HUT50871A - Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same - Google Patents

Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same Download PDF

Info

Publication number
HUT50871A
HUT50871A HU881692A HU169288A HUT50871A HU T50871 A HUT50871 A HU T50871A HU 881692 A HU881692 A HU 881692A HU 169288 A HU169288 A HU 169288A HU T50871 A HUT50871 A HU T50871A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
plasmid
ppr
interferon
coli
Prior art date
Application number
HU881692A
Other languages
Hungarian (hu)
Inventor
Vladimir G Debabov
Jury I Kozlov
Sergei V Masko
Aleksandr Y Strongin
Viktor E Sterkin
Vitaly L Jurin
Original Assignee
Vnii Genetiki Selektsii Promy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vnii Genetiki Selektsii Promy filed Critical Vnii Genetiki Selektsii Promy
Publication of HUT50871A publication Critical patent/HUT50871A/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555Interferons [IFN]
    • C07K14/565IFN-beta

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

A recombinant plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13, coding for synthesis of human beta 1-interferon has a size of 3.9 k.b.p. and consists of the following elements: BamHI-BglII, a fragment of a size of 3.4 k.b.p. of vector plasmid obtained on the basis of pPR40 and pML24, EcoRI-Sau3A, a fragment of plasmid pIN beta -trp 7 of a size of 510 b.p. deposited on 12.01.87 under No. 1825 at the culture collection of the USSR Research Institute for Antibiotics. A method of construction of the above plasmid DNA comprises the preliminary construction of vector plasmid pPR124B, then the construction of intermediary plasmid pPR-IFN beta 1-123 with the subsequent construction of plasmid pPR-IFN beta 1-13. A strain of bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) as producer of human beta 1-interferon deposited on 12.01.87 under No. 1825 at the culture collection of the USSR Research Institute for Antibiotics.

Description

A találmány tárgya eljárás emberi fibroblaszt-pi-interferont kódoló uj, pPR-IFN pl-13 jelű rekombináns plazmid DNS előállítására, továbbá emberi fibroblaszt-pi interferont termelő Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) baktérium előállítására.The present invention relates to a novel recombinant plasmid DNA encoding human fibroblast-pi interferon, pPR-IFN p13, and to Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) producing human fibroblast-pi interferon.

• ·• ·

- 3 Az interferonok olyan fehérjék, amelyeket specializált emberi sejtek vírusfertőzésre, illetve különböző induktorok hatására válaszképpen termelnek. A jelenleg rendelkezésre állő kísérleti adatok azt mutatják, hogy egyes sejtek, szövetek és szervek interferonnal végzett kezelésekor az interferonok vírusellenes, fertőzésellenes és immunmódositó hatást mutatnak. Általános alkalmazási lehetőségét és jelentőségét tekintve az interferon-rendszer a szervezet számára az immunrendszerrel hasonlítható össze. Biológiai, kémiai és antigén tulajdonságok, valamint a termelő sejtek szempontjából az emberi interferonokat három csoportra osztják: oc- leukocita, p - fibroblaszt és immun interferonok, amelyeket főleg a leukocita, fibroblaszt, illetve T-limfocita sejtek termelnek.Interferons are proteins produced by specialized human cells in response to viral infections or to various inducers. Currently available experimental data indicate that interferons exhibit antiviral, anti-infectious and immunomodulatory properties when treated with interferon in certain cells, tissues and organs. In terms of its general application and importance, the interferon system for the body is comparable to the immune system. In terms of biological, chemical, and antigenic properties and production cells, human interferons are divided into three groups: α-leukocyte, β-fibroblast, and immune interferons, which are mainly produced by leukocyte, fibroblast, and T-lymphocyte cells.

Az interferonok gyógyászati alkalmazási területeit nagyjából már meghatározták. Ezek a keratitis és dermatozis, továbbá légúti fertőzések, amelyeket különböző vírusok (Grippe, adenovirusok) Hepatitis B és más vírusok keltenek.The therapeutic applications of interferons have largely been identified. These include keratitis and dermatosis, and respiratory tract infections caused by various viruses (Grippe, adenoviruses), Hepatitis B and other viruses.

Az interferonok hatásmechanizmusa, strukturális és funkcionális sajátságaik és klinikai lehetőségeik azonban még nincsenek kellőképpen megvizsgálva. Ez arra vezethető vissza, hogy a tiszta interferonok szokásos módszerekkel preparativ mennyiségben történő előállítása nehézségekbe ütközik, ami a fehérjeforrásként alkalmazott indukált emberi sejtkulturák alkalmazására vezethető vissza. Az igy szintetizált interferonok ezen kívül rendszerint különböző altípusok és formák bonyolult elegyei, amelyeknek komponensei strukturális és funkcionális jellemzők szempontjából különbö • · · · zőek. Ez jelentősen megnehezíti az egyes interferonok tulaj donságainak vizsgálatát. Ennek következtében az egyes inter feronok mikrobiológiai utón történő szintézise egyre jobban terjed.However, the mechanism of action, structural and functional properties and clinical potential of interferons have not yet been sufficiently investigated. This is due to difficulties in the preparation of pure interferons in a preparative manner by conventional methods due to the use of induced human cell cultures as a protein source. In addition, interferons synthesized in this way are usually complex mixtures of different subtypes and forms, the components of which differ in structural and functional characteristics. This makes it very difficult to investigate the properties of each interferon. As a result, the microbiological post-synthesis of individual interferons is becoming increasingly widespread.

Számos eljárás ismeretes emberi oú-, β- és ^-interferonok előállítására baktériumok segítségével, különösen különböző Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas törzsek segítségével, amelyek rekombináns plazmid DNS-t tar talmaznak, amelyek a heterológ gének uj genetikai környezet ben történő kifejeződését elősegítik. Az emberi fibroblaszt interferon (IFN βΐ) esetén az IFN βΐ gén kifejezésére azSeveral methods are known for the production of human o, β and β interferons by bacteria, in particular various strains of Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas, which contain recombinant plasmid DNA which promotes expression of heterologous genes in a new genetic environment. In the case of human fibroblast interferon (IFN βΐ), the expression of the IFN βΐ gene is

E.coli sejtekben az érett interferont kódoló részt az E.coli gének és kolifágok (P^)The E. coli genes and colifags (P ^) encode the mature interferon in E. coli cells.

UV 5 trp) transzkripciója (tuf B, rec A) és operonok (lac és transzlációja szignáljának elle nőrzése alá helyezték. A mikrobiológiai szintézis eredményeképpen képződő érett βΙ-interferont (amelynek molekulatömege kb. 19000 Dalton) egy szénhidrát-komponens hiánya és a metionincsoport helyén egy formil-metionin-N-végcsoport jelenléte jellemzi. Ez a különbség azonban nem vezet az IFN βΐ-gén fehérjeterméke biológiai aktivitása megváltozásához a természetes glikoproteinhez hasonlóan, amely a fibroblaszt sejtekben képződik. Az említett mikrobiológiai utón szintetizált βΐ-interferon akár a sejtreceptorokkal történő kölcsönhatás molekuláris mechanizmusának vizsgálatára, akár gyógyászati célokra használható.UV 5 trp) transcription (tuf B, rec A) and operons (lac and translational signaling). Mature interferon βΙ (molecular weight ca. 19000 Dalton) resulting from microbiological synthesis was deficient in a carbohydrate component and in the methionine moiety characterized by the presence of a formylmethionine N-terminal group, however, this difference does not lead to a change in the biological activity of the protein product of the IFN βΐ gene, similar to the native glycoprotein produced in fibroblast cells. molecular mechanism, even for medical purposes.

Ismeretesek rekombináns plazmid DNS-k, amelyek az emberi fibroblaszt-pi-interferon szintézisét kódolják, ilyenek például a pC1857 és pPLc245HFIF25 és az E.coli SG40444,Recombinant plasmid DNAs encoding the synthesis of human fibroblast-pi interferon are known, such as pC1857 and pPLc245HFIF25 and E. coli SG40444,

- 5 amely utóbbi az említett plazmidokat tartalmazza (Remaut E, Staussens P., Fiers G, 1983, Nucl.Acida Rés. 11, 4677-4688).5 containing the said plasmids (Remaut E, Staussens P., Fiers G, 1983, Nucl. Acida Res. 11, 4677-4688).

A rekombináns pPLc245HFIF25 plazmid DNS összetételben az IFNpi-gén átírását a lambda-bakteriofág P|_G[_ regulátor eleme szabályozza, és a gén fehérjeterméke transzlációjának bevezetése a riboszóma kötőhely hibridrészletének, az MS2-fág replikáz-génje SD-szekvenciája alapján történő konstruálása rovására van megoldva. Az emberi p-interferon maximális kitermelése, amely az említett törzs tenyésztésével érhető el, 4 % a plazmidot tartalmazó E.coli sejtek teljes fehérjetartalmára vonatkoztatva.In the recombinant pPLc245HFIF25 plasmid DNA composition, the transcription of the IFNβ1 gene is regulated by the P1GG regulatory element of the lambda bacteriophage, and the translation of the protein product of the gene into the hybrid fragment of the ribosome binding site is based on the SD2 solved. The maximum yield of human? -Interferon that can be achieved by culturing said strain is 4% of the total protein content of E. coli containing the plasmid.

