JPS59203495A - 外来遺伝子の新規な発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、外来遺伝子の新規な発現方法に関する。さら
に詳細には、本発明は、外来遺伝子を微生物のオペロン
に組込み、ポリシストロンを形成するようにオペロンを
再構成し、該外来遺伝子を効率よく発現させる方法に関
する。

近年、組換えＤＮＡ技術の発達により、微生物とくに大
腸菌を利用して異種蛋白質の大量生産が可能となってい
る。異種蛋白遺伝子の宿主細胞内での発現効率の向上は
重要な開発課題である。

発現効率向上のだめに、転写開始に必要な遺伝情報であ
るプロモーターとしてＪａｃ系、　ｔｒｐ系のプロモー
ターを用いて転写の効率を高める方法、リポソーム結合
部位（ＳＤ配列）と翻訳開始コドン（主にＡＴＧ　）と
の間の距離と塩基配列を変えた組換え体を用いて翻訳の
効率を高める方法（ＨＭ、５ｈｅｐａｒｄら：　ＤＮＡ
、上、１２５（１９８２）〕などが知られている。

また真核細胞由来の遺伝子を翻訳開始の効率が高い原核
細胞の構造遺伝子の最初の部分に連結し、融合蛋白の形
として発現させれば、該遺伝子が高率に発現することが
知られている。

しかし、ヒト成長ホルモンやヒトインターフェロンなど
の人体投与を目的とする生理活性ペプチドの場合、原核
細胞由来の蛋白と融合した形あ の蛋白では副作用等の問題力沖ので、原核細胞由来の蛋
白を含まない蛋白として外来遺伝子を発現させる方法の
開発が期待されている。

本発明者らは、外来遺伝子の効率のよい発現を目的に研
究を重ねた結果、微生物のオペ口／に組込み、ポリシス
トロンを形成するよウニオペロンを再構成し、これを組
込んだプラスミドを用いれば、外来遺伝子を効率よく発
現できることを見い出し本発明を完成するに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、オペロンまたはオペロンの一部と外来遺伝子
とを組換え、ポリシストロンを形成するように再構成し
たオペロンを用い、外来遺伝子を発現する方法を提供す
る。

オペロンとしては、原核細胞由来のオペロン、たとえば
、大腸菌のトリプトファｙ（ｔｒｐ）オペロン（Ｃ，Ｙ
ａｎｏｆｓｋｙら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　９６６４７（１９８１））、スレオ−
ロン・オペｏ　ン［Ｐａ５ｃＴｏｃｏｓｓａｒｔら：　
Ｎｕｃ／ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦３３
９（１９８１）　］、＄ｘ１７４ファージのオペｏ　ン
［Ｆ、Ｓａｎｇｅｒら：Ｎａｔｕｒｅ　２６５６８７　
（１９７７）、　ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏ７！、１２５゜
２２５（１９７８）　）、λ７７−ジのオペｏ　ｙ　［
Ｆ、Ｓａｎｇｅｒら：　ＪｏＭａｉｌ　Ｂｉｏ４１６２
．７２９（１９Ｂ２）：］のようなポリシストロンを形
成しているオペロンがあげられる。

これらポリシストロン中の各シストロン上流には、その
シストロンの翻訳開始に必要なＳＤ配列を持っており、
第２番目以降のシストロンはすぐ上流にあるシストロン
の停止コドンが、ＳＤ配列の近傍に存在するか、あるい
は翻訳開始コド／とＳＤ配列とが重複していることが知
られているので、オペロンの再構築には、これらのポリ
シストロンの条件を満たすような塩基配列が形成される
ように外来遺伝子をオペロン中に組込む。

本発明に使用するオペロンは、活性の強いプロモーター
を持つことが好ましく、第１番目のシストロンには、翻
訳開始効率のよい遺伝子を配置させるのが好ましい。

翻訳開始コドンとＳＤ配列の周辺のＤＮＡ塩基配列は、
統計的に解析され、翻訳開始に最適な構造［Ｎｕｃｈ３
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８．３８９５（
１９８０）］や翻訳開始に必要な、あるいは適する法則
［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１
０　、２９７１（１９８２）　］などが報告されている
。これらの報告によると翻訳開始に最適な特徴的構造の
一つとして、翻訳開始コドン周辺のＤＮＡ塩基配列がア
デニンとチミンの塩基に富んでいることがあげられてい
る。

たとえば、リボプロティン（）ｐｐ）　（Ｃｅｌｌ　１
８゜１１０９（１９７９）：］、アルカリフォスファタ
ーゼ（ｐｈｏＡ）　（Ｎｕｃ＆ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　９　、５６７１（１９８１））、リポソ
ーム蛋白などをコードする遺伝子の翻訳開始コドンの周
辺のＤＮＡ塩基配列も、アデニンとチミンの塩基に富ん
でいる。

従って、効率のよい翻訳開始に必要な構造として、ＳＤ
配列と翻訳開始コドンの間の構造だけでなく、翻訳開始
コドン下流の塩基配列を含めた翻訳開始コドン周辺の構
造を調整する必要がある。

しかしながら、大腸菌においてプロモーターとＳＤ配列
の下流に外来遺伝子を連結し該外来遺伝子を発現させる
場合、該外来遺伝子の翻訳開始コドン下流のＤＮＡ塩基
配列を大腸菌の翻訳開始に適する構造に変えることは不
可能であるので、犬Ｐ＆菌の有する蛋白質合成能を最大
限に生かすことができなかった。

大腸菌の蛋白質合成能を最大限に生かすために本発明の
方法は有利である。すなわち、大腸菌の強力なプロモー
ターの下流に翻訳開始の効率が高い構造遺伝子を配置さ
せ、その下流に第２番目以降のシストロンとして目的の
外来遺伝子をポリシストロンを形成するように配置させ
る。このようにオペロンを再構成した場合、その強力な
プロモータ一部位から転写されたｒｎＲＮＡを鋳型とし
て、リポソーム分子はまず第１番目のジストロ／から効
率よく翻訳を開始し、引き続き同一のリポソーム分子が
第２番目以降のジストロ／を翻訳し蛋白質を合成する。

この結果、第２番目以降のシストロンは、前のシストロ
ンとの継かり具合を調整すれば、第１ジストロ／と同じ
効率で翻訳され蛋白質が合成されるので、大腸菌の有す
る蛋白合成能を十分に生かして外来遺伝子を発現させる
ことが可能である。

本発明の発現方法の具体例として、転写、翻訳の機構が
比較的詳細に解明されていて、しかも転写、翻訳の効率
が高いｔｒｐオペロンを利用した方法を次に記載する。

大腸菌のｔｒｐオペロンは、コリスミン酸からトリプト
ファ／への生合成に関与する酵素をコードしている５個
の構造遺伝子（ｔｒｐ　Ｅ＋　ｔｒｐ　Ｄ＋ｔｒｐ　Ｃ
，ｔｒｐ　Ｂ、　ｔｒｐＡ　）と、これらの遺伝子の発
現を制限する領域（ｔｒｐ　Ｐ、　ｔｒｐ　Ｏ＋　ｔｒ
ｐ　Ｌ＋　ｔｒｐ　ａ）から成る。ｔｒｐオペロンの５
個の構造遺伝子は、約７．０００塩基の長さの１個のポ
リジストロニックなｍＲＮＡ　、！：Ｌズ転写され、転
写開始はｔｒｐリプレッザ−（ｔｒｐ　Ｒ遺伝子の産物
）とオペレータ一部位（ｔｒｐ　Ｏ）との相互作用によ
って制限されている。プロモーター（ｔｒｐ　Ｐ）−オ
ペレーター（ｔｒｐ　Ｏ）領域内にある転写開始点とｔ
ｒｐ　Ｅ遺伝子の間にある領域は、リーダー領域とよば
れ、リーダー・ペプチドをコードするｔｒｐ　Ｌ遺伝子
とアテニーエータ一部位（ｔｒｐａ）を含む。

細胞内のトリプトファニル−ｔＲＮＡＯ量が多いと、転
写はアテニーエータ一部位で終結し、リーダー領域に続
く５個の構造遺伝子の転写は起らないが、トリプトファ
ニル−ｔＲＮＡの量が少いと、アテニーエータ一部位で
転写が終結せず、５個の構造遺伝子の転写が起る。

