すアミノ酸
配列を示し、そしてＴｒｐＥ−８Ｓ１４と称する。最初
の３２３個のアミノ酸はＴｒ’ｐＥの最初の２７３を示
し、ハイホンで囲んだ４個のアミノ酸はＢｇ！ｎ −Ｈ
ｉｎｄ Ｉｌｌコンバーター（第３図参照のこと）によ
りコードされる。
このコンバーターアミノ酸に続いて、５Ｓ１４に特徴的
な１４個のアミノ酸が存在する。
な１４個のアミノ酸が存在する。
ノマトスタチン雑種ポリベグチドの製造Ｗ３１１０ΔＴ
ｒｐＥ （ｐｓＰ ４ ）細胞を、前記のようにグルコ
ース及びトリプトファンが添加されている３００Ｍの最
少培地中に増殖せしめた。乙の培養物（４，３Ｘ１０８
細胞／ゴ）を１０ｔの同じ培地に稀釈し、そしてこの細
胞を、インペラー攪拌（３００ｒｐｍ）のもとで、そし
て３〜４１７分の１気圧の空気を注入しながら増殖せし
めた。２２〜２５時間の増殖の後、この培養物は約２の
ＯＤ（５９０ｎｍ）に達した。細胞を収得し、そしてイ
タクラ等〔サイｘンｙ、 （５ｃｉｅｎａｅ ）、 １
９８ ｒ１０５６−１０６３．１９７７）により記載さ
れたようにしてＣＮＢｒにより処理した。放出されたソ
マトスタチンをＲＩＡにより試験した。転換された５Ｓ
１４の平均濃度は３００μＩ／を細菌培養物でおった。
ｒｐＥ （ｐｓＰ ４ ）細胞を、前記のようにグルコ
ース及びトリプトファンが添加されている３００Ｍの最
少培地中に増殖せしめた。乙の培養物（４，３Ｘ１０８
細胞／ゴ）を１０ｔの同じ培地に稀釈し、そしてこの細
胞を、インペラー攪拌（３００ｒｐｍ）のもとで、そし
て３〜４１７分の１気圧の空気を注入しながら増殖せし
めた。２２〜２５時間の増殖の後、この培養物は約２の
ＯＤ（５９０ｎｍ）に達した。細胞を収得し、そしてイ
タクラ等〔サイｘンｙ、 （５ｃｉｅｎａｅ ）、 １
９８ ｒ１０５６−１０６３．１９７７）により記載さ
れたようにしてＣＮＢｒにより処理した。放出されたソ
マトスタチンをＲＩＡにより試験した。転換された５Ｓ
１４の平均濃度は３００μＩ／を細菌培養物でおった。
培地中のトリプトファンをその前駆体でおるインドール
（３，５μＶｍｌ ）により置き換えた場合、最終５Ｓ
１４濃度が４００μＶｔに増加した。
（３，５μＶｍｌ ）により置き換えた場合、最終５Ｓ
１４濃度が４００μＶｔに増加した。
１１１１ｍにより−るインドールの転換に由来するトリ
プトファンがほとんど細菌の増殖自体のみに使用された
と信じられる。従ってこのような条件がＴｒｐオペ−ロ
ンの抑制解除を維持するために理想的である。Ｗ３１１
０ Ｔｒｐ Ｅ ５ （ｐｓＰ４）細胞を、トリプトフ
ァンの代シに３．５μｍ１／ｍｌのインドールを含有す
る前記の最少培地１０を中で、インー！！２−攪拌のも
と、１ｔ／分の１気圧の空気の吹き込みを伴って増殖せ
しめる場合、光学濃度は２２〜２５時間の増殖の後５９
０ ｎｍにおいて約３に達する。増殖中の培地への空気
の吹込み量の減少が、ＴｒｐＥ−８Ｓ１４ポリベゾチド
の相対濃度の変化を伴わないで細菌体量５０％の増加を
もたらす。ＣＮＢｒ処理後にＲＩＡにより検出された５
Ｓ１４の濃度は約６００μル／７ ＪｉＢ菌培養物であ
った。
プトファンがほとんど細菌の増殖自体のみに使用された
と信じられる。従ってこのような条件がＴｒｐオペ−ロ
ンの抑制解除を維持するために理想的である。Ｗ３１１
０ Ｔｒｐ Ｅ ５ （ｐｓＰ４）細胞を、トリプトフ
ァンの代シに３．５μｍ１／ｍｌのインドールを含有す
る前記の最少培地１０を中で、インー！！２−攪拌のも
と、１ｔ／分の１気圧の空気の吹き込みを伴って増殖せ
しめる場合、光学濃度は２２〜２５時間の増殖の後５９
０ ｎｍにおいて約３に達する。増殖中の培地への空気
の吹込み量の減少が、ＴｒｐＥ−８Ｓ１４ポリベゾチド
の相対濃度の変化を伴わないで細菌体量５０％の増加を
もたらす。ＣＮＢｒ処理後にＲＩＡにより検出された５
Ｓ１４の濃度は約６００μル／７ ＪｉＢ菌培養物であ
った。
従って、通気の減少は細菌の増殖に好都合であシ、Ｔｒ
ｐオペ−ロン制御系を変化させず、そして同じ容量の細
菌培養物から一層多量の細菌蛋白質、従ってこれに伴っ
てＴｒｐＥ −Ｓ Ｓ １４の回収を可能にする。
ｐオペ−ロン制御系を変化させず、そして同じ容量の細
菌培養物から一層多量の細菌蛋白質、従ってこれに伴っ
てＴｒｐＥ −Ｓ Ｓ １４の回収を可能にする。
ＴｒｐＥ −Ｓ Ｓ １４ポリペプチドの特徴付けＲＩ
Ａにより検出された８８１４の濃度は雑種ポリペゾチド
中の含量により予想したものより低いことが見出された
。ＴｒｐＥ−８８１４蛋白質の特定の構造的配置が観察
された差異になんらかの寄与をしている可能性があり、
このため次に蛋白質の性質を検討した。Ｗ３１１０ Ｊ
ＴｒｐＥ５ （ｐｓＰ４ ）細胞の蛋白質抽出物を調製
し、そしてＴｒｐ−８Ｓ１４ポリペゾチドを硫酸アンモ
ニウム沈澱により部分的に精製し、そしてセファロース
