WO1998049275A2 - INTEINE D'ARCHAEBACTERIE DE L'ESPECE $i(THERMOCOCCUS FUMICOLANS) - Google Patents

INTEINE D'ARCHAEBACTERIE DE L'ESPECE $i(THERMOCOCCUS FUMICOLANS) Download PDF

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WO1998049275A2
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Jean-Michel Masson
Isabelle Saves
Valérie OZANNE
Joël QUERELLOU
Jacques Dietrich
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to an intein from an archaebacterium " of the species Thermococcus fumicolans as well as the nucleic acid sequence of its recognition site and their use, in particular in genetic engineering methods.
  • the intein of the invention comes from an archaebacterium of the species Thermococcus fumicolans This bacterium produces two inteins: I-Tfu-1 and I-Tfu-2.
  • the nucleotide sequence of these two inteins is inserted into that of DNA polymerase from Th e rm o c o c c u s fumicolans, at conserved sites, involved after translation, in catalytic reactions. These sequences are transcribed and translated at the same time as that of DNA polymerase and the autocatalytic splicing of the inteins then produces three enzymes: two inteins, I-Tfu-1 and I-Tfu-2, and a DNA polymerase.
  • Inteins are also found in other proteins, such as vacuolar ATPase in S. cerevisiae (1), GyrA in Mycobacterium leprae (2), Rec A in Mycobacterium tuberculosis (3, 4).
  • the inteins are defined as protein introns which are spliced, not at the level of the messenger AR, but at the level of a protein maturation. They therefore fall under a single gene translated and transcribed in a single step, and constitute by-products of the maturation of the protein encoded by this gene (5).
  • thermococcus fumicolans inteins and in particular in I-Tfu-2, a thermostable restriction endonuclease activity.
  • a first object of the present invention therefore relates to an intein of the archaebacterium Thermococcus fumicolans
  • the object of the invention more particularly consists of an intein of the archaebacterium
  • Thermococcus fumicolans having an endonuclease and / or protease activity and its functionally equivalent derivatives.
  • the invention therefore also relates to: - an intein whose amino acid sequence is identical or equivalent to the sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1 and,
  • the invention also relates to a DNA sequence constituted by or comprising the sequence coding for an intein of the invention.
  • I- Tfu-2 has a molecular weight of 44,765 Da deduced from the sequence of 389 amino acids from the sequence SEQ ID N0: 1.
  • the invention relates as much to these thermostable inteins isolated and purified from the Thermococcus fumicolans strain as to inteins prepared by chemical synthesis or even by genetic engineering methods.
  • the invention also relates to a vector comprising a DNA sequence defined above, a cellular host transformed by such a vector, as well than a process for the production or expression in a cell host of the inteins of the invention.
  • a process for producing an intein according to the invention consists in: transferring a nucleic acid sequence coding for the intein or a vector containing said sequence into a cellular host,
  • the vector used is chosen according to the host to which it will be transferred.
  • the cell host used in the above method can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and especially from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells.
  • An additional process for producing an intein of the archa-bacterium Thermococcus fumicolans consists in isolating and purifying by any appropriate means an intein resulting from the catalytic splicing of the DNA polymerase of Thermococcus fumicolans.
  • the present invention further relates to the use of the intein of the invention as an endonuclease.
  • the present invention also relates to the nucleic acid sequence recognized and cut by an intein and in particular by I-Tfu-2.
  • the restriction site of I-Tfu-2 consists of 21 base pairs and is cut specifically to generate protruding ends of 4 bases in 3 'as illustrated below 5'ACGCGGATACAGACGGCTTTT 3 '
  • restriction site recognized by l-Tfu-2 is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 2.
  • the products of digestion with I-Tfu-2 can be religated by T4 DNA ligase, which allows the use of I-Tfu-2 in genetic engineering.
  • the present invention therefore also relates to an optionally recombinant nucleic acid comprising the specific recognition site of I-Tfu-2. and the use of said sequence for the preparation of a vector for gene cloning.
