JPS61111690A - 組換えｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な組換えＤＮＡおよびその用途に関し、
さらに詳しくは、形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、
亜鉛型スーパーオキシドデイスムクーゼ構造遺伝子を有
する組換えＤＮＡおよびその用途に関するものである。

従来の技術 スーパーオキシドディスムターゼ（以後ＳＯＤと略す）
は、下式に示す不均化反応によりによりスーパーオキシ
ド（０□−）を消失させる作用を持つ酵素である。

Ｏｚ−＋Ｏｚ−＋２Ｈ”　−Ｏｚ＋ＨｚＯｚＳＯＤは分
子中に含まれている金属の違いにより銅、亜鉛型（Ｃｕ
　、　Ｚｎ−５ＯＤ）　、マンガン型（Ｍｎ−ＳＯＤ）
及び鉄量（Ｆｅ−ＳＯＤ）の３種類に分けられる。この
うちＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤはヒトや動物などの真核生
物の細胞質に主として存在しており、またミトコンドリ
アにはＭ、ｎ−５ＯＤが存在している。一方、バクテリ
アなどの原核生物はＭｎ−５ＯＤ　、　Ｆｅ−５ＯＤの
両者を細胞内に存している。

ＳＯＤに抗炎症作用のあることを最初に見出したのはＭ
ｃＣｏｒｄ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１８５．　５２９−
５３１．１９７４）であり、ウシの赤血球から精製した
ＳＯＤを用いている。また細菌由来のＳＯＤの抗炎症作
用も知られている（特開昭５８−１６６８５号、ｃ報）
。しかしながら、−これらのＳＯＤは人体にとって異種
タンパクであり、免疫上の問題をひき起す危険性がある
ため、ヒトの医薬としてはヒｌ−３ＯＤを使用するのが
好ましい。ヒト細胞や組織からヒトＳＯＤを製造する方
法に関しては既に多くの知見がある（特開昭５７−１４
１２８８号公報、特開昭５７−１５５９９１号公報、特
開昭５９−９１８８１号、狐報等）。

発明が解決しようとする問題点並びにその手段及ｐづ１
朋 しかしながら、前記した方法は原料を多量に入手するこ
とが困難であるし、また比較的入手し易い原料であるヒ
ト胎盤ではＳＯＤ含有量が低いなどの欠点があり、工業
生産に適したものとは言い難い。

以上の知見にもとづき、本発明者らは、遺伝子組換え法
によるヒｌ−３ＯＤの製造について種々検討を行った結
果、形質発現調節遺伝子を利用して、ヒトＣｕ　、　Ｚ
ｎ−５ＯＤ遺伝子を効率よく発現させうろことを見出し
、本発明の完成に到った。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においてヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤのｃＤＮＡ
合成の鋳型として用いられるｍＲＮＡは正常なヒト組織
（肝臓。

胎盤、腎臓など）から分離される。組織からのＲＮＡの
分離は、フェノール−クロロホルム法、グアニジニウム
−熱フェノール法、グアニジニウム−塩化セシウム法な
どの公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１
８７−１９８＋　１９８２．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が利用できる。

次いでオリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セファロ
ースなどを用いてポリ（Ａ）テイルをもったｍＲＮＡを
分離する。

このようにして得られたｍＲＮＡは、ヒトＣｕ　、　Ｚ
ｎ−５００のｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ混合物であ
るが、これをそのままｃＤＮＡ合成に用いる。まず、逆
転写酵素を用いｍＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを
合成し、次いで逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを
用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、適当なベクターに
組込まれた形でｃＤＮＡを得る。これにはｄＧ　−ｄＣ
またはｄＡ−ｄＴホモポリマー結合法（Ｎｅｌｓｏｎ、
　Ｔ、Ｓ、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、６Ｂ、　４ｔ、　１９７９＋　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　ＰｒｅｓｓＩｎｃ、）やＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２．１６１．１
９８２）が利用できる。

本発明の場合のようにｍＲＮＡ混合物中の目的ｍＲＮＡ
含量が低い場合は、効率の高いＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ
ｇ法が好ましい。この方法に必要なりＮＡおよび宿主菌
はファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社カタログ患
２７−４７５０−０１として入手できる。

このようにして得られる組換えＤＮＡをたとえばエシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
ｘ　１７７６株あるいはＤＨＩ株（Ｌｏｗ、Ｂ、、　Ｐ
ｒ０ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、６０＋　　１６０＋　　１９６８；　　Ｍｅ
ｓｅｌｓｏｎ、Ｍ、ａｎｄ　Ｙｕａｎ、Ｒ，。

Ｎａｔｕｒｅ、　　２１７＋　　１１１０＋　　１９６
８；　　Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ、、　　Ｊ、　　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１６６、５５７．１９８３）に導入して形
質転換させる。形質転換法は公知の方法（重定勝哉、細
胞工学、　Ｖｏｌ、　２．　Ｎｎ３．６１６．１９８３
）またはそれに準する方法で行うことができる。アンピ
シリン耐性などの薬剤耐性によりまず形質転換体を選別
したのち、ヒ）Ｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤ遺伝子に対応す
ると考えられる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
化学合成しこれを３２ｐで標識してプローブとして用い
、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（Ｈａｎａ
ｈａｎ、　Ｄ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ＋　１００＋３３３、１９８３）によりポ
ジティブなシグナルを示した形質転換体を選択する。こ
れらの形質転換体より常法に従ってプラスミドＤＮＡを
単離し、ｃＤＮ八部背部分基配列をＭａｘａｍ−Ｇ　ｉ
　１ｂｅｒ　を法（Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、　ａｎｄＧｉ
ｌｂｅｒｔ、Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、、　７４．５６０゜１９７７）またはジ
デオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、ら・Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５１９＋　３０９＋　１９８１）に
よって決定し、ヒトＣｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤ　ｃＤＮＡ
の存在を確認する。

確認には、ヒト赤血球より単離されたＣｕ　、　Ｚｎ−
３００のアミノ酸配列（Ｊａｂｕｓｃｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、’１９゜２３１０、１９８０
）またはダウン症候群患者に由来する樹立細胞株より分
離されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの塩基配列（Ｓ
ｈｅｒｍａｎ、　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

８０、５４６５．１９８３）を参考にすることかできる
。

次に、得られたヒトＣｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤのｃＤＮＡ
を適当な形質発現調節遺伝子の下流に連結する。これに
はトリプトファンオペロンプロモーター（ｔｒｐプロモ
ーター）、ラクトースオペロンプロモーター（ｌａｃプ
ロモーター）、λファージのＰＬプロモーター、ｔａｃ
プロモーターなどの公知のプロモーターが利用できる。

しかし、ここで注目すべきことは、生体内にはＯ２−を
必要とする酵素の存在が知られており（大柳善彦、スー
パーオキサイドと医学、５８．１９８１゜共面出版）、
従って、Ｏ２−を消去する作用を持つＳＯＤを過剰生産
させることにより宿主菌の生理障害をひき起す可能性が
充分に考えられることである。これを避けるためには、
遺伝子の発現を抑制した状態で細胞を成育させたのち、
適当な条件下にこの抑制を解除させて遺伝子を発現させ
ＳＯＤを多量に産生させることが好ましい。

