JPH0838177A - 組換ｄｎａ分子の作製方法 - Google Patents
組換ｄｎａ分子の作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 改良ベクタおよび原核もしくは真核起源のク
ローン化遺伝子の発現方法およびこの種ベクタの製造方
法を得る。 【構成】 改良ベクタはλファージからのプロモータと
オペレータとを含み、好ましくは活性ｃｒｏ遺伝子もし
くは活性Ｎ遺伝子を含まず、ベクタはプロモータおよび
オペレータから約３００塩基対以内の所望の遺伝子をク
ローン化する少なくとも一つのエンドヌクレアーゼ認識
部位を有すると共に、広汎な種類の原核、真核およびウ
イルスポリペプチド、ホルモン、酵素、抗原、蛋白質お
よびアミノ酸を生産する際のベクタを使用する方法と同
様に有用である。
ローン化遺伝子の発現方法およびこの種ベクタの製造方
法を得る。 【構成】 改良ベクタはλファージからのプロモータと
オペレータとを含み、好ましくは活性ｃｒｏ遺伝子もし
くは活性Ｎ遺伝子を含まず、ベクタはプロモータおよび
オペレータから約３００塩基対以内の所望の遺伝子をク
ローン化する少なくとも一つのエンドヌクレアーゼ認識
部位を有すると共に、広汎な種類の原核、真核およびウ
イルスポリペプチド、ホルモン、酵素、抗原、蛋白質お
よびアミノ酸を生産する際のベクタを使用する方法と同
様に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、改良ベクタならびにこ
の種ベクタの製造方法およびクローン化遺伝子の発現方
法に関するものである。ここに開示するベクタおよび方
法は、クローン化遺伝子、特に原核宿主における真核起
源のものについての改良された発現を特徴とする。以下
の開示から判るように、これらのベクタおよび方法を使
用して、宿主細胞における各種のポリペプチド、蛋白質
およびアミノ酸の生産を向上させることができる。
の種ベクタの製造方法およびクローン化遺伝子の発現方
法に関するものである。ここに開示するベクタおよび方
法は、クローン化遺伝子、特に原核宿主における真核起
源のものについての改良された発現を特徴とする。以下
の開示から判るように、これらのベクタおよび方法を使
用して、宿主細胞における各種のポリペプチド、蛋白質
およびアミノ酸の生産を向上させることができる。
【０００２】
【従来の技術】宿主細胞における蛋白質の生産レベルは
３つの主要な因子によって支配される：すなわち、細胞
内の遺伝子のコピー数と、それら遺伝子コピーが転写さ
れる効率と、得られたメッセンジャＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）が翻訳される効率とである。転写および翻訳（一
緒になって発現を構成する）の効率は次いで、通常所望
のコード配列の前部に位置するヌクレオチド配列に依存
する。これらのヌクレオチド配列または発現制御配列
は、特に、ＲＮＡポリメラーゼが反応して転写を開始す
る（プロモータ配列）と共にリボソームがｍＲＮＡ（転
写の生産物）と結合しかつ反応して翻訳を開始する位置
を規定する。
３つの主要な因子によって支配される：すなわち、細胞
内の遺伝子のコピー数と、それら遺伝子コピーが転写さ
れる効率と、得られたメッセンジャＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）が翻訳される効率とである。転写および翻訳（一
緒になって発現を構成する）の効率は次いで、通常所望
のコード配列の前部に位置するヌクレオチド配列に依存
する。これらのヌクレオチド配列または発現制御配列
は、特に、ＲＮＡポリメラーゼが反応して転写を開始す
る（プロモータ配列）と共にリボソームがｍＲＮＡ（転
写の生産物）と結合しかつ反応して翻訳を開始する位置
を規定する。
【０００３】必ずしもこれら全ての発現制御配列が同等
な効率をもって機能するとは限らない。したがって、し
ばしば所望蛋白質に対する特定コード配列を隣接するヌ
クレオチド配列から分離しかつこれを他の発現制御配列
に融合させてより高レベルの発現を促進するようにする
のが有利である。これが達成された後、新たに作成され
たＤＮＡ断片をより高度のコピー数プラスミドまたはバ
クテリオファージ誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピ
ー数を増大させ、それにより発現蛋白質の収率をさらに
向上させることができる。
な効率をもって機能するとは限らない。したがって、し
ばしば所望蛋白質に対する特定コード配列を隣接するヌ
クレオチド配列から分離しかつこれを他の発現制御配列
に融合させてより高レベルの発現を促進するようにする
のが有利である。これが達成された後、新たに作成され
たＤＮＡ断片をより高度のコピー数プラスミドまたはバ
クテリオファージ誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピ
ー数を増大させ、それにより発現蛋白質の収率をさらに
向上させることができる。
【０００４】通常、無毒性の遺伝子生産物でさえ過剰に
生産されると宿主細胞に対し有害となり、特定の宿主−
ベクタ系の安定性を低下させることがあるので、良好な
発現制御配列はクローン化遺伝子の転写および翻訳の効
率を向上させる他、細菌増殖の際発現を変調させるよう
制御しうるものでなければならない。たとえば、好適な
発現制御配列は、宿主細胞が過剰の遺伝子生産物の蓄積
なしに繁殖しうるよう滅勢され、次いで多量の所望蛋白
質生産物の発現を促進するよう付勢されうるものであ
る。
生産されると宿主細胞に対し有害となり、特定の宿主−
ベクタ系の安定性を低下させることがあるので、良好な
発現制御配列はクローン化遺伝子の転写および翻訳の効
率を向上させる他、細菌増殖の際発現を変調させるよう
制御しうるものでなければならない。たとえば、好適な
発現制御配列は、宿主細胞が過剰の遺伝子生産物の蓄積
なしに繁殖しうるよう滅勢され、次いで多量の所望蛋白
質生産物の発現を促進するよう付勢されうるものであ
る。
【０００５】上記した基準のいくつかを満足させる数種
の発現制御配列が、細菌宿主における蛋白質およびポリ
ペプチドの発現を向上させるべく使用されている。これ
らには、たとえばイー・コリ（大腸菌）の乳糖オペロン
におけるプロモータ、オペレータならびにリボソーム結
合および相互作用配列〔たとえばケー・イタクラ等、
「ホルモン・ソマトスタチンに関する化学合成遺伝子の
大腸菌における発現」、サイエンス誌、第１９８巻、第
１０５６−１０６３頁（１９７７）；ディー・ヴィー・
ゲデル等、「ひとインシュリンに関する化学合成遺伝子
の大腸菌における発現」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第１
０６−１１０頁（１９７９）〕、イー・コリのトリプト
ファン合成酵素系の対応配列〔ジェー・エス・エムタゲ
等、「インフルエンザ抗原決定因子は大腸菌でクローン
化されたヘマグルチニン遺伝子から発現される」、ネイ
チャー誌、第２８３巻、第１７１−１７４頁（１９８
０）〕；ジェー・エー・マーシャル等、「ひと成長ホル
モン：細菌における補完的ＤＮＡクローン化および発
現」、サイエンス誌、第２０５巻、第６０２−６０６頁
（１９７９）〕およびファージλの主要なオペレータお
よびプロモータ域〔エッチ・バーナード等、「バクテリ
オファージλＰ Ｌプロモータからの遺伝子発現を促進す
るプラスミドクローン化運搬体の作成」、ジーン誌、第
５巻、第５９−７６頁（１９７９）〕が包含される。本
発明は、これら発現制御配列のうち最後のものに関する
ものである。
の発現制御配列が、細菌宿主における蛋白質およびポリ
ペプチドの発現を向上させるべく使用されている。これ
らには、たとえばイー・コリ（大腸菌）の乳糖オペロン
におけるプロモータ、オペレータならびにリボソーム結
合および相互作用配列〔たとえばケー・イタクラ等、
「ホルモン・ソマトスタチンに関する化学合成遺伝子の
大腸菌における発現」、サイエンス誌、第１９８巻、第
１０５６−１０６３頁（１９７７）；ディー・ヴィー・
ゲデル等、「ひとインシュリンに関する化学合成遺伝子
の大腸菌における発現」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第１
０６−１１０頁（１９７９）〕、イー・コリのトリプト
ファン合成酵素系の対応配列〔ジェー・エス・エムタゲ
等、「インフルエンザ抗原決定因子は大腸菌でクローン
化されたヘマグルチニン遺伝子から発現される」、ネイ
チャー誌、第２８３巻、第１７１−１７４頁（１９８
０）〕；ジェー・エー・マーシャル等、「ひと成長ホル
モン：細菌における補完的ＤＮＡクローン化および発
現」、サイエンス誌、第２０５巻、第６０２−６０６頁
（１９７９）〕およびファージλの主要なオペレータお
よびプロモータ域〔エッチ・バーナード等、「バクテリ
オファージλＰ Ｌプロモータからの遺伝子発現を促進す
るプラスミドクローン化運搬体の作成」、ジーン誌、第
５巻、第５９−７６頁（１９７９）〕が包含される。本
発明は、これら発現制御配列のうち最後のものに関する
ものである。
【０００６】バクテリオファージλは３種の主要なプロ
モータＰ Ｌ、Ｐ ＲおよびＰ′ Ｒ、を含有する。リプレッ
サ蛋白質、すなわちファージ遺伝子ｃＩの生産物は、プ
ロモータＰ ＬおよびＰ Ｒの活性を制御することが知られ
ている。これらリプレッサは、これらプロモータの各プ
ロモータ領域（すなわちＯ ＬおよびＯ Ｒ）に結合して対
応プロモータからの転写の開始を阻止する。さらに、合
成に関するその自己調節方式〔エム・プタシン等、「バ
クテリオファージλにおけるリプレッサの自己調節およ
び機能」、サイエンス誌、第１５６−１６１頁（１９７
６）〕により、溶原性菌株の染色体上におけるｃＩ遺伝
子の一つのコピーは、多コピープラスミドに存在するＰ
ＬもしくはＰ Ｒプロモータを完全に抑制することができ
る（下記）。ｌａｃプロモータを含む系においては、非
誘発条件下でのプロモータの抑制が部分的に過ぎないこ
とに注目すべきである〔ケー・イタクラ等、上記；ディ
ー・ヴィー・ゲデル等、上記〕。
モータＰ Ｌ、Ｐ ＲおよびＰ′ Ｒ、を含有する。リプレッ
サ蛋白質、すなわちファージ遺伝子ｃＩの生産物は、プ
ロモータＰ ＬおよびＰ Ｒの活性を制御することが知られ
ている。これらリプレッサは、これらプロモータの各プ
ロモータ領域（すなわちＯ ＬおよびＯ Ｒ）に結合して対
応プロモータからの転写の開始を阻止する。さらに、合
成に関するその自己調節方式〔エム・プタシン等、「バ
クテリオファージλにおけるリプレッサの自己調節およ
び機能」、サイエンス誌、第１５６−１６１頁（１９７
６）〕により、溶原性菌株の染色体上におけるｃＩ遺伝
子の一つのコピーは、多コピープラスミドに存在するＰ
ＬもしくはＰ Ｒプロモータを完全に抑制することができ
る（下記）。ｌａｃプロモータを含む系においては、非
誘発条件下でのプロモータの抑制が部分的に過ぎないこ
とに注目すべきである〔ケー・イタクラ等、上記；ディ
ー・ヴィー・ゲデル等、上記〕。
【０００７】プロモータＰ ＬおよびＰ Ｒに対しリプレッ
サにより発揮される制御は、リプレッサ蛋白質またはそ
の遺伝子の改変により変化させることができる。たとえ
ば、リプレッサ蛋白質が温度感受性であるような一つの
突然変異が知られている。この突然変異を用いれば、培
養の温度すなわちリプレッサの安定性を変化させること
により、プロモータを活性化もしくは失活させることが
できる。
サにより発揮される制御は、リプレッサ蛋白質またはそ
の遺伝子の改変により変化させることができる。たとえ
ば、リプレッサ蛋白質が温度感受性であるような一つの
突然変異が知られている。この突然変異を用いれば、培
養の温度すなわちリプレッサの安定性を変化させること
により、プロモータを活性化もしくは失活させることが
できる。
【０００８】バクテリオファージλは、また、遺伝子Ｎ
およびｃｒｏをも含有する。Ｎ遺伝子はＰ Ｌ制御下にあ
る。Ｎ遺伝子の生産物は、バクテリオファージλにおけ
る抗−終止因子として作用することが知られている。抗
−終止は、転写すべき特定ＤＮＡ配列における終止配
列、終止様配列または転写遅延配列の存在により惹起さ
れる転写終止もしくは遅延を克服するのに有利である。
さらに、プロモータ転写においてノンセンスコドンの存
在により導入される極性効果はＮ遺伝子生産物により緩
和することができる〔エヌ・フランクリンおよびシー・
ヤノフスキィ、「λのＮ蛋白質：イー・コリＲＮＡポリ
メラーゼの転写終止、極性および変化に関する証明」、
ＲＮＡポリメラーゼ（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー）第６９３−７０６頁（１９７６）〕。
およびｃｒｏをも含有する。Ｎ遺伝子はＰ Ｌ制御下にあ
る。Ｎ遺伝子の生産物は、バクテリオファージλにおけ
る抗−終止因子として作用することが知られている。抗
−終止は、転写すべき特定ＤＮＡ配列における終止配
列、終止様配列または転写遅延配列の存在により惹起さ
れる転写終止もしくは遅延を克服するのに有利である。
さらに、プロモータ転写においてノンセンスコドンの存
在により導入される極性効果はＮ遺伝子生産物により緩
和することができる〔エヌ・フランクリンおよびシー・
ヤノフスキィ、「λのＮ蛋白質：イー・コリＲＮＡポリ
メラーゼの転写終止、極性および変化に関する証明」、
ＲＮＡポリメラーゼ（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー）第６９３−７０６頁（１９７６）〕。
【０００９】Ｐ Ｒプロモータから転写されたｃｒｏ遺伝
子の生産物は、両プロモータＰ ＬおよびＰ Ｒに対する二
次リプレッサであることが知られている〔ジェー・ペ
ロ、「ｔｏｆ遺伝子生産物の部位に関するデレーション
・マッピング」、バクテリオファージλ（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー）第５４９−６０８
頁（１９７１）；エッチ・エコルス、「バクテリオファ
ージλ発生におけるｃｒｏ遺伝子の役割」、ジャーナル
・モレキュラー・バイオロジー）第８０巻、第２０３−
２１６頁（１９７３）；エー・ジョンソン等、「バクテ
リオファージλのｃｒｏ蛋白質の作用メカニズム」、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス
・ＵＳＡ、第７５巻、第１７８３−１７８７頁（１９７
８）〕。ｃｒｏ遺伝子生産物は宿主とベクタとの組合せ
の所望生産物と一緒に共生産されるので、Ｐ Ｌもしくは
Ｐ Ｒからの発現に対するｃｒｏ遺伝子生産物の効果は時
間と共に増大する傾向がある。したがって、連続した高
レベルの発現を望む系においては、ｃｒｏ遺伝子の欠失
または失活が必要である。
子の生産物は、両プロモータＰ ＬおよびＰ Ｒに対する二
次リプレッサであることが知られている〔ジェー・ペ
ロ、「ｔｏｆ遺伝子生産物の部位に関するデレーション
・マッピング」、バクテリオファージλ（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー）第５４９−６０８
頁（１９７１）；エッチ・エコルス、「バクテリオファ
ージλ発生におけるｃｒｏ遺伝子の役割」、ジャーナル
・モレキュラー・バイオロジー）第８０巻、第２０３−
２１６頁（１９７３）；エー・ジョンソン等、「バクテ
リオファージλのｃｒｏ蛋白質の作用メカニズム」、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス
・ＵＳＡ、第７５巻、第１７８３−１７８７頁（１９７
８）〕。ｃｒｏ遺伝子生産物は宿主とベクタとの組合せ
の所望生産物と一緒に共生産されるので、Ｐ Ｌもしくは
Ｐ Ｒからの発現に対するｃｒｏ遺伝子生産物の効果は時
間と共に増大する傾向がある。したがって、連続した高
レベルの発現を望む系においては、ｃｒｏ遺伝子の欠失
または失活が必要である。
【００１０】クローン化遺伝子の発現に関するＰ Ｌプロ
モータの効果は、イー・コリのトリプトファン（ｔｒ
ｐ）オペロンをファージλ中に組込むことにより示され
ている〔エヌ・フランクリン、「バクテリオファージλ
のＮオペロンに融合した遺伝シグナルの読み変化：Ｎ遺
伝子の蛋白質生産物によるポリメラーゼの改変に関する
遺伝子的証明」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、第８９巻、第３３−４８頁（１９７９）；エー・
ホプキンス等、「試験管内で作成されたλｔｒｐ−形質
導入バクテリオファージの特性化」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第１０７巻、第５４９−５６
９頁（１９７６）〕。この改変ファージにおいて、ｔｒ
ｐ遺伝子をそれら自身のプロモータからあるいはＰ Ｌプ
ロモータから転写させることができる。Ｐ Ｌ媒介の発現
は、同族ｔｒｐプロモータから得られるレベルより３〜
４倍高いことが判った。
モータの効果は、イー・コリのトリプトファン（ｔｒ
ｐ）オペロンをファージλ中に組込むことにより示され
ている〔エヌ・フランクリン、「バクテリオファージλ
のＮオペロンに融合した遺伝シグナルの読み変化：Ｎ遺
伝子の蛋白質生産物によるポリメラーゼの改変に関する
遺伝子的証明」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、第８９巻、第３３−４８頁（１９７９）；エー・
ホプキンス等、「試験管内で作成されたλｔｒｐ−形質
導入バクテリオファージの特性化」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第１０７巻、第５４９−５６
９頁（１９７６）〕。この改変ファージにおいて、ｔｒ
ｐ遺伝子をそれら自身のプロモータからあるいはＰ Ｌプ
ロモータから転写させることができる。Ｐ Ｌ媒介の発現
は、同族ｔｒｐプロモータから得られるレベルより３〜
４倍高いことが判った。
【００１１】Ｐ Ｌ媒介の発現に対するリプレッサの効果
も、この改変ファージにおいて示された。たとえば、リ
プレッサの不存在下において、アントラニレートシンセ
ターゼ（ｔｒｐオペロンにおける第１の酵素）のＰ Ｌ制
御された発現は、ｔｒｐリプレッサの不存在下における
ｔｒｐプロモータ制御下での酵素につき得られるものよ
り１１倍大きいものであった〔ジェー・ダピソン等、
「λｔｒｐ融合オペロンにおける遺伝子発現の定量
面」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１３
０巻、第９−２０頁（１９７４）〕。しかしながら、活
性ｃＩ遺伝子の存在において、酵素のＰ Ｌ媒介された発
現は少なくとも９００倍減少された。これらの研究も、
宿主においてｃｒｏ遺伝子が機能しない場合のみ、連続
高レベルのＰ Ｌ媒介された転写が可能であったことを示
した。
も、この改変ファージにおいて示された。たとえば、リ
プレッサの不存在下において、アントラニレートシンセ
ターゼ（ｔｒｐオペロンにおける第１の酵素）のＰ Ｌ制
御された発現は、ｔｒｐリプレッサの不存在下における
ｔｒｐプロモータ制御下での酵素につき得られるものよ
り１１倍大きいものであった〔ジェー・ダピソン等、
「λｔｒｐ融合オペロンにおける遺伝子発現の定量
面」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１３
０巻、第９−２０頁（１９７４）〕。しかしながら、活
性ｃＩ遺伝子の存在において、酵素のＰ Ｌ媒介された発
現は少なくとも９００倍減少された。これらの研究も、
宿主においてｃｒｏ遺伝子が機能しない場合のみ、連続
高レベルのＰ Ｌ媒介された転写が可能であったことを示
した。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】問題は、上記したλｔ
ｒｐファージは挿入遺伝子の発現に対するＰ Ｌプロモー
タの有用性を示すが、この種のファージの使用はｃｒｏ
受容体ファージの作成および安定な増殖における困難性
により若干制約を受けるということである。
ｒｐファージは挿入遺伝子の発現に対するＰ Ｌプロモー
タの有用性を示すが、この種のファージの使用はｃｒｏ
受容体ファージの作成および安定な増殖における困難性
により若干制約を受けるということである。
【００１３】この種のファージが存在しないと、観察さ
れた高レベルの発現は、共生産されたｃｒｏ遺伝子のレ
ベルが増大してＰ Ｌプロモータからの転写を抑制すると
直ちに低下する。
れた高レベルの発現は、共生産されたｃｒｏ遺伝子のレ
ベルが増大してＰ Ｌプロモータからの転写を抑制すると
直ちに低下する。
【００１４】λファージの欠点は、λ制御エレメントを
たとえばＣｏｌＥｌまたはその誘導体のような自己再生
プラスミドにクローン化させることにより〔ジェー・ヘ
ッジペス等、「プラスミド−クローン化遺伝子の発現を
高めるため使用されるλファージプロモータ」、モレキ
ュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１６３巻、第１９
７−２０３頁（１９７８）〕。あるいはλＰ Ｌ系のみを
組込む比較的小さいプラスミドを作成することにより
〔エッチ・バーナード等、上記〕ある程度克服されてい
るが、これら後者のベクタはクローン化遺伝子挿入に使
用しうる部位とＰＬプロモータとの間の距離が欠点とな
る。たとえばエッチ・バーナード等（上記）により記載
されたベクタにおいて、ベクタ上の遺伝子挿入部位とＰ
Ｌプロモータとの間の距離は約３００〜約８６００塩基
の範囲である。さらに、バーナード等のベクタにおいて
特に一般的に使用されるＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ挿
入部位はそれぞれＰ Ｌプロモータに対し６００〜１００
０塩基よりも近くない。さらに、所望ＤＮＡ配列の転写
に対するＮ遺伝子生産物の効果は、バーナード等のベク
タにおいて容易に評価することができない。何故なら、
Ｎ遺伝子生産物はプラスミド自身にコードされており、
染色体起源のものでないからである。最後に、バーナー
ドのベクタが高レベルの蛋白質発現を与えるという直接
的証明がなく、さらにバーナードにおいてはそのベクタ
が原核宿主における真核遺伝子生産物の発現に有用に使
用されるという教示がない。
たとえばＣｏｌＥｌまたはその誘導体のような自己再生
プラスミドにクローン化させることにより〔ジェー・ヘ
ッジペス等、「プラスミド−クローン化遺伝子の発現を
高めるため使用されるλファージプロモータ」、モレキ
ュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１６３巻、第１９
７−２０３頁（１９７８）〕。あるいはλＰ Ｌ系のみを
組込む比較的小さいプラスミドを作成することにより
〔エッチ・バーナード等、上記〕ある程度克服されてい
るが、これら後者のベクタはクローン化遺伝子挿入に使
用しうる部位とＰＬプロモータとの間の距離が欠点とな
る。たとえばエッチ・バーナード等（上記）により記載
されたベクタにおいて、ベクタ上の遺伝子挿入部位とＰ
Ｌプロモータとの間の距離は約３００〜約８６００塩基
の範囲である。さらに、バーナード等のベクタにおいて
特に一般的に使用されるＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ挿
入部位はそれぞれＰ Ｌプロモータに対し６００〜１００
０塩基よりも近くない。さらに、所望ＤＮＡ配列の転写
に対するＮ遺伝子生産物の効果は、バーナード等のベク
タにおいて容易に評価することができない。何故なら、
Ｎ遺伝子生産物はプラスミド自身にコードされており、
染色体起源のものでないからである。最後に、バーナー
ドのベクタが高レベルの蛋白質発現を与えるという直接
的証明がなく、さらにバーナードにおいてはそのベクタ
が原核宿主における真核遺伝子生産物の発現に有用に使
用されるという教示がない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記した諸問
題を、改良ベクタならびにこの種ベクタの製造方法およ
び宿主細胞におけるクローン化遺伝子の発現方法を提供
することにより解決する。
題を、改良ベクタならびにこの種ベクタの製造方法およ
び宿主細胞におけるクローン化遺伝子の発現方法を提供
することにより解決する。
【００１６】さらに詳細には、本発明によれば、バクテ
リオファージから誘導される少なくとも一種のプロモー
タとオペレータとからなる少なくとも一種のＤＮＡ配列
を含み、前記プロモータとオペレータとからなる前記Ｄ
ＮＡ配列の部分から約３００塩基対以内に位置する少な
くとも一つのエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする
ベクタが提供される。
リオファージから誘導される少なくとも一種のプロモー
タとオペレータとからなる少なくとも一種のＤＮＡ配列
を含み、前記プロモータとオペレータとからなる前記Ｄ
ＮＡ配列の部分から約３００塩基対以内に位置する少な
くとも一つのエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とする
ベクタが提供される。
【００１７】本発明のベクタにおけるファージλの主プ
ロモータは、これらベクタ中に挿入されたＤＮＡ配列の
転写を促進する。本発明の方法およびベクタは、所望Ｄ
ＮＡ配列を選択プロモータの近傍においてベクタ中に挿
入するための多数の適当な認識部位が存在することをさ
らに特徴とする。好ましくは、選択プロモータと認識部
位との間の距離は約３００塩基対以内、より好ましくは
約１５０塩基対以内である。本発明の好適ベクタは、さ
らに、活性Ｎ遺伝子および活性ｃｒｏ遺伝子が存在しな
いようなものである。したがって、適当な宿主、すなわ
ち活性の染色体Ｎ遺伝子を含有するものまたは欠如する
ものを選択することにより、本発明の任意のベクタを使
用して、Ｎ遺伝子生産物の存在下または不存在下にＤＮ
Ａ配列を発現することができる。
ロモータは、これらベクタ中に挿入されたＤＮＡ配列の
転写を促進する。本発明の方法およびベクタは、所望Ｄ
ＮＡ配列を選択プロモータの近傍においてベクタ中に挿
入するための多数の適当な認識部位が存在することをさ
らに特徴とする。好ましくは、選択プロモータと認識部
位との間の距離は約３００塩基対以内、より好ましくは
約１５０塩基対以内である。本発明の好適ベクタは、さ
らに、活性Ｎ遺伝子および活性ｃｒｏ遺伝子が存在しな
いようなものである。したがって、適当な宿主、すなわ
ち活性の染色体Ｎ遺伝子を含有するものまたは欠如する
ものを選択することにより、本発明の任意のベクタを使
用して、Ｎ遺伝子生産物の存在下または不存在下にＤＮ
Ａ配列を発現することができる。
【００１８】以下の記載から判るように、本発明のベク
タおよび方法は、宿主細胞における原核および真核生産
物の改良された発現を可能にするような宿主−ベクタ組
合せ物の作成を可能にする。
タおよび方法は、宿主細胞における原核および真核生産
物の改良された発現を可能にするような宿主−ベクタ組
合せ物の作成を可能にする。
【００１９】
【実施例】ここに記載した本発明をより充分に理解する
ため、以下詳細に説明する。
ため、以下詳細に説明する。
【００２０】本明細書中において、次の用語を使用す
る。
る。
【００２１】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸塩と含窒素複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮ
Ａの単量体単位。塩基は、グリコシド炭素（ペントース
の１′炭素）を介して糖成分に結合される。塩基と糖と
の結合はヌクレオシドと呼ばれる。各ヌクレオチドはそ
の塩基を特徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は、
Ａ，Ｇ，Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
酸塩と含窒素複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮ
Ａの単量体単位。塩基は、グリコシド炭素（ペントース
の１′炭素）を介して糖成分に結合される。塩基と糖と
の結合はヌクレオシドと呼ばれる。各ヌクレオチドはそ
の塩基を特徴とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は、
Ａ，Ｇ，Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００２２】ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３′炭素と
５′炭素との間のホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。
５′炭素との間のホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。
【００２３】コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸と翻訳
開始シグナルと翻訳終了シグナルとをコードする３種の
ヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。例えばヌ
クレオチドトリプレットＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴ
Ｃ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）をコードし、ＴＡＧ，ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
終了シグナルであり、ＡＴＧは翻訳開始シグナルであ
る。
開始シグナルと翻訳終了シグナルとをコードする３種の
ヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。例えばヌ
クレオチドトリプレットＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴ
Ｃ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）をコードし、ＴＡＧ，ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
終了シグナルであり、ＡＴＧは翻訳開始シグナルであ
る。
【００２４】リーディングフレーム：アミノ酸配列まで
ｍＲＮＡを翻訳する際のコドンのグループ化。翻訳の
際、適切なリーディングフレームを維持せねばならな
い。例えば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのリ
ーディングフレームすなわち相において翻訳することが
でき、その各々は異なるアミノ酸配列ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ−−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−（停止） を与える。
ｍＲＮＡを翻訳する際のコドンのグループ化。翻訳の
際、適切なリーディングフレームを維持せねばならな
い。例えば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは３つのリ
ーディングフレームすなわち相において翻訳することが
でき、その各々は異なるアミノ酸配列ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ−−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−（停止） を与える。
【００２５】ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−ア
ミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互
いに結合されたアミノ酸の線状列。
ミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互
いに結合されたアミノ酸の線状列。
【００２６】ゲノム：細胞もしくはウィルスの全ＤＮ
Ａ。これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリボソ
ーム結合ならびに例えばシャイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列を含めて相互作用配列を包含する。
Ａ。これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリボソ
ーム結合ならびに例えばシャイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列を含めて相互作用配列を包含する。
【００２７】構造遺伝子：雛型もしくはメッセンジャー
ＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を介して、特定ポリペプチドに
特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
ＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を介して、特定ポリペプチドに
特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
【００２８】転写：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成する
過程。
過程。
【００２９】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成す
る過程。
る過程。
【００３０】発現：ポリペプチドを生成するため構造遺
伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合せ
である。
伝子により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合せ
である。
【００３１】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非クロモソーム二重鎖ＤＮＡ配列であり、これによりプ
ラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミドを単細
胞微生物に入れると、その生物の特性がプラスミドのＤ
ＮＡの結果として変化または形質転換する。例えば、テ
トラサイクリン耐性（Ｔｅｔ Ｒ）についての遺伝子を担
持するプラスミドは従前テトラサイクリンに感受性であ
った細胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「トランスホー
マント」と呼ぶ。
非クロモソーム二重鎖ＤＮＡ配列であり、これによりプ
ラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミドを単細
胞微生物に入れると、その生物の特性がプラスミドのＤ
ＮＡの結果として変化または形質転換する。例えば、テ
トラサイクリン耐性（Ｔｅｔ Ｒ）についての遺伝子を担
持するプラスミドは従前テトラサイクリンに感受性であ
った細胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。
プラスミドにより形質転換された細胞を「トランスホー
マント」と呼ぶ。
【００３２】ファージまたはバクテリオファージ：細菌
性ウィルスであり、その多くは蛋白質エンベロプもしく
はコート（「カプシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ
配列からなっている。
性ウィルスであり、その多くは蛋白質エンベロプもしく
はコート（「カプシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ
配列からなっている。
【００３３】クローン化運搬体（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅ
ｈｉｃｌｅ）：宿主細胞中に複製しうるプラスミド、フ
ァージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、これは
一個または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴と
し、この部位においてこのＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的
な生物学的機能（例えば複製）、コート蛋白質の生成の
喪失またはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わず
に決定可能に切断され、またこの部位は形質転換細胞の
同定（例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性）に使用するのに適するマーカを含有する。クロー
ン化運搬体はしばしばベクタ（ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれ
る。
ｈｉｃｌｅ）：宿主細胞中に複製しうるプラスミド、フ
ァージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であり、これは
一個または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴と
し、この部位においてこのＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的
な生物学的機能（例えば複製）、コート蛋白質の生成の
喪失またはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わず
に決定可能に切断され、またこの部位は形質転換細胞の
同定（例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性）に使用するのに適するマーカを含有する。クロー
ン化運搬体はしばしばベクタ（ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれ
る。
【００３４】クローン化：微生物またはＤＮＡ配列の繁
殖を得る過程であって、無性増殖によりこの種の一種の
微生物または配列から得られる。
殖を得る過程であって、無性増殖によりこの種の一種の
微生物または配列から得られる。
【００３５】組替えＤＮＡ分子またはハイブリッドＤＮ
Ａ：生体細胞の外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞
を感染してそこに維持される能力を有する、異なるゲノ
ム（細胞またはウイルスの全ＤＮＡ）からのＤＮＡ断片
よりなる分子。
Ａ：生体細胞の外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞
を感染してそこに維持される能力を有する、異なるゲノ
ム（細胞またはウイルスの全ＤＮＡ）からのＤＮＡ断片
よりなる分子。
【００３６】発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した
場合これら遺伝子の発現を制御および調整するヌクレオ
チド配列。
場合これら遺伝子の発現を制御および調整するヌクレオ
チド配列。
【００３７】本発明の宿主細胞 多数の入手しうる宿主細胞の任意のものを、本発明の宿
主−ベクタ組合せ物に使用することができる。特定宿主
の選択は当分野で知られた多くの因子に依存する。これ
らには、たとえば選択ベクタの和合性、ハイブリッドプ
ラスミドによりコードされる蛋白質の毒性、所望蛋白質
の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および価格が包
含される。これら因子のバランスは必ずしもすべての宿
主が特定組替えＤＮＡ分子の発現に関し同等に有効では
ないという理解に基づいて決定せねばならない。これら
一般的指針のうち、有用な宿主はイー・コリ（大腸
菌）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。高熱菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）およびその他細菌、酵母およその他真菌類の菌
株、動物または植物宿主、たとえば培養物における動物
（人間を含む）または植物細胞、あるいはその他宿主を
包含する。
主−ベクタ組合せ物に使用することができる。特定宿主
の選択は当分野で知られた多くの因子に依存する。これ
らには、たとえば選択ベクタの和合性、ハイブリッドプ
ラスミドによりコードされる蛋白質の毒性、所望蛋白質
の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および価格が包
含される。これら因子のバランスは必ずしもすべての宿
主が特定組替えＤＮＡ分子の発現に関し同等に有効では
ないという理解に基づいて決定せねばならない。これら
一般的指針のうち、有用な宿主はイー・コリ（大腸
菌）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。高熱菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）およびその他細菌、酵母およその他真菌類の菌
株、動物または植物宿主、たとえば培養物における動物
（人間を含む）または植物細胞、あるいはその他宿主を
包含する。
【００３８】本発明における好適な宿主細胞はイー・コ
リ菌株Ｋ１２ｃＩ ｔｓΔＨＩ〔Ｋ１２Ｍ７２ｌａｃ ａｍ
ΔｔｒｐＥＡ２Ｓｍ Ｒ（λｃＩ８５７Ｎ ａｍ７Ｎ ａｍ５
３ΔＨＩビオ −）〕（「Ｋ１２ΔＨＩ」）〔エッチ・バ
ーナード等、上記〕およびＭ５２１９〔Ｋ１２Ｍ７２ｌ
ａｃ ａｍｔｒｐ ａｍＳｍ Ｒ（λｃＩ８５７ ΔＨＩビオ
２５２）〕（「Ｍ５２１９」）〔エッチ・グリア、「バ
クテリオファージλのｋｉｌ遺伝子」、バイロロジー、
第６６巻、第５８９−６０４頁（１９７５）〕または染
色体−もしくはプラスミド−コード化されたｃＩ８５７
遺伝子（またはその等価物）を有するその他任意の菌株
である。
リ菌株Ｋ１２ｃＩ ｔｓΔＨＩ〔Ｋ１２Ｍ７２ｌａｃ ａｍ
ΔｔｒｐＥＡ２Ｓｍ Ｒ（λｃＩ８５７Ｎ ａｍ７Ｎ ａｍ５
３ΔＨＩビオ −）〕（「Ｋ１２ΔＨＩ」）〔エッチ・バ
ーナード等、上記〕およびＭ５２１９〔Ｋ１２Ｍ７２ｌ
ａｃ ａｍｔｒｐ ａｍＳｍ Ｒ（λｃＩ８５７ ΔＨＩビオ
２５２）〕（「Ｍ５２１９」）〔エッチ・グリア、「バ
クテリオファージλのｋｉｌ遺伝子」、バイロロジー、
第６６巻、第５８９−６０４頁（１９７５）〕または染
色体−もしくはプラスミド−コード化されたｃＩ８５７
遺伝子（またはその等価物）を有するその他任意の菌株
である。
【００３９】両菌株は、欠陥のある非切除性のλプロフ
ァージを有し、これは突然変異ｃＩ遺伝子を担持してい
る。突然変異遺伝子は温度感受性リプレッサをコード
し、したがって温度の調整によりＰ Ｌプロモータからの
転写を活性化させることができ、すなわち２８℃におい
てこのリプレッサは活性であってＰ Ｌプロモータからの
転写を抑制するが、４２℃においてこのリプレッサは失
活してＰ Ｌプロモータからの転写を付勢する。
ァージを有し、これは突然変異ｃＩ遺伝子を担持してい
る。突然変異遺伝子は温度感受性リプレッサをコード
し、したがって温度の調整によりＰ Ｌプロモータからの
転写を活性化させることができ、すなわち２８℃におい
てこのリプレッサは活性であってＰ Ｌプロモータからの
転写を抑制するが、４２℃においてこのリプレッサは失
活してＰ Ｌプロモータからの転写を付勢する。
【００４０】プロファージのΔＨＩ欠失はｃｒｏ遺伝子
の一部とプロファージにおけるｃｒｏのさらに右方に対
する全ての他の遺伝子を除去する〔エム・カステラッチ
等、「イー・コリＫ１２にプロファージとして存在する
バクテリオファージλにおける欠失物の単離および特性
化」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１１
７巻、第２１１−２１８頁（１９７２）〕。
の一部とプロファージにおけるｃｒｏのさらに右方に対
する全ての他の遺伝子を除去する〔エム・カステラッチ
等、「イー・コリＫ１２にプロファージとして存在する
バクテリオファージλにおける欠失物の単離および特性
化」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１１
７巻、第２１１−２１８頁（１９７２）〕。
【００４１】さらに、菌株Ｍ５２１９はｂｉｏ２５２欠
失をも含み、これはプロファージにおけるｋｉｌを含め
ｃＩＩＩの左方に対する全ての遺伝子を除去する。さら
に、温度誘発の際菌株Ｍ５２１９は染色体Ｎ遺伝子から
の機能性Ｎ−遺伝子生産物を発現する。他方、菌株Ｋ１
２ΔＨＩはＮにおける二つのアンバ（ａｍｂｅｒ）突然
変異体を有し、これらはこの菌株を機能的にＮ−陰性に
する。
失をも含み、これはプロファージにおけるｋｉｌを含め
ｃＩＩＩの左方に対する全ての遺伝子を除去する。さら
に、温度誘発の際菌株Ｍ５２１９は染色体Ｎ遺伝子から
の機能性Ｎ−遺伝子生産物を発現する。他方、菌株Ｋ１
２ΔＨＩはＮにおける二つのアンバ（ａｍｂｅｒ）突然
変異体を有し、これらはこの菌株を機能的にＮ−陰性に
する。
【００４２】したがって、２種の菌株はＰ Ｌプロモータ
からの発現を実験的に付勢または滅勢することが可能で
ある。さらにＫ１２ΔＨＩまたはＭ５２１９の選択は、
Ｐ Ｌ媒介の転写をＮ遺伝子生産物の不存在下または存在
下に進行させるのを可能にする。また、イー・コリＫ１
２ΔＨＩもイー・コリＭ５２１９も機能性ｃｒｏ遺伝子
生産物を発現しないので、Ｐ Ｌ媒介の発現における二次
抑制が避けられる。
からの発現を実験的に付勢または滅勢することが可能で
ある。さらにＫ１２ΔＨＩまたはＭ５２１９の選択は、
Ｐ Ｌ媒介の転写をＮ遺伝子生産物の不存在下または存在
下に進行させるのを可能にする。また、イー・コリＫ１
２ΔＨＩもイー・コリＭ５２１９も機能性ｃｒｏ遺伝子
生産物を発現しないので、Ｐ Ｌ媒介の発現における二次
抑制が避けられる。
【００４３】本発明のベクタにおけるいくつかの具体例
の作成 ファージλプロモータについてはいくつかの起源が周知
されているが、本発明によるベクタの作成に関する以下
の例示目的には、ファージλｔｒｐ４４ｃＩＡｔ ２ｃｒ
ｏ −をファージλプロモータの起源として選択した。
の作成 ファージλプロモータについてはいくつかの起源が周知
されているが、本発明によるベクタの作成に関する以下
の例示目的には、ファージλｔｒｐ４４ｃＩＡｔ ２ｃｒ
ｏ −をファージλプロモータの起源として選択した。
【００４４】ファージλｔｒｐ４４ ｃＩ Ａｔ ２ｃｒ
ｏ −の生成はエヌ・フランクリンにより記載されている
〔「λのＮオペロン：大腸菌のトリプトファンオペロン
に対する融合物において観察される程度および調整」、
ザ・バクテリオファージλ（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリース）、第６２１−６３８頁（１９
７１）〕。ｃＩ遺伝子におけるＡｔ ２突然変異はリプレ
ッサを温度感受性にする〔エム・リーブ、「熱誘発性λ
バクテリオファージの研究．Ｉ．突然変異プロファージ
の遺伝子部位の程度および性質」、ジャーナル・モレキ
ュラー・バイオロジー、第１６巻、第１４９−１６３頁
（１９６６）〕。ｃｒｏ −突然変異は、Ｐ Ｌ機能の二次
抑制を防止する。勿論、長期発現については大して好ま
しくないが、ｃｒｏ ＋ファージも本発明のベクタに使用
しうるであろうことを了解すべきである。さらに、ファ
ージは機能性Ｎ遺伝子と活性Ｐ Ｌプロモータとを担持す
る。ファージは、同族のｔｒｐプロモータ自体によって
得られるものよりも３〜４倍高いレベルのｔｒｐ酵素発
現を与える〔エヌ・フランクリン、上記〕。
ｏ −の生成はエヌ・フランクリンにより記載されている
〔「λのＮオペロン：大腸菌のトリプトファンオペロン
に対する融合物において観察される程度および調整」、
ザ・バクテリオファージλ（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリース）、第６２１−６３８頁（１９
７１）〕。ｃＩ遺伝子におけるＡｔ ２突然変異はリプレ
ッサを温度感受性にする〔エム・リーブ、「熱誘発性λ
バクテリオファージの研究．Ｉ．突然変異プロファージ
の遺伝子部位の程度および性質」、ジャーナル・モレキ
ュラー・バイオロジー、第１６巻、第１４９−１６３頁
（１９６６）〕。ｃｒｏ −突然変異は、Ｐ Ｌ機能の二次
抑制を防止する。勿論、長期発現については大して好ま
しくないが、ｃｒｏ ＋ファージも本発明のベクタに使用
しうるであろうことを了解すべきである。さらに、ファ
ージは機能性Ｎ遺伝子と活性Ｐ Ｌプロモータとを担持す
る。ファージは、同族のｔｒｐプロモータ自体によって
得られるものよりも３〜４倍高いレベルのｔｒｐ酵素発
現を与える〔エヌ・フランクリン、上記〕。
【００４５】λｔｒｐ４４ｃＩ Ａｔ ２ ｃｒｏ −ＤＮ
Ａは、ＣｓＣｌ精製されたファージ粒子からのフェノー
ル抽出によりこのファージから調製した。このファージ
のＰＬＯ Ｌ領域の構造を図１に示す。
Ａは、ＣｓＣｌ精製されたファージ粒子からのフェノー
ル抽出によりこのファージから調製した。このファージ
のＰＬＯ Ｌ領域の構造を図１に示す。
【００４６】Ｐ Ｌプロモータと隣接オペレータ（Ｏ Ｌ）
とは、Ｎ遺伝子配列の開始部と共に、ＤＮＡの延びすな
わち約１００塩基対長さ内に規定され、λ地図上の約７
３．４％に位置する（図１）〔ティー・マニアチス等、
「バクテリオファージλのオペレータにおけるリプレッ
サおよびポリメラーゼの認識配列」、セル誌、第５巻、
第１０９−１１３頁（１９７５）；ジェー・ダールベル
クおよびエフ・ブラットナー、「バクテリオファージλ
の主要左方ＲＮＡのプロモータ−オペレータ近心域にお
ける配列」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第２
巻、第１４４１−１４５８頁（１９７５）〕。同様に、
Ｐ Ｒプロモータと隣接オペレータ（Ｏ Ｒ）とは、ｃｒｏ
遺伝子配列の開始部と共に、ＤＮＡの延び内に規定され
てλ地図上の約７６．６％に位置する（図１）〔ティー
・マニアチス等、上記〕。
とは、Ｎ遺伝子配列の開始部と共に、ＤＮＡの延びすな
わち約１００塩基対長さ内に規定され、λ地図上の約７
３．４％に位置する（図１）〔ティー・マニアチス等、
「バクテリオファージλのオペレータにおけるリプレッ
サおよびポリメラーゼの認識配列」、セル誌、第５巻、
第１０９−１１３頁（１９７５）；ジェー・ダールベル
クおよびエフ・ブラットナー、「バクテリオファージλ
の主要左方ＲＮＡのプロモータ−オペレータ近心域にお
ける配列」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第２
巻、第１４４１−１４５８頁（１９７５）〕。同様に、
Ｐ Ｒプロモータと隣接オペレータ（Ｏ Ｒ）とは、ｃｒｏ
遺伝子配列の開始部と共に、ＤＮＡの延び内に規定され
てλ地図上の約７６．６％に位置する（図１）〔ティー
・マニアチス等、上記〕。
【００４７】これら領域をファージλＤＮＡから単離す
るためのいくつかの手段のいずれかを用いて、所望プロ
モータ配列を有するクローンを調製することができる。
たとえば、制限酵素の種々な組合せを使用して所望領域
をファージλＤＮＡから開裂させることができる（図
１）。次いで、これら断片を直接に使用してクローンを
調製するか、あるいはクローン化前に当分野で知られた
方法により断片をさらに処理してこれらを切断または伸
長させることもできる。
るためのいくつかの手段のいずれかを用いて、所望プロ
モータ配列を有するクローンを調製することができる。
たとえば、制限酵素の種々な組合せを使用して所望領域
をファージλＤＮＡから開裂させることができる（図
１）。次いで、これら断片を直接に使用してクローンを
調製するか、あるいはクローン化前に当分野で知られた
方法により断片をさらに処理してこれらを切断または伸
長させることもできる。
【００４８】適当なＤＮＡ断片を調製した後、これをい
くつかのクローン化用運搬体もしくはベクタのいずれか
に挿入することができる。たとえば、有用なクローン化
用運搬体は染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の
断片、たとえばＳＶ４０および公知細菌プラスミドの各
種公知誘導体、たとえばＣｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ
３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を包含するイー
・コリからのプラスミド、広宿主範囲のプラスミド、た
とえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージλの
多数の誘導体、その他ＤＮＡファージ、フィラメント状
単一鎖ＤＮＡファージ、たとえばＭ１３ならびにプラス
ミドとファージＤＮＡもしくは酵母プラスミド（たとえ
ば２μプラスミド）との組合せから得られるベクタまた
はその誘導体から構成することができる。
くつかのクローン化用運搬体もしくはベクタのいずれか
に挿入することができる。たとえば、有用なクローン化
用運搬体は染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の
断片、たとえばＳＶ４０および公知細菌プラスミドの各
種公知誘導体、たとえばＣｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ
３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を包含するイー
・コリからのプラスミド、広宿主範囲のプラスミド、た
とえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージλの
多数の誘導体、その他ＤＮＡファージ、フィラメント状
単一鎖ＤＮＡファージ、たとえばＭ１３ならびにプラス
ミドとファージＤＮＡもしくは酵母プラスミド（たとえ
ば２μプラスミド）との組合せから得られるベクタまた
はその誘導体から構成することができる。
【００４９】さらに、各特定のクローン化運搬体におい
て、種々の部位を用いてファージλＤＮＡ断片を挿入す
ることができる。これらの部位は通常、それらを切断す
る制限エンドヌクレアーゼにより命名される。たとえ
ば、ｐＢＲ３２２においてはＤＮＡ断片挿入に使用しう
る種々の制限部位が存在する〔エフ・ボリバール等、
「新規なクローン化運搬体の作成および特性化。ＩＩ、
多目的クローン化系」、ジーン誌、第２巻、第９５−１
１３頁（１９７７）；ジェー・ジー・サットクリフ、
「ＤＮＡ配列から誘導されるｐＢＲ３２２制限地図：４
３６１ヌクレオチド対長さまでの正確なＤＮＡ寸法マー
カ」、ヌクレイック・アッシド・リサーチ、第５巻、第
２７２１−２７２８頁（１９７８）〕。図２および図４
をも参照。勿論、本発明に有用なクローン化運搬体はフ
ァージλＤＮＡ断片を挿入するための制限部位を有する
必要はないことを了解すべきである。むしろ、運搬体
は、本発明による所望ベクタを生産する別の手段により
断片に結合させることができた。
て、種々の部位を用いてファージλＤＮＡ断片を挿入す
ることができる。これらの部位は通常、それらを切断す
る制限エンドヌクレアーゼにより命名される。たとえ
ば、ｐＢＲ３２２においてはＤＮＡ断片挿入に使用しう
る種々の制限部位が存在する〔エフ・ボリバール等、
「新規なクローン化運搬体の作成および特性化。ＩＩ、
多目的クローン化系」、ジーン誌、第２巻、第９５−１
１３頁（１９７７）；ジェー・ジー・サットクリフ、
「ＤＮＡ配列から誘導されるｐＢＲ３２２制限地図：４
３６１ヌクレオチド対長さまでの正確なＤＮＡ寸法マー
カ」、ヌクレイック・アッシド・リサーチ、第５巻、第
２７２１−２７２８頁（１９７８）〕。図２および図４
をも参照。勿論、本発明に有用なクローン化運搬体はフ
ァージλＤＮＡ断片を挿入するための制限部位を有する
必要はないことを了解すべきである。むしろ、運搬体
は、本発明による所望ベクタを生産する別の手段により
断片に結合させることができた。
【００５０】Ａ．複製開始点に対し反時計方向にＰ Ｌプ
ロモータを有する本発明によるベクタ＊ １．ｐＰＬａ２３ 次に図２を参照して、本発明のｐＰＬａ２３の一改良ベ
クタを順次の過程において調製した。これらを図２に示
し、以下さらに詳細に説明する。
ロモータを有する本発明によるベクタ＊ １．ｐＰＬａ２３ 次に図２を参照して、本発明のｐＰＬａ２３の一改良ベ
クタを順次の過程において調製した。これらを図２に示
し、以下さらに詳細に説明する。
【００５１】（ａ）中間プラスミドｐＰＬａ２ 上記で単離されたλｔｒｐ４４ｃＩ Ａｔ２ｃｒｏ −Ｄ
ＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、λ地図
上の約７１．３％から８１．０２％まで延在する断片を
切除した（図１および図２）。開始点断片の方向性は、
通常示されると同様にｐＢＲ３２２中に存在すると解釈
される（サットクリフ等、上記）。同様にして、ｐＢＲ
３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにて消化しそして
ファージλＤＮＡ断片を切除ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
ｐＢＲ３２２断片の代りに挿入した（図２）。
ＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、λ地図
上の約７１．３％から８１．０２％まで延在する断片を
切除した（図１および図２）。開始点断片の方向性は、
通常示されると同様にｐＢＲ３２２中に存在すると解釈
される（サットクリフ等、上記）。同様にして、ｐＢＲ
３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにて消化しそして
ファージλＤＮＡ断片を切除ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
ｐＢＲ３２２断片の代りに挿入した（図２）。
【００５２】得られたベクタをｐＰＬａ２と名付け、こ
こで「ａ」は複製開始点に対しＰ Ｌプロモータの反時計
方向を示す。この分子に関するλ情報はファージのＢａ
ｍＨＩ部位（７１．３％）からＥｃｏＲＩ部位（８１．
０２％λ）まで延在し、これは遺伝子Ｎ、Ｏ ＬＰ Ｌ領
域、遺伝子ｒｅｘおよびｃＩ（突然変異体）、Ｏ ＲＰ Ｒ
領域、遺伝子ｃｒｏ（突然変異体）およびｃＩＩ、なら
びに遺伝子Ｏの部分を包含する（図１および図２）。
こで「ａ」は複製開始点に対しＰ Ｌプロモータの反時計
方向を示す。この分子に関するλ情報はファージのＢａ
ｍＨＩ部位（７１．３％）からＥｃｏＲＩ部位（８１．
０２％λ）まで延在し、これは遺伝子Ｎ、Ｏ ＬＰ Ｌ領
域、遺伝子ｒｅｘおよびｃＩ（突然変異体）、Ｏ ＲＰ Ｒ
領域、遺伝子ｃｒｏ（突然変異体）およびｃＩＩ、なら
びに遺伝子Ｏの部分を包含する（図１および図２）。
【００５３】イー・コリｃ６００（ＣａＣｌ ２コンピテ
ント）を、適当な条件および封じ込めの下に、上記で調
製されたｐＰＬａ２により形質転換させた。形質転換種
を、ファージλクリヤ変異体の１０ ９ｐｆｕが接種され
（エム・リーブ、上記）かつ１００μｇ／ｍｌのカルベ
ニシリンをも含有するＬＢ平板培地上で３４℃にて選択
した。選択したλＤＮＡ断片はｃＩ Ａｔ ２遺伝子を含
み、したがってこの断片を含有する形質転換種は３４℃
においてファージλクリヤ突然変異体に対し耐性であ
