NL8820103A

NL8820103A - RECOMBINANT PLASMIDE DNA - PHR-IFNBETA 1-13 CODING SYNTHESIS OF FIBROBLASTIC HUMAN BETA1-INTERFERON, METHOD FOR ITS PREPARATION AND A STEM OF THE BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETAUM VL190-INTERN-BETAN-BETA THIS INCLUDES.

Info

Publication number: NL8820103A
Application number: NL8820103A
Authority: NL
Original assignee: Vnii Genetiki Selektsii Promy
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-08
Publication date: 1989-01-02
Also published as: FI884556A0; SE8803567L; FI884556A; GB2208866A; WO1988005819A1; JPH01502478A; HUT50871A; SE8803567D0; CH676996A5; SU1703692A1; GB8823728D0

Description

S' 88 2 0 1 0 3 * N.O. 35425 1S '88 2 0 1 0 3 * N.O. 35425 1

Recombinant plasmide DNA - pHR-IFNB 1-13 coderende synthese van fibroblast! sch humaan Bl-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pHR-IFNBl-13), die humaan Bl-interferon vormt, die dit bevat._ 5Recombinant plasmid DNA - pHR-IFNB 1-13 coding synthesis of fibroblast! sch human Bl interferon, method of preparation thereof and a strain of the bacterium Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pHR-IFNBl-13), which forms human B1 interferon, containing it.

Aanvraagster noemt als uitvinders:Applicant mentions as inventors:

VLADIMIR GEORGIEVICH DEBABOV JURY IVANOVICH KOZLOV 10 SERGEI VLADIMIROVICH MASHKO ALEXANDR YAKOVLEVICH STRONGIN VIKTOR EMILIEVICH STERKIN VITALY IVOVICH JURIN MARINA IVANOVNA LEBEDEVA 15 MAXIM EDUARDOVICH TRUKHANVLADIMIR GEORGIEVICH DEBABOV JURY IVANOVICH KOZLOV 10 SERGEI VLADIMIROVICH MASHKO ALEXANDR YAKOVLEVICH STRONGIN VIKTOR EMILIEVICH STERKIN VITALY IVOVICH JURIN MARINA IVANOVNA LEBEDEVA 15 MAXIM EDUARDOVICH TRUKHAN

SERGEI MIKHAILOVICH PODKOVYROV ALLA LVOVNA LAPIDUS ANDREI VLADIMIROVICH MOCHULSKY LARA SEMENOVNA IZOTOVA 20 ANNA STANISLAVOVNA RYZHAVASKAYA ANDREI PETROVICH ALEXENKO SERGEI VIKTOROVICH KOSTROV MARINA ALEXEEVNA KOLEVATYKH VALDEMARAS VITAUTOVICH GERVINSKAS 25 ELENA ALEXEEVNA NOSOVSKAYA LJUDMILA VLADIMIROVNA EVDONINA VITALY ARKADIEVICH LIVSHITS VLADAS-ALGIRDAS VLADOVICH BUMYALIS SERGIE IONOVICH BORUKHOV 30 TATYANA GRIGORIEVNA PLOTNIKOVA ALEXANDR PETROVICH BOLOTIN EUGENIJUS-ARVIDAS ANDREEVICH YANULAITISSERGEI MIKHAILOVICH PODKOVYROV Alla Lvovna LAPIDUS ANDREI Vladimirovich MOCHULSKY LARA SEMENOVNA IZOTOVA 20 ANNA Stanislavovna RYZHAVASKAYA ANDREI Petrovich ALEXENKO SERGEI Viktorovich KOSTROV MARINA ALEXEEVNA KOLEVATYKH Valdemaras VITAUTOVICH GERVINSKAS 25 ELENA ALEXEEVNA NOSOVSKAYA LJUDMILA vladimirovna EVDONINA VITALY ARKADIEVICH Livshits Vladas-Algirdas VLADOVICH BUMYALIS sergie IONOVICH BORUKHOV 30 TATYANA GRIGORIEVNA Plotnikova ALEXANDR PETROVICH BOLOTIN EUGENIJUS-ARVIDAS ANDREEVICH YANULAITIS

Beschrijving 35 Gebied van de uitvindingDescription 35 Field of the Invention

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebied van genetische constructie en biotechnologie en meer in het bijzonder op een nieuw recombinant plasmide DNA - pHR-IFNBl-13, dat de synthese van een fibroblastisch humaan 1-interferon codeert, op een werkwijze ter berei-40 ding ervan en op een stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika Ï882O103 2 VL 903 (pPR-IFN 1-13), dat een vormer van humaan-interferon is, die dit bevat.The present invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, and more particularly, to a novel recombinant plasmid DNA - pHR-IFNBl-13, which encodes the synthesis of a fibroblastic human 1 interferon, to a method of preparing 40 and on a strain of the bacterium Escherichia coli VNIIGenetika 888O103 2 VL 903 (pPR-IFN 1-13), which is a human interferon builder containing it.

Stand der techniekState of the art

Interferons zijn proteïnen, die door speciale humane cellen wor-5 den gesynthetiseerd in reactie op een virusinfectie of op een effect van verschillende inductoren. De op het huidige tijdstip beschikbare experimentele gegevens zijn gericht op antivirale, antiproliferative en immunomodulerende effecten van interferon na behandeling daarmee van afzonderlijke cellen, weefsels en het organisme als geheel. Met betrek-10 king tot het veelzijdige karakter en de betekenis voor het organisme ervan, is het interferonsysteem vergelijkbaar met het immuniteitssy-steem. In overeenstemming met antigene, biologische en chemische eigenschappen, alsmede afhankelijk van het type cellen, dat deze interferons vormt, worden humane interferons in drie groepen verdeeld: 15 α-leukocytisch, $-fibrob1astisch, Y-immuunachtig, die in hoofdzaak door cellen van respectievelijk leukocyten, fibroblasten en T-lymfocyten worden gevormd.Interferons are proteins that are synthesized by special human cells in response to a virus infection or to the effect of various inducers. The experimental data available at the present time are aimed at antiviral, antiproliferative and immunomodulatory effects of interferon after treatment thereof with individual cells, tissues and the organism as a whole. With regard to its versatile nature and significance to its organism, the interferon system is similar to the immunity system. In accordance with antigenic, biological and chemical properties, as well as depending on the type of cells that these interferons form, human interferons are divided into three groups: α-leukocytic, $ -fibrobastic, Y-immune-like, which are mainly composed of cells of leukocytes, fibroblasts and T lymphocytes are formed.

Op het ogenblik worden de toepassingsgebieden van interferons in de geneeskunde in het algemeen bepaald. Deze toepassingen zijn kerati-20 tis en dermatosen, behandeling van ademhalingsinfeeties teweeggebracht door verschillende virussen (influenza, adenovirussen) hepatitis B en dergelijke.At present, the fields of application of interferons in medicine are generally being determined. These applications are keratitis and dermatoses, treatment of respiratory infections induced by various viruses (influenza, adenoviruses) hepatitis B and the like.

Echter is het werkingsmechanisme van interferons, de structurele en functionele kenmerken en de klinische potentie ervan niet voldoende 25 geschikt bestudeerd. Dit hangt in grote mate samen met de moeilijkheden van het verkrijgen van preparatieve hoeveelheden zuivere interferons door traditionele methoden, die gebaseerd zijn op het gebruik van geïnduceerde kweken van humane cellen als een bron van dit proteïne. Voorts bevat het in dit geval gesynthetiseerde interferon als 30 regel een mengsel van verschillende typen en vormen ervan, die in hun structurele en functionele eigenschappen verschillen. In dit opzicht verwerft de bereiding van afzonderlijke interferons door een microbiologische synthese een steeds groeiende schaal.However, the mechanism of action of interferons, their structural and functional characteristics and their clinical potency have not been adequately studied. This is largely due to the difficulties of obtaining preparative amounts of pure interferons by traditional methods based on the use of induced cultures of human cells as a source of this protein. Furthermore, the interferon synthesized in this case generally contains a mixture of different types and forms thereof, differing in their structural and functional properties. In this regard, the preparation of individual interferons by microbiological synthesis is gaining an ever-growing scale.

In de techniek is een aantal werkwijzen bekend voor de bereiding 35 van humane interferonen α, β en V» die gebaseerd zijn op het gebruik van bacteriën als producenten, in het bijzonder verschillende stammen van Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. die recombinant plasmide DNA's bevatten, die expressie van heterologe genen in een nieuwe genetische omgeving waarborgen. In het geval van een fibroblas-40 tisch humaan interferon (IFBB1), voor het waarborgen van expressie van .8820103 3 het gen IFNB1 in cellen van E.coli wordt gebruik gemaakt van het instellen van het coderende gedeelte van een volgroeid inteferon onder de controle van transcriptiesignalen en genentranslatie (tuf B, ree A) en operons (lac UV 5t ) van E.coli en colifagen (PLA). Een als 5 resultaat van de microbiologische synthese (met een moleculaire massa van ongeveer 19.000 Dalton) gevormd volgroeid βΐ-interferon wordt gekenmerkt door de afwezigheid van de koolhydraatcomponent en door de beschikbaarheid van een N-eindstandige rest van formylmethionine in plaats van die van methionine. Echter resulteert dit onderscheid niet 10 in een verandering in de biologische activiteit van een protelnepro-dukt van het gen IFNB1 in vergelijking met het in cellen van fibroblas-ten gevormde natuurlijke glycoproteïne. Het volgens deze microbioli-gische werkwijze gesynthetiseerde Bl-interferon kan gebruikt worden voor zowel onderzoekingen over het moleculaire mechanisme van wissel-15 werking met cel receptoren als in de medische praktijk.A number of methods are known in the art for the preparation of human interferons α, β and V »based on the use of bacteria as producers, in particular various strains of Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. containing recombinant plasmid DNAs that ensure expression of heterologous genes in a new genetic environment. In the case of a fibroblasmic human interferon (IFBB1), to ensure expression of .8820103 3 gene IFNB1 in E.coli cells, use is made to set the coding portion of a mature inteferon under the control of transcription signals and gene translation (tuf B, roe A) and operons (lac UV 5t) of E. coli and coliphages (PLA). A mature βΐ-interferon formed as a result of microbiological synthesis (with a molecular mass of about 19,000 Daltons) is characterized by the absence of the carbohydrate component and by the availability of an N-terminal residue of formylmethionine instead of that of methionine. However, this distinction does not result in a change in the biological activity of a protein product of the IFNB1 gene compared to the natural glycoprotein formed in fibroblast cells. The B1 interferon synthesized according to this microbiological method can be used for studies of the molecular mechanism of interaction with cell receptors as well as in medical practice.