Az említett törzsre az jellemző, hogy az IFN pi-gén szabályozható expressziójához, amelyet a P|_-promotor eredményez, még egy pC1857 plazmidot igényel, amely a lambda-fág ugyanazon hőmérsékletérzékeny clts857 regulátor-génjén helyezkedik el. Ez a rekombináns plazmid potenciális instabilitásához vezet a törzs nagyipari körülmények között történő tenyésztésekor a pC1857 és a pPLc245HFIF25 plazmidok közötti recA-tól függő, a homológia területeken túli rekombináció miatt. A riboszóma kötőhely hibridszakaszának megalkotásához az MS2-fág replikáz-génje viszonylag nem hosszú SD-szekvenciájának alkalmazása ezen kívül nem teszi teljes mértékben lehetővé, hogy az E.coli transzlációs apparátusának potenciális teljesítménye megvalósuljon, mivel a fibroblaszt-interferon transzlációja bevezetésekor a riboszómákkal való egymásrahatás nem kellően hatékony. Ugyanakkor a transzkripció (^-független terminátorainak hiánya a pPLc24HFIF25 plazmid IFN p-1 génje nem-transzlatálható 3'‘-végterületében a kópia• · ···· · · • · · ·· · ·····* · · ' • · · · · ·« • · · · · · · · · szám-termelés jelentős csökkenését sőt a rekombináns plazmid elvesztését eredményezi a lambda-fág igen hatékony P^-promotorja depressziója esetén, amely az IFNpi-gén transzkripcióját indítja.This strain is characterized in that it requires a plasmid pC1857, which is located on the same temperature-sensitive regulator gene of clts857, for the control of the expression of the IFN pi gene by the P1 promoter. This leads to a potential instability of the recombinant plasmid due to recA-dependent recombination between pC1857 and pPLc245HFIF25 in large-scale commercial culture, due to recombination beyond homology domains. In addition, the use of the relatively short SD sequence of the MS2 phage replicase gene to construct the hybridosome of the ribosome binding site does not fully allow for the potential performance of the E. coli translation apparatus, since the introduction of translocation of fibroblast interferon with non-ribosomes effective enough. However, the lack of transcriptional (? -Independent terminators) at the 3 '' end of the IFN p-1 gene of pPLc24HFIF25 is untranslated in the copy. In addition, a significant reduction in the production of numbers results in the loss of the recombinant plasmid in the case of depression of the highly efficient β 1 promoter of the lambda phage, which initiates transcription of the IFNβ1 gene.

Mindez nem teszi lehetővé az IFNpi-gén terméke nagy mennyiségben történő szintézisét, és a biomassza pi-interferontartalmának további csökkenéséhez vezethet a termelő törzs ipari méretekben történő tenyésztése esetén, ami nehezíti a tiszta fehérje izolálását és csökkenti a végtermék kitermelését.This does not allow large-scale synthesis of the IFNβ gene product and may lead to further reduction of the pi-interferon content of the biomass when industrially grown, which makes it difficult to isolate the pure protein and reduces the yield of the final product.

A találmány szerinti eljárással előállított rekombináns pPR-IFNpi-13 plazmid DNS, és az ezt tartalmazó Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNpi-13) törzs uj, az irodalomban nincs leírva.The recombinant plasmid pPR-IFNpI-13 DNA produced by the method of the invention and the strain Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNpI-13) containing it are novel, not described in the literature.

Szükség volt egy olyan uj rekombináns plazmid-DNS-re, amely az emberi fibroblaszt-pi-interferőn szintézisét kódolja, és egy olyan, nagy termelőképességü törzsre, amely ezt tartalmazza, és a pi-interferőn nagy kitermeléssel történő előállítását teszi lehetővé.There was a need for a novel recombinant plasmid DNA encoding the synthesis of human fibroblast-pi interferon and for a high-throughput strain containing it that permits its production on pi-interferon in high yield.

Előállítottuk a rekombináns pPR-IFNpi-13 plazmid-DNS-t, amely az emberi fibroblaszt-pi-interferőn szintézisét kódolja, és amely 3,9 ezer bázispárt (az irodalomban: kb) tartalmaz, és amely a következő elemekből áll: pPR 124B vektor plazmid 3,4 kb nagyságú BamHI-BglII fragmense, amelyet a pINp~trp7 plazmid 510 bp nagyságú, pPR40-és pML24-EcoRI-Sau3A fragmense alapján állítottunk elő, és amely a következőképpen jellemezhető:Recombinant plasmid DNA, pPR-IFNβ-13, which encodes for the synthesis of human fibroblast pi interferon, was prepared and contains 3.9 thousand base pairs (kb) and consists of the vector pPR 124B. a 3.4 kb BamHI-BglII fragment of plasmid plasmid, constructed from the 510 bp fragment of plasmid pINp-trp7, pPR40 and pML24-EcoRI-Sau3A, which is characterized as follows:

olyan szakaszt tartalmaz, amely a replikáció in• ······ · · · * · · ····· ··· ·· ··· ··· ·contains a section that replication in. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · |

- Ί ditását és annak regulációját biztosítja, ColEI-replikont, a lambda-fág clts 857 represszor génjét, ampicillin-rezisztencia gént (Ap ), az fd-fág transzkripciója ς-független terminátorjainak tandemjét, PpO^ regulátor területet és a cro-gén SD-szekvenciáját tartalmazza, amelyek az érett emberi fibroblaszt-interferőn IFNfl egy metionin kodont tartalmazó szekvenciáját kódolják.- Ί provides and regulates annak, the ColEI replicon, the lambda phage clts 857 repressor gene, the ampicillin resistance gene (Ap), the tdem of the ς-independent terminators of fd phage transcription, the PpOO regulatory domain and the SD cro gene which encodes a methionine codon on a mature human fibroblast interferon.

pi-interferőn kódoló szakaszát és az fd-fág transzkripció-terminátorát kódoló cro-gén szabályozó területének kötése úgy történik, hogy az IFN pl-gén előtt a riboszómák kötésére szolgáló hibridszakaszt képezünk, amelynek nukleotid-szekvenciája:The coding region of the pi-interferon coding region and the cogene regulatory region encoding the transcription terminator of the fd phage is formed by forming a hybrid region for ribosome binding upstream of the IFN p1 gene, having the nucleotide sequence:

5’-... TAAGGAGGTTGGARG...-3’ ahol TAAGGAGGT - a lambda-fág cro-génjének SD-szekvenciája, ATG a fibroblaszt interferon metionin-kodonja, és közvetlenül az IFN pl-gén terminátor-kodonja után helyezkedik el az fd-fág transzkripciója φ-független terminátorainak tandemje:5 '-... TAAGGAGGTTGGARG ...- 3' where TAAGGAGGT is the SD sequence of the lambda phage cro gene, ATG is the methionine codon of the fibroblast interferon and is located immediately after the terminator codon of the IFN p1 gene tandem of φ-independent terminators of phage transcription:

- unikális clal-restriktáz felismerő helyeket tar- talmaz, ahol a clal koordinátái a leolvasás kezdetét (0), PvuII ( ~ 1110), BglII ( 1480), AccI (^ 1870), Pvul (^ 3360) jelölik,- contains unique clal-restrictionase recognition sites, with clal coordinates indicating start of reading (0), PvuII (~ 1110), BglII (1480), AccI (^ 1870), Pvul (^ 3360),

- 1987. 01. 12-én 1825 szám alatt helyeztük letétbe az Antibiotikum Kutatóintézet Mikroorganizmus- és Tenyészetgyűjteményében .- 12.01.1987, 1825, deposited in the Microorganism and Culture Collection of the Antibiotic Research Institute.

A találmány szerinti, eljárással előállított, pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid DNS az IFN pi-gén expresszióját eredményezi a lambda-bakteriofág P^0p regulator területe • · • ······ 4 ♦ .The recombinant plasmid pPR-IFNβ-13 produced by the method of the invention results in the expression of the IFN pi gene in the regulatory region of the lambda bacteriophage P ^ 0p.

• · · ····· ··· ·· ·♦· ··· ·• · · ····· ··· ··· ♦ · ··· ·

- 8 kontrollja mellett.- With 8 controls.

A clts857-gén, amely a lambda-bakteriofág korai promotere transzkripciója bevezetésének regulatora, és az IFN pi-gén, amelyet a Pp-promotor szabályoz, ugyanabban a rekombináns, pPR-IFN pi-13 plazmidban helyezkednek el. Ez a körülmény lehetővé teszi, hogy egy rekombináns DNS-molekulát tartalmazó törzs tenyésztésénél a fellépő potenciális instabilitást kiküszöböljük, mivel az általunk javasolt konstrukcióban a termelő törzsben a további plazmid hiányában nem lép fel recA-tól függő rekombináció.The clts857 gene, which regulates transcriptional introduction of the early promoter of the lambda bacteriophage, and the IFN pi gene, which is regulated by the Pp promoter, are located in the same recombinant plasmid, pPR-IFN pi-13. This circumstance allows to eliminate potential instability in the cultivation of a strain containing a recombinant DNA molecule, since in the proposed construct no recA-dependent recombination occurs in the production strain in the absence of additional plasmid.

A találmány szerinti eljárás a pPR-IFN pi-13 rekombináns plazmid előállítására abban áll, hogy a pPR40 és PML24 plazmidokból alkotott pPR124B vektor plazmidot EcoRI és BglII restrikciós endonukleázzal hasítjuk, az EcoRI-Sau 3A vektor-molekula kapott fragmensei közül a legnagyobbat a pINp-trp7 plazmid fragmensével, amely az érett pi-interferőn kódoló szakaszát tartalmazza, kapcsoljuk. Az igy kapott pPR-IFN pi-123 rekombináns plazmidba bevezetjük a cro-gén SD-szekvenciáját és a pi-interferőn első metionin-kodonját, ehhez a plazmid-DNS-t BamHI-gyel hidrolizáljuk, a nukleotidok egy részét E.coli DNS-polimeráz I exonukleázzal eltávolítjuk, amelyek nukleozid-trifoszfát nem-teljes tétele arányaiban megjelennek a reakcióelegyben. A DNS-t EcoRI restriktázzal fermentációsán hasítjuk, és az egyszálu DNS-darabok eltávolítása érdekében Sl-endonukleázzal kezeljük, majd a kétszálu végeket E.coli DNS-polimerázI Klenow-fragmensével helyreállítjuk, és a kapott lineáris DNS-molekulákat T4-fág DNS-ligázzal ciklizáljuk. A kapott készítménnyel E.coli C600The method of constructing the recombinant plasmid pPR-IFN pi-13 according to the invention consists in cleaving the plasmid pPR124B made of plasmids pPR40 and PML24 with restriction endonuclease EcoRI and BglII, the largest fragment of the vector EcoRI-Sau 3A obtained being the pINp- trp7, which contains the coding region on the mature pi interferon. The resulting recombinant plasmid pPR-IFN pi-123 is inserted into the SD sequence of the cogene and the first methionine codon on the pi interferon is hydrolyzed with BamHI, a portion of the nucleotides being digested with E. coli DNA. polymerase I exonuclease, which are present in the reaction mixture in incomplete proportions of nucleoside triphosphate. The DNA was digested with EcoRI restriction enzyme and treated with S1 endonuclease to remove single-stranded DNA fragments, then the double-stranded ends were repaired with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase and the resulting linear DNA molecules were cleaved with T4 phage DNA ligase. cyclized. The resulting composition was E.coli C600

- 9 sejteket transzformálunk ampicillint tartalmazó táptalajon 28 °C-on tenyésztve a transzformánsok elvételével, majd a kiónok kiválogatásával, amelyek 42 °C-on lassabban szaporodnak, ezután a kiválasztott kiónokból a pPR-IFN pi-13 rekombináns plazmidot kiválasztjuk.- 9 cells were transformed on culture medium containing ampicillin at 28 ° C by removing the transformants, then selecting the clones which proliferate at 42 ° C, and then selecting the recombinant plasmid pPR-IFN pi-13 from the selected clones.

A pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid konstruálásával, amelynek során a lambda-bakteriofág cro-génje különösen hosszú SD-szekvenciáját, amely a kolifágokból E.coli mátrix-RNS-ként ismert, érett, emberi pi-interferőn kódoló részével kapcsoljuk, az IFN pi-gén riboszóma kötőhely hibridszakaszát kapjuk, amely a mátrix-RNS 5’-végének optimális primer és térbeli szerkezetével rendelkezik. Az ismert eljárásokkal szemben a találmány szerinti eljárás a pPR-IFNpi-13 plazmidban az IFNpl-gén 3 ’-nem-transzlatálható területében a transzkripció q-tól nem függő terminátora tandemének jelenlétét biztosítja, ami a plazmid DNS replikációja és a fibroblaszt-interferőn génje nagy hatékonyságú transzkripciója közötti interferenciát a P^promotor depressziója esetén megakadályozza.By constructing the recombinant plasmid pPR-IFNpI-13, which encodes a particularly long SD sequence of the lambda bacteriophage cro gene, which is encoded by the mature human interferon portion of the coliforms, known as E. coli matrix RNA, A hybrid region of the pi gene ribosome binding site is obtained which has the optimal primary and spatial structure of the 5 'end of the matrix RNA. In contrast to known methods, the method of the present invention provides for the presence of a tandem of the q -dependent transcriptional terminator in the 3 'untranslated region of the IFNβ1 gene in plasmid pPR-IFNβ1, which results in high levels of plasmid DNA replication and fibroblast interferon gene. interference with its efficient transcription in the case of depression of the? 1 promoter.

Az elmondottakon kívül a találmány egy Escherichia coli törzs, az Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) törzs előállítására is vonatkozik, amely emberi interferont termel, és amely a találmány szerinti pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid DNS-t tartalmazza, és amelyet genetikai utón, a pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid-DNS Escherichia coli baktériumba történő bevezetésével állítottunk elő, és 1987.Dl.12-én 1825 számon az Antibiotikum Kutatóintézet Mikroorganizmus- és Tenyészetgyüjteményében • « • ··♦ ··« « ' · . · · · · ···· •·· ·· ·♦· ·«· ·In addition to the foregoing, the present invention also relates to the production of an Escherichia coli strain, the Escherichia coli strain VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13), which produces human interferon and which contains the recombinant plasmid DNA pPR-IFNpi-13 according to the invention. , produced genetically by introduction of recombinant plasmid DNA, pPR-IFNβ-13 into Escherichia coli, and on December 12, 1987, in the Microorganism and Culture Collection of the Antibiotic Research Institute. «'·. · · · · · · · · · · · · · · · ·

- 10 helyeztünk letétbe.- 10 have been deposited.

A találmány szerinti törzs lehetővé teszi, hogy az emberi pi-interferont nagyipari körülmények között végzettThe strain of the invention allows human pi interferon to be performed under large-scale industrial conditions

Q tenyésztéssel állítsuk elő 2.10 egység/1 vagy ennél nagyobb kitermeléssel, ami megfelel a teljes sejtfehérje 5-10 %-ánakProduced by Q culture with a yield of 2.10 units / l or 5-10% of the total cellular protein

A találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kiviteli módjaThe most preferred embodiment of the process of the invention

A találmány szerinti pPR-IFNpl-13 rekombináns plazmid-DNS előállítása több lépésben történik.The preparation of the recombinant plasmid DNA pPR-IFNβ1-13 according to the invention is carried out in several steps.

Első lépésben egy pPR124B vektor-plazmidot állítunk elő.As a first step, a plasmid vector pPR124B is constructed.

Ehhez a pPR40 plazmidban (Molekularbiologie, 1987, 21. kötet, 5. (Moszkva), 1309-1321. oldal) a BglII restrikciós enzim felismerőhelyének területében Bal31 exonukleázzal deléciót hozunk létre.To do this, a deletion of the Bal31 exonuclease was made in the plasmid pPR40 (Molecular Biology, 1987, Vol. 21, Vol. 5, Moscow, pp. 1309-1321) at the recognition site of the BglII restriction enzyme.

így a pPRIOO jelű plazmidot kapjuk, amelyben aThus, plasmid pPR100, in which a

BamHI felismerőhelye közvetlenül a lambda-fág riboszóma kötőhelye után helyezkedik el, miáltal az iniciálandó AUG-kodonban a következő szekvencia képződik:The BamHI recognition site is located immediately downstream of the lambda phage ribosome binding site, resulting in the following sequence in the AUG codon to be initiated:

A^GATCC,N GATCC,

BamHIBam

Ezután szokásos géntechnikai módszerekkel a pPRIOO plazmid kisebbik Pstl-BamHI fragmensét a pML24 plazmid nagyobbik Pstl-BamHI fragmensével kapcsoljuk, és igy képződik a pPR124 plazmid, amelybe egy oligonukleotid-linker segítségével egy BglII restrikciós enzim felismerő helyet iktatunk be. így kapjuk a pPR124B plazmidot.Subsequently, the smaller PstI-BamHI fragment of plasmid pPR101 is ligated with the larger PstI-BamHI fragment of plasmid pML24 by conventional genetic engineering techniques to form plasmid pPR124, which is inserted into a BglII restriction site recognition site using an oligonucleotide linker. This gives plasmid pPR124B.

» · · · · · • · • · ♦ · « ·»· · · · ·•••••••••••

Ezután megalkotjuk a pPR-IFNpi-123 közbelső plazmidot.The intermediate plasmid pPR-IFNβ123 was then constructed.

A pPR124B plazmidot EcoRI és BglII restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, és a kapott vektor-molekula fragmensek közül a nagyobbikat EcoRI-Sau3A fragmenssel kapcsoljuk, amely a pINp-trp7 plazmidból az érett pi-interferon kódoló részét tartalmazza. így a pPR — IFN|51 -123 rekombináns közbelső plazmidot kapjuk.Plasmid pPR124B was cleaved with restriction endonucleases EcoRI and BglII, and the larger of the resulting vector molecule fragments was ligated with the EcoRI-Sau3A fragment, which contains the coding portion of the mature pi-interferon from plasmid pINp-trp7. Thus, the recombinant intermediate plasmid pPR-IFN? 51 -123 was obtained.

Ezután következik a harmadik lépés, amelynek során a pPR-IFNpi-13 plazmidot alkotjuk meg. Ehhez a ρPR-1FNJ51 — 123 plazmidban a cro-gén SD-szekvenciáját és a pi-interferin első kodonját közelítjük, amihez a plazmid-DNS-t BamHI restrikciós enzimmel hidrolizáljuk, a nukleotidok egy részét E.coli DNS-polimeráz I endonukleázzal eltávolítjuk, a DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, Sí endonukleázzal, majd a kettős lánc helyreállítása érdekében E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmense segítségével kezeljük, és a kapott lineáris DNS-molekulákat T4-fág DNS-ligázzal ciklizáljuk.Next, the third step involves constructing plasmid pPR-IFNβ-13. This involves approximating the SD sequence of the cogene in plasmid ρPR-1FNJ51 - 123 and the first codon of pi-interferin, to which the plasmid DNA is hydrolyzed with the restriction enzyme BamHI, and some of the nucleotides are removed by E. coli DNA polymerase I endonuclease, the DNA was digested with EcoRI restriction enzyme S1 endonuclease and then treated with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I to repair the double chain, and the resulting linear DNA molecules were cyclized with T4 phage DNA ligase.

A kapott preparátummal E.coli C600 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin-tartalmu táptalajon, 28 °C-on tenyésztjük, majd 42 °C-on csökkent növekedési sebességnél szelektáljuk. Az igy szelektált kiónokban a pPR-IFNpi-13 plazmid-DNS-t kifejezzük.The resulting preparation is used to transform E. coli C600 cells. Transformants were grown on ampicillin-containing medium at 28 ° C and then selected at 42 ° C at a reduced growth rate. Clones thus selected express plasmid pPR-IFNβ-13 DNA.

A találmány szerinti, Escherichia coli VNIIGENE1IKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) baktériumtörzset úgy állítjuk elő, hogy a befogadó törzset pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmiddal transzformáljuk, majd a rekombináns kiónokat ampicillint tartalmazó táptalajon 28 °C-on végzett tenyésztés után elvesz12 • ·· ···· · · •·· ·· *«· • »·· ··· · · · •ς. ·.' ...· .:. ··;· szűk, majd a transzformáns sejtek extraktumában a Pp promotor depressziója után a fibroblaszt pi-interferőn aktivitását meghatározva, amelyet a törzs 1-2 óra hosszat 42 °C-on végzett tenyésztésével érünk el.The bacterial strain of the present invention, Escherichia coli VNIIGENE1IKA VL 903 (pPR-IFN pi-13), was prepared by transforming the host strain with the recombinant plasmid pPR-IFN? lose12 • ·· ···· · · · ···································································································································································································· · ·. ' ... ·.:. ··; · Determination of the activity of fibroblasts on pi-interferon after depression of the Pp promoter in extract of transformant cells, which is achieved by culturing the strain for 1-2 hours at 42 ° C.