４Ｂクロマトグラフイーによｐ特徴付けた。ＴｒｐＥ−
８８１４のほとんどが、還元剤により溶解することがで
きる高分子量複合体として細菌から回収されることが証
明された。
Ａにより検出された８８１４の濃度は雑種ポリペゾチド
中の含量により予想したものより低いことが見出された
。ＴｒｐＥ−８８１４蛋白質の特定の構造的配置が観察
された差異になんらかの寄与をしている可能性があり、
このため次に蛋白質の性質を検討した。Ｗ３１１０ Ｊ
ＴｒｐＥ５ （ｐｓＰ４ ）細胞の蛋白質抽出物を調製
し、そしてＴｒｐ−８Ｓ１４ポリペゾチドを硫酸アンモ
ニウム沈澱により部分的に精製し、そしてセファロース
４Ｂクロマトグラフイーによｐ特徴付けた。ＴｒｐＥ−
８８１４のほとんどが、還元剤により溶解することがで
きる高分子量複合体として細菌から回収されることが証
明された。
さらに、このような集合は、分子間及び分子内ジスルフ
ィド結合により決定される。この複合体がＴｒｐＥ −
Ｓ Ｓ １４ポリペグチドにより生ずることが、８８１
４抗体に対して免疫反応性を示すイムノプロット実験に
よυ証明される。
ィド結合により決定される。この複合体がＴｒｐＥ −
Ｓ Ｓ １４ポリペグチドにより生ずることが、８８１
４抗体に対して免疫反応性を示すイムノプロット実験に
よυ証明される。
検出される５Ｓ１４の濃度が低いのは少なくとも下記の
２つの理由によると結論される。
２つの理由によると結論される。
（１） ＴｒｐＥ−Ｓ Ｓ １４ポリペプチドの５８１
４部分に非特異的ジスルフィド結合が関与し、定量的に
免疫反応する５Ｓ１４ベゾチド（環状）のＣＮＢ ｒに
よる遊離が妨害される。
４部分に非特異的ジスルフィド結合が関与し、定量的に
免疫反応する５Ｓ１４ベゾチド（環状）のＣＮＢ ｒに
よる遊離が妨害される。
（２）細胞中に存在するかもしれないＴｒｐＥ−８８１
４集合体がＣＮＢ ｒ開裂に対して感受性でなく、この
ために放出される環状８８１４の量が減少する。
４集合体がＣＮＢ ｒ開裂に対して感受性でなく、この
ために放出される環状８８１４の量が減少する。
下記のシラスミドを含有する温シ」細胞Ｗ３１１０ΔＴ
ｒｐＥ５は央０←争Ｏ与各籟ＡＴＣＣ（ロツクペレ、メ
リーランド、米国）に、１９８５年３月１２日に寄１６
７１“６° 以下余白菌株の
名称 Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ２） Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ２−ｄｅｌ）Ｗ３１１
０ΔＴｒｐＥ５（ｐＳＰ３） Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ４）
ｒｐＥ５は央０←争Ｏ与各籟ＡＴＣＣ（ロツクペレ、メ
リーランド、米国）に、１９８５年３月１２日に寄１６
７１“６° 以下余白菌株の
名称 Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ２） Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ２−ｄｅｌ）Ｗ３１１
０ΔＴｒｐＥ５（ｐＳＰ３） Ｗ３１１０ΔＴｒｐＥ５（ｐｓＰ４）
第１図Ａは化学合成された８８１４のヌクレオチド配列
及び同じ５Ｓ１４のアミノ酸配列を示す。矢印間のヌク
レオチド配列は化学合成される種々のブロック８１〜Ｓ
８を示す。 第１図Ｂは種々のブロックから５Ｓ１４コート遺伝子を
形成する方針を示す。オリゴヌクレオチドの化学合成は
組立ブロックとしてジヌクレオチドを用いる固相トリエ
ステル法により行われる。コドンのほとんどが大腸菌中
で良好に発現されるように選択される。Ｓ−１〜Ｓ−８
オリゴヌクレオチドのＴ ４ ＤＮＡリガーゼによる連
結により完全遺伝子が得られる。次に、ＴｒｐＥ遺伝子
とリーディングフレームが整合する５Ｓ１４遺伝子が選
択される。 第２図はｐｓｐ ２プラスミドベクターの制限地―を示
す。細線がｐＢＲ３２２ＤＮＡを示し、太線がＴｒｐゾ
ロモータ／オペレー１−、 Ｔｒｐリーダー配列（Ｔｒ
ｐＬ）、完全なＴｒｐＥ構造遺伝子及び部分的ＴｒｐＤ
構造遺伝子（１ＴｒｐＤ）を有するＥ、コリ染色体ＤＮ
Ａを示す。Ａｐｍ及びＴｃＲはそれぞれアンピシリン及
びテトラサイクリンに耐性を付与する遺伝子を示す。Ｏ
ｒｉはこのグラスミドの複製開始点である。 第３図はｐｓＰ２ ｄｅｌグラスミド及びｐｓｐ ａプ
ラスミドの造成を示す。ΔＥは不完全なＴｒｐＥ構造遺
伝子を示す。 第４図は５Ｓ１４をコードする合成りＮＡ分子のｐｓｐ
ａプラスミドベクターへのクローニングによるシラス
ミドｐｓｐ ４の形成を示す。Ｔｃ１はテトラサイクリ
ンに対する感受性を示す。 第５図は雑種ＴｒｐＥ −ＳＳ １４ポリペゾチドのア