In de techniek bekend zijn recombinant plasmide DNA's, die de synthese van een fibroblastisch humaan Bl-interferon coderen, zoals pC1857 en pPL c 245HFIF25 en de stam E.coli SG4044, die deze plasmiden bevatten. (Remaut E., Staussenes P., Fiers G., 1983, Nucl. Acida Res. 11, 20 4677-4688).Known in the art are recombinant plasmid DNAs encoding the synthesis of a fibroblastic human B1 interferon, such as pC1857 and pPL c 245HFIF25 and the strain E.coli SG4044, containing these plasmids. (Remaut E., Staussenes P., Fiers G., 1983, Nucl. Acida Res. 11, 20, 4677-4688).

In het recombinant plasmide DNA pPL c 24HFIF25 wordt de transcriptie van het gen IFNBl geregeld door de regelingseenheid Pj_0|_ van het bacteriofaag A en initiëring van translatie van het proteïne-produkt van het gen wordt gewaarborgd voor rekening van constructie van 25 een hybridegebied van het binden van ribosomen op de basis van de SD-sekwentie van het replicase gen van het faag MS2. De maximale opbrengst van humaan BI-interferon, gewaarborgd door het kweken van de hierboven geïdentificeerde stam is 4¾ van het totale proteïne van plasmide bevattende cellen van E.coli.In the recombinant plasmid DNA pPL c 24HFIF25, the transcription of the IFNB1 gene is regulated by the bacteriophage A control unit Pj_0 | _ and initiation of translation of the protein product of the gene is ensured for construction of a hybrid region of the binding of ribosomes based on the SD sequence of the replicase gene of the phage MS2. The maximum yield of human B1 interferon assured by culturing the strain identified above is 4¾ of the total protein of E. coli plasmid containing cells.

30 De hierboven vermelde stam wordt gekenmerkt, doordat de gecontroleerde expressie van het gen IFNB1, gewaarborgd met behulp van de Pl promotor, een additioneel plasmide pC1857 vereist met een daarop geplaatst temperatuurgevoelig genregulerend clts857 van het faag A. Dit resulteert in een potentiële instabiliteit van het recombinant plas-35 mi de onder omstandigheden van het kweken van de stam op een grote pro-duktieschaal ten gevolge van een recA afhankelijke recombinatie tussen de plasmiden pC1857 en pPL c 245HFIF25 bij homologe gebieden. Voorts maakt het gebruik van een relatief korte SD-sekwentie van het replocase gen van het faag MS2 voor de organisatie van een hybridegebied van 40 binding van ribosomen het niet mogelijk volledig het potentiële ver- .8820103 4 mogen van het trans!atieapparaat van E.coü te realiseren ten gevolge van een onvoldoende effectieve wisselwerking met ribosomen na initiëring van translatie van firboblastisch interferon. Daarnaast resulteert de afwezigheid van J-afhankelijke transcriptieterminatoren 5 bij het 3'-eindstandige gebied van het gen IFNB1 in het plasmide pPL c 245HFIF25 in een aanzienlijke vermindering van repliceerbaarheid en zelfs in een waarschijnlijk verlies van het recombinant plasmide onder omstandigheden van depressie van een sterk werkzame PL promotor van het faag λ, die initiëring van transcriptie van het gen IFNB1 waar-10 borgt.The above-mentioned strain is characterized in that the controlled expression of the IFNB1 gene, assured by the P1 promoter, requires an additional plasmid pC1857 with a temperature-sensitive gene regulating clts857 of the phage A placed thereon. This results in a potential instability of the recombinant plas-35 ml under conditions of culture of the strain on a large production scale due to a recA dependent recombination between the plasmids pC1857 and pPL c 245HFIF25 in homologous regions. Furthermore, the use of a relatively short SD sequence of the replocase gene of the phage MS2 for the organization of a hybrid region of ribosome binding does not fully allow the potential potential of the E! Transcription device. coü due to an insufficiently effective interaction with ribosomes after initiation of translation of firboblastic interferon. In addition, the absence of J-dependent transcription terminators 5 at the 3 'terminal region of the IFNB1 gene in the plasmid pPL c 245HFIF25 results in a significant reduction in replicability and even in a likely loss of the recombinant plasmid under conditions of depression of a strong active PL promoter of the phage λ, which ensures initiation of transcription of the IFNB1 gene.

Dit alles maakt het niet mogelijk een hoog niveau van de biosyn-these van het produkt van het gen IFNB1 te bereiken en kan resulteren in een verdere verlaging van het contact van Bl-interferon in een biomassa van de producerende stam na de kweek op grote schaal ervan, het-15 geen derhalve winning van het zuivere proteïne ingewikkeld maakt en de opbrengst van het gewenste produkt verlaagt.All this does not allow to achieve a high level of biosynthesis of the product of the IFNB1 gene and may result in a further decrease of Bl-interferon contact in a biomass of the producing strain after large scale cultivation. thereof, therefore complicating recovery of the pure protein and decreasing the yield of the desired product.

Beschrijving van de uitvindingDescription of the invention

Het recombinant plasmide DNA pPR-INFBl-13, de werkwijze voor de constructie ervan en de stam van de bacterie Escherichia coli 20 VNIIGetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), die dit bevat, zijn nieuw en tot dusverre niet uit de literatuur bekend.The recombinant plasmid DNA pPR-INFBl-13, the method for its construction and the strain of the bacterium Escherichia coli 20 VNIIGetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), which contains it, are new and so far not known from the literature .

De onderhavige uitvinding is gericht op het verschaffen van een nieuw recombinant plasmide DNA, dat de synthese van fibroblastisch humaan Bl-interferon codeert, een werkwijze voor de constructie ervan en 25 een nieuwe sterk produktieve stam, die humaan Bl-interferon vormt, die dit bevat, hetgeen bereiding van Bl-interferon in een hoge opbrengst zal waarborgen.The present invention is directed to providing a novel recombinant plasmid DNA encoding the synthesis of fibroblastic human B1 interferon, a method for its construction and a new highly productive strain comprising human B1 interferon containing it which will ensure preparation of B1 interferon in a high yield.

Dit oogmerk wordt tot stand gebracht doordat het recombinant plasmide pPR-IFNBl-12, dat de synthese van humaan fibroblastisch Bl-inter-30 feron volgens de onderhavige uitvinding codeert de afmeting van 3900 b.p. heeft en uit de volgende eenheden bestaat: BamHI-BglII fragment met de afmeting van 3400 b.p. van het vectorplasmide pPRI24B, gevormd op basis van pPR40 en pML24-EcorI-$au3A fragment van het plasmide PINB-trp 7 met de afmeting van 510 b.p. en heeft de volgende kenmer-35 ken: - bevat een gebied, dat verantwoordelijk is voor de initiëring van replicatie en de regeling ervan - ColEI-replicon, een gen van de repressor cits 857 van het faag A, een gen van resistentie voor ampicilline Apr, een tandem van sigma-afhankelijk transcript!etermi-40 natoren van het faag fd, een regelend gebied PR0R en een SD-sekwen- .8820103 5 tie van het gen cro, dat de sekwentie van een volgroeid fibroblastisch humaan Interferon IFN31 met het eigen methionine codon ervan codeert; - ligatuur van het regelingsgebied van het gen cro, dat een deel van 31-interferon codeert en transcript!eterminatoren van het faag fd 5 wordt zodanig bewerkstelligd, dat voordat het gen IFN31 een hybridege- bied van combinerende ribosomen wordt gevormd, dat de volgende necluotide volgorde heeft: 5'-...TAAGGAGGTTGCATG...-3', waarin TAAGGAGGT - SD-sekwentie van het gen cro van het faagΛ , ATG-methioni-necodon van fribroblastisch interferon en, direct na het eindigende 10 codon van het gen IFN31 een tandem van ^-afhankelijke transcriptieter-minatoren van het faag fd is geplaatst; - heeft unieke herkenningsgebieden van restrictasen cla I, waarvan de coördinaat het begin van telling (0), Pvu II (ongeveer 1.110), Bgl II (ongeveer 1.480), AccI (ongeveer 1.870), Pvu I (ongeveer 3.360) is; 15 gedeponeerd op 12-01-1987 bij de Collection of Cultures ofThis object is accomplished in that the recombinant plasmid pPR-IFNBl-12 encoding the synthesis of human fibroblastic B1 interferon feron of the present invention has the size of 3900 b.p. and consists of the following units: BamHI-BglII fragment with the size of 3400 b.p. of the vector plasmid pPRI24B, generated from pPR40 and pML24-EcorI- $ au3A fragment of the plasmid PINB-trp 7 at the size of 510 b.p. and has the following characteristics: - contains a region responsible for initiation of replication and its regulation - ColEI replicon, a gene from phage A repressor cits 857, a gene of resistance to ampicillin Apr , a tandem of sigma-dependent transcript etermi-40 nators of the phage fd, a regulatory region PR0R and an SD sequence of the gene cro, which replicates the sequence of a mature fibroblastic human Interferon IFN31 with its own encodes its methionine codon; - ligature of the regulatory region of the cro gene, which encodes a portion of 31-interferon and phage fd 5 transcriptional terminators, is effected such that before the IFN31 gene forms a hybrid region of combining ribosomes, the following necluotide sequence has: 5 '-... TAAGGAGGTTGCATG ...- 3', in which TAAGGAGGT - SD sequence of the phage gene cro, ATG-methionine necodon of fribroblastic interferon and, immediately after the ending codon of the gene IFN31 a tandem of β-dependent transcription terminators of the phage fd is placed; - has unique regions of restrictases cla I, whose coordinate is the beginning of count (0), Pvu II (about 1,110), Bgl II (about 1,480), AccI (about 1,870), Pvu I (about 3,360); 15 deposited on 12-01-1987 with the Collection of Cultures of

Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825.Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics and registered under no. 1825.