Befogadó törzsként E.coli C600-t vagy más, E.coliThe host strain is E.coli C600 or other E.coli

K12 származékot használhatunk.A K12 derivative may be used.

Az Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) törzs jellemzői a következők.The characteristics of Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) are as follows.

Morfológiai jellemzőkMorphological characteristics

A sejtek egyenes, pálcika alakú, (1,2-1,6) x (2,0-6,0) /um méretű, gyengén mozgó, fonalas képződményeket képző, Gram-negativ, spórát nem tartalmazó sejtek.Cells are straight, rod-shaped cells (1.2-1.6) x (2.0-6.0) / µm, which are poorly mobile, gram-negative, spore-free, forming filaments.

Tenyésztési jellemzőkBreeding characteristics

A sejtek jól növekszenek folyékony és szilárd vagy félszilárd, egyszerű szintetikus, félszintetikus vagy komplex tápközegeken. Hottinger-bouillon, illetve L-bouillon agáron növesztve nyálkás, kerek, gyengén matt kolóniákat képeznek. L-bouillon tipusu vagy kazaminsav-tartalmu M9 folyékony tápközegben tenyésztve homogén szuszpenziót képeznek.Cells grow well in liquid and solid or semi-solid, simple synthetic, semi-synthetic or complex media. Grown on Hottinger-bouillon and L-bouillon agar, they form mucus-like, round, poorly matte colonies. When grown in M9 liquid medium with L-bouillon type or casaminic acid, they form a homogeneous suspension.

Fiziológiai-biokémiai jellemzőkPhysiological-biochemical characteristics

A sejtek 5 és 40 °C közötti hőmérsékleten (az optimum 35 °C körüli), 6,7 és 7,5 pH között képesek növekedni. Szénforrásként aminosavakat és szinhidrátokat (például szacharózt) alkalmazunk. Nitrogénforrásként szervetlen sók például ammóniumsók vagy szerves vegyületek, például pepton, tripton, élesztőkivonat és aminosavak alkalmazhatók.Cells can grow at temperatures between 5 and 40 ° C (optimum around 35 ° C), pH 6.7 to 7.5. Carbon sources include amino acids and synhydrates (e.g., sucrose). As the nitrogen source, inorganic salts include ammonium salts or organic compounds such as peptone, tryptone, yeast extract and amino acids.

• ····«· ··· · « * »···«· • · · ··· ····· • · ···· «• · · · · · · · · · · · · · · · · · ···

- 13 Antibiotikumok elleni rezisztencia- 13 Antibiotic resistance

A törzs folyékony és agar tápközegeken tenyésztve legfeljebb 100 mg/1 ampicillinnel szemben rezisztens.The strain is resistant to ampicillin up to 100 mg / l when grown on liquid and agar media.

A plazmid stabilitásaStability of the plasmid

A sejteket agar tápközegen tárolva (legfeljebb hónapig), sorozatos átoltás esetén (legalább 6 hónapon belül) és folyékony, antibiotikumot tartalmazó tápközegben szubmerz eljárással tenyésztve veszteség nem figyelhető meg, és a plazmid nem alakul át.When cells are stored on agar medium (up to one month), serial passage (at least 6 months) and cultured in liquid antibiotic medium by submersion, no loss is observed and the plasmid is not transformed.

Az előállított Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pl-13) törzs az emberi fibroblaszt-jJl-interferont nagy hatásfokkal termeli, és ipari méretekben alkalmazható pi-interferőn előállítására.The Escherichia coli strain VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pl-13) produced is highly efficient in the production of human fibroblast-III interferon and can be used commercially for the production of pi interferon.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal, amelyekben bemutatjuk a találmány szerinti plazmid konstruálását, a törzs előállítását, és annak tenyésztését, továbbá az ábrákkal szemléltetjük.The present invention is illustrated by the following examples, which illustrate the construction of the plasmid of the invention, the construction of the strain, and the culture thereof, as well as the figures.

Az 1. ábra a pPR-IFNpl-13 rekombináns plazmid genetikai térképét mutatja.Figure 1 shows a genetic map of the recombinant plasmid pPR-IFNβ1-13.

A 2. ábra a találmány szerinti pPR-IFNpl-13 plazmid előállításának vázlatát mutatja.Figure 2 is a schematic diagram of the construction of the plasmid pPR-IFNβ1-13 according to the invention.

1. példaExample 1

A pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmidot (1. ábra) több lépésben állítjuk elő. Az első lépés a pPR124B vektor plazmid konstruálása.The recombinant plasmid pPR-IFNβ-13 (Figure 1) was constructed in several steps. The first step is the construction of the plasmid pPR124B vector.

Ehhez először a pPR124 plazmidot konstruáljuk a következőképpen. 3 yug pPR40 plazmid-DNS-t 60 ^ul pufferoldat• ·· ···· « · ·· · · · ,: ;To do this, plasmid pPR124 was first constructed as follows. 3 .mu.g of plasmid pPR40 DNA • ···· ·· 60 microliters of buffer solution "·· · · · ·,:;

• ··· ··· « « * β* * · · ···♦ ·♦* ·· ··· ·«« ,• ··· ··· «« * β * * · · ··· ♦ · ♦ * ·· ··· · ««,

- 14 bán (1. restrikciós puffer: 10 mmól/1 tris-HCl, pH=8,0, 6 mmól/1 MgC^, 6 mmól/1 2-merkapto-etanol, 150 mmól/1 NaCl) BglII restrikciós enzimmel hasítunk. A DNS-t kétszeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A csapadékot 20 yul vízben oldjuk. A DNS-t 3 percig 30 °C-on 30 /U1 pufferoldatban (3 mmól/1 NaCl, 60 mmól/1 CaC^, 60 mmól/1 MgC^, 100 mmól/1 tris-HCl, pH = 8,0, 5 mmól/1 étilén-diamin-tetraecetsav) Bal31 exonukleázzal kezeljük. A DNS-t kétszeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A csapadékot 10 ^ul vízben feloldjuk. A 30 ^ul térfogatú mintát, amelyet az 1. restrikciós pufferrel készítettünk, BamHI restrikciós enzimmel kezeljük. Az egyszálu 3’-vég E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmens segítségével történő kiegészítését 20 ^ul térfogatú mintában végezzük, amelynek összetétele: 10 mmól/1 tris-HCl, pH=8,0, 10 mmól/1 MgC^, yug DNS-preparátum, 30-30 yumól/1 minden dezoxi-ribonukleotid-trifoszfátból, és 5 egység enzim. A DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk és 100 /U1 vízben feloldjuk. A linearizált plazmid-DNS egyesítését 16 °C-on 12 óra alatt végezzük, T4-fág DNS-ligáz segítségével ligáló pufferoldatban (60 mmól/1 tris-HCl, pH=7,6, 10 mmól/1 MgC^, 10 mmól/1 2-merkapto-etanol, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfát), amely 1 yug DNS-t tartalmaz. Az előállított eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk.- 14 bar (restriction buffer 1: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6 mM MgCl 2, 6 mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl) was digested with BglII. . The DNA was precipitated with double volume ethanol. The precipitate was dissolved in 20 µl of water. DNA for 3 minutes at 30 ° C in 30 µl buffer (3 mM NaCl, 60 mM CaCl 2, 60 mM MgCl 2, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0). 5 mM ethylene diamine tetraacetic acid) treated with Bal31 exonuclease. The DNA was precipitated with double volume ethanol. The precipitate was dissolved in 10 µl of water. The 30 µl sample prepared with restriction buffer 1 is treated with BamHI. The single-stranded 3'-end was supplemented with a Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I in a 20 µl sample of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl ^. yug DNA preparation, 30-30 µM / l of each DNA and 5 units of enzyme. The DNA was precipitated from the reaction mixture with ethanol and dissolved in 100 µl of water. The linearized plasmid DNA was pooled at 16 ° C for 12 hours in phage T4 DNA ligase in ligated buffer (60 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2, 10 mM). 1-2-mercaptoethanol, 0.4 mmol / l adenosine triphosphate) containing 1 µg of DNA. The resulting mixture is used to transform E. coli C600 cells.

A transzformáció hatékonysága 5.106 kolóniáig terjed a natív pPR40 plazmid 1 yug-jára vonatkoztatva. Azokat a kiónokat választjuk ki, amelyek ampicillinnel (100 yug/1) szemben rezisztensek, ezekben a plazmid-DNS-t módosított Bimbóim és Doly módszerrel kifejezzük, és restrikciós analízisnekTransformation efficiency ranges from 5.10 to 6 colonies per liter of native plasmid pPR40. Clones that are resistant to ampicillin (100 µg / L) are selected, in which plasmid DNA is expressed by modified Bimbolim and Doly methods and is subjected to restriction analysis.

··· ·*·· vetjük alá. Eredményül a pPRIOO plazmidot kapjuk, amely unikális BamHI hasitóhelyet tartalmaz. Ezután elvégezzük a pPR124 plazmid konstruálását.··· · * ··. As a result, plasmid pPR100, which contains a unique BamHI site, is obtained. The plasmid pPR124 was then constructed.