エシェリヒア・コリから分離されたプラスミドＣｏｌ　
Ｅ　ｌ上に存在するコリシンＥ１遺伝子はコリシンＥ１
タンパクの産生を支配している遺伝子であり、通常の状
態においてはリプレッサータンパクがオペレーターに結
合することにより遺伝子の発現は抑制されているが、Ｄ
ＮＡに損傷を与えるような処理、たとえば紫外線照射、
マイトマイシンＣ処理、ナリジキシン酸処理などにより
この抑制が解除されて誘発が起り、コリシンＥ１タンパ
クが多量につくられる。これはいわゆる負の制御と呼ば
れる調節機構である。これに加えて、コリシンＥ１遺伝
子には正の制御も存在しており（調恒明ら、生化学、Ｖ
ｏｌ、５６．　Ｎａ　８　、１０８２．１９８４）、ユ
ニークな形質発現調節機構を持つ遺伝子であって、誘発
時には正の制御の効果も加わってきわめて多量のコリシ
ンＥ１タンパクが産生される。ざらにコリシンＥ１タン
パクはエシェリヒア・コリに対する抗菌性を機能とする
タンパクであって、通常時の細胞の成育には必要ないタ
ンパクと見なし得るものであり、その性質上、通常時の
コリシンＥ１遺伝子の発現が厳密に抑制されていること
からも、コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の利
用は本発明にとってきわめて有利である。

Ｃｏｌ　Ｅ　Ｉ　ＤＮＡはたとえばファルマシアＰ、Ｌ
、バイオケミカルズ社のカタログｍ２７−４９１４−０
１として入手することが可能である。また、正の制御に
関与する領域、プロモーター・オペレーター領域、リポ
ソーム結合領域からなるコリシンＥ１遺伝子の形質発現
調節遺伝子の塩基配列は既に報告されている　（Ｅｂｉ
ｎａ＋Ｙ、ら、　Ｇｅｎｅ、　１５．１１９．１９８１
）。なお、本発明におけるコリシンＥ１遺伝子の形質発
現調節遺伝子とは、第１図の−１４０から７８番目まで
の塩基配列の存在を必須とするものである。

コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒト
Ｃｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤｃＤＮＡを連結する際に、いわ
ゆる融合タンパクを産生ずるような形での連結は、適当
な制限酵素の切断部位を利用することにより比較的容易
に行うことができる。しかし、コリシンＥ１タンパクに
由来する部分がある程度以上の長さを持っている場合、
この融合タンパクを人体に投与した際に免疫原性（抗原
性）を発揮する危険性が充分に考えられる。従って、コ
リシンＥ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直後に
ヒ）Ｃｕ。

Ｚｎ−５ＯＤのＮ末端アミノ酸コドンが連結される形が
好ましい。しかし、これを満足させてくれるような適当
な制限酵素の切断部位はどちらの遺伝子にも存在してい
ない。そこで、制限酵素を用いて両方のＤＮＡ断片を必
要部分が欠失した形で切り出し、欠失した部分は合成り
ＮＡ断片により補間することができる。

合成りＮＡ断片は、たとえば固相トリエステル法（Ｍｉ
ｙｏｓｈｉ、に、ら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　８＋　５５０７＋１９８０）によりオリゴヌク
レオチドを化学合成し、これらをたとえばＴ４ＤＮＡリ
ガーゼでつなぎ合せることにより得られる。合成りＮＡ
断片は、ちとの塩基配列を再現するものである必要は必
ずしもない。アミノ酸コドンには縮重が存在し、かつ生
物の種によってコドンの使用頻度が異なることは良く知
られている。従って、アミノ酸の配列を変えない限りに
おいては、合成りＮＡ断片の作製時にどのようなコドン
を選んでも自由であるが、宿主菌中で使用頻度の高いコ
ドンを選択すると、遺伝子の発現量の増大が期待できる
。コリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域に関し
ては、もとの塩基配列を再現する方が好ましいが、結果
として遺伝子の発現量の増加につながるような塩基配列
の変更は採用できる。

自律複製できるベクターに、コリシンＥｌ遺伝子の形質
発現調節遺伝子を含むＤＮＡ断片、合成りＮＡ断片、ヒ
トＣｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤ構造遺伝子断片を正しく組込
むことにより目的の組換えＤＮＡが得られる。これらの
ＤＮＡ断片は、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
することができ、最終的に得られる組換えＤＮＡの構造
が目的とするものである限り、ＤＮＡ断片の連結順序に
は制限はない。使用するベクターは宿主微生物内で複製
可能なものであれば特に制限はなく、宿主がエシェリヒ
ア・コリの場合はｐＢＲ３２２が良く用いられている。

得られた組換えＤＮＡをベクターの宿主微生物に導入し
形質転換させる。本発明では宿主微生物としてエシェリ
ヒア・コリを使用しているが、形質発現調節遺伝子、特
にコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子が機能する
限りにおていは、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス・セレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ−ｖｉｓ
ｉａｅ）等の他の微生物も使用できる。エシェリヒア・
コリの場合は一３１１０株、２０ＳＯ株、Ｃ６００５株
などの名前があげられる。特にＷ３１１０株が好ましい
。Ｗ３１１０株はエシェリヒア・コリに１２株の野性株
（λ”、Ｆａから誘導されたλ−Ｆ−株であり、栄養要
求性などその他の点では野性株と同一である（Ｂａｃｈ
ｍａｎｎ、Ｂ、Ｊ、、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、３６＋５２５、１９７２）。

テトラサイクリン耐性などによりまず形質転換体を選択
したのち、常法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、制限
酵素地図の解析により第２次のスクリーニングを行う。

さらに誘発時のヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤの産生能に
よって目的の形質転換体を選択する。

ＳＯＤ活性の測定法としては、チトクロームＣ−キサン
チン−キサンチンオキシダーゼを用いる方法（ＭｃＣｏ
ｒｄ、Ｊ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ、■、、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２４４．６０４９．１９６９）　、ニト
ロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）　−リボフラビンを
用いる方法（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ＋Ｃ，ａｎｄ　Ｆｒ１
ｄｏｖｉｃｈ、１．、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
。

４４、２７６、１９７１）等が利用できる。ＮＢＴ−リ
ボフラビン法は簡便であり、電気泳動後のタンパクの活
性染色にも利用できるため便利である。エシェリヒア・
コリの場合について言うと、組換えＤＮＡから産生され
るヒトｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤに加えて、宿主染色体か
ら産生されるＭｎ−５ＯＤおよびＦｅ−８００が混在し
ている。これらのＳＯＤの酵素としての作用は同一であ
るが、Ｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤは１〜２ｍＭのＣＮ−イ
オンによって活性が阻害されるのに対し、Ｍｎ−３ＯＤ
　。

Ｆｅ−３ＯＤは同条件下での阻害を受けないことから区
別できる。また、これら３種のＳＯＤは分子量や等電点
が互いに異なるため、電気泳動、イオン交換またはゲル
口過カラムクロマトグラフィーにより分離することがで
きる。

