NL8820103A - Recombinant plasmide dna - phr-ifnbeta 1-13 coderende synthese van fibroblastisch humaan beta1-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie escherichia coli vniigenetika vl 903 (phr-ifnbeta1-13), die humaan beta1-interferon vormt, die dit bevat. - Google Patents

Description

S' 88 2 0 1 0 3 * N.O. 35425 1

Recombinant plasmide DNA - pHR-IFNB 1-13 coderende synthese van fibroblast! sch humaan Bl-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pHR-IFNBl-13), die humaan Bl-interferon vormt, die dit bevat._ 5

Aanvraagster noemt als uitvinders:

VLADIMIR GEORGIEVICH DEBABOV JURY IVANOVICH KOZLOV 10 SERGEI VLADIMIROVICH MASHKO ALEXANDR YAKOVLEVICH STRONGIN VIKTOR EMILIEVICH STERKIN VITALY IVOVICH JURIN MARINA IVANOVNA LEBEDEVA 15 MAXIM EDUARDOVICH TRUKHAN

SERGEI MIKHAILOVICH PODKOVYROV ALLA LVOVNA LAPIDUS ANDREI VLADIMIROVICH MOCHULSKY LARA SEMENOVNA IZOTOVA 20 ANNA STANISLAVOVNA RYZHAVASKAYA ANDREI PETROVICH ALEXENKO SERGEI VIKTOROVICH KOSTROV MARINA ALEXEEVNA KOLEVATYKH VALDEMARAS VITAUTOVICH GERVINSKAS 25 ELENA ALEXEEVNA NOSOVSKAYA LJUDMILA VLADIMIROVNA EVDONINA VITALY ARKADIEVICH LIVSHITS VLADAS-ALGIRDAS VLADOVICH BUMYALIS SERGIE IONOVICH BORUKHOV 30 TATYANA GRIGORIEVNA PLOTNIKOVA ALEXANDR PETROVICH BOLOTIN EUGENIJUS-ARVIDAS ANDREEVICH YANULAITIS

Beschrijving 35 Gebied van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op het gebied van genetische constructie en biotechnologie en meer in het bijzonder op een nieuw recombinant plasmide DNA - pHR-IFNBl-13, dat de synthese van een fibroblastisch humaan 1-interferon codeert, op een werkwijze ter berei-40 ding ervan en op een stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika Ï882O103 2 VL 903 (pPR-IFN 1-13), dat een vormer van humaan-interferon is, die dit bevat.

Stand der techniek

Interferons zijn proteïnen, die door speciale humane cellen wor-5 den gesynthetiseerd in reactie op een virusinfectie of op een effect van verschillende inductoren. De op het huidige tijdstip beschikbare experimentele gegevens zijn gericht op antivirale, antiproliferative en immunomodulerende effecten van interferon na behandeling daarmee van afzonderlijke cellen, weefsels en het organisme als geheel. Met betrek-10 king tot het veelzijdige karakter en de betekenis voor het organisme ervan, is het interferonsysteem vergelijkbaar met het immuniteitssy-steem. In overeenstemming met antigene, biologische en chemische eigenschappen, alsmede afhankelijk van het type cellen, dat deze interferons vormt, worden humane interferons in drie groepen verdeeld: 15 α-leukocytisch, $-fibrob1astisch, Y-immuunachtig, die in hoofdzaak door cellen van respectievelijk leukocyten, fibroblasten en T-lymfocyten worden gevormd.

Op het ogenblik worden de toepassingsgebieden van interferons in de geneeskunde in het algemeen bepaald. Deze toepassingen zijn kerati-20 tis en dermatosen, behandeling van ademhalingsinfeeties teweeggebracht door verschillende virussen (influenza, adenovirussen) hepatitis B en dergelijke.

Echter is het werkingsmechanisme van interferons, de structurele en functionele kenmerken en de klinische potentie ervan niet voldoende 25 geschikt bestudeerd. Dit hangt in grote mate samen met de moeilijkheden van het verkrijgen van preparatieve hoeveelheden zuivere interferons door traditionele methoden, die gebaseerd zijn op het gebruik van geïnduceerde kweken van humane cellen als een bron van dit proteïne. Voorts bevat het in dit geval gesynthetiseerde interferon als 30 regel een mengsel van verschillende typen en vormen ervan, die in hun structurele en functionele eigenschappen verschillen. In dit opzicht verwerft de bereiding van afzonderlijke interferons door een microbiologische synthese een steeds groeiende schaal.

In de techniek is een aantal werkwijzen bekend voor de bereiding 35 van humane interferonen α, β en V» die gebaseerd zijn op het gebruik van bacteriën als producenten, in het bijzonder verschillende stammen van Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. die recombinant plasmide DNA's bevatten, die expressie van heterologe genen in een nieuwe genetische omgeving waarborgen. In het geval van een fibroblas-40 tisch humaan interferon (IFBB1), voor het waarborgen van expressie van .8820103 3 het gen IFNB1 in cellen van E.coli wordt gebruik gemaakt van het instellen van het coderende gedeelte van een volgroeid inteferon onder de controle van transcriptiesignalen en genentranslatie (tuf B, ree A) en operons (lac UV 5t ) van E.coli en colifagen (PLA). Een als 5 resultaat van de microbiologische synthese (met een moleculaire massa van ongeveer 19.000 Dalton) gevormd volgroeid βΐ-interferon wordt gekenmerkt door de afwezigheid van de koolhydraatcomponent en door de beschikbaarheid van een N-eindstandige rest van formylmethionine in plaats van die van methionine. Echter resulteert dit onderscheid niet 10 in een verandering in de biologische activiteit van een protelnepro-dukt van het gen IFNB1 in vergelijking met het in cellen van fibroblas-ten gevormde natuurlijke glycoproteïne. Het volgens deze microbioli-gische werkwijze gesynthetiseerde Bl-interferon kan gebruikt worden voor zowel onderzoekingen over het moleculaire mechanisme van wissel-15 werking met cel receptoren als in de medische praktijk.