る。さらに、選択ｐＢＲ３２２断片はアンピシリン耐性
に関する遺伝子を含み、したがってこの完全遺伝子を有
するプラスミドで形質転換させた宿主は、このように形
質転換させた宿主を除き、抗生物質を含有する培養物に
おいて増殖するであろう。
ント）を、適当な条件および封じ込めの下に、上記で調
製されたｐＰＬａ２により形質転換させた。形質転換種
を、ファージλクリヤ変異体の１０ ９ｐｆｕが接種され
（エム・リーブ、上記）かつ１００μｇ／ｍｌのカルベ
ニシリンをも含有するＬＢ平板培地上で３４℃にて選択
した。選択したλＤＮＡ断片はｃＩ Ａｔ ２遺伝子を含
み、したがってこの断片を含有する形質転換種は３４℃
においてファージλクリヤ突然変異体に対し耐性であ
る。さらに、選択ｐＢＲ３２２断片はアンピシリン耐性
に関する遺伝子を含み、したがってこの完全遺伝子を有
するプラスミドで形質転換させた宿主は、このように形
質転換させた宿主を除き、抗生物質を含有する培養物に
おいて増殖するであろう。
【００５４】２０種の形質転換種を選択し、培養物を１
００μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１０ −２ＭのＭｇＣ
ｌ ２とを含有するＬＢ培地において３４℃で増殖させ
た。形質転換種がｃＩ遺伝子を有する真正の形質転換種
であって、λファージを吸着し得ない稀な細菌でないよ
うにするため、培養物の一部にλクリヤまたはλウイル
スのいずれかを感染させた〔エフ・ヤコブおよびイー・
ウォールマン、「大腸菌のバクテリオファージの発生研
究．Ｉ．バクテリオファージλの発生系」、アナーレン
・インスチチュート・パスツール、第８７巻、第６５３
−６９０頁（１９５４）〕。２０種の形質転換種は全
て、λクリヤに対する耐性とλウイルスに対する感受性
を示した。
００μｇ／ｍｌのカルベニシリンと１０ −２ＭのＭｇＣ
ｌ ２とを含有するＬＢ培地において３４℃で増殖させ
た。形質転換種がｃＩ遺伝子を有する真正の形質転換種
であって、λファージを吸着し得ない稀な細菌でないよ
うにするため、培養物の一部にλクリヤまたはλウイル
スのいずれかを感染させた〔エフ・ヤコブおよびイー・
ウォールマン、「大腸菌のバクテリオファージの発生研
究．Ｉ．バクテリオファージλの発生系」、アナーレン
・インスチチュート・パスツール、第８７巻、第６５３
−６９０頁（１９５４）〕。２０種の形質転換種は全
て、λクリヤに対する耐性とλウイルスに対する感受性
を示した。
【００５５】これら２０種の形質転換の１種からの型Ｉ
ＤＮＡを標準法により単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで制限しそして標準マーカに対し大きさを決定し
た。ＤＮＡは、ｐＢＲ３２２断片とファージλ断片との
予想した大きさに対応する二つの帯域を示した。
ＤＮＡを標準法により単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩで制限しそして標準マーカに対し大きさを決定し
た。ＤＮＡは、ｐＢＲ３２２断片とファージλ断片との
予想した大きさに対応する二つの帯域を示した。
【００５６】（ｂ）中間プラスミドｐＰＬａ２０、すな
わちｐＰＬａ２からのＢｇｌＩＩ断片の除去 ｐＰＬａ２のλ領域は４個のＢｇｌＩＩ部位を有し、こ
れらは７３．７７、７８．８０、８０．１６および８
０．２８λに位置する（図１および図２）〔ヴィー・ピ
ロッタ、「バチルス・グロビギィからの２種の制限エン
ドヌクレアーゼ」、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ、第３巻、第１７４７−１７６０頁（１９７６）；エ
ッチ・スジバルスキィおよびダブリュ・スジバルスキ
ィ、「バクテリオファージλの広汎な分子地図」、ジー
ン誌、第７巻、第２１７−２７０頁（１９７９）〕。
わちｐＰＬａ２からのＢｇｌＩＩ断片の除去 ｐＰＬａ２のλ領域は４個のＢｇｌＩＩ部位を有し、こ
れらは７３．７７、７８．８０、８０．１６および８
０．２８λに位置する（図１および図２）〔ヴィー・ピ
ロッタ、「バチルス・グロビギィからの２種の制限エン
ドヌクレアーゼ」、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ、第３巻、第１７４７−１７６０頁（１９７６）；エ
ッチ・スジバルスキィおよびダブリュ・スジバルスキ
ィ、「バクテリオファージλの広汎な分子地図」、ジー
ン誌、第７巻、第２１７−２７０頁（１９７９）〕。
【００５７】７３．７７％λと８０．２８％λとの間の
ＢｇｌＩＩ断片を除去するため、ｐＰＬａ２ＤＮＡをＢ
ｇｌＩＩで消化し、１μｇ／ｍｌ以下のＤＮＡ濃度で再
連結しそしてＰ Ｌ依存性転写を阻止させるよう染色体λ
リプレッサｃＩを有するイー・コリＷ６（λｒｅｘ）
（ＣａＣｌ ２コンピテント）に対し形質転換させた（図
２）。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬ
−ブロスにおいて増殖させることによりカルベニシリン
耐性クローンを選択しそしてＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異
体を用いてλｒｅｘ機能の損失に付き選別した。λｒｅ
ｘ機能はＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異体の増殖を防止する
〔ビー・ハワード、「ｒＩＩ排除に欠けるファージλ突
然変異体」、サイエンス誌、第１５８巻、第１５８８−
１５８９頁（１９６７）〕。したがってｐＰＬａ２によ
り形質転換させた宿主における突然変異体の増殖の欠如
に対比してＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異体の増殖をこれら
ＢｇｌＩＩ制限形質転換種が阻止し得ないことは、Ｂｇ
ｌＩＩ削除によりｒｅｘ機能がｐＰＬａ２組替えＤＮＡ
分子から除去されていることを示している。
ＢｇｌＩＩ断片を除去するため、ｐＰＬａ２ＤＮＡをＢ
ｇｌＩＩで消化し、１μｇ／ｍｌ以下のＤＮＡ濃度で再
連結しそしてＰ Ｌ依存性転写を阻止させるよう染色体λ
リプレッサｃＩを有するイー・コリＷ６（λｒｅｘ）
（ＣａＣｌ ２コンピテント）に対し形質転換させた（図
２）。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬ
−ブロスにおいて増殖させることによりカルベニシリン
耐性クローンを選択しそしてＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異
体を用いてλｒｅｘ機能の損失に付き選別した。λｒｅ
ｘ機能はＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異体の増殖を防止する
〔ビー・ハワード、「ｒＩＩ排除に欠けるファージλ突
然変異体」、サイエンス誌、第１５８巻、第１５８８−
１５８９頁（１９６７）〕。したがってｐＰＬａ２によ
り形質転換させた宿主における突然変異体の増殖の欠如
に対比してＴ ４ｒＩＩ６３８突然変異体の増殖をこれら
ＢｇｌＩＩ制限形質転換種が阻止し得ないことは、Ｂｇ
ｌＩＩ削除によりｒｅｘ機能がｐＰＬａ２組替えＤＮＡ
分子から除去されていることを示している。
【００５８】これらＢｇｌＩＩ制限形質転換種の組替え
ＤＮＡ分子の制限酵素分析は、単一ＢｇｌＩＩ部位の存
在を示した。さらに、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの
消化は２個の断片をもたらし、一方は予想ｐＢＲ３２２
断片に相当し、他方はＢｇｌＩＩ部位７３．７７％λと
８０．２８％λとの間の部分を除去した後のファージλ
ＤＮＡ断片の予想サイズ（１９００塩基対）に相当し
た。この改変プラスミドをｐＰＬａ２０と名付けた。そ
のλＤＮＡ挿入物はＢａｍＨＩ部位（７１．３％）から
ＢｇｌＩＩ部位（７３．７７％）までおよびＢｇｌＩＩ
部位（８０．２８％）からＥｃｏＲＩ部位（８１．０２
％）まで延在する。これは遺伝子ＮとＯ ＬＰ Ｌ領域と遺
伝子Ｏの部分とを含有する（図１）。
ＤＮＡ分子の制限酵素分析は、単一ＢｇｌＩＩ部位の存
在を示した。さらに、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの
消化は２個の断片をもたらし、一方は予想ｐＢＲ３２２
断片に相当し、他方はＢｇｌＩＩ部位７３．７７％λと
８０．２８％λとの間の部分を除去した後のファージλ
ＤＮＡ断片の予想サイズ（１９００塩基対）に相当し
た。この改変プラスミドをｐＰＬａ２０と名付けた。そ
のλＤＮＡ挿入物はＢａｍＨＩ部位（７１．３％）から
ＢｇｌＩＩ部位（７３．７７％）までおよびＢｇｌＩＩ
部位（８０．２８％）からＥｃｏＲＩ部位（８１．０２
％）まで延在する。これは遺伝子ＮとＯ ＬＰ Ｌ領域と遺
伝子Ｏの部分とを含有する（図１）。
【００５９】本発明におけるベクタの具体例の作成に関
するこの実施例の残余部分はＰ Ｌプロモータ（すなわち
ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片と共にＰ Ｒプロモータがｐ
ＰＬａ２から除去されたもの）に向けられるが、同様な
操作を用いてＰ ＬプロモータをｐＰＬａ２から除去する
と共にＰ Ｒプロモータを保持するベクタを作成しうるこ
とも了解すべきである。さらに本発明の範囲内のベクタ
はＰ ＬとＰ Ｒとの両プロモータを有する同様な手段によ
り作成することができ、これら２つのプロモータは挿入
ＤＮＡ配列の発現を媒介すべく調和してまたは相反して
作用する。
するこの実施例の残余部分はＰ Ｌプロモータ（すなわち
ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片と共にＰ Ｒプロモータがｐ
ＰＬａ２から除去されたもの）に向けられるが、同様な
操作を用いてＰ ＬプロモータをｐＰＬａ２から除去する
と共にＰ Ｒプロモータを保持するベクタを作成しうるこ
とも了解すべきである。さらに本発明の範囲内のベクタ
はＰ ＬとＰ Ｒとの両プロモータを有する同様な手段によ
り作成することができ、これら２つのプロモータは挿入
ＤＮＡ配列の発現を媒介すべく調和してまたは相反して
作用する。
【００６０】（ｃ）ｐＰＬａ２３、すなわちＰ Ｌから下
方の短距離におけるＥｃｏＲＩ部位の導入 ｐＰＬａ２０上に存在するＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片
は、Ｐ Ｌの下方約１５０個のヌクレオチドに位置する単
一のＨａｅＩＩＩ部位を有する〔７３．１％λ、図１〕
〔ビー・アレットおよびアール・ソレム、「バクテリオ
ファージλＤＮＡにおけるプロモータ部位の特定エンド
ヌクレアーゼによる分離および分析」、ジャーナル・モ
レキュラー・バイオロジー、第８５巻、第４７５−４８
４頁（１９７５）〕。この部位は、デオキシリボヌクレ
オシド三燐酸の存在下にＤＮＡポリメラーゼＩで１日
３′−末端を伸長させることにより予めフラッシュ末端
化された開裂ＥｃｏＲＩ末端に対し、開裂ＨａｅＩＩＩ
末端をフラッシュ末端連結させてＥｃｏＲＩ部位に変換
することができる〔ケー・ベックマン等、「バクテリオ
ファージλのｃＩ遺伝子を有するプラスミドの作成」、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス・ＵＳＡ、第７３巻、第４１７４−４１７８頁（１９
７６）〕。手順の詳細を以下に説明しかつ図２に図示す
る。
方の短距離におけるＥｃｏＲＩ部位の導入 ｐＰＬａ２０上に存在するＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片
は、Ｐ Ｌの下方約１５０個のヌクレオチドに位置する単
一のＨａｅＩＩＩ部位を有する〔７３．１％λ、図１〕
〔ビー・アレットおよびアール・ソレム、「バクテリオ
ファージλＤＮＡにおけるプロモータ部位の特定エンド
ヌクレアーゼによる分離および分析」、ジャーナル・モ
レキュラー・バイオロジー、第８５巻、第４７５−４８
４頁（１９７５）〕。この部位は、デオキシリボヌクレ
オシド三燐酸の存在下にＤＮＡポリメラーゼＩで１日
３′−末端を伸長させることにより予めフラッシュ末端
化された開裂ＥｃｏＲＩ末端に対し、開裂ＨａｅＩＩＩ
末端をフラッシュ末端連結させてＥｃｏＲＩ部位に変換
することができる〔ケー・ベックマン等、「バクテリオ
ファージλのｃＩ遺伝子を有するプラスミドの作成」、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス・ＵＳＡ、第７３巻、第４１７４−４１７８頁（１９
７６）〕。手順の詳細を以下に説明しかつ図２に図示す
る。
【００６１】６ｐモルのｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩで消
化した。酵素を熱失活させた後、ＤＮＡを沈殿させそし
て５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）と５ｍＭの
ＭｇＣｌ ２と１ｍＭのβ−メルカプトエタノールと２μ
Ｍのそれぞれ４種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸
〔α−Ｐ ３２−ｄＡＴＰ（３４５ＣｉＰ ３２／ミリモ
ル）を有する〕と５０μｇのＢＳＡ／ｍｌとを含有する
緩衝液２５０μｌ中に溶解させた。イー・コリからのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ワーシントン社）の６単位を加え
そして混合物を１６℃にて９０分間培養した。この過程
により、線状化ｐＢＲ３２２における開裂３′ＥｃｏＲ
Ｉ部位のフラッシュ末端化（ｆｌｕｓｈｅｎｄｉｎｇ）
が達成された。
化した。酵素を熱失活させた後、ＤＮＡを沈殿させそし
て５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）と５ｍＭの
ＭｇＣｌ ２と１ｍＭのβ−メルカプトエタノールと２μ
Ｍのそれぞれ４種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸
〔α−Ｐ ３２−ｄＡＴＰ（３４５ＣｉＰ ３２／ミリモ
ル）を有する〕と５０μｇのＢＳＡ／ｍｌとを含有する
緩衝液２５０μｌ中に溶解させた。イー・コリからのＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ワーシントン社）の６単位を加え
そして混合物を１６℃にて９０分間培養した。この過程
により、線状化ｐＢＲ３２２における開裂３′ＥｃｏＲ
Ｉ部位のフラッシュ末端化（ｆｌｕｓｈｅｎｄｉｎｇ）
が達成された。
【００６２】酵素を熱失活させた後、混合物を５０ｍＭ
のＮａＣｌ、７ｍＭのβ−メルカプトエタノールまで調
整し、そしてＤＮＡをＢａｍＨＩにより消化した。１．
４％アガロースゲル上での電気泳動により断片を分離
し、オートラジオグラフにより検定した。２個の断片の
うち大きい方を含むゲル切片（すなわち開裂ＢａｍＨＩ
部位とフラッシュ末端化ＥｃｏＲＩ部位とを有するｐＢ
Ｒ３２２）を切り取って−９０℃にて凍結させた。次い
でこのアガロース片をソルバールＳＳ３４型ロータにて
２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。排除され
た上澄液を取り出し、凍結および遠心分離過程をさらに
２回繰り返した。これら条件下において、アガロース切
片中に含有されたＤＮＡの約３０％が上澄液中に浸出し
た。浸出されたＤＮＡを合併上澄液から沈澱させ、１０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と５０ｍＭのＮａ
Ｃｌと７ｍＭのβ−メルカプトエタノールとの１０μｌ
中に溶解させた。
のＮａＣｌ、７ｍＭのβ−メルカプトエタノールまで調
整し、そしてＤＮＡをＢａｍＨＩにより消化した。１．
４％アガロースゲル上での電気泳動により断片を分離
し、オートラジオグラフにより検定した。２個の断片の
うち大きい方を含むゲル切片（すなわち開裂ＢａｍＨＩ
部位とフラッシュ末端化ＥｃｏＲＩ部位とを有するｐＢ
Ｒ３２２）を切り取って−９０℃にて凍結させた。次い
でこのアガロース片をソルバールＳＳ３４型ロータにて
２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。排除され
た上澄液を取り出し、凍結および遠心分離過程をさらに
２回繰り返した。これら条件下において、アガロース切
片中に含有されたＤＮＡの約３０％が上澄液中に浸出し
た。浸出されたＤＮＡを合併上澄液から沈澱させ、１０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と５０ｍＭのＮａ
Ｃｌと７ｍＭのβ−メルカプトエタノールとの１０μｌ
中に溶解させた。
【００６３】２ｐモルのｐＰＬａ２０をＢｇｌＩＩとＢ
ａｍＨＩとで消化し、断片をアガロースゲル上で分離し
た。小さい方の断片（ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ）を上記
のようにゲルから溶出させ、ＢｓｐＲＩすなわちＨａｅ
ＩＩＩのイソシゾマー〔エー・キス等、「バチルス・ス
ファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ）からの新規な配列特異性エンドヌクレアーゼ（Ｂｓ
ｐ）」、ジーン誌、第１巻、第３２３−３２９頁（１９
７７）〕により消化してＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断片と
ＢｓｐＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片との混合物を生成させ、後
者の断片はＰ Ｌプロモータを有した。酵素ＢｇｌＩＩと
ＢａｍＨＩとは同一の開裂端部を作り、したがって開裂
ＢｇｌＩＩ端部を開裂ＢａｍＨＩ端部に連結させること
ができ、またその逆もできる。さらに、いずれかの連結
の結果はもはやＢｇｌＩＩもしくはＢａｍＨＩに対する
基質とはならないが、酵素Ｓａｕ３Ａ１（ＭｂｏＩ）に
より認識される（ヴィー・ピロッタ、上記）。
ａｍＨＩとで消化し、断片をアガロースゲル上で分離し
た。小さい方の断片（ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ）を上記
のようにゲルから溶出させ、ＢｓｐＲＩすなわちＨａｅ
ＩＩＩのイソシゾマー〔エー・キス等、「バチルス・ス
ファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ）からの新規な配列特異性エンドヌクレアーゼ（Ｂｓ
ｐ）」、ジーン誌、第１巻、第３２３−３２９頁（１９
７７）〕により消化してＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断片と
ＢｓｐＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片との混合物を生成させ、後
者の断片はＰ Ｌプロモータを有した。酵素ＢｇｌＩＩと
ＢａｍＨＩとは同一の開裂端部を作り、したがって開裂
ＢｇｌＩＩ端部を開裂ＢａｍＨＩ端部に連結させること
ができ、またその逆もできる。さらに、いずれかの連結
の結果はもはやＢｇｌＩＩもしくはＢａｍＨＩに対する
基質とはならないが、酵素Ｓａｕ３Ａ１（ＭｂｏＩ）に
より認識される（ヴィー・ピロッタ、上記）。
【００６４】２ｐモルの上記ｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩの大きい断片をＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断
片とＢｓｐＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片との混合物０．８ｐモ
ルに連結させた。連結後（ｐＢＲ３２２断片上の開裂Ｂ
ａｍＨＩ部位はｐＰＬａ２０断片の開裂ＢｇｌＩＩまた
はＢａｍＨＩ部位のいずれかに連結させるのに使用で
き、さらにｐＢＲ３２２断片上のフラッシュ末端化Ｅｃ
ｏＲＩ部位はｐＰＬａ２０断片のＢｓｐＲＩ（ＨａｅＩ
ＩＩ）部位に連結させるのに使用できる）、混合物をＢ
ａｍＨＩで消化して、ｐＢＲ３２２ベクタ中に挿入され
た望ましくないＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断片からなる組
替え分子を除去した。得られた混合物でイー・コリＭ５
２１９を形質転換させ、形質転換種をカルベニシリン耐
性について選別した。全部で２３種の形質転換種が得ら
れた。これら形質転換種の全てはテトラサイクリン感受
性（ｐＢＲ３２２も有している）であった。何故なら、
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ制限酵素処理は、Ｔｅｔ Ｒを
コードする遺伝子をもはや改変プラスミドにおいてもと
のままにしないからである（図２）。
−ＢａｍＨＩの大きい断片をＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断
片とＢｓｐＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片との混合物０．８ｐモ
ルに連結させた。連結後（ｐＢＲ３２２断片上の開裂Ｂ
ａｍＨＩ部位はｐＰＬａ２０断片の開裂ＢｇｌＩＩまた
はＢａｍＨＩ部位のいずれかに連結させるのに使用で
き、さらにｐＢＲ３２２断片上のフラッシュ末端化Ｅｃ
ｏＲＩ部位はｐＰＬａ２０断片のＢｓｐＲＩ（ＨａｅＩ
ＩＩ）部位に連結させるのに使用できる）、混合物をＢ
ａｍＨＩで消化して、ｐＢＲ３２２ベクタ中に挿入され
た望ましくないＢａｍＨＩ−ＢｓｐＲＩ断片からなる組
替え分子を除去した。得られた混合物でイー・コリＭ５
２１９を形質転換させ、形質転換種をカルベニシリン耐
性について選別した。全部で２３種の形質転換種が得ら
れた。これら形質転換種の全てはテトラサイクリン感受
性（ｐＢＲ３２２も有している）であった。何故なら、
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ制限酵素処理は、Ｔｅｔ Ｒを
コードする遺伝子をもはや改変プラスミドにおいてもと
のままにしないからである（図２）。
【００６５】Ｐ Ｌ担持ＢｓｐＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片のこ
れらクローンにおける継続的存在を、ＨｉｎｃＩＩでの
ＤＮＡの消化により検査した。ｐＢＲ３２２は２個のＨ
ｉｎｃＩＩ部位を有し、〔ジェー・サットクリフ、上
記〕かつ予期したλＰ Ｌ断片は単一のＨｉｎｃＩＩ部位
（７３．４％λ、図１）を有する〔ビー・アレットおよ
びアール・ソレム、上記〕ので、正しく作成された組替
えＤＮＡ分子は３個のＨｉｎｃＩＩ部位を有する筈であ
る。得られた２３種の形質転換種のうち、５種のものが
３個の予想ＨｉｎｃＩＩ部位を有した。これらのうち３
種は独特のＥｃｏＲＩ部位を有し、これらクローンにお
いてｐＰＬａ２０断片のＢｓｐＲＩ（ＨａｅＩＩＩ）部
位とｐＢＲ３２２断片のフラッシュ末端化ＥｃｏＲＩ部
位との間に正確な接合部を形成したことを示した。これ
ら３種のクローンは、さらに、ｐＢＲ３２２断片のＢａ
ｍＨＩ末端に対するｐＰＬａ２０断片のＢｇｌＩＩ末端
の予期した連結により予想されるように、ＢａｍＨＩ部
位を欠如した。これらクローンのうち１種を後の研究用
として選択し、ｐＰＬａ２３と名付けた（図２）。
れらクローンにおける継続的存在を、ＨｉｎｃＩＩでの
ＤＮＡの消化により検査した。ｐＢＲ３２２は２個のＨ
ｉｎｃＩＩ部位を有し、〔ジェー・サットクリフ、上
記〕かつ予期したλＰ Ｌ断片は単一のＨｉｎｃＩＩ部位
（７３．４％λ、図１）を有する〔ビー・アレットおよ
びアール・ソレム、上記〕ので、正しく作成された組替
えＤＮＡ分子は３個のＨｉｎｃＩＩ部位を有する筈であ
る。得られた２３種の形質転換種のうち、５種のものが
３個の予想ＨｉｎｃＩＩ部位を有した。これらのうち３
種は独特のＥｃｏＲＩ部位を有し、これらクローンにお
いてｐＰＬａ２０断片のＢｓｐＲＩ（ＨａｅＩＩＩ）部
位とｐＢＲ３２２断片のフラッシュ末端化ＥｃｏＲＩ部
位との間に正確な接合部を形成したことを示した。これ
ら３種のクローンは、さらに、ｐＢＲ３２２断片のＢａ
ｍＨＩ末端に対するｐＰＬａ２０断片のＢｇｌＩＩ末端
の予期した連結により予想されるように、ＢａｍＨＩ部
位を欠如した。これらクローンのうち１種を後の研究用
として選択し、ｐＰＬａ２３と名付けた（図２）。
【００６６】ｐＰＬａ２３は、ＢａｍＨＩ部位（ｐＢＲ
３２２の塩基対３７７）からＥｃｏＲＩ部位（ｐＢＲ３
２２の塩基対４３６２）まで延在するｐＢＲ３２２断片
からなっている〔ジェー・サットクリフ、上記〕（図
２）。残部のｐＢＲ３２２は、ｐＰＬａ２３において、
７３．３％λにおけるＨａｅＩＩＩ部位（今回再編成さ
れたＥｃｏＲＩ部位）と７３．７７％λにおけるＢｇｌ
ＩＩ部位（今回のＳａｕ３Ａ部位）との間に位置するλ
ｔｒｐ４４ｃＩ Ａｔ ２ｃｒｏ −ＤＮＡの断片により代
替されている（図２）。この断片の大きさを、アガロー
スゲル電気泳動により約３００塩基対であると推定し
た。この断片には、Ｏ ＬＰ Ｌ領域とＮ遺伝子転写物の最
初の１１５個ヌクレオチドとが含有される〔ジェー・ダ
ールベルクおよびエフ・ブラットナー、上記〕。Ｐ Ｌプ
ロモータの転写の方向は、ＢｇｌＩＩ部位からＨａｅＩ
ＩＩ部位の方向に指向し、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマ
ーゼプロモータからの転写と同方向である〔ジェー・ダ
ールベルクおよびエフ・ブラットナー、上記；ジェー・
サットクリフ、上記〕。
３２２の塩基対３７７）からＥｃｏＲＩ部位（ｐＢＲ３
２２の塩基対４３６２）まで延在するｐＢＲ３２２断片
からなっている〔ジェー・サットクリフ、上記〕（図
２）。残部のｐＢＲ３２２は、ｐＰＬａ２３において、
７３．３％λにおけるＨａｅＩＩＩ部位（今回再編成さ
れたＥｃｏＲＩ部位）と７３．７７％λにおけるＢｇｌ
ＩＩ部位（今回のＳａｕ３Ａ部位）との間に位置するλ
ｔｒｐ４４ｃＩ Ａｔ ２ｃｒｏ −ＤＮＡの断片により代
替されている（図２）。この断片の大きさを、アガロー
スゲル電気泳動により約３００塩基対であると推定し
た。この断片には、Ｏ ＬＰ Ｌ領域とＮ遺伝子転写物の最
初の１１５個ヌクレオチドとが含有される〔ジェー・ダ
ールベルクおよびエフ・ブラットナー、上記〕。Ｐ Ｌプ
ロモータの転写の方向は、ＢｇｌＩＩ部位からＨａｅＩ
ＩＩ部位の方向に指向し、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマ
ーゼプロモータからの転写と同方向である〔ジェー・ダ
ールベルクおよびエフ・ブラットナー、上記；ジェー・
サットクリフ、上記〕。
【００６７】プラスミドの二つの特徴は特に興味があ
る。（１）Ｐ Ｌプロモータとβ−ラクタマーゼ遺伝子と
をコードする領域は単一のＨａｅＩＩ断片上に存在し、
ｐＢＲ３２２の塩基対２７２０および４３６におけるＨ
ａｅＩＩ部位により示される（図３）〔ジェー・サット
クリフ、上記；ビー・アレットおよびアール・ソレム、
上記；ヴィー・ピロッタ、上記〕。（２）複製開始点
は、β−ラクタマーゼ担持ＨａｅＩＩ断片に隣接した３
７０塩基対ＨａｅＩＩ断片上に位置する（図３）。機能
性複製開始点は、位置２７２０におけるＨａｅＩＩ部位
近傍の接合部が維持されることを必要とする〔エー・オ
カ等、「小ＣｏｌＥｌ誘導体のヌクレオチド配列。自己
再生およびコリシンＥｌ免疫に対し必須とされる領域の
構造」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１
７２巻、第１５１−１５９頁（１９７９）〕。ｐＰＬａ
２３のこれら特徴を利用して、第二の抗生物質耐性マー
カをベクタ中に導入した。
る。（１）Ｐ Ｌプロモータとβ−ラクタマーゼ遺伝子と
をコードする領域は単一のＨａｅＩＩ断片上に存在し、
ｐＢＲ３２２の塩基対２７２０および４３６におけるＨ
ａｅＩＩ部位により示される（図３）〔ジェー・サット
クリフ、上記；ビー・アレットおよびアール・ソレム、
上記；ヴィー・ピロッタ、上記〕。（２）複製開始点
は、β−ラクタマーゼ担持ＨａｅＩＩ断片に隣接した３
７０塩基対ＨａｅＩＩ断片上に位置する（図３）。機能
性複製開始点は、位置２７２０におけるＨａｅＩＩ部位
近傍の接合部が維持されることを必要とする〔エー・オ
カ等、「小ＣｏｌＥｌ誘導体のヌクレオチド配列。自己
再生およびコリシンＥｌ免疫に対し必須とされる領域の
構造」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第１
７２巻、第１５１−１５９頁（１９７９）〕。ｐＰＬａ
２３のこれら特徴を利用して、第二の抗生物質耐性マー
カをベクタ中に導入した。
【００６８】２．ｐＰＬａ２３１およびｐＰＬａ２３１
１、すなわちｐＰＬａ２３中へのカナマイシン耐性マー
カの導入 図３を参照して、ｐＰＬａ２３から本発明の他のベクタ
を調製するため使用した過程を示す。これら過程を以
下、一層詳細に説明する。
１、すなわちｐＰＬａ２３中へのカナマイシン耐性マー
カの導入 図３を参照して、ｐＰＬａ２３から本発明の他のベクタ
を調製するため使用した過程を示す。これら過程を以
下、一層詳細に説明する。
【００６９】カナマイシン耐性をコードするＨａｅＩＩ
断片をプラスミドｐＭＫ２０から得た〔エム・カーン
等、「プラスミドＣｏｌＥｌから誘導されたプラスミド
クローン化運搬体、Ｆ、Ｒ６ＫおよびＲＫ２」、メソッ
ド・イン・エンザイモロジー、第６８巻、第２６８−２
８０頁（１９７９）〕。プラスミドｐＭＫ２０に関する
複製開始点は、主として３５９塩基対ＨａｅＩＩ断片内
に含有された。しかしながら、この開始点はさらに、こ
の断片と隣接ＨａｅＩＩ断片との間の接合部を離間する
〔エム・カーン等、上記〕。このＨａｅＩＩ部位近傍の
ヌクレオチド配列は、位置２７２０におけるＨａｅＩＩ