このような構造をもつｔｒｐオペロンの転写は、ｉｎ　
ｖｉｖｏにおいてはりプレッションとアテニュエーシヲ
ンにより制御されている。すなわち、リプレッションは
転写を’／７０に減少させ、アテニュエーションは１／
／８〜”／１０に減少させる。

結局、大腸舊細胞内のトリプトファンが欠乏状態にナル
ト、リプレッションとアテニュエーションが解除される
ことにより、トリプトファンが細胞内に豊富に存在する
ときに比べ、転写が最大約６００倍増大することになる
。

５個の構造遺伝子の第１番目の構造遺伝子の下流にポリ
シストロンを形成するように外来遺伝子を挿入し、オペ
ロンな再構成すれば、リプレッションやアテニエエーシ
ョンカカカラナいのでｔｒｐオペロンの転写、翻訳の効
率と同じ効率で、その外来遺伝子の発現が可能である。

ｔｒｐオペロンを含むＤＮＡの供給源としては、プラス
ミド　ＫＹＰ−１，ＫＹＰ−２，、ＫＹＰｐ −８，ＫＹＰ−９，ＫＹＰ−１０８，ｐＫＹＰ−１０９
ｐ またはその誘導体を用いることができる。これらのプラ
スミドは、実施例に記載の方法で製造される。

ｔｒｐオペロンの５個の構造遺伝子の内部に存在する適
当な制限酵素の認識部位、たとえば、Ｈｉｎｄｆｆｉ、
Ｃｌａｌ部位、Ｂａ１１部位、Ｂｙｌｉ部位。

Ｂｙ６１部位＋　ＥｃｏＲｖ部位ｒ　Ｈｉｎｃ１部位＋
　Ｎｒｕ　１部位、Ｐｖｕ１部位、、ｓｇｍ■−１１１
１ｓｅｔ１部位などで、これら制限酵素により、上記Ｄ
ＮＡを切断（消化）する。

ＤＮＡの消化は、通常０．１〜１００μグのＤＮＡを２
〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０ミリモル）の
トリス塩酸（ｐＨ６，ｏ〜９．５、好ましくはｐＨ７，
０〜８．０）、１〜１５０ミリモルのＮａＣＪおよび２
〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭ４
Ｊ２からなる液中で制限酵素０．１〜３００単位（好１
しくは］、　ｌ’ｆのＤＮＡに対し１〜３単位の酵素）
を用い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）にお
いて、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停止は
通常５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５〜３
０分間加熱することによるが、フェノールやジエチルピ
ロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる
方法も用いることができる。

得られるＤＮＡ断片の切断木端に、発現させるべき外来
遺伝子に翻訳に必要なＳＤ配列をその遺伝子の上流の適
切な位置に付加したＤＮＡ断片を連結する。

発現させるべき外来遺伝子としては、真核細胞の遺伝子
たとえばインターフェロン、インシーリン、成長ホルモ
ンなどの生理活性ペプチドをコードする遺伝子などがあ
げられる。好適にはヒトβ型インターフエクン（以下”
β−ＩＦＮ　’と略記する）が用いられる。

付加すべきＳＤ配列は１ａｃｚ遺伝子＋　ｔｒｐＬ逢好
＋ｚｐ’ｐ遺伝子ｒ　　ｐｈｏＡ遺伝子などの遺伝子由
来のものが用いられる。

遺伝子の上流、適切な位置とは、ＳＤ配列と翻訳開始コ
ドンの間の距離が効率のよい翻訳開始を可能にする距離
、通常は３〜２０地基上流になるような位置である。

ＤＮＡ断片を結合させる場合は、両ＤＮＡ断片を２〜２
００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のトリ
ス塩酸（ｐＨ６，０〜９．５、ｐＨ７，０〜８．０）、
２〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭ
ｇＣノ２．０．１〜１０ミリモル（好゛ましくけ０．５
〜２ミリモル）のＡＴＰおよび１〜５０ミリモル（好ま
しくは５〜１０ミリモル）のジチオスレイトールからな
る液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．１〜１０単位を用いて
１〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）反応する。

反応の停止は、上記消化の場合と同様に行う。

ＤＮＡを結合させる際、外来遺伝子の前に存在するｔｒ
ｐオペロン由来の遺伝子の翻訳の読み取り枠は、外来遺
伝子の翻訳が可能となる位置、要がある。

このように連結されたＤＮＡは、適当なプラスミドに挿
入して組換え体プラスミドを造成し、これを適当な宿主
微生物に入れて培養することにより、外来遺伝子の形質
を発現することができる。

適当な７リスミドとしては、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
５゜ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８＋　ｐＢＲ３２９，ｐ
ＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣｌ　８４、ｐＧＡ２２など
があげられる。

適当な宿主微生物としては、大腸菌に１２株の野生株お
よびその変異株、例えばＨＢ　１０１株、Ｃ６００株な
どがあげられる。

組換え体プラスミドの造成法ならびに形質転換株の培養
法は、特願昭５６−２１３１９３号明細書ならびにＮｕ
ｃ７ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ａｒｃｈｉ４０５７（
１９８０）に記載の方法に従えばよい。

以上、大腸菌のｔｒｐオペロンについて本発明方法を説
明したが、ｔｒｐオペロン以外の大腸菌のオペ口／、例
えばリボプロティン・オペ口／、スレオニン・オペロン
、さらには、大腸菌以外の原核細胞のオペロンを利用ｊ
７ても同様に本発明方法は実施できる。

以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明する。

実施例１゜ ｔｒｐプロモーターからｔｒｐ　Ｄ遺伝子の途中までの
ｔｒｐオペロ／領域を有するプラスミド・ベクターｐＫ
ＹＰ−１およびｐＫＹＰ−２の造成：λｐｔｒｐファー
ジであるλｃＩ８５７ｔｒｐＥＤ１０〔第１図参照。λ
ｔｒｐｇＤと略す。Ｇ、Ｆ、Ｍｉａｚｚａｒｉら：　Ｊ
、　Ｂａｃｔｄｒｉｏ７．１３３．１４５７　（１９７
８）　］を大腸＠ＪＡ１９４株〔Ｆ″′λ−ｒｋ−ｎｋ
−△ｔ　ｒ　ｐ　Ｅ　５　。

１ｅｕ−６、Ｊ、Ｃａｒｂｏｎら、　Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ　ＭｏＡｅｃｕｊ！ｅｓｐ　３５５　（１９７７
）　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　）に溶原化［Ｊ、Ｈ，Ｍ
ｉｌｌｅｒ：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ＆
ｃｕＡａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓｐ、２７４（１９７２）
　）させることによって得られる菌株ＪＡ１９４（λｔ
ｒｐＥＤ）をＬ培地（１０ｆＡバクトドリプトン、５ｙ
／／ｌ酵母エキス、５グ４Ｎａ（Ｊ　、　ｐＨ７，２）
を用いて、４２℃、３０分間培養することによってλｔ
ｒｐＥＤファージを誘発し、ファージ溶′ａｉ液を調製
した。

このファージ液より塩化セシウム平衡密度勾配遠心法（
山川ら＝「核酸の化学ｌ」東京化学同人社、ｐ。５４−
６１．１９７４）によってλｔｒｐ　ＥＤファージを精
製した。ついで、このλｔｒｐＥＤファージよりＤＮＡ
を、山川らの方法（同上文献、ｐ、６２−６５）に従い
、フェノール処理とクロロホルム処理をして精製した。

一方、λｃＩ　８５７　ｔｒｐＥＤ１０ファージのｔｒ
ｐＬとｔｒｐ　Ｅ遺伝子領域に約７２０ｂｐの欠失変異
をもつλｃＩ　８５７　ｔｒｐ　ＥＤＩ（ＭＬＥＩ　４
１７フアージ〔第１図参照。以下”λｔｒｐ　ＥＩＭＬ
Ｅ’と略記する。Ｇ、Ｆ、　Ｍｉａｚｚａｒｉら：　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３　。

１４５７、（１９７８））よりＤＮＡを精製した。

λｔｒｐＥＤ７ｙ−ジＤＮＡからのｔｒｐオペロ／のク
ローン化は以下のごとく行った。

８Ｐ１のλｔｒｐＥＤファージＤＮＡを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ　−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、　　７５　ｍＭＮａｃ
Ｊ、”−”１０ｍＭＭｙＣ１！、および５ｍＭジチオス
レイトールを含む反応液３０μｌ中で１６単位のＥｃｏ
ＲＩ（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｉｎｄｌ
ｌ　（全酒造社製、以下同じ）を加えて３７℃で２時間
消化反応を行った。

