JPH0757193B2 - 改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌 - Google Patents
改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌Info
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- JPH0757193B2 JPH0757193B2 JP19452487A JP19452487A JPH0757193B2 JP H0757193 B2 JPH0757193 B2 JP H0757193B2 JP 19452487 A JP19452487 A JP 19452487A JP 19452487 A JP19452487 A JP 19452487A JP H0757193 B2 JPH0757193 B2 JP H0757193B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は大腸菌の改良プロモーター、改良プロモーター
を有するベクター、このベクターを有するプラスミドお
よびそれにより形質転換された大腸菌に関する。さらに
詳しくは、蛋白質の過剰生産を指示する改良プロモータ
ー、それを有するベクター、このベクターを有するプラ
スミド及びそれにより形質転換された大腸菌に関する。
を有するベクター、このベクターを有するプラスミドお
よびそれにより形質転換された大腸菌に関する。さらに
詳しくは、蛋白質の過剰生産を指示する改良プロモータ
ー、それを有するベクター、このベクターを有するプラ
スミド及びそれにより形質転換された大腸菌に関する。
［従来技術の説明］ 近年、人類にとって有用な生理活性物質を、生体物質か
らの分離抽出よりも動物細胞の培養、形質転換微生物の
培養などで安価に工業的な規模で得る試みが、活発に展
開されている。
らの分離抽出よりも動物細胞の培養、形質転換微生物の
培養などで安価に工業的な規模で得る試みが、活発に展
開されている。
これらの中で、微生物を用いた生理活性物質の生産は、
これまでに蓄積された醗酵技術を駆使することによって
工業的規模で、大量に実施することが可能である。
これまでに蓄積された醗酵技術を駆使することによって
工業的規模で、大量に実施することが可能である。
従って、遺伝子組み換え技術を用いて有用な形質転換微
生物を作製できるか否かが、生理活性物質の工業的生産
の鍵を握っていると考えられている。
生物を作製できるか否かが、生理活性物質の工業的生産
の鍵を握っていると考えられている。
形質転換微生物として有用なものは、目的とする生理活
性物質を効率的にかつ活性体として大量に生産できなけ
ればならない。その為には、生理活性物質の構造遺伝子
が、形質転換微生物体内で効率的に転写され、翻訳され
なければならないし、その結果得られたものは、活性体
としての立体構造が保持されていなければならない。
性物質を効率的にかつ活性体として大量に生産できなけ
ればならない。その為には、生理活性物質の構造遺伝子
が、形質転換微生物体内で効率的に転写され、翻訳され
なければならないし、その結果得られたものは、活性体
としての立体構造が保持されていなければならない。
構造遺伝子の転写を効率的に行わせる方法としては、構
造遺伝子事態の遺伝暗号を形質転換微生物が利用し易い
ものに変えたり、プロモーターに対するRNAポリメラー
ゼの親和性を高めたり、構造遺伝子を担うプラスミドを
増幅させることによって生産物の増大を計ったりするこ
となどがある。
造遺伝子事態の遺伝暗号を形質転換微生物が利用し易い
ものに変えたり、プロモーターに対するRNAポリメラー
ゼの親和性を高めたり、構造遺伝子を担うプラスミドを
増幅させることによって生産物の増大を計ったりするこ
となどがある。
一方、その遺伝子の翻訳を効率的に行わせる方法として
は、リボソール結合部位へのリボソームの結合を増強し
たり、翻訳を阻害する部位を改善したりする方法があ
る。
は、リボソール結合部位へのリボソームの結合を増強し
たり、翻訳を阻害する部位を改善したりする方法があ
る。
これらの転写及び翻訳に関する遺伝子組換え技術は、い
ずれも非常に重要であるが、これまでは、特に、構造遺
伝子の転写段階の効率を高める試みが活発に行われてき
た。
ずれも非常に重要であるが、これまでは、特に、構造遺
伝子の転写段階の効率を高める試みが活発に行われてき
た。
従来、遺伝子組み換えで構造遺伝子の転写を行う方法と
しては、適当な制限酵素を作用させて得た天然のプロモ
ーター、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロン
プロモーター（trpプロモーター）、ラクトースオペロ
ンプロモーター（lacプロモーター）及びコリシンE1プ
ロモーターColE1プロモーター）などを構造遺伝子の上
流に結合する方法がある。
しては、適当な制限酵素を作用させて得た天然のプロモ
ーター、例えば、大腸菌由来のトリプトファンオペロン
プロモーター（trpプロモーター）、ラクトースオペロ
ンプロモーター（lacプロモーター）及びコリシンE1プ
ロモーターColE1プロモーター）などを構造遺伝子の上
流に結合する方法がある。
しかしながら、これらのプロモーターを結合した構造遺
伝子の発現効率は、従来の天然のプロモーターを用いた
時の発現効率の範囲内であり、大巾には変わっていな
い。
伝子の発現効率は、従来の天然のプロモーターを用いた
時の発現効率の範囲内であり、大巾には変わっていな
い。
大腸菌プロモーターのDNA塩基配列に関しては、これま
でに多くのデータが蓄積されている。それらのデータか
ら、転写開始点の上流35塩基の領域（以下、『−35領
域』と略す）には、 ５′−TTGACA−３′ AACTGT 転写開始点の上流10塩基の領域（以下、『−10領域』と
略す）には、 ５′−TATAAT−３′ ATATTA というコーデイング塩基配列が共通に存在することが明
らかにされている。
でに多くのデータが蓄積されている。それらのデータか
ら、転写開始点の上流35塩基の領域（以下、『−35領