ミノ酸配列を示す。 以下余白 ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲｌ −４８７”−− ｃｏＲ１ ↓ 十ＢｇＪＩＩ 十ＢｇＪＩＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ コンバーター↓
及び同じ５Ｓ１４のアミノ酸配列を示す。矢印間のヌク
レオチド配列は化学合成される種々のブロック８１〜Ｓ
８を示す。 第１図Ｂは種々のブロックから５Ｓ１４コート遺伝子を
形成する方針を示す。オリゴヌクレオチドの化学合成は
組立ブロックとしてジヌクレオチドを用いる固相トリエ
ステル法により行われる。コドンのほとんどが大腸菌中
で良好に発現されるように選択される。Ｓ−１〜Ｓ−８
オリゴヌクレオチドのＴ ４ ＤＮＡリガーゼによる連
結により完全遺伝子が得られる。次に、ＴｒｐＥ遺伝子
とリーディングフレームが整合する５Ｓ１４遺伝子が選
択される。 第２図はｐｓｐ ２プラスミドベクターの制限地―を示
す。細線がｐＢＲ３２２ＤＮＡを示し、太線がＴｒｐゾ
ロモータ／オペレー１−、 Ｔｒｐリーダー配列（Ｔｒ
ｐＬ）、完全なＴｒｐＥ構造遺伝子及び部分的ＴｒｐＤ
構造遺伝子（１ＴｒｐＤ）を有するＥ、コリ染色体ＤＮ
Ａを示す。Ａｐｍ及びＴｃＲはそれぞれアンピシリン及
びテトラサイクリンに耐性を付与する遺伝子を示す。Ｏ
ｒｉはこのグラスミドの複製開始点である。 第３図はｐｓＰ２ ｄｅｌグラスミド及びｐｓｐ ａプ
ラスミドの造成を示す。ΔＥは不完全なＴｒｐＥ構造遺
伝子を示す。 第４図は５Ｓ１４をコードする合成りＮＡ分子のｐｓｐ
ａプラスミドベクターへのクローニングによるシラス
ミドｐｓｐ ４の形成を示す。Ｔｃ１はテトラサイクリ
ンに対する感受性を示す。 第５図は雑種ＴｒｐＥ −ＳＳ １４ポリペゾチドのア
ミノ酸配列を示す。 以下余白 ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲｌ −４８７”−− ｃｏＲ１ ↓ 十ＢｇＪＩＩ 十ＢｇＪＩＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ コンバーター↓
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＴｒｐＥ同種配列及び異種配列を含有する雑種ポリ
ペプチドのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現のため
のプラスミドベクターであって、プロモータ、オペレー
タ、Ｔｒｐリーダー及びＴｒｐアテヌエーターからなる
完全なＴｒｐ制御系の存在を特徴とするプラスミドベク
ター。 ２、ＴｒｐＥをコードするＤＮＡの全部より少ない部分
を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
のプラスミドベクター。 ３、Ｅ．コリＴｒｐプロモーター／オペレーター、Ｔｒ
ｐリーダー及びアテヌエーター、ＴｒｐＥリボゾーム結
合部位、ＴｒｐＥの最初の２／３をコードするＤＮＡ、
並びにソマトスチタンコード遺伝子が配列順序に存在す
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のプラス
ミドベクター。 ４、特許請求の範囲第３項記載のプラスミドｐＳＰ４。 ５、ｐＳｐ２、ｐＳＰ２ｄｅ１及びｐＳＰ３から成る群
から選ばれるプラスミド。 ６、細菌からのポリペプチドの発現方法であって、Ｔｒ
ｐＥ同種配列及び異種配列を含有する雑種ポリペプチド
のＥ．コリ内での発現のための、プロモータ、オペレー
ター、Ｔｒｐリーダー及びＴｒｐアテヌエーターから成
る完全なＴｒｐ制御系を有するプラスミドベクターによ
り形質転換された細菌を使用することを特徴とする方法
。 ７、Ｅ．コリＴｒｐプロモーター／オペレーター、Ｔｒ
ｐリーダー及びアテヌエーター、ＰｒｐＥリボゾーム結
合部位、ＴｒｐＥの最初の２／３をコードするＤＮＡ、
並びにソマトスタチンコード遺伝子が配列順序に存在す
るプラスミドベクターにより形質転換された細菌を使用
することを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法
。 ８、プラスミドｐＳＰ４により形質転換された細菌を使
用することを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方
法。 ９、前記形質転換された細菌の細胞を、Ｔｒｐオペーロ
ンをわずかに抑制解除しながら細胞の増殖を許容するの
に十分な濃度のトリプトファンの存在下で増殖せしめる
ことを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第８項に記
載の方法。 １０、前記形質転換された細菌の細胞を、Ｔｒｐオペー