Ehhez 2 yug pML24 plazmid DNS-t 40 yul 1. restrikciós pufferben BamHI és PstI restrikciós enzimmel hasítunk. Ezeket 0 °C-on, T4-fág DNS-ligáz segítségével azokkal a fragmensekkel egyesitjük, amelyeket a pPR 100 plazmid BamHI és PstI enzimekkel végzett hasításával nyertünk. A kapott DNS-preparátummal E.coliCéOO sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó táptalajon majd 300 /ug/1 kloramfenikolt tartalmazó táptalajon a Cmr-klónok szelekciójával, 42 °C-on végzett tenyésztéssel választjuk ki. Az igy kiválasztott klónokból a plazmid-DNS-t elválasztjuk, és restrikciós analízissel megvizsgáljuk. Eredményül a pPR124 plazmidot kapjuk, amely egy unikális BamHI hasitóhelyet tartalmaz. Ezután 2 yug pPR124 plazmid-DNS-t 70 /U1 1. restrikciós pufferoldatban (10 mmól/1 tris-HCl, pH=7,9, 6 mmól/1 MgC12, 6 mmól/1 2-merkapto-etanol és 150 mmól/1 NaCl) Xbal restrikciós enzimmel hasítunk. A DNS-t kétszeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A csapadékot 15 /U1 vízben feloldjuk. Az egyszálu DNS 3’-végének helyreállítását E.coli DNS-polimeráz Klenow-fragmens segítségével 20 ^ul térfogatú pufferoldatban végezzük, amely 10 mmól/1 tris-HCl, pH=8,0.For this, 2 µg of plasmid pML24 DNA was cleaved with 40 µl of restriction enzyme BamHI and PstI in restriction buffer 1. These were combined at 0 ° C with the fragments obtained by digestion of plasmid pPR 100 with BamHI and PstI using phage T4 DNA ligase. The resulting DNA preparation is used to transform E.coliCeOO cells, the transformants are selected on medium containing ampicillin and then 300 µg / L chloramphenicol by selection of Cm r clones at 42 ° C. Plasmid DNA was isolated from the clones thus selected and analyzed by restriction analysis. As a result, plasmid pPR124 is obtained, which contains a unique BamHI site. 2 µg of plasmid pPR124 DNA were then added in 70 µl restriction buffer 1 (10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 6 mM MgCl 2, 6 mM 2-mercaptoethanol and 150 mM). (NaCl) was cleaved with XbaI. The DNA was precipitated with double volume ethanol. The precipitate was dissolved in 15 µl of water. Restoration of the 3 'end of single-stranded DNA was performed using a Klenow fragment of E. coli DNA polymerase in 20 µl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0.

mmól/1 MgC^, 2 /Ug DNS-készitmény, 30-30 yumól/l dezoxi-ribonukleotid-trifoszfát és 5 egység enzim összetételű.mM DNA, 2 µg DNA, 30-30 µM DNA, and 5 units enzyme composition.

A DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, és 100 yul vízben feloldjuk. A linearizált plazmid-DNS BglII-linker segítségével végzett egyesítését 16 °C-on 12 óra alatt végezzükThe DNA was precipitated from the reaction mixture with ethanol and dissolved in 100 µl of water. Ligation of the linearized plasmid DNA using the BglII linker was performed at 16 ° C for 12 hours.

T4-fág DNS-ligáz segítségével ligáié pufferoldatban (60 mmól/1 tris-HCl, pH=7,6, 10 mmól/1 MgCl2, 10 mmól/1 2-merkapto-etanol, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfát, 2 yug plazmid-DNS, 0,5 yug linker).Using phage T4 DNA ligase ligated buffer (60 mmol / 1 Tris-HCl, pH 7.6, 10 mmol / 1 MgCl2, 10 mmol / 1 2-mercaptoethanol, 0.4 mmol / 1 ATP , 2µg plasmid DNA, 0.5µg linker).

A ligálás után a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, feloldjuk, és BglII restrikciós enzimmel hidrolizáljuk 40 yul térfogatú oldatban, amely a 2. restrikciós puffért tartalmazza (60 mmól/1 tris-HCl, pH=7,6, 6 mmól/1 MgCl2, 6 mmól/1 2-merkapto-etanol, 50 mmól/1 NaCl). A DNS-t újból kicsapjuk etanollal, feloldjuk, és ciklizáljuk, amihez 1 /ug plazmid-DNS preparátumot 240 yul ligáló pufferoldatban T4-fág DNS-ligázzal kezelünk. Az előállított eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk. A transzformálás hatékonysága 5.10^ kolóniát eléri 1 ^ug natív pPR124 plazmidra vonatkoztatva. Azokat a kiónokat választjuk ki, amelyek ampicilinnel szemben (100 yug/l) rezisztensek, ezekből a plazmid-DNS-t a módosított Bimbóim és Doly módszerrel kiválasztjuk, és restrikciós analízisnek vetjük alá. Eredményül a pPR124B plazmidot kapjuk, amely a kiindulási pPR124 vektortól eltérően egy unikális BglII hasítási helyet tartalmaz az Xbal felismerőhely helyett (2. ábra).After ligation, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved, and hydrolyzed with BglII in 40 µl solution containing restriction buffer 2 (60 mM Tris-HCl, pH 7.6, 6 mM). MgCl 2 , 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl). The DNA is again precipitated with ethanol, dissolved and cyclized by treatment with 1 µg of plasmid DNA preparation in 240 µl of ligation buffer with phage T4 DNA ligase. The resulting mixture is used to transform E. coli C600 cells. Transformation efficiency is 5.10 µg per µg native plasmid pPR124. Clones that are resistant to ampicillin (100 µg / L) are selected, and plasmid DNA is selected from them by the modified Bimbolim and Doly method and subjected to restriction analysis. As a result, plasmid pPR124B is obtained which, unlike the parent vector pPR124, contains a unique BglII site instead of the XbaI recognition site (Figure 2).

Második lépés: pPR-IFNpi-123 közti plazmid konstruálásaStep Two: Construction of pPR-IFNβ1-123 Plasmid

A pPR124B vektorba a pIN{5-trp7 plazmidból az emberi fibroblaszt-interferőn kódoló szekvenciáját integráljuk. Ehhez 10 ^ug pINp~trp7 DNS-t EcoRI és Sau3A restrikciós enzimekkel együtt 100 yul mintában kezelünk, amely 2. restrikciós puffért tartalmaz. Az előállított preparátumot 1,1 %-os köny• « *·4« ·· ···· • · • · · · ··· ·♦ ··· ···The vector encoding the human fibroblast interferon sequence from plasmid pIN {5-trp7 is integrated into pPR124B. To do this, 10 µg of pINp-trp7 DNA, together with restriction enzymes EcoRI and Sau3A, were treated in 100 µl sample containing restriction buffer 2. The preparation was prepared with 1.1% readily. ········································································•

- 17 nyen olvadó agarőz gélre visszük, és tris-acetát-puffer-rendszerben elektroforézisnek vetjük alá. A gél egy csíkját, amely 510 bázispár hosszúságú DNS-fragmenst tartalmaz, kivágjuk, és a DNS-t a gélről eluáljuk. Az igy előállított DNS-fragmenst (kb. 1 /ug) a pPR124B plazmidba integráljuk. Ehhez 1 yug pPR124B DNS-t EcoRI és BglII restrikciós enzimmel 20 yul,- Transfer onto 17 melting agar vapor gels and electrophoreses in tris-acetate buffer system. A band of the gel containing a 510 bp DNA fragment was excised and the DNA eluted from the gel. The DNA fragment thus produced (about 1 µg) was integrated into plasmid pPR124B. For this, 1 µg of pPR124B DNA with EcoRI and BglII was added at 20 µl,

2. restrikciós puffért tartalmazó mintában hasítunk. Az előállított preparátumot fenolos fehérjementesitésnek vetjük alá, a DNS-t etanollal kicsapjuk, és 10 yul vízben oldjuk. 0,5 yug hasított pPR124B DNS-t 1 ^ug kivágott pINptrp7 plazmid-fragmenssel egyesítünk, és T4-fág DNS-ligázzal kezeljük 30 /Ul, ligáló puffért tartalmazó mintában. Az előállított DNS preparátummal E.coli C600 sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó táptalajon, majd 200 yug/1 klóramfenikolt tartalmazó táptalajon a Cm -kiónok szelekciójával, 42 °C-on végzett tenyésztéssel választjuk ki. Az igy kiválasztott klónokból a plazmid-DNS-t elválasztjuk, és restrikciós analízisnek vetjük alá. Az előállított plazmidban az EcoRI-BglII framenst, amely a pPR124B vektorban a kloramfenikol-eti1-transzferáz C-terminális területét kódolja, az érett emberi pl-interferőn kódoló szekvenciájával helyettesítjük. Ezt a plazmidot pPR-IFNpi-123 jellel jelöljük, és a konstruálás következő lépcsőjében alkalmazzuk.2) in a sample containing restriction buffer. The preparation was subjected to phenol deprotection, the DNA was precipitated with ethanol and dissolved in 10 µl of water. 0.5 µg of cleaved pPR124B DNA was combined with 1 µg of the excised plasmid pINptrp7 fragment and treated with phage T4 DNA ligase in a 30 µl sample containing ligation buffer. The resulting DNA preparation is used to transform E.coli C600 cells, the transformants are selected on culture medium containing ampicillin and then cultured at 42 ° C in medium containing 200 µg / l chloramphenicol. Plasmid DNA was isolated from the clones thus selected and subjected to restriction analysis. In the resulting plasmid, the EcoRI-BglII framework, which encodes the C-terminal region of chloramphenicol ethyl1-transferase in the pPR124B vector, is replaced by its mature human p1 interferon coding sequence. This plasmid is designated pPR-IFNβ1-123 and used in the next step of construction.