λｔｒｐ　Ｅ　Ｄ　ｄ　Ｌ　ＥファージＤＮＡも同様に
消化反応を行った。

一方、プラスミドｐＢＲ３２５ＤＮＡ　［Ｆ、Ｂｏｌｉ
ｖａｒら：Ｇｅｎｅ　４．１２１　（１９７８）　）　
１μｆを同様の反応液（３０μ！り中で、２単位のＥｃ
ｏＲｉと２単位のＨｉｎｄｌｌで同様に消化反応を行っ
た。

消化反応液は、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止
し、ファージＤＮＡの消化ＤＮＡ溶液とプラスミドの消
化ＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合し、終濃度０．５ｍＭ
のＡＴＰと５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製、以下同じ）を加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得九組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株（Ｃａｍｅｒｏｎら：Ｐｒｏｃ
、　ＮａｔＡ！、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７２．３４１
６　（１９７５））を公知の方法（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ
ら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｊ（Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、６９．２１１０（１９７２）］に従って形質
転換し、アンピシリン耐性（ＡｐＲ）、テトラサイクリ
ン耐性（ＴｃＲ）およびクロジムフェニコール感受性（
Ｃｍ”）を有する形質転換株を得た。

この形質転換株よりグラスミドＤＮＡを公知の方法［Ｈ
ｏＣ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍら：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ。

工１５１３（１９７９）］に従って分離精製し、該ＤＮ
ＡをＰＡｏＲ（、Ｈｐａ　ｌ、　Ｈｉｎｄ　ｉ　、　Ｐ
ｓｔ　Ｉ　（以上全酒造社製）などの制限酵素で消化す
ることによりプラスミドの構造解析を行なワた結果、λ
ｔｒｐＥＤ由来のｔｒｐプロモーターからｔ　ｒｐＤ遺
伝子の途中までのｔｒｐオペロンがクローン化されたｐ
ＫＹＰ−１（第２図参照）が造成されたことを確認した
。

λｔ　ｒｐＥＤ４　ＬＥ　７７−ジＤＮＡも同様に消化
、結合、形質転換を行い、λｔｒｐＥＩＭＬＥ由来のｔ
ｒｐオペロ／がクローン化されたｐＫＹＰ−２（第２図
参照）を造成した。

ｐＫＹＰ−１およびｐＫＹＰ−２を含む大腸菌菌株は、
それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＫＹＰ
−１，Ｆ　Ｅ　ＲＭＰ−６９６２および同Ｉ　ＫＹＰ−
２，ＦＥＲＭＰ−６９６３として工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）に寄託されている。

これらプラスミド・ベクターｐＫＹＰ−１およびｐＫＹ
Ｐ−２は、ｔｒｐＥ遺伝子内のＢｙｌ　ｌ［サイトやｔ
ｒｐＤ遺伝子内のＨｉ　ｎｄ　ｌサイドなどを利用して
、これらの下流に外来遺伝子をポリシストロンを形成す
るように連結してオペロンを再構成すれば、外来遺伝子
の効率のよい発現に応用できる。

実施例２゜ ｔｒｐプロモーターからｔｒｐＥ遺伝子の途中までのｔ
ｒｐオペロン領域を有するプラスミドベクターｐＫＹＰ
−８およびｐＫＹＰ−９の造成：実施例１で得られたｐ
ＫＹＰ−１のＤＮＡ約３０／Ｌｆに約１．５単位のＴａ
ｑ　■（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）
を加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉ　ｓ　−ＨＯＡ！（ｐＨ７
、５）　＋　１００　ｍ　Ｍ　ＮａＣ１＋　７　ｍＭ　
ＭｙＣ６□および６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
む緩衝液（以下’ｙ−ｉｏｏ緩衝液パと略称する）１０
０〜中で４５℃で６０分間消化反応を行った。

この反応によって、ｐＫＹＰ−１プラスミドＤＮＡ１分
子当り、平均１個所当てのＴａｑ　ｌによる切断を受け
た。この消化反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出とエタノール沈殿を行った。沈殿したＤＮ
Ａ断片をＹ−１００緩衝液１００μｌに溶解し、８０単
位のＥｃ　ｏＲＩを加え、３７℃で２時間反応させた。

６５℃、１０分間の熱処理によって反応を停止させた後
、低融点アガロース・ゲル電気泳動法（Ｌａｒｓ　Ｗｉ
ｅｓｌａｎｄｅｒ　：　Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、９３．３０５（１９７９）、以下アガロース電気泳動
によるＤＮＡ断片の精製にはこの方法を用いる〕により
、ｔｒｐプロモーター領域とｔｒｐＥ遺伝子の一部を含
む約２．８　Ｋｂ　（キロベース）と約２．９Ｋｂの２
個のＤＮＡ断片を精製した２゜ 一方、５μｍのｐＢＲ３２５に１０単位のＣ１ａ　■（
ベーリ／ガー・マンハイム社製、以下同じ）を加え、１
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ　Ｈ８，０）、　１０
ｍＭＭｙＣ１２および６　ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタ
ノールを含む消化反応液３０μｌ中、３７℃で２時間反
応させた。６５℃、１０分間の熱処理によって反応を停
止させた後、２　Ｍ　ＮａＣｌを加えてＮａＣＡ！濃度
を１００ｍＭとし、８単位のＥｃｏＲｌを加えて、さら
に３７℃で２時間反応させた。

このようにして得たｐＢＲ３２５ＤＮＡのＣＡ！＆Ｉヒ
ＥｃｏＲＩによる消化物的０．１５μグとｔｒｐプロモ
ーター領域とｔ　ｒｐＥ遺伝子の一部を含む上記の約２
．８Ｋｂと約２．９　Ｋｂの２個のＤＮＡ断片それぞれ
約０．２μ？を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ＋（ｐＨ
７，６）　＋　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび０．５ｍＭＡＴＰを含む緩衝液（
以下この緩衝液を′リガーゼ緩衝液′と略称する）２０
ｐｌ中、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１
８時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を上記と同様にして形質転換し
、ＡｐＲＴｃＲＣｍ’の形質転換株をこの形質転換株よ
りプラスミドＤＮＡを上記と同様に分離精製し、該ＤＮ
Ａを５種の制限酵素Ｈｐａ）＋　Ｐｓｔｌ＋　ＥｃｏＲ
Ｊ＋　ＨｉｎｄＬ　Ｃｊ！ａｌによって消化してプラス
ミドの構造解析を行った結果、ｐＢＲ３２５のＥｃｏＲ
４ザイトとＣ１ａｌサイト間に、ｔｒｐオペロンを含む
約２．８　Ｋｂの断片が挿入されたｐＫＹＰ−８（第３
図参照）、ｔｒｐオペｏｙを含む約２．９Ｋｂの断片が
挿入されたｐＫＹＰ−９（第３図参照）が造成されたこ
とを確認した。

ｐＫＹＰ−８およびｐＫＹＰ−９のＨｉｎｄｌサイト周
辺の塩基配列を、マキサム・ギルバートの方法（Ａ、　
Ｍ　Ｍａｘａｍら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　７４　。

５６０　（１９７７））を用いて調べた結果、ｐＫＹＰ
−８はｔｒｐＥタンパクのＮ末端からアミノ酸残基８個
までの部分、ｐ　ＫＹＰ−９は４３個ま・での部分がク
ローン化されていることが判明した。

ｐＫＹＰ−８およびｐＫＹＰ−９を含む大腸菌菌株は、
それぞれ＆ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＫＹＰ−
８、ＦＥＲＭＰ−６９６４および同Ｉ　ＫＹＰ−９、Ｆ
ＥＲＭＰ−６９６５として微工研に寄託されている。

これらプラスミド・ベクターｐＫＹＰ−８およびｐＫＹ
Ｐ−９は、ｔｒｐＤ遺伝子内のＨｉｎｄｌサイトなどを
利用して、その下流に外来遺伝子をポリシストロンを形
成するように連絡してオペロンを再構成すれば、外来遺
伝子の効率のよい発現に応用できる。

実施例３゜ プラスミド、ベクターｐＫＹＰ−８およびｐＫＹＰ−９
の誘導体ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１０９の造
成： 実施例２で造成したプラスミド・ベクターｐ　Ｋ　Ｙ　
Ｐ　−８およびｐＫＹＰ−９をさらに使いやすくするた
めに、ｔｒｐプロモーターの上流の余分なりＮＡ部分を
削除した誘導体、ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１
０９を次のようにして得た。