部位近傍でｐＢＲ３２２において見られる配列と同一で
ある〔エー・オカ等、上記；ジェー・サットクリフ、上
記〕。
断片をプラスミドｐＭＫ２０から得た〔エム・カーン
等、「プラスミドＣｏｌＥｌから誘導されたプラスミド
クローン化運搬体、Ｆ、Ｒ６ＫおよびＲＫ２」、メソッ
ド・イン・エンザイモロジー、第６８巻、第２６８−２
８０頁（１９７９）〕。プラスミドｐＭＫ２０に関する
複製開始点は、主として３５９塩基対ＨａｅＩＩ断片内
に含有された。しかしながら、この開始点はさらに、こ
の断片と隣接ＨａｅＩＩ断片との間の接合部を離間する
〔エム・カーン等、上記〕。このＨａｅＩＩ部位近傍の
ヌクレオチド配列は、位置２７２０におけるＨａｅＩＩ
部位近傍でｐＢＲ３２２において見られる配列と同一で
ある〔エー・オカ等、上記；ジェー・サットクリフ、上
記〕。
【００７０】ｐＰＬａ２３とｐＭＫ２０との混合物をＨ
ａｅＩＩにより完全に消化させ、再連結しそしてイー・
コリＭ５２１９（ＣａＣｌ ２コンピテント）を形質転換
させた（図３）、正しく形質転換したコロニを、それら
のカルベニシリンおよびカナマイシン耐性に基づいて選
択した。何故なら、ｐＢＲ３２２からのβ−ラクタマー
ゼ遺伝子とｐＭＫ２０からのカナマイシン遺伝子とを有
するクローンのみが、二重の抗生物質耐性を示すからで
ある。１２種の二重耐性形質転換種を選択した。これら
の形質転換種から上記と同様にプラスミドＤＮＡを単離
しそしてＨａｅＩＩ制限および６％アクリルアミドゲル
上での断片寸法決定とにより分析した。これらクローン
のうち５種はわずか３個のＨａｅＩＩ断片、すなわちＰ
Ｌプロモータとβ−ラクタマーゼ遺伝子とを有するｐＰ
Ｌａ２３のＨａｅＩＩ断片に対応するＨａｅＩＩ断片
と、カナマイシン耐性に関する遺伝子を持ったｐＭＫ２
０のＨａｅＩＩ断片に対応するＨａｅＩＩ断片と、ｐＭ
Ｋ２０から誘導されかつプラスミド再生に必要とされる
小ＨａｅＩＩ断片とを有した（図３）。
ａｅＩＩにより完全に消化させ、再連結しそしてイー・
コリＭ５２１９（ＣａＣｌ ２コンピテント）を形質転換
させた（図３）、正しく形質転換したコロニを、それら
のカルベニシリンおよびカナマイシン耐性に基づいて選
択した。何故なら、ｐＢＲ３２２からのβ−ラクタマー
ゼ遺伝子とｐＭＫ２０からのカナマイシン遺伝子とを有
するクローンのみが、二重の抗生物質耐性を示すからで
ある。１２種の二重耐性形質転換種を選択した。これら
の形質転換種から上記と同様にプラスミドＤＮＡを単離
しそしてＨａｅＩＩ制限および６％アクリルアミドゲル
上での断片寸法決定とにより分析した。これらクローン
のうち５種はわずか３個のＨａｅＩＩ断片、すなわちＰ
Ｌプロモータとβ−ラクタマーゼ遺伝子とを有するｐＰ
Ｌａ２３のＨａｅＩＩ断片に対応するＨａｅＩＩ断片
と、カナマイシン耐性に関する遺伝子を持ったｐＭＫ２
０のＨａｅＩＩ断片に対応するＨａｅＩＩ断片と、ｐＭ
Ｋ２０から誘導されかつプラスミド再生に必要とされる
小ＨａｅＩＩ断片とを有した（図３）。
【００７１】これら５種の選択クローンをさらに検査し
て、ｐＰＬａ２３からのＨａｅＩＩ断片における再編成
ＥｃｏＲＩ部位に対する、ｐＭＫ２０からのＨａｅＩＩ
断片を有するカナマイシン遺伝子の方向性を決定した。
ｐＭＫ２０からのＨａｅＩＩ断片を有するカナマイシン
遺伝子は、独特の非対称ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するこ
とが知られている〔エム・カーン等、上記〕（図３）、
したがって、この部位は断片の方向性を決定する手段を
与える。
て、ｐＰＬａ２３からのＨａｅＩＩ断片における再編成
ＥｃｏＲＩ部位に対する、ｐＭＫ２０からのＨａｅＩＩ
断片を有するカナマイシン遺伝子の方向性を決定した。
ｐＭＫ２０からのＨａｅＩＩ断片を有するカナマイシン
遺伝子は、独特の非対称ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するこ
とが知られている〔エム・カーン等、上記〕（図３）、
したがって、この部位は断片の方向性を決定する手段を
与える。
【００７２】５種のクローンをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化し、得られた断片を前記のようにサイズ
決定した。５種のクローンのうち４種が、ｐＭＫ２０か
らのＨａｅＩＩ断片を有するＨｉｎｄＩＩＩ開裂カナマ
イシン遺伝子の大きい方の部分を開始点含有の小Ｈａｅ
ＩＩ断片に隣接して有した。１種のクローンは反対の方
向性を示した。これら二組のクローンをそれぞれ任意に
ｐＰＬａ２３１およびｐＰＬａ２３１１と命名した（図
３）。
ｃｏＲＩで消化し、得られた断片を前記のようにサイズ
決定した。５種のクローンのうち４種が、ｐＭＫ２０か
らのＨａｅＩＩ断片を有するＨｉｎｄＩＩＩ開裂カナマ
イシン遺伝子の大きい方の部分を開始点含有の小Ｈａｅ
ＩＩ断片に隣接して有した。１種のクローンは反対の方
向性を示した。これら二組のクローンをそれぞれ任意に
ｐＰＬａ２３１およびｐＰＬａ２３１１と命名した（図
３）。
【００７３】ｐＰＬａ２３１１を上記作成に係るプラス
ミドから任意に選択し、Ｐ Ｌ領域のヌクレオチド配列を
決定した。
ミドから任意に選択し、Ｐ Ｌ領域のヌクレオチド配列を
決定した。
【００７４】配列決定するに先立ち、二組の制限断片を
ｐＰＬａ２３１１から調製し、すなわちＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｃＩＩ断片とＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ断
片とである（図３に示さず）。両場合において、ｐＰＬ
ａ２３１１を第一制限酵素で消化し、得られた断片にＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌビオケミカルス
社）を用いてＰ ３２をラベルした。次いで、断片を第二
制限酵素またはＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩの場合には酵素対
により消化し、そして断片を６％アガロースゲル上で分
離した。配列決定は、エー・マキサムおよびダブリュ・
ギルバートの手順を用いて常法で行った〔「ＤＮＡの新
規な配列決定法」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０−
５６４頁（１９７７）〕。
ｐＰＬａ２３１１から調製し、すなわちＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｃＩＩ断片とＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ断
片とである（図３に示さず）。両場合において、ｐＰＬ
ａ２３１１を第一制限酵素で消化し、得られた断片にＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌビオケミカルス
社）を用いてＰ ３２をラベルした。次いで、断片を第二
制限酵素またはＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩの場合には酵素対
により消化し、そして断片を６％アガロースゲル上で分
離した。配列決定は、エー・マキサムおよびダブリュ・
ギルバートの手順を用いて常法で行った〔「ＤＮＡの新
規な配列決定法」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０−
５６４頁（１９７７）〕。
【００７５】この領域のヌクレオチド配列を図６に示
す。これは、ｐＢＲ３２２におけるＨａｅＩＩ部位か
ら、λファージ断片とｐＢＲ３２２との間の接合部にお
ける再編成ＥｃｏＲＩ部位まで延在する。決定された配
列は、公知配列と比較して次の特徴を有する。（１）Ｏ
ＬＰ Ｌオペレータ−プロモータ領域のヌクレオチド配列
は、ファージλにおけるこの領域の配列と同一である
〔ティー・マニアチス等、上記〕。（２）ＨａｅＩＩ部
位と、λファージ断片とｐＢＲ３２２との間の接合部に
おけるＳａｕ３Ａ部位との間の配列は、標準ｐＢＲ３２
２におけるそれと同一である〔ジェー・サットクリフ、
上記〕。（３）Ｎ遺伝子転写物の配列は、ダールベルク
およびグリーンブラット（上記）によりｍＲＮＡレベル
において決定された配列と一致し、ただし転写物の位置
４１において１個のアデノシン残基が削除されている。
（４）この配列はＮ遺伝子の翻訳開始信号を含まない
〔エヌ・フランクリンおよびジー・ベネット、「バクテ
リオファージλのＤＮＡ配列により規定されるそのＮ蛋
白質は高度に塩基性である」、ジーン誌、第８巻、第１
０７−１１９頁（１９７９）〕。
す。これは、ｐＢＲ３２２におけるＨａｅＩＩ部位か
ら、λファージ断片とｐＢＲ３２２との間の接合部にお
ける再編成ＥｃｏＲＩ部位まで延在する。決定された配
列は、公知配列と比較して次の特徴を有する。（１）Ｏ
ＬＰ Ｌオペレータ−プロモータ領域のヌクレオチド配列
は、ファージλにおけるこの領域の配列と同一である
〔ティー・マニアチス等、上記〕。（２）ＨａｅＩＩ部
位と、λファージ断片とｐＢＲ３２２との間の接合部に
おけるＳａｕ３Ａ部位との間の配列は、標準ｐＢＲ３２
２におけるそれと同一である〔ジェー・サットクリフ、
上記〕。（３）Ｎ遺伝子転写物の配列は、ダールベルク
およびグリーンブラット（上記）によりｍＲＮＡレベル
において決定された配列と一致し、ただし転写物の位置
４１において１個のアデノシン残基が削除されている。
（４）この配列はＮ遺伝子の翻訳開始信号を含まない
〔エヌ・フランクリンおよびジー・ベネット、「バクテ
リオファージλのＤＮＡ配列により規定されるそのＮ蛋
白質は高度に塩基性である」、ジーン誌、第８巻、第１
０７−１１９頁（１９７９）〕。
【００７６】３．ｐＰＬａ４およびｐＰＬａ８、すなわ
ちｐＰＬａ２３１１のβ−ラクタマーゼ遺伝子における
Ｐｓｔ部位からＢａｍＨＩ部位への変換 図３および図７は、ｐＰＬａ２３１１のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子におけるＰｓｔＩ部位からＢａｍＨＩ部位への
変換を大略示している。プラスミドｐＰＬａ２３１１を
ＰｓｔＩにより線状化させた。フェノールおよびクロロ
ホルム抽出の後、ＤＮＡを沈澱させ、２５ｍＭのＮａＣ
ＯＯＣＨ ３（ｐＨ４．５）と１ｍＭのＺｎＣＯＯＣＨ ３
と１２５ｍＭのＮａＣｌとに５０ｐモル／ｍｌの濃度で
再溶解させそしてＤＮＡｐモル当り１．５単位のＳ１ヌ
クレアーゼ（シグマ社）により２５℃にて９０分間処理
して３′−突出末端を除去した（図７）。反応は、５ｍ
ＭまでのＥＤＴＡの添加により停止させた。混合物を
０．２％ＳＤＳの存在下に７０℃で１０分間培養するこ
とによりＳ１ヌクレアーゼを除去し、次いでフェノール
およびクロロホルム抽出を行った。ＤＮＡを、４容量の
２Ｍ ＮＨ ４ＣＯＯＣＨ ３と１４容量のエタノールとの
添加により沈澱させた。
ちｐＰＬａ２３１１のβ−ラクタマーゼ遺伝子における
Ｐｓｔ部位からＢａｍＨＩ部位への変換 図３および図７は、ｐＰＬａ２３１１のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子におけるＰｓｔＩ部位からＢａｍＨＩ部位への
変換を大略示している。プラスミドｐＰＬａ２３１１を
ＰｓｔＩにより線状化させた。フェノールおよびクロロ
ホルム抽出の後、ＤＮＡを沈澱させ、２５ｍＭのＮａＣ
ＯＯＣＨ ３（ｐＨ４．５）と１ｍＭのＺｎＣＯＯＣＨ ３
と１２５ｍＭのＮａＣｌとに５０ｐモル／ｍｌの濃度で
再溶解させそしてＤＮＡｐモル当り１．５単位のＳ１ヌ
クレアーゼ（シグマ社）により２５℃にて９０分間処理
して３′−突出末端を除去した（図７）。反応は、５ｍ
ＭまでのＥＤＴＡの添加により停止させた。混合物を
０．２％ＳＤＳの存在下に７０℃で１０分間培養するこ
とによりＳ１ヌクレアーゼを除去し、次いでフェノール
およびクロロホルム抽出を行った。ＤＮＡを、４容量の
２Ｍ ＮＨ ４ＣＯＯＣＨ ３と１４容量のエタノールとの
添加により沈澱させた。
【００７７】回収されたＤＮＡは、１０倍モル過剰のＢ
ａｍＨＩリンカ分子（コラボラチブ・リサーチ・インコ
ーポレイテッド）に平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）連
結させた（シー・バール等、「クローン化用運搬体中に
特定ＤＮＡ配列を挿入する一般的方法」、ジーン誌、第
１巻、第８１−９２頁（１９７７）〕（図７）。Ｂａｍ
ＨＩでの開裂および低ＤＮＡ濃度での再連結の後（図
７）、混合物をＰｓｔＩで開裂させて、Ｓ１ヌクレアー
ゼ処理を逃れかつ完全ＰｓｔＩ部位に保持されているよ
うな分子を選択した。次いで２μｇの処理ＤＮＡをイー
・コリＭ５２１９に形質転換させ、形質転換種をカナマ
イシン耐性により選択した。全部で１０種の形質転換種
が得られ、そのうちの２種はＰｓｔＩ部位を欠如しかつ
ＢａｍＨＩ部位を獲得していた。これら後者の２種の形
質転換種の組替えＤＮＡ分子をｐＰＬａ８およびｐＰＬ
ａ４と名付けた（図３、ｐＰＬａ４は図３に図示せ
ず）。これら形質転換種の組替えＤＮＡ分子における混
成ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化の後に得られた断片は、
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ開裂後にｐＰＬａ２３１１から得
られた断片と一緒に１．４％アガロースゲル上にて移動
した。したがって、ｐＰＬａ２３１１におけるＰｓｔＩ
部位はＢａｍＨＩ部位により交換されている。
ａｍＨＩリンカ分子（コラボラチブ・リサーチ・インコ
ーポレイテッド）に平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）連
結させた（シー・バール等、「クローン化用運搬体中に
特定ＤＮＡ配列を挿入する一般的方法」、ジーン誌、第
１巻、第８１−９２頁（１９７７）〕（図７）。Ｂａｍ
ＨＩでの開裂および低ＤＮＡ濃度での再連結の後（図
７）、混合物をＰｓｔＩで開裂させて、Ｓ１ヌクレアー
ゼ処理を逃れかつ完全ＰｓｔＩ部位に保持されているよ
うな分子を選択した。次いで２μｇの処理ＤＮＡをイー
・コリＭ５２１９に形質転換させ、形質転換種をカナマ
イシン耐性により選択した。全部で１０種の形質転換種
が得られ、そのうちの２種はＰｓｔＩ部位を欠如しかつ
ＢａｍＨＩ部位を獲得していた。これら後者の２種の形
質転換種の組替えＤＮＡ分子をｐＰＬａ８およびｐＰＬ
ａ４と名付けた（図３、ｐＰＬａ４は図３に図示せ
ず）。これら形質転換種の組替えＤＮＡ分子における混
成ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化の後に得られた断片は、
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ開裂後にｐＰＬａ２３１１から得
られた断片と一緒に１．４％アガロースゲル上にて移動
した。したがって、ｐＰＬａ２３１１におけるＰｓｔＩ
部位はＢａｍＨＩ部位により交換されている。
【００７８】再び図７を参照して、β−ラクタマーゼ遺
伝子に関する過程の上記配列の効果を示す。図７に示さ
れているように、作成の最終的結果は、β−ラクタマー
ゼ蛋白質における位置１８２のＡｌａアミノ酸残基を配
列Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇにより交換することである。
この交換はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリーディングフレ
ームを完全のままにするので、再編成クローンの形質転
換種はカルベニシリン耐性を示すことが予想された。こ
の予想に反し、ｐＰＬａ４およびｐＰＬａ８により形質
転換させた宿主細胞はカルベニシリン耐性でなかった。
伝子に関する過程の上記配列の効果を示す。図７に示さ
れているように、作成の最終的結果は、β−ラクタマー
ゼ蛋白質における位置１８２のＡｌａアミノ酸残基を配
列Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇにより交換することである。
この交換はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリーディングフレ
ームを完全のままにするので、再編成クローンの形質転
換種はカルベニシリン耐性を示すことが予想された。こ
の予想に反し、ｐＰＬａ４およびｐＰＬａ８により形質
転換させた宿主細胞はカルベニシリン耐性でなかった。
【００７９】４．ｐＰＬａ８３、すなわちｐＰＬａ８の
ＥｃｏＲＩ部位に隣接するＢａｍＨＩの導入 プラスミドｐＡＤ３（エッチ・シャラーにより寄贈）
は、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入された４７個
の塩基対配列を有する。この配列は次の単位からなって
いる：ＢａｍＨＩ部位−ＥｃｏＲＩ部位−乳糖オペレー
タ−ＥｃｏＲＩ部位−ＢａｍＨＩ部位。この配列をｐＰ
Ｌａ８の再編成ＢａｍＨＩ部位に挿入するため、ｐＰＬ
ａ８と１０倍過剰のｐＡＤ３とをＢａｍＨＩによって消
化し、再連結しそしてイー・コリＷ６（λｒｅｘ）に形
質転換させた（図４）。形質転換種を、最少量の培地と
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと０．１％のグルコース
と４０μｇ／ｍｌのＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）とを含有す
る平板上で選別した〔ジェー・ミラー、エキスペリメン
ト・イン・モレキュラー・ゲネチックス（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリース）、第４８頁（１
９７２）〕。何故なら、Ｘｇａｌ色素の存在は、乳糖−
オペレータ断片を含有する形質転換種の検出を可能にす
るからである。実際その培地において、乳糖オペレータ
含有の形質転換種は青色になり、したがって他の形質転
換種から容易に区別できる。
ＥｃｏＲＩ部位に隣接するＢａｍＨＩの導入 プラスミドｐＡＤ３（エッチ・シャラーにより寄贈）
は、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入された４７個
の塩基対配列を有する。この配列は次の単位からなって
いる：ＢａｍＨＩ部位−ＥｃｏＲＩ部位−乳糖オペレー
タ−ＥｃｏＲＩ部位−ＢａｍＨＩ部位。この配列をｐＰ
Ｌａ８の再編成ＢａｍＨＩ部位に挿入するため、ｐＰＬ
ａ８と１０倍過剰のｐＡＤ３とをＢａｍＨＩによって消
化し、再連結しそしてイー・コリＷ６（λｒｅｘ）に形
質転換させた（図４）。形質転換種を、最少量の培地と
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと０．１％のグルコース
と４０μｇ／ｍｌのＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）とを含有す
る平板上で選別した〔ジェー・ミラー、エキスペリメン
ト・イン・モレキュラー・ゲネチックス（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリース）、第４８頁（１
９７２）〕。何故なら、Ｘｇａｌ色素の存在は、乳糖−
オペレータ断片を含有する形質転換種の検出を可能にす
るからである。実際その培地において、乳糖オペレータ
含有の形質転換種は青色になり、したがって他の形質転
換種から容易に区別できる。
【００８０】組換えＤＮＡ分子を上記のように青色コロ
ニーの一つから単離し、ＥｃｏＲＩによって消化した。
得られた２個の断片は、ｐＰＬａ８のＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化から得られた２個の断片と実質的に一緒にア
ガロースゲル上で移動し、それによりｐＡＤ３からの所
望の４７塩基対断片がｐＰＬａ８の再編成ＢａｍＨＩ部
位に正しく挿入されたことを確認した。このプラスミド
をｐＰＬａ８３と名付けた（図４）。
ニーの一つから単離し、ＥｃｏＲＩによって消化した。
得られた２個の断片は、ｐＰＬａ８のＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ消化から得られた２個の断片と実質的に一緒にア
ガロースゲル上で移動し、それによりｐＡＤ３からの所
望の４７塩基対断片がｐＰＬａ８の再編成ＢａｍＨＩ部
位に正しく挿入されたことを確認した。このプラスミド
をｐＰＬａ８３と名付けた（図４）。
【００８１】５．ｐＰＬａ８３１、すなわちｐＰＬａ８
３におけるＰ Ｌプロモータに対しＢａｍＨＩ部位の一層
の近接 ｐＰＬａ８３におけるＰ Ｌプロモータに対しＢａｍＨＩ
部位をより近接させるため、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断
片をＥｃｏＲＩでのｐＰＬａ８３の消化および希薄ＤＮ
Ａ濃度における再連結により除去した（図４）。得られ
た組替えＤＮＡ分子からイー・コリＷ６（λｒｅｘ）へ
の形質転換および上記したようなＸｇａｌおよびカナマ
イシンを補填した最少量培地を含む平板上での増殖は、
もはや乳糖オペレータ領域を持たないようなクローンの
選別を可能にした。選択形質転換種からのＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ−ＸｈｏＩによる制限、および得られた断片の移
動とｐＰＬａ８のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化から得られ
た２個の断片の移動との比較により、予想通り、改変プ
ラスミドにおけるＢａｍＨＩ部位がＰ Ｌプロモータから
約１５０塩基対にあったことを確認した。この改変プラ
スミドをｐＰＬａ８３１と名付けた。
３におけるＰ Ｌプロモータに対しＢａｍＨＩ部位の一層
の近接 ｐＰＬａ８３におけるＰ Ｌプロモータに対しＢａｍＨＩ
部位をより近接させるため、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断
片をＥｃｏＲＩでのｐＰＬａ８３の消化および希薄ＤＮ
Ａ濃度における再連結により除去した（図４）。得られ
た組替えＤＮＡ分子からイー・コリＷ６（λｒｅｘ）へ
の形質転換および上記したようなＸｇａｌおよびカナマ
イシンを補填した最少量培地を含む平板上での増殖は、
もはや乳糖オペレータ領域を持たないようなクローンの
選別を可能にした。選択形質転換種からのＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ−ＸｈｏＩによる制限、および得られた断片の移
動とｐＰＬａ８のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化から得られ
た２個の断片の移動との比較により、予想通り、改変プ
ラスミドにおけるＢａｍＨＩ部位がＰ Ｌプロモータから
約１５０塩基対にあったことを確認した。この改変プラ
スミドをｐＰＬａ８３１と名付けた。
【００８２】勿論、上記３，４および５のいずれかに記
載されたと同様な操作を用いて、本発明のベクタおける
選択プロモータおよびオペレータから３００塩基対以内
に他のエンドヌクレアーゼ認識部位を与えうることも了
解すべきである。このような操作の例は下記のものを包
含する。
載されたと同様な操作を用いて、本発明のベクタおける
選択プロモータおよびオペレータから３００塩基対以内
に他のエンドヌクレアーゼ認識部位を与えうることも了
解すべきである。このような操作の例は下記のものを包
含する。
【００８３】６．ｐＰＬａ８３２、すなわちｐＰＬａ８
３１のＢａｍＨＩ部位に隣接したＨｉｎｄＩＩＩ部位の
挿入 プラスミドｐＡＤ１６（エッチ・シャラーにより寄贈）
は、ＢａｍＨＩ部位−ＨｉｎｄＩＩＩ部位−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位−ＢａｍＨＩ部位からなるｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩ部位に挿入された３６塩基対断片を含有する。こ
の配列をｐＰＬａ８３１のＢａｍＨＩ部位に挿入するた
め、ｐＰＬａ８３１と１０倍過剰量のｐＡＤ１６とをＢ
ａｍＨＩで開裂させ、再連結しそしてイー・コリＭ５２
１９を形質転換させ、カナマイシン耐性につき選別した
（図４）。ｐＰＬａ８３１中への所望ＢａｍＨＩ断片の
適切な挿入を決定するための容易な選別方法が存在しな
いので、カナマイシンの存在下で増殖した形質転換種の
分析は、個々のランダム選択したクローンの制限開裂に
依存した。分析した３２種のクローンのうち、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩでの開裂後に２個の断片を生成する１種を見出し
た（図４）。これら断片の大きさは、ｐＰＬａ８３１の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ開裂またはＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ開裂の後に得られた断片から１．４％アガ
ロースゲル上で区別できなかった。この改変プラスミド
をｐＰＬａ８３２と名付けた。
３１のＢａｍＨＩ部位に隣接したＨｉｎｄＩＩＩ部位の
挿入 プラスミドｐＡＤ１６（エッチ・シャラーにより寄贈）
は、ＢａｍＨＩ部位−ＨｉｎｄＩＩＩ部位−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位−ＢａｍＨＩ部位からなるｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩ部位に挿入された３６塩基対断片を含有する。こ
の配列をｐＰＬａ８３１のＢａｍＨＩ部位に挿入するた
め、ｐＰＬａ８３１と１０倍過剰量のｐＡＤ１６とをＢ
ａｍＨＩで開裂させ、再連結しそしてイー・コリＭ５２
１９を形質転換させ、カナマイシン耐性につき選別した
（図４）。ｐＰＬａ８３１中への所望ＢａｍＨＩ断片の
適切な挿入を決定するための容易な選別方法が存在しな
いので、カナマイシンの存在下で増殖した形質転換種の
分析は、個々のランダム選択したクローンの制限開裂に
依存した。分析した３２種のクローンのうち、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩでの開裂後に２個の断片を生成する１種を見出し
た（図４）。これら断片の大きさは、ｐＰＬａ８３１の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ開裂またはＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ開裂の後に得られた断片から１．４％アガ
ロースゲル上で区別できなかった。この改変プラスミド
をｐＰＬａ８３２と名付けた。
【００８４】Ｂ．複製開始点に対し時計方向の方向性で
Ｐ Ｌプロモータを含有するベクタ １．ｐＰＬｃ２、すなわちｐＰＬａ８３２のＰ Ｌ担持断
片のクローン化 ｐＢＲ３２２とｐＰＬａ８３２との等モル混合物をＢａ
ｍＨＩにより、次いでＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させた
（図４）。この混合物を再連結し、Ｍ５２１９を形質転
換させてカルベニシリン耐性につき選択した。この構成
の正しく調製された組替えＤＮＡ分子はもはやテトラサ
イクリンに対する完全遺伝子を含まないので、これら形
質転換種をさらにテトラサイクリン耐性の喪失につき選
別した。組替えＤＮＡ分子を上記と同様に選択形質転換
種から単離し、制限により分析した。選択したプラスミ
ドは単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有した。混成Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化は２つの断片をもたらし、こ
れらはアガロースゲル上において、単一のＥｃｏＲＩ消
化により得られた２つの断片と実質的に一緒に移動し
た。Ｐ Ｌ担持断片の存在はＨｉｎｃＩＩ消化により証明
された。この酵素はベクタを３個の断片に開裂し、それ
らの大きさは図４に示した断片の構造と一致した。この
プラスミドをｐＰＬｃ２と名付け、ここで「ｃ」は複製
開始点に対しＰＬプロモータの時計方向の方向性を示
す。
Ｐ Ｌプロモータを含有するベクタ １．ｐＰＬｃ２、すなわちｐＰＬａ８３２のＰ Ｌ担持断
片のクローン化 ｐＢＲ３２２とｐＰＬａ８３２との等モル混合物をＢａ
ｍＨＩにより、次いでＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させた
（図４）。この混合物を再連結し、Ｍ５２１９を形質転
換させてカルベニシリン耐性につき選択した。この構成
の正しく調製された組替えＤＮＡ分子はもはやテトラサ
イクリンに対する完全遺伝子を含まないので、これら形
質転換種をさらにテトラサイクリン耐性の喪失につき選
別した。組替えＤＮＡ分子を上記と同様に選択形質転換
種から単離し、制限により分析した。選択したプラスミ
ドは単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有した。混成Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化は２つの断片をもたらし、こ
れらはアガロースゲル上において、単一のＥｃｏＲＩ消
化により得られた２つの断片と実質的に一緒に移動し
た。Ｐ Ｌ担持断片の存在はＨｉｎｃＩＩ消化により証明
された。この酵素はベクタを３個の断片に開裂し、それ
らの大きさは図４に示した断片の構造と一致した。この
プラスミドをｐＰＬｃ２と名付け、ここで「ｃ」は複製
開始点に対しＰＬプロモータの時計方向の方向性を示
す。
【００８５】２．ｐＰＬｃ２３、すなわちｐＰＬｃ２か