このようにして得られた、形質発現調節遺伝子特にはコ
リシンＥｌ遺伝子の形質発現調節遺伝子の下流にヒ）　
Ｃｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤ構造遺伝子を有する組換えＤＮ
Ａで形質転換された微生物を、その宿主微生物の増殖に
適した条件下で所定の時間培養し、その後に誘発合成を
行わせてヒ）Ｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤを大量に産生させ
る。エシェリヒア・コリの場合、たとえばＬ培地、グル
コースおよびカザミノ酸を含むＭ９培地などの公知の培
地により培養を行う。

培養は通常１５〜４３°Ｃの温度で２〜２４時間行う。

必要により通気、攪拌を加えることができる。対数増殖
期にある培養物にマイトマイシンＣ，ナリジキシン酸な
どの薬剤を添加したり、紫外線を照射することにより誘
発合成を行わせることができる。

培養後、公知の方法で菌体を集め破砕したのち、通常知
られているタンパクの精製法に従ってヒトＣｕ　、　Ｚ
ｎ−５ＯＤ活性を持つタンパクを単離することによりヒ
トＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤが製造できる。精製は、たと
えば熱処理、塩析、濃縮、透析、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル口過クロマトグラフィー、クロマトフオ
ーカシング、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフイーなどの操作を適宜組合
せて行うことができる。

叉舅脳 以下、本発明を実施例により具体的に開示するが、本発
明の範囲をこれらの実施例に限定するものでないことは
いうまでもない。

例１．　ヒト胎　からのｍＲＮＡの背離正常分娩によっ
て得られたヒト胎盤を細断し、液体窒素により急速凍結
させた。液体窒素共存下に凍結胎盤をホモジナイザーで
ホモジナイズし、パウダー状の胎盤組織試料を得た。

組織試料１ｇにつき５ｍ１ｌのグアニジニウム液（６Ｍ
グアニジニウム　チオシアネート、５ｍＭクエン酸ナト
リウム、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウ
ム、０．１　Ｍ　２−メルカブトエタポリアロマーチュ
ーブに５．７　Ｍ　ＣｓＣ１（０，１ＭＥＤＴＡ。

ｐＨ７，５を含む）を入れ、その上に２倍容のホモジネ
ートを重層し、日立１？ＰＳ４０Ｔローターを用いて２
５℃で３２．ＯＯＯｒｐｍ　１７時間遠心した。遠心後
、上清を注意深く除去し、底に沈澱したＲＮＡを少量の
エタノールで洗浄してＣｓＣｌ１を除いてから１ｍ１ｌ
の水にン容かした。これにＮａＣ１を０．２Ｍになるよ
うに加え２．５ｍｊ２のエタノールで再沈澱させた後、
０．５ｍｊ２の１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ
７，５）　＋１ｍＭＥＤＴＡ（以下ＴＥと略す）にＲＮ
Ａを溶解させオリゴ（ｄＴ）セルロース（コラボレイテ
ィプリサーチ社製タイプ３．カタログＮａ２０００３）
によるｍＲＮＡの分離を行った。

ＲＮＡ溶液を６５℃で５分加熱し急冷した後Ｑ、５ｍｆ
のＩ　Ｍ　ＮａＣｌ２を加え、これをＴ　Ｅ　＋　０．
５Ｍ　ＮａＣｌで平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラム（ベッド容量１．５ｍＡ、カラム内径７龍）にか
けた。カラムの通過液をもう一部カラムに通した後、Ｔ
Ｅ　＋０．５　Ｍ　ＮａＣｌ！でカラムを洗ってから、
ＴＥでｍＲＮＡを溶出させた。２５４ｎｍでの紫外吸収
ピーク画分を回収し、ＮａＣｌ１を０．２　Ｍになるよ
うに加え２．５倍容のエタノールでｍＲＮＡを沈澱させ
た。

沈澱を７５％エタノールで洗浄後凍結乾燥させた。

胎盤組織試料５ｇより５０μｇのｍＲＮＡを得た。

方　　　２．　　　ｃＤＮＡ合 Ｏｋａｙａｍｓ−Ｂｅｒｇの方法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ
，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２．１６１．１
９８２）に従ってｃＤＮＡを合成した ４００１１　ｇ　（７）ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０，
７１〜０．８６）ＤＮＡを７００ユ゛ニツトのＫｐｎＩ
　（宝酒造■製カタログｉ％１０６８Ａ）と３７℃、５
時間反応させた。反応液の組成は６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　（ｐＦ１７．５）　、６　ｍＭ　ＭｇＣｎ　２．
６ｍＭＮａＣＩｔ、６　ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタノ
ール、０．１ｍｇ／ｎ＋ｊ！ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）であり、反応液量は４００μ２であった。４０μｌ
の０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤ
ＴＡ、　ｐ１４８．０）　と２０μでの１０％ラウリル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えて反応を停止した。こ
れに０．４ｍｌの水飽和フェノール−クロロホルム混液
（１：　１）を加えて抽出した後、エタノール沈澱２回
、７０％エタノールによる洗浄１回を行ってＤＮＡを回
収した。

ＤＮＡのＫｐｎＩ切断端にターミナルトランスフェラー
ゼ（ＴＴａｓｅ）を用いてｄＴ鎖を付加した。反応液の
組成は１４０ｍＭ　　カコジル酸ナトリウム３０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ！（ｐＨ６−８）　、１　ｍＭ　Ｃｏ
（／！　ｚ　、０１１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ
）　、０．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ（〔α−５２Ｐ）　ｄＴ
ＴＰ　Ｏ，５μＣｉを含む）であり、反応液量は２００
μｌであった。３７℃に保温した反応液にＴＴａｓｅ　
（宝酒造（掬製カタログｌｌ＆ｈ２２３０　Ｂ　）４０
０ユニツトを添加して反応を開始させた。一定時間毎に
反応液の一部を抜き取り、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈
澱への３２ｐの取り込み量を測定してｄＴ鎖の平均鎖長
を求めた。平均鎖長が６０±１０塩基の範囲に達したと
ころで０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　２０μｌと１０％ＳＤＳ
　Ｌ　Ｏμβを添加して反応をとめ、フェノール−クロ
ロホルム抽出を４回行った後、前のスチップと同様に処
理してＤＮＡを回収した。

本実施例におけるｄＴ鎖の平均鎖長は７０塩基であった
。

次にＤＮＡを１７ユニー／トのＨｐａＩ　（宝酒造ＩＩ
製カタログ１ｌｈ１０６４Ｂ）と３７℃で５時間反応さ
せた。

反応液の組成は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
７，４）　、１０ｍＭＭｇＣ１ｘ　、２０ｍＭＫ（Ｊ　
、　１　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．　Ｌｍｇ／ｍ１ＢＳＡで
あり、反応液量は２００　ｔｔ　！！とした。

反応停止後１％アガロースゲル電気泳動にかけ、長い方
のＤＮＡ断片（約２．７ｋｂ）を分離した。ＤＮＡのゲ
ルからの回収は電気泳動溶出法（ＦＩａｎｊａｔｉｓ。

Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１
６４．１９８２．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により行った。次にオリゴ
（ｄＡ）セルロース（コラボレイティプリサーチ社製カ
タログ隘２０００５）により精製を行った（ベッド容量
０．７ｍ１）。回収されたピーク画分をベクタープライ
マーＤＮＡとして用いた。