In de techniek bekend zijn recombinant plasmide DNA's, die de synthese van een fibroblastisch humaan Bl-interferon coderen, zoals pC1857 en pPL c 245HFIF25 en de stam E.coli SG4044, die deze plasmiden bevatten. (Remaut E., Staussenes P., Fiers G., 1983, Nucl. Acida Res. 11, 20 4677-4688).

In het recombinant plasmide DNA pPL c 24HFIF25 wordt de transcriptie van het gen IFNBl geregeld door de regelingseenheid Pj_0|_ van het bacteriofaag A en initiëring van translatie van het proteïne-produkt van het gen wordt gewaarborgd voor rekening van constructie van 25 een hybridegebied van het binden van ribosomen op de basis van de SD-sekwentie van het replicase gen van het faag MS2. De maximale opbrengst van humaan BI-interferon, gewaarborgd door het kweken van de hierboven geïdentificeerde stam is 4¾ van het totale proteïne van plasmide bevattende cellen van E.coli.

30 De hierboven vermelde stam wordt gekenmerkt, doordat de gecontroleerde expressie van het gen IFNB1, gewaarborgd met behulp van de Pl promotor, een additioneel plasmide pC1857 vereist met een daarop geplaatst temperatuurgevoelig genregulerend clts857 van het faag A. Dit resulteert in een potentiële instabiliteit van het recombinant plas-35 mi de onder omstandigheden van het kweken van de stam op een grote pro-duktieschaal ten gevolge van een recA afhankelijke recombinatie tussen de plasmiden pC1857 en pPL c 245HFIF25 bij homologe gebieden. Voorts maakt het gebruik van een relatief korte SD-sekwentie van het replocase gen van het faag MS2 voor de organisatie van een hybridegebied van 40 binding van ribosomen het niet mogelijk volledig het potentiële ver- .8820103 4 mogen van het trans!atieapparaat van E.coü te realiseren ten gevolge van een onvoldoende effectieve wisselwerking met ribosomen na initiëring van translatie van firboblastisch interferon. Daarnaast resulteert de afwezigheid van J-afhankelijke transcriptieterminatoren 5 bij het 3'-eindstandige gebied van het gen IFNB1 in het plasmide pPL c 245HFIF25 in een aanzienlijke vermindering van repliceerbaarheid en zelfs in een waarschijnlijk verlies van het recombinant plasmide onder omstandigheden van depressie van een sterk werkzame PL promotor van het faag λ, die initiëring van transcriptie van het gen IFNB1 waar-10 borgt.

Dit alles maakt het niet mogelijk een hoog niveau van de biosyn-these van het produkt van het gen IFNB1 te bereiken en kan resulteren in een verdere verlaging van het contact van Bl-interferon in een biomassa van de producerende stam na de kweek op grote schaal ervan, het-15 geen derhalve winning van het zuivere proteïne ingewikkeld maakt en de opbrengst van het gewenste produkt verlaagt.

Beschrijving van de uitvinding

Het recombinant plasmide DNA pPR-INFBl-13, de werkwijze voor de constructie ervan en de stam van de bacterie Escherichia coli 20 VNIIGetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), die dit bevat, zijn nieuw en tot dusverre niet uit de literatuur bekend.

De onderhavige uitvinding is gericht op het verschaffen van een nieuw recombinant plasmide DNA, dat de synthese van fibroblastisch humaan Bl-interferon codeert, een werkwijze voor de constructie ervan en 25 een nieuwe sterk produktieve stam, die humaan Bl-interferon vormt, die dit bevat, hetgeen bereiding van Bl-interferon in een hoge opbrengst zal waarborgen.

Dit oogmerk wordt tot stand gebracht doordat het recombinant plasmide pPR-IFNBl-12, dat de synthese van humaan fibroblastisch Bl-inter-30 feron volgens de onderhavige uitvinding codeert de afmeting van 3900 b.p. heeft en uit de volgende eenheden bestaat: BamHI-BglII fragment met de afmeting van 3400 b.p. van het vectorplasmide pPRI24B, gevormd op basis van pPR40 en pML24-EcorI-$au3A fragment van het plasmide PINB-trp 7 met de afmeting van 510 b.p. en heeft de volgende kenmer-35 ken: - bevat een gebied, dat verantwoordelijk is voor de initiëring van replicatie en de regeling ervan - ColEI-replicon, een gen van de repressor cits 857 van het faag A, een gen van resistentie voor ampicilline Apr, een tandem van sigma-afhankelijk transcript!etermi-40 natoren van het faag fd, een regelend gebied PR0R en een SD-sekwen- .8820103 5 tie van het gen cro, dat de sekwentie van een volgroeid fibroblastisch humaan Interferon IFN31 met het eigen methionine codon ervan codeert; - ligatuur van het regelingsgebied van het gen cro, dat een deel van 31-interferon codeert en transcript!eterminatoren van het faag fd 5 wordt zodanig bewerkstelligd, dat voordat het gen IFN31 een hybridege- bied van combinerende ribosomen wordt gevormd, dat de volgende necluotide volgorde heeft: 5'-...TAAGGAGGTTGCATG...-3', waarin TAAGGAGGT - SD-sekwentie van het gen cro van het faagΛ , ATG-methioni-necodon van fribroblastisch interferon en, direct na het eindigende 10 codon van het gen IFN31 een tandem van ^-afhankelijke transcriptieter-minatoren van het faag fd is geplaatst; - heeft unieke herkenningsgebieden van restrictasen cla I, waarvan de coördinaat het begin van telling (0), Pvu II (ongeveer 1.110), Bgl II (ongeveer 1.480), AccI (ongeveer 1.870), Pvu I (ongeveer 3.360) is; 15 gedeponeerd op 12-01-1987 bij de Collection of Cultures of

Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825.