らの１個のＥｃｏＲＩ部位の除去 プラスミドｐＰＬｃ２は２つのＥｃｏＲＩ部位を含有
し、１つは親ｐＢＲ３２２ベクタから由来したものであ
り、１つはｐＰＬａ８３２からのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片の挿入により導入されたＢａｍＨＩ部位に近
接するものである（図４）。ｐＢＲ３２２から由来した
ＥｃｏＲＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩでの
ｐＰＬｃ２の開裂に続き、０．６ＭのＮａＣｌと各１
２．５ｍＭのＣａＣｌ ２およびＭｇＳＯ ４と１ｍＭのＥ
ＤＴＡと２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）とに
おけるＢａｌ３１での２５℃、３０分間の消化によって
除去した。エンドヌクレアーゼＢａｌ３１は３′−およ
び５′−未満を段階的に滅勢する〔エッチ・グレー等、
「シュードモナスＢａｌ３１の細胞外ヌクレアーゼ。
Ｉ．単一鎖−特異性デオキシリボエンドヌクレアーゼお
よび二重鎖デオキシリボエキソヌクレアーゼ活性の特性
化」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第２巻、第
１４５９−１４９２頁（１９７５）〕。
らの１個のＥｃｏＲＩ部位の除去 プラスミドｐＰＬｃ２は２つのＥｃｏＲＩ部位を含有
し、１つは親ｐＢＲ３２２ベクタから由来したものであ
り、１つはｐＰＬａ８３２からのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片の挿入により導入されたＢａｍＨＩ部位に近
接するものである（図４）。ｐＢＲ３２２から由来した
ＥｃｏＲＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩでの
ｐＰＬｃ２の開裂に続き、０．６ＭのＮａＣｌと各１
２．５ｍＭのＣａＣｌ ２およびＭｇＳＯ ４と１ｍＭのＥ
ＤＴＡと２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）とに
おけるＢａｌ３１での２５℃、３０分間の消化によって
除去した。エンドヌクレアーゼＢａｌ３１は３′−およ
び５′−未満を段階的に滅勢する〔エッチ・グレー等、
「シュードモナスＢａｌ３１の細胞外ヌクレアーゼ。
Ｉ．単一鎖−特異性デオキシリボエンドヌクレアーゼお
よび二重鎖デオキシリボエキソヌクレアーゼ活性の特性
化」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第２巻、第
１４５９−１４９２頁（１９７５）〕。
【００８６】混合物をフェノールとクロロホルムとで抽
出し、ＤＮＡ濃度／μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで連結
した。連結後、ＤＮＡをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
により再び開裂させて親プラスミド分子を除去しそして
Ｍ５２１９を形質転換させてカルベニシリン耐性につき
選別した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を欠如す
る１つの形質転換種を見出した。このプラスミドは単一
のＥｃｏＲＩ部位を含むと共に、３つのＨｉｎｃＩＩ部
位を有した（図４）。この後者の性質により、Ｐ Ｌ領域
がまだ存在することが確認された。このプラスミドをｐ
ＰＬｃ２３と名付けた。
出し、ＤＮＡ濃度／μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで連結
した。連結後、ＤＮＡをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
により再び開裂させて親プラスミド分子を除去しそして
Ｍ５２１９を形質転換させてカルベニシリン耐性につき
選別した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を欠如す
る１つの形質転換種を見出した。このプラスミドは単一
のＥｃｏＲＩ部位を含むと共に、３つのＨｉｎｃＩＩ部
位を有した（図４）。この後者の性質により、Ｐ Ｌ領域
がまだ存在することが確認された。このプラスミドをｐ
ＰＬｃ２３と名付けた。
【００８７】Ｂａｌ３１酵素によるエキソヌクレアーゼ
減成の程度を評価するため、ｐＰＬｃ２３ＤＮＡをＢａ
ｍＨＩとＰｓｔＩとにより同時に開裂させ、これら断片
を１．４％アガロースゲル上で大きさを決定した。親ｐ
ＰＬｃ２からのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と比較して、
ｐＰＬｃ２３からのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片は８００
塩基対以上の除去を示した。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ開裂
に対比してＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ−ＨａｅＩＩによる混
成消化は、Ｐ Ｌ担持断片とカナマイシン断片との間の接
合部におけるＨａｅ部位が維持されていることを確認し
た。
減成の程度を評価するため、ｐＰＬｃ２３ＤＮＡをＢａ
ｍＨＩとＰｓｔＩとにより同時に開裂させ、これら断片
を１．４％アガロースゲル上で大きさを決定した。親ｐ
ＰＬｃ２からのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と比較して、
ｐＰＬｃ２３からのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片は８００
塩基対以上の除去を示した。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ開裂
に対比してＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ−ＨａｅＩＩによる混
成消化は、Ｐ Ｌ担持断片とカナマイシン断片との間の接
合部におけるＨａｅ部位が維持されていることを確認し
た。
【００８８】３．ｐＰＬｃ２３６、すなわちｐＰＬｃ２
３へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の導入 プラスミドｐＰＬｃ２３は、Ｐ Ｌプロモータから下方約
１５０ヌクレオチドに位置する独特のＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩ部位を含有する。ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位
を、ｐＰＬａ８３２から得られたＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＬｃ２
３のＢａｍＨＩ部位に連結することにより、ｐＰＬｃ２
３中に導入した。Ｍ５２１９において形質転換種を得、
これらをＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在について制限分析に
より選別した。代表的クローンの構造は、ＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩもしくはＰｓｔＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ消化の後に得られた断片のアガロースゲル
電気泳動により確認した。これら各混成消化の後に得ら
れた断片は１．４％アガロースゲル上にて実質的に一緒
に移動し、このことはＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位が互いに近接して偏在することを示し
ている。このプラスミドをｐＰＬｃ２３６と名付けた
（図４）。
３へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の導入 プラスミドｐＰＬｃ２３は、Ｐ Ｌプロモータから下方約
１５０ヌクレオチドに位置する独特のＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩ部位を含有する。ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位
を、ｐＰＬａ８３２から得られたＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＬｃ２
３のＢａｍＨＩ部位に連結することにより、ｐＰＬｃ２
３中に導入した。Ｍ５２１９において形質転換種を得、
これらをＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在について制限分析に
より選別した。代表的クローンの構造は、ＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩもしくはＰｓｔＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ消化の後に得られた断片のアガロースゲル
電気泳動により確認した。これら各混成消化の後に得ら
れた断片は１．４％アガロースゲル上にて実質的に一緒
に移動し、このことはＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位が互いに近接して偏在することを示し
ている。このプラスミドをｐＰＬｃ２３６と名付けた
（図４）。
【００８９】プラスミドｐＰＬｃ２３６の大きい方の部
分は、位置３７７におけるＢａｍＨＩ部位（ジェー・サ
ットクリフ、上記）から位置４１６０近傍におけるβ−
ラクタマーゼ遺伝子の少なくとも開始部位（ジェー・サ
ットクリフ、上記）までｐＢＲ３２２に由来する。残部
は次のものから構成される：（１）ＸｈｏＩ部位とこの
断片の１つのＨａｅＩＩ末端との間に位置するカナマイ
シン遺伝子の部分に由来する配列；（２）約３００個の
ヌクレオチドからなりかつｐＰＬａ８３２に由来するＰ
Ｌプロモータを含有するＨａｅＩＩ−ＢａｍＨＩ断片；
（３）ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ部位をコードする配列。
分は、位置３７７におけるＢａｍＨＩ部位（ジェー・サ
ットクリフ、上記）から位置４１６０近傍におけるβ−
ラクタマーゼ遺伝子の少なくとも開始部位（ジェー・サ
ットクリフ、上記）までｐＢＲ３２２に由来する。残部
は次のものから構成される：（１）ＸｈｏＩ部位とこの
断片の１つのＨａｅＩＩ末端との間に位置するカナマイ
シン遺伝子の部分に由来する配列；（２）約３００個の
ヌクレオチドからなりかつｐＰＬａ８３２に由来するＰ
Ｌプロモータを含有するＨａｅＩＩ−ＢａｍＨＩ断片；
（３）ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢａｍＨＩ部位をコードする配列。
【００９０】４．ｐＰＬｃ２８すなわちｐＰＬｃ２３６
からの除去 ｐＰＬｃ２３６における２つの隣接するＨｉｎｄＩＩＩ
部位の重複はＢａｌＩ部位である（図４に示さず）。さ
らに、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２部分の塩基対２
０６７に、独特のＰｖｕＩＩ部位を含有する〔ジェー・
サットクリフ、上記〕（図４）。酵素ＢａｌＩおよびＰ
ｖｕＩＩの両者はフラッシュ末端をもたらす。ｐＰＬｃ
２３６ＤＮＡをＢａｌＩおよびＰｖｕＩＩによって開裂
し、低ＤＮＡ濃度で再連結した。形質転換種をＭ５２１
９にて獲得し、カルベニシリン耐性につき選択した。代
表的クローンのＤＮＡは制限により分析した。ＢａｍＨ
Ｉ開裂は単一の断片を生成し、これは１．４％アガロー
スゲル上においてＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ開裂後のｐＰ
Ｌｃ２３６の大きい方の部分と共に移動した。ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩまたはＰｓｔＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩのいずれかによる混成消化は、各場合に
２つの断片を生成し、その小さい方の断片は１．４％ア
ガロースゲル上においてｐＰＬｃ２３６から得られたＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片と実質的に一緒に移動した。こ
のプラスミドをｐＰＬｃ２８と名付けた（図４）。
からの除去 ｐＰＬｃ２３６における２つの隣接するＨｉｎｄＩＩＩ
部位の重複はＢａｌＩ部位である（図４に示さず）。さ
らに、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２部分の塩基対２
０６７に、独特のＰｖｕＩＩ部位を含有する〔ジェー・
サットクリフ、上記〕（図４）。酵素ＢａｌＩおよびＰ
ｖｕＩＩの両者はフラッシュ末端をもたらす。ｐＰＬｃ
２３６ＤＮＡをＢａｌＩおよびＰｖｕＩＩによって開裂
し、低ＤＮＡ濃度で再連結した。形質転換種をＭ５２１
９にて獲得し、カルベニシリン耐性につき選択した。代
表的クローンのＤＮＡは制限により分析した。ＢａｍＨ
Ｉ開裂は単一の断片を生成し、これは１．４％アガロー
スゲル上においてＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ開裂後のｐＰ
Ｌｃ２３６の大きい方の部分と共に移動した。ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩまたはＰｓｔＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩのいずれかによる混成消化は、各場合に
２つの断片を生成し、その小さい方の断片は１．４％ア
ガロースゲル上においてｐＰＬｃ２３６から得られたＰ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片と実質的に一緒に移動した。こ
のプラスミドをｐＰＬｃ２８と名付けた（図４）。
【００９１】ｐＰＬｃ２８は、本発明により記載された
他のプラスミドと同様に、さらに処理して他の制限部位
を挿入し得ることは勿論である。たとえば、次のもの：
Ｘｂａ制限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制限部位−Ｐ
ｓｔ制限部位−Ｘｂａ制限部位、を含有する断片は、ｐ
ＰＬｃ２８中のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入されてい
る。このプラスミドをｐＰＬｃ２８１９と名付けた。他
の同様な操作は、ｐＰＬｃ２８のＢａｍＨＩ部位に挿入
された断片Ｐｓｔ制限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制
限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制限部位を含有するプ
ラスミドを与えた。このプラスミドをｐＰＬｃ２８３３
と名付けた。
他のプラスミドと同様に、さらに処理して他の制限部位
を挿入し得ることは勿論である。たとえば、次のもの：
Ｘｂａ制限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制限部位−Ｐ
ｓｔ制限部位−Ｘｂａ制限部位、を含有する断片は、ｐ
ＰＬｃ２８中のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入されてい
る。このプラスミドをｐＰＬｃ２８１９と名付けた。他
の同様な操作は、ｐＰＬｃ２８のＢａｍＨＩ部位に挿入
された断片Ｐｓｔ制限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制
限部位−Ｓａｌ制限部位−Ｘｂａ制限部位を含有するプ
ラスミドを与えた。このプラスミドをｐＰＬｃ２８３３
と名付けた。
【００９２】５．ｐＰＬｃ２４、すなわちｐＰＬｃ２８
中へのバクテリオファージＭＳ２レプリカーゼ蛋白質の
リボソーム結合部位およびアミノ末端部分の挿入 バクテリオファージＭＳ２レプリカーゼ遺伝子のリボソ
ーム結合部位および最初の９８個のアミノ酸残基をコー
ドする４３１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラ
スミドｐＭＳ２−７から得た〔アール・デボス等、「バ
クテリオファージＮＳ２ＲＮＡのほぼ完全サイズＤＮＡ
コピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、ジ
ャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１２巻、第
５９５−６１９頁（１９７９）〕。この断片をプラスミ
ドｐＰＬｃ２８中に挿入して、そこの元来のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片を交換した（図５）。ｐＰＬｃ２４と
名付けたこの得られたプラスミドの構造を、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩでの制限分析ならびに、得られた断片とｐ
ＭＳ２−７およびｐＰＬｃ２８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化により得られたものとの比較により証明した。ｐ
ＰＬｃ２４において、ＭＳ２レプリカーゼ蛋白質断片の
翻訳はＰ Ｌプロモータからの転写と平行して進行し、し
たがってＰ Ｌ制御下におかれる。
中へのバクテリオファージＭＳ２レプリカーゼ蛋白質の
リボソーム結合部位およびアミノ末端部分の挿入 バクテリオファージＭＳ２レプリカーゼ遺伝子のリボソ
ーム結合部位および最初の９８個のアミノ酸残基をコー
ドする４３１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラ
スミドｐＭＳ２−７から得た〔アール・デボス等、「バ
クテリオファージＮＳ２ＲＮＡのほぼ完全サイズＤＮＡ
コピーを含有するプラスミドの作成および特性化」、ジ
ャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１２巻、第
５９５−６１９頁（１９７９）〕。この断片をプラスミ
ドｐＰＬｃ２８中に挿入して、そこの元来のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片を交換した（図５）。ｐＰＬｃ２４と
名付けたこの得られたプラスミドの構造を、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩでの制限分析ならびに、得られた断片とｐ
ＭＳ２−７およびｐＰＬｃ２８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化により得られたものとの比較により証明した。ｐ
ＰＬｃ２４において、ＭＳ２レプリカーゼ蛋白質断片の
翻訳はＰ Ｌプロモータからの転写と平行して進行し、し
たがってＰ Ｌ制御下におかれる。
【００９３】本発明のベクタにより形質転換された宿主
細胞の生物学的性質 １．２８℃における安定性 上記ベクタのいずれかにより形質転換させた菌株Ｋ１２
ΔＨＩまたはＭ５２１９を、抗生物質耐性マーカに関す
る選択なしに、ＬＢ培地において２０世代にわたり２８
℃にて増殖させた。次いで培養物の適当な希釈物を、所
望の抗生物質の存在下または不存在下のいずれかにおい
て２８℃にて平板に接種した。すべての場合、得られた
集落の数は抗生物質耐性についての選択とは無関係に同
じであり、このことはベクタがこれら宿主において２８
℃で完全に安定であったことを示している（表１参照、
下記）。
細胞の生物学的性質 １．２８℃における安定性 上記ベクタのいずれかにより形質転換させた菌株Ｋ１２
ΔＨＩまたはＭ５２１９を、抗生物質耐性マーカに関す
る選択なしに、ＬＢ培地において２０世代にわたり２８
℃にて増殖させた。次いで培養物の適当な希釈物を、所
望の抗生物質の存在下または不存在下のいずれかにおい
て２８℃にて平板に接種した。すべての場合、得られた
集落の数は抗生物質耐性についての選択とは無関係に同
じであり、このことはベクタがこれら宿主において２８
℃で完全に安定であったことを示している（表１参照、
下記）。
【００９４】さらに、全てのベクタは、バクテリオファ
ージλに対し溶原性の宿主菌株を形質転換させることが
できた。存在ファージが野性型ｃＩ生産物を合成するこ
の種の菌株は高温（３７℃）にて生存可能であった。こ
れに対し、非溶原性宿主はこれらベクタにより形質転換
させ得なかった。むしろ、これら実験から得られた稀な
形質転換種は常に、Ｐ Ｌ領域の全部またはほとんどを除
去する欠失を伴ったベクタを含んでいた。
ージλに対し溶原性の宿主菌株を形質転換させることが
できた。存在ファージが野性型ｃＩ生産物を合成するこ
の種の菌株は高温（３７℃）にて生存可能であった。こ
れに対し、非溶原性宿主はこれらベクタにより形質転換
させ得なかった。むしろ、これら実験から得られた稀な
形質転換種は常に、Ｐ Ｌ領域の全部またはほとんどを除
去する欠失を伴ったベクタを含んでいた。
【００９５】２．４２℃における長期誘発後のＰ Ｌベク
タを含有する細胞の挙動 本発明のベクタにより形質転換させた菌株Ｋ１２ΔＨＩ
およびＭ５２１９の４２℃における平板接種の効果を、
抗生物質選択の存在または不存在下で決定した。
タを含有する細胞の挙動 本発明のベクタにより形質転換させた菌株Ｋ１２ΔＨＩ
およびＭ５２１９の４２℃における平板接種の効果を、
抗生物質選択の存在または不存在下で決定した。
【００９６】複製開始点に対し時計方向の方向性にてＰ
Ｌを挿入したベクタ（ｐＰＬｃ型）は同様に挙動した。
ｐＰＬｃ２３６により得られた結果を表１に示す（下
記）。ｐＰＬｃ２３６で形質転換させた菌株Ｋ１２ΔＨ
Ｉを、抗生物質選択を行ったかどうかには無関係に、４
２℃におけると同様に２８℃においても平板接種した。
ｐＰＬｃ２３６で形質転換させた菌株Ｍ５２１９を非選
択平板上に接種して１の効果を得た。しかしながら、抗
生物質選択を行った場合、接種の効果は少なくとも１０
００倍低下した。非選択平板上で４２℃にて得られた集
落は、もはや抗生物質マーカに対する耐性を持たなかっ
た。
Ｌを挿入したベクタ（ｐＰＬｃ型）は同様に挙動した。
ｐＰＬｃ２３６により得られた結果を表１に示す（下
記）。ｐＰＬｃ２３６で形質転換させた菌株Ｋ１２ΔＨ
Ｉを、抗生物質選択を行ったかどうかには無関係に、４
２℃におけると同様に２８℃においても平板接種した。
ｐＰＬｃ２３６で形質転換させた菌株Ｍ５２１９を非選
択平板上に接種して１の効果を得た。しかしながら、抗
生物質選択を行った場合、接種の効果は少なくとも１０
００倍低下した。非選択平板上で４２℃にて得られた集
落は、もはや抗生物質マーカに対する耐性を持たなかっ
た。
【００９７】複製開始点に対し反時計方向の方向性で挿
入されたＰ Ｌを有するベクタ（ｐＰＬａ型）は、４２℃
においてより複雑なパターンの集落形成を示した。菌株
Ｍ５２１９の形質転換種は、抗生物質選択の不存在にお
いてさえ、４２℃において集落を形成しなかった（接種
の効果は１０ −３以下であった。表１）、４２℃におけ
る菌株Ｋ１２ΔＨＩの形質転換種の挙動は、存在するベ
クタの性質に依存した。たとえば、抗生物質選択を行っ
ても行わなくとも、ｐＰＬａ８３２を含有する形質転換
種は常に少なくとも１０００倍の接種効果減少を示した
のに対し、ｐＰＬａ２３またはｐＰＬａ２３１１を含有
する形質転換種は１〜１０ −３の範囲の接種効果を示
し、しばしば集落の大きさにおける大きな不均一性を伴
った。
入されたＰ Ｌを有するベクタ（ｐＰＬａ型）は、４２℃
においてより複雑なパターンの集落形成を示した。菌株
Ｍ５２１９の形質転換種は、抗生物質選択の不存在にお
いてさえ、４２℃において集落を形成しなかった（接種
の効果は１０ −３以下であった。表１）、４２℃におけ
る菌株Ｋ１２ΔＨＩの形質転換種の挙動は、存在するベ
クタの性質に依存した。たとえば、抗生物質選択を行っ
ても行わなくとも、ｐＰＬａ８３２を含有する形質転換
種は常に少なくとも１０００倍の接種効果減少を示した
のに対し、ｐＰＬａ２３またはｐＰＬａ２３１１を含有
する形質転換種は１〜１０ −３の範囲の接種効果を示
し、しばしば集落の大きさにおける大きな不均一性を伴
った。
【００９８】したがって、４２℃におけるｐＰＬａ型ベ
クタの発現は、宿主代謝に対する阻害をひきおこし、プ
ラスミドに対する選択の不存在においてさえこの高温度
では細胞が生存し得ないようにした。この効果は、Ｍ５
２１９宿主を使用した場合に特に顕著である。逆に、ｐ
ＰＬｃ型ベクタは宿主細胞代謝に関し直接には阻害しな
い。何故なら、選択的圧力の不存在において誘発細胞の
１００％生存が観察されるからである。しかしながら、
Ｍ５２１９におけるＮ遺伝子の発現と同時的なＰ Ｌプロ
モータからの継続的転写は、Ｍ５２１９菌株におけるベ
クタ再生の阻止をもたらすであろう。このことは、選択
平板上において４２℃でこれら細胞が増殖しえないこと
により示される。
クタの発現は、宿主代謝に対する阻害をひきおこし、プ
ラスミドに対する選択の不存在においてさえこの高温度
では細胞が生存し得ないようにした。この効果は、Ｍ５
２１９宿主を使用した場合に特に顕著である。逆に、ｐ
ＰＬｃ型ベクタは宿主細胞代謝に関し直接には阻害しな
い。何故なら、選択的圧力の不存在において誘発細胞の
１００％生存が観察されるからである。しかしながら、
Ｍ５２１９におけるＮ遺伝子の発現と同時的なＰ Ｌプロ
モータからの継続的転写は、Ｍ５２１９菌株におけるベ
クタ再生の阻止をもたらすであろう。このことは、選択
平板上において４２℃でこれら細胞が増殖しえないこと
により示される。
【００９９】
【表１】
【０１００】＊細菌培養物を抗生物質の存在下で２８℃
にてＬＢ培地において飽和するまで培養させた。適当な
希釈物を抗生物質の存在下または不存在下で平板接種
し、２８℃または４２℃にて培養した。得られた集落の
数を測定した。
にてＬＢ培地において飽和するまで培養させた。適当な
希釈物を抗生物質の存在下または不存在下で平板接種
し、２８℃または４２℃にて培養した。得られた集落の
数を測定した。
【０１０１】本発明のベクタにおける遺伝子の発現 １．一般的手順 本発明のベクタは、所望ポリペプチドもしくは蛋白質を
コードする遺伝子からなるＤＮＡ配列をプロモータおよ
びオペレータに隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位の
一つにおいてベクタ中に挿入し、これら挿入ＤＮＡ配列
を有するベクタにより適当な宿主を形質転換させ、宿主
を培養しそしてポリペプチドもしくは蛋白質生産物を回
収することにより、種々のポリペプチドおよび蛋白質を
生産するため有用に使用することができる。この種のポ
リペプチドおよび蛋白質の例は、白血球インターフェロ
ン、インシュリン、肝炎の抗原、脚および口疾患の抗
原、繊維芽細胞インターフェロン、ひと成長ホルモン、
免疫インターフェロンならびに各種の他の原核、真核お
よびウイルス酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗原およ
び蛋白質を包含する。
コードする遺伝子からなるＤＮＡ配列をプロモータおよ
びオペレータに隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位の
一つにおいてベクタ中に挿入し、これら挿入ＤＮＡ配列
を有するベクタにより適当な宿主を形質転換させ、宿主
を培養しそしてポリペプチドもしくは蛋白質生産物を回
収することにより、種々のポリペプチドおよび蛋白質を
生産するため有用に使用することができる。この種のポ
リペプチドおよび蛋白質の例は、白血球インターフェロ
ン、インシュリン、肝炎の抗原、脚および口疾患の抗
原、繊維芽細胞インターフェロン、ひと成長ホルモン、
免疫インターフェロンならびに各種の他の原核、真核お
よびウイルス酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗原およ
び蛋白質を包含する。
【０１０２】これらの処理を説明するため、本発明のベ
クタにおける特定遺伝子生産物の合成を、誘発細胞のパ
ルス−ラベル化（ｐｕｌｓｅ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動でのラベル化蛋白
質の分析により検定した。
クタにおける特定遺伝子生産物の合成を、誘発細胞のパ
ルス−ラベル化（ｐｕｌｓｅ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動でのラベル化蛋白
質の分析により検定した。
【０１０３】本発明のベクタで形質転換させた細胞を、
抗生物質のないＬＢ培地において２８℃にて２×１０ ８
／ｍｌの密度まで増殖させた。細胞を遠心分離により集
め、１９ｍＭのＮＨ ４Ｃｌと８６ｍＭのＮａＣｌと４２
ｍＭのＮａ ２ＨＰＯ ４と１ｍＭのＭｇＳＯ ４と０．２％
のグルコースと０．０５％のカサミノ酸（ディフコ社）
と０．０１％の酵母エキスと５０μｇ／ｍｌのＬ−トリ
プトファンとよりなる培地の初期容量に懸濁させ、細胞
をＣ １４−アミノ酸混合物もしくは上記培地でラベル
し、ただし後者の培地はカサミノ酸および酵母エキスの
代りに５％メチオニン分析培地（ディフコ社）を使用し
て細胞をＳ ３５−メチオニンでラベルした。２８℃にお
ける培養を６０分間続けた。次いで培養物の半分を４２
℃に変化させた。誘発後の種々な時間において、２８℃
および４２℃培養物からの部分をＣ１４−アミノ酸混合
物またはＳ ３５−メチオニン（アメルシャム社）でラベ
ルした。
抗生物質のないＬＢ培地において２８℃にて２×１０ ８
／ｍｌの密度まで増殖させた。細胞を遠心分離により集
め、１９ｍＭのＮＨ ４Ｃｌと８６ｍＭのＮａＣｌと４２