一方、別に１００μｇのｐＢＲ３２２−５Ｖ４０　（０
，１９〜０．３２）　ＤＮＡを１２０ユニツトのＰｓｔ
Ｉ　（宝酒造０１製カタログ隘１０７３　Ａ　）と３７
°Ｃ１１，５時間反応させた。反応液組成は６　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，４）　、６ｍＭ門ｇＣ
１ｚ　、６　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、５０　
ｍ　Ｍ　ＮａＣ１，，０，１ｍｇ／ｍ１ＢＳＡで反応液
量は２００μ！であった。反応停止および反応後の処理
は前に述べた反応と同様である。次にＤＮＡのＰｓｔｌ
ｌ！Ｆｒ端にｄＧ鎖を付加した。（α−”Ｐ）　ｄＧＴ
ＰのＩμＣｉを基質とじ６０ユニントのＴＴａｓｅを用
いる他は後処理も含めてｄＴ鎖付加の場合と同様である
。本実施例におけるｄＧ鎖の平均鎖長は２７塩基であっ
た。次にＤＮＡを５０ユニツトの旧ｎｄ■（宝酒造側製
カタログ嵐１０６０　Ａ　）　　と３７℃、１時間反応
させ、１．８％アガロースゲル電気泳動により小さい方
のＤＮＡ断片（約０．２８ｋｂ）を分離、回収し、リン
カ−ＤＮＡとして用いた。なお、これらベクタープライ
マーＤＮＡおよびリンカ−ＤＮＡはファルマシアＰ、Ｌ
、バイオリミカルズ社よりカタログ患２７−４９４８−
０１および２７−４９５０−０１として入手することも
できる。

次に、ｃＤＮＡの合成を行った。反応液（２０μｌ）の
組成は、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃｊ！　（ｐＨ８，３
）　、８　ｍＭＭｇＣｌ　ｚ　　、３０　ｍＭＫｃＩｌ
　、　　０．３　ｍ１１４　　ＤＴＴ、　２ｍＭｄＮ１
’Ｐ　（４種それぞれにつき）、１０μＣｉ　（α−”
Ｐ）　ｄＣＴＰ　　（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、０
．９　ｐ　ｇ　ｍＲＮＡ、１．４μｇベクタープライマ
ーＤＮＡ、４ユニツト逆転写酵素（ライフサイエンス社
製）とした。反応は３７゛Ｃで３０分間行い、平均鎖長
１０００〜２０００塩基に相当する３２Ｐの取り込みが
あった。反応停止、後処理を前のステップと同様にして
行い。ＤＮＡを減圧乾燥後ｄＣ鎖の付加を行った。ＤＮ
Ａを１５μｌのＴＴａｓｅ反応液（１４０ｍＭカコジル
酸ナトリウム、３０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／！　（ｐ
Ｈ６，８）　、１　ｍＭＣｏＣＩ！　ｚ　、０．１　ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、　　０．２　μｇ　ポリ（＾）、６６μＭ
〔α−”Ｐ）　ｄＣＴＰ　（１０μＣｉ）　］に溶解さ
せた。

１８ユニツトのＴＴａｓｅを添加して３７°Ｃで反応を
開始させ、ｄＣ鎖の平均鎖長がリンカ−ＤＮＡのｄＧ鎖
の長さとほぼ等しくなった時点で反応を止め、前のステ
ップと同様に後処理を行った。ＤＮＡを１０μβの旧ｎ
ｄｌ［Ｉバッファーに溶かし、２．５ユニツトのＨｉｎ
ｄＩ［Ｉを加え３７℃で１時間反応させた。後処理後リ
ンカ−ＤＮＡによる環状化を行った。

０．０２ＰｍｏｌのＤＮＡに対し０．０４Ｐｍｏｌのリ
ンカ−ＤＮＡを添加し、１０１２のＴＥ＋０．ＩＭ　Ｎ
ａｃｆ中で６５℃、５分ついで４２℃、３０分加温した
後Ｏ℃に冷却した。これを液量１００．ｃＡ’、反応液
組成、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）
　、４　ｍＭＭｇＣｊ！　ｚ　、１０　ｍＭ（ＮＨ４）
ｚｓ０４．０．１　ＭＫＣｊ２　。

０、１　ｍ　Ｍｇ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（β−ＮＡＤ）　、５０　／’　ｇ／ｍｆ！　Ｂ　
５Ａ１０．６１１　ｇＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（
ファルマシアＰ、Ｌ、バイオケミカルズ社製カタログＮ
１１２７　０８７２−０１）　　となるように各成分を
加え、１２℃で一夜反応させた。さらに、４種のｄＮＴ
Ｐ各４０　μＭ、　０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤ。

０、４　μｇ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ、０．３
　μｇ　Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（宝酒造側
製カタログ１ｔ２１３０Ａ）、１ニー１−７トＥ、ｃｏ
ｌｉ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（ファルマシアＰ、Ｌ。

ハイオケミカルズ社製カタログＮ１１２７−０８９４−
０１）となるように各成分を追加し反応液量を１０４μ
ｒとし、１２°Ｃで１時間ついで２５°Ｃで１時間反応
させた後、形質転換を行った。

１１３、　　コンピテント細胞の調製と形パ転枦２％バ
タトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％バクトイ−
ストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｍＭＮａＣ
４−２，５ｍＭＫＣｌ　、　ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｊｉ’
ｚ　、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａの組成を有するＳＯＢ培地
４００　ｍ　ｌにエシェリヒア・コリＤＨ１株を接種し
、３７℃でＯＤ、５゜がおよそ０．６に達するまで振と
う培養した。１０分間氷冷した後、４℃で６．ＯＯＱｒ
ｐｍ、５分遠心し菌を集めた。Ｔｆｂ　Ｉ液（３０ｍ　
Ｍ　ＫＯＣＯＣＨ３，１００ｍＭ　Ｒｂ（Ｊ　、１０ｍ
Ｍ　ＣａＣ１ｚ　、５０ｍＭ　Ｍｎ（ｌ　ｚ、１５％グ
リセロール、０．２Ｍ酢酸でｐＨ５，８に調製）１４０
ｍｊ２に菌を懸濁させ、０°Ｃに５分間静置後ふたたび
遠心して菌を集めた。Ｔｆｂ　ｎ液（１０ｍＭＭＯＰＳ
、　７５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　、１０ｍＭ　Ｒｂ１Ｊ　、
　１５％グリセロール、ＫＯＨでｐＨ６，５に調製）３
２ｒｒｖに菌を懸濁させ、２００μβずつ分注しでてド
ライアイス−エタノール浴で瞬間凍結させた後−８０°
Ｃで保存した。

凍結菌液を室温に戻し融解したところで０℃に移して１
５分間静置した。ＤＮＡ溶液２０μｌを加えＯ’ｃ、３
０分間静置後、４２℃で９０秒間加熱して熱ショックを
加えた。水浴上に２分間置いて冷却してからＳＯＢ培地
を８００　ｐＩｔ加え３７°Ｃでゆっくりと振とうしな
がら１時間培養した後、コロニーハイブリダイゼーショ
ンを行った。