Het recombinant plasmide DNA pPR-IFN31-13 volgens de onderhavige uitvinding waarborgt expressie van het gen IFN31 onder de controle van 20 het regelingsveld PrOr van de bacteriofaag Λ. Het gen cits 857-reguleringsmiddel van de initiëring van transcriptie uit voorgaande promotors van de bacteriofaag A en het gen IFN31-13, dat onder controle van de Pr promotor is, zijn in hetzelfde recombinant plasmide pPR-IFN31-12 geplaatst. Deze omstandigheid maakt het mogelijk een po-25 tentiële instabiliteit tijdens het kweken van de stam met het recombinant molecule van DNA te verwijderen, aangezien in de structuur volgens de onderhavige uitvinding geen recA-afhankelijke recombinatie ontstaat ten gevolge van de afwezigheid van een additioneel plasmide in de producerende stam.

30 De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een con-structiewerkwijze van het recombinant plasmide DNA pPR-IFN31-13, die splitsing van het vectorplasmide pPR124B, gebouwd op de basis van de piasmiden pPR40 en pML24, door middel van de restrictie endonucleasen EcoRI en Bgl II en ligatuur van de grotere van de gevormde fragmenten 35 van het vectormolecule met het EcoRI-Sau3A fragment van het plasmide pINFB-trp7, dat het coderende gedeelte van een volgroeid Bl-interferon bevat, omvat; in het aldus gevormde recombinant plasmide pPR-IFNBl-123 is er nabij de SD-sekwentie van het gen cro en van het eerste (methionine) codon van 31-interferon bewerkstelligd, om welke reden het 40 plasmide DNA door middel van het restrictase BamHI is gehydrauliseerd, -8820163 6 een deel van de nucleotiden door middel van de endonuclease activiteit van het DNA-polymerase I E.coli onthuld onder omstandigheden van een onvolledige instelling van nucleocide trifosfaten in het reactiemengsel verwijderd, het DNA fermentatief wordt afgesplitst door middel van het 5 restrictase EcoRI, behandeld met het SI-endonuclease om gebieden van het DNA met enkele keten te verwijderen, vervolgens de uiteinden met twee ketens worden hersteld door middel van een Klenov fragment van het DNA-polymerase I E.coli en de gevormde lineaire DNA moleculen worden gecycliseerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4; het resul-10 terende preparaat wordt gebruikt om cellen van E.coliC600 met selectie van de transformanten op een milieu met ampicilline te transformeren, na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 28°C, gevolgd door selectie van de klonen met een verminderde groeisnelheid bij de temperatuur van 42°C, waarna uit de aldus geselecteerde klonen het recombi-15 nant plasmide pPR-IFNpl-13 wordt geïsoleerd.

Het gebruik van de constructiemethode van het recombinant plasmide pPR-INF31-13, waarbij de langste (uit de bekende voor de matrix RNA

E.coli en colifagen) SD-sekwentie van het gen cro van de bacteriofaagλ is verbonden met het coderende gedeelte van volgroeid humaan 81-inter-20 feron, resulteert in organisatie van een hybridegebied van combinerende ribosomen van het gen IFN31 met de optimale primaire en sterische structuur van het 5'-eindstandige gebied van de matrix RNA. In tegenstelling tot de bekende werkwijze, waarborgt de construct)ewerkwijze volgens de onderhavige uitvinding ook de aanwezigheid van een tandem 25 van sigma-onafhankelijke transcript!eterminatoren in het 3'-non-getranslateerde gebied van het gen IFN81 op het plasmide pPR-IFNBl-13, waardoor dus interferentie tussen replicatie van het plasmide DNA en een sterk werkzame transcriptie van het gen van fibroblast! nterferon onder de omstandigheden van depressie van de Pr pro-30 motor wordt voorkomen.

Naast het hierboven gezegde heeft de onderhavige uitvinding ook betrekking op een bacteristam Escherichia coli VNIIgenetika VL 903 (pPR-IFNpl-13), die humaan βΐ-interferon vormt, dat het recombinant plasmide DNA pPR-IFN&l-13 volgens de onderhavige uitvinding bevat en 35 dat verkregen is volgens de werkwijze van genetische constructie door invoering van het plasmide DNA pPR-IFNBl-13 in de bacterie Escherichia coli, gedeponeerd op 12-01-1987 bij de Collection of Cultures of Microorganisms of the All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825.

40 De stam volgens de onderhavige uitvinding maakt het mogelijk een .8820103 7 stabiele accumulatie van humaan Bl-interferon te waarborgen onder omstandigheden van een kweek op grote schaal en om een opbrengst van het gewenste produkt te bereiken van meer dan 2 x 10^ U/l, hetgeen overeenkomt met 5-10% van de totale hoeveelheid van het cel proteïne.

5 Beste wijze van uitvoering van de uitvinding

De constructiewerkwijze van het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding wordt in verschillende trappen uitgevoerd.

In de eerste trap wordt het vectorplasmide pPRI24 geconstrueerd.

10 Tot dit doel wordt deletie door middel van het endonuclease Bal31 in de DNA van de plasmide pPR40 (Molekulyarnaya Biologiya, 1987, deel 21 nr. 5, Moskou blz. 1309-1321) in het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II bewerkstelligd.

Op deze wijze wordt het plasmide pPRIOO verkregen, waarin het her-15 kenningsgebied BamHI direct na het combinatiegebied van ribosomen van de faagA zodanig is geplaatst, dat in het gebied van de initiëring AUG codon een sekwentie wordt gevormd:

AUGGATCC

20 BamHI

Vervolgens wordt onder toepassing van conventionele methoden van genetische constructie het kleine Pstl-BamHI fragment van het plasmide pPRIOO geligateerd met het grootste PstI-BamHI fragment van het plasmi-25 de pML24 met de vorming van het plasmide pPRI24, waarin een herkenningsgebied van het restructase Bgl II door middel van een oligonucleotide verbindingsmiddel wordt ingevoerd. Aldus wordt het plasmide pPRI24B verkregen.

Het tussenprodukt plasmide pPR-IFNBl-123 wordt geconstrueerd.