ロンをわずかに抑制解除しながら細胞の増殖を許容する
のに十分な濃度のインドールの存在下で増殖せしめるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第８項に記載
の方法。 １１、トリプトファン又はインドールを部分的に不活性
化するのに十分な容量の空気を通気しながら前記細菌の
細胞を増殖せしめることを特徴とする特許請求の範囲第
６項記載の方法。 １２、トリプトファン又はインドールを部分的に不活性
化するのに十分な容量の空気を通気しながら前記の細菌
の細胞を増殖せしめる特許請求の範囲第７項記載の方法
。 １３、前記細菌の細胞を、Ｔｒｐオペーロンをわずかに
抑制解除しながら細胞の増殖を許容するのに十分な濃度
のトリプトファン又はインドールの存在下で、そしてこ
のトリプトファン又はインドールを部分的に不活性化す
るのに十分な容量の空気を通気しながら増殖せしめる特
許請求の範囲第８項記載の方法。 １４、産生されたポリペプチドをシアノゲンブロミドで
分解し、そしてこれによって生成したソマトスタチンを
回収することを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載
の方法。 １５、第５図に示されるアミノ酸配列を有する雑種Ｔｒ
ｐＥ−ＳＳ１４ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT47976/84A IT1198443B (it) | 1984-03-30 | 1984-03-30 | Espressione genetica di polipeptidi ibridi contenenti la sequenza della somatostatina |
| IT47976A/84 | 1984-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS615788A true JPS615788A (ja) | 1986-01-11 |
Family
ID=11263727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60065088A Pending JPS615788A (ja) | 1984-03-30 | 1985-03-30 | ソマトスタチン雑種ポリペプチド遺伝子 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0160190A3 (ja) |
| JP (1) | JPS615788A (ja) |
| AU (2) | AU4046185A (ja) |
| CA (1) | CA1301676C (ja) |
| DK (1) | DK131285A (ja) |
| ES (1) | ES8605284A1 (ja) |
| FI (1) | FI851288L (ja) |
| IL (1) | IL74620A (ja) |
| IT (1) | IT1198443B (ja) |
| NO (1) | NO851308L (ja) |
| ZA (1) | ZA852035B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304996A (ja) * | 1987-06-04 | 1988-12-13 | Toray Ind Inc | 融合タンパク質およびその製造方法 |
| JPH0380096A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-04-04 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1234977B (it) * | 1985-03-22 | 1992-06-09 | Serono Ist Farm | Espressione in e. coli polipeptidi ibridi contenenti la sequenza del fattore di rilascio dell'ormone della crescita |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK173092B1 (da) * | 1977-11-08 | 2000-01-10 | Genentech Inc | Rekombinant plasmid, fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet, bakterie indeholdende plasmidet, samt fremgangsmåde til f |