  • the exceptional size of the I-Tfu-2 recognition site means that this site is represented statistically 1 time every 4400 billion base pairs.
  • the endonuclease I-Tfu-2 is therefore particularly suitable for the study of large genomes. It should have at most between 0 and 1 site in the human or mammalian genome.
  • the present invention therefore also relates to the use of a nucleic acid sequence constituting a vector, comprising the restriction site of I-Tfu-2 for the preparation of a genomic bank or of artificial chromosomes.
  • a further object of the present invention therefore consists in using the restriction site of I-Tfu-2 in a method of transformation of a host by a heterologous polynucleotide fragment.
  • a method consists in: a) introducing into the host genome by any suitable means a nucleic acid sequence constituting a site for recognition and cleavage of an intein according to the invention, b) causing a cleavage in said genome by l using an intein according to the invention, c) introducing into the cleavage a heterologous polynucleotide fragment whose ends are homologous to those which surround the cleavage site.
  • E. coli when E. coli is transformed with a vector containing the nucleotide sequence coding for Tfu DNA polymerase and comprising the genes of I-Tfu-1 and I-Tfu-2, this sequence is transcribed and translated in its entirety. Then, autocatalytic splicing of the inteins produces three enzymes: two inteins and a DNA polymerase.
  • Tfu inteins have no toxicity for the host, unlike one of the inteins of Thermococcus li toral is (6), and consequently their use in kits useful in genetic engineering is easy.
  • the inteins therefore have in their sequence all the information necessary for their own protein splicing since they splice in E. coli.
  • the present invention further relates to the use of the intein of the invention as a protease.
  • thermostable protein of the invention
  • FIGS. 3-a to 3-f illustrate the optimization of the endonuclease activity of I-Tfu-2.
  • the figures 4-a and 4-b illustrate the determination of the minimal site of recognition of I-Tfu- 2.
  • FIG. 6 shows the abolition of the "star" activity of I-Tfu-2: 100 ng of each DNA substrate is incubated with 1 ⁇ l of I-Tfu-2 in 10 ⁇ l (final volume) of 50 mM buffer Tris acetate pH 8, 75 mM Mg (OAc) 2 and 10 mM NHOAc, for 10 minutes at 70 ° C.
  • FIG. 7 illustrates the use of I-Tfu-2 for the creation of a bank of artificial chromosomes in yeast. MATERIAL AND METHODS.
  • Tfu-2 The sequence coding for the I-T u-2 intein was amplified by PCR from 100 ng of thermococcus fumicolans genomic DNA.
  • the reaction included 10 ⁇ l of 10X Vent Thermopol buffer (NEB), 10 ⁇ l of 2mM dNTP (Pharmacia), 2 units of Vent polymerase (NEB) and 2 ⁇ l of each of the 20 pM oligonucleotides (TFUInt2-5 ': 5' ctgtacgcatatgagtgttacaggggacacag3 'and TFUInt2-3': 5 'agcgtcgacctagttgtgaacgagtattccg3') in a final volume of 100 ⁇ l.
  • the amplification was carried out by an incubation of 2 min at 94 ° C then 25 cycles (30 sec at 94 ° C, 30 sec at 48 ° C, 45 sec at
  • the amplification product (1189 bp) comprises an Nde I restriction site and an ATG codon inserted in phase at the 5 'end of the gene, and a TAG codon and a Sal I restriction site at the 3' end.
  • Nde I and Sal I Appligene Oncor
  • plasmid pET26b-Int2 50 ng of the plasmid pET26b-Int2 were used to transform bacteria BL21 (DE3) pLys S electrocompetent.
  • the transformed bacteria are cultured in 1 liter of LB medium supplemented with 50 mg / 1 of Kanamycin until an absorbance at 600 nm of 0.4.
  • 0.5 mM IPTG (Sigma) is then added to induce expression of the intein gene.
  • the bacteria are harvested by centrifugation (5000g, 10 min) when the culture reaches an absorbance of 2 to 600 nm.
  • the bacterial pellet is resuspended in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 and subjected to 6 freeze-thaw cycles in liquid nitrogen.