域』と略す）には、 ５′−TTGACA−３′ AACTGT 転写開始点の上流10塩基の領域（以下、『−10領域』と
略す）には、 ５′−TATAAT−３′ ATATTA というコーデイング塩基配列が共通に存在することが明
らかにされている。
そして、プロモーターの塩基配列が上記の共通のコーデ
イング塩基配列に近い程、また『−35領域』と『−10領
域』との間の領域（以下、『間の領域』と略す）の塩基
配列中に塩基のG,Cが少ない程、構造遺伝子の転写効率
が高くなると考えられている［Hawlei et al.:Nucleic
Acid Res.,11（８）2237（1983）］。
イング塩基配列に近い程、また『−35領域』と『−10領
域』との間の領域（以下、『間の領域』と略す）の塩基
配列中に塩基のG,Cが少ない程、構造遺伝子の転写効率
が高くなると考えられている［Hawlei et al.:Nucleic
Acid Res.,11（８）2237（1983）］。
天然のプロモーターから、そのような塩基配列を持つプ
ロモーターへの改良を行った例としては、trpプロモー
ターの『−35領域』とlacUV−５プロモーターの『−10
領域』からなる発現効率が高い複合的プロモーター（ta
cプロモーター）が知られている。
ロモーターへの改良を行った例としては、trpプロモー
ターの『−35領域』とlacUV−５プロモーターの『−10
領域』からなる発現効率が高い複合的プロモーター（ta
cプロモーター）が知られている。
ところで、宿主に障害を与えると考えられる生理活性物
質の過剰生産は、生理活性物質の産生を抑制した状態で
宿主を成育させた後、適当な条件でこの抑制を解除して
行うことが好ましい。
質の過剰生産は、生理活性物質の産生を抑制した状態で
宿主を成育させた後、適当な条件でこの抑制を解除して
行うことが好ましい。
このような方法で生理活性物質の過剰生産を行うのに適
したプロモーターとしては、コリシンE1プロモーター
（col E1プロモーター）がある。
したプロモーターとしては、コリシンE1プロモーター
（col E1プロモーター）がある。
特開昭61-111690号公報にはcol E1プロモーターを用い
て生理活性物質であるヒトスーパーオキシドジスムター
ゼを産生する方法が記載されている。
て生理活性物質であるヒトスーパーオキシドジスムター
ゼを産生する方法が記載されている。
しかしながら、col E1プロモーターの塩基配列を人為的
に変異させた改良プロモーターは知られていず、従って
そのような改良プロモーターが得られたときにそれが構
造遺伝子の発現効率をどのように変化させるかは全く知
られていない。
に変異させた改良プロモーターは知られていず、従って
そのような改良プロモーターが得られたときにそれが構
造遺伝子の発現効率をどのように変化させるかは全く知
られていない。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、大腸菌のプロモーターを改良した新規
な改良プロモーターを提供することにある。
な改良プロモーターを提供することにある。
本発明の他の目的は、天然に存在するプロモーターの塩
基配列を人為的に変異させて蛋白質の過剰生産を指示す
る改良プロモーターを製造し且つそれを提供することに
ある。
基配列を人為的に変異させて蛋白質の過剰生産を指示す
る改良プロモーターを製造し且つそれを提供することに
ある。
本発明のさらに他の目的は、天然のプロモーター例えば
col E1プロモーターが本来有する特異的な誘発能例え
ば、紫外線照射やマイトマイシンＣなどの処理によっ
て、プロモーターの下流に続く構造遺伝子の誘発生産を
行う機能を失うことなく、相当する該天然プロモーター
例えばcol E1プロモーターの場合よりも非常に高い蛋白
質生産の発現効率を有する改良プロモーターを提供する
ことにある。
col E1プロモーターが本来有する特異的な誘発能例え
ば、紫外線照射やマイトマイシンＣなどの処理によっ
て、プロモーターの下流に続く構造遺伝子の誘発生産を
行う機能を失うことなく、相当する該天然プロモーター
例えばcol E1プロモーターの場合よりも非常に高い蛋白
質生産の発現効率を有する改良プロモーターを提供する
ことにある。
本発明のさらに他の目的は、本発明の上記改良プロモー
ターを有するベクター、同ベクターを有するプラスミド
および同プラスミドで形質転換された大腸菌を提供する
ことにある。
ターを有するベクター、同ベクターを有するプラスミド
および同プラスミドで形質転換された大腸菌を提供する
ことにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明
らかとなろう。
らかとなろう。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、大腸
菌の改良プロモーターであって、 （ａ）プロモーター中の−35領域が、下記塩基配列を示
し、 ５′−TTGACAX−３′ AACTGTY 上記配列におけるXY塩基対はTA、GC、AT又はCGのいずれ
かの塩基対を表わす、 及び／または プロモーター中の−10領域が、下記塩基配列を示し、 ５′−TATAAT−３′ ATATTA （ｂ）プロモーター中の−35領域と−10領域との間の領
域（以下、『間の領域』と略す）が15〜17塩基対からな
り、その『間の領域』における塩基対に占めるGC塩基対
の割合が60％以上である塩基配列を示す ことを特徴とする改良プロモーターによって達成され
る。
菌の改良プロモーターであって、 （ａ）プロモーター中の−35領域が、下記塩基配列を示
し、 ５′−TTGACAX−３′ AACTGTY 上記配列におけるXY塩基対はTA、GC、AT又はCGのいずれ
かの塩基対を表わす、 及び／または プロモーター中の−10領域が、下記塩基配列を示し、 ５′−TATAAT−３′ ATATTA （ｂ）プロモーター中の−35領域と−10領域との間の領
域（以下、『間の領域』と略す）が15〜17塩基対からな
り、その『間の領域』における塩基対に占めるGC塩基対
の割合が60％以上である塩基配列を示す ことを特徴とする改良プロモーターによって達成され
る。
本発明の生理活性物質の過剰生産を指示する改良プロモ