30 Het aldus gevormde vectorplasmide pPRI24B wordt door middel van restrictie-endonucleasen EcoRI en Bgl II gesplitst en ligatie van het grootste fragment uit de gevormde fragmenten van een vectormolecule met het EcoRI-Sau3A fragment, dat het coderende gedeelte van volgroeid 81-interferon uit het plasmide pINB-trp7 bevat, wordt bewerkstelligd 35 onder vorming van het tussenrecombinant plasmide pPR-IFNBl-123.

Vervolgens wordt de derde trap uitgevoerd - constructie van het plasmide pPR-IFNB-13. Tot dit doel wordt in het tussenprodukt plasmide pPR-IFN$l-123 de nabijheid van de SD-sekwentie van het gen cro en van het eerste codon van Bl-interferon, om welke reden het plasmide DNA 40 wordt gehydrolyseerd door middel van het restrictase BamHI, een deel .8820103 δ van de nucleotiden verwijderd door middel van de endonuclease activiteit van het DNA-polymerase I E.coli, wordt het DNA gesplitst door middel van het restrictase EcoRI, met het SI-endonuclease behandeld, gevolgd door een volledig herstel van de twee-keteneinden door middel van 5 een Klenov fragment van het DNA-polymerase I E.coli en cyclisering van de resulterende lineaire DNA moleculen wordt gewaarborgd door middel van het DNA-ligase van de faag T4. Het aldus verkregen preparaat wordt gebruikt om de cellen van E.coli C600 te transformeren, worden de transformanten geselecteerd op een milieu met ampicilline na het kweken 10 van de cellen bij een temperatuur van 28°C, gevolgd door selectie op een verminderde groeisnelheid bij de temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA pPR-IFN81-13 geïsoleerd.

De stam van de bacterie Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFN81-13) volgens de onderhavige uitvinding wordt gevormd door 15 transformatie van de ontvangerstam met het recombinant plasmide pPR-IFN81-13, gevolgd door selectie van de recombinantklonen op een milieu met ampicilline bij een temperatuur van 28°C en bepaling van de activiteit van fibroblastisch $1-interferon in extracten van de trans-formantcellen na depressie van de P^-promotor gewaarborgd door het 20 kweken van de stam gedurende 1-2 uur bij de temperatuur van 42°C. Als de ontvanger kunnen de stammen E.coli C600 en andere derivaten van E.coli K12 worden gebruikt.

De stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) wordt door de volgende kenmerken gekarakteriseerd.

25 Morfologische kenmerken. Cellen recht, staafvormig (1,2-1,6) x (2,0-6,0) /urn, weinig beweeglijk, in staat draadachtige vormen te vormen, gram-negatief, non-sporenvormig.

Kweekkenmerken. Cellen groeien goed op dichte en vloeibare gewone synthetische, semi-synthetische en complexe milieus. Wanneer gegroeid 30 op een agar bevattende vloeibare kweekbodem van Hottinger of L-vloeiba-re kweekbodem vormen zij met slijm bedekte, ronde, enigszins verwarde koloniën. Wanneer gegroeid in vloeibare milieus zoals N-vloeibare kweekbodem of M9 met casiminezuren vormen zij een gelijkmatige suspensie.

35 Fysiologisch-biochemische kenmerken. Cellen zijn in staat te groeien bij een temperatuur binnen het traject van 5 tot 40°C (optimum 35°C) bij een pH van 6,5 tot 7,5. Als koolstofbron worden aminozuren en koolhydraten (bijvoorbeeld saccharose) gebruikt. De stikstofbron kan worden vertegenwoordigd door anorganische zouten in de ammoniumvorm er-40 van, alsmede organische verbindingen in de vorm van pepton, trypton, .8820103 9 gistextract en aminozuren.

Resistentie tegen antibiotica. De stam is resistent tegen ampicil-1 ine in een concentratie tot 100 mg/1 na groei in vloeibare en agar bevattende voedingsmilieus.

5 Stabiliteit van het plasmide. Na opslag van cellen op een agar be vattende milieu (gedurende een periode tot 1 maand) met een reeks opeenvolgende herinoculaties (gedurende ten minste 6 maanden) en gedurende een diepe kweek in een vloeibaar milieu met een antibioticum heeft geen verlies of herstructurering van het plasmide plaats.

10 De aldus bereide stam E.coli VNIIGenetika VL 903 pPR-IFNBl-13) is een zeer efficiënte vormer van fibroblastisch humaan Bl-interferon en kan voor een produktie op commerciële schaal van Bl-interferon worden gebruikt.

De onderhavige uitvinding wordt verder door voorbeelden van bij-15 zondere uitvoeringsvormen van de werkwijze voor de constructie van het plasmide, de werkwijze voor de vorming van de stam, de kweek ervan toegelicht onder verwijzing naar de bijgevoegde figuren, waarin: fig. 1 - fysische-genetische kaart van het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13; 20 fig. 2 - een diagram van de bereiding van het plasmide pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding zijn.

Voorbeeld I

Het recombinant plasmide pPR-IFNBl-13 (fig. 1) wordt in verschillende trappen gevormd. Trap I - constructie van het vectorplasmide 25 pPRI24B.