Het recombinant plasmide DNA pPR-IFN31-13 volgens de onderhavige uitvinding waarborgt expressie van het gen IFN31 onder de controle van 20 het regelingsveld PrOr van de bacteriofaag Λ. Het gen cits 857-reguleringsmiddel van de initiëring van transcriptie uit voorgaande promotors van de bacteriofaag A en het gen IFN31-13, dat onder controle van de Pr promotor is, zijn in hetzelfde recombinant plasmide pPR-IFN31-12 geplaatst. Deze omstandigheid maakt het mogelijk een po-25 tentiële instabiliteit tijdens het kweken van de stam met het recombinant molecule van DNA te verwijderen, aangezien in de structuur volgens de onderhavige uitvinding geen recA-afhankelijke recombinatie ontstaat ten gevolge van de afwezigheid van een additioneel plasmide in de producerende stam.The recombinant plasmid DNA pPR-IFN31-13 of the present invention ensures expression of the gene IFN31 under the control of the PrOr control field of the bacteriophage Λ. The gene cits 857 regulator of transcription initiation from previous promoters of the bacteriophage A and the IFN31-13 gene, which is under the control of the Pr promoter, are placed in the same recombinant plasmid pPR-IFN31-12. This circumstance makes it possible to remove potential instability during culturing of the strain with the recombinant molecule of DNA, since no recA-dependent recombination arises in the structure of the present invention due to the absence of an additional plasmid in the producing strain.

30 De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een con-structiewerkwijze van het recombinant plasmide DNA pPR-IFN31-13, die splitsing van het vectorplasmide pPR124B, gebouwd op de basis van de piasmiden pPR40 en pML24, door middel van de restrictie endonucleasen EcoRI en Bgl II en ligatuur van de grotere van de gevormde fragmenten 35 van het vectormolecule met het EcoRI-Sau3A fragment van het plasmide pINFB-trp7, dat het coderende gedeelte van een volgroeid Bl-interferon bevat, omvat; in het aldus gevormde recombinant plasmide pPR-IFNBl-123 is er nabij de SD-sekwentie van het gen cro en van het eerste (methionine) codon van 31-interferon bewerkstelligd, om welke reden het 40 plasmide DNA door middel van het restrictase BamHI is gehydrauliseerd, -8820163 6 een deel van de nucleotiden door middel van de endonuclease activiteit van het DNA-polymerase I E.coli onthuld onder omstandigheden van een onvolledige instelling van nucleocide trifosfaten in het reactiemengsel verwijderd, het DNA fermentatief wordt afgesplitst door middel van het 5 restrictase EcoRI, behandeld met het SI-endonuclease om gebieden van het DNA met enkele keten te verwijderen, vervolgens de uiteinden met twee ketens worden hersteld door middel van een Klenov fragment van het DNA-polymerase I E.coli en de gevormde lineaire DNA moleculen worden gecycliseerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4; het resul-10 terende preparaat wordt gebruikt om cellen van E.coliC600 met selectie van de transformanten op een milieu met ampicilline te transformeren, na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 28°C, gevolgd door selectie van de klonen met een verminderde groeisnelheid bij de temperatuur van 42°C, waarna uit de aldus geselecteerde klonen het recombi-15 nant plasmide pPR-IFNpl-13 wordt geïsoleerd.The present invention also relates to a construction method of the recombinant plasmid DNA pPR-IFN31-13, which cleaves the vector plasmid pPR124B, built on the basis of the piasmids pPR40 and pML24, by the restriction endonucleases EcoRI and Bgl II and ligature of the larger of the generated fragments of the vector molecule with the EcoRI-Sau3A fragment of the plasmid pINFB-trp7, which contains the coding portion of a mature B1 interferon; in the recombinant plasmid pPR-IFNB1-123 thus formed, the SD sequence of the gene cro and of the first (methionine) codon of 31 interferon has been established, for which reason the plasmid DNA is by means of the restrictase BamHI hydraulic, -8820163 6 part of the nucleotides by means of the endonuclease activity of the DNA polymerase I E. coli revealed under conditions of incomplete setting of nucleocide triphosphates removed in the reaction mixture, the DNA is split off by fermentation restrictase EcoRI, treated with the SI endonuclease to remove regions of the single chain DNA, then the two chain ends are repaired by means of a Klenov fragment of the DNA polymerase I E. coli and the linear DNA molecules formed are cycled by the phage T4 DNA ligase; the resulting preparation is used to transform cells of E. coli C600 with selection of the transformants in an environment with ampicillin, after culturing the cells at a temperature of 28 ° C, followed by selection of the clones with reduced growth rate at the temperature of 42 ° C, after which the recombinant plasmid pPR-IFNpl-13 is isolated from the clones thus selected.

Het gebruik van de constructiemethode van het recombinant plasmide pPR-INF31-13, waarbij de langste (uit de bekende voor de matrix RNAThe use of the construction method of the recombinant plasmid pPR-INF31-13, where the longest (from the known for the matrix RNA

E.coli en colifagen) SD-sekwentie van het gen cro van de bacteriofaagλ is verbonden met het coderende gedeelte van volgroeid humaan 81-inter-20 feron, resulteert in organisatie van een hybridegebied van combinerende ribosomen van het gen IFN31 met de optimale primaire en sterische structuur van het 5'-eindstandige gebied van de matrix RNA. In tegenstelling tot de bekende werkwijze, waarborgt de construct)ewerkwijze volgens de onderhavige uitvinding ook de aanwezigheid van een tandem 25 van sigma-onafhankelijke transcript!eterminatoren in het 3'-non-getranslateerde gebied van het gen IFN81 op het plasmide pPR-IFNBl-13, waardoor dus interferentie tussen replicatie van het plasmide DNA en een sterk werkzame transcriptie van het gen van fibroblast! nterferon onder de omstandigheden van depressie van de Pr pro-30 motor wordt voorkomen.E. coli and coliphages) SD sequence of the bacteriophage λ gene is linked to the coding portion of mature human 81-inter-20 feron, resulting in organization of a hybrid region of combining ribosomes of the IFN31 gene with the optimal primary and steric structure of the 5 'terminal region of the matrix RNA. In contrast to the known method, the construction method of the present invention also ensures the presence of a tandem of sigma-independent transcriptional terminators in the 3 'non-translated region of the gene IFN81 on the plasmid pPR-IFNB1- 13, thus interfering with replication of the plasmid DNA and a highly effective transcription of the fibroblast gene! nterferon under the conditions of depression of the Pr pro-30 engine is prevented.

Naast het hierboven gezegde heeft de onderhavige uitvinding ook betrekking op een bacteristam Escherichia coli VNIIgenetika VL 903 (pPR-IFNpl-13), die humaan βΐ-interferon vormt, dat het recombinant plasmide DNA pPR-IFN&l-13 volgens de onderhavige uitvinding bevat en 35 dat verkregen is volgens de werkwijze van genetische constructie door invoering van het plasmide DNA pPR-IFNBl-13 in de bacterie Escherichia coli, gedeponeerd op 12-01-1987 bij de Collection of Cultures of Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825.In addition to the above, the present invention also relates to a bacterial strain Escherichia coli VNIIgenetika VL 903 (pPR-IFNpl-13), which forms human βΐ-interferon, which contains the recombinant plasmid DNA pPR-IFN & l-13 of the present invention and obtained by the method of genetic engineering by introducing the plasmid DNA pPR-IFNBl-13 into the bacterium Escherichia coli deposited on 12-01-1987 at the Collection of Cultures of Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics and registered under no. 1825.

40 De stam volgens de onderhavige uitvinding maakt het mogelijk een .8820103 7 stabiele accumulatie van humaan Bl-interferon te waarborgen onder omstandigheden van een kweek op grote schaal en om een opbrengst van het gewenste produkt te bereiken van meer dan 2 x 10^ U/l, hetgeen overeenkomt met 5-10% van de totale hoeveelheid van het cel proteïne.The strain of the present invention makes it possible to ensure a stable accumulation of human B1 interferon under conditions of large-scale culture and to achieve a yield of the desired product in excess of 2 x 10 µU / 1, which corresponds to 5-10% of the total amount of the cell protein.

5 Beste wijze van uitvoering van de uitvindingBest mode of carrying out the invention

De constructiewerkwijze van het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding wordt in verschillende trappen uitgevoerd.The construction method of the recombinant plasmid pPR-IFNBl-13 of the present invention is carried out in several steps.

In de eerste trap wordt het vectorplasmide pPRI24 geconstrueerd.In the first stage, the vector plasmid pPRI24 is constructed.

10 Tot dit doel wordt deletie door middel van het endonuclease Bal31 in de DNA van de plasmide pPR40 (Molekulyarnaya Biologiya, 1987, deel 21 nr. 5, Moskou blz. 1309-1321) in het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II bewerkstelligd.For this purpose, deletion by the endonuclease Bal31 in the DNA of the plasmid pPR40 (Molekulyarnaya Biologiya, 1987, vol. 21 no. 5, Moscow pp. 1309-1321) is effected in the region of the restriction Bgl II.