ーターは、その上流から『−35領域』、『間の領域』及
び『−10領域』の３つの領域から成っている。『−35領
域』の塩基対配列は下記のとおりである。
ーターは、その上流から『−35領域』、『間の領域』及
び『−10領域』の３つの領域から成っている。『−35領
域』の塩基対配列は下記のとおりである。
５′−TTGACAX−３′ AACTGTY 上記配列におけるXY塩基対はTA、GC、AT又はCGのいずれ
かの塩基対を表わし、好ましくはAT又はGCのいずれかの
塩基対を表わす。
かの塩基対を表わし、好ましくはAT又はGCのいずれかの
塩基対を表わす。
Ｐ−35領域』は−30領域対（上記配列では右端のXY）か
ら−36塩基対（上記配列では左端のTA）までの７組の塩
基対で構成されている。
ら−36塩基対（上記配列では左端のTA）までの７組の塩
基対で構成されている。
『−10領域』の塩基配列は下記のとおりである。
５′−TATAAT−３′ ATATTA 『−10領域』は−８塩基対（上記配列では右端のTA）か
ら−13領域対（上記配列では左端のTA）までの６組の塩
基対で構成されている。
ら−13領域対（上記配列では左端のTA）までの６組の塩
基対で構成されている。
また、『間の領域』は、15〜17塩基対、好ましくは16塩
基対から成る。この『間の領域』においては、全塩基対
に占めるGCおよびCG塩基対の割合は60％以上である。
基対から成る。この『間の領域』においては、全塩基対
に占めるGCおよびCG塩基対の割合は60％以上である。
本発明のプロモーターは、『−35領域』、『間の領域』
および『−10領域』の塩基配列として、好ましくは下記
塩基配列のいずれかの塩基配列を有する。
および『−10領域』の塩基配列として、好ましくは下記
塩基配列のいずれかの塩基配列を有する。
５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATATTA、 ５′−TTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTCCCTTTTACGTCGCCGCATATTA、および ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATCGAA このような改良プロモーターの作製は、例えばtrpプロ
モーター、lacプロモーター、tacプロモーター、λPLプ
ロモーター、col E1プロモーターなどの天然のプロモー
ターの適当なDNA断片（これは適当な制限酵素を用いて
得ることができる）を適当に組み合わせて行うことがで
きる。また化学的な合成で得られた適当なDNA断片（こ
れはアミダイト法などを採用した自動DNA合成装置を用
いて得ることができる）と組み合わせて行うこともでき
る。もちろん化学的な合成だけで行うこともできる。
モーター、lacプロモーター、tacプロモーター、λPLプ
ロモーター、col E1プロモーターなどの天然のプロモー
ターの適当なDNA断片（これは適当な制限酵素を用いて
得ることができる）を適当に組み合わせて行うことがで
きる。また化学的な合成で得られた適当なDNA断片（こ
れはアミダイト法などを採用した自動DNA合成装置を用
いて得ることができる）と組み合わせて行うこともでき
る。もちろん化学的な合成だけで行うこともできる。
その際、『間の領域』の塩基配列は、紫外線やマイトマ
イシンＣなどのようなDNAに損傷を与えるものによっ
て、プロモーター下流に連結した構造遺伝子を発現する
機能を保持するようにするのが望ましい。
イシンＣなどのようなDNAに損傷を与えるものによっ
て、プロモーター下流に連結した構造遺伝子を発現する
機能を保持するようにするのが望ましい。
そして、本発明のプロモーターを種々の生理活性物質例
えば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼなどの生産に
利用できるような汎用的プロモーターとするためには、
このプロモーターの『−10領域』の下流に複数の制限酵
素による切断部位を有するDNA断片を連結することが好
ましい。そのようなDNA断片としては、できるだけ多く
の種類の制限酵素、例えば、SstI、SmaI、XmaI、BamH
I、XbaI、SalI、AccI、HincIIなどによる切断部位を有
している方がよく、例えばpUC13（ファルマシア社製）
や化学的に合成したものを用いることができる。
えば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼなどの生産に
利用できるような汎用的プロモーターとするためには、
このプロモーターの『−10領域』の下流に複数の制限酵
素による切断部位を有するDNA断片を連結することが好
ましい。そのようなDNA断片としては、できるだけ多く
の種類の制限酵素、例えば、SstI、SmaI、XmaI、BamH
I、XbaI、SalI、AccI、HincIIなどによる切断部位を有
している方がよく、例えばpUC13（ファルマシア社製）
や化学的に合成したものを用いることができる。
生理活性物質の生産は、この構造遺伝子を含むDNA断片
を本発明の改良プロモーターの下流に連結し、コピー数
が多いかまたは誘導操作によってコピー数が増加するプ
ラスミド（例えば、汎用性が高いpBR322など）に組み込
み、大腸菌などの微生物に形質転換し、コロニーハイブ
リダイゼーシヨンや生理活性物質の生産量を測定するこ
とによって選択して得た形質転換微生物を培養すること
によって行うことができる。
を本発明の改良プロモーターの下流に連結し、コピー数
が多いかまたは誘導操作によってコピー数が増加するプ
ラスミド（例えば、汎用性が高いpBR322など）に組み込
み、大腸菌などの微生物に形質転換し、コロニーハイブ
リダイゼーシヨンや生理活性物質の生産量を測定するこ
とによって選択して得た形質転換微生物を培養すること
によって行うことができる。
以下に改良コリシンE1プロモーターの下流に構造遺伝子
としてヒトCu・Zn−スーパーオキシドデイスムターゼ
（以下ヒトCu・Zn−SODと略す）を有し、プラスミドと
してpBR322を使用した例について実施例を挙げ説明す