Tot dit doel wordt het plasmide pPRI"(a) op de volgende wijze geconstrueerd. 3 /ug van het plasmide pPR40 wordt gesplitst door middel van het restrictase Bgl II in 60 /Ul van een buffer voor restric-tie-I, die 10 mM tris-HCl, pH 8,0, 6 mM MgC^s 6 mM 2-mercaptoetha-30 nol, 150 mM Nacl bevat. Het DNA wordt met 2 volumedelen ethanol opnieuw neergeslagen. Het precipitaat wordt in 20 /ul H2O opgelost. De behandeling van het DNA met het endonuclease Bal 31 wordt gedurende 3 minuten bij een temperatuur van 30°C uitgevoerd in 30 /ul van een buffer, die 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM NgCl2» 100 mM tris-HCl, pH 35 8,0, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur bevat. Het DNA wordt met 2 volumedelen ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt in 10 /ul H2O opgelost. De behandeling met het restrictase BamHI wordt in een monster van 30 /ul, dat de hierboven vermelde buffer voor restrictie-I bevat, uitgevoerd. De competering van de 3'-eindstand!ge gebieden met enkele 40 keten van het DNA wordt bewerkstelligd door behandeling met een Klenov .8820103 10 fragment van het DNA-polymerase I E.coli in een monster van 20 /ul, dat 10 mM tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgClg» 2 /Ug van het DNA preparaat bevat, door 30 /uM van elk van desoxiribonucleoside trifosfaten, 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het reactiemengsel wordt met 5 ethanol neergeslagen en in 100 /ul H2O opgelost. De ligatie van het rechtgemaakte plasmide DNA wordt bewerkstelligd bij een temperatuur van 16°C gedurende 12 uur door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster, dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosinetrifosfaat) en 1 10 /Ug van het DNA bevat. Het resulterende mengsel wordt voor transformatie van cellen van E.coli C600 gebruikt. Het rendement van de transformer is 5x10^ koloniën per 1 /ug van het natuurlijke plasmide pPR40. De tegen ampicilline resistente klonen (100 /ug/ml), het plasmide DNA wordt daaruit gewonnen volgens een gemodificeerde werkwijze, 15 die gesuggereerd is door Birnboim en Doli en vervolgens toegepast voor een restrictieanalyse. Als resultaat wordt het plasmide pPRIOO verkregen, dat een uniek splitsingsgebied BamHI bevat. Daarna wordt het plasmide pPRI24 geconstrueerd.

Tot dit doel wordt 2 /ug van het DNA van het plasmide pML24 ge-20 zamelijke gesplitst door middel van de restrictasen BamHI en PstI in 40/ul van een buffer voor restrictie-I. De ligatie wordt uitgevoerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4 bij een temperatuur van 0eC met de fragmenten, die verkregen zijn bij de hydrolyse van het DNA van het plasmide pPRIOO met de restrictasen BamHI en PstI. Het resulte-25 rende DNA preparaat wordt gebruikt voor het transformeren van cellen van E.coli C600 met selectie van transformanten op een milieu met ampi-cilline, gevolgd door selectie van Cmr klonen op een milieu met 300 /ug/ml chlooramfenicol na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA 30 geïsoleerd en bestudeerd door middel van een restrictieanalyse. Als resultaat wordt het plasmide pPRI24 verkregen, dat een uniek gebied door middel van het restrictase BamHI bevat. Daarna wordt 3 /ug van het DNA van het plasmide pPRI24 gesplitst door middel van het restrictase Xbal in 70 /ul van een buffer voor restrictie-I, die 10 mM 35 tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl2> 6 mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl bevat. Het DNA wordt opnieuw neergeslagen met 2 volumedelen ethanol.

Het precipitaat wordt in 15 /ul H2O opgelost. De completering van de 3'-eindstandige gebieden met enkele keten van het DNA wordt bewerkstelligd door behandeling met een Klenov's fragment van het DNA-polyme-40 rase I van E.coli in een monster van 20 /ul, dat 10 mM tris-HCl, pH

.8820103 11 8,0, 10 mM MgCl2» 2 /Ug van het DNA preparaat bevat, door 30 /UM desoxyribonuclelsidetrifosfaten, 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het react!emengsel wordt met ethanol neergeslagen en in 100 /ul H2O opgelost. De ligatie van het lineair gemaakte plasmide DNA met Bgl II 5 bindingsmiddelen wordt bewerkstelligd bij een temperatuur van 16eC gedurende 12 uur. Door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster, dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH.7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosinetrifosfaat, 2/ug van het plasmide DNA en 0,5 /ug van de bindingsmiddelen bevat. Na de 10 ligatie wordt het DNA uit het reactiemengsel met ethanol neergeslagen, opgelost en aan enzymatische hydrolyse onderworpen door middel van het restrictase BglII in een monster van 40 /ul, dat een buffer voor (6 mM tris-HCl, pH 7,6, 6mM MgCl2» 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl) bevat. Het DNA wordt opnieuw met ethanol neergeslagen, opgelost 15 en cyclisering van de DNA moleculen wordt veilig gesteld; tot dit doel wordt 1 /ug van het plasmide DNA preparaat in 240 yul van een buffer voor ligatie met het DNA-liagse van T4 behandeld. Het resulterende mengsel wordt gebruikt om cellen van E.coli C600 te transformeren. Het transformatierendement is tot 5x10® koloniën per 1 /ug van het 20 natuurlijke plasmide pPRI24. De tegen ampicilline resistente klonen worden gekozen (100 /ug/ml), het plasmide DNA wordt daaruit geïsoleerd gevolgd door een gemodificeerde methode, die gesuggereerd is door Birnboim en Doli en dit DNA wordt voor een restrictieanalyse gebruikt. Als resultaat wordt het plasmide pPRI24B verkregen, in tegenstelling 25 tot het uitgangsvectormolecule pPRI24, heeft een unieke restrictie Bgl II in plaats van de vroeger beschikbare herkenningssekwentie Xbal (fig. 2).

Trap 2 - constructie van het tussenprodukt plasmide pPR-IFNBl-123. In de vector pPRI24B wordt de coderingssekwentie van fibroblastisch hu-30 maan interferon geïntegreerd uit het plasmide pINB-trp 7. Tot dit doel wordt 10 /ug van het DNA pINB-trp 7 gezamenlijk met de restric-tasen EcoRI en Sau 3A behandeld in een monster van 100 /ul, dat een buffer voor restrictie-2 bevat.