Harmadik lépés: a ρPR-1FN|51 -13 plazmid konstruálása 30 yug pPR-IFNpi-123 plazmid-DNS-t BamHI restrikciós enzimmel hasítunk 150 /U1 1. restrikciós pufferoldatban, a DNS-t fenollal proteinmentesitjük, és etanollal kicsapjuk. A csapadékot 40 ^ul vízben feloldjuk. A DNS korlátozott deg• · ·*«· • ·♦ ···· · ·* · · · ·· • ··· ··« · • · · · ··· ·· ··· ···Step Three: Construction of Plasmid ρPR-1FN? 51 -13 30 µg of plasmid pPR-IFNpI-123 were digested with restriction enzyme BamHI in 150 µl restriction buffer 1, the DNA was deprotected with phenol and precipitated with ethanol. The precipitate was dissolved in 40 µl of water. The DNA has limited deg • · · * • ♦ ♦ ♦ · · · ♦ ♦ ♦ ♦ «« «« · ·

- 18 radációja érdekében, amelyet E.coli DNS-polimeráz I exonukleázzal 3’--->5’ irányban végzünk, a kapott DNS-preparátumot 150 /U1 térfogatú mintában inkubáljuk, amely 50 mmól/1 tris-HCl-t (pH = 8,0), 10 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsavat, 5 mmól/1 MgC^-t, 100 yumól/1 dezoxi-adenozin-trifoszfátot (majd dezoxi-guanozin-foszfátot) és 20 egység DNS-polimerázt tartalmaz. A reakciót leállítjuk, a DNS-t kicsapjuk, és a csapadékot 40 yul vízben feloldjuk. 10 /ug előállított preparátumot EcoRI restrikciós enzimmel kezelünk 50 /Ul, 2. restrikciós puffért tartalmazó mintában, fenolos proteinmentesitést, majd etanolos kicsapást végzünk, és a csapadékot 30 /U1 vízben oldjuk.- For 18 radiations with E. coli DNA polymerase I exonuclease in the 3 'to> 5' direction, the resulting DNA preparation was incubated in a 150 µl sample containing 50 mM Tris-HCl (pH = 8.0), 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 5 mM MgCl 2, 100 μM deoxyadenosine triphosphate (then deoxy guanosine phosphate) and 20 units DNA polymerase. The reaction was stopped, the DNA was precipitated, and the precipitate was dissolved in 40 µl of water. 10 µg of the prepared preparation was treated with EcoRI restriction enzyme in 50 µl sample containing restriction buffer 2, phenol deprotection followed by ethanol precipitation and the precipitate was dissolved in 30 µl water.

Az előállított DNS-preparátum egyszálu szakaszainak eltávolítását Sl-endonukleáz segítségével végezzük 100 yul térfogatú mintában, amely 30 mmól/1 nátrium-acetátot (pH=4,4),The single-stranded sections of the prepared DNA preparation were removed using a S1 endonuclease in a 100 µl sample containing 30 mM sodium acetate (pH 4.4),

4,5 mmól/1 ZnSO^-t, 250 mmól/1 NaCl-t, 10 yug DNS-t és 200 egység Sl-endonukleázt tartalmaz. A reakciót 20 °C-on hajtjuk végre, majd az elegyet fenolos kezelésnek vetjük alá, és a nukleinsavat etanollal kicsapjuk. A csapadékot 20 /U1 vízben feloldjuk. 4 yug igy előállított DNS-t E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmenssel kezelünk a fent ismertetett körülmények között az esetleg jelenlevő egyszálu végek feltöltése érdekében. A reakciót proteinmentesitéssel leállítjuk, a nukleinsavat etanollal kicsapjuk és 20 ^ul vízben feloldjuk.Contains 4.5 mM ZnSO4, 250 mM NaCl, 10 µg DNA and 200 units S1 endonuclease. The reaction was carried out at 20 ° C, then the mixture was subjected to phenol treatment and the nucleic acid was precipitated with ethanol. The precipitate was dissolved in 20 µl of water. 4 µg of the thus prepared DNA were treated with the E. coli DNA polymerase I Klenow fragment under the conditions described above to fill any single-stranded ends that may be present. The reaction is stopped by deprotection, the nucleic acid is precipitated with ethanol and dissolved in 20 µl of water.

A kétszálu végekkel rendelkező lineáris DNS-molekulák ligálását 16 °C-on 50 /U1 térfogatban végezzük, amelynek összetétele: 60 mmól/1 tris-HCl (pH=7,6), 10 mmól/1 MgCl?, 10 mmól/1 ditiotreitol, 4 mmól/1 adenozin-trifoszfát, 8 tömeg% ·· ··*· • · ·*♦ «·· • · ··♦· ·« *♦· ·· ··» *«·The ligation of the double-stranded linear DNA molecules was carried out at 16 ° C in a volume of 50 µl of 60 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol. , 4 mmol / l adenosine triphosphate, 8 wt% ···················································•

- 19 polietilén-glikol 6000, 4 yug DNS és 100 egység T4-fág DNS-ligáz. A reakció befejezése után az elegyet négyszeresére hígítjuk, a nukleinsavakat etanollal kicsapjuk, 2 yug vízben feloldott DNS-t 30 ^ul 2. restrikciós pufferben BglII restrikciós enzimmel kezelünk, a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, vízben feloldjuk, és 200 yul ligáló puffer oldatban T4-fág DNS-ligázzal ligáljuk. A kapott DNS-preparátumot E.coliC600 sejtek transzformálására használjuk a fenti módon, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó táptalajon 24 óra hosszat 28 °C-on végzett tenyésztéssel választjuk ki. A kapott transzformánsok közül azokat a variánsokat választjuk ki, amelyek 42 °C-on csökkent növekedési sebességet mutatnak. Ezekből a kiónokból a plazmid DNS-t a fenti módon kiválasztjuk és restrikciós analízisnek vetjük alá.19 polyethylene glycol 6000, 4 µg DNA and 100 units of T4 phage DNA ligase. After completion of the reaction, the mixture is diluted four-fold, the nucleic acids are precipitated with ethanol, 2 µl of DNA dissolved in water are treated with 30 µl of restriction enzyme BglII, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved in 200 µl of ligation buffer. in ligation with phage T4 DNA ligase. The resulting DNA preparation was used to transform E.coliC600 cells as described above, and the transformants were selected by culturing on ampicillin-containing medium for 24 hours at 28 ° C. From the resulting transformants, variants are selected which show a reduced growth rate at 42 ° C. From these clones, plasmid DNA was selected as described above and subjected to restriction analysis.

Az igy előállított pPR-IFNpi-13 plazmidban az IFNpi gén előtti riboszóma kötőhely hibrid területének a primer szerkezete előállításához 30 yug megfelelő DNS-t Hindii restrikciós enzimmel kezelünk 100 ^ul 2. restrikciós pufferoldatban, a preparátumot 4-12 % poliakrilamidgél gradiensre visszük fel, és tris-acetát-pufférrendszerben elektroforézisnek vetjük alá. A 190 bázispár hosszúságú DNS-fragmenseket Maxam-Gilbert-módszerrel eluáljuk, és a linearizált pPR124 plazmidra a fent ismertetett, a BglII-linker hozzákapcsolási eljárásához hasonló módon T4-fág DNS-ligáz segítségével hozzákötjük a BamHI-linkért. A DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, a csapadékot 20 yul vízzel feloldjuk, és BamHI restrikciós enzimmel 30 yulIn the thus produced plasmid pPR-IFNβ-13, 30 µg of the appropriate DNA was prepared by digestion with 30 µl of restriction enzyme HindIII in 100 µl of restriction buffer 2, prepared on a 4-12% polyacrylamide gel gradient to generate the primary structure of the hybrid region of the ribosome binding site of the IFNβ gene. and subjected to electrophoresis in a tris-acetate buffer system. The 190 bp DNA fragments were eluted by the Maxam-Gilbert method and ligated to the linearized plasmid pPR124 in a similar manner to the BglII linker described above using phage T4 DNA ligase. The DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, the precipitate is dissolved in 20 µl of water and 30 µl of BamHI

1. restrikciós pufferoldatban hasítjuk, a DNS-t fenollal • · ···· • ·*· ··* · * · · · ·*· ·· ··· ·«·Cleavage buffer 1, DNA with phenol · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

- 20 proteinmentesitjük, etanollal ismét kicsapjuk és vízben feloldjuk.It is deprotected, precipitated again with ethanol and dissolved in water.

A BamHl hasítással kapott DNS-fragmens és az M13mpl0 bakteriofág DNS-replikativ formájának molekuláris klónozása, a rekombináns fágok 5’-bróm-4-klór-3’-indolil-p-D-galaktozidot tartalmazó indikátortáptalajon végzett szelekciója, az egyszálu fág-DNS kifejezése és a klónozott fragmensek primer szerkezetének meghatározása korlátozott mátrix-kópiák segítségével (F.Senger-módszer) a standard módszerekkel történik.Molecular cloning of the DNA fragment obtained by BamHI digestion and the DNA replicative form of bacteriophage M13mpl0, selection of recombinant phages on indicator medium containing 5'-bromo-4-chloro-3'-indolyl-β-galactoside, expression of single-stranded phage DNA the primary structure of cloned fragments is determined by limited matrix copies (F.Senger's method) by standard methods.

A riboszóma kötőhely hibrid szakaszának nukleotid szekvenciája a pPR-IFNpl-13 plazmidban a Senger-módszer szerint:Nucleotide sequence of the hybrid sequence of the ribosome binding site in pPR-IFNp1-13 according to the Senger method:

5’-...TAAGGAGGTTGGATG...-3’, ahol a TAAGGAGGT a lambda-fág cro-génjének SD-szekvenciája, és ATG a p-l-interferőn metionin-kódja.5 '-... TAAGGAGGTTGGATG ...- 3', wherein TAAGGAGGT is the SD sequence of the phage gene of the lambda phage, and ATG is the methionine code for interferon p-1.

2. példaExample 2

Az emberi fibroblaszt-pl-interferont termelő Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) törzset a következőképpen állítjuk elő.The human fibroblast-β1 interferon-producing strain VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) is produced as follows.

A pPR-IFNpi-13 plazmidot, amely az emberi fibroblaszt interferont kódolja, az 1. példa szerinti módon E. coli VNIIGENETIKA VL 903 törzsbe transzformáljuk. Az említett törzset VKPM B-3546 szám alatt deponáltuk az Üsszövetségi Genetikai Kutatóintézet Ipari Mikroorganizmusok Gyűjteményénél .Plasmid pPR-IFNβ-13 encoding human fibroblast interferon was transformed into E. coli strain VNIIGENIKA VL 903 as in Example 1. Said strain was deposited under VKPM B-3546 at the Federal Institute for Genetics Research, Collection of Industrial Microorganisms.

Az E.coli VNIIGENETIKA VL 903 sejtek transzformálásának hatékonysága mintegy 10^ klón 1 yug natív pPR-IFNpi-13 plazmid-DNS-re számítva. A transzformánsokat olyan táptalajról vesszük, amely 100 yug/1 ampicillint tartalmaz, és a ·♦ » · ··♦*··* • *····· · • · · · ·♦· ·· ··· ···Transformation efficiency of E. coli VNIIGENETIKA VL 903 cells is about 10 µg clone per 1 µg of native pPR-IFNβ-13 plasmid DNA. Transformants are obtained from medium containing 100 µg / l of ampicillin and the medium containing 100 µg / l of ampicillin.