る。しかし、構造遺伝子については、目的蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列であり、天然から単離された
物、化学合成により得られた物、あるいは両方法の組み
合わせにより得られた物でもよい。また、特別に記載の
行なわれていない手法は、公知の方法で十分行なうこと
ができる。
としてヒトCu・Zn−スーパーオキシドデイスムターゼ
（以下ヒトCu・Zn−SODと略す）を有し、プラスミドと
してpBR322を使用した例について実施例を挙げ説明す
る。しかし、構造遺伝子については、目的蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列であり、天然から単離された
物、化学合成により得られた物、あるいは両方法の組み
合わせにより得られた物でもよい。また、特別に記載の
行なわれていない手法は、公知の方法で十分行なうこと
ができる。
［実施例］ 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明す
る。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定する
ものではない。
る。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定する
ものではない。
実施例１ １本オリゴヌクレオチドの化学合成： 本発明に用いた合成オリゴヌクレオチドは下記に示す２
種である。
種である。
５′−GTCTTGACATGGAAAATGC−３′ ５′−AGCGGCGTATAATTTATGCTG3′ アミダイト法を合成方法として採用している自動DNA合
成装置（Beckman System I DNA Synthesiger）を用い
て、上記２種のオリゴヌクレオチドを合成した。
成装置（Beckman System I DNA Synthesiger）を用い
て、上記２種のオリゴヌクレオチドを合成した。
実施例２ 合成オリゴヌクレオチドの精製とその末端の
リン酸化 実施例１によるオリゴヌクレオチド合成完了後、下記の
手順によって精製合成オリオヌクレオチドを得、その末
端のリン酸化を行った。
リン酸化 実施例１によるオリゴヌクレオチド合成完了後、下記の
手順によって精製合成オリオヌクレオチドを得、その末
端のリン酸化を行った。
１）シリカゲル担体に200μｌのチオフエノール、400μ
ｌのトリエチルアミン、400μｌのジオキサンを加え、
時々振とうしながら室温にて１時間放置した。
ｌのトリエチルアミン、400μｌのジオキサンを加え、
時々振とうしながら室温にて１時間放置した。
２）溶液を除去した後、担体1mlのジオキサンで２回、1
mlのメタノールで２回動、1mlのエーテルで１回洗浄し
た。その後窒素ガスで担体を乾燥させた。
mlのメタノールで２回動、1mlのエーテルで１回洗浄し
た。その後窒素ガスで担体を乾燥させた。
３）冷したアンモニア水1mlを担体に加え、時々振とう
しながら室温で３時間放置した。
しながら室温で３時間放置した。
４）担体を遠心又は静置して沈澱させ、上清アンモニア
水を回収した。新たに0.5mlのアンモニア水を加え担体
を洗い、全体として1.5mlの上清アンモニア水を得た。
水を回収した。新たに0.5mlのアンモニア水を加え担体
を洗い、全体として1.5mlの上清アンモニア水を得た。
５）上清アンモニア水をシリコン処理した試験管に移
し、熱により封管した。
し、熱により封管した。
６）封した試験管を50〜55℃で12時間ないし１晩保温し
た。
た。
７）試験管を氷中で十分冷した後開封し、２本の1.5ml
容量エッペンドルフチューブに分け、真空下で乾固させ
た。
容量エッペンドルフチューブに分け、真空下で乾固させ
た。
８）乾固物全体を300μｌの減菌水に溶かした。
９）1mlのブタノールを加え、不純物を抽出した。操作
を２回繰返すことにより合成オリゴヌクレオチドは沈澱
として得られた。
を２回繰返すことにより合成オリゴヌクレオチドは沈澱
として得られた。
10）沈澱物として得られた合成オリゴヌクレオチドを30
0μｌの0.3M酢酸ナトリウム溶液に再溶解した後、エタ
ノール沈澱操作を行なった。
0μｌの0.3M酢酸ナトリウム溶液に再溶解した後、エタ
ノール沈澱操作を行なった。
11）得られた沈澱を200μｌの7M尿素に溶かし、分離用
アクリルアミド電気泳動のサンプルとした。
アクリルアミド電気泳動のサンプルとした。
［ゲル組成］ 18％ポリアクリルアミド（40:1.3＝アクリルアミド、メ
チレンビスアクリルアミド） 7M尿素 100mM トリス−ボレート（pH8.3） 2mM EDTA 0.1％（W/V）過硫酸アンモニウム 12）上記組成で作製したゲルを20分間プレラン（pre-ru
n）させた後、合成オリゴヌクレオチド溶液をアプライ
して、電気泳動を行なった。（定電圧:20V/cm） 13）マーカーとして用いたブロモフエノールブルーとキ
シレンサイアノールのバンドの間隔が6cm程度に開いた
時点で電気泳動を止めた。
チレンビスアクリルアミド） 7M尿素 100mM トリス−ボレート（pH8.3） 2mM EDTA 0.1％（W/V）過硫酸アンモニウム 12）上記組成で作製したゲルを20分間プレラン（pre-ru
n）させた後、合成オリゴヌクレオチド溶液をアプライ
して、電気泳動を行なった。（定電圧:20V/cm） 13）マーカーとして用いたブロモフエノールブルーとキ
シレンサイアノールのバンドの間隔が6cm程度に開いた
時点で電気泳動を止めた。
14）ゲルを蛍光指示体を含むTLCプレート上に載せ、短
波長紫外線をあてることによりバンドを可視化して、目
的とする領域を切り出した。
波長紫外線をあてることによりバンドを可視化して、目
的とする領域を切り出した。
15）アクリルアミドゲル断片をシリンジを用いて細かく
破砕し、1mlの1.0mHEDTA、0.2Mトリエチルアンモニウム
−ボレート（pH8.0）に懸濁した。
破砕し、1mlの1.0mHEDTA、0.2Mトリエチルアンモニウム
−ボレート（pH8.0）に懸濁した。
16）37℃で一晩放置した後、遠心分離を行ない上清画分