Op deze wijze wordt het plasmide pPRIOO verkregen, waarin het her-15 kenningsgebied BamHI direct na het combinatiegebied van ribosomen van de faagA zodanig is geplaatst, dat in het gebied van de initiëring AUG codon een sekwentie wordt gevormd:In this way, the plasmid pPRI00 is obtained, in which the recognition region BamHI is placed immediately after the combination region of ribosomes of the phage A such that a sequence is formed in the region of the initiation AUG codon:

AUGGATCCAUGGATCC

20 BamHI20 BamHI

Vervolgens wordt onder toepassing van conventionele methoden van genetische constructie het kleine Pstl-BamHI fragment van het plasmide pPRIOO geligateerd met het grootste PstI-BamHI fragment van het plasmi-25 de pML24 met de vorming van het plasmide pPRI24, waarin een herkenningsgebied van het restructase Bgl II door middel van een oligonucleotide verbindingsmiddel wordt ingevoerd. Aldus wordt het plasmide pPRI24B verkregen.Then, using conventional genetic engineering methods, the small PstI-BamHI fragment of the plasmid pPRIOO is ligated with the largest PstI-BamHI fragment of the plasmid pML24 to form the plasmid pPRI24, which contains a recognition region of the restructase Bgl II is introduced through an oligonucleotide linker. Thus, the plasmid pPRI24B is obtained.

Het tussenprodukt plasmide pPR-IFNBl-123 wordt geconstrueerd.The intermediate plasmid pPR-IFNB1-123 is constructed.

30 Het aldus gevormde vectorplasmide pPRI24B wordt door middel van restrictie-endonucleasen EcoRI en Bgl II gesplitst en ligatie van het grootste fragment uit de gevormde fragmenten van een vectormolecule met het EcoRI-Sau3A fragment, dat het coderende gedeelte van volgroeid 81-interferon uit het plasmide pINB-trp7 bevat, wordt bewerkstelligd 35 onder vorming van het tussenrecombinant plasmide pPR-IFNBl-123.The vector plasmid pPRI24B thus formed is cleaved by restriction endonucleases EcoRI and Bgl II and ligation of the largest fragment from the generated fragments of a vector molecule with the EcoRI-Sau3A fragment, which is the coding portion of mature 81 interferon from the plasmid. pINB-trp7 is accomplished to form the intermediate recombinant plasmid pPR-IFNB1-123.

Vervolgens wordt de derde trap uitgevoerd - constructie van het plasmide pPR-IFNB-13. Tot dit doel wordt in het tussenprodukt plasmide pPR-IFN$l-123 de nabijheid van de SD-sekwentie van het gen cro en van het eerste codon van Bl-interferon, om welke reden het plasmide DNA 40 wordt gehydrolyseerd door middel van het restrictase BamHI, een deel .8820103 δ van de nucleotiden verwijderd door middel van de endonuclease activiteit van het DNA-polymerase I E.coli, wordt het DNA gesplitst door middel van het restrictase EcoRI, met het SI-endonuclease behandeld, gevolgd door een volledig herstel van de twee-keteneinden door middel van 5 een Klenov fragment van het DNA-polymerase I E.coli en cyclisering van de resulterende lineaire DNA moleculen wordt gewaarborgd door middel van het DNA-ligase van de faag T4. Het aldus verkregen preparaat wordt gebruikt om de cellen van E.coli C600 te transformeren, worden de transformanten geselecteerd op een milieu met ampicilline na het kweken 10 van de cellen bij een temperatuur van 28°C, gevolgd door selectie op een verminderde groeisnelheid bij de temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA pPR-IFN81-13 geïsoleerd.Then the third step is performed - construction of the plasmid pPR-IFNB-13. To this end, in the intermediate plasmid pPR-IFN $ 1-123, the proximity of the SD sequence of the gene cro and of the first codon of B1 interferon, for which reason the plasmid DNA 40 is hydrolyzed by the restrictase BamHI, part of .8820103 δ of the nucleotides removed by the endonuclease activity of the DNA polymerase I E.coli, the DNA is cleaved by the restrictase EcoRI, treated with the SI endonuclease, followed by complete recovery of the two chain ends by means of a Klenov fragment of the DNA polymerase I E. coli and cyclization of the resulting linear DNA molecules is ensured by means of the DNA ligase of the phage T4. The thus obtained preparation is used to transform the cells of E.coli C600, the transformants are selected on an environment with ampicillin after culturing the cells at a temperature of 28 ° C, followed by selection for a reduced growth rate at the temperature of 42 ° C. The plasmid DNA pPR-IFN81-13 is isolated from the clones thus selected.

De stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFN81-13) volgens de onderhavige uitvinding wordt gevormd door 15 transformatie van de ontvangerstam met het recombinant plasmide pPR-IFN81-13, gevolgd door selectie van de recombinantklonen op een milieu met ampicilline bij een temperatuur van 28°C en bepaling van de activiteit van fibroblastisch $1-interferon in extracten van de trans-formantcellen na depressie van de P^-promotor gewaarborgd door het 20 kweken van de stam gedurende 1-2 uur bij de temperatuur van 42°C. Als de ontvanger kunnen de stammen E.coli C600 en andere derivaten van E.coli K12 worden gebruikt.The strain of the bacterium Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFN81-13) according to the present invention is formed by transformation of the recipient strain with the recombinant plasmid pPR-IFN81-13, followed by selection of the recombinant clones on an ampicillin medium. at a temperature of 28 ° C and determination of the activity of fibroblastic $ 1 interferon in extracts of the transformant cells after depression of the β-promoter guaranteed by cultivating the strain for 1-2 hours at the temperature of 42 ° C. As the recipient, the strains E. coli C600 and other derivatives of E. coli K12 can be used.

De stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) wordt door de volgende kenmerken gekarakteriseerd.The strain E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) is characterized by the following characteristics.

25 Morfologische kenmerken. Cellen recht, staafvormig (1,2-1,6) x (2,0-6,0) /urn, weinig beweeglijk, in staat draadachtige vormen te vormen, gram-negatief, non-sporenvormig.25 Morphological features. Cells straight, rod-shaped (1.2-1.6) x (2.0-6.0) / µm, little agile, able to form threadlike shapes, gram-negative, non-spore-shaped.

Kweekkenmerken. Cellen groeien goed op dichte en vloeibare gewone synthetische, semi-synthetische en complexe milieus. Wanneer gegroeid 30 op een agar bevattende vloeibare kweekbodem van Hottinger of L-vloeiba-re kweekbodem vormen zij met slijm bedekte, ronde, enigszins verwarde koloniën. Wanneer gegroeid in vloeibare milieus zoals N-vloeibare kweekbodem of M9 met casiminezuren vormen zij een gelijkmatige suspensie.Breeding traits. Cells grow well in dense and liquid ordinary synthetic, semi-synthetic and complex environments. When grown on an agar-containing Hottinger liquid culture medium or L-liquid culture medium, they form mucous-covered, round, slightly tangled colonies. When grown in liquid mediums such as N-liquid culture medium or M9 with casimic acids, they form an even suspension.

35 Fysiologisch-biochemische kenmerken. Cellen zijn in staat te groeien bij een temperatuur binnen het traject van 5 tot 40°C (optimum 35°C) bij een pH van 6,5 tot 7,5. Als koolstofbron worden aminozuren en koolhydraten (bijvoorbeeld saccharose) gebruikt. De stikstofbron kan worden vertegenwoordigd door anorganische zouten in de ammoniumvorm er-40 van, alsmede organische verbindingen in de vorm van pepton, trypton, .8820103 9 gistextract en aminozuren.35 Physiological-biochemical characteristics. Cells are able to grow at a temperature within the range of 5 to 40 ° C (optimum 35 ° C) at a pH of 6.5 to 7.5. As a carbon source, amino acids and carbohydrates (for example, sucrose) are used. The nitrogen source can be represented by inorganic salts in its ammonium form, as well as organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract and amino acids.

Resistentie tegen antibiotica. De stam is resistent tegen ampicil-1 ine in een concentratie tot 100 mg/1 na groei in vloeibare en agar bevattende voedingsmilieus.Antibiotic resistance. The strain is resistant to ampicillin in a concentration of up to 100 mg / l after growth in liquid and agar-containing food environments.

5 Stabiliteit van het plasmide. Na opslag van cellen op een agar be vattende milieu (gedurende een periode tot 1 maand) met een reeks opeenvolgende herinoculaties (gedurende ten minste 6 maanden) en gedurende een diepe kweek in een vloeibaar milieu met een antibioticum heeft geen verlies of herstructurering van het plasmide plaats.Stability of the Plasmid. After storage of cells on an agar-containing medium (for a period up to 1 month) with a series of consecutive reinoculations (for at least 6 months) and during a deep culture in a liquid medium with an antibiotic, there is no loss or restructuring of the plasmid place.

10 De aldus bereide stam E.coli VNIIGenetika VL 903 pPR-IFNBl-13) is een zeer efficiënte vormer van fibroblastisch humaan Bl-interferon en kan voor een produktie op commerciële schaal van Bl-interferon worden gebruikt.The strain E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) thus prepared is a highly efficient generator of fibroblastic human B1 interferon and can be used for commercial scale production of B1 interferon.

De onderhavige uitvinding wordt verder door voorbeelden van bij-15 zondere uitvoeringsvormen van de werkwijze voor de constructie van het plasmide, de werkwijze voor de vorming van de stam, de kweek ervan toegelicht onder verwijzing naar de bijgevoegde figuren, waarin: fig. 1 - fysische-genetische kaart van het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13; 20 fig. 2 - een diagram van de bereiding van het plasmide pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding zijn.The present invention is further illustrated by examples of particular embodiments of the method of construction of the plasmid, the method of strain formation, its culture, with reference to the accompanying figures, in which: Figure 1 - physical genetic map of the recombinant plasmid pPR-IFNBl-13; Figure 2 - are a diagram of the preparation of the plasmid pPR-IFNBl-13 of the present invention.

Voorbeeld IExample I

Het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13 (fig. 1) wordt in verschillende trappen gevormd. Trap I - constructie van het vectorplasmide 25 pPRI24B.The recombinant plasmid pPR-IFNBl-13 (Fig. 1) is formed in several steps. Stage I - construction of the vector plasmid pPRI24B.