- 21 tenyésztés 24 óra hosszat 28 °C-on történt. A kiválasztott klónokból izoláljuk a plazmid-DNS-t, és pPR-IFNpl-13 DNS-preparátumokkal való azonosságukat restrikciós-analízissel igazoljuk. így kapjuk az E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN P1-13) törzset.- 21 cultures for 24 hours at 28 ° C. Plasmid DNA was isolated from the selected clones and their identity to pPR-IFNβ1-13 DNA preparations was confirmed by restriction analysis. This gives E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN P1-13).

Az E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN {Jl-13) törzs produktivitásának meghatározására a plazmidot tartalmazó sejteket 28 °C-on 50 /ug/ml ampicillint tartalmazó standard Hottinger-tápközeges ferde agaron 14 óra hosszat tenyésztjük. A ferde felületen kapott biomasszát inokulumként alkalmazzuk. A sejteket 750 ml-es Erlenmeyer-lombikokba visszük át, amelyek 100 /ug/ml ampicillint tartalmazó 100 ml Hottinger-tápközeget tartalmaznak, és 28 °C-on, 240 ford/perc sebességgel, 6 óra hosszat rázatva tenyésztjük. Az inokulum optikai sűrűsége 1,5-2,5 egység.To determine the productivity of E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN {J-13), plasmid containing cells were cultured at 28 ° C on standard Hottinger's medium inclined agar containing 50 µg / ml ampicillin for 14 hours. The biomass obtained on the inclined surface is used as an inoculum. Cells were transferred to 750 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml Hottinger's medium containing 100 µg / ml ampicillin and cultured at 28 ° C at 240 rpm for 6 hours. The optical density of the inoculum is 1.5-2.5 units.

A fermentációt pH-, hőmérséklet-, keverési sebesség és levegőztetés szabályozó rendszerrel ellátott fermentorban végezzük. A fermentálást 100 yug/ml ampicillint és 10 yug/1 glükózt tartalmazó Hottinger-tápközegen végezzük. Az inokulumot 5-10 tömeg% mennyiségben adagoljuk. A tenyésztést 6,6-6,8 pH-értéknél végezzük, és ezt ammónium-hidroxid-oldat adagolásával fenntartjuk. A fermentálás első részét 28 °C-on, az 550 nm-nél mért 3,5 optikai sűrűségértékig folytatjuk, majd a hőmérséklet 5 percig tartó 42-45 °C-ra emelésével termoindukálást végzünk, majd a fermentálást ugyanazon a hőmérsékleten folytatjuk 2 óra hosszat.The fermentation is carried out in a fermentor equipped with a pH, temperature, agitation and aeration control system. Fermentation is performed on Hottinger's medium containing 100 µg / ml ampicillin and 10 µg / l glucose. The inoculum is added in an amount of 5-10% by weight. The culture was carried out at pH 6.6-6.8 and maintained by the addition of ammonium hydroxide solution. The first part of the fermentation was continued at 28 ° C to 3.5 optical density at 550 nm, then thermoinduced by raising the temperature to 42-45 ° C for 5 minutes and then continued at the same temperature for 2 hours. .

Az eljárás befejezése után az interferon-sejteket az aktivitás meghatározása érdekében 1 ml tenyészléből ··At the end of the procedure, interferon cells were determined from 1 ml of culture broth to determine activity.

- 22 centrifugálással kicsapjuk, a csapadékot 1 ml, 1 %-os nátrium-dodecilszulfátot és 1 % 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,02 mól/l-es foszfát-puffer-oldatban 7,2-es pH-nál ujraszuszpendáljuk, és 2-4 percig 100 °C-on melegítjük. Ezután a csapadékot lecentrifugáljuk, és a felüluszó interferon-tartalmát standard módszerrel, illetve az emberi diploid fibroblaszt sejtek vezikuláris stomatitis vírus citopatologikus hatásától megvédve vagy immun-ferment-analizis módszerrel határozzuk meg. Standardként [3-interferon-preparátumot (Torey, Japán) alkalmazunk, amelyet a leukocita-interferon B 69/19 (Nagy-Britannia) szabvány szerint titrálunk.- precipitated by centrifugation at 22, resuspended in 1 ml of 0.02 M phosphate buffer solution containing 1% sodium dodecyl sulphate and 1% 2-mercaptoethanol at pH 7.2, and Heat at 100 ° C for 2-4 minutes. The precipitate was then centrifuged and the supernatant interferon content was determined by standard methods, either by protection against the cytopathological effect of vesicular stomatitis virus in human diploid fibroblast cells or by immuno-enzyme analysis. [3-interferon preparation (Torey, Japan), which is titrated to leukocyte interferon B 69/19 (UK), is used as a standard.

A meghatározás különböző módszerei szerint az emberi fibroblaszt interferon aktivitása, amelyet az E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN J51-13) sejtek szintetizálnak,According to different assays, the activity of human fibroblast interferon synthesized by E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN J51-13) cells,

2.10 nemzetközi egység fölött van.2.10 above international units.

A teljes sejtfehérjére vonatkoztatott szintetizált fibroblaszt-interferőn meghatározását úgy végezzük, hogy 1 ml tenyészlét centrifugálással kicsapunk, a fenti módon kezelünk, a preparátumot 1,0 % nátrium-dodecilszulfát jelenlétében 15 %-os poliakrilamid-gélen elektroforézissel elválasztjuk, és R-250 Serva (NSzK) Kumassi-oldatban standard módszerrel megfestjük. A zónák kvantitatív fehérjetartalmát automata lézer-denzitométerrel letapogatva határozzuk meg. A sejtekben szintetizált érett fibroblaszt-interferonnak (19kD) megfelelő zónák azonosítását a marker-proteinek elektroforetikus mozgékonyságával történő összehasonlítással, valamint az elválasztott fehérjefrakciók nitrocellulóz- 23 • t · ··« ·· ···· • · ··· ··· • · *· ···Determination of synthesized fibroblast interferon relative to whole cell protein was performed by precipitation of 1 ml of culture broth by centrifugation, treatment as described above, separation of the preparation in 1.0% sodium dodecyl sulfate on 15% polyacrylamide gel and electrophoresis on R-250. NSK) Stained in Kumassi's solution by standard method. The quantitative protein content of the zones is determined by scanning an automatic laser densitometer. Identification of zones corresponding to mature fibroblast interferon (19kD) synthesized in cells by comparison with the electrophoretic mobility of the marker proteins and nitrocellulose-separated protein fractions. · * · ···

-szűrőn történő immunfolt-meghatározásával végezzük, és a szűrőket p-interferon elleni monoklonális egér antitestet és anti-egér-nyul-antitestet tartalmazó oldatban dolgozzuk fel, amelyek tormából nyert peroxidázzal vannak konjugálva.immunoprecipitated on a strainer and processed in a solution containing monoclonal mouse antibody and anti-mouse rabbit antibody to interferon-β, conjugated to horseradish peroxidase.

A megfelelő festés után az interferon-zónák sötétbarna csikként jelentkeznek a nitrocellulóz szűrő meg nem festett hátterén.After proper staining, the interferon zones appear as a dark brown streak on the unpainted background of the nitrocellulose filter.

A zóna fehérjetartalma, amely a pi-interferonnak felel meg, mintegy 10 % az E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13) plazmidtartalmu sejtek teljes sejtfehérjéjére vonatkoztatva.The protein content of the zone, which corresponds to interferon pi, is about 10% of the total cellular protein of E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pi-13).

Ipari alkalmazhatóságIndustrial applicability

A találmányi eljárással előállított rekombináns pPR-IFN pi-13 plazmid-DNS, amely az emberi fibroblaszt pl-interferont kódolja, emberi pl-interferont nagy aktivitással termelő sejtek előállításához alkalmazható.The recombinant pPR-IFN pi-13 plasmid DNA produced by the method of the invention, which encodes human fibroblast P1 interferon, can be used to produce cells that produce high levels of human P1 interferon.

A találmány szerinti eljárással előállítottPrepared by the process of the invention

Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pl-13) baktériumtörzs, amely emberi interferont termel, a mikrobiológiai és gyógyszeriparban emberi pi-interferőn előállítására használható, amely a gyógyászatban alkalmazható.Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pl-13) bacterial strain, which produces human interferon, can be used in the microbiological and pharmaceutical industry for the production of human pi interferon for use in medicine.