  • Fraction I Fraction I is subjected to chromatography on a Q Fast Flow ion exchange column (Pharmacia). The elution is carried out by a gradient of sodium chloride from 0 to 1 M in 20 mM sodium phosphate pH 7.5, with a flow rate of 5 ml / minM The intein 1-Tfu-2 is eluted at 0, 7 M NaCl.
  • the fractions containing the intein are dialyzed against a 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50 mM NaCl; 50% glycerol.
  • Bovine serum albumin (BSA) is added to reach a final concentration of 200 ⁇ g / ml.
  • the DNA sequences were obtained by the chain termination method (7) using an Applied Biosystems automated DNA analysis system.
  • the two strands of genes encoding the intein were sequenced using universal primers localized on vectors as well as internal primers. Sequence analysis was performed with DNASTAR software (Madison, Wis., USA) and the program of Genetic Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Wis., USA) available online on INFOBIOGEN. Computerized similarity searches were performed with the BLAST program, multiple alignments with CLUSTAL V, and phylogenetic trees were established using the so-called "Neighbor-joining" method (8).
  • FIGS. 3-a to 3-f An analysis of the operational conditions is shown in FIGS. 3-a to 3-f which illustrate the optimization of the endonuclease activity of I-Tfu-2 from 100 ng of DNA substrate N22C21 which are incubated with 1 ⁇ l of I -Tfu-2 purified, under different conditions, in a total volume of 10 ⁇ l.
  • Figure 3-c shows the effect of pH on the reaction which is carried out at 60 ° C for 30 min, in different 50 mM Tris-acetate buffers whose pH is adjusted between 7 and 9, and containing 75 mM Mg (OAc) 2 and 100 mM NH4OAC.
  • Figure 3-d shows the effect of the glycerol concentration on the reaction which is carried out at 60 ° C for 30 min in a 50 mM buffer
  • Figure 3-f shows the cutoff kinetics of the reaction which is carried out at 70 ° C in a 50 mM Tris-acetate pH 8 buffer containing 75 mM Mg (OAc) 2 and 100 mM NH4OAC. It is stopped in ice after different incubation times and then the cleavage products are analyzed on gel.
  • the cleavage site was determined by the primer extension method (9). Plasmid N22C21 is sequenced by the method of Sanger (1977) with a T7 polymerase sequencing kit (Pharmacia) using universal primers (direct and reverse). After the sequencing reaction, the samples are extracted at phenol-chloroform, precipitated and resuspended in 10 ⁇ l of water. 5 ⁇ l are used in a cleavage reaction with I-Tfu-2 with 2 ⁇ l of enzyme, in a final reaction volume of 10 ⁇ l, including 1 ⁇ l of 10X cleavage buffer.
  • the figure 4-a shows the delimitation of the minimal site of recognition.
  • the autoradiogram of the sequencing gel shows the sequence obtained with the oligonucleotides SeqPuc (on the left) and Ml3Rev (on the right).
  • the reactions incubated (lines +) and not incubated with I-Tfu-2 (lines -) were deposited side by side so as to determine the minimal site of recognition of the enzyme.
  • the cut site for each of the two strands of DNA is marked with an arrow. In the box is the sequence of nucleotides belonging to the minimal site in each direction.
  • the figure 4-b shows the minimal nucleotide sequence necessary for the recognition and the cut by I-Tfu-2.
  • the arrow indicates the "homing site” (HS) of the intein in the polymerase gene for Thermococcus fumicolans.
  • the dotted lines delimit the minimal recognition site.
  • a vector of type pYAC2 is transformed so as to carry an I-Tfu-2 recognition and cleavage site within the SUP4 gene by introduction of the sequence according to a known procedure (10).
  • This vector is prepared by cleavage with BamHI and dephosphorylation according to the procedure conventionally used.
  • a genomic library is prepared by controlled hydrolysis of genomic DNA with a restriction enzyme generating blunt ends. These fragments are separated according to not
  • Vector previously cut with I-Tfu-2 is then mixed with fragments "DNA and ligated by T4 DNA ligase.