Tot dit doel wordt het plasmide pPRI"(a) op de volgende wijze geconstrueerd. 3 /ug van het plasmide pPR40 wordt gesplitst door middel van het restrictase Bgl II in 60 /Ul van een buffer voor restric-tie-I, die 10 mM tris-HCl, pH 8,0, 6 mM MgC^s 6 mM 2-mercaptoetha-30 nol, 150 mM Nacl bevat. Het DNA wordt met 2 volumedelen ethanol opnieuw neergeslagen. Het precipitaat wordt in 20 /ul H2O opgelost. De behandeling van het DNA met het endonuclease Bal 31 wordt gedurende 3 minuten bij een temperatuur van 30°C uitgevoerd in 30 /ul van een buffer, die 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM NgCl2» 100 mM tris-HCl, pH 35 8,0, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur bevat. Het DNA wordt met 2 volumedelen ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt in 10 /ul H2O opgelost. De behandeling met het restrictase BamHI wordt in een monster van 30 /ul, dat de hierboven vermelde buffer voor restrictie-I bevat, uitgevoerd. De competering van de 3'-eindstand!ge gebieden met enkele 40 keten van het DNA wordt bewerkstelligd door behandeling met een Klenov .8820103 10 fragment van het DNA-polymerase I E.coli in een monster van 20 /ul, dat 10 mM tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgClg» 2 /Ug van het DNA preparaat bevat, door 30 /uM van elk van desoxiribonucleoside trifosfaten, 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het reactiemengsel wordt met 5 ethanol neergeslagen en in 100 /ul H2O opgelost. De ligatie van het rechtgemaakte plasmide DNA wordt bewerkstelligd bij een temperatuur van 16°C gedurende 12 uur door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster, dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosinetrifosfaat) en 1 10 /Ug van het DNA bevat. Het resulterende mengsel wordt voor transformatie van cellen van E.coli C600 gebruikt. Het rendement van de transformer is 5x10^ koloniën per 1 /ug van het natuurlijke plasmide pPR40. De tegen ampicilline resistente klonen (100 /ug/ml), het plasmide DNA wordt daaruit gewonnen volgens een gemodificeerde werkwijze, 15 die gesuggereerd is door Birnboim en Doli en vervolgens toegepast voor een restrictieanalyse. Als resultaat wordt het plasmide pPRIOO verkregen, dat een uniek splitsingsgebied BamHI bevat. Daarna wordt het plasmide pPRI24 geconstrueerd.For this purpose, the plasmid pPRI "(a) is constructed in the following manner. 3 µg of the plasmid pPR40 is cleaved by means of the restrictase Bgl II in 60 / µl of a restriction-I buffer containing 10 mM tris-HCl, pH 8.0, 6 mM MgCl 3 s 6 mM 2-mercaptoetha-30 nol, 150 mM Nacl The DNA is reprecipitated with 2 parts by volume of ethanol The precipitate is dissolved in 20 µl H 2 O. The treatment of the DNA with the endonuclease Bal 31 is performed in 30 µl of a buffer containing 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM NgCl2 »100 mM tris-HCl, pH 35 8 at a temperature of 30 ° C for 3 minutes. 0.5 mM ethylenediamine tetraacetic acid The DNA is precipitated with 2 parts by volume of ethanol The precipitate is dissolved in 10 µl H 2 O. The treatment with the restrictase BamHI is taken in a sample of 30 µl containing the above restriction buffer. I, performed The compete of the 3'-terminal regions with some 40 chain of the DNA is accomplished d For treatment with a Klenov .8820103 fragment of the DNA polymerase I E. coli in a sample of 20 µl containing 10 mM tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgClg 2 / Ug of the DNA preparation , by 30 µM of each of deoxiribonucleoside triphosphates, 5 units of the enzyme. The DNA from the reaction mixture is precipitated with ethanol and dissolved in 100 µl H 2 O. The ligation of the straightened plasmid DNA is accomplished at a temperature of 16 ° C for 12 hours using the DNA ligase from the phage T4 in a sample containing a buffer for ligation (60 mM tris-HCl, pH 7.6 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.4 mM adenosine triphosphate) and 10 µg of the DNA. The resulting mixture is used for transformation of E. coli C600 cells. The efficiency of the transformer is 5x10 4 colonies per 1 µg of the natural plasmid pPR40. The ampicillin resistant clones (100 µg / ml), the plasmid DNA are recovered therefrom by a modified method suggested by Birnboim and Doli and then used for a restriction analysis. As a result, the plasmid pPRIOO is obtained, which contains a unique cleavage region BamHI. The plasmid pPRI24 is then constructed.

Tot dit doel wordt 2 /ug van het DNA van het plasmide pML24 ge-20 zamelijke gesplitst door middel van de restrictasen BamHI en PstI in 40/ul van een buffer voor restrictie-I. De ligatie wordt uitgevoerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4 bij een temperatuur van 0eC met de fragmenten, die verkregen zijn bij de hydrolyse van het DNA van het plasmide pPRIOO met de restrictasen BamHI en PstI. Het resulte-25 rende DNA preparaat wordt gebruikt voor het transformeren van cellen van E.coli C600 met selectie van transformanten op een milieu met ampi-cilline, gevolgd door selectie van Cmr klonen op een milieu met 300 /ug/ml chlooramfenicol na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA 30 geïsoleerd en bestudeerd door middel van een restrictieanalyse. Als resultaat wordt het plasmide pPRI24 verkregen, dat een uniek gebied door middel van het restrictase BamHI bevat. Daarna wordt 3 /ug van het DNA van het plasmide pPRI24 gesplitst door middel van het restrictase Xbal in 70 /ul van een buffer voor restrictie-I, die 10 mM 35 tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl2> 6 mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl bevat. Het DNA wordt opnieuw neergeslagen met 2 volumedelen ethanol.To this end, 2 µg of the DNA of the plasmid pML24 is cleaved together by the restrictases BamHI and PstI in 40 µl of a restriction I buffer. The ligation is performed by the DNA ligase of the phage T4 at a temperature of 0eC with the fragments obtained on the hydrolysis of the DNA of the plasmid pPRIOO with the restrictases BamHI and PstI. The resulting DNA preparation is used to transform cells of E.coli C600 with selection of transformants on an environment with ampi-cillin, followed by selection of Cmr clones on an environment with 300 µg / ml chloramphenicol after culturing of the cells at a temperature of 42 ° C. From the clones thus selected, the plasmid DNA 30 is isolated and studied by restriction analysis. As a result, the plasmid pPRI24 is obtained, which contains a unique region by means of the restrictase BamHI. Then 3 µg of the DNA of the plasmid pPRI24 is cleaved by the restrictase Xbal in 70 µl of a restriction I buffer containing 10mM 35 tris-HCl, pH 7.9, 6mM MgCl2> 6mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl. The DNA is reprecipitated with 2 parts by volume of ethanol.

Het precipitaat wordt in 15 /ul H2O opgelost. De completering van de 3'-eindstandige gebieden met enkele keten van het DNA wordt bewerkstelligd door behandeling met een Klenov's fragment van het DNA-polyme-40 rase I van E.coli in een monster van 20 /ul, dat 10 mM tris-HCl, pHThe precipitate is dissolved in 15 µl H 2 O. Completion of the 3'-single-chain regions of the DNA is accomplished by treatment with a Klenov's fragment of the E. polymer DNA polymer-40 phase I in a 20 µl sample containing 10 mM tris-HCl , pH

.8820103 11 8,0, 10 mM MgCl2» 2 /Ug van het DNA preparaat bevat, door 30 /UM desoxyribonuclelsidetrifosfaten, 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het react!emengsel wordt met ethanol neergeslagen en in 100 /ul H2O opgelost. De ligatie van het lineair gemaakte plasmide DNA met Bgl II 5 bindingsmiddelen wordt bewerkstelligd bij een temperatuur van 16eC gedurende 12 uur. Door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster, dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH.7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosinetrifosfaat, 2/ug van het plasmide DNA en 0,5 /ug van de bindingsmiddelen bevat. Na de 10 ligatie wordt het DNA uit het reactiemengsel met ethanol neergeslagen, opgelost en aan enzymatische hydrolyse onderworpen door middel van het restrictase BglII in een monster van 40 /ul, dat een buffer voor (6 mM tris-HCl, pH 7,6, 6mM MgCl2» 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl) bevat. Het DNA wordt opnieuw met ethanol neergeslagen, opgelost 15 en cyclisering van de DNA moleculen wordt veilig gesteld; tot dit doel wordt 1 /ug van het plasmide DNA preparaat in 240 yul van een buffer voor ligatie met het DNA-liagse van T4 behandeld. Het resulterende mengsel wordt gebruikt om cellen van E.coli C600 te transformeren. Het transformatierendement is tot 5x10® koloniën per 1 /ug van het 20 natuurlijke plasmide pPRI24. De tegen ampicilline resistente klonen worden gekozen (100 /ug/ml), het plasmide DNA wordt daaruit geïsoleerd gevolgd door een gemodificeerde methode, die gesuggereerd is door Birnboim en Doli en dit DNA wordt voor een restrictieanalyse gebruikt. Als resultaat wordt het plasmide pPRI24B verkregen, in tegenstelling 25 tot het uitgangsvectormolecule pPRI24, heeft een unieke restrictie Bgl II in plaats van de vroeger beschikbare herkenningssekwentie Xbal (fig. 2)..8820103 11 8.0, 10 mM MgCl2 »2 / Ug of the DNA preparation contains, by 30 µm deoxyribonuclideside triphosphates, 5 units of the enzyme. The DNA from the reaction mixture is precipitated with ethanol and dissolved in 100 µl H 2 O. The ligation of the linearized plasmid DNA with Bgl II 5 binding agents is accomplished at a temperature of 16 ° C for 12 hours. Using the DNA ligase from the phage T4 in a sample containing a buffer for ligation (60 mM tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl 2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.4 mM adenosine triphosphate, 2 µg of the plasmid contains DNA and 0.5 µg of the binding agents After the ligation, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved and subjected to enzymatic hydrolysis by means of the restrictase BglII in a sample of 40 µl , which contains a buffer for (6mM tris-HCl, pH 7.6, 6mM MgCl2 »6mM 2-mercaptoethanol, 50mM NaCl) The DNA is reprecipitated with ethanol, dissolved and cyclization of the DNA molecules becomes safe To this end, 1 µg of the plasmid DNA preparation in 240 µl of a buffer for ligation is treated with the DNA layer of T4 The resulting mixture is used to transform cells of E. coli C600. 5x10® colonies per 1 µg of the natural plasmid pPRI24 The counter ampicillin res Selected clones are selected (100 µg / ml), the plasmid DNA is isolated therefrom followed by a modified method suggested by Birnboim and Doli and this DNA is used for a restriction analysis. As a result, the plasmid pPRI24B is obtained, unlike the starting vector molecule pPRI24, has a unique restriction Bgl II instead of the previously available recognition sequence Xbal (Fig. 2).