を回収した。
を回収した。
17）0.2Mトリエチルアンモニウム、バイカ−ボレート
（TEAB）（pH8.0）で平衡化したDE52カラム（1.0〜1.5c
m）に合成オリゴヌクレオチド溶液をアプライし、３〜4
mlの0.2M TEABで洗いを行なった後、1.5mlの2M TEABで
溶出させ、最初に溶出される1mlを回収した。
（TEAB）（pH8.0）で平衡化したDE52カラム（1.0〜1.5c
m）に合成オリゴヌクレオチド溶液をアプライし、３〜4
mlの0.2M TEABで洗いを行なった後、1.5mlの2M TEABで
溶出させ、最初に溶出される1mlを回収した。
18）回収した合成オリゴヌクレオチド溶液に10倍量の減
菌水を加えた後、凍結乾燥を行ない、精製合成オリゴヌ
クレオチドを得た。
菌水を加えた後、凍結乾燥を行ない、精製合成オリゴヌ
クレオチドを得た。
19）乾燥した合成オリゴヌクレオチドを適当量の水に溶
かした。
かした。
20）公知の方法により、合成オリゴヌクレオチドの末端
をリン酸化した。
をリン酸化した。
実施例３ 改良コリシンE1プロモーターを含むベクター
の作製 本実施例においては、プラスミド法を用いて、部位特異
的変異を行なった。特開昭61-111690号公報に記載され
た公知のプラスミドpUBE2をPvuIIで切断し、細菌アルカ
リホスフアターゼで切断部位を脱リン酸化した（これを
DNAフラグメントＩという）。一方、プラスミドpUBE2を
SspI及びStuI出る切断し、生ずる大きなDNAフラグメン
ト（テトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNAフラグメン
ト）を分離した（これをDNAフラグメントIIという）。
実施例２で得られたリン酸化合成オリゴヌクレオチドを
用い、下記の反応溶液を調製した。
の作製 本実施例においては、プラスミド法を用いて、部位特異
的変異を行なった。特開昭61-111690号公報に記載され
た公知のプラスミドpUBE2をPvuIIで切断し、細菌アルカ
リホスフアターゼで切断部位を脱リン酸化した（これを
DNAフラグメントＩという）。一方、プラスミドpUBE2を
SspI及びStuI出る切断し、生ずる大きなDNAフラグメン
ト（テトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNAフラグメン
ト）を分離した（これをDNAフラグメントIIという）。
実施例２で得られたリン酸化合成オリゴヌクレオチドを
用い、下記の反応溶液を調製した。
［反応溶液組成］ DNAフラグメントＩ 0.3μg DNAフラグメントII 0.26μｇ ５倍濃ポリメラーゼ・リガーゼ 緩衝液 12μｌ リン酸化合成オリゴヌクレオチド （10pmol/μｌ） 3.75μｌ水 ｘμｌ 全体として 34.8μｌ （５倍濃ポリメラーゼ・リガーゼ緩衝液） 500mM NaCl 32.5mM トリス・HCl（pH7,5） 40mM MgCl2 5mM β−メルカプトエタノール 上記反応液中11.6μｌを煮沸処理なしのコントロールと
して分注しておいた。残りの23.2μｌを３分間煮沸、30
分間30℃、30分間４℃と徐々に冷却し、氷中にて10分間
放置した。温度処理をした反応液中11.6μｌをヘテロデ
ユープレックス形成検定のため、無処理のものと共に、
0.7％アガロースゲル電気泳動を行なった。電気泳動
は、Ｅ緩衝液［40mMトリス−アセテート（pH8.0）、20m
Mナトリウムアセテート、2mM EDTA］中で、6V/cm、２〜
３時間行なった。ヘテロデユープレックス形成を確認し
た後、下記の反応溶液で12.5℃、１晩反応させた。
して分注しておいた。残りの23.2μｌを３分間煮沸、30
分間30℃、30分間４℃と徐々に冷却し、氷中にて10分間
放置した。温度処理をした反応液中11.6μｌをヘテロデ
ユープレックス形成検定のため、無処理のものと共に、
0.7％アガロースゲル電気泳動を行なった。電気泳動
は、Ｅ緩衝液［40mMトリス−アセテート（pH8.0）、20m
Mナトリウムアセテート、2mM EDTA］中で、6V/cm、２〜
３時間行なった。ヘテロデユープレックス形成を確認し
た後、下記の反応溶液で12.5℃、１晩反応させた。
（反応溶液組成） 熱処理反応溶液 11.6μｌ 10mM ATP ２μｌ Klenow酵素（5U/μｌ） 0.4μｌ T4DNAリガーゼ（0.5U/μｌ） ２μｌ 2.5mM dNTP ４μｌ 計 20μｌ （2.5mM dNTPは、dTTP、dCTP、dGTP及びdATPをそれぞれ
2.5mMずつ含有した溶液を示す。） 以上の様な方法で作製したプラスミドベクターを公知の
方法により大腸菌に形質転換し、プラスミドベクターを
保持する菌を得た。
2.5mMずつ含有した溶液を示す。） 以上の様な方法で作製したプラスミドベクターを公知の
方法により大腸菌に形質転換し、プラスミドベクターを
保持する菌を得た。
実施例４ 変異プラスミドベクターを保持菌のスクリー
ニング スクリーニング方法としては、コロニーハイブリダイゼ
ーション法を用いた。
ニング スクリーニング方法としては、コロニーハイブリダイゼ
ーション法を用いた。
１）実施例３において得られたれ形質転換菌を寒天培地
上にまき、直径が0.5〜1mmになるまで37℃で生育させ
た。
上にまき、直径が0.5〜1mmになるまで37℃で生育させ
た。
２）オートクレーブ処理したニトロセルロースフイルタ
ーを寒天培地面にのせ、コロニーのレプリカをとった。
ーを寒天培地面にのせ、コロニーのレプリカをとった。
３）レプリカフイルターをクロラムフエニコール含有の
選択寒天培地上にコロニーを上にして密着させ、37℃、
１晩保温した。一方、マスタープレートは、37℃で、２
〜３時間保温して、保存しておいた。
選択寒天培地上にコロニーを上にして密着させ、37℃、
１晩保温した。一方、マスタープレートは、37℃で、２
〜３時間保温して、保存しておいた。
４）一晩保温したフイルターを0.5M NaOH/NaClで湿らせ
たろ紙上に載せ、10〜15分間、溶菌させた。
たろ紙上に載せ、10〜15分間、溶菌させた。
５）フイルターを中和するために、1M Tris・HCl（pH7.