  • the mixture was heated at 70 ° C for 10 minutes in the presence of I-Tfu-2, which makes it possible to cross-reference any vector which is religated on itself, without affecting the vectors which have integrated a fragment of the library. This also makes it possible to inactivate the T4 DNA ligase. desalting step of the mixture, it is used to transform a strain of Saccharomyces cerevisiae ade2- ocher, ura3, trpl and the autotrophic clones colored in red are selected on a synthetic medium without uracil or tryptophan.
  • the introduction of the I-Tfu-2 site makes it possible to considerably improve the efficiency of the construction of artificial chromosomes, on the one hand by improving the cloning step which is done with protruding ends and not more with blunt ends, and on the other hand by eliminating the background noise caused by the religious vector on itself. This improvement is particularly noticeable when we want to make large artificial chromosomes (> 1000 Kpb).
  • a modified vector pYAC2 in which the NotI sites located on either side of the SUP4o gene have been replaced by I-Tfu-2 sites allows, after cloning of a genomic library in this vector by the conventional procedure described by Burke et al, to excise and purify the cloned fragments in the artificial chromosomes after cleavage of said artificial chromosomes by the enzyme I-Tfu-2, regardless of the size of the fragments, which is not the case with the enzyme Not I for example.
  • the vector N8C13 is a derivative of pUC19 into which the recognition and cleavage site of I-Tfu-2 has been introduced at the Smal site.
  • the ligation step is followed by a heating step at 70 ° C in the presence of the enzyme I-Tfu-2.
  • the ligase is inactivated and any vector which has not integrated the fragment to be cloned is simultaneously cleaved at the I-Tfu-2 site, which makes it possible to eliminate the "false positives" during the transformation step.
  • Another vector into which two recognition and cleavage sites of I-Tfu-2 have been introduced on either side of the cassette comprising the multiple cloning sites makes it possible to extract the intact heterologous fragments regardless of their size or their sequence, after cloning of the fragments in this vector by one or more conventional cloning sites, then cleavage of the recombinant vector by I-Tfu-2.
  • GAG TTC GTT CCA ATC GAG AAA CTC TTT GAG CGC GTT GAT CAC CGT GTT 96
  • GTC TAT GAC ATC GAG GTT GAG GGA ACC CAC AGG TTC TTC GCC AAC GGA 1162 Val Tyr Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly 370 375 380

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Abstract

La présente invention concerne une intéine provenant d'une archæbactérie de l'espèce Thermococcus fumicolans ainsi que la séquence en acides nucléiques de son site de reconnaissance et leur utilisation, notamment dans des procédés de génie génétique.

Description

I NTÉ I NE D ' ARCHAEBACTER I E DE L ' E S P EC E THERMOCOCCUS FUMICOLANS
La présente invention concerne une intéine provenant d ' une archaebactérie" de l ' espèce Thermococcus fumicolans ainsi que la séquence en acides nucléiques de son site de reconnaissance et leur utilisation, notamment dans des procédés de génie génétique .
L ' intéine de l'invention provient d'une archaebactérie de l'espèce Thermococcus fumicolans Cette bactérie produit deux intéines : I-Tfu-1 et I-Tfu-2. La séquence nucléotidique de ces deux intéines est insérée dans celle de 1 ' ADN polymerase de Th e rm o c o c c u s fumicolans, au niveau de sites conservés, impliqués après traduction, dans les réactions catalytiques . Ces séquences sont transcrites et traduites en même temps que celle de l'ADN polymerase et l'épissage autocatalytique des intéines produit alors trois enzymes: deux intéines, I-Tfu-1 et I-Tfu-2, et une ADN polymerase.
On trouve des intéines également au sein d'autres protéines, telles l'ATPase vacuolaire chez S. cerevisiae (1), GyrA chez Mycobacterium leprae (2), Rec A chez Mycobacterium tuberculosis (3, 4).
Comme indiqué précédemment, les intéines sont définies comme des introns protéiques qui sont épissés, non pas au niveau de l'AR messager, mais au niveau d'une maturation proteique. Elles relèvent donc d'un seul gène traduit et transcrit en une seule étape, et constituent des sous-produits de la maturation de la protéine codée par ce gène (5) .