ｍＭのＮａ ２ＨＰＯ ４と１ｍＭのＭｇＳＯ ４と０．２％
のグルコースと０．０５％のカサミノ酸（ディフコ社）
と０．０１％の酵母エキスと５０μｇ／ｍｌのＬ−トリ
プトファンとよりなる培地の初期容量に懸濁させ、細胞
をＣ １４−アミノ酸混合物もしくは上記培地でラベル
し、ただし後者の培地はカサミノ酸および酵母エキスの
代りに５％メチオニン分析培地（ディフコ社）を使用し
て細胞をＳ ３５−メチオニンでラベルした。２８℃にお
ける培養を６０分間続けた。次いで培養物の半分を４２
℃に変化させた。誘発後の種々な時間において、２８℃
および４２℃培養物からの部分をＣ１４−アミノ酸混合
物またはＳ ３５−メチオニン（アメルシャム社）でラベ
ルした。
【０１０４】ラベルの組込みは、フェノール抽出により
停止させた。合成蛋白質を５容量のエタノールの添加に
よりフェノール層から沈澱させ、１％のＳＤＳと１％の
β−メルカプトエタノールと１０％のグリセリンと６
２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）とに再溶解
させた。試料を５分間煮沸し、１２０００ｘｇにて遠心
分離しそしてユー・ラエムリの方法〔「バクテリオファ
ージＴ４の頭部を組立てる際の構造蛋白質の開裂」、ネ
イチャー誌、第２２７巻、第６８０−６８２頁（１９７
０）〕によりＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（１０
〜１５％アクリルアミド）にて電気泳動にかけた。電気
泳動の後、ゲルをダブリュ・ボナーおよびアール・ラス
キーの方法〔「ポリアクリルアミドゲルにおけるトリチ
ウム標識した蛋白質および核酸の薄膜検出法」、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第４６巻、
第８３−８８頁（１９７４）〕により蛍光写真分析用に
調製し、ただしＰＰＯ−ＤＭＳＯの代りにＥＮ ３ＨＡＮ
ＣＥ（ＮＥＮ）を使用した。 ２．原核遺伝子 （ａ）β−ラクタマーゼ遺伝子 ｐＰＬａ２３（図３）は、Ｐ Ｌプロモータから下流に読
み取れる方向性でβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。し
たがって、β−ラクタマーゼ遺伝子によりコードされる
蛋白質の生産は、原核遺伝子を発現する際のベクタの効
率を示すものとして検定することができる。
停止させた。合成蛋白質を５容量のエタノールの添加に
よりフェノール層から沈澱させ、１％のＳＤＳと１％の
β−メルカプトエタノールと１０％のグリセリンと６
２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）とに再溶解
させた。試料を５分間煮沸し、１２０００ｘｇにて遠心
分離しそしてユー・ラエムリの方法〔「バクテリオファ
ージＴ４の頭部を組立てる際の構造蛋白質の開裂」、ネ
イチャー誌、第２２７巻、第６８０−６８２頁（１９７
０）〕によりＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（１０
〜１５％アクリルアミド）にて電気泳動にかけた。電気
泳動の後、ゲルをダブリュ・ボナーおよびアール・ラス
キーの方法〔「ポリアクリルアミドゲルにおけるトリチ
ウム標識した蛋白質および核酸の薄膜検出法」、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第４６巻、
第８３−８８頁（１９７４）〕により蛍光写真分析用に
調製し、ただしＰＰＯ−ＤＭＳＯの代りにＥＮ ３ＨＡＮ
ＣＥ（ＮＥＮ）を使用した。 ２．原核遺伝子 （ａ）β−ラクタマーゼ遺伝子 ｐＰＬａ２３（図３）は、Ｐ Ｌプロモータから下流に読
み取れる方向性でβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。し
たがって、β−ラクタマーゼ遺伝子によりコードされる
蛋白質の生産は、原核遺伝子を発現する際のベクタの効
率を示すものとして検定することができる。
【０１０５】ｐＰＬａ２３を有するＫ１２ΔＨＩまたは
Ｍ５２１９の形質転換種、すなわちイー・コリＫ１２Δ
ＨＩ（ｐＰＬａ２３）およびイー・コリＭ５２１９（ｐ
ＰＬａ２３）、を上記のように調製し、そしてその蛋白
質合成を検定した。その結果を図８に示す。ここで判る
ように、それぞれ２７．５Ｋおよび３０Ｋの見掛け分子
量を有する２種の蛋白質の合成速度における著しい増加
が、４２℃における形質転換種の誘発直後に起こった。
これら発現された蛋白質の大きさは、成熟β−ラクタマ
ーゼおよびその先駆体の予想長さと一致する〔ジェー・
サットクリフ、上記〕。さらに、これら蛋白質の誘発合
成はオーカラガン等の方法〔「染色体セファロスポリン
基質を使用するβ−ラクタマーゼの新規な検出方法」、
アンチミクロビアル・エージェント・アンド・ケモテラ
ピー、第１巻、第２８３−２８８頁（１９７２）〕によ
り決定されるβ−ラクタマーゼの酵素活性増加と平行し
ており、両蛋白質を抗−β−ラクタマーゼ血清により特
異的に沈澱させた。比較として、ベクタｐＰＬａ２３に
より形質転換されていない宿主における蛋白質合成を検
定した。これら非形質転換宿主からは、２種の上記蛋白
質のいずれの合成も観察されなかった。
Ｍ５２１９の形質転換種、すなわちイー・コリＫ１２Δ
ＨＩ（ｐＰＬａ２３）およびイー・コリＭ５２１９（ｐ
ＰＬａ２３）、を上記のように調製し、そしてその蛋白
質合成を検定した。その結果を図８に示す。ここで判る
ように、それぞれ２７．５Ｋおよび３０Ｋの見掛け分子
量を有する２種の蛋白質の合成速度における著しい増加
が、４２℃における形質転換種の誘発直後に起こった。
これら発現された蛋白質の大きさは、成熟β−ラクタマ
ーゼおよびその先駆体の予想長さと一致する〔ジェー・
サットクリフ、上記〕。さらに、これら蛋白質の誘発合
成はオーカラガン等の方法〔「染色体セファロスポリン
基質を使用するβ−ラクタマーゼの新規な検出方法」、
アンチミクロビアル・エージェント・アンド・ケモテラ
ピー、第１巻、第２８３−２８８頁（１９７２）〕によ
り決定されるβ−ラクタマーゼの酵素活性増加と平行し
ており、両蛋白質を抗−β−ラクタマーゼ血清により特
異的に沈澱させた。比較として、ベクタｐＰＬａ２３に
より形質転換されていない宿主における蛋白質合成を検
定した。これら非形質転換宿主からは、２種の上記蛋白
質のいずれの合成も観察されなかった。
【０１０６】図８に示されるように、これら形質転換種
における蛋白質合成の全体的パターンは２８℃および４
２℃において極めて類似する。しかしながら、いくつか
の蛋白質の合成速度は、細胞を４２℃に移行させること
により顕著に変化すると思われる。ｐＰＬａ２３により
形質転換されていない細胞においても同様な挙動が観察
された。さらに、図８に示されるように、２種のβ−ラ
クタマーゼ関連蛋白質における大きい方（すなわちβ−
ラクタマーゼに対する未処理先駆体）の相対的量は、誘
発後の時間と共に増大する。先駆体蛋白質の蓄積へのこ
の指向は、細胞のβ−ラクタマーゼ処理装置の飽和を示
すことがある。
における蛋白質合成の全体的パターンは２８℃および４
２℃において極めて類似する。しかしながら、いくつか
の蛋白質の合成速度は、細胞を４２℃に移行させること
により顕著に変化すると思われる。ｐＰＬａ２３により
形質転換されていない細胞においても同様な挙動が観察
された。さらに、図８に示されるように、２種のβ−ラ
クタマーゼ関連蛋白質における大きい方（すなわちβ−
ラクタマーゼに対する未処理先駆体）の相対的量は、誘
発後の時間と共に増大する。先駆体蛋白質の蓄積へのこ
の指向は、細胞のβ−ラクタマーゼ処理装置の飽和を示
すことがある。
【０１０７】形質転換種の全新規蛋白質合成に対比した
β−ラクタマーゼの合成割合を決定するため、β−ラク
タマーゼ（２７．５Ｋ）とその先駆体（３０Ｋ）とに対
する蛋白質帯域を乾燥ゲルから切除しそしてそれらの放
射能をゲルに施された全放射能と比較した。これらの結
果を表２に示す。
β−ラクタマーゼの合成割合を決定するため、β−ラク
タマーゼ（２７．５Ｋ）とその先駆体（３０Ｋ）とに対
する蛋白質帯域を乾燥ゲルから切除しそしてそれらの放
射能をゲルに施された全放射能と比較した。これらの結
果を表２に示す。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】表２に示したように、β−ラクタマーゼお
よびその先駆体の合成は、両宿主細胞菌株において全新
規蛋白質合成の約３０％という最高レベルに達する。し
かしながら、このレベルに達する速度は、２種の菌株に
ついて異なっている。すなわち、３０％レベルを達成す
るには、菌株Ｋ１２ΔＨＩは菌株Ｍ５２１９よりも約２
０分遅れる。如何なる理論にも拘束されるものでない
が、菌株Ｋ１２ΔＨＩの不存在下に菌株Ｍ５２１９の誘
発の際生産されるＮ遺伝子蛋白質は、Ｐ Ｌプロモータか
ら下方のＤＮＡ配列においてある種の転写遅延信号を打
ち破り、それにより菌株Ｍ５２１９におけるβ−ラクタ
マーゼ合成を早めることがあり得るであろう。
よびその先駆体の合成は、両宿主細胞菌株において全新
規蛋白質合成の約３０％という最高レベルに達する。し
かしながら、このレベルに達する速度は、２種の菌株に
ついて異なっている。すなわち、３０％レベルを達成す
るには、菌株Ｋ１２ΔＨＩは菌株Ｍ５２１９よりも約２
０分遅れる。如何なる理論にも拘束されるものでない
が、菌株Ｋ１２ΔＨＩの不存在下に菌株Ｍ５２１９の誘
発の際生産されるＮ遺伝子蛋白質は、Ｐ Ｌプロモータか
ら下方のＤＮＡ配列においてある種の転写遅延信号を打
ち破り、それにより菌株Ｍ５２１９におけるβ−ラクタ
マーゼ合成を早めることがあり得るであろう。
【０１１０】これら形質転換種における全蛋白質合成の
速度を決定するため、特定時間間隔で組込まれた全放射
能を測定し、これを０〜１０分間隔で組込まれたものと
比較した（すなわち、初期間隔は、比較用として任意に
１００％として選択した）。その結果を表３に示す。
速度を決定するため、特定時間間隔で組込まれた全放射
能を測定し、これを０〜１０分間隔で組込まれたものと
比較した（すなわち、初期間隔は、比較用として任意に
１００％として選択した）。その結果を表３に示す。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】表３に示したように、イー・コリＭ５２１
９（ｐＰＬａ２３）における全蛋白質合成は、誘発後に
急速に遅延した。これは、Ｍ５２１９形質転換種が４２
℃にて生存し得ないという先の観察と一致する。イー・
コリＭ５２１９（ｐＢＲ３２２）においては、蛋白質合
成の同様な抑制は観察されない。イー・コリＫ１２ΔＨ
Ｉ（ｐＰＬａ２３）においては４２℃での長期培養後
に、全蛋白質合成の相当な低下が観察される。しかしな
がら、これら細胞は温度４２℃において生存することが
できる。
９（ｐＰＬａ２３）における全蛋白質合成は、誘発後に
急速に遅延した。これは、Ｍ５２１９形質転換種が４２
℃にて生存し得ないという先の観察と一致する。イー・
コリＭ５２１９（ｐＢＲ３２２）においては、蛋白質合
成の同様な抑制は観察されない。イー・コリＫ１２ΔＨ
Ｉ（ｐＰＬａ２３）においては４２℃での長期培養後
に、全蛋白質合成の相当な低下が観察される。しかしな
がら、これら細胞は温度４２℃において生存することが
できる。
【０１１３】（ｂ）トリプトファンシンセターゼＡ遺伝
子 （ｉ）ｐＰＬａ２３ サルモネラ・トリフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｔｒｐＡシストロンを
含有するＥｃｏＲＩ断片（５３００ｂ．ｐ．）をｐＥＳ
９から得〔イー・セルカー等、「プラスミドＣｏｌＥｌ
中に挿入されたサルモネラ・トリフィムリウムのｔｒｐ
ＡのマイトマイシンＣ誘発された発現」、ジャーナル・
バクテリオロジー、第１２９巻、第３８８−３９４頁
（１９７７）〕、これをｐＰＬａ２３のＥｃｏＲＩ部位
に挿入した。Ｐ Ｌプロモータの方向に対し２つの可能な
方向性のいずれかで挿入されたこの断片を有する２種の
代表的プラスミドをｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １およびｐＰ
Ｌａ２３ｔｒｐＡ ２と名付けた。
子 （ｉ）ｐＰＬａ２３ サルモネラ・トリフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｔｒｐＡシストロンを
含有するＥｃｏＲＩ断片（５３００ｂ．ｐ．）をｐＥＳ
９から得〔イー・セルカー等、「プラスミドＣｏｌＥｌ
中に挿入されたサルモネラ・トリフィムリウムのｔｒｐ
ＡのマイトマイシンＣ誘発された発現」、ジャーナル・
バクテリオロジー、第１２９巻、第３８８−３９４頁
（１９７７）〕、これをｐＰＬａ２３のＥｃｏＲＩ部位
に挿入した。Ｐ Ｌプロモータの方向に対し２つの可能な
方向性のいずれかで挿入されたこの断片を有する２種の
代表的プラスミドをｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １およびｐＰ
Ｌａ２３ｔｒｐＡ ２と名付けた。
【０１１４】ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １またはｐＰＬａ２
３ｔｒｐＡ ２のいずれかを含有する菌株Ｋ１２ΔＨＩの
誘発状況を図９に示す。約２５０００ダルトンの主要部
分はｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １により誘発されたが、ｐＰ
Ｌａ２３ｔｒｐＡ ２を含有する誘発細胞には存在しなか
った。この蛋白質の観測された分子量はサルモネラ・ト
リフィムリウムｔｒｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列から
予測された理論値（２８５００）と一致した〔ビー・ニ
コルスおよびシー・ヤノフスキイ、「サルモネラ・トリ
フィムリウムおよび大腸菌のｔｒｐＡのヌクレオチド配
列：発生比較」、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第５２４４−
５２４８頁（１９７９）〕。さらに酵素活性は、オー・
スミスおよびシー・ヤノフスキイの手法〔（トリプトフ
ァンの生合成に関与する酵素」、メソッド・イン・エン
ザイモロジー、第５巻、第７９４−８０６頁（１９６
２）〕により決定されるｔｒｐＡ遺伝子生産物の存在と
一致し、この誘発蛋白質の蓄積と平行して増大した。
３ｔｒｐＡ ２のいずれかを含有する菌株Ｋ１２ΔＨＩの
誘発状況を図９に示す。約２５０００ダルトンの主要部
分はｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １により誘発されたが、ｐＰ
Ｌａ２３ｔｒｐＡ ２を含有する誘発細胞には存在しなか
った。この蛋白質の観測された分子量はサルモネラ・ト
リフィムリウムｔｒｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列から
予測された理論値（２８５００）と一致した〔ビー・ニ
コルスおよびシー・ヤノフスキイ、「サルモネラ・トリ
フィムリウムおよび大腸菌のｔｒｐＡのヌクレオチド配
列：発生比較」、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第５２４４−
５２４８頁（１９７９）〕。さらに酵素活性は、オー・
スミスおよびシー・ヤノフスキイの手法〔（トリプトフ
ァンの生合成に関与する酵素」、メソッド・イン・エン
ザイモロジー、第５巻、第７９４−８０６頁（１９６
２）〕により決定されるｔｒｐＡ遺伝子生産物の存在と
一致し、この誘発蛋白質の蓄積と平行して増大した。
【０１１５】ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １とｐＰＬａ２３ｔ
ｒｐＡ ２との両者の長期誘発の後、約１８Ｋの分子量を
有する蛋白質が合成される（図９）。形質転換種の全新
規蛋白質合成に比較したこの蛋白質の合成割合は、Ｐ Ｌ
プロモータからの転写方向に対するＥｃｏＲＩ ｔｒｐ
Ａ断片の方向性とは無関係である。したがって、おそら
くこの蛋白質の合成は、ｔｒｐＡについて必要とされる
よりずっと大きなコード能力を備えた５３００塩基対Ｅ
ｃｏＲＩ ｔｒｐＡ断片に存在するやや温度依存性の細
菌プロモータにより制御されるであろう（イー・セルカ
ー、上記）。
ｒｐＡ ２との両者の長期誘発の後、約１８Ｋの分子量を
有する蛋白質が合成される（図９）。形質転換種の全新
規蛋白質合成に比較したこの蛋白質の合成割合は、Ｐ Ｌ
プロモータからの転写方向に対するＥｃｏＲＩ ｔｒｐ
Ａ断片の方向性とは無関係である。したがって、おそら
くこの蛋白質の合成は、ｔｒｐＡについて必要とされる
よりずっと大きなコード能力を備えた５３００塩基対Ｅ
ｃｏＲＩ ｔｒｐＡ断片に存在するやや温度依存性の細
菌プロモータにより制御されるであろう（イー・セルカ
ー、上記）。
【０１１６】形質転換種における全新規蛋白質合成に比
較したｔｒｐＡの合成割合は、β−ラクタマーゼにつき
前記したものとほぼ同様に決定した。その結果を表４に
示す。ここでも、ｔｒｐＡ合成は全新規合成の約３０％
という最高レベルに達した。
較したｔｒｐＡの合成割合は、β−ラクタマーゼにつき
前記したものとほぼ同様に決定した。その結果を表４に
示す。ここでも、ｔｒｐＡ合成は全新規合成の約３０％
という最高レベルに達した。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】（ｉｉ）ｐＰＬａ２３１１ ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １に同一であり、ｐＰＬａ２３１
１に基づく組替えＤＮＡ分子を前記したとほぼ同様に調
製した。ｐＰＬａ２３１１ｔｒｐＡ １を有するＫ１２Δ
ＨＩ形質転換種は、ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １のそれと同
様に挙動した（ただし、この実験において全新規合成の
最大レベルは１５０分後に僅か２０％であった）。ここ
でも、長期誘発は全蛋白質合成における正味の低下をも
たらした。
１に基づく組替えＤＮＡ分子を前記したとほぼ同様に調
製した。ｐＰＬａ２３１１ｔｒｐＡ １を有するＫ１２Δ
ＨＩ形質転換種は、ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １のそれと同
様に挙動した（ただし、この実験において全新規合成の
最大レベルは１５０分後に僅か２０％であった）。ここ
でも、長期誘発は全蛋白質合成における正味の低下をも
たらした。
【０１１９】（ｉｉｉ）ｐＰＬｃ２３ ｐＥＳ９のＥｃｏＲＩ断片はｔｒｐＢ遺伝子内に位置す
る１つの末端部を有し、ＥｃｏＲＩ部位から約２５００
塩基対のところに単一のＳａｌＩ部位を含有する（イー
・セルカー等、上記）。ｔｒｐＡ遺伝子はＳａｌＩ部位
を含有しないので（ビー・ニコルスおよびシー・ヤノフ
スキイ、上記）ｔｒｐＡ遺伝子は第一ＥｃｏＲＩ部位か
らＳａｌＩ部位まで延在するｐＥＳ９のＥｃｏＲＩ断片
の部分に完全に位置せねばならない。したがって、ｐＥ
Ｓ９の前記で調製したＥｃｏＲＩ断片をＳａｌＩで消化
し、得られた断片をそこのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片に
対する代替としてｐＰＬｃ２３中に挿入した（図４）。
ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １およびｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ ２
におけるｔｒｐＡ遺伝子の翻訳における観察方向に基づ
いて、Ｐ Ｌプロモータからの転写と平行してｔｒｐＡ遺
伝子を有するｐＰＬｃ２３に基づく組替えＤＮＡ分子を
ｐＰＬｃ２３ｔｒｐＡ １と名付けた。
る１つの末端部を有し、ＥｃｏＲＩ部位から約２５００
塩基対のところに単一のＳａｌＩ部位を含有する（イー
・セルカー等、上記）。ｔｒｐＡ遺伝子はＳａｌＩ部位
を含有しないので（ビー・ニコルスおよびシー・ヤノフ
スキイ、上記）ｔｒｐＡ遺伝子は第一ＥｃｏＲＩ部位か
らＳａｌＩ部位まで延在するｐＥＳ９のＥｃｏＲＩ断片
の部分に完全に位置せねばならない。したがって、ｐＥ
Ｓ９の前記で調製したＥｃｏＲＩ断片をＳａｌＩで消化
し、得られた断片をそこのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片に
対する代替としてｐＰＬｃ２３中に挿入した（図４）。
ｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ １およびｐＰＬａ２３ｔｒｐＡ ２
におけるｔｒｐＡ遺伝子の翻訳における観察方向に基づ
いて、Ｐ Ｌプロモータからの転写と平行してｔｒｐＡ遺
伝子を有するｐＰＬｃ２３に基づく組替えＤＮＡ分子を
ｐＰＬｃ２３ｔｒｐＡ １と名付けた。
【０１２０】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２３ｔ
ｒｐＡ １）の誘発（４２℃）の際、ｔｒｐＡは３時間の
誘発後に全新規蛋白質合成の約４０％という最高レベル
まで合成された。さらに、この高レベルの新規合成は２
時間にわたり維持された（図１０）。これらの結果を表
５に示す（下記）。したがって、ｐＰＬａ型ベクタの挙
動に対比し、ｐＰＬｃ型形質転換種の蛋白質合成は、誘
発後５時間まで低下しない。
ｒｐＡ １）の誘発（４２℃）の際、ｔｒｐＡは３時間の
誘発後に全新規蛋白質合成の約４０％という最高レベル
まで合成された。さらに、この高レベルの新規合成は２
時間にわたり維持された（図１０）。これらの結果を表
５に示す（下記）。したがって、ｐＰＬａ型ベクタの挙
動に対比し、ｐＰＬｃ型形質転換種の蛋白質合成は、誘
発後５時間まで低下しない。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】上記形質転換種中に蓄積する誘発蛋白質の
実際の量をも、誘発細胞の連続ラベリングによって測定
した。イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２３ｔｒｐＡ
１）をＬＢ培地で２８℃にて１×１０ ７細胞／ｍｌの密
度まで増殖させた。次いで、細胞を１０μＣｉのＣ １４
−アミノ酸混合物でラベルした。４×１０ ７細胞／ｍｌ
の培養密度にて、細胞を４２℃に変化させ、培養を続け
た。培養物が飽和に達した後（誘発６時間後）、蛋白質
を細胞から抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ｔｒｐＡ帯域中に組込まれた放射能の割合
を測定した。使用条件下において、細胞は均一にラベル
され、したがって蛋白質中に組込まれた放射能は細胞中
に存在するその蛋白質の実際の量を反映すると推定でき
る。ｔｒｐＡ蛋白質は全細胞蛋白質の１０％になること
が判明した。
実際の量をも、誘発細胞の連続ラベリングによって測定
した。イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２３ｔｒｐＡ
１）をＬＢ培地で２８℃にて１×１０ ７細胞／ｍｌの密
度まで増殖させた。次いで、細胞を１０μＣｉのＣ １４
−アミノ酸混合物でラベルした。４×１０ ７細胞／ｍｌ
の培養密度にて、細胞を４２℃に変化させ、培養を続け
た。培養物が飽和に達した後（誘発６時間後）、蛋白質
を細胞から抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。ｔｒｐＡ帯域中に組込まれた放射能の割合
を測定した。使用条件下において、細胞は均一にラベル
され、したがって蛋白質中に組込まれた放射能は細胞中
に存在するその蛋白質の実際の量を反映すると推定でき
る。ｔｒｐＡ蛋白質は全細胞蛋白質の１０％になること
が判明した。
【０１２３】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２３ｔ
ｒｐＡ １）の全細胞蛋白質におけるｔｒｐＡのこの１０
％という濃度は、エッチ・バーナード等（上記）のベク
タを含有するλＰ Ｌと本発明のものとの間における重要
な相違を示すにも役立つ。本発明のベクタにより与えら
れる１０％という実際のｔｒｐＡ濃度に対比し、エッチ
・バーナード等はｔｒｐＡの僅か６．６％濃度を報告し
ている〔これは、ｔｒｐＡ酵素活性と蛋白質の推定比活
性とに基づいて推定される〕。さらに、エッチ・バーナ
ード等により報告された６．６％というｔｒｐＡ濃度
は、活性Ｎ遺伝子をも含むベクタにより観察され、した
がって恐らく転写が抗−終止性Ｎ遺伝子産物の存在下で
行われたことに注目すべきである。活性Ｎ遺伝子を持た
ないベクタについては、僅か２％のｔｒｐＡ濃度がエッ
チ・バーナード等により報告された。これに対し、本発
明の改良ベクタにより観察された１０％ｔｒｐＡ濃度
は、Ｎ遺伝子産物の不存在下に得られた。したがって、
本発明のベクタおよび方法は、従来記載されたようなベ
クタおよび方法に比べ、顕著な改良を構成する。
ｒｐＡ １）の全細胞蛋白質におけるｔｒｐＡのこの１０
％という濃度は、エッチ・バーナード等（上記）のベク
タを含有するλＰ Ｌと本発明のものとの間における重要
な相違を示すにも役立つ。本発明のベクタにより与えら
れる１０％という実際のｔｒｐＡ濃度に対比し、エッチ
・バーナード等はｔｒｐＡの僅か６．６％濃度を報告し
ている〔これは、ｔｒｐＡ酵素活性と蛋白質の推定比活
性とに基づいて推定される〕。さらに、エッチ・バーナ
ード等により報告された６．６％というｔｒｐＡ濃度
は、活性Ｎ遺伝子をも含むベクタにより観察され、した
がって恐らく転写が抗−終止性Ｎ遺伝子産物の存在下で
行われたことに注目すべきである。活性Ｎ遺伝子を持た
ないベクタについては、僅か２％のｔｒｐＡ濃度がエッ
チ・バーナード等により報告された。これに対し、本発
明の改良ベクタにより観察された１０％ｔｒｐＡ濃度
は、Ｎ遺伝子産物の不存在下に得られた。したがって、
本発明のベクタおよび方法は、従来記載されたようなベ
クタおよび方法に比べ、顕著な改良を構成する。
【０１２４】（ｃ）バクテリオファージＭＳ２レプリカ
ーゼ蛋白質遺伝子 プラスミドｐＭＳ２−７は、ＲＮＡバクテリオファージ
ＭＳ２のゲノムのほぼ完全な大きさのコピーを含有する
〔アール・デボス等、上記〕。ファージレプリカーゼ遺
伝子（Ｒ）はＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片内に含有され
る。この断片を、このベクタのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断
片の単純交換によりｐＰＬａ２３１１中に挿入した。ア
ンピシリン耐性に関する遺伝子はｐＰＬａ２３１１Ｒ １
においてもはや完全でないため、形質転換種イー・コリ
Ｋ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１１Ｒ１）をカルベニシリ
ン感受性につき選別した。挿入断片の本質を、アガロー
スゲル上においてｐＭＳ２−７ＤＮＡからの既知断片と
共に電気泳動にかけて確認した。ｐＰＬａ２３１１Ｒ １
において、ＭＳ２レプリカーゼ蛋白質の転写はＰ Ｌプロ
モータからの転写と平行する。
ーゼ蛋白質遺伝子 プラスミドｐＭＳ２−７は、ＲＮＡバクテリオファージ
ＭＳ２のゲノムのほぼ完全な大きさのコピーを含有する
〔アール・デボス等、上記〕。ファージレプリカーゼ遺
伝子（Ｒ）はＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片内に含有され
る。この断片を、このベクタのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断
片の単純交換によりｐＰＬａ２３１１中に挿入した。ア
ンピシリン耐性に関する遺伝子はｐＰＬａ２３１１Ｒ １
においてもはや完全でないため、形質転換種イー・コリ
Ｋ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１１Ｒ１）をカルベニシリ
ン感受性につき選別した。挿入断片の本質を、アガロー
スゲル上においてｐＭＳ２−７ＤＮＡからの既知断片と
共に電気泳動にかけて確認した。ｐＰＬａ２３１１Ｒ １
において、ＭＳ２レプリカーゼ蛋白質の転写はＰ Ｌプロ
モータからの転写と平行する。
【０１２５】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１
１Ｒ １）の誘発細胞は、約５９Ｋの見掛け分子量を有す
る蛋白質を合成する（図１１）。この蛋白質の大きさ
は、ウイルスＲＮＡの配列データからＭＳ２レプリカー
ゼにつき計算された６０６９２ダルトンの分子量と一致
する〔ダブリュ・ファイエル等、「バクテリオファージ
ＭＳ２ＲＮＡの完全ヌクレオチド配列：レプリカーゼ遺
伝子の一次および二次構造」、ネイチャー誌、第２６０
巻、第５００−５０７頁（１９７６）〕。
１Ｒ １）の誘発細胞は、約５９Ｋの見掛け分子量を有す
る蛋白質を合成する（図１１）。この蛋白質の大きさ
は、ウイルスＲＮＡの配列データからＭＳ２レプリカー
ゼにつき計算された６０６９２ダルトンの分子量と一致
する〔ダブリュ・ファイエル等、「バクテリオファージ
ＭＳ２ＲＮＡの完全ヌクレオチド配列：レプリカーゼ遺
伝子の一次および二次構造」、ネイチャー誌、第２６０
巻、第５００−５０７頁（１９７６）〕。
【０１２６】ｐＰＬａ２３１１Ｒ １で形質転換された細
胞の蛋白質産物における機能的ＭＳ２レプリカーゼ蛋白
質の存在は、同様にＭＳ２アンバー突然変異体について
の相補分析により証明された。この分析により、ｐＰＬ
ａ２３１１Ｒ １で形質転換された細胞はレプリカーゼ遺
伝子中に障害を有するＭＳ２突然変異体の産物と特異的
に相補する産物を生成し、ｐＰＬａ２３１１Ｒ １で形質
転換されていない細胞はこの種の突然変異体の産物を相
補しなかったことが確認された。
胞の蛋白質産物における機能的ＭＳ２レプリカーゼ蛋白
質の存在は、同様にＭＳ２アンバー突然変異体について