プラスミドｐＫＹＰ−８ＤＮＡ８μグに１６単位のＢａ
ｍＨＩ　（全酒造社製、以下同じ）と１６単位のＨｐａ
Ｉを加え、Ｙ−１００緩衝液５ｏｐｌ中で３７℃で２時
間反応させた。６５℃、１０分間の熱処理によって反応
を停止させた後、低融点アガロースゲル電気泳動法を用
い、小さい方のプラスミドＤＮＡ断片（約５’　５０　
ｂｐ　）　［ｐＫＹＰ−９の場合は約６５０ｂｐ］を分
離、精製した。

一方、約４μ２のｔｒｐポータプル・プロモーターを持
つプラスミド・ベク４−ｐＫＹＰ−１００のＤＮＡ（特
願昭５７−１７７１９２、参考例２参照）〔このベクタ
ーは、ＥｃｏＲｉサイトの下流にＸｈｏ［リンカ−（Ｃ
ＣＴＣＧＡＧＧ　）が２個挿入されているため、最終的
にＥｃｏＲｌとＨｉｎｄｌｌｌにより１２４　ｂｐの大
きさでｔｒｐプロモーター官有ＤＮＡ断片が切り出せる
。第４図参照〕に、８単位のＢ　ａｍＨＩと８単位のＨ
ｐａｉを加え、Ｙ　−１００緩衝液３０μｌ中、３７℃
で２時間消化反応させた。ついで６５℃、１０分間の熱
処理によって反応を停止させた後、低融点アガロース・
ゲル電気泳動法を用い、大きい方のプラスミドＤＮＡ断
片（約４．ＩＫｂ）を精製した。

このようにして得た約０．１μ？のｐＫＹＰ−８由来の
ＤＮＡ断片（約５５０ｂｐ）と約０．１５μグのｐＫＹ
’Ｐ−１００由来のＤＮＡ断片（約４．１ｋｂ）をリガ
ーゼ緩衝液２０１ｔｌ中で、２単位のＴ４ＤＮＡＩＪガ
ーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌ＨＢＩＯＩ株（Ｂｏｌｉｖａｚら：　Ｇｅｎｅ２
７５　（１９７７））を形質転換し、ＡｐＲｒｒ：の形
質転換株を得た。

この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを上記と同様に分
離精製し、該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ　＋Ｈｐａ　
Ｉ　＋　Ｈｉ　ｎｄ　ｍ　ｒ　ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ
Ｊで消化することによって、プラスミドの構造解析を行
った。

その結果、ｔｒｐプロモーター領域、ｔｒｐ　Ｌ遺伝子
およびｔｒｐ　Ｅ遺伝子の一部を含むｐＫＹＰ　−８由
来のＤＮＡ断片（２８８ｂｐ）がＥｃｏＲｉ　（！：Ｈ
ｉｎｄｌにより切り出される構造を有するｐＫＹＰ−１
０８（第４図参照）が造成されたことを確認した。

同様の方法で、ｔｒｐプロモーター領域、ｔｒｐＬ遺伝
子およびｔｒｐＥ遺伝子の一部を含むｐＫＹＰ−９由来
のＤＮＡ断片（３９３ｂｐ）がＥｃｏＲｉとＨｉｎｄｌ
により切り出される構造を有するｐＫＹＰ−１０９（第
４図参照）を造成した。

ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１０９のｔｒｐ領域
の塩基配列をマキサム・ギルバート法で調べた結果を第
５図に示す。

ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１０９を含む大腸菌
菌株は、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＩ
　ＫＹＰ−１０８、ＦＥＲＭ　　Ｐ−６９６６および同
ＩＫＹＰ−１０９，ＦＥＲＭ　Ｐ−６９６７として微工
研に寄託されている。

これらプラスミド・ベクターｐＫＹＰ−１０８およびｐ
ＫＹＰ−１０９は、Ｈｉｎｄｌサイトなどを利用して、
その下流にポリシストロンを形成するように外来遺伝子
を連絡し、オペロンを再構成すれば、その外来遺伝子の
効率のよい発現に応用できる。

実施例４゜ ｔｒｐオペロンを利用したβ−ＩＦＨの生産：実施例３
で造成したプラスミド・ベクターｐＫＹＰ−１０９のｔ
ｒｐ　Ｅ遺伝子の内部に存在するＮｒｕｌサイトとβ−
ＩＦ’Ｎ遺伝子を持つ組換えプラスミドＩ）ＬＶ−１（
特願昭５６−２１３１９３に記載のプラスミドで、ｐＬ
Ｖ−１保有拍Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＬ
Ｖ−１はＡＴＣＣ３９０２５としてアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されている。参考例
４参照）のｔｒｐプロモーター内に存在するＨｐａＪサ
イトを連結し、ｔｒｐ　Ｅ蛋白のＮ末端に１８個のアミ
ノ酸に１２個の余分のアミノ酸が付加した計３０個のア
ミノ酸から成るポリペプチドをコードする遺伝子がポリ
シストロンを形成するようにオペ口／を再構成し、β−
ＩＦＮを発現する系を下記のごとく構築した。

８〜のｐＫＹＰ−１０９ＤＮＡに、１２単位のＮｒｕｉ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製、以下
同じ）と１６単位のＥｃｏＲｉを加え、Ｙ−１００緩衝
液５０μｌ中で３７℃、２時間反応させた。ついで、６
５℃、１０分間の熱処理によって反応を停止させた後、
低融点アガロース・ゲル電気泳動法を用いｔｒｐプロモ
ーター領域を含む３１３ｂｐのＥｃｏＲ（−Ｎｒｕ　ｌ
　ＤＮＡ断片を分離精製しまた。

一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３９０２５がら常法［Ｍ、　Ｋａｈｎら：　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　。

２６８（１９７９）］によりプラスミドｐＬＶ−１を分
離し、ｐＬＶ−Ｉ　ＤＮＡの４μＳ’に８単位のＨｐａ
ｉと８単位のＥｃｏＲ）を加え、Ｙ−１００緩衝液５０
μｌ中で、３７℃、２時間消化反応させた。

ついで、６５℃、１ｏ分間の熱処理によって反応を停止
させた後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法を用い、
β−ＩＦＮ遺伝子を含む約５．２ＫｂのＥｃｏＲｌ　−
Ｈｐａ　ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を分離精製した。

このようにして得たｐＫＹＰ−１０９由来のＥｃｏＲＩ
−ＮｒｕＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片約りＯｎ＋？とｐＬＶ−１
由来のＥｃｏＲｉ−Ｈｐａ　ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片約１．
５０　ｎｙをリガーゼ緩衝液２０μｌ中で、２単位のＴ
　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結合
反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換し、ＡＰＲＴｃ８の形
質転換株を得た。

この形質転換株よりプラスミドＤＮＡを上記と同様に分
離精製し、該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ。

ＸｈｏＩ、　Ｈｐａ■、　Ｎｒｕｌ＋　ＢａｍＨＩで消
化することによってプラスミドの構造解析を行った。そ
の結果、第６図に示す構造を持つ目的のプラスミドｐＦ
Ｎ−４が造成されたことを確認した。

組換え体プラスミドｐＦＮ−４は、ｐＫＹＰ　−１０９
由来のＥｃｏＲｉ−ＮｒｕＩＤＮＡ断片とｐ、ＬＶ−１
由来のＥｃｏＲＩ−Ｈｐａｉ　ＤＮＡ断片を連結したこ
とによってできたものであるが、このことをマキサム・
ギルバート法によって調べた。す々わぢ、ｐＦＮ−４の
ＮｒｕｌサイトとＨｐａｌルミｌサイト部分のＤＮＡ塩
基配列を、ｐＬＶ−１由来のβ−ＩＦＮ遺伝子の直前に
あるＮｒｕ■サイトから上流方向に調べた結果、その連
結部分は予想どおりのＤＮＡ塩基配列を有しており、ｔ
ｒｐＥ蛋白のＮペプチドをコードする遺伝子の下流にβ
−ＩＦＮ遺伝子がポリシストロンを形成するように配置
されていることがわかる（第７図参照）。