| AU542264B2 (en) * | 1979-06-01 | 1985-02-14 | G.D. Searle & Co. | Plasmid vectors |
| IE52122B1 (en) * | 1980-08-25 | 1987-06-24 | Univ California | Somatostatin or somatostatin precursors |
| EP0068719A3 (en) * | 1981-06-16 | 1984-03-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Deoxyribonucleic acids, their production and use |
| JPS59203495A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 外来遺伝子の新規な発現方法 |
-
1984
- 1984-03-30 IT IT47976/84A patent/IT1198443B/it active
-
1985
- 1985-03-13 EP EP85102891A patent/EP0160190A3/en not_active Withdrawn
- 1985-03-15 IL IL74620A patent/IL74620A/xx unknown
- 1985-03-19 ZA ZA852035A patent/ZA852035B/xx unknown
- 1985-03-22 DK DK131285A patent/DK131285A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-03-28 AU AU40461/85A patent/AU4046185A/en not_active Abandoned
- 1985-03-29 NO NO851308A patent/NO851308L/no unknown
- 1985-03-29 CA CA000477979A patent/CA1301676C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-29 ES ES541782A patent/ES8605284A1/es not_active Expired
- 1985-03-29 FI FI851288A patent/FI851288L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-03-30 JP JP60065088A patent/JPS615788A/ja active Pending
-
1989
- 1989-08-11 AU AU39547/89A patent/AU611048B2/en not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304996A (ja) * | 1987-06-04 | 1988-12-13 | Toray Ind Inc | 融合タンパク質およびその製造方法 |
| JPH0380096A (ja) * | 1989-08-24 | 1991-04-04 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8605284A1 (es) | 1986-04-01 |
| IL74620A (en) | 1990-12-23 |
| AU611048B2 (en) | 1991-05-30 |
| CA1301676C (en) | 1992-05-26 |
| IT8447976A0 (it) | 1984-03-30 |
| DK131285D0 (da) | 1985-03-22 |
| NO851308L (no) | 1985-10-01 |
| ES541782A0 (es) | 1986-04-01 |
| IL74620A0 (en) | 1985-06-30 |
| FI851288L (fi) | 1985-10-01 |
| AU3954789A (en) | 1989-11-30 |
| AU4046185A (en) | 1985-10-31 |
| ZA852035B (en) | 1985-11-27 |
| IT1198443B (it) | 1988-12-21 |
| EP0160190A3 (en) | 1987-07-15 |
| EP0160190A2 (en) | 1985-11-06 |
| FI851288A0 (fi) | 1985-03-29 |
| DK131285A (da) | 1985-10-01 |
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