Les Inventeurs ont de plus mis en évidence chez les intéines de Thermococcus fumicolans et notamment chez I-Tfu-2, une activité d ' endonucléase de restriction thermostable . Un premier objet de la présente invention concerne donc une intéine de 1 ' archaebactérie Thermococcus fumicolans
L'objet de l' invention consite plus particulièrement en une intéine de 1 'archaebactérie
Thermococcus fumicolans . ayant une activité endonucléasique et/ou protéasique et ses dérivés fonctionnellement équivalents.
L'invention est en conséquence aussi relative : - à une intéine dont la séquence en acides aminés est identique ou équivalente à la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l et,
- à une protéine constituée ou comprenant la séquence d'acides aminés formant une intéine selon la présente invention.
L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une intéine de l'invention.
Une séquence d'ADN codant pour 1 ' intéine I-Tfu- 2 et la séquence en acides aminés correspondante sont représentés dans la séquence SEQ ID NO: 1 en annexe. I- Tfu-2 présente un poids moléculaire de 44 765 Da déduit de la séquence de 389 acides aminés de la séquence SEQ ID N0:1.
L'invention concerne autant ces intéines thermostables isolées et purifiées de la souche Thermococcus fumicolans que des intéines préparées par synthèse chimique ou encore par les méthodes du génie génétique.
Dans le cadre des méthodes de biologie moléculaire, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, un hôte cellulaire transformé par un tel vecteur, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des intéines de l'invention.
Un procédé de production d'une intéine conforme à 1 ' invention consiste à : - transférer une séquence d'acides nucléiques codant pour 1 ' intéine ou un vecteur contenant ladite séquence dans un hôte cellulaire,
- cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape précédente dans des conditions permettant la production de l' intéine,
- isoler et purifier par tout moyen approprié ladite intéine.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré. L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans le procédé précédent peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
Un procédé supplémentaire de production d'une intéine de 1 ' archa-bactérie Thermococcus fumicolans consiste à isoler et purifier par tout moyen approprié une intéine issue de 1 ' epissage catalytique de l 'ADN polymerase de Thermococcus fumicolans .
La présente invention concerne en outre l ' uti lisation de 1 ' intéine de l ' invention comme endonucléase .
La présente invention concerne également la séquence d ' acide nucléique reconnue et coupée par une intéine et notamment par I-Tfu-2 . Le site de restriction de I-Tfu-2 se compose de 21 paires de bases et est coupé de manière spéci f ique pour générer des extrémités protubérantes de 4 bases en 3 ' comme illustré ci-dessous 5'A C G C G G A T A C A G A C G G C T T T T 3'
3'T G C G C C T A T G T C T G C C G A A A A 5'
Le site de restriction, reconnu par l-Tfu-2 est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2.
Les produits de la digestion par I-Tfu-2 peuvent être religués par la T4 DNA ligase, ce qui permet l'utilisation de I-Tfu-2 en génie génétique. La présente invention concerne donc aussi un acide nucléique éventuellement recombinant comprenant le site de reconnaissance spécifique de I-Tfu-2. et l'utilisation de ladite séquence pour la préparation d'un vecteur destiné au clonage de gène. La taille exceptionnelle du site de reconnaissance de I-Tfu-2 fait que ce site est représenté statistiquement 1 fois toutes les 4400 milliards de paires de bases. L ' endonucléase I-Tfu-2 est donc particulièrement adaptée à l'étude des grands génomes. Elle devrait avoir au plus entre 0 et 1 site dans le génome humain ou des mammifères. Le clonage d'une banque d'ADN génomique par ce site de restriction, via des linkers I-Tfu-2 permettrait donc de cloner des fragments de n'importe quelle taille sans risquer que ces fragments ne comportent dans leur séquence interne la séquence du site de clonage. Ils ne seront donc pas recoupés par l'enzyme de clonage, même s'il s'agit de chromosomes artificiels. On peut donc imaginer des vecteurs de clonage spécifiquement conçus pour la réalisation de banques genomiques et de chromosomes artificiels grâce à la présence de la séquence de reconnaissance de I-Tfu-2 qui servirait de site spécifique de clonage.