さらに第７図に示すととくβ−ＩＦＮ遺伝子の翻訳開始
コドンの８塩基上流にはｔｒｐ　Ｌ遺伝子出来のＳＤ配
列（ＡＡＧＧ）が存在し、リポソームの蛋白合成の再開
始を可能にさせており、β−ＩＦＮ遺伝子の上流にある
計３０個のポリペプチドをコードする遺伝子の終止コド
ンは、β−ＩＦＮ遺伝子の翻訳開始コドンと重複してい
る。

ｐ　ＩＦＮ−４を含む大腸菌菌株はＦａｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ　ＩＦＮ−４，ＦＥＲＭ　Ｐ−６９６８と
して微工研に寄託されている。

該１株によるβ−ＩＦＨの生産を以下のとおり行った。

本菌株をＬＧ培地〔トリプトン１０？、酵母エキス５　
Ｌ　ＮａＣ／　５　ｆｔ、　　グルコース１？を水１１
にとかし、ＮａＯＨでｐＨを７．２とする〕で３７℃、
１８時間培養した。この培養液０．２罰を１０ＭのＭＣ
Ｇ培地［Ｎａ２ＨＰＯ４０，６％、ＫＩ（２Ｐ０４０．
３％ｒ　ＮａＣｊｌｌ　　０．５　’％、ＮＨ４ｃｚ　
　ｏ、　１％、グルコース０．５％、カザミノ酸０，５
チ、　ＭｇＳＯ３１ｍＭ、サイアミン塩酸塩４μ？／ｍ
ｅ、　ｐＨ７，２〕に接種し、３０℃で４〜８時間培養
後、トリプトファン遺伝子の誘導物質であるイノドール
アクリル酸を１０μ２７ｍ１加え、さらに５〜１２時間
培養を続けた。

培養液を８，０００　ｒｐｍ、　１０分間遠心して集菌
し、３０ｍＭ　ＮａＣＡ！＋　　ａｏ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を
上記緩衝液ｘｍｌＶｃ懸濁し、２００μ？のリゾチーム
。

０、２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸
）を５ｐｌ！加えて、０℃に３０分間放置した後、凍結
、融解を３回繰返して菌体を破砕した。

これを１．５，０００　ｒ　ｐｍ、３０分間遠心し、上
清を採取した。上清中のインターフェロンの量をアーム
ストロングの方法［Ｊ、Ａ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　：　
Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２１　、７２３−７２５　（１９
７１）　］に従って定量した。但し、ウィルスとしては
、ＶｅｓｉｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕ
ｓ、動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のウイッシエ・
セル（ＷｉｓｈＣθ１１）を用いた。

この結果、本菌株は５Ｘ１０’単位／７！のインターフ
ェロン生産を示した。

実施例５ 発現ベクターｐＩＮ−ＩＩ−Ａ２にβ−ＩＦＮ：Ｍ伝子
を組込んだ組換え体プラスミド］）ＯＡ−１５の造成： ｐ工Ｎ−１ｌ−Ａ２　（特開昭５７−１４０８００公報
のｐＫＥＮＯ３９と同じもの）２μｍをＹ−１００緩衝
液３０μｌに溶かし、ＥｃｏＲＩ　４単位とＢａｍＨ１
４単位を加え、３７℃で２時間消化反応させた。ついで
６５℃、５分間の熱処理によって反応を停止させた後、
低融点アガロース・ゲル電気泳動法を用い、約５　Ｋｂ
のリボプロディン（ｌｐｐ　）プロモーター・Ａａｃプ
ロモーターを含むＤ　Ｎ　’Ａ断片約１．２μりを分離
精製した。

一方、プラスミドｐＮ、ｒＥ−＋（参渚例５の方法で調
製）４μｉをＹ−１００緩価液３０μｌに溶かし、ｇｃ
ｏＲｌ　　６単位とＢａｍＨｌ　６単位を加え、３７℃
で２時間消化反応させた。ついで、６５℃、５分間の熱
処理によって反応を停止させた後、低融点アガロース・
ゲル電気泳動法を用い、約１．　Ｉ　ＫｂのＥｃｏＲｉ
　−Ｂａｍ　Ｈ１断片約０．３μ２を分離精製した。

ｐＩＮ−ＩＩ−Ａ２よシ得た５　Ｋｂ断片０．６μｆと
ｐＮＪＥ−１よシ得た１、　１　Ｋ、１）断片０．２μ
りをリガーゼ緩衝液２０μｌ中、０．５単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃で１６時間結合反応を行った。

このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
常法に従って大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、ＡＩの
形質転換株を得た。

この形質転換株よシブラスミドを上記と同様に分離精製
し、該プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩ、
　８ａＡ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで消化することによってプラ
スミドの構造解析を行った。その結果、第８図に示す構
造を持つプラスミドｐＯＡ−１５が造成されたことを確
認した。

さらにマキサム・ギルバートの方法で、該プラスミドｐ
ＯＡ−１５のＳＤ配列からβ−ＩＦＮの開始コドン（Ａ
ＴＧ）までの塩基配列がであることを確認した。

この場合は必ずしもポリジストロニック発現に適合した
構造をとっていないが、点線で示したとおシ、β−ＩＦ
Ｎの開始コドン（ＡＴＧ）の前にＳＤ配列様の構造（Ａ
ＡＧＧ）があるため、β−ＩＦＨの発現が期待される。

ｐＯＡ−１５を含む大腸菌菌株はＥｅｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ　Ｉ　ＯＡ　−１５、Ｆ’ＥＲＭ　Ｐ−６９
６０として倣工研に寄託されている。

本菌株を用い実施例４と同様に培養した結果、１×１０
７単位／ｌのインターフェロンの生産がみられた。

実施例６ Ｊｌ’ｐｐオペロンを利用した発現、系によるβ−ＩＦ
Ｈの生産： 実施例５で得られたｐＯＡ−１５の１０μｉを１２　ｍ
　Ｍ　ＣａＣｌ２．１２　ｍＭ　ＭＶＣＩ２．６００　
ｍＭＮａｃｆｆｌ、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８，１）および１　ｍＭＥＤＴＡを含む溶液５０Ｅｌ
に溶かし、二本鎖Ｄ↑ＪＡを末端から削る酵素であるＢ
ａ／＋　３１（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
　Ｌａ’ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）０．５単位を加え
、３０℃、３０秒間反応させた。

反応後、５０μｌの水飽和フェノールを加えてよく振盪
し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、　５分間）後、水
層を分離した。上記のフェノール処理を再度繰返した後
、約４５μｌの水層を得た。該水層に２．５倍容のエタ
ノールを加え、−２０℃に１時間放置後、遠心分離（１
４，０００ｒｐｍ　、　５分間）し、プラスミドＤＮＡ
を沈殿として回収した。

このグラスミドＤＮＡをリガーゼ緩衝液２０ｍ１に溶か
し、０．５単位のＴ４ＯＮＡＩ）ｊｊ−ゼ１加え、４℃
で１８時間結合反応を行った。

この反応液を用いて、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し
、Ａｐ　Ｒの形質転換株を得た。

この形質転換株よシブラスミドを上記と同様に分離精製
し、該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ　Ｉ　
、Ｘｂａ　Ｉ　、　ＥｃｏＲｌで消化することによって
プラスミドの構造解析を行った。その結果第　８　図に
示す構造を持つプラスミドｐＯＡＡ−１０１が造成され
たことを確認した。

さらにマキサム・ギルバートの方法で、該プラスミドｐ
ＯＡＡ−１０１のＳＤ配列からＩＦＮ−βの開始コドン
（ＡＴＧ）までの塩基配列がであることを確認した。

この構造かられかるように、はじめのＡＴＧは大腸菌リ
ボプロティンの開始コドンで、リホプロテインに由来す
るペプチドはｍｅｔがらａｒｆまで計６個からなり、終
止コドン（ＴＧＡ）で終っている。この終止コドンと一
部重複してβ−ＩＦＮの開始コドン（ＡＴＧ）が存在し
、ＡＴＧの９塩基上流にあるＡＡＧＧがいわゆるＳＤ配
列としての機能を果していると考えられる。

ｐＯＡＡ−１０１を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　Ｉ　０ＡＡ−１０１、ＦＥＢＭ　　Ｐ
−６９６１として倣工研に寄託されている。

本菌株を用い、インプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド２０μｙ／ｄによる誘発後、実施例４と同様に培養し
た結果、８×１０７単位／ｌのインターフェロンの生産
がみられた。