の相補分析により証明された。この分析により、ｐＰＬ
ａ２３１１Ｒ １で形質転換された細胞はレプリカーゼ遺
伝子中に障害を有するＭＳ２突然変異体の産物と特異的
に相補する産物を生成し、ｐＰＬａ２３１１Ｒ １で形質
転換されていない細胞はこの種の突然変異体の産物を相
補しなかったことが確認された。
【０１２７】ＭＳ２レプリカーゼ蛋白質合成に関し、イ
ー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１１Ｒ １）とイー
・コリＭ５２１９（ｐＰＬａ２３１１Ｒ １）との両者は
同様に挙動した（すなわち、３０分間の誘発後、ＭＳ２
レプリカーゼの合成割合は全新規蛋白質合成の２９％で
あり、蛋白質合成のレベルは、さらに誘発すると急速に
低下した）（図１１）。合成におけるこのような低下
は、β−ラクタマーゼまたはｔｒｐＡの合成においては
観察されなかったので、この低下はＭＳ２レプリカーゼ
の特殊な性質により惹起されるのであろう。たとえば、
ファージレプリカーゼがシストロンの中央近傍の部位に
おいてそれ自身のｍＲＮＡに結合するという観察された
傾向〔マイヤー等、「ＱβＲＮＡの結合部位」、エキス
ペリエンタ、第３１巻、第１４３頁以降（１９７５）〕
は、複雑ｍＲＮＡがさらに翻訳されるのを阻害するであ
ろう。
ー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１１Ｒ １）とイー
・コリＭ５２１９（ｐＰＬａ２３１１Ｒ １）との両者は
同様に挙動した（すなわち、３０分間の誘発後、ＭＳ２
レプリカーゼの合成割合は全新規蛋白質合成の２９％で
あり、蛋白質合成のレベルは、さらに誘発すると急速に
低下した）（図１１）。合成におけるこのような低下
は、β−ラクタマーゼまたはｔｒｐＡの合成においては
観察されなかったので、この低下はＭＳ２レプリカーゼ
の特殊な性質により惹起されるのであろう。たとえば、
ファージレプリカーゼがシストロンの中央近傍の部位に
おいてそれ自身のｍＲＮＡに結合するという観察された
傾向〔マイヤー等、「ＱβＲＮＡの結合部位」、エキス
ペリエンタ、第３１巻、第１４３頁以降（１９７５）〕
は、複雑ｍＲＮＡがさらに翻訳されるのを阻害するであ
ろう。
【０１２８】３．真核遺伝子 （ａ）猿ウイルス４０遺伝子の小−ｔ抗原 ＳＶ４０小−ｔ抗原に関する全コード配列を含むＨｉｎ
ｄＩＩＩＤＮＡ断片〔ジー・ボルケルト等、「猿ウイル
ス４０小−ｔ遺伝子のヌクレオチド配列」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７５巻、第２１６０−２１６４頁（１９７８）〕
をｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（図１
２）。挿入物の方向性を、不対称配置ＴａｇＩ部位の存
在に基づく制限分析により決定した。このハイブリッド
ＤＮＡ分子から、上記ＨｉｎｄＩＩＩ断片とｐＢＲ３２
２の部分とを含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を切除
し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に対する代替物として
ｐＰＬｃ２８中に挿入し、その小−ｔ抗原の翻訳の方向
性をＰ Ｌプロモータからの転写と平行にした（図１
２）。得られた組替えＤＮＡ分子をｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ
５と名付けた。
ｄＩＩＩＤＮＡ断片〔ジー・ボルケルト等、「猿ウイル
ス４０小−ｔ遺伝子のヌクレオチド配列」、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第７５巻、第２１６０−２１６４頁（１９７８）〕
をｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（図１
２）。挿入物の方向性を、不対称配置ＴａｇＩ部位の存
在に基づく制限分析により決定した。このハイブリッド
ＤＮＡ分子から、上記ＨｉｎｄＩＩＩ断片とｐＢＲ３２
２の部分とを含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を切除
し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に対する代替物として
ｐＰＬｃ２８中に挿入し、その小−ｔ抗原の翻訳の方向
性をＰ Ｌプロモータからの転写と平行にした（図１
２）。得られた組替えＤＮＡ分子をｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ
５と名付けた。
【０１２９】Ｐ Ｌプロモータと小−ｔ抗原をコードする
遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）との間の間隔を短縮させ
るため、ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５を改変させて、遺伝子と
Ｐ Ｌプロモータとの間のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を除去した。この操作を図１２および図１３に示す。
これは、ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５をＣｌａＩで開裂させ、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３′エキソヌクレアーゼ活性
を使用してそれぞれＧＴＰおよびＴＴＰの存在下に２つ
の別々の過程においてＤＮＡの３′末端を減成し、Ｓ１
ヌクレアーゼによってさらに処理し、ＥｃｏＲＩリンカ
を平滑末端部に付加し、この断片をＥｃｏＲＩで開裂さ
せそして相補的末端部を連結することからなっている。
遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）との間の間隔を短縮させ
るため、ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５を改変させて、遺伝子と
Ｐ Ｌプロモータとの間のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片を除去した。この操作を図１２および図１３に示す。
これは、ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５をＣｌａＩで開裂させ、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３′エキソヌクレアーゼ活性
を使用してそれぞれＧＴＰおよびＴＴＰの存在下に２つ
の別々の過程においてＤＮＡの３′末端を減成し、Ｓ１
ヌクレアーゼによってさらに処理し、ＥｃｏＲＩリンカ
を平滑末端部に付加し、この断片をＥｃｏＲＩで開裂さ
せそして相補的末端部を連結することからなっている。
【０１３０】これら改変ハイブリッドＤＮＡ分子による
イー・コリＫ１２ΔＨＩの形質転換と誘発とは、１４Ｋ
の見掛け分子量を有するかなり多量の蛋白質の発現を与
えた（図１４）。この蛋白質は誘発なしには生産され
ず、ＳＶ４０ＤＮＡを含むベクタにより形質転換されて
いない宿主細胞では生産されなかった。
イー・コリＫ１２ΔＨＩの形質転換と誘発とは、１４Ｋ
の見掛け分子量を有するかなり多量の蛋白質の発現を与
えた（図１４）。この蛋白質は誘発なしには生産され
ず、ＳＶ４０ＤＮＡを含むベクタにより形質転換されて
いない宿主細胞では生産されなかった。
【０１３１】標準小−ｔ抗原は１９Ｋの分子量を有し、
これら形質転換細胞で生産された蛋白質はＳＶ４０の大
−Ｔ抗原に対し発生する抗体によって極く僅かしか沈澱
しなかったが、この蛋白質および標準小−ｔ抗原から誘
導されたトリプチック（ｔｒｙｐｔｉｃ）ペプチドの二
次元フィンガプリント〔ｐＨ３．５における電気泳動、
および次いでブタノール／酢酸／ピリジン／水（１５：
３：１０：１２）におけるクロマトグラフィー〕は、２
者が関連していることを確認した。如何なる理論にも拘
束されるものではないが、Ｐ Ｌプロモータから出発する
ｍＲＮＡの二次構造は小−ｔ抗原の内部開始コドンにお
ける開始が真正開始シグナルにおける開始よりも好まし
いようなものであるといえる。この仮説は、ディー・イ
セレンタントおよびダブリュ・フアイエル、の手法
〔「ｍＲＮＡの二次構造および翻訳開始の効率」、ジー
ン誌、第９巻、第１−１２頁（１９８０）〕を用いて、
これらＳＶ ｔ含有ベクタのいくつかにおけるヌクレオチ
ド配列から得られる二次構造とも一致する。
これら形質転換細胞で生産された蛋白質はＳＶ４０の大
−Ｔ抗原に対し発生する抗体によって極く僅かしか沈澱
しなかったが、この蛋白質および標準小−ｔ抗原から誘
導されたトリプチック（ｔｒｙｐｔｉｃ）ペプチドの二
次元フィンガプリント〔ｐＨ３．５における電気泳動、
および次いでブタノール／酢酸／ピリジン／水（１５：
３：１０：１２）におけるクロマトグラフィー〕は、２
者が関連していることを確認した。如何なる理論にも拘
束されるものではないが、Ｐ Ｌプロモータから出発する
ｍＲＮＡの二次構造は小−ｔ抗原の内部開始コドンにお
ける開始が真正開始シグナルにおける開始よりも好まし
いようなものであるといえる。この仮説は、ディー・イ
セレンタントおよびダブリュ・フアイエル、の手法
〔「ｍＲＮＡの二次構造および翻訳開始の効率」、ジー
ン誌、第９巻、第１−１２頁（１９８０）〕を用いて、
これらＳＶ ｔ含有ベクタのいくつかにおけるヌクレオチ
ド配列から得られる二次構造とも一致する。
【０１３２】上記のように調製した改変ｐＰＬｃ２８Ｓ
Ｖ ｔ５組替えＤＮＡ分子の１つは、主として１４Ｋ蛋白
質成分の他に、少量の１７Ｋ成分をも発現した。この分
子をｐＰＬｃＳＶ ｔ５−３７と名付けた。１７Ｋ蛋白質
の存在は大−Ｔ抗血清での特異的免疫沈澱によってのみ
初めて検出できたが、この分子をさらに改変させると１
７Ｋ成分の向上した合成が可能となった。この改変は、
ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７をＥｃｏＲＩで開裂させ、
旧３′末端をＤＮＡポリメラーゼＩで伸長させ〔ケー・
ベックマン等、上記〕そして平滑末端部を再連結させる
ことからなり、ｍＲＮＡの二次構造を変化させることが
できた。ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７−９により形質転
換された宿主は、誘発の際全新規蛋白質合成の約４０％
を１７Ｋ蛋白質成分として与えた。これらの結果を図１
４に示す。図１４の系統ｃで示すように、１７Ｋ成分
は、ＳＶ４０感染したアフリカ緑猿腎臓細胞で増殖した
標準小−ｔ抗原とほぼ同じ程度に、ＳＶ４０−腫瘍ハム
スターから血清により免疫沈澱された。
Ｖ ｔ５組替えＤＮＡ分子の１つは、主として１４Ｋ蛋白
質成分の他に、少量の１７Ｋ成分をも発現した。この分
子をｐＰＬｃＳＶ ｔ５−３７と名付けた。１７Ｋ蛋白質
の存在は大−Ｔ抗血清での特異的免疫沈澱によってのみ
初めて検出できたが、この分子をさらに改変させると１
７Ｋ成分の向上した合成が可能となった。この改変は、
ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７をＥｃｏＲＩで開裂させ、
旧３′末端をＤＮＡポリメラーゼＩで伸長させ〔ケー・
ベックマン等、上記〕そして平滑末端部を再連結させる
ことからなり、ｍＲＮＡの二次構造を変化させることが
できた。ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７−９により形質転
換された宿主は、誘発の際全新規蛋白質合成の約４０％
を１７Ｋ蛋白質成分として与えた。これらの結果を図１
４に示す。図１４の系統ｃで示すように、１７Ｋ成分
は、ＳＶ４０感染したアフリカ緑猿腎臓細胞で増殖した
標準小−ｔ抗原とほぼ同じ程度に、ＳＶ４０−腫瘍ハム
スターから血清により免疫沈澱された。
【０１３３】（ｂ）ヒト繊維芽細胞インターフェロン
（ＨＦＩＦ）遺伝子 １９８０年６月６日付出願の英国特許出願第８０．１８
７０１号明細書に記載されているように、ヒト繊維芽細
胞インターフェロンをコードする遺伝子をベクタｐＰＬ
ａ８およびｐＰＬｃ２４に挿入して組替えＤＮＡ分子を
生成させ、これらは形質転換宿主において適当な誘発の
後に標準ヒト繊維芽細胞インターフェロンに酷似した抗
ウイルス的、物理−化学的、免疫的かつ生物学的活性を
有する蛋白質を発現することができる。
（ＨＦＩＦ）遺伝子 １９８０年６月６日付出願の英国特許出願第８０．１８
７０１号明細書に記載されているように、ヒト繊維芽細
胞インターフェロンをコードする遺伝子をベクタｐＰＬ
ａ８およびｐＰＬｃ２４に挿入して組替えＤＮＡ分子を
生成させ、これらは形質転換宿主において適当な誘発の
後に標準ヒト繊維芽細胞インターフェロンに酷似した抗
ウイルス的、物理−化学的、免疫的かつ生物学的活性を
有する蛋白質を発現することができる。
【０１３４】１．プラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−
６７−１の構築 プラスミドＧ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−６
をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより切断し次いでこれを、Ｐ
ｓｔＩとＰｖｕＩにより切断されたプラスミドＧ−ｐＢ
Ｒ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−７に結合した。結合に
続いて、混合物をＥｃｏＲＩとＨａｅＩＩにより消化し
た。次いでこの混合物の４倍モル過剰を、ＨａｅＩＩと
ＥｃｏＲＩにより消化したプラスミドＧ−ｐＰＬａ２３
１１に結合した。このプラスミドは、独自のＥｃｏＲＩ
部位と独自のＰｓｔＩ部位を含んでいた。混合したＥｃ
ｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化は、２つの断片を生成し−−この
より小形断片は、Ｇ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩ
Ｆ−６のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断の後得られた断片と
共に共移動した。ＢｇｌＩＩ消化は、約６５０塩基対の
小形断片に切断した。より後期断片の大きさは、クロー
ンＧ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−６の近位Ｂ
ｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片を、Ｇ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／ＨＦＩＦ−７の遠位ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ部位へ
結合した後に、期待の大きさに一致している。Ｈｉｎｃ
ＩＩ消化は、Ｐ Ｌ領域中のＨｉｎｃＩＩ部位、β−ラク
タマーゼ遺伝子のアミノ末端部位、およびＨｕＩＦＮ−
βのＤＮＡ配列の翻訳しない５′末端の存在から期待さ
れる通り、３つの断片を生成した。このプラスミドは、
Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２と命名された。
６７−１の構築 プラスミドＧ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−６
をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより切断し次いでこれを、Ｐ
ｓｔＩとＰｖｕＩにより切断されたプラスミドＧ−ｐＢ
Ｒ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−７に結合した。結合に
続いて、混合物をＥｃｏＲＩとＨａｅＩＩにより消化し
た。次いでこの混合物の４倍モル過剰を、ＨａｅＩＩと
ＥｃｏＲＩにより消化したプラスミドＧ−ｐＰＬａ２３
１１に結合した。このプラスミドは、独自のＥｃｏＲＩ
部位と独自のＰｓｔＩ部位を含んでいた。混合したＥｃ
ｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化は、２つの断片を生成し−−この
より小形断片は、Ｇ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩ
Ｆ−６のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断の後得られた断片と
共に共移動した。ＢｇｌＩＩ消化は、約６５０塩基対の
小形断片に切断した。より後期断片の大きさは、クロー
ンＧ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＦＩＦ−６の近位Ｂ
ｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片を、Ｇ−ｐＢＲ３２２（Ｐｓ
ｔ）／ＨＦＩＦ−７の遠位ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ部位へ
結合した後に、期待の大きさに一致している。Ｈｉｎｃ
ＩＩ消化は、Ｐ Ｌ領域中のＨｉｎｃＩＩ部位、β−ラク
タマーゼ遺伝子のアミノ末端部位、およびＨｕＩＦＮ−
βのＤＮＡ配列の翻訳しない５′末端の存在から期待さ
れる通り、３つの断片を生成した。このプラスミドは、
Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２と命名された。
【０１３５】２．プラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−
６７−１２の構築 構成における次の工程は、Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６
７−１から、ポリ（Ａ．Ｔ）尾部および逆方向３′末端
断片の部分を除去に向けられた。Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩ
Ｆ−６７−１ＤＮＡを、ＢｇｌＩＩとＨｐａＩＩにより
切断した。得られたＢｇｌＩＩ断片を、ＢａｍＨＩによ
り消化されたプラスミドＧ−ｐＰＬａＢへ結合した。酵
素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩは、同じ千鳥配列の末端を、
ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩの末端が解放されたＢａｍＨＩ
部位へ結合され得るようにし、逆もまた同じである。こ
のような再構築された部位は、もはやＢｇｌＩＩまたは
ＢａｍＨＩに対する基質でなくて、酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（ＭｂｏＩ）により認識される〔Ｖ．ピロッタ、「バシ
ラス−グロビギルからの２つの制限酵素」、核酸研究
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第３巻、第
１７４７−１７６０頁（１９７６）〕。連結反応に続い
て、この混合物を再びＢａｍＨＩにより切断して、簡単
に再環化したＧ−ｐＰＬａＢ分子を除去した。形質転換
体を、カナマイシン抵抗性を選択するＣ６００ｒ Ｋｍ Ｋ
＋（λ）中に得た。
６７−１２の構築 構成における次の工程は、Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６
７−１から、ポリ（Ａ．Ｔ）尾部および逆方向３′末端
断片の部分を除去に向けられた。Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩ
Ｆ−６７−１ＤＮＡを、ＢｇｌＩＩとＨｐａＩＩにより
切断した。得られたＢｇｌＩＩ断片を、ＢａｍＨＩによ
り消化されたプラスミドＧ−ｐＰＬａＢへ結合した。酵
素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩは、同じ千鳥配列の末端を、
ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩの末端が解放されたＢａｍＨＩ
部位へ結合され得るようにし、逆もまた同じである。こ
のような再構築された部位は、もはやＢｇｌＩＩまたは
ＢａｍＨＩに対する基質でなくて、酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（ＭｂｏＩ）により認識される〔Ｖ．ピロッタ、「バシ
ラス−グロビギルからの２つの制限酵素」、核酸研究
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第３巻、第
１７４７−１７６０頁（１９７６）〕。連結反応に続い
て、この混合物を再びＢａｍＨＩにより切断して、簡単
に再環化したＧ−ｐＰＬａＢ分子を除去した。形質転換
体を、カナマイシン抵抗性を選択するＣ６００ｒ Ｋｍ Ｋ
＋（λ）中に得た。
【０１３６】形質転換体を、ＩＦＮ−β−関連組換体プ
ラスミドの特徴付けのために、上述のように、アガロー
スゲル上の未切断ＤＮＡの分子量決定により選抜した。
Ｇ−ｐＰＬａＢ親より僅かに大きいと証明されたクロー
ンをさらに、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｃＩＩのいずれかに
より制限分析に付した。一つのクローンは、単ＰｓｔＩ
部位と３つのＨｉｎｃＩＩ部位を含むことが判った。こ
のクローンの一つの断片は、Ｐ Ｌから誘導されたｐＰＬ
ａＢからβ−ラクタマーゼ領域へ、ＨｉｎｃＩＩ断片と
共に共移動した。クローンのもう一つのより小さい断片
は約４００塩基対と測定され−−これは、Ｐ Ｌプロモー
タに関して感覚配向中のＧ−ｐＰＬａＢ中へＢｇｌＩＩ
断片の挿入と矛盾しない。このプロモータは、Ｇ−ｐＰ
Ｌａ−ＨＦＩＦ−６７−１２と命名された。
ラスミドの特徴付けのために、上述のように、アガロー
スゲル上の未切断ＤＮＡの分子量決定により選抜した。
Ｇ−ｐＰＬａＢ親より僅かに大きいと証明されたクロー
ンをさらに、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｃＩＩのいずれかに
より制限分析に付した。一つのクローンは、単ＰｓｔＩ
部位と３つのＨｉｎｃＩＩ部位を含むことが判った。こ
のクローンの一つの断片は、Ｐ Ｌから誘導されたｐＰＬ
ａＢからβ−ラクタマーゼ領域へ、ＨｉｎｃＩＩ断片と
共に共移動した。クローンのもう一つのより小さい断片
は約４００塩基対と測定され−−これは、Ｐ Ｌプロモー
タに関して感覚配向中のＧ−ｐＰＬａＢ中へＢｇｌＩＩ
断片の挿入と矛盾しない。このプロモータは、Ｇ−ｐＰ
Ｌａ−ＨＦＩＦ−６７−１２と命名された。
【０１３７】次にＥ．ｃｏｌｉＫ１２ΔＨＩとＭ５２１
９を特徴付けしたプラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−
６７−１２により形質転換した。
９を特徴付けしたプラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−
６７−１２により形質転換した。
【０１３８】３．プラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−
６７−１２Δ１９の構築 Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２をＨｉｎｃＩＩに
より部分消化した。約０．０１μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度
にての連結反応に続いて、ＤＮＡを、３′突出末端を生
成するＰｖｕＩのアイソシゾマーであるＸｏｒＩＩによ
り切断し、かつ低いＤＮＡ濃度において再結合した。親
プラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２は、２
つのＸｏｒＩＩ部位を含む：その一つの部位は、カナマ
イシン遺伝子を不活性化し、もう一つの部位は、プラス
ミドから除去されるべきＨｉｎｃＩＩ断片中に位置す
る。ＸｏｒＩＩ消化−再結合工程の目的は、ＨｉｎｃＩ
Ｉ酵素により切断されない親ＤＮＡ分子を除去するため
である。このような分子は、２つのＸｏｒＩＩ部位を有
し、かつ連結反応に使用した条件下において、２つの断
片は、再結合されるとはとても思われない。形質転換体
は、カナマイシンを選択するＣ６００ｒ Ｋ −ｍ Ｋ ＋
（λ）中に得られ、かつ単ＰｖｕＩ部位の存在に対する
制限分析により選抜された。さらにクローンの分析を、
ＨｉｎｃＩＩ消化を使用して実施した。最小ＨｉｎｃＩ
Ｉ断片を欠くけれども、その他の点ではＧ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２と一致する一つのクローンは、Ｇ
−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２Δ１９と命名され
た。
６７−１２Δ１９の構築 Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２をＨｉｎｃＩＩに
より部分消化した。約０．０１μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度
にての連結反応に続いて、ＤＮＡを、３′突出末端を生
成するＰｖｕＩのアイソシゾマーであるＸｏｒＩＩによ
り切断し、かつ低いＤＮＡ濃度において再結合した。親
プラスミドＧ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２は、２
つのＸｏｒＩＩ部位を含む：その一つの部位は、カナマ
イシン遺伝子を不活性化し、もう一つの部位は、プラス
ミドから除去されるべきＨｉｎｃＩＩ断片中に位置す
る。ＸｏｒＩＩ消化−再結合工程の目的は、ＨｉｎｃＩ
Ｉ酵素により切断されない親ＤＮＡ分子を除去するため
である。このような分子は、２つのＸｏｒＩＩ部位を有
し、かつ連結反応に使用した条件下において、２つの断
片は、再結合されるとはとても思われない。形質転換体
は、カナマイシンを選択するＣ６００ｒ Ｋ −ｍ Ｋ ＋
（λ）中に得られ、かつ単ＰｖｕＩ部位の存在に対する
制限分析により選抜された。さらにクローンの分析を、
ＨｉｎｃＩＩ消化を使用して実施した。最小ＨｉｎｃＩ
Ｉ断片を欠くけれども、その他の点ではＧ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２と一致する一つのクローンは、Ｇ
−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１２Δ１９と命名され
た。
【０１３９】４．プラスミドＧ−ｐＰＬｃ−ＨＦＩＦ−
６７−８の構築 Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１ＤＮＡを、ＢｇｌＩ
Ｉにより消化し、かつＢａｍＨＩ−切断ｐＰＬｃ２４Ｄ
ＮＡと結合した。連結反応混合物を、ＢａｍＨＩで再切
断して、親ｐＰＬｃ２４分子を除去しかつカルベニシリ
ン抵抗性を選択するＣ６００ｒ Ｋ −ｍ Ｋ ＋（λ）中に形
質転換した。形質転換体をＨｉｎｃＩＩによる制限によ
り分析した。ｐＰＬｃ２４の制限部位の既知位置から、
Ｐ Ｌに関して感覚配向中にＢｇｌＩＩ−ＩＦＮ−β断片
の挿入が、約６５０塩基対のＨｉｎｃＩＩ外断片を生成
すべきことは予言することができる。この立体配置を現
す典型的クローンをｐＰＬｃ−ＨＦＩＦ−６７−８と命
名された。ＥｃｏｌｉＫ１２ΔＨＩとＭ５２１９を、特
徴付けしたプラスミドＧ−ｐＰＬｃ−ＨＦＩＦ−６７−
８により形質転換した。
６７−８の構築 Ｇ−ｐＰＬａ−ＨＦＩＦ−６７−１ＤＮＡを、ＢｇｌＩ
Ｉにより消化し、かつＢａｍＨＩ−切断ｐＰＬｃ２４Ｄ
ＮＡと結合した。連結反応混合物を、ＢａｍＨＩで再切
断して、親ｐＰＬｃ２４分子を除去しかつカルベニシリ
ン抵抗性を選択するＣ６００ｒ Ｋ −ｍ Ｋ ＋（λ）中に形
質転換した。形質転換体をＨｉｎｃＩＩによる制限によ
り分析した。ｐＰＬｃ２４の制限部位の既知位置から、
Ｐ Ｌに関して感覚配向中にＢｇｌＩＩ−ＩＦＮ−β断片
の挿入が、約６５０塩基対のＨｉｎｃＩＩ外断片を生成
すべきことは予言することができる。この立体配置を現
す典型的クローンをｐＰＬｃ−ＨＦＩＦ−６７−８と命
名された。ＥｃｏｌｉＫ１２ΔＨＩとＭ５２１９を、特
徴付けしたプラスミドＧ−ｐＰＬｃ−ＨＦＩＦ−６７−
８により形質転換した。
【０１４０】（ｃ）ＦＭＤＶ抗原遺伝子 １９８０年８月１５日付出願の英国特許出願第８０．２
６６６１号明細書に記載されているように、ＦＭＤウイ
ルス抗原の特異性を示すポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列をベクタｐＰＬｃ２４中に挿入して組替えＤＮＡ
分子を生成させ、これらは形質転換宿主において適当な
誘発の後に、ＦＭＤウイルス抗原の特異性を有するポリ
ペプチドを発現することができる。
６６６１号明細書に記載されているように、ＦＭＤウイ
ルス抗原の特異性を示すポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列をベクタｐＰＬｃ２４中に挿入して組替えＤＮＡ
分子を生成させ、これらは形質転換宿主において適当な
誘発の後に、ＦＭＤウイルス抗原の特異性を有するポリ
ペプチドを発現することができる。
【０１４１】ベクタｐＰＬｃ２４を、制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩにより制限して、ｐＦＭＤＶ−１０
３４による制限ＤＮＡ配列を有するサブ配列連結反応に
対する相補末端を与えた。
ＩとＨｉｎｄＩＩＩにより制限して、ｐＦＭＤＶ−１０