実施例４０合成りＮＡプローブの合成 コロニーハイブリダイゼーションに用いるプローブとし
て ５°ＴＴＣＧＴＣＧＣＣＡＴ３′　　　　　（１１量体
）５”ＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴ””　
　　（１９量体）の配列を有する２種のオリゴヌクレオ
チドを合成した。これらはそれぞれ、ヒトＣｕ　、　Ｚ
ｎ−５ＯＤのＮ末端およびＣ末端部に対応する塩基配列
（第２図で下線を施した部分）に相補的な配列を有して
いる。

合成は固相トリエステル法で行った。１１量体プローブ
の合成は、１０ｍｇのポリスチレンサポートＴ（和光純
薬■製カタログｍ１６０−１１６８１）に保護ヌクレオ
チドダイマーブロックＣＡ　、　ＧＣ、ＴＣ、ＣＧ　。

ＴＴ　（いずれもバノケム社！りを順番にカップリング
反応させた。５°末端保護基をはずす反応は１ＭＺｎＢ
ｒｚ　、ジクロロメタン−イソプロパツール（８５：　
１５）溶液を用いた。カップリング反応は反応液量０．
１５ｍｊ！でピリジン溶液中で行い、０．１Ｍのダイマ
ーブロックと３倍当量のメシチレンスルホニル−３−ニ
トロトリアゾールの存在下４５°Ｃで１５分間反応させ
た。未反応の反応基を無水酢酸でブロックした後、次の
カップリング反応を行った。

最後のカップリング反応が終了した後、０．５Ｍのテト
ラメチルグアニジウム−２−ピリジンアルドキシメート
３００μβ中で４０℃、２０時間反応させポリスチレン
サポートよりオリゴヌクレオチドを脱離させた。さら２
８％アンモニア水で５゛末端保護基以外の保護基をはず
した後、高速液クロを用い逆相カラム（東洋曹達工業■
製００５−１２ＯＡ、４．６ｗφＸ２５Ｃ１１）０．５
％ギ酸アンモニウムバッファーを用い、アセトニトリル
濃度勾配溶出法で溶出し、３０％アセトニトリル付近で
溶出されるオリゴヌクレオチドピークを回収した。８０
％酢酸中で２５℃、３００分間反応せて５゛末端保護基
をはずした後、再度逆相カラムで精製し、１７％アセト
ニトリルで？容出されるピークを回収し、コロニーハイ
ブリダイゼーションのプローブとして用いた。１９量体
プローブも同様にして合成した。ｌｌ量体プローブの収
率は４１％、１９量体プローブは６％の収率であった。

滅菌したニトロセルロースフィルターを１００μｇ　／
ｍｌ！のアンピシリンを含むし寒天培地にのせ、実施例
３で得られた培養液をフィルター上に拡げて３７°Ｃで
培養した。コロニーの直径が０．１　ｍｍ程度の時点で
、別のニトロセルロースフィルター２枚にレプリカし、
２５０μｇ　／ｍｌのクロラムフェニコールを含むし寒
天培地上にフィルターをのせ３７゛Ｃ１２４時間培養し
た。フィルター上のコロニーを０．５　ＭＮａＯＨで溶
菌させ中和した後、減圧下に６５°Ｃ１２時間加熱して
ＤＮＡをフィルター上に固定化させた。フィルターを５
００　ｍ　Ｉｔの５倍濃度デンハート？容ン夜０．５％
ＳＤＳ、１０　ｍ　ＭＥＤＴＡに浸漬し、６８℃で６時
間ゆっくりと振とうした。５倍濃度のＳＥＴ、５倍濃度
デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｊ２
の変性したＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　、１０μｇ　／ｎ／
！の３２ｐ標識合成りＮＡプローブという組成の溶液に
フィルターを浸し、ｌｌ量体プローブは２８℃、１９量
体プローブは４０℃でそれぞれ４８時間ハイブリダイゼ
ーションさせた。また、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造■製カタログＮ１２０２０Ａ）により２２ｐラ
ベルされたプローブの比活性はそれぞれ１．　Ｉ　Ｘ　
１０９ｃｌｍ／μｇ、９．４Ｘ　１０　”　Ｃｐｍ／μ
ｇであった。なおＳＥＴの組成は０．１５Ｍ　Ｎａｃｊ
２　、３０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｌ（ｐＨ８）　、
１ｍＭ　ＥＤＴＡであり、デンハート溶液の組成は０．
０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、
０．０２％ＢＳＡである。フィルターを洗浄後オートラ
ジオグラフィーにかけ、両方のプローブにポジティブな
シグナルを与えたコロニーを選別して培養し、プラスミ
ドＤＮＡを単離してＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの方法
およびジデオキシ法によりｃＤＮＡの塩基配列を調べた
。

その結果、３０数万コロニーの中からただひとつだけ、
ヒ）Ｃｕ　、　Ｚｎ−５００の構造遺伝子全体を有する
プラスミドｐｓＯＤ　２が得られた。

ヒ）Ｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤの構造遺伝子の塩基配列と
それによって決定されるアミノ酸配列を第２図に示した
。

Ｓｈｅｒｍａｎら（前出）がダウン症候群患者由来の樹
立細胞株から単離したヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤと比
較すると５４番目のスレオニンのコドンがＡＣＧではな
くＡＣＡとなっており、塩基配列に１カ所の違いが存在
していた。しかし、アミノ酸配列に関しては同一であっ
た。Ｊａｂｕｓｃｈら（前出）はヒト赤血球由来のＣｕ
　、　Ｚｎ−５ＯＤのアミノ酸配列を報告している。そ
れと比較すると、１７番目のアミノ酸がＳＥＲではなく
ＩＬＥ、９８番目がＶＡＬではなく　ＳＥＲと２カ所の
明確な違いがあった。その他に２６番目のアミノ酸のＡ
ＳＰ−４ＡＳＮ、４９番目のＧＬＮ−ＧＬＵ、５２番目
のＡＳＮ−４ＡＳＰ、５３番目のＡＳＰ−ＡＳＮという
４つの不一致があったが、これらのアミノ酸はアミノ酸
分析の技術上の問題から同定が困難なものであり、実質
的には一致していると考えて良い。以上の結果からプラ
スミドｐｓＯＤ　Ｚ上にヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤ構
造遺伝子が存在していることを確認できた。

施例６０組換えＤＮＡの作製 （１）コリシンＥｌ遺伝子の形質発現調節遺伝子断片の
分離とベクターへの組込み Ｃｏｌ　Ｅ　Ｉ　ＤＮＡ　１０Ａ１ｇを８ユニツトのＤ
ｒａｌ　（宝酒造■製カタログｌ’ｈ１０３７Ａ）と３
７℃、１２ＨＲａ’ｆ反応させた。反応液量５０μｌで
組成は１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）　、７
　ｍＭ　ＭｇＣｊ２　ｚ　、６０　ｍＭＮａＣｊ２　、
７　ｍＭ　２−メルカプトエタノールであった。エタノ
ール沈澱によりＤＮＡを回収後、１０ユニツトの５ｔｕ
Ｉ　にッポンジーン■製）と３７℃、１２時間反応させ
た。反応液量５０μｌ、組成は１００ｍＭ　ＮａＣ１，
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｚ　、６　ｍＭ　２−メルカプトエタ
ノールであった。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、３４０ｂρの５ｔｕＩ−ＤｒａＩ断片を
電気泳動溶出法により回収した。