0）/1.5M NaClで湿らせたろ紙上に移し、２〜３分間放
置した。
0）/1.5M NaClで湿らせたろ紙上に移し、２〜３分間放
置した。
６）３×SSCで、15〜20秒フイルターを軽くすすいだ
後、乾いたろ紙上で乾燥させた。
後、乾いたろ紙上で乾燥させた。
７）フイルターを真空下、80℃で２時間処理した。
８）菌の残骸を除去するために、0.1％・SDS.を含む３
×SSCで65℃、１時間軽く振とうした。この洗いを２回
繰り返した後、フイルターの表面をかるくこすり、再に
２回洗いを繰り返した。
×SSCで65℃、１時間軽く振とうした。この洗いを２回
繰り返した後、フイルターの表面をかるくこすり、再に
２回洗いを繰り返した。
９）乾いたろ紙上で、フイルターを風乾した。
10）実施例２で得られた合成ヌクレオチドを32Pで末端
標識し、プローブとした。プローブの比活性は、7.8×1
07〜4.4×108cpm/μgDNAであった。
標識し、プローブとした。プローブの比活性は、7.8×1
07〜4.4×108cpm/μgDNAであった。
11）ハイブリダイゼーシヨンの条件は下記に示した通り
である。
である。
［ハイブリダイゼーシヨン溶液］ 50×Denhardt 0.2ml 30×NET 0.4ml 20％デキストラン サルフエイト 1.0ml 10％ SDS 0.1ml H2O 0.3ml32 P標識プローブ 最終濃度５×105cpm/ml ［上記の値はニトロセル
ロースフイルター１枚当りの量である。］ ［ハイブリダイゼーシヨン温度］ Ｔ＝［（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４］−４ ここでT:ハイブリダイゼーシヨン温度（℃）、 A:アデニン、T:チミン、G:グアニン、C:シトシン （注）Ｔ＝55℃以上の時は、50℃で行なう。
ロースフイルター１枚当りの量である。］ ［ハイブリダイゼーシヨン温度］ Ｔ＝［（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４］−４ ここでT:ハイブリダイゼーシヨン温度（℃）、 A:アデニン、T:チミン、G:グアニン、C:シトシン （注）Ｔ＝55℃以上の時は、50℃で行なう。
［ハイブリダイゼーシヨン時間］ 16〜18時間 12）ハイブリダイゼーシヨン後、室温から37℃の適当な
温度でフイルターを６×SSC中にて保温し、プローブを
除去した。
温度でフイルターを６×SSC中にて保温し、プローブを
除去した。
13）乾いたろ紙上で風乾させた。
14）Ｘ線フイルムを用いてオートラジオグライーを行な
った。
った。
15）スポットとコロニーを対応させ、ハイブリダイゼー
シヨンしたコロニーを選別した。
シヨンしたコロニーを選別した。
以上の様な方法で、部位特異的変異を起したプラスミド
ベクター保持菌を得た。
ベクター保持菌を得た。
実施例５ 改良コリシンE1プロモーターを含むベクター
のDNA塩基配列 実施例４で選ばれたコロニーを、テトラサイクリン12.5
μg/mlを含むLB培地で培養して菌体を得た。この菌体を
Birmboimの方法［Nucleic Acids Res.７.1513（197
9）］に従って処理し、プラスミドを得た。このプラス
ミドをFruDII＜TaqIで分解し、得られたコリシンE1プロ
モーターを含む断片について、ジデオキシ法［Sarger e
tal Science、214、1205（1981）、Messing,Methods in
Enzymology,101、20（1983）］による塩基配列の決定
を行なった。その結果、コリシンE1プロモーター領域が
下式の様に変異したことを確認し、それぞれのプラスミ
ドベクターをpHT35−１、pHT10−６及びpHT35−２と命
名した。（ａ）ベクター:pHT35−１、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT35−１） ５′−CAGTCTTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAATTTATGCT−
３′ （ｂ）ベクター:pHT10−６、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT10−６） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAATTTATGCT−
３′ （ｃ）ベクター:pHT35−２、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT35−２） ５′−CAGTCTTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ 実施例６ 形質発現実験 実施例５で得られた３種類のプラスミドベクター保持菌
をマイトマイシンＣで処理し誘発合成を行なわせ、ヒト
Cu−Zn−SOD産生能を指標として、改良コリシンE1プロ
モーターの強さを測定した。保持菌は大腸菌545πHR株
を公知の方法で形質転換した後、テトラサイクリン耐性
菌として選別した。またpUBE2保持菌をコントロールと
して、同時に誘発合成を行なわせた。
のDNA塩基配列 実施例４で選ばれたコロニーを、テトラサイクリン12.5
μg/mlを含むLB培地で培養して菌体を得た。この菌体を
Birmboimの方法［Nucleic Acids Res.７.1513（197
9）］に従って処理し、プラスミドを得た。このプラス
ミドをFruDII＜TaqIで分解し、得られたコリシンE1プロ
モーターを含む断片について、ジデオキシ法［Sarger e
tal Science、214、1205（1981）、Messing,Methods in
Enzymology,101、20（1983）］による塩基配列の決定
を行なった。その結果、コリシンE1プロモーター領域が
下式の様に変異したことを確認し、それぞれのプラスミ
ドベクターをpHT35−１、pHT10−６及びpHT35−２と命
名した。（ａ）ベクター:pHT35−１、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT35−１） ５′−CAGTCTTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAATTTATGCT−
３′ （ｂ）ベクター:pHT10−６、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT10−６） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAATTTATGCT−
３′ （ｃ）ベクター:pHT35−２、 （改良前） ５′−CAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ （改良後:pHT35−２） ５′−CAGTCTTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTTTTATGCT−
３′ 実施例６ 形質発現実験 実施例５で得られた３種類のプラスミドベクター保持菌
をマイトマイシンＣで処理し誘発合成を行なわせ、ヒト
Cu−Zn−SOD産生能を指標として、改良コリシンE1プロ
モーターの強さを測定した。保持菌は大腸菌545πHR株
を公知の方法で形質転換した後、テトラサイクリン耐性
菌として選別した。またpUBE2保持菌をコントロールと
して、同時に誘発合成を行なわせた。