Trap 2 - constructie van het tussenprodukt plasmide pPR-IFNBl-123. In de vector pPRI24B wordt de coderingssekwentie van fibroblastisch hu-30 maan interferon geïntegreerd uit het plasmide pINB-trp 7. Tot dit doel wordt 10 /ug van het DNA pINB-trp 7 gezamenlijk met de restric-tasen EcoRI en Sau 3A behandeld in een monster van 100 /ul, dat een buffer voor restrictie-2 bevat.Stage 2 - construction of the intermediate plasmid pPR-IFNB1-123. In the vector pPRI24B, the coding sequence of fibroblastic hu-lunar interferon is integrated from the plasmid pINB-trp 7. For this purpose, 10 µg of the DNA pINB-trp 7 is treated together with the restric tasen EcoRI and Sau 3A. 100 µl sample containing a restriction-2 buffer.

Het resulterende preparaat wordt op een gel van een 1,1¾ agarose 35 met laag smeltpunt aangebracht en aan electroforese in een tris-ace-taatbuffersysteem onderworpen. De gel strook, die het DNA fragment 510 b.p. lang bevat, wordt uitgesneden en het DNA wordt uit de gel geëlu-eerd. Het aldus gevormde DNA fragment (ongeveer 1/ug) wordt in het plasmide pPRI24B geïntegreerd. Tot dit doel wordt 1 /ug van het DNA 40 pPRI24 gesplitst door middel van de restrictasen EcORI en BglII in een .8820103 12The resulting preparation is applied to a gel of a low melting point 1.1¾ agarose 35 and electrophoresed in a tris-acetate buffer system. The gel strip containing the DNA fragment 510 b.p. long, cut out and the DNA is eluted from the gel. The DNA fragment thus formed (about 1 µg) is integrated into the plasmid pPRI24B. For this purpose, 1 µg of the DNA 40 pPRI24 is cleaved by means of the restrictases EcORI and BglII in a .8820103 12

monster van 20 /Ul in een buffer voor restrictie-2. Het resulterende preparaat wordt aan een fenolische deproteïnisering onderworpen, het DNA wordt met ethanol neergeslagen en in 10 /Ul h^O opgelost. 0,5 /ug van het gesplitste plasmide pPRI24B wordt met 1 /Ug van het ge-5 isoleerde fragment van het plasmide pINB-trp 7 verenigd en met het DNA-ligase van T4 in een monster van 30 /Ul in een buffer voor liga-tie behandeld. Het aldus gevormde DNA preparaat wordt voor transformatie van cellen van E.coli C600 met selectie van transformanten op een milieu met ampicilline gebruikt, gevolgd door selectie van cCms-klo-10 nen op een milieu met 200 /ug/ml chlooramfenicol na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 42eC. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA geïsoleerd en door middel van een restrictie-analyse bestudeerd. In het resulterende plasmide is het EcoRI-BglII frapent, dat het C-eindstandige deel van chlooramfenicol acetyl transfe-15 rase in de vector pPRI24 codeert, vervangen door de coderingssekwentie van volgroeid humaan 81-interferon. Dit plasmide wordt als pPR-IFN20 µL sample in restriction-2 buffer. The resulting preparation is subjected to phenolic deproteinization, the DNA is precipitated with ethanol and dissolved in 10 µl h 2 O. 0.5 µg of the cleaved plasmid pPRI24B is combined with 1 µg of the isolated fragment of the plasmid pINB-trp 7 and with the DNA ligase of T4 in a sample of 30 µL in a buffer for league -tie treated. The DNA preparation thus formed is used for transformation of cells of E. coli C600 with selection of transformants on an environment with ampicillin, followed by selection of cCms clones on an environment with 200 µg / ml chloramphenicol after culturing the cells at a temperature of 42 ° C. The plasmid DNA is isolated from the clones thus selected and examined by means of a restriction analysis. In the resulting plasmid, the EcoRI-BglII frapent encoding the C-terminal portion of chloramphenicol acetyl transferase in the vector pPRI24 has been replaced by the coding sequence of mature human 81 interferon. This plasmid is referred to as pPR-IFN

1-123 aangeduid en het wordt bij de volgende trap van het constructieproces gebruikt.1-123 and is used in the next step of the construction process.

Trap 3 - constructie van het plasmide pPR-IFNBl-13. 30 /ug van 20 het DNA van het plasmide pPR-IFNBl-123 wordt gesplitst door middel van het restrictase BamHI in 150 /ul van een buffer voor restrictie-I, wordt het DNA aan een fenolische deproteïnisering onderworpen en met ethanol neergeslagen. Het precipitaat wordt in 40 /Ul H2O opgelost. Voor de beperkte afbraak van het DNA door middel van 3*—*· 5* exonu-25 clease activiteit van het DNA-polymerase-I. E.coli, wordt het resulterende DNA preparaat aan incubatie onderworpen in een monster van 50 /ul, dat 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 /uM ethyleendiaminetetraazijn-zuur, 5 mM MaCl2» 100 /UM desoxyadenosinetrifosfaat (en vervolgens desoxyguanosinetrifosfaat) en 20 eenheden van het DNA-polymerase bevat. 30 De reactie wordt gestopt, het DNA wordt neergeslagen en het neerslag wordt opnieuw in 40 /Ul H2O opgelost. 10 /ug van het resulterende preparaat wordt met het restrictase EcoRI in 50 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, gevolgd door een fenolische deproteïni-sering en precipitatie van het DNA met ethanol; het precipitaat wordt 35 in 30 /ul H2O opgelost.Step 3 - construction of the plasmid pPR-IFNBl-13. 30 µg of the DNA of the plasmid pPR-IFNB1-123 is cleaved by means of the restrictase BamHI in 150 µl of a restriction I buffer, the DNA is phenolic deproteinized and precipitated with ethanol. The precipitate is dissolved in 40 µl H 2 O. For the limited degradation of the DNA by means of 3 * - * 5 * exonu-25 clease activity of the DNA polymerase-I. E.coli, the resulting DNA preparation is incubated in a sample of 50 µl containing 50 mM tris-HCl (pH 8.0), 10 µM ethylenediamine tetraacetic acid, 5 mM MaCl 2 »100 / UM deoxyadenosine triphosphate (and then deoxyguanosine triphosphate) and 20 units of the DNA polymerase. The reaction is stopped, the DNA is precipitated and the precipitate is redissolved in 40 µl H 2 O. 10 µg of the resulting preparation is treated with the restriction EcoRI in 50 µl of a restriction-2 buffer, followed by a phenolic deproteinization and precipitation of the DNA with ethanol; the precipitate is dissolved in 30 µl H 2 O.

De verwijdering van de eendradige eindstandige gebieden van het resulterende DNA preparaat wordt bewerkstelligd onder toepassing van het SI-endonuclease in een monster van 100 /ul, dat 30 mM Q^COONa (pH 4,4), 4,5 mM ZnSO/j, 250 mM NaCl, 10 /ug van het DNA, 200 eenhe-40 den van het SI-endonuclease. De reactie wordt bij een temperatuur van > 882 0103 13 20eC uitgevoerd, waarna het mengsel aan een fenolische behandeling en preeipitatie van het nucleïnezuur met ethanol wordt onderworpen. Het precipitaat wordt in 20 /Ul H2O opgelost. 4 /Ug van het aldus verkregen DNA preparaat wordt met een Klenov fragment van het DNA-poly-5 merase I E.coli onder de hierboven beschreven omstandigheden behandeld om waarschijnlijk bestaande molecuul einden met enkele keten tot die met twee ketens te completeren. De reactie wordt door een fenolische depro-teïnisering gestopt, de nucleïnezuren worden met ethanol neergeslagen en in 20 /ul H2O opgelost.Removal of the one-stranded terminal regions of the resulting DNA preparation is accomplished using the SI endonuclease in a 100 µl sample containing 30 mM Q 2 COONa (pH 4.4), 4.5 mM ZnSO / j, 250 mM NaCl, 10 µg of the DNA, 200 units-40 units of the SI endonuclease. The reaction is carried out at a temperature of> 882 0103 13 20 ° C, after which the mixture is subjected to a phenolic treatment and precipitation of the nucleic acid with ethanol. The precipitate is dissolved in 20 µl H 2 O. 4 / Ug of the DNA preparation thus obtained is treated with a Klenov fragment of the DNA polymer merase I E. coli under the conditions described above to complete probably existing single-chain to two-chain molecule ends. The reaction is stopped by phenolic deproteinization, the nucleic acids are precipitated with ethanol and dissolved in 20 µl H 2 O.