一方、ρＢＲ３２２ＤＮＡ　１０μｇを１３ユニツトの
Ｄｒａ　Ｉと３７℃、１２時間反応させた。（条件はＣ
ｏｌ　Ｅ　ｌと同様）。１．２％アガロースゲル電気泳
動を行い、前記と同様にして３６５１ｂｐ断片を回収し
た。この断片を０．２ユニツトのアルカリホスファター
ゼ（宝酒造■製カタログＮｃｔ２１２０Ａ）で２５℃、
２時間反応させ、５”末端のリン酸基を除去した。

フェノール処理、エーテル抽出、エタノール沈澱を行い
ＤＮＡを回収した。

０、　Ｉ　、＋１ｔｇのＣｏｌ　Ｅ　１３４０ｂｐ断片
と２ｔｔｇのアルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ３
２２の３６５１ｂｐ断片を１ユニツトの７４ＤＮＡリガ
ーゼで連結した。反応液ｆｉｌＯ，ｃｒｆ、反応液組成
は６６　ｍＭ　Ｔｒｉ、５−ＨＣＩ！（ｐＨ７，６）　
、６．６　ｍＭ　ＭｇＣ４２ｚ　、１０　ｍＭ　ＤＴＴ
　：０、４　ｍ　Ｍアデノシン三リン酸（八ＴＰ）であ
り、１５℃で１２時間反応させた。これを実施例３と同
様にしてＤＨＩ株に４人し、テトラサイクリン耐性株を
選択してプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素切断地図
の解析結果から３４０ｂｐのＣａｌ　Ｅ　Ｉ　５ｔｕｌ
−Ｄｒａ　Ｉ断片がｐＢＲ３２２のＤｒａＩ３６５１ｂ
ｐ断片に組込まれたプラスミドｐＡＯＫ　１を得た（第
４図参照）。ｐＡＯＫｌにおいて、コリシンＥ１遺伝子
の形質発現調節遺伝子からの転写はテトラサイクリン耐
性遺伝子の転写方向と逆向きになるように組込まれてい
る。

（ｉｉ）ＳＯＤ構造遺伝子断片の分離 ｐｓＯＤ２ＤＮＡ　１０　ｐ　ｇを６ユニソトのＡｌｕ
Ｉ　（宝酒造■製カタログ＆１００４Ａ）と３７℃、１
２時間反応させた。エタノール沈澱によりＤＮＡを回収
し、３ユニツト（７）Ｔａｑｌ　（宝酒造ａｌ製カタロ
グ１１ｈ１０９２Ｂ）と６５℃、１２時間反応させた。

反応液量はどちらも５０μ！であり、ＡｌｕＩの場合の
反応液組成は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，
５）　、７　ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ、２０ｍＭ　Ｎａ（
Ｊ　、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、また、Ｔａｑ
ｌの場合は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ７
，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｊ！　、、１００ｍＭ　Ｎ
ａ（／！、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールであった
。５％ポリアクリアミドゲル電気泳動により分離して、
４４０ｂｐ断片を（ｉ）と同様にして回収した。なお、
ＴａｑＩ切断部位はＳＯＤの２０番目のアミノ酸フェニ
ルアラニンに対応するコドンの中にあり、＾ｌｕｌ切断
部位は３゛非翻訳領域の中にある。

（石）合成りＮＡ断片の作製 Ｃｏｌ　Ｅ　１３４０ｂｐ断片およびＳＯＤ構造遺伝子
断片で欠失している必要部分ａ４ｂｐを第３図に示した
ような１２個のオリゴヌクレオチドに分割し、実施例４
に示した方法で合成した。〔γ−５２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼで各オリゴヌクレオチドを３
２ｐラベルした後、ｌから６までと７から１２までのオ
リゴヌクレオチドをそれぞれ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにより連結した。各オリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌ
ずつを混合し、水溶液の状態で９０’Ｃ１３分間加熱後
急冷した。（１）で示した連結反応と同様の組成となる
ように各成分を添加して１９℃で８時間静置した後、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを加えて１９“Ｃで２４時間反応させ
た。

反応物を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
てからオートラジオグラフィーを行ってＤＮＡハンドを
検出し、目的とするサイズに合うバンドをゲルから切り
出した。ゲルを粉砕ｆ＆ＴＥバッファー０．３ｍ１ｌを
加えて３７℃、１２時間静置してゲルからＤＮＡ抽出し
た。遠心して上滑を回収し、エタノール沈澱ののち減圧
乾燥させた。

このようにして得られた２つのＤＮＡ断片を１５μ２の
Ｈ，Ｏに溶解させて混合し、４５゛ｃで１０分間加熱し
てから１９℃に２時間静置した後、前回と同様にしてＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結した。１０％ポリアクリルアミ
ドゲルで泳動を行った点を除くと前回と同様に処理して
８４ｂｐの合成りＮＡが得られた。

なお、第３図に示した合成りＮＡ断片においては、１２
番目のアミノ酸、グリシンに対応するコドンを、もとの
ｃＤＮＡ中で使用されているＧＧｃからＧＧＴに変更し
である。また１５番目のグルタミンのコドンもＣＡＧか
らＣＡＡに変更した。

ＧＧＴ　、　ＣＡＡというコドンはＧＧＣ、ＣＡＧ　と
いうコドンよりも宿主菌中での使用頻度の高いコドンで
ある。

（ｉｖ）組換えＤＮＡの作製 ｐＡＯＫ　Ｉ　ＤＮＡをＤｒａ　Ｉで切断後、アルカリ
フォスファターゼ処理した断片０．３８ｐｍｏｌと０．
５６ｐｍｏｌの合成りＮＡ断片、０．５６ｐｍｏｌのＳ
ＯＤ構造遺伝子断片の３つの断片を混合し、１ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。４℃で２時間
反応させた後、１５゛Ｃで１２時間反応させた。テトラ
サイクリン耐性で形質転換株を選択し、培養して組換え
ＤＮＡを分離した。得られたＤＮＡをＴａｑ　Ｉと反応
させて、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた
。目的とする組換えＤＮＡはＴａｑｌ消化により１３０
７　、１１１５　、４９８，４７５，３６８，３１５，
３１２．１４１　ｂｐの８個の断片に切断される。２０
０株について調べた結果、目的物と同じ電気泳動パター
ンを示す組換えＤＮＡ　ｐ［ＪＢＥｌ　、　ｐＵＢＥ２
　　、　ｐＵＢＥ３　　、　ｐＵＢＥ４が得られた。

−施例７．ＳＯＤの沃　合゛ 実施例６で得られた４種類の組換えＤＮＡの保持菌と、
ｐＡＯＫ　１保持菌をマイトマイシンＣ処理して誘発合
成を行わせ、ヒ）Ｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤの産生能を測
定した。ｐＡＯＫ　１保持菌は、ｐＡＯＫ　Ｉ　ＤＮＡ
をＷ３１１０に実施例３と同様にして導入し、テトラサ
イクリン耐性により選択した形質転換体であり、宿主染
色体上の遺伝子から産生されるＭｎ−３ＯＤ、　Ｆｅ−
３ＯＤの産生量をみるための比較例とした。