0.3％のカザミノ酸（Difco社製）、0.4％のグルコー
ス、12.5μg/mlのテトラサイクリンを添加したM9培地20
mlにそれぞれの保持菌を接種し、37℃で振とう培養し
た。OD660が0.4付近になった時、2mlの10倍濃M9緩衝
液、0.2mlの40％グルコース、0.1mlの0.4mg/mlマイトマ
イシンＣを添加し、37℃で２時間静置し、誘発合成を行
なわせた。
ス、12.5μg/mlのテトラサイクリンを添加したM9培地20
mlにそれぞれの保持菌を接種し、37℃で振とう培養し
た。OD660が0.4付近になった時、2mlの10倍濃M9緩衝
液、0.2mlの40％グルコース、0.1mlの0.4mg/mlマイトマ
イシンＣを添加し、37℃で２時間静置し、誘発合成を行
なわせた。
改良コリシンE1プロモーターの強さをヒトCu・Zn−SOD
タンパク産生能で測定するために、1.5mlの培養液をエ
ッペンドルフチューブに採取した。15.000rpm30秒の遠
心で集菌し、1mlの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で洗菌し
た後、100μｌの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し
た。懸濁液から40μｌを分取し、等量の溶菌溶液（４％
SDS、20％グリセロール、1.4Mβ−メルカプトエタノー
ル、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）、0.01％（BPB）を加
え、100℃、３時間煮沸した。これをタンパク電気泳動
用サンプルとした。
タンパク産生能で測定するために、1.5mlの培養液をエ
ッペンドルフチューブに採取した。15.000rpm30秒の遠
心で集菌し、1mlの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）で洗菌し
た後、100μｌの50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁し
た。懸濁液から40μｌを分取し、等量の溶菌溶液（４％
SDS、20％グリセロール、1.4Mβ−メルカプトエタノー
ル、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）、0.01％（BPB）を加
え、100℃、３時間煮沸した。これをタンパク電気泳動
用サンプルとした。
タンパク電気泳動法は、公知の方法であるレムリー（La
emmli）の方法［Laemmli,Nature227、680−685（197
0）］に準じ、濃縮用ゲル３％、分離用ゲル12.5％で行
なった。
emmli）の方法［Laemmli,Nature227、680−685（197
0）］に準じ、濃縮用ゲル３％、分離用ゲル12.5％で行
なった。
ヒトCu・Zn−SODタンパク産生量をデンシトメーター
（常光社製、DENSITRON MICON20）により測定した。表
Ｉに測定結果を示した。
（常光社製、DENSITRON MICON20）により測定した。表
Ｉに測定結果を示した。
実施例７ 形質発現実験 プラスミドベクターpHT35−１保持菌（FERM P−9435）
とpUBE2保持菌について、2.6lジヤーフアーメンター
（丸菱バイオエンジ（株）社製）を用いて、プロモータ
ーの強さを測定した。0.3％のカザミノ酸、0.4％のグル
コース、12.5μg/mlのテトラサイクリンを添加したM9培
地１にそれぞれの保持菌の前培養液50mlを接種した。
37℃で培養しOD660が0.4付近に菌が生育した時、マイト
マイシンＣを最終濃度２μg/mlになるように添加し、継
続的に培養し、誘発合成を行なった。培養液1.5mlを採
取し、実施例６と同様にヒトCu・Zn−SOD産生量を指標
としてプロモーターの強さを測定した。表IIに測定結果
を示した。
とpUBE2保持菌について、2.6lジヤーフアーメンター
（丸菱バイオエンジ（株）社製）を用いて、プロモータ
ーの強さを測定した。0.3％のカザミノ酸、0.4％のグル
コース、12.5μg/mlのテトラサイクリンを添加したM9培
地１にそれぞれの保持菌の前培養液50mlを接種した。
37℃で培養しOD660が0.4付近に菌が生育した時、マイト
マイシンＣを最終濃度２μg/mlになるように添加し、継
続的に培養し、誘発合成を行なった。培養液1.5mlを採
取し、実施例６と同様にヒトCu・Zn−SOD産生量を指標
としてプロモーターの強さを測定した。表IIに測定結果
を示した。
実施例８ 形質発現実験 プラスミドベクターpHT35−１保持菌とpUBE2保持菌につ
いて、2.6lジヤーフアーメンター（丸菱バイオエンジ
（株）社製）を用いてプロモーターの強さを測定した。
いて、2.6lジヤーフアーメンター（丸菱バイオエンジ
（株）社製）を用いてプロモーターの強さを測定した。
0.3％のカザミノ酸、0.4％のグルコース、12.5μg/mlの
テトラサイクリンを添加したM9培地１にそれぞれの保
持菌の前培養液50mlを接種した。37℃で培養し、OD660
が0.4付近に菌が成長した時に、紫外線（254nm、7800μ
Ｗ・sec/cm2）を照射し、継続的に培養し誘発合成を行
なった。
テトラサイクリンを添加したM9培地１にそれぞれの保
持菌の前培養液50mlを接種した。37℃で培養し、OD660
が0.4付近に菌が成長した時に、紫外線（254nm、7800μ
Ｗ・sec/cm2）を照射し、継続的に培養し誘発合成を行
なった。
培養液1.5mlを採取し、実施例６と同様にヒトCu・Zn−S
OD産生量を指標としてプロモーターの強さを測定した。
表IIIに測定結果を示した。
OD産生量を指標としてプロモーターの強さを測定した。
表IIIに測定結果を示した。
実施例９ マルチクローニング部位をもったプラスミド
ベクター（第１図参照） 部位突然変異法を用いて、高発現能を有する様に改良し
たコリシンE1プロモーターに任意の構造遺伝子を発現し
得る様に、マルチクローニング部位を作製した。
ベクター（第１図参照） 部位突然変異法を用いて、高発現能を有する様に改良し
たコリシンE1プロモーターに任意の構造遺伝子を発現し
得る様に、マルチクローニング部位を作製した。
プラスミドベクターpHT35−１をDraIで切断し、細菌ア
ルカリホスフアターゼを作用させ切断部位を脱リン酸化
した。一方、pUC13（フアルマシア社製）をEcoRI.HindI
IIの２種の制限酵素で切断し、マルチクローニング部位
（MCS）を含む45bpを単離した。得られたMCSを含むDNA
鎖をDNAポリメラーゼＩ（Klenowフラグメント）で一本
鎖部分を二本鎖にした。pHT35−１のDraI切断DNAとMCS
を含む二本鎖DNAを結合させ、大腸菌に形質転換し、改
良コリシンE1プロモーターの下流にMCSをもったプラス
ミドベクターを作製した。このことにより得られたプラ
スミドベクターのMCSには、SstI、SmaI、XmaI、BamHI、
XbaI、SalI、AccI、HincII、PstIの制限酵素切断部位が
存在する。
ルカリホスフアターゼを作用させ切断部位を脱リン酸化
した。一方、pUC13（フアルマシア社製）をEcoRI.HindI
IIの２種の制限酵素で切断し、マルチクローニング部位
（MCS）を含む45bpを単離した。得られたMCSを含むDNA
鎖をDNAポリメラーゼＩ（Klenowフラグメント）で一本
鎖部分を二本鎖にした。pHT35−１のDraI切断DNAとMCS