３４による制限ＤＮＡ配列を有するサブ配列連結反応に
対する相補末端を与えた。
【０１４２】切断ベクタとＤＮＡ断片を、１：２の割合
で結合し、エタノールで沈澱させた。沈澱物を分離しか
つＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（３μｇベクタ／ｍｌ）
中に再溶解し、連結反応を１５℃で一晩進行させた。
で結合し、エタノールで沈澱させた。沈澱物を分離しか
つＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（３μｇベクタ／ｍｌ）
中に再溶解し、連結反応を１５℃で一晩進行させた。
【０１４３】Ｐ Ｌ調節発現を防止するための染色λリプ
レッサｃＩを有する、ＣａＣｌ ２受容Ｅ・ｃｏｌｉＷ６
（λｒｅｘ）を、リガーゼ混合物と、４０μｇ／ｍｌア
ンピシリンを補充したＬ−培養液中で増殖した後に選択
されたアンピシリン抵抗性コロニーとにより形質転換し
た。ベクタｐＰＬｃ２４はβ−ラクタマーゼをコードす
る遺伝子を含むので、この無傷遺伝子を有するプラスミ
ドにより形質転換されたＥｃｏｌｉ宿主は、そのように
形質転換されない細菌の排除のためのアンピシリンを含
む媒質中で増殖するだろう。
レッサｃＩを有する、ＣａＣｌ ２受容Ｅ・ｃｏｌｉＷ６
（λｒｅｘ）を、リガーゼ混合物と、４０μｇ／ｍｌア
ンピシリンを補充したＬ−培養液中で増殖した後に選択
されたアンピシリン抵抗性コロニーとにより形質転換し
た。ベクタｐＰＬｃ２４はβ−ラクタマーゼをコードす
る遺伝子を含むので、この無傷遺伝子を有するプラスミ
ドにより形質転換されたＥｃｏｌｉ宿主は、そのように
形質転換されない細菌の排除のためのアンピシリンを含
む媒質中で増殖するだろう。
【０１４４】５０個のアカデミー抵抗性クローンを拾い
挙げ、かつＭ．グルンシュタインとＤ．Ｓ．ホグネス、
「コロニーハイブリッド形成：特定遺伝子を含むクロー
ン化ＤＮＡの単離方法」プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第３９
６１−６５頁（１９７５）により記載されるようにし
て、Ｅ・ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩおよびα− ３２
Ｐ−ｄＡＴＰの存在下におけるニックトランスレーショ
ンにより調製された ３２Ｐ−標識したＰｓｔＩ−ｐＦＭ
ＤＶ−１０３４プローブによりハイブリッド形成した。
７個の非常に陽性のクローンを選択した。これら７個の
クローンは、次のように同定して良い：Ｅ・ｃｏｌｉＷ
６（λｒｅｘ−ｐＰＬｃ２４（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）／ＦＭＤＶ−１０３４（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）。これらのクローンをＥ・ｃｏｌｉＷ６（λｒｅ
ｘ−ｐＰＬ−ＶＰ１−１）、これらのプラスミドをｐＰ
Ｌ−ＶＰ１−１、およびこれらのＤＮＡ挿入断片をＶＰ
１−１として、それぞれ呼ぶであろう。Ｅ・ｃｏｌｉＷ
６（λｒｅｘ−ｐＰＬ−ＶＰ１−５）として同定された
第２のクローンも選択された。最近の検定において、Ｅ
・ｃｏｌｉＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ ｔｓ−ｐＰＬ−
ＶＰ１−５）のコロニーは、３７℃で一晩の増殖の後
に、ＶＰ１−関連抗原の存在と矛盾しない応答を発揮す
る細菌抽出物を生成した。
挙げ、かつＭ．グルンシュタインとＤ．Ｓ．ホグネス、
「コロニーハイブリッド形成：特定遺伝子を含むクロー
ン化ＤＮＡの単離方法」プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第３９
６１−６５頁（１９７５）により記載されるようにし
て、Ｅ・ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩおよびα− ３２
Ｐ−ｄＡＴＰの存在下におけるニックトランスレーショ
ンにより調製された ３２Ｐ−標識したＰｓｔＩ−ｐＦＭ
ＤＶ−１０３４プローブによりハイブリッド形成した。
７個の非常に陽性のクローンを選択した。これら７個の
クローンは、次のように同定して良い：Ｅ・ｃｏｌｉＷ
６（λｒｅｘ−ｐＰＬｃ２４（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）／ＦＭＤＶ−１０３４（ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ）。これらのクローンをＥ・ｃｏｌｉＷ６（λｒｅ
ｘ−ｐＰＬ−ＶＰ１−１）、これらのプラスミドをｐＰ
Ｌ−ＶＰ１−１、およびこれらのＤＮＡ挿入断片をＶＰ
１−１として、それぞれ呼ぶであろう。Ｅ・ｃｏｌｉＷ
６（λｒｅｘ−ｐＰＬ−ＶＰ１−５）として同定された
第２のクローンも選択された。最近の検定において、Ｅ
・ｃｏｌｉＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ ｔｓ−ｐＰＬ−
ＶＰ１−５）のコロニーは、３７℃で一晩の増殖の後
に、ＶＰ１−関連抗原の存在と矛盾しない応答を発揮す
る細菌抽出物を生成した。
【０１４５】プラスミドＤＮＡを、上述のようにして、
強くハイブリッド形成するクローンから単離され、かつ
Ｅ・ｃｏｌｉＮＦ１（Ｋ１２ Ｍ７２ ｌａｃ ａｍΔｔ
ｒｐＥＡ２Ｓｍ Ｒ）（λｃＩ８５１Ｎ ａｍ７Ｎ ａｍ５３
ΔＨＩｂｉｏ −）（「Ｅ・ｃｏｌｉＮＦ１（λＮ −ｃｒ
ｏ −ｃＩ ｔｓ）」）の（ＣａＣｌ ２受容）細菌株を形質
転換するのに使用された〔Ｕ．Ｈ．バーナード等、バク
テリオファージλＰ Ｌプロモータからの遺伝子発現を促
進するプラスミドクローン用運搬体の構築」遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ）、第５巻、第５９−７６頁（１９７９）〕。
強くハイブリッド形成するクローンから単離され、かつ
Ｅ・ｃｏｌｉＮＦ１（Ｋ１２ Ｍ７２ ｌａｃ ａｍΔｔ
ｒｐＥＡ２Ｓｍ Ｒ）（λｃＩ８５１Ｎ ａｍ７Ｎ ａｍ５３
ΔＨＩｂｉｏ −）（「Ｅ・ｃｏｌｉＮＦ１（λＮ −ｃｒ
ｏ −ｃＩ ｔｓ）」）の（ＣａＣｌ ２受容）細菌株を形質
転換するのに使用された〔Ｕ．Ｈ．バーナード等、バク
テリオファージλＰ Ｌプロモータからの遺伝子発現を促
進するプラスミドクローン用運搬体の構築」遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ）、第５巻、第５９−７６頁（１９７９）〕。
【０１４６】他の株類、たとえば、Ｎ−遺伝子生成物を
発現するＥ・ｃｏｌｉＭ５２１９（Ｋ１２ Ｍ７２ ｌ
ａｃ ａｍｔｒｐ ａｍＳｍ Ｒ（λｃＩ８５７ ΔＨＩｂｉ
ｏ２５２）〔Ｈ．グリール、「バクテリオファージλの
ｋｉｌ遺伝子」、ウイルス学、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、
第６６巻、第５８９−６０４頁（１９７５）〕もまた、
本発明において使用できるだろう。
発現するＥ・ｃｏｌｉＭ５２１９（Ｋ１２ Ｍ７２ ｌ
ａｃ ａｍｔｒｐ ａｍＳｍ Ｒ（λｃＩ８５７ ΔＨＩｂｉ
ｏ２５２）〔Ｈ．グリール、「バクテリオファージλの
ｋｉｌ遺伝子」、ウイルス学、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、
第６６巻、第５８９−６０４頁（１９７５）〕もまた、
本発明において使用できるだろう。
【０１４７】形質転換した宿主のクローンを、４０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを補充したＬ−培養液中で、２８
℃にて増殖し、かつクローンを７セットの形質転換体の
それぞれから無作為に選択した。さらに、プラスミドｐ
ＰＬｃ２４により形質転換した宿主のクローンを２８℃
で増殖し、かつクローンをこれらの形質転換体から無作
為に選択した。これらのクローンは次のように同定され
た。
／ｍｌのアンピシリンを補充したＬ−培養液中で、２８
℃にて増殖し、かつクローンを７セットの形質転換体の
それぞれから無作為に選択した。さらに、プラスミドｐ
ＰＬｃ２４により形質転換した宿主のクローンを２８℃
で増殖し、かつクローンをこれらの形質転換体から無作
為に選択した。これらのクローンは次のように同定され
た。
【０１４８】Ｅ・ｃｏｌｉＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ
ｔｓ−ｐＰＬ−ＶＰ１−１）Ｅ・ｃｏｌｉ ＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ ｔｓ−ｐＰＬ
ｃ２４） 本明細書中に記載した方法により調製された微生物およ
びベクタは、米国メリーランド州ロックビル所在のアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８０
年９月８日付で寄託した培養物によって例示され、これ
らは次のようにＰＬ−ＡないしＰＬ−Ｄとして同定され
ている。
ｔｓ−ｐＰＬ−ＶＰ１−１）Ｅ・ｃｏｌｉ ＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ ｔｓ−ｐＰＬ
ｃ２４） 本明細書中に記載した方法により調製された微生物およ
びベクタは、米国メリーランド州ロックビル所在のアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８０
年９月８日付で寄託した培養物によって例示され、これ
らは次のようにＰＬ−ＡないしＰＬ−Ｄとして同定され
ている。
【０１４９】 Ａ、イー・コリＭ５２１９（ｐＰＬａ２３１１） Ｂ、イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ８） Ｃ、イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２８） Ｄ、イー・コリＭ５２１９（ｐＰＬｃ２４） これらの培養物には、受託番号ＡＴＴＣ３１６９４〜３
１６９７がそれぞれ付与されている。
１６９７がそれぞれ付与されている。
【０１５０】さらに、本明細書中に記載した方法で調製
されかつ発現用として挿入ＤＮＡ配列を含有する微生物
およびベクタは、ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在の
カルチャーコレクションであるドイツチェ・ザンムルン
ク・フォン・ミクロオルガニスメンに寄託された培養物
によって例示され、これらは次のように同定されてい
る： ＨＦＩＦ−Ｄ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２）〔ＤＳＭ１８５１〕 ＨＦＩＦ−Ｅ：イー・コリＫ１２ΔＨＩ（Ｇ−ｐＰＬａ
−ＨＦＩＦ−６７−１２）〔ＤＳＭ１８５２〕 ＨＦＩＦ−Ｆ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２Δ１９）〔ＤＳＭ１８５３〕 ＨＦＩＦ−Ｇ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬｃ−
ＨＦＩＦ−６７−８）〔ＤＳＭ１８５４〕 ＦＭＤＶ−Ａ：イー・コリＷ６（λｒｅｘ−ｐＰＬ−Ｖ
Ｐ１−１）〔ＤＳＭ１８７９〕 ＦＭＤＶ−Ｂ：イー・コリＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ
ｔｓ−ｐＰＬ−１）〔ＤＳＭ１８８０〕 ＦＭＤＶ−Ｃ：イー・コリＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ
ｔｓ−ｐＰＬ−ＶＰ１−５）〔ＤＳＭ１８８１〕 培養物ＨＦＩＦ−Ｄ〜ＨＦＩＦ−Ｇは１９８０年６月５
日付で寄託され、培養物ＦＭＤＶ−Ａ〜ＦＭＤＶ−Ｃは
１９８０年７月３１日付で寄託された。
されかつ発現用として挿入ＤＮＡ配列を含有する微生物
およびベクタは、ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在の
カルチャーコレクションであるドイツチェ・ザンムルン
ク・フォン・ミクロオルガニスメンに寄託された培養物
によって例示され、これらは次のように同定されてい
る： ＨＦＩＦ−Ｄ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２）〔ＤＳＭ１８５１〕 ＨＦＩＦ−Ｅ：イー・コリＫ１２ΔＨＩ（Ｇ−ｐＰＬａ
−ＨＦＩＦ−６７−１２）〔ＤＳＭ１８５２〕 ＨＦＩＦ−Ｆ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬａ−
ＨＦＩＦ−６７−１２Δ１９）〔ＤＳＭ１８５３〕 ＨＦＩＦ−Ｇ：イー・コリＭ５２１９（Ｇ−ｐＰＬｃ−
ＨＦＩＦ−６７−８）〔ＤＳＭ１８５４〕 ＦＭＤＶ−Ａ：イー・コリＷ６（λｒｅｘ−ｐＰＬ−Ｖ
Ｐ１−１）〔ＤＳＭ１８７９〕 ＦＭＤＶ−Ｂ：イー・コリＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ
ｔｓ−ｐＰＬ−１）〔ＤＳＭ１８８０〕 ＦＭＤＶ−Ｃ：イー・コリＮＦ１（λＮ −ｃｒｏ −ｃＩ
ｔｓ−ｐＰＬ−ＶＰ１−５）〔ＤＳＭ１８８１〕 培養物ＨＦＩＦ−Ｄ〜ＨＦＩＦ−Ｇは１９８０年６月５
日付で寄託され、培養物ＦＭＤＶ−Ａ〜ＦＭＤＶ−Ｃは
１９８０年７月３１日付で寄託された。
【０１５１】以上、本発明の多くの具体例を提示した
が、この基本構成を変化させて、本発明の方法および組
成物を使用する他の実施態様をも与えうることは明らか
である。したがって、本発明は上記実施例に示された特
定実施態様のみに限定されず、本発明の範囲は特許請求
の範囲の記載により規定されることが了解されよう。
が、この基本構成を変化させて、本発明の方法および組
成物を使用する他の実施態様をも与えうることは明らか
である。したがって、本発明は上記実施例に示された特
定実施態様のみに限定されず、本発明の範囲は特許請求
の範囲の記載により規定されることが了解されよう。
【図１】ファージλｔｒｐ４４ｃＩ Ａｔ ２ｃｒｏ −の
領域の略図であって、制限部位の全部は示されておら
ず、イー・スジバルスキイおよびダブリュ・スジバルス
キイにより記載されたような〔「バクテリオファージλ
の広汎分子地図」、ジーン誌、第７巻、第２１７−２７
０頁（１９７９）〕、λ単位において距離を地図化した
図である。
領域の略図であって、制限部位の全部は示されておら
ず、イー・スジバルスキイおよびダブリュ・スジバルス
キイにより記載されたような〔「バクテリオファージλ
の広汎分子地図」、ジーン誌、第７巻、第２１７−２７
０頁（１９７９）〕、λ単位において距離を地図化した
図である。
【図２】本発明によるベクタ、すなわちｐＰＬａ２、ｐ
ＰＬａ２０およびｐＰＬａ２３の作成の略図である。
ＰＬａ２０およびｐＰＬａ２３の作成の略図である。
【図３】本発明によるベクタ、すなわちｐＰＬａ２３１
１、ｐＰＬａ２３１およびｐＰＬａ８の作成の略図であ
る。
１、ｐＰＬａ２３１およびｐＰＬａ８の作成の略図であ
る。
【図４】本発明によるベクタ、すなわちｐＰＬａ８３、
ｐＰＬａ８３１、ｐＰＬａ８３２、ｐＰＬｃ２、ｐＰＬ
ｃ２３、ｐＰＬｃ２３６およびｐＰＬｃ２８の作成の略
図である。
ｐＰＬａ８３１、ｐＰＬａ８３２、ｐＰＬｃ２、ｐＰＬ
ｃ２３、ｐＰＬｃ２３６およびｐＰＬｃ２８の作成の略
図である。
【図５】本発明によるベクタ、すなわちｐＰＬｃ２４の
作成の略図である。
作成の略図である。
【図６】ｐＰＬａ２３１１のＯ ＬＰ Ｌ領域のヌクレオチ
ド配列を示す図である。
ド配列を示す図である。
【図７】β−ラクタマーゼにおけるＰｓｔＩ部位からＢ
ａｍＨＩ部位への変換を示す図である。
ａｍＨＩ部位への変換を示す図である。
【図８】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３）およ
びイー・コリＭ５２１９（ｐＰＬａ２３）における２８
℃および４２℃でのオートラジオグラフ検定による蛋白
質合成を示す図である。
びイー・コリＭ５２１９（ｐＰＬａ２３）における２８
℃および４２℃でのオートラジオグラフ検定による蛋白
質合成を示す図である。
【図９】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３ｔｒｐ
Ａ １）およびイー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３ｔ
ｒｐＡ ２）における２８℃および４２℃でのオートラジ
オグラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
Ａ １）およびイー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３ｔ
ｒｐＡ ２）における２８℃および４２℃でのオートラジ
オグラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
【図１０】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２３ｔｒ
ｐＡ １）における２８℃および４２℃でのオートラジオ
グラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
ｐＡ １）における２８℃および４２℃でのオートラジオ
グラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
【図１１】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬａ２３１１
Ｒ １）における２８℃および４２℃でのオートラジオグ
ラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
Ｒ １）における２８℃および４２℃でのオートラジオグ
ラフ検定による蛋白質合成を示す図である。
【図１２】ｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５およびｐＰＬｃ２８Ｓ
Ｖ ｔ５−３７の作成の略図である。
Ｖ ｔ５−３７の作成の略図である。
【図１３】ヌクレオチドレベルにおけるｐＰＬｃ２８Ｓ
Ｖ ｔ５からのｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７の作成を示す
図である。
Ｖ ｔ５からのｐＰＬｃ２８ＳＶ ｔ５−３７の作成を示す
図である。
【図１４】イー・コリＫ１２ΔＨＩ（ｐＰＬｃ２８ＳＶ
ｔ５−３７−９）の２８℃および４２℃におけるオート
ラジオグラフ検定による蛋白質合成であって、ＳＶ４０
−腫瘍を有するハムスターから４２℃での培養後に合成
された蛋白質をこの宿主からの血清により免疫沈澱させ
たものと、ＳＶ４０感染したアフリカ緑猿の腎臓細胞で
合成された標準小−ｔ抗原を同抗血清により免疫沈澱さ
せたものとの比較を示す図である。
ｔ５−３７−９）の２８℃および４２℃におけるオート
ラジオグラフ検定による蛋白質合成であって、ＳＶ４０
−腫瘍を有するハムスターから４２℃での培養後に合成
された蛋白質をこの宿主からの血清により免疫沈澱させ
たものと、ＳＶ４０感染したアフリカ緑猿の腎臓細胞で
合成された標準小−ｔ抗原を同抗血清により免疫沈澱さ
せたものとの比較を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 バクテリオファージ ラムダの左向きプ
ロモータおよびオペレータであるＰL ＯL を有するこ
と、活性ｃｒｏ遺伝子および活性Ｎ遺伝子が存在しない
こととを特徴とするベクター中に、ＰL ＯL の下流３０
０塩基対未満で且つ分子中に存在し得るバクテリオファ
ージ ラムダのＨａｅＩＩＩ部位（７３．１％）の下流
にあるラムダＤＮＡ由来のあらゆる配列の上流の位置
に、所望の原核、真核またはウイルスポリペプチドのコ
ード領域を含有するＤＮＡ配列を挿入する段階を特徴と
する組換ＤＮＡ分子の作製方法。 - 【請求項２】 ベクター中のＰL ＯL と所望のポリペプ
チドのコード領域との間にリボゾーム結合部位を挿入す
ることをさらに特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - 【請求項３】 リボゾーム結合部位が、バクテリオファ
ージ ＭＳ２レプリカーゼのそれである特許請求の範囲
第２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8018701 | 1980-06-06 | ||
| GB8026661 | 1980-08-15 | ||
| GB8028983 | 1980-09-08 | ||
| GB8026661 | 1980-09-08 | ||
| GB8018701 | 1980-09-08 | ||
| GB8028983 | 1980-09-08 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56047362A Division JPH0787785B2 (ja) | 1980-06-06 | 1981-04-01 | 改良ベクタおよびこの種ベクタの製造方法ならびにクローン化遺伝子の発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838177A true JPH0838177A (ja) | 1996-02-13 |
| JP3158952B2 JP3158952B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=27260930
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56047362A Expired - Lifetime JPH0787785B2 (ja) | 1980-06-06 | 1981-04-01 | 改良ベクタおよびこの種ベクタの製造方法ならびにクローン化遺伝子の発現方法 |
| JP10784895A Expired - Lifetime JP3158953B2 (ja) | 1980-06-06 | 1995-04-10 | 改良Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞 |
| JP10784695A Expired - Lifetime JP3158951B2 (ja) | 1980-06-06 | 1995-04-10 | 改良組換ｄｎａ分子 |
| JP10784795A Expired - Lifetime JP3158952B2 (ja) | 1980-06-06 | 1995-04-10 | 組換ｄｎａ分子の作製方法 |
| JP10060225A Pending JPH10304876A (ja) | 1980-06-06 | 1998-03-11 | 改良組換ｄｎａ分子 |
| JP2000314383A Pending JP2001136966A (ja) | 1980-06-06 | 2000-10-13 | 改良組換ｄｎａ分子 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56047362A Expired - Lifetime JPH0787785B2 (ja) | 1980-06-06 | 1981-04-01 | 改良ベクタおよびこの種ベクタの製造方法ならびにクローン化遺伝子の発現方法 |
| JP10784895A Expired - Lifetime JP3158953B2 (ja) | 1980-06-06 | 1995-04-10 | 改良Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞 |
| JP10784695A Expired - Lifetime JP3158951B2 (ja) | 1980-06-06 | 1995-04-10 | 改良組換ｄｎａ分子 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10060225A Pending JPH10304876A (ja) | 1980-06-06 | 1998-03-11 | 改良組換ｄｎａ分子 |
| JP2000314383A Pending JP2001136966A (ja) | 1980-06-06 | 2000-10-13 | 改良組換ｄｎａ分子 |
Country Status (17)
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|---|---|
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| JP (6) | JPH0787785B2 (ja) |
| KR (1) | KR860001557B1 (ja) |
| BG (1) | BG60443B2 (ja) |
| BR (1) | BR8101972A (ja) |
| CA (1) | CA1207251A (ja) |
| DD (1) | DD158918A5 (ja) |
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| DK (1) | DK171301B1 (ja) |
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| FI (1) | FI811009L (ja) |
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| IE (1) | IE63126B1 (ja) |
| IL (1) | IL62553A (ja) |
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| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| US5510472A (en) * | 1979-11-21 | 1996-04-23 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Production of recombinant human interferon-beta2 |
| ES8302096A1 (es) | 1980-04-03 | 1982-12-16 | Biogen Nv | Un metodo de producir un polipeptido que muestra una actividad immunologica obiologica de interferon de fibroblasto hu- mano. |
| IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
| GB2103622B (en) * | 1981-06-16 | 1986-01-15 | Genentech Inc | Production of foot and mouth disease vaccine from microbially expressed antigens |
| JPS5835198A (ja) * | 1981-08-28 | 1983-03-01 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規ベクター |
| ZA831854B (en) * | 1982-03-26 | 1984-01-25 | Biogen Nv | Small peptides with the specificity of foot and mouth disease viral antigens |
| JPS58183659A (ja) * | 1982-03-31 | 1983-10-26 | ジェネテイックス、インスチチュ−ト、インコ−ポレ−テッド | 修飾プロインシュリン前駆体、これを暗号化するｄｎａ配列およびそれらの産生方法 |
| FR2526661B1 (fr) * | 1982-05-13 | 1986-02-21 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs d'expression de la proteine antigenique de la rage et leur application a la preparation de vaccins |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| CA1341012C (en) * | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| EP0121569B1 (en) * | 1982-10-08 | 1990-08-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel vector |
| FR2539758B1 (fr) * | 1983-01-21 | 1985-11-15 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs d'expression et leur application a la preparation d'une proteine ayant l'activite de l'antitrypsine-a1 humaine |
| CA1303530C (en) * | 1983-01-21 | 1992-06-16 | Michael Courtney | EXPRESSION VECTORS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF A PROTEIN HAVING HUMAN .alpha. -ANTITRYPSIN ACTIVITY |
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