Het resulterende preparaat wordt op een gel van een 1,1¾ agarose 35 met laag smeltpunt aangebracht en aan electroforese in een tris-ace-taatbuffersysteem onderworpen. De gel strook, die het DNA fragment 510 b.p. lang bevat, wordt uitgesneden en het DNA wordt uit de gel geëlu-eerd. Het aldus gevormde DNA fragment (ongeveer 1/ug) wordt in het plasmide pPRI24B geïntegreerd. Tot dit doel wordt 1 /ug van het DNA 40 pPRI24 gesplitst door middel van de restrictasen EcORI en BglII in een .8820103 12

monster van 20 /Ul in een buffer voor restrictie-2. Het resulterende preparaat wordt aan een fenolische deproteïnisering onderworpen, het DNA wordt met ethanol neergeslagen en in 10 /Ul h^O opgelost. 0,5 /ug van het gesplitste plasmide pPRI24B wordt met 1 /Ug van het ge-5 isoleerde fragment van het plasmide pINB-trp 7 verenigd en met het DNA-ligase van T4 in een monster van 30 /Ul in een buffer voor liga-tie behandeld. Het aldus gevormde DNA preparaat wordt voor transformatie van cellen van E.coli C600 met selectie van transformanten op een milieu met ampicilline gebruikt, gevolgd door selectie van cCms-klo-10 nen op een milieu met 200 /ug/ml chlooramfenicol na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 42eC. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA geïsoleerd en door middel van een restrictie-analyse bestudeerd. In het resulterende plasmide is het EcoRI-BglII frapent, dat het C-eindstandige deel van chlooramfenicol acetyl transfe-15 rase in de vector pPRI24 codeert, vervangen door de coderingssekwentie van volgroeid humaan 81-interferon. Dit plasmide wordt als pPR-IFN

1-123 aangeduid en het wordt bij de volgende trap van het constructieproces gebruikt.

Trap 3 - constructie van het plasmide pPR-IFNBl-13. 30 /ug van 20 het DNA van het plasmide pPR-IFNBl-123 wordt gesplitst door middel van het restrictase BamHI in 150 /ul van een buffer voor restrictie-I, wordt het DNA aan een fenolische deproteïnisering onderworpen en met ethanol neergeslagen. Het precipitaat wordt in 40 /Ul H2O opgelost. Voor de beperkte afbraak van het DNA door middel van 3*—*· 5* exonu-25 clease activiteit van het DNA-polymerase-I. E.coli, wordt het resulterende DNA preparaat aan incubatie onderworpen in een monster van 50 /ul, dat 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 /uM ethyleendiaminetetraazijn-zuur, 5 mM MaCl2» 100 /UM desoxyadenosinetrifosfaat (en vervolgens desoxyguanosinetrifosfaat) en 20 eenheden van het DNA-polymerase bevat. 30 De reactie wordt gestopt, het DNA wordt neergeslagen en het neerslag wordt opnieuw in 40 /Ul H2O opgelost. 10 /ug van het resulterende preparaat wordt met het restrictase EcoRI in 50 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, gevolgd door een fenolische deproteïni-sering en precipitatie van het DNA met ethanol; het precipitaat wordt 35 in 30 /ul H2O opgelost.

De verwijdering van de eendradige eindstandige gebieden van het resulterende DNA preparaat wordt bewerkstelligd onder toepassing van het SI-endonuclease in een monster van 100 /ul, dat 30 mM Q^COONa (pH 4,4), 4,5 mM ZnSO/j, 250 mM NaCl, 10 /ug van het DNA, 200 eenhe-40 den van het SI-endonuclease. De reactie wordt bij een temperatuur van > 882 0103 13 20eC uitgevoerd, waarna het mengsel aan een fenolische behandeling en preeipitatie van het nucleïnezuur met ethanol wordt onderworpen. Het precipitaat wordt in 20 /Ul H2O opgelost. 4 /Ug van het aldus verkregen DNA preparaat wordt met een Klenov fragment van het DNA-poly-5 merase I E.coli onder de hierboven beschreven omstandigheden behandeld om waarschijnlijk bestaande molecuul einden met enkele keten tot die met twee ketens te completeren. De reactie wordt door een fenolische depro-teïnisering gestopt, de nucleïnezuren worden met ethanol neergeslagen en in 20 /ul H2O opgelost.

10 De ligatie van de lineaire DNA moleculen met de einden met twee ketens wordt bij een temperatuur van 16°C uitgevoerd in een monster van 50 /u 1, dat 60 mM tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgC^j 10 mM dithiotre-itol, 4 mM adenosinetrifosfaat, 8 gew.% polyethyleenglycol-6000, 4 /ug van het DNAm 100 eenheden van het DNA-ligase van T4 bevat. Na 15 voltooiing van de reactie wordt het monster viermaal verdund en wordt precipitatie van nuclelnezuren bewerkstelligd door middel van ethanol. 20 /ug van het in water opgeloste DNA wordt met het restrictase Bgl II in 30 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, het DNA wordt uit het reactiemengsel met ethanol neergeslagen, in water opge-20 lost en met het DNA-ligase van T4 in 20 /ul van een buffer voor ligatie behandeld. Het resulterende DNA-preparaat wordt gebruikt voor transformatie van cellen van E.coli C600, zoals het hiervoor is beschreven, gevolgd door selectie van de transformanten op een milieu met ampicilline na het kweken van de cellen gedurende een dag bij een tem-25 peratuur van 28°C. Uit de aldus bereide transformanten worden die met een verminderd vermogen voor groei bij een temperatuur van 42°C geselecteerd. Uit deze klonen wordt het plasmide DNA zoals hierboven beschreven geïsoleerd en aan een restrictieanalyse onderworpen.

Om de primaire structuur van het hybridegebied van combinerende 30 ribosomen voor het gen IFN-1 in het aldus gevormde plasmide pPR-IFN

1-13 te identificeren, wordt 30 /ug van het overeenkomstige DNA met het restrictase Hind II in 100 /ul van een buffer voor restrictie-2 behandeld, wordt het preparaat op een gradiënt (4-12%) polyacrylami-degel aangebracht en aan el ectroforese in een buffersysteem van tris— 35 acetaat onderworpen. Het DNA fragment ongeveer 190 b.p. lang wordt uit de gel geëlueerd onder toepassing van de methode van Maxam Gilbert; het wordt vervolgens door middel van het DNA-ligase van T4 met BamHI bindingsmiddelen verlengd op een wijze, soortgelijk aan de hierboven beschreven methode van de toevoeging van Bgl II-bindingsmiddelen aan 40 het lineair gemaakte plasmide pPRI24. Het DNA wordt uit het reactie- . 8820103 14 mengsel door middel van ethanol neergeslagen en het precipitaat wordt in 20 /ul H2O opgelost, door middel van het restrictase BamHI in 30 /ul van een buffer voor restrictie-1 gesplitst, het DNA wordt aan een fenolische deprotelnisering onderworpen, opnieuw met ethanol neerge-5 slagen en in H2O opgelost.