を含む二本鎖DNAを結合させ、大腸菌に形質転換し、改
良コリシンE1プロモーターの下流にMCSをもったプラス
ミドベクターを作製した。このことにより得られたプラ
スミドベクターのMCSには、SstI、SmaI、XmaI、BamHI、
XbaI、SalI、AccI、HincII、PstIの制限酵素切断部位が
存在する。
第１図は、本発明のプラスミドベクターpHT35−１から
マルチクローニング部位（MCS）を有する高発現ベクタ
ーを製造する概略の工程を示している。
マルチクローニング部位（MCS）を有する高発現ベクタ
ーを製造する概略の工程を示している。
Claims (3)
- 【請求項１】大腸菌（Escherichia coli）の改良プロモ
ーターであって、前記プロモーター中の−35領域、−10
領域、および−35領域と−10領域との間の領域とからな
る塩基配列が、下記の３種の塩基配列： ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATATTA ５′−TTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTCCCTTTTACGTCGCCGCATATTA および ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATCGAA より選ばれる、いずれか一種であることを特徴とする改
良プロモーター。 - 【請求項２】大腸菌（Escherichia coli）の改良プロモ
ーターを有するベクターであって、前記プロモーター中
の−35領域、−10領域、および−35領域と−10領域との
間の領域とからなる塩基配列が、下記の３種の塩基配
列： ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATATTA ５′−TTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTCCCTTTTACGTCGCCGCATATTA および ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATCGAA より選ばれる、いずれか一種であることを特徴とするベ
クター。 - 【請求項３】大腸菌（Escherichia coli）の改良プロモ
ーターを有するベクターを含むエシェリヒア・コリー種
に属する微生物であって、前記プロモーター中の−35領
域、−10領域、および−35領域と−10領域との間の領域
とからなる塩基配列が、下記の３種の塩基配列： ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATATTA ５′−TTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTATAAT−３′ AACTGTCCCTTTTACGTCGCCGCATATTA および ５′−TTGACATGGAAAATGCAGCGGCGTAGCTT−３′ AACTGTACCTTTTACGTCGCCGCATCGAA より選ばれる、いずれか一種であることを特徴とする微
生物。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19452487A JPH0757193B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | 改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌 |
| CA000573698A CA1301678C (en) | 1987-08-05 | 1988-08-03 | Promoter, vector having the improved promoter, plasmid having the vector, and transformer with the plasmid |
| DK434588A DK434588A (da) | 1987-08-05 | 1988-08-03 | Promotor samt vektor indeholdende promotoren |
| EP19880307215 EP0314274B1 (en) | 1987-08-05 | 1988-08-04 | Improved promoter, vector having the improved promoter, plasmid having the vector, and E.coli transformed with the plasmid |
| DE19883888916 DE3888916T2 (de) | 1987-08-05 | 1988-08-04 | Promoter, diesen Promoter enthaltender Vektor, diesen Vektor enthaltendes Plasmid und durch dieses Plasmid transformierte E.Coli-Zellen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19452487A JPH0757193B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | 改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6439988A JPS6439988A (en) | 1989-02-10 |
| JPH0757193B2 true JPH0757193B2 (ja) | 1995-06-21 |
Family
ID=16325965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19452487A Expired - Lifetime JPH0757193B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | 改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0314274B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0757193B2 (ja) |
| CA (1) | CA1301678C (ja) |
| DE (1) | DE3888916T2 (ja) |
| DK (1) | DK434588A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2044876A1 (en) * | 1990-06-25 | 1991-12-26 | Rama M. Belagaje | Tryptophan promoters |
| GB9017037D0 (en) * | 1990-08-03 | 1990-09-19 | Health Lab Service Board | Process for producing enzymes having superoxide dismutase activity,novel superoxide dismutase enzymes and novel pharmaceutical compositions comprising enzymes |
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