10 De ligatie van de lineaire DNA moleculen met de einden met twee ketens wordt bij een temperatuur van 16°C uitgevoerd in een monster van 50 /u 1, dat 60 mM tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgC^j 10 mM dithiotre-itol, 4 mM adenosinetrifosfaat, 8 gew.% polyethyleenglycol-6000, 4 /ug van het DNAm 100 eenheden van het DNA-ligase van T4 bevat. Na 15 voltooiing van de reactie wordt het monster viermaal verdund en wordt precipitatie van nuclelnezuren bewerkstelligd door middel van ethanol. 20 /ug van het in water opgeloste DNA wordt met het restrictase Bgl II in 30 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, het DNA wordt uit het reactiemengsel met ethanol neergeslagen, in water opge-20 lost en met het DNA-ligase van T4 in 20 /ul van een buffer voor ligatie behandeld. Het resulterende DNA-preparaat wordt gebruikt voor transformatie van cellen van E.coli C600, zoals het hiervoor is beschreven, gevolgd door selectie van de transformanten op een milieu met ampicilline na het kweken van de cellen gedurende een dag bij een tem-25 peratuur van 28°C. Uit de aldus bereide transformanten worden die met een verminderd vermogen voor groei bij een temperatuur van 42°C geselecteerd. Uit deze klonen wordt het plasmide DNA zoals hierboven beschreven geïsoleerd en aan een restrictieanalyse onderworpen.The ligation of the linear DNA molecules with the two-chain ends is performed at a temperature of 16 ° C in a sample of 50 µl 1 containing 60 mM tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgC ^ j 10 mM dithiothreitol, 4 mM adenosine triphosphate, 8 wt% polyethylene glycol-6000, 4 µg of the DNAm contains 100 units of the T4 DNA ligase. After the completion of the reaction, the sample is diluted four times and precipitation of nucleic acids is effected by means of ethanol. 20 µg of the DNA dissolved in water is treated with the restrictase Bgl II in 30 µl of a buffer for restriction-2, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved in water and with the DNA ligase of T4 in 20 µl of a buffer for ligation. The resulting DNA preparation is used for transformation of E. coli C600 cells as described above, followed by selection of the transformants on an ampicillin medium after culturing the cells for one day at a temperature of 28 ° C. From the transformants thus prepared, those with a reduced ability for growth at a temperature of 42 ° C are selected. The plasmid DNA is isolated from these clones as described above and subjected to a restriction analysis.

Om de primaire structuur van het hybridegebied van combinerende 30 ribosomen voor het gen IFN-1 in het aldus gevormde plasmide pPR-IFNTo determine the primary structure of the hybrid region of combining ribosomes for the IFN-1 gene in the plasmid pPR-IFN thus formed

1-13 te identificeren, wordt 30 /ug van het overeenkomstige DNA met het restrictase Hind II in 100 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, wordt het preparaat op een gradiënt (4-12%) polyacrylami-degel aangebracht en aan el ectroforese in een buffersysteem van tris— 35 acetaat onderworpen. Het DNA fragment ongeveer 190 b.p. lang wordt uit de gel geëlueerd onder toepassing van de methode van Maxam Gilbert; het wordt vervolgens door middel van het DNA-ligase van T4 met BamHI bindingsmiddelen verlengd op een wijze, soortgelijk aan de hierboven beschreven methode van de toevoeging van Bgl II-bindingsmiddelen aan 40 het lineair gemaakte plasmide pPRI24. Het DNA wordt uit het reactie- . 8820103 14 mengsel door middel van ethanol neergeslagen en het precipitaat wordt in 20 /ul H2O opgelost, door middel van het restrictase BamHI in 30 /ul van een buffer voor restrictie-1 gesplitst, het DNA wordt aan een fenolische deprotelnisering onderworpen, opnieuw met ethanol neerge-5 slagen en in H2O opgelost.1-13, 30 µg of the corresponding DNA is treated with the restrictase Hind II in 100 µl of a restriction-2 buffer, the preparation is applied to a gradient (4-12%) polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis in a tris-acetate buffer system. The DNA fragment about 190 b.p. eluted from the gel for a long time using the method of Maxam Gilbert; it is then extended by the T4 DNA ligase with BamHI binding agents in a manner similar to the above-described method of adding Bgl II binding agents to the linearized plasmid pPRI24. The DNA is extracted from the reaction. 8820103 14 mixture precipitated by means of ethanol and the precipitate is dissolved in 20 µl H 2 O, split by means of the restrictase BamHI in 30 µl of a buffer for restriction-1, the DNA is subjected to a phenolic depopulation, again with ethanol knocked down and dissolved in H2O.

De moleculaire kloonvorming van het DNA fragment in de replicatie-ve vorm van het DNA van de bacteriofaag M13mpI0 gevormd na splitsing met BamHI, selectie van recombinant fagen op een indicatormilieu, dat 5*-broom-4-chloor-3-indolyl- -D-galactoside bevat, isolering van het 10 faag DNA met enkele keten en bepaling van de primaire structuur van het gekloonde fragment volgens de methode van een beperkte matrixkopi-ering {methode gesuggereerd door F. Senger) worden uitgevoerd volgens standaardmethoden. De nucleotidesekwentie van het hybridegebied van combinerende ribosomen gevonden door de Senger methode in het plasmide 15 pPR-IFNPl-13 is de volgende: 51---- TAAGGAGGTTGCATG...-31, waarin TAAGGAGGT - SD-sekwentie van het cro van de faag A en ATG - methioni-necodon van Bl-interferon.The molecular cloning of the DNA fragment in the replicative form of the DNA of the bacteriophage M13mp10 formed after cleavage with BamHI, selection of recombinant phages on an indicator medium containing 5 * -bromo-4-chloro-3-indolyl--D galactoside, isolation of the single chain phage DNA and determination of the primary structure of the cloned fragment by the method of limited matrix copying (method suggested by F. Senger) are performed according to standard methods. The nucleotide sequence of the hybrid region of combining ribosomes found by the Senger method in the plasmid pPR-IFNPl-13 is the following: 51 ---- TAAGGAGGTTGCATG ...- 31, wherein TAAGGAGGT - SD sequence of the phage cro A and ATG - methionine necodon of B1 interferon.

Voorbeeld IIExample II

De stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) - vormer van fi-20 broblastisch humaan 1-interferon wordt op de volgende wijze gevormd.The strain E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) -former of fibro-20 broblastic human 1-interferon is formed in the following manner.

Het plasmide pPR-IFNBl-13, dat de synthese van fibroblastisch humaan interferon codeert, wordt door transformatie op een wijze soortgelijk aan die beschreven in voorbeeld I hierboven uitgevoerd in cellen van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (gedeponeerd bij de All-Union 25 Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union ResearchThe plasmid pPR-IFNBl-13, encoding the synthesis of fibroblastic human interferon, is carried out in cells of the strain E.coli VNIIGenetika VL 903 (deposited with the All-Union) by transformation in a manner similar to that described in Example I above. 25 Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research

Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms en geregistreerd onder nr. BKIIM B-3546). Het transformatierendement van cellen van E.coli VNIIGenetika VL 903 is ongeveer 10® klonen per /ug van het natuurlijke DNA van het plasmide pPR-IFNBl-13. De trans-30 formanten worden op een milieu, dat ampicilline (100 /ug/ml) bevat na het kweken van de cellen gedurende een dag bij een temperatuur van 28°C geselecteerd. Uit de geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA gewonnen en de identiteit ervan wordt met het DNA preparaat pPR-IFNBl-13 bewezen door middel van een restrictieanalyse. De stan E.coli 35 VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFB 1-13) wordt aldus verkregen.Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms and registered under No. BKIIM B-3546). The transformation efficiency of E.coli VNIIGenetika VL 903 cells is approximately 10® clones per µg of the natural DNA of the plasmid pPR-IFNBl-13. The trans-30 formants are selected on an environment containing ampicillin (100 µg / ml) after culturing the cells for a day at a temperature of 28 ° C. The plasmid DNA is recovered from the selected clones and its identity is proved by the restriction analysis with the DNA preparation pPR-IFNBl-13. The standard E.coli 35 VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFB 1-13) is thus obtained.

Voor de bepaling van de produktiviteit van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) worden de plasmide bevattende cellen bij een temperatuur van 28°C op een schuin opgesteld agar bevattend standaardmilieu van Hottinger, dat 50 /ug/ml ampicilline bevat, gedu-40 rende 14 uur gekweekt. De op de schuinten gekweekte biomassa wordt ge- -8820103 15 bruikt voor de bereiding van het inoculatiemateriaal. Tot dit doel worden de cellen in Erlenmeyerkolven van 750 /ul met 100 ml van het milieu van Hottinger, dat 100 /Ug/ml ampicilline bevat overgebracht en bij een temperatuur van 28eC op een schutinrichting bij 240 omw./min 5 gedurende 6 zes gekweekt. De optische dichtheid van de inoculatiekweek is 1,5-2,5 eenheden.For the determination of the productivity of the strain E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), the plasmid-containing cells are placed at a temperature of 28 ° C on an obliquely placed agar containing Hottinger's medium, containing 50 µg / ml ampicillin cultivated for 14 hours. The skew grown biomass is used for the preparation of the inoculation material. For this purpose, the cells are transferred into 750 / µl Erlenmeyer flasks with 100 ml of Hottinger's medium containing 100 µg / ml ampicillin and grown at 6 ° C on a shaker at 240 rpm for 6-6 . The optical density of the inoculation culture is 1.5-2.5 units.

De fermentatie wordt uitgevoerd in een fermentatieinrichting, die voorzien is van systemen voor het regelen van de pH, de temperatuur, het roeren en de beluchtingssnelheid. Voor de fermentatie wordt een 10 milieu van Hottinger met 100 /ug/ml ampicilline en 10 g/1 glucose gebruikt. De inoculatiekweek wordt in een hoeveelheid van 5-10% betrokken op de massa ingevoerd. De kweek wordt bij een pH van 6,6-6,8 uitgevoerd, terwijl dit niveau door toevoeging van ammoniakwater wordt gehandhaafd. Het eerste deel van de fermentatie wordt uitgevoerd bij een 15 temperatuur van 28°C tot de optische dichtheid van 3,5 bij 550 nm, waarna thermoinductie wordt uitgevoerd door de temperatuur gedurende 5 minuten op 42-45°C te verhogen, vervolgens wordt de fermentatie gedurende nog eens 2 uur bij dezelfde temperatuur voortgezet.The fermentation is carried out in a fermenter equipped with systems for controlling the pH, temperature, stirring and aeration rate. A fermentation medium of Hottinger with 100 µg / ml ampicillin and 10 g / l glucose is used for the fermentation. The inoculation culture is introduced in an amount of 5-10% by mass. The culture is carried out at a pH of 6.6-6.8, while this level is maintained by adding ammonia water. The first part of the fermentation is carried out at a temperature of 28 ° C to the optical density of 3.5 at 550 nm, after which thermoinduction is carried out by raising the temperature at 42-45 ° C for 5 minutes, then the fermentation continued at the same temperature for an additional 2 hours.