De moleculaire kloonvorming van het DNA fragment in de replicatie-ve vorm van het DNA van de bacteriofaag M13mpI0 gevormd na splitsing met BamHI, selectie van recombinant fagen op een indicatormilieu, dat 5*-broom-4-chloor-3-indolyl- -D-galactoside bevat, isolering van het 10 faag DNA met enkele keten en bepaling van de primaire structuur van het gekloonde fragment volgens de methode van een beperkte matrixkopi-ering {methode gesuggereerd door F. Senger) worden uitgevoerd volgens standaardmethoden. De nucleotidesekwentie van het hybridegebied van combinerende ribosomen gevonden door de Senger methode in het plasmide 15 pPR-IFNPl-13 is de volgende: 51---- TAAGGAGGTTGCATG...-31, waarin TAAGGAGGT - SD-sekwentie van het cro van de faag A en ATG - methioni-necodon van Bl-interferon.

Voorbeeld II

De stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) - vormer van fi-20 broblastisch humaan 1-interferon wordt op de volgende wijze gevormd.

Het plasmide pPR-IFNBl-13, dat de synthese van fibroblastisch humaan interferon codeert, wordt door transformatie op een wijze soortgelijk aan die beschreven in voorbeeld I hierboven uitgevoerd in cellen van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (gedeponeerd bij de All-Union 25 Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research

Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms en geregistreerd onder nr. BKIIM B-3546). Het transformatierendement van cellen van E.coli VNIIGenetika VL 903 is ongeveer 10® klonen per /ug van het natuurlijke DNA van het plasmide pPR-IFNBl-13. De trans-30 formanten worden op een milieu, dat ampicilline (100 /ug/ml) bevat na het kweken van de cellen gedurende een dag bij een temperatuur van 28°C geselecteerd. Uit de geselecteerde klonen wordt het plasmide DNA gewonnen en de identiteit ervan wordt met het DNA preparaat pPR-IFNBl-13 bewezen door middel van een restrictieanalyse. De stan E.coli 35 VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFB 1-13) wordt aldus verkregen.

Voor de bepaling van de produktiviteit van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) worden de plasmide bevattende cellen bij een temperatuur van 28°C op een schuin opgesteld agar bevattend standaardmilieu van Hottinger, dat 50 /ug/ml ampicilline bevat, gedu-40 rende 14 uur gekweekt. De op de schuinten gekweekte biomassa wordt ge- -8820103 15 bruikt voor de bereiding van het inoculatiemateriaal. Tot dit doel worden de cellen in Erlenmeyerkolven van 750 /ul met 100 ml van het milieu van Hottinger, dat 100 /Ug/ml ampicilline bevat overgebracht en bij een temperatuur van 28eC op een schutinrichting bij 240 omw./min 5 gedurende 6 zes gekweekt. De optische dichtheid van de inoculatiekweek is 1,5-2,5 eenheden.

De fermentatie wordt uitgevoerd in een fermentatieinrichting, die voorzien is van systemen voor het regelen van de pH, de temperatuur, het roeren en de beluchtingssnelheid. Voor de fermentatie wordt een 10 milieu van Hottinger met 100 /ug/ml ampicilline en 10 g/1 glucose gebruikt. De inoculatiekweek wordt in een hoeveelheid van 5-10% betrokken op de massa ingevoerd. De kweek wordt bij een pH van 6,6-6,8 uitgevoerd, terwijl dit niveau door toevoeging van ammoniakwater wordt gehandhaafd. Het eerste deel van de fermentatie wordt uitgevoerd bij een 15 temperatuur van 28°C tot de optische dichtheid van 3,5 bij 550 nm, waarna thermoinductie wordt uitgevoerd door de temperatuur gedurende 5 minuten op 42-45°C te verhogen, vervolgens wordt de fermentatie gedurende nog eens 2 uur bij dezelfde temperatuur voortgezet.

Na voltooiing van de werkwijze worden om de activiteit van intefe-20 ron te bepalen cellen uit 1 ml van de kweekvloei stof door centrifugeren neergeslagen, wordt het neerslag in 1 ml van een 1%'s oplossing van na-triumdodecylsulfaat in een 0,02M fosfaatbuffer met een pH van 7,2, die 1% 2-mercaptoethanol bevat, gesuspendeerd en gedurende 2-4 minuten op een temperatuur van 100°C verhit. Daarna wordt het neerslag door cen-25 trifugeren afgescheiden en wordt de activiteit van interferon, aanwezig in de bovenstaande fractie, volgens standaardmethoden of door bescherming van humane diplolde fibroblasten uit het cytopatische effect van het virus van vesicualaire stomatitis of volgens de methode van immuno-enzymatische analyse bepaald. Als standaardreferenties worden prepara-30 ten van 8-interferon ("Torey", Japan) gebruikt, die tegen het standaard leukocytinterferon MPC B 69/19 (Groot-Brittannië) worden getriteerd.

De activiteit van fibroblastisch humaan interferon, dat gesynthetiseerd is in cellen van de stam E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13), bepaald volgens verschillende methoden, is meer dan 35 2 x 10^ internationale eenheden/liter van de bacterie kweek.