Claims (3)

1. Rekombináns pPR-IFNpi-13 plazmid-DNS, amely az emberi fibroblaszt-pi-interferont kódolja, azzal jellemezve, hogy 3,9 ezer bázispárból áll, és a következő elemeket tartalmazza:CLAIMS 1. A recombinant plasmid DNA, pPR-IFNβ-13 encoding human fibroblast pi interferon, characterized in that it consists of 3.9 thousand base pairs and comprises the following elements: - pPR124B vektor-plazmid 3,4 ezer bázispár nagyságú BamHI-BglII fragmens, amely pPR40 és pML23 plazmidokból készült ,- the vector plasmid pPR124B, a 3.4 thousand bp BamHI-BglII fragment, made from plasmids pPR40 and pML23, - pINp-trp 7 plazmid 510 bázispár nagyságú EcoRI-Sau3A-fragmense, amely a következő jellemzőkkel jellemezhető :510 bp EcoRI-Sau3A fragment of plasmid pINp-trp 7, which has the following characteristics: - egy olyan szakaszt tartalmaz, amely a replikáció bevezetéséért és szabályozásáért felelős, továbbá Col El-rep- p- includes a section responsible for introducing and regulating replication, and Col El-rep likont, a lambda-fág olts 857 represszor génjét, Ap ampicillin rezisztencia gént, az fd-fág transzkripciója terminátorának q-tól független tandemjét, a lambda cro-gén PR0R regulator területét és SD-szekvenciáját, amely a saját metionin-kodont tartalmazó emberi érett IFNpi-fibroblaszt-interferont kódolja,lycda, the lambda phage inactivated 857 repressor gene, the Ap ampicillin resistance gene, the q-independent tandem of the fd phage transcription terminator, the P R 0 R regulator region of the lambda cro gene and its own methionine codon containing human mature IFNβ1 fibroblast interferon, - a cro-gén regulator területének kapcsolását, amely a pl-interferőn kódoló területét és az fd-fág transzkripció terminátorát kódolja, úgy végezzük, hogy az IFNpl-gén előtt egy hibrid riboszóma kötőhely szakaszt hozunk létre, amelynek nukleotid-szekvenciája:- linking the regulatory region of the cRO gene, which encodes the p1 interferon coding region and the transcription terminator of the fd phage, by constructing a hybrid ribosome binding site region before the IFNβ1 gene having the nucleotide sequence: 5’-. ..TAAGGAGGTTGGATG. . .-3’, amelyben TAAGGAGGT a lambda-fág cro-génjének SD-szekvenciája, ATG pedig az inter25 férőn metionin-kodonja, és az IFNpi-gén zárókodonja után közvetlenül egy, az fd-fág transzkripció q-tól független terminátor tandemje helyezkedik el,5 '. ..TAAGGAGGTTGGATG. . .-3 ', in which TAAGGAGGT is located in the SD sequence of the lambda phage cro gene, and ATG is located after the methionine codon on the inter25 site and the tandem of the qd-independent terminator of the fd phage transcription, . - unikális Clal felismerőhelyet tartalmaz, ahol a koordináta a leolvasás kezdetét (p), PvuII 1110), BglII 1480), Acél (^ 1870), Pvul (^ 3360) jelenti, és 1987. 01. 12-én az Antibiotikum Kutatóintézet Mikroorganizmus- és Tenyészetgyüjteményénél 1825 számon letétbe helyeztük .- contains a unique Clal recognition site, where the coordinates represent the beginning of the reading (p), PvuII 1110), BglII 1480), Steel (^ 1870), Pvul (^ 3360), and on 01.01.1987, the Microorganism Research Institute and was deposited with his Breed Collection under number 1825. 2. Eljárás az 1. igénypont szerinti pPR-IFNpl-13 rekombináns plazmid-DNS előállítására, azzal jellemezve hogy a pPR40 és pML24 plazmidból előállított pPR124B vektor-plazmidot EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel hasítjuk, a EcoRI-Sau3A vektor-molekula kapott fragmenseinek nagyobbikát pIN trn 7 plazmid fragmensén keresztül, amely az érett pl-interferőn kódoló területét tartalmazza, kapcsoljuk, az igy kapott pPR-IFNpl-123 rekombináns plazmidban a cro-gén SD-szekvenciáját és a pi-interferőn első (metionin) kodonját közelítjük, ehhez a plazmid-DNS-t BamHI restrikciós enzimmel hidrolizáljuk, a nukleotidok egy részét E.coli DNS-polimeráz I segítségével eltávolítjuk, amely a reakcióelegyben a nukleozid-trifoszfát nem teljes adagja körülményei között előkerül, a DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel fermentativ utón hasítjuk, a DNS egyszálu szakaszainak eltávolítására Sl-endonukleázzal kezelve, majd E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmens segítségével helyreállítjuk, a kapott lineáris DNS-molekulákat T4 fág DNS-ligázzal ciklizáljuk, a kapott preparátummal E.coli C600 sej···· ··. :β·· ··· ··· • · ·· ··· teket transzformálunk, a transzformánsokat a sejtek ampicillint tartalmazó tápközegen, 28 °C-on végzett tenyésztése és a 42 °C-on csökkent növekedési sebességet mutató klónok kiválogatása utján kiválogatjuk, majd a kiválasztott kiónokból a pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid-DNS-t elválasztjuk.2. A method for generating recombinant plasmid DNA pPR-IFNp13 according to claim 1, characterized in that the plasmid pPR124B produced from plasmids pPR40 and pML24 is cleaved with the restriction enzymes EcoRI and BglII, the larger fragments of the resulting vector EcoRI-Sau3A being pIN. Through the fragment of plasmid trn 7, which contains the coding region for the mature p1 interferon, the SD sequence of the cogene and the first (methionine) codon of the pi interferon are approximated in the resulting recombinant plasmid pPR-IFNp1 123. DNA is hydrolyzed with BamHI restriction enzyme, a portion of the nucleotides are removed using E. coli DNA polymerase I, which is recovered in the reaction mixture under incomplete conditions of the nucleoside triphosphate, and digested with EcoRI restriction enzyme. to remove single-stranded sections by treatment with S1 endonuclease followed by E. coli DNA polymerase I Klenow fra , the resulting linear DNA molecules were cyclized with phage T4 DNA ligase to produce the resulting E. coli C600 cell ···· ··. : β ········· · ··························································································································· · · and then separating the recombinant plasmid DNA pPR-IFNβ-13 from the selected clones. 3. Emberi 31-interferont termelő Escherichia coli3. Escherichia coli producing human 31 interferon VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN pl-13) baktériumtörzs, amely az 1. igénypont szerinti pPR-IFNpi-13 rekombináns plazmid-DNS-ΐ tartalmazza, és géntechnikai utón, a pPR.IFNpi-13 rekombináns plazmid-DNS Escherichia coli baktériumba történő bevezetésével készült, és 1987. 01. 12-én az Antibiotikum Kutatóintézet Mikroorganizmus- és Tenyészetgyüjteményénél 1825 számon letétbe van helyezve.VNIIGENETICS The bacterial strain VL 903 (pPR-IFN p13) containing the recombinant plasmid DNA pPR-IFN p13 according to claim 1 and genetically engineered into the bacterium Esprichia coli pPR.IFNpi-13. and was deposited at the Antibiotic Research Institute's Microorganism and Culture Collection on 18 January 1987 under No. 1825.
HU881692A 1987-02-09 1988-02-08 Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same HUT50871A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU874191345A SU1703692A1 (en) 1987-02-09 1987-02-09 Recombination plasmid dna that codes synthesis of fibroblast human interferon and method developing escherichia coli strain, producent of human interferon @@@ 1
PCT/SU1988/000033 WO1988005819A1 (en) 1987-02-09 1988-02-08 RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IFNbeta1-13, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN FIBROBLAST beta1-INTERFERON, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) AS PRODUCER OF HUMAN beta1-INTERFERON, CONTAINING IT

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT50871A true HUT50871A (en) 1990-03-28

Family

ID=21284355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881692A HUT50871A (en) 1987-02-09 1988-02-08 Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same

Country Status (9)

Country Link
JP (1) JPH01502478A (en)
CH (1) CH676996A5 (en)
FI (1) FI884556A0 (en)
GB (1) GB2208866A (en)
HU (1) HUT50871A (en)
NL (1) NL8820103A (en)
SE (1) SE8803567D0 (en)
SU (1) SU1703692A1 (en)
WO (1) WO1988005819A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69219775T3 (en) * 1992-10-14 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Novel L-threonine-producing microbacterium and a manufacturing method for L-threonine
WO2006067804A2 (en) * 2004-12-20 2006-06-29 Cadila Healthcare Limited Process for preparing high levels of interferon beta

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression

Also Published As

Publication number Publication date
GB2208866A (en) 1989-04-19
WO1988005819A1 (en) 1988-08-11
CH676996A5 (en) 1991-03-28
JPH01502478A (en) 1989-08-31
GB8823728D0 (en) 1988-12-07
NL8820103A (en) 1989-01-02
SU1703692A1 (en) 1992-01-07
SE8803567L (en) 1988-10-07
SE8803567D0 (en) 1988-10-07
FI884556A (en) 1988-10-04
FI884556A0 (en) 1988-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0041313B1 (en) Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon
KR920006349B1 (en) Microbiologically produces alpha-and beta-interferon, dna sequences with code for these interferon
US5089400A (en) Polypeptides and process for the production thereof
EP0048970A2 (en) Polypeptides, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them
JPH0248235B2 (en)
JPH0838179A (en) Improved e.coli host cell
JPH0665305B2 (en) Method for stabilizing host cell containing recombinant DNA
HU194316B (en) Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone
JPS6156199A (en) Novel human interferon alpha
EP0133321B1 (en) Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same
HUT50871A (en) Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same
EP0048497A2 (en) DNA transducing vector and microorganism containing it
EP0121569A1 (en) Novel vector
Bornstein-Forst et al. In vivo D-serine deaminase transcription start sites in wild-type Escherichia coli and in dsdA promoter mutants
JP2567199B2 (en) Bacillus subtilis and method of forming the same
KR890001828B1 (en) Method for production of inf-alpha
RU2054041C1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA PIF16 ENCODING THE MATURE HUMAN LEUCOCYTE α-INTERFERON, THE STRAIN OF ESCHERICHIA COLI - A PRODUCER OF THE MATURE HUMAN LEUCOCYTE a-INTERFERON
HUT50873A (en) Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same
RU2105813C1 (en) Mutant gene δ encoding polypeptide eliciting activity of human gamma-interferon, recombinant plasmid δ providing expression of δ gene in escherichia coli and strain escherichia coli - a producer of polypeptide eliciting activity of human gamma-interferon
RU2089613C1 (en) Recombinant phage dna m13 pol t7 and recombinant strain of phage m13 - a producer of phage t7 rna-polymerase
SU1744111A1 (en) Recombinant plasmid dna prv7-ii, containing drv7-ii-fragment for detection of human rhota-viruses, and strain of bacteria escherichial coli - a producer of drv7-ii-fragment for detection of human rhota-viruses
EP0337441A2 (en) Expression of a functional form of a herpes virus DNA polymerase in yeast
RU2045575C1 (en) RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-TGATG-HIL-Iβ-TSR WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF RECOMBINANT INTERLEIKIN-1 AND STRAIN BSCHERICHIA COLI BEING PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN INTERLEIKIN-1 b
PH26492A (en) Recombinant human immune interferon

Legal Events

Date Code Title Description
DFA9 Temporary prot. cancelled due to abandonment