０．３％のカザミノ酸（Ｄｆｆｃｏ社製）、０．４％の
グルコース、１０μｇ　７ｍｌのテトラサイクリンを添
加したＭ９培地２０ｍ１にそれぞれの菌を接種し、ＯＤ
、６゜がＱ、　４になるまで３７０℃で振とう培養した
。４℃で８　、　ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心して菌を
集め、新しい上述の培地２０ｍ２に懸濁させた後、マイ
トマイシンＣ（協和発酵■製）を２μｇ　７ｍｌとなる
ように添加し、３７℃で２時間誘発合成を行わせた。

８＋　ＯＯＯｒｐｍ、１０分（４℃）で菌を集め、１０
ｍ１の生理食塩水で洗菌した後、菌体を３ｍｌの生理食
塩水に懸濁させた。超音波処理によって菌を破砕し、１
２．０００ｒｐｍで１５分（４℃）遠心し、上清の粗抽
出液を回収してＳＯＤ活性を測定した。活性測定はＢｅ
ａｕｃｈａｍｐら（前出）の方法に準じた。

活性測定液の組成は５．６　Ｘ　１０−’Ｍ　ＮＢＴ　
（和光純薬■製カタログ隘１４８−０１９９１）、Ｉ　
Ｘ　１０−２Ｍメチオニン、５．８５Ｘ　１０−”Ｍリ
ボフラビン、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ
７，８）で液量は３ｍｌとした。活性測定液に１０μｌ
の粗抽出液を加え、１８ワツト蛍光灯を２分間照射後、
５６０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定した。同時に１０μ
βのＨ２Ｏを添加した試料についても測定し、この試料
の発色度に対する発色阻害率を求めた。発色阻害率はＳ
ＯＤ活性と正の相関をもつ値であり、阻害率が高いほど
ＳＯＤ活性は高いことになる。また同一条件下に２ｍＭ
のＫＣＮを加えて活性測定を行い、ＣＮ−イオンの影響
を見た。結果を下表に示した。

以下余白 表中、タンパｊ濃度はバイオラッド社製プロティンアッ
セイ試薬（カタログｍ５００−０００１）を用い、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準試料として測定した。

また相対活性値はタンパク量の影響を補正した値である
。

組換えＤＮＡ保持保持−５１１０（ｐへ０Ｋ１）に比較
して１．４〜２倍の高いＳＯＤ活性を示し、この増加分
の活性がヒトｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤによるものである
。このことは、ＣＮ”　イオンの存在下においては値に
ばらつきはあるもののすべてほぼ同一レベルの活性を示
したことからも明らかである。なお、ＣＮ−の存在によ
りＯＤ、６゜の上昇が見られるが、阻害率で比較するこ
とによりその影響は無視できる。

実施例において最も高い活性を示したエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｗ３１１０
　（ｐＵＢＥ２）〔微工研条寄第６３４号（ＦＥＲＭ　
、ＢＰ−６３４）は昭和５９年１０月１２日に微工研に
寄託した。

施例８．　　ヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤであることの
確認実施例７の結果からもヒトｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤ
が産生されていることは明らかであるが、さらに確認を
行った。比較のための標準試料としてヒト赤血球より精
製されたＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤ　（シグマ社製カタロ
グ寛５７００６）を用いた。この標準試料の比活性は３
．０００ユニツト／■タンパクであった。

まず、電気泳動を行い、泳動後のゲルを活性染色した。

泳動はゲルディスク電気泳動法（堀尾・山下編、蛋白質
・酵素の基礎実験法、２８２．１９８１、南江堂）に従
って行った。アクリルアシド濃度は分離ゲル１５％、濃
縮ゲル０．３％とし、Ｎ、Ｎ、Ｎ　′。

Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭεＤ）に
よる化学重合法でゲルを作製し、泳動用バッファーはト
リス−グリシン（ｐＨ８，３）バフファーを使用した。

泳動後のゲルを遮光した状態でまず２．４５Ｘ１０−３
ＭＮＢＴ溶液に２０分間浸漬し、次いで０．０２８　Ｍ
ＴＥＭＥＤ　、　２．８　Ｘｌ０−’Ｍリボフラビン、
０．０３６Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，８）
の組成をもつ溶液に１５分間浸漬した後、１８ワツト蛍
光灯で８分間光照射した。光照射によりゲルは透明な黄
色から半透明の暗青紫色へと変色するがＳＯＤタンンパ
クのバンドだけは変色が起こらず透明に抜けて見える。

０．３８μｇのシグマ社ＳＯＤとそれと同■のヒトＣｕ
　、　Ｚｎ−５００を含むＷ３１１０（ｐＵＲＥ　２）
粗抽出液（総タンパク量は１３１μｇ）は同一の泳動距
離と同一の無変色透明度を有するタンパクバンドを示し
、両者が実質的に同一であることを確認できた。

なお、Ｗ３１１０（ｐＡＯＫ　１）粗抽出液１６４μｇ
を一緒に泳動したが、ＳＯＤ活性を存するバンドは検出
されず、この条件下で検出できるほどの量のＭｎ−５０
０およびＦｅ−５ＱＤは産生されていないことが判明し
た。

次に、抗ヒｈＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤ抗体（以下抗体と
称す）による活性阻害をみた。シグマ社ヒトＣｕ　、　
Ｚｎ−３ＯＤ１、５　ｍｇをフロイントの完全アジュバ
ントと共にウサギに皮下注射した。１６日後、１８日後
に同様にして注射を行い、最終免疫の６日後に採血し抗
血清を分離した。５６°Ｃ１３０分熱処理後、プロティ
ンＡ−セファローズＣＬ−４Ｂ　（ファルマシアＰ、Ｌ
、ハイオケミカルズ社カタログ隘１７−０７８０−０１
）カラムクロマトグラフィーによりＩｇＧを単離した。

ヘッド容９２ｍ１で１Ｍ酢酸で溶出した。オフタロニー
法で検定した結果、シグマ社ヒトＣｕ　、　Ｚｎ−５Ｏ
口と沈降線を生じたが、ウシ赤血球由来のＣｕ　、　Ｚ
ｎ−５ＯＤ　（シグマ社製カタログ魚５８２５４）およ
びＷ３１１０株の粗抽出液とは沈降線を示さず、ヒトＣ
ｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤに特異的な抗体であることを確認
できた。

誓３１１０（ｐＵＢＥ　２）および目１１０（ρ＾０Ｋ
１）の粗抽出液１０μｌに抗体５０μｌを加え４℃で４
時間反応させた。並行して抗体の代わりに生理食塩水５
０μβを加え同様に反応させた。反応後、実施例７と同
様にして活性測定を行った。結果を下表に示す。

以下余白 第　　２　　表 Ｍｎ−５ＯＤ、　Ｆｅ−５００だけしか産生じない−５
１１０（ｐＡＯＫｌ）の場合、抗体の添加によって発色
度は変化しなかったのに対し、Ｗ３１１０（ｐＵＢＥ　
２）の場合は発色度が抗体添加によって増加し、Ｗ３１
１０（ｐＡＯＫ　１）　とほぼ等しくなった。これはヒ
トＣｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤによる発色阻害効果だけが抗
体添加により解除されたことによる。