Voor de bepaling van het deel van het gesynthetiseerde fibroblas-tische interferon in het totaal van het cel proteïne, worden de cellen uit 1 ml van de kweekvloei stof door centrifugeren neergeslagen en zoals hierboven beschreven behandeld; het preparaat wordt door middel van 40 electroforese bij aanwezigheid van 0,1% natriumdodecylsulfaat in een .8820103 16 15¾1s polyacrylamidegel volgens een standaardmethode afgescheiden. De in de polyacrylamidegel afgescheiden proteïnen worden in een oplossing Kumassi R-250 "Serva" (West-Duitsland) volgens een standaardmethode gekleurd. Het kwantitatieve gehalte van proteïnen in de zones 5 wordt bepaald na het aftasten van de gel in een geautomatiseerde laser-densitometer. De identificatie van de zone, die overeenkomt met het volgroeide fibroblastinterferon, dat in de cellen is gesynthetiseerd (19 kD) wordt uitgevoerd op basis van vergelijking met de electrofore-tische beweeglijkheid van de merkerproteïne, alsmede door middel van 10 immunovlekvorming van afgescheiden proteïnefracties in nitrocellulo-sefilters en identificatie van de interferonzone door behandeling van de filters in oplossingen, die monoclonale antilichamen van de muis tegen Mnterferon en anti-muis konijnenantilichamen geconjugeerd met peroxidase uit mierikswortel bevatten. Na een overeenkomstige kleu-15 ringsmethode verschijnt de interferonzone als een donkerbruine band tegen een niet gekleurde achtergrond van het nitrocellulosefilter.

Het proteïnegehalte in de zone, die overeenkomt met Bl-interfe-ron, is ongeveer 10¾ van het totale proteïne van de plasmide bevattende cellen van E.coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13).

20 Industriële toepasbaarheid

Het recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13 volgens de onderhavige uitvinding, dat de synthese van fibroblastisch humaan βΐ-interferon codeert, is geschikt voor de bereiding van stammen, die humaan βΐ-inter-feron met een grote activiteit vormen.

25 De bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IFNBl-13) volgens de onderhavige uitvinding - een vormer van humaan 31-interferon, is geschikt in de microbiologische en medische industrieën.

.8820103

Claims (3)

1. Een recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13, dat de synthese van fibroblastisch humaan βΐ-interferon codeert, met het kenmerk, dat het 5 een afmeting van 3.900 b.p. heeft en uit de volgende eenheden bestaat: « - BamHI-Bgl II fragment met een afmeting van 3.400 b.p. van het vectorplasmide pPRI34B, gevormd uit pPR40 en pML23; - EcoRI-Sau3A fragment van het plasmide pINB-trp 7 met een afmeting van 510 b.p. en met de volgende kenmerken: 10. bevat een gebied, dat verantwoordelijk is voor de initiëring van replicatie en de regulering ervan - Col EI-replicon, een gen van repressor cits 857 van de faag A , een gen met resistentie tegen ami-cilline Apr, een tandem van / -onafhankelijke transcriptieterminato-ren van de faag fd, een reguleringsgebied PrOr en een SD-sekwentie 15 van het gen λ cro, dat de sekwentie van een volgroeid fibroblastisch humaan interferon IFNPl met het eigen methioninecodon ervan codeert; - de ligatie van het reguleringsgebied van het gen A cro, dat een deel van βΐ-interferon en transcriptieterminatoren fd codeert, wordt zodanig bewerkstelligd, dat voor het gen IFNBI een hybridegebied van 20 combinerende ribosomen wordt gevormd, dat de volgende nucleotidesekwen-tie heeft: 51-...TAAGGAGGTTGCATG...-31, waarin TAAGGAGGT -SD-sekwentie van het gen cro van de faag λ ATG - methioninecodon van interferon en di-rekt na het eindstandige codon van het gen IFNBl een tandem van 25 /-onafhankelijke terminatoren van de transcriptie van de faag fd is gelokaliseerd; - heeft unieke herkenningsgebieden van de restrictasen Cla I, waarvan de coördinaat het begin van telling is (0), Pvu II (ongeveer 1,110), Bgl II (ongeveer 1.480), AccI (ongeveer 1.870), Pvu I (ongeveer 30 3.360); gedeponeerd bij de Collection of Cultures of Microorganisms van het ΑΠ-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825.

2. Werkwijze voor de constructie van een recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13 volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het vectorplas- 35 mide pPRI24B, geconstrueerd op basis van de plasmiden pPR40 en pML24, wordt gesplitst door middel van de restrictie-endonucleasen E coRI en BglII en ligatie van de grootste van de gevormde fragmenten van het vectormolecule met het EcoRI-Sau3A fragment van het plasmide ρΙΝβ-trp 7, dat het coderende gedeelte van volgroeid humaan 1-interferon bevat; 40 in het aldus gevormde recombinant plasmide pPR-IFNBl-123 in de nabij- .8820103 heid van de SD-sekwentie van het gen cro en het eerste (methionine) codon van 1-interferon wordt bewerkstelligd, waarvoor het plasmide DNA wordt gehydrolyseerd door middel van het restrictase BamHI, een deel van de nucleotiden wordt door middel van de exonuclease activiteit van 5 het DNA-polymerase I van E.coli, dat zichzelf manifesteert onder omstandigheden van een onvolledige instelling van nucleosidetrifosfaten in het reactiemengsel, verwijderd; het DNA wordt enzymatisch door het restrictase EcoRI gesplitst, met het SI-endonuclease behandeld om DNA gebieden met enkele keten te verwijderen, vervolgens worden de einden 10 met twee keten hersteld door middel van een Klenov fragment van het DNA-polymerase I van E.coli en de resulterende lineaire DNA moleculen worden gecycliseerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4; het resulterende preparaat wordt gebruikt om cellen van E.coli C600 met selectie van transformanten op een milieu met ampicilline over te brengen 15 na het kweken van de cellen bij een temperatuur van 28°C, gevolgd door selectie van klonen, die een verminderde groei snel heid bij 42°C vertonen, waarna uit de geselecteerde klonen het recombinant plasmide DNA pPR-IFN31-13 wordt geïsoleerd.

3. Een bacteriestam van Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 20 (pPR-IFNBl-13) een vormer van humaan βΐ-interferon, dat het recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13 volgens conclusie 1 bevat, gevormd volgens de methode van genetische constructie door middel van invoering van het recombinant plasmide DNA pPR-IFNBl-13 in de bacterie Escherichia coli, gedeponeerd op 12-01-1987 bij de Collection of Cultures van microorga-25 nismen van het All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1825. ***** .8820103