参考例１　　ｔｒｐプ四モーターを有するプラスミド・
ベクターｐＫＹＰ−１０の造成： ａ）実施例１と同様にして製造したプラスミドｐＫＹＰ
−１をＴａｑ　ｌとＦＣＯＲＩで消化しトリプトファン
プロモーターとＥＩＤ配列を含む２．６に’ｌ）のＤＮ
Ａ断片をアガロース・ゲル電気泳動法によシ精製した。

このＺ６ＫｂのＤＮＡ断片を第９　図に示した方法によ
シ既知ベクターであるｐＢＲ３２２にクローン化する。

すなわち、８μＶのｐＢＲ３２２に２単位のＴａｑ　ｌ
を加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ（ｐＨ８，４）
、６ｍＭＭｆＣ１２，１００ｍＭＮａＣＡ１　、６　ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む全量１００μｌの
反応液中４５℃で６０分、反応させた。Ｔａｑ　Ｉによ
る部分消化後、低融点アガロース・ゲル電気泳動法によ
シ４．３６　ＫｂのＤＮＡ断片を精製し、さらにこのＤ
ＮＡ（約１．５μ？）を３単位のＥｃｏＲＩを加えて、
３７℃、３時間反応させて完全に消化した後、上と同様
に低融点アガロース・ゲル電気泳動法により、約４．３
３　ＫｂのＤＮＡ断片（約１．０μｆ）を得た。

次に１２μりのｐＫＹＰ−ＩＤＮＡを上と同様に３単位
のＴａｑ　ｌを加えて部分消化し、低融点アガロース・
ゲル電気泳動法で８．５Ｋｂ１７）ＤＮＡ断片（約２μ
ｆ）を鞘製し、さらにこのＤ　Ｎ　ＡをＥｃＯＲＩで完
全消化することによシ、２．６に’ｂのＤＮＡ＃ｊｒ片
、約０．５μ７を才す製し′ｋ。

このようにして得たｐＢＲ３２２の４．３３　ＫｂＤＮ
Ａ（０，４μｆ）とｐＫＹＰ−１の２．６　ＫｂＤＮＡ
断片（０，２５μ２）を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ−ＨＯ２
（ｐＨ７，６）、１０　ｍＭＭｆ／Ｃ１２，１０ｍＭジ
チオスレイトールを含む全景２０μｌの反応液中で、０
、５　ｍＭのＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ４単位を加え
、４℃で１８時間、結合反応を行なった。このようにし
て得られる組みかえプラスミドＤ　Ｎ　Ａを用い、大腸
菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、得られるＡｐＲ，Ｔ
ｃＲの形質転換株がもつプラスミドを分離ｆ＃製した。

このプラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、ＥｃｏＲｌ　
。

Ｈｌｍ　ｌ［、Ｃ１ａ　ｌ　、ＨｐａＩ、Ｈｌｎｃｌ［
（全酒造社製）、ＢａｍＨＩによって消化して、プラス
ミドの構造解析を行ない、これをｐＫＹｌ”５と命名し
た。

（ｂ）　　ｔｒｐプロモーターのポータプル化上記のプ
ラスミド・ベクターｐＫＹＰ−５はＳＤ配列の下流（１
〜２０塩基以内）にＣｌａｌ部位とＨｌｎｃｌ　ｍ部位
を有するのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能で
ある。しかし、ｐＫＹＰ−５ＤＮＡ中にＳＤ配列の直後
のＣ１ａ　１部位以外にもう１カ所Ｃ１ａ　１部位があ
ること、およびｐＫＹＰ−５ＤＮＡからｇｃｏＲＩとＨ
ｌｎｃｌｌ［ｌで切り出したｔｒｐプロモーターを含む
断片がＺ６５Ｋｂとやや大きいのでより使いやすいよう
にするため第１θ図のようにしてさらに小さいトリプト
ファンプロモーターを含むＤＮＡ断片を有するプラスミ
ドを造成する。

すなわちｐＫＹＰ−５Ｄ　Ｎ　ＡをＨｐａｌｌとＨ１ｎ
ｄ■で消化して約３４０　ｂｐ（ベースペアー）のＤＮ
Ａ断片を精製し、これをＣ１ａ　ＩとＨｌｎｄｌｌで消
化したｐＢＲ３２２に第１０図のように挿入し、ｐｘｙ
ｐ−１０を得た。ｐＫＹＰ−１０の構造は制限酵素Ｅｃ
ｏＲ１、Ｃ１ａ　Ｉ、　Ｈｌｎｄ、Ｉ［Ｉ、Ｈｐａ　ｌ
　　で消化した後、アガロース・ゲル電気泳動で確認し
た。

参考例２　　ｐＫＹＰ−１００の造成：本発明に述べる
プラスミド・ベクターを造成するために、第１１図に示
すように芒らに利用しやすい形にしたｐＫＹＰ−１００
を造成する。

ｔｒｐプロモーターを含むＤ　Ｎ　Ａの供給源として、
ｔｒｐボータプルプロモーターを運ぶプラスミドｐＫＹ
Ｐ−１０を用いる。

５０μＶのｐＫＹＰ−１０に５０単位のＨｈａｌ（宝酒
造社製）を加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ／（ｐ
Ｈ７，５）、７　ｍＭ　ＭｆＣ１１２，６ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノールを含む全に！′１００μｌの反応液
中３７℃で２時間反応させた。Ｈｂ−ａ　Ｉによる消化
後５％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動〔九Ｍ、　Ｍ
ａｘａｍら：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　８ｃ
ｉ、ｙ第７４巻、５６０頁（１９７７年）、以下ＰＡＧ
Ｅと略す〕によυ、ｔｒｐプロモーターを含む約１８０
すｐのＤＮＡ断片を精製した。この際、このＤＮＡ断片
以外の２つのＤＮＡ断片がＰＡＧＥによって良好に分離
できないために一緒に精製される。精製した３つのＤＮ
Ａ断片（計約４μ７）を５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ　
（ｐＨ７，６）、７　ｍＭＭｙｃｌ！、１０ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、０．２５　ｍＭ　ｄＡ、ＴＰ。

０、２５　ｍＭ　ａＣＴＰ、　０．２５　ｍＭ　ｄＧＴ
Ｐ、　０．２５　ｍＭ（ｉＴＴＰを含む全量３０μ）の
反応液中で、１位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｉ　−Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片を加え、１５℃、２時間反応させた。こ
の反応によシ、Ｈｈａ　Ｉ消化によって生じた３１−突
出末端はＤＮＡポリメラーゼｌ　−Ｋｌｅｎｏｗ断片が
持つ３′→５′のエキソヌクレアーゼ活性および５′→
３′の修復合成活性によシ平坦末端に変えられる。続い
て７２℃、３０分間の熱処理によってＤＮＡポリメラー
ゼ■・ＫｌθｎＯＷ断片を失活させた後、１ＭＮａＣ７
でＮａＣｌ濃度を５０ｍＭとし、８単位のＨｌｎｄ　■
　　を加え、３７℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄ　ｍ
による消化後、ＰＡ（）Ｅによシ、ｔｒｐプロモーター
を含む約１００　ｂｐ　のＤＮＡ断片を分離精製した。

一方、５μ２のプラスミドｐＢＲ３２２に８単位のＥｃ
ｏＲ）を加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｖ（ｐＨ
７，５）、５０　ｍＭ　ＮａＣ／　、　７　ｍＭ　ＩＪ
’ＣＩＪ２．６　ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含
む全量２０μｌの反応液中、３７℃で２時間反応させた
。反応後、フェノールおよびクロロホルム抽出とエタノ
ール沈殿の後、Ｄ　Ｎ　Ａ断片を全量２０μノの５０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、７　ｍＭ　Ｍ
ｆ’Ｃ１ｌ　２．６　ｍＭ　２−メルカプトエタノール
、０．２５鵬臥！ｒＰ、　０．２５観ｄｃ’ｌ’Ｐ、　
０．２５餌ｄＧＴＰ、　０．２５　ｍＭ　ａＴＴＰに溶
解し、続いて８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ　−
Ｋ’ｌｅｎｏｗ断片を加え、１５℃、２時間反応させた
。ＥｃｏＲＩ消化によって生じた５Ｉ−突出末端をＤ　
Ｎ　Ａポリメラーゼ■・Ｋ１ｅｎＯＷ断片の修復合成活
性により平坦末端に変えた。７２℃、３０分間の熱処理
によって、ＤＮＡポリメラーゼ１−Ｋｌθｎｏｗ断片を
失活させた後、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１１でＮａＣ７両度を５
０　ｍＭとし、８単位のＨｌｎｄ　ＩＩＩを加え、３７
℃で２時間反応させた。Ｈｌｎｄｌｌによる消化後、低
融点アガロース・ゲル電気泳動法によシ大きいプラスミ
ドＤＮＡ断片（約４．ａａＫ、ｂ）を精製した。