以上の結果から、組換えＤＮＡ　ｐＵＢＥ　２による形
質転換微生物Ｗ３１１０（ｐＵＢＥ　２）がヒトＣｕ　
、　Ｚｎ−５００を産生じていることが確認できたため
、次にこれを利用してヒトｃｕ　、　Ｚｎ−５ＯＤの製
造を行った。

実施例９．　ヒトＣｕ　、　Ｚｎ−３ＯＤの製造法０．
３％カザミノ酸、０．４％グルコース、１０ｇｇ／　ｍ
　ｌテトラサイクリンを含むＭ９培地５ｊｌ！に匈３１
１０（ｐＵＢＥ　２）を接種し、ＯＤ　ｂｂｏ　＝　０
．４まで３７℃振とう培養後、実施例７と同様にして誘
発合成を３７℃、２時間行わせた。遠心により２０ｇの
湿菌体が得られた。生理食塩水で洗苗後、１６０ｍｊ２
の５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）に菌体を
懸濁して超音波処理を行い、１４．ＯＯＯｒｐｍ　、１
５分（４℃）の遠心により粗抽出液１５５ｍｄを得た。

粗抽出液を６０℃で３分間熱処理し、生じた沈澱を１４
．００Ｏｒｐｍ　、１５分（４°Ｃ）の遠心により除去
し、１４２ｍｊ２の上清を得た。これにストレプトマイ
シン硫酸塩を２．５％（Ｗ／Ｖ）となるように加え、生
じた沈澱を前回と同様に遠心し、上清１４０ｍＡを得た
。次に硫安沈澱を行い５０〜９０％飽和硫安画分を回収
し、透析後イオン交換セルロースＤＥ５２（ワットマン
ケミカル社製）カラムクロマトグラフィーにかけて（ベ
ッド容量４３．３ｍ６　、カラム内径２．１　ｃｍ）　
、Ｏ〜０．２　ＭＮａｃｌ濃度勾配溶出を行った。ＳＯ
Ｄ活性の溶出パターンを第５図に示した。

３つのＳＯＤ活性ピークが得られ、２ｍＭのＫＣＮ共存
下で活性が消失した２番目のピーク画分を回収した。

なお、第５図の活性測定は、ピーク画分を検出するため
の測定であった関係上、かなり多量のＳＯＤを添加して
いるために定量性が低い。従って、第５図におけるＳＯ
Ｄピーク面積の比が３種類のＳＯＤの全活性の比にはな
っていないことを述べておく。

限外口過により濃縮後上フアクリルＳ−２００（ファル
マシアファインケミカルズ社製カクログ患１７−０８７
１−０１）カラムクロマトグラフィー（ベッド？容量３
１５ｍｊ！　、カラム内径２．１ｃｍ）にかけ、ヒトＣ
ｕ。

Ｚｎ−５００活性画分を回収し凍結乾燥した。精製の結
果を下表に示した。

以下余白 第　　３　　表 比活性４０９０ユニツト／■タンパクの精製ヒトＣｕ。

Ｚｎ−５ＯＤが３７．０％の回収率で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリシンＥ１遺伝子の形質発現調節遺伝子領域
の塩基配列を示したものである。ＰＢはＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位、ＲＳはＲＮＡポリメラーゼの認識部位
である。太い矢印は転写の開始点と転写方向を示してい
る。破線による下線部はリポソーム結合部位を示し、Ｍ
　ｅ　ｔが翻訳開始コドンの位置を示している。２カ所
存在する実線下線部は正の制御に関与する領域である。 また制限酵素Ｄｒａｌの切断位置を示した。 第２図は胎盤のｍＲＮＡから得られたヒトＣｕ。 Ｚｎ−５００ｃＤＮＡの構造遺伝子領域の塩基配列と、
塩基配列から決定されるアミノ酸配列を示した。２カ所
の下線部はコロニーハイブリダイゼーションに用いた２
種類の合成りＮＡがハイブリダイズする領域である。 第３図は合成りＮＡ断片の塩基配列と、化学合成したオ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示したものであり、オリ
ゴヌクレオチドを結合して得られる合成りＮＡ断片は、
５′端はＤｒａＩ断端、３′端はＴａｑＩ切断端となっ
ている。＊印は第２図の塩基配列を変更した個所で２カ
所存在している。 但しアミノ酸配列は変わっていない。 第４図は組換えＤＮＡ　ｐＵＢＥ　２が作製されるまで
の経過の概略を図示したものである。 第５図はイオン交換セルロースＤＥ５２によるカロムク
ロマトグラフィーの溶出曲線をＳＯＤ活性で示したもの
であり、図には発色阻害率でプロットしである。直線は
Ｎａｃ　ｌの濃度勾配を示している。 第４図 分画数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛型、スー
   パーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する組換え
   ＤＮＡ。 ２、形質発現調節遺伝子がコリシンＥ１遺伝子の形質発
   現調節遺伝子である特許請求の範囲第１項記載の組換え
   ＤＮＡ。 ３、形質発現調節遺伝子の翻訳開始コドンの直後にヒト
   銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼのＮ末端ア
   ミノ酸アラニンのコドンが存在する特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の組換えＤＮＡ。 ４、ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構
   造遺伝子がヒト正常組織から分離されたメッセンジャー
   ＲＮＡに由来する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である特許請
   求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の組換えＤＮＡ
   。 ５、ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構
   造遺伝子が、ヒト胎盤から分離されたメッセンジャーＲ
   ＮＡに由来する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である特許請求
   の範囲第１項、第２項又は第３項記載の組換えＤＮＡ。 ６、ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構
   造遺伝子がヒト正常組織から分離されたメッセンジャー
   ＤＮＡに由来する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であって、ア
   ミノ酸配列を変えない範囲において、一部のアミノ酸コ
   ドンを宿主菌において使用頻度の高いコドンに変更して
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項又
   は第３項記載の組換えＤＮＡ。 ７、宿主菌がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
   ｉａ　ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第６項記載の組
   換えＤＮＡ。 ８、ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構
   造遺伝子が、 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第６
   項記載の組換えＤＮＡ。 ９、ヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムターゼ構
   造遺伝子が、 【遺伝子配列があります】 である特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４
   項記載の組換えＤＮＡ。 １０、形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛型スー
   パーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する組換え
   ＤＮＡで形質転換された微生物。 １１、微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ　ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１０項記載
   の微生物。 １２、形質発現調節遺伝子の下流にヒト銅、亜鉛型スー
   パーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する組換え
   ＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培養物中に蓄
   積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムター
   ゼを採取することを特徴とするヒト銅、亜鉛型スーパー
   オキシドディスムターゼの製造法。 １３、形質発現調節遺伝子がコリシンＥ１遺伝子の形質
   発現調節遺伝子であって、その下流にヒト銅、亜鉛型ス
   ーパーオキシドディスムターゼ構造遺伝子を有する組換
   えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、培養物中に
   蓄積されたヒト銅、亜鉛型スーパーオキシドディスムタ
   ーゼを採取することを特徴とする特許請求の範囲第１２
   項記載の製造法。 １４、微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ　ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１２項又は
   第１３項記載の製造法。