Na voltooiing van de werkwijze worden om de activiteit van intefe-20 ron te bepalen cellen uit 1 ml van de kweekvloei stof door centrifugeren neergeslagen, wordt het neerslag in 1 ml van een 1%'s oplossing van na-triumdodecylsulfaat in een 0,02M fosfaatbuffer met een pH van 7,2, die 1% 2-mercaptoethanol bevat, gesuspendeerd en gedurende 2-4 minuten op een temperatuur van 100°C verhit. Daarna wordt het neerslag door cen-25 trifugeren afgescheiden en wordt de activiteit van interferon, aanwezig in de bovenstaande fractie, volgens standaardmethoden of door bescherming van humane diplolde fibroblasten uit het cytopatische effect van het virus van vesicualaire stomatitis of volgens de methode van immuno-enzymatische analyse bepaald. Als standaardreferenties worden prepara-30 ten van 8-interferon ("Torey", Japan) gebruikt, die tegen het standaard leukocytinterferon MPC B 69/19 (Groot-Brittannië) worden getriteerd.After the completion of the procedure, to determine the activity of intra-20 cells, cells are precipitated from 1 ml of the culture liquid by centrifugation, the precipitate is dissolved in 1 ml of a 1% solution of sodium dodecyl sulfate in a 0.02M phosphate buffer with a pH of 7.2, containing 1% 2-mercaptoethanol, suspended and heated at a temperature of 100 ° C for 2-4 minutes. The precipitate is then separated by centrifugation and the activity of interferon present in the above fraction is obtained by standard methods or by protection of human diplolate fibroblasts from the cytopathic effect of the virus of vesicular stomatitis or by the method of immunoenzymatic analysis determined. As standard references, preparations of 8-interferon ("Torey", Japan) are used, which are triturated against the standard leukocyte interferon MPC B 69/19 (Great Britain).

De activiteit van fibroblastisch humaan interferon, dat gesynthetiseerd is in cellen van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), bepaald volgens verschillende methoden, is meer dan 35 2 x 10^ internationale eenheden/liter van de bacterie kweek.The activity of fibroblastic human interferon, which has been synthesized in cells of the strain E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), determined by different methods, is more than 35 2 x 10 ^ international units / liter of the bacterial culture .

Voor de bepaling van het deel van het gesynthetiseerde fibroblas-tische interferon in het totaal van het cel proteïne, worden de cellen uit 1 ml van de kweekvloei stof door centrifugeren neergeslagen en zoals hierboven beschreven behandeld; het preparaat wordt door middel van 40 electroforese bij aanwezigheid van 0,1% natriumdodecylsulfaat in een .8820103 16 15¾1s polyacrylamidegel volgens een standaardmethode afgescheiden. De in de polyacrylamidegel afgescheiden proteïnen worden in een oplossing Kumassi R-250 "Serva" (West-Duitsland) volgens een standaardmethode gekleurd. Het kwantitatieve gehalte van proteïnen in de zones 5 wordt bepaald na het aftasten van de gel in een geautomatiseerde laser-densitometer. De identificatie van de zone, die overeenkomt met het volgroeide fibroblastinterferon, dat in de cellen is gesynthetiseerd (19 kD) wordt uitgevoerd op basis van vergelijking met de electrofore-tische beweeglijkheid van de merkerproteïne, alsmede door middel van 10 immunovlekvorming van afgescheiden proteïnefracties in nitrocellulo-sefilters en identificatie van de interferonzone door behandeling van de filters in oplossingen, die monoclonale antilichamen van de muis tegen Mnterferon en anti-muis konijnenantilichamen geconjugeerd met peroxidase uit mierikswortel bevatten. Na een overeenkomstige kleu-15 ringsmethode verschijnt de interferonzone als een donkerbruine band tegen een niet gekleurde achtergrond van het nitrocellulosefilter.For the determination of the portion of the synthesized fibroblastic interferon in the total of the cell protein, the cells are centrifuged from 1 ml of the culture fluid and treated as described above; the preparation is separated by electrophoresis in the presence of 0.1% sodium dodecyl sulfate in a .8820103 16 15µs polyacrylamide gel according to a standard method. The proteins separated in the polyacrylamide gel are stained in a standard Kumassi R-250 "Serva" (West Germany) solution. The quantitative content of proteins in zones 5 is determined after scanning the gel in an automated laser densitometer. The identification of the zone corresponding to the mature fibroblast interferon synthesized in the cells (19 kD) is performed on the basis of comparison with the electrophoretic motility of the marker protein, as well as by immunostaining of secreted protein fractions in nitrocellulose. filtering and identification of the interferon zone by treatment of the filters in solutions containing mouse monoclonal antibodies to Mnterferon and rabbit anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase. After a corresponding staining method, the interferon zone appears as a dark brown band against an uncoloured background of the nitrocellulose filter.

Het proteïnegehalte in de zone, die overeenkomt met Bl-interfe-ron, is ongeveer 10¾ van het totale proteïne van de plasmide bevattende cellen van E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13).The protein content in the zone corresponding to B1 interferon is about 10¾ of the total protein of the plasmid containing cells of E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13).

20 Industriële toepasbaarheid20 Industrial applicability

Het recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding, dat de synthese van fibroblastisch humaan βΐ-interferon codeert, is geschikt voor de bereiding van stammen, die humaan βΐ-inter-feron met een grote activiteit vormen.The recombinant plasmid DNA pPR-IFNBl-13 of the present invention, which encodes the synthesis of fibroblastic human βΐ-interferon, is suitable for the preparation of high activity human βΐ-interferon strains.

25 De bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) volgens de onderhavige uitvinding - een vormer van humaan 31-interferon, is geschikt in de microbiologische en medische industrieën.The bacterial strain Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) according to the present invention - a creator of human 31 interferon, is suitable in the microbiological and medical industries.

.8820103.8820103

Claims

1. A recombinant plasmid DNA pPR-IFNBl-13 encoding the synthesis of fibroblastic human βΐ-interferon, characterized in that it has a size of 3,900 b.p. and consists of the following units: «- BamHI-Bgl II fragment with a size of 3,400 b.p. of the vector plasmid pPRI34B, formed from pPR40 and pML23; EcoRI-Sau3A fragment of the plasmid pINB-trp 7 with a size of 510 b.p. and having the following characteristics: 10. Contains a region responsible for the initiation of replication and its regulation - Col EI replicon, a gene from phage A repressor cits 857, a gene with resistance to amicillin Apr , a tandem of β-independent transcription terminators of the phage fd, a regulatory region PrOr and an SD sequence of the gene λ cro, which encodes the sequence of a mature fibroblastic human interferon IFNP1 with its own methionine codon; the ligation of the regulatory region of the A cro gene, which encodes a portion of βΐ-interferon and transcription terminators fd, is effected to form a hybrid region of 20 combining ribosomes for the IFNBI gene, which has the following nucleotide isolation: 51 -... TAAGGAGGTTGCATG ...- 31, in which TAAGGAGGT -SD sequence of the gene cro of the phage λ ATG - methionine codon of interferon and directs after the terminal codon of the gene IFNBl a tandem of 25 / -independent phage fd transcription terminators are located; - has unique recognition regions of the restases Cla I, the coordinate of which is the beginning of count (0), Pvu II (about 1,110), Bgl II (about 1,480), AccI (about 1,870), Pvu I (about 30,360); deposited with the Collection of Cultures of Microorganisms of the Union-Union Research Institute of Antibiotics and registered under No. 1825.

Method for the construction of a recombinant plasmid DNA pPR-IFNBl-13 according to claim 1, characterized in that the vector plasmid pPRI24B, constructed on the basis of the plasmids pPR40 and pML24, is cleaved by means of the restriction endonucleases E coRI and BglII and ligation of the largest of the fragments of the vector molecule formed with the EcoRI-Sau3A fragment of the plasmid ρΙΝβ-trp 7, which contains the coding portion of mature human 1-interferon; 40 in the recombinant plasmid pPR-IFNB1-123 thus formed in the vicinity of the SD sequence of the gene cro and the first (methionine) codon of 1-interferon is effected, for which the plasmid DNA is hydrolyzed by of the restrictase BamHI, part of the nucleotides is removed by the exonuclease activity of the E.coli DNA polymerase I, which manifests itself under conditions of incomplete setting of nucleoside triphosphates in the reaction mixture; the DNA is enzymatically cleaved by the restrictase EcoRI, treated with the SI endonuclease to remove single chain DNA regions, then the two chain ends are repaired by means of a Klenov fragment of the E. polymer DNA polymerase I and the resulting linear DNA molecules are cycled by the DNA ligase from the phage T4; the resulting preparation is used to transfer E. coli C600 cells with transformant selection to an ampicillin medium after culturing the cells at a temperature of 28 ° C, followed by selection of clones, which rapidly slow growth at 42 ° C, after which the recombinant plasmid DNA pPR-IFN31-13 is isolated from the selected clones.

A bacterial strain of Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 20 (pPR-IFNBl-13), a creator of human βΐ-interferon, containing the recombinant plasmid DNA pPR-IFNBl-13 according to claim 1, formed by the method of genetic engineering by means of of introduction of the recombinant plasmid DNA pPR-IFNBl-13 into the bacterium Escherichia coli, deposited on 12-01-1987 with the Collection of Cultures of microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics and registered under no. 1825 . ***** .8820103