このようにして得られたｔｒｐプロモーターを含む約１
．００　ｂｐのＤＮＡ断片（約ｓ　ｏ　ｎｆ　）とｐＢ
Ｒ３２２由来の約４．３３に１）のＤＮＡ断片（約０．
２μ？）に５０ｎ２の５′−リン酸されたＸｈｏｌすｙ
　カー（ｐＣＣＴＣＧＡＧＧ、　コラボレイティブ・リ
サーチ社製）を加え、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｅ−Ｈｃｌ（
Ｉ）Ｈ７，ａ　）、１０　ｍＭ　ＭｆＣ７！２．１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．５ｍＭＡＴＰを含む全量２
０μｌの反応液中で、１単位のＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガ
ーゼを加え、４℃で４０時間、結合反応を行った。

このようにして得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い
、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し、得られるＡｐ　Ｔ
ｃの形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精製した
。これらのグラスミドＤ　Ｎ　Ａを８種類の制限酵累Ｅ
ｃｏＲ１，Ｘ１１０　■、Ｈｌｎｄｌ［、Ｈａｅ　ｉｌ
ｌ、Ｃ１ａ　ｌ、Ｔａｑ　ｌ、Ｒｓａ　ｌ（−＝　ユ・
イングランド・バイオラボ社製）で消化することにより
、約１００　ｂｐのｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断
片と２個のｘｈｏ　ｌリンカ−がクローン化されたプラ
スミドを選びｐＫＹＰ−１００と命名した。

参考例３　β−ＩＦＮをコードするＤ　Ｎ　Ａのプラス
ミド・ベクターｐＫＹＰ−１２への組込み：ｐＴｕＩＦ
’Ｎβ−５（ＡＴＣＣ３１８７９から常法により分離す
る）を■］土ｎｄｌｌで消化後Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
ｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ１ｏ１ａｂθ社製）
で処理した後結合反応を行ない第１２図に示しフｔ　ｐ
ＴｕＩＦＮβＨ−５を得る。ｐＴｕｌＦＮβＨ−５よシ
β−ＩＦＮ遺伝子を切シ出し、ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドｐＫＹＰ−１２にクローン化する。すな
わち、ｐＫＹＰ−１２Ｄ　Ｎ　Ａ　２μｍに制限酵素Ｃ
ｄａ　ｌを４単位加え、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＶ
（ｐＨ７，５）、６　ｍＭ　ＭｆＣＡ２．５　ｍＭジチ
オスレイトール（以下Ｃ１！ａバツフアーとよぷ）中（
全量３０μｌ）で、３７℃、２時間反応させた後、Ｎａ
ＣＡ！を最終濃度１００　ｍＭになるように加えてさら
に３７℃で２時間反応を続ける。次いで６５℃で５分間
加熱して酵素を失活させ、低融点アガロース・ゲル電気
泳動法的５　Ｋｌ）のｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ
断片を精製し、１．２μ７を得る。次にｐＴ訂ＦＮβＨ
−５ＤＮＡ１５μ２を上と同様に制限酵素（ＪａｌとＢ
ａｍＨＩで消化し、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
で精製し、β−ＩＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１，Ｉ
Ｋｂ）約１μｍを得る。以上のようにして得られる２個
のＤＮＡ断片（第１２図の５　Ｋｂと１．１　ｘｂ　）
を２０ｍＭＴｒｉｓ　＋　ＨＣＡ　（ｐＨ７，５）　６
　ｍＭＭｓ’ｃＡ’　２．５　Ｉｎ　Ｍジチオスレイト
ール、５００μＭ　ＡＴＰに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行う。得ら
れた組換え体プラスミドの混合物を用いて、常法通り、
大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを
得る。

このコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第１２
図に示したｐＬＥ−３を得る。：ｐＬＥ−３の構造はＣ
Ａ！ａｌ、Ｅｃ　ｏｌＲｌ、　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ　、Ｂ
ａｍ）目で消化後、アガロース・ゲル電気泳動によシ確
認する。プラスミドｐＬＥ−３のＳＤ配列（ＡＡＧＧ）
から開始コドン（ＡＴＧ）までの塩基配列は 「ＡＡＧ、（）（）ＴＡＴＣＧＡＴ狙」であることをマ
キサム・ギルバートの方法で確認する。

ｐＬＥ−３を含む大腸菌菌株はアメリカン・タイツ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｌ　ＬＥ−３、ＡＴＣＣ３９０１
０として寄託されている。

参考例４ 参考例３により得られるｐＬＥ−３ＤｉＪＡ２μ２をＣ
７ａ−バッファー（３０μｌ）にとかし、制限酵素ＣＡ
ａ１４単位を加え、３７℃、２時間反応させた後、６５
℃、５分間加熱してＣ／ａ　Ｉ　を失活させる。次いで
ｃｉＧＴＰＳｄＣＴＰを各々２０μＭＫなるように加え
、さらに６単位の大腸拍ＤＮＡポリメラーゼＩ（１μｌ
）を加えて１５℃で１時間反応させる。次に５ｍＭジチ
オスレイトール、５００μＭＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガー
ゼ２０単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行なう。

これを用いて常法通シ、大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換
し、Ａｐ　ｌのコロニーを得る。

本菌の培養液よｐプラスミドを分離し、第１３図に示し
たｐＬｖ−１を得る。ｐＬＶ−ｉの構造はＥｃｏＲｌ　
、　Ｃｌａ　１．　Ｈｌｎｃｌｌｌ［、ＢａｍＨＩで消
化した後、アガロース・ゲル電気泳動によシ確認する。

ｐＬＶ−１においてＳＤ配列から開始コドン（５）■）
までの塩基配列は１−ＡＡ、（）ＧＣ）ＴＡＴＣＣ）Ｃ
Ｇ、ＡＴＧＪであることをマキサム・ギルバートの方法
で確認する。

ｐＬＶ−１を含む大腸菌菌株はＡ’ＦＣＣにＢｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦ＩＬＶ−Ｉ　ＡＴＣＣ３９０１０
として寄託されている。

参考例５ 組換え体プラスミドｐＮＪＥ−１の造成：β−ＩＦＮ遺
伝子をｌｐｐプロモーターをもつ発現ベクターｐＩＮ−
１１−Ａ２で発現させる前段階として、２１４図に示し
たごとくプラスミドｐＬＥ−３’（特願昭５６−２１３
１９３、参考例３参照）のＣＡ！ａ１部位をＥｃｏＲＩ
リンカ−挿入によっテＥｃｏＲ１部位に変換させる。

まずｐＬＥ−３の１μ２を１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ！（ｐＨ７，５）、７　ｍＭ　Ｍ？Ｃ１１２，１０ｍ
ｌイジチオスレイトールを含む溶液２０μｌに溶かし、
Ｃｌａ　Ｉ２単位を加え、３７℃で２時間反応させた。

ついで６５℃、５分間の熱処理によって反応を停止させ
、ｄＧＴＰ、ｃｉｃＴＰを各々２０　Ｑになるように加
え、さらに６単位の大腸＠Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼｌ　
−Ｋｌｅｎｏｗ断片（１μ））を加えて、１５℃で１時
間反応させた。

一方１μｍのＥＣ０ＲＩリンカ−（Ｃｏｒｏｂｏｌａｔ
ｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｆＵ２．５ｍＭジ
゛チオ７、　Ｌ／　イ）　−／Ｌ、、１　ｍＭ　ｇＤＴ
Ａの溶液２０μｍ中、Ｉ０単位のＴ４ポリヌクレオチド
・キナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を加え、
３７℃で３０分間反応させた。ついで、６５℃、１ｏ分
間の熱処理によって反応を停止させた。

ｐＬＥ−３の上記反応液に、ここで得られたリン酸化さ
れｆｃ、ＥｃｏＲ）リンカ−０，０５，１を加え、さら
に５００／ｌｊＭＡＴＰと０．５単位Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

この反応液を用いて、常法に従い大腸菌ＨＢ１０１株を
形質転換し、ＡｐＲの形質転換株を得た。

この形質転換株から上記の方法でプラスミドを分離精製
し、該プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨｌ　
、　５ａｌＩで消化することにょシブラスミドの構造解
析を行った結果、第１４図に示したプラスミドｐＮＪ　
Ｅ−１の構造を有することが確認された。さらにマキサ
ム・ギルバートの方法で該プラスミドｐＮＪＥ−１のＳ
Ｄ配列からβ−ＩＦＮの開始コドン（ＡＴＧ）までの塩
基配列がであることを確認した。

ｐＮＪ　Ｅ’−１を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｌ　ＩＮＪＥ−１、ＦＥＲＭ　Ｐ−６９５
９として微工研に寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、λ野生株ＤＮＡ、　λｃＩ８５７ｔｒｐＥＤ
ｉＯファージＤｌｊＡ、λｃＩ８５７ｔｒｐＥＤ１０△
ＬＥ１４１７フアージＤＮＡの制限Ｌｌｉ’？素地図を
示す。 第２図は、ｐＫＹＰ−１およびｐＫＹＰ−２の造成の工
程図を示す。 第３図は、ｐＫＹＰ−８およびｐＫ、ＹＰ−９の造成の
工程図を示す。 第４図は、ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１０９の
造成の工程図を示す。 第５図は、ｐＫＹＰ−１０８およびｐＫＹＰ−１０９の
ｔｒｐオペロン領域の塩基配列全示す。 第６図は、ｐＦＮ−４の造成の工程図を示す。 第７図は、ｐＦＮ−４のｔｒｐＥ遺伝子部分とその下流
の塩基配列を示す。 第８図は、ｐＯＡ−１５およびｐＯＡＡ−１０１の造成
の工程図を示す。 図中、Ｐｔｒｐはｔｒｐプロモーター、ＰＬｐｐは１ｐ
Ｔ３プロモーター、ＰＬａｃは７１！ａＣプロモーター
、ｘｂはＸｂａ１％ＥはＥｃＯＲＩ％　ＨはＨｌｎｄ　
ｌ［、ＢはＢａｍＨＩ％Ｓは５ａｌｌをそれぞれ示す。 第９図は、ｐＫＹＰ−５の造成の工程図を示す。 第１０図は、ｐＫＹＰ−１０の造成の工程図を示す。 第１１図は、ｐＫＹＰ−１００の造成の工程図を示す。 第１２図は、ｐＬＥ−３の造成の工程図を示す。 第１３図は、ｐＬＶ−１の造成の工程図を示す。 第１４図は、ｐＮＪＥ−１の造成の工程図を示す。 第　５　図 ｐＫＹ＋、’−１０８ ｒｐＬ ｐＫＹＰ−１０９ ＣＬａＴ　　Ｉｊ６ｎｄＸＩＩ 第６図 め ｏ　Ｔｈｔ 二ＣＧ　ＡＣＴ ：ｌｎ　Ｖａｌ ＴｈＡＡ　　ＧＴＩ コＣＣＴＡ ］ｅＬｅｕ ５５９− Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ’　ＣＴＣＧ
ＡＡ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＡＣＣＨｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　Ｖａｌ’　ＣＡＣＧＴＡ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　
ＧＴＡＤ 第←図 Ｈｉｎル■ 第→図 −５６１− 第４４図 、Ｌｖ−１ 第特図 ＰＮ、ＴＥ−１ 手続補正書（自発） １、事件の表示 昭和５８年特許願第７５７２０号 ２、発明の名称 外来遺伝子の新規な発現方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称
　（１０２）協和醗酵工業株式会社（ＴＢＬ　：　０３
−２０１〜７２１１　　内線２７５１）明細書の発明の
詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （υ明細書第１１頁９行目および同１４行目の「制限」
を「制御」に訂正する。 （２）明細書第１２頁１８行目〜２０行目の「リプレッ
ションやアテニュエーションがかからないので」を削除
する。　　　　　　　　　　　　　　７くて１［７さ、
（３）明細書第２１頁３行目のｒ６９６２Ｊの後にｒ（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５１９）Ｊを加入する。 （／７）明細書第２１頁４行目のｒ６９６３Ｊの後にｒ
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５２０）Ｊを加入する。 （５）明細書第２４頁２０行目のｒ６９６４Ｊの後にｒ
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５２１）ｊを加入する。 （Ｃ）明細書第２５頁１行目のｒ６９６５Ｊの後にｒ（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ’−５２２）Ｊを加入する。 （′７）明細書第２８頁８行目のｒ６９６６Ｊの後にｒ
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５２３）Ｊを加入する。 （θジ明細書第２８頁９行目のｒ６９６７Ｊの後にｒ（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５２４）Ｊを加入する。 （９）明細書第３２頁９行目のｒ６９６８Ｊの後にｒ（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５２５）Ｊを加入する。 （／Ｉｌｌン明細書第３６頁下から９行目のｒ、６９６
０Ｊの後にｒ、（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５１７）Ｊを加入
する。 （／／ジ明明細書第３貞 ｒ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−’５１８）Ｊを加入する。 （１２）明細書第５２頁３行目の「６９５９」の後にｒ
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５・１６）」を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）オペロンまたはオペロンの一部と外来遺伝子とを
   組換え、ポリシストロンを形成するように再構成したオ
   ペロンを用いることを特徴とする外来遺伝子の発現方法
   。 （２）該オペロンが微生物のオペロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法０ （３１微生物のオペロンが大腸菌のオペロンであること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）大腸菌のオペロンがトリプトファ／・オペ口／ま
   たはリボプロティン・オペ口／であることを特徴とする
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）外来遺伝子がヒトβ型インターフェロン（以下′
   β−ＩＦＮ’と略記する）遺伝子であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （６）オペロンまたはオペロンの一部と外来遺伝子とを
   組換え、ポリシストロンを形成するように再構成したオ
   ペロンを組込んだプラスミド−。 （７）該オペロンが微生物のオペロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。 （８）微生物のオペロンが大腸菌のオペロンであること
   を特徴とする特許請求の範囲第７項記載のプラスミド。 （９）大腸菌のオペロンがトリプトファ／・オペロンま
   たはリボプロティン・オベロンテアルことを特徴とする
   特許請求の範囲第８項記載のプラスミド。 ■　外来遺伝子がβ−ＩＦＮ遺伝子であることを特徴と
   する特許請求の範囲第６項記載のプラスミド。 （ｌυ　ｐ　ＦＮ　−４ｔ　ｐ　ＯＡＡ　−１０１，ｐ
   ＮＪＥ−１゜―■■■ＩまたはｐＯＡ−１５で特徴づけ
   られる特許請求の範囲第１０項記載のプラスミド。 （１２）オペロンまたはオペロンの一部と外来遺伝子と
   を組換え、ポリシストロンを形成するように再構成した
   オペロンを組込んだプラスミドを含む微生物。 α３）該オペロンが微生物のオペロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１２項記載の微生物。 （１４）　　ａ生物のオペロンが大腸菌のオペロンであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の微生
   物。 ０．５）　　大腸ｉのオペロンがトリプトファン・オペ
   ロンまたはリボプロティン・オペロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１４項記載の微生物。 （１６）外来遺伝子がβ−ＩＦＮ遺伝子であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１２項記載の微生物。 （１７）　　プラスミドが、ＦＮ−４１，０ＡＡ−１０
   １゜ｐＮＪＥ−１１ｖＭＭＭＩＭｋまたは、ＯＡ＝＋５
   で特徴づけられる特許請求の範囲第１６項記載の微生物
   。 （１ね　　微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
   許請求の範囲第１２項記載の微生物。 翰　オペロンまたはオペ口／の一部と外来遺伝子とを組
   換え、ポリシストロンを形成するように再構成したオペ
   ロンを組込んだプラスミドを含む微生物を培地に培養し
   、培養物中に外来遺伝子が指令する物質を生成蓄積せし
   め、猪 す物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造
   法。 （２０）オペロンが微生物のオペロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。 （２１）　　微生物のオペロンが大腸菌のオペロンであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２０項記載の方法
   。 （イ）大腸菌のオペロンがトリプトファン・オペロンま
   たはリポプロティン・オペロンであることを特徴とする
   特許請求の範囲第２１項記載の方法。 （ハ）外来遺伝子がβ−ＩＦＮ遺伝子であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。 で特徴づけられる微生 物である ことを特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の方法。