La présente invention porte donc encore sur l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique constituant un vecteur, comportant le site de restriction de I-Tfu-2 pour la préparation d'une banque genomique ou de chromosomes artificiels.
De la même manière, l'introduction d'un site de reconnaissance I-Tfu-2 dans un génome devrait aboutir à une coupure unique dans ce génome, situation très favorable pour la transgénèse par exemple. Une fois cette séquence introduite, dans un génome par des méthodes génétiques, l'utilisation de I-Tfu-2, parallèlement à l'introduction du fragment d'ADN à transduire, provoquera une coupure unique dans le génome, ce qui stimulera fortement la recombinaison homologue à ce site spécifique, évitant une insertion au hasard de 1 ' ADN transformant .
Un objet supplémentaire de la présente invention consiste par conséquent à utiliser le site de restriction de I-Tfu-2 dans un procédé de transformation d'un hôte par un fragment polynucléotidique hétérologue. Un tel procédé consiste à : a) introduire dans le génome hôte par tout moyen approprié une séquence d'acide nucléique constituant un site de reconnaissance et de coupure d'une intéine selon l'invention, b) provoquer une coupure dans ledit génome à l'aide d'une intéine selon l'invention, c) introduire au niveau de la coupure un fragment polynucléotidique hétérologue dont les extrémités sont homologues à celles qui entourent le site de coupure.
II convient par ailleurs de remarquer que lorsque E. coli est transformée par un vecteur contenant la séquence nucléotidique codant pour l'ADN polymerase de Tfu et comprenant les gènes de I-Tfu-1 et I-Tfu-2, cette séquence est transcrite et traduite dans son intégralité. Puis, l' epissage autocatalytique des intéines produit trois enzymes : deux intéines et une ADN polymerase. Cela signifie que les intéines de Tfu n'ont pas de toxicité pour l'hôte, à la différence de l'une des intéines de Thermococcus l i toral i s (6), et en conséquence leur utilisation dans des kits utiles en génie génétique est aisée. Les intéines possèdent donc dans leur séquence toute l'information nécessaire à leur propre epissage proteique puisqu'elles s'épissent dans E. coli .
La présente invention concerne en outre l'utilisation de 1 ' intéine de l'invention comme protéase.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs et concernant le clonage, l'expression, la caractérisation et l'activité de la protéine thermostable de l'invention, et se référant aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 montre différents substrats d'ADN synthétiques pour I-Tfu-2. - la figure 2 montre le produit de la réaction de I-Tfu-2 sur des substrats d'ADN synthétiques. les figures 3-a à 3-f illustrent l'optimisation de l'activité endonucléase de I-Tfu-2. les figures 4-a et 4-b illustrent la détermination du site minimal de reconnaissance de I-Tfu- 2.
- la figure 5 montre la confirmation du site minimal de reconnaissance.
- la figure 6 montre l'abolition de l'activité "star" de I-Tfu-2 : 100 ng de chaque substrat ADN est incubé avec 1 μl de I-Tfu-2 dans 10 μl (volume final) de tampon 50 mM Tris acétate pH 8 , 75 mM Mg(OAc)2 et 10 mM NHOAc, pendant 10 minutes à 70°C.
- la figure 7 illustre l'utilisation de I-Tfu-2 pour la création d'une banque de chromosomes artificiels dans la levure . MATERIEL ET METHODES.
1 ) Clonage, production et purification de I-
Tfu-2 La séquence codant pour 1 ' intéine I-T u-2 a été amplifiée par PCR à partir de 100 ng d'ADN genomique de Thermococcus fumicolans . La réaction comprenait 10 μl de tampon 10X Vent Thermopol (NEB) , 10 μl de 2mM dNTP (Pharmacia) , 2 unités de Vent polymerase (NEB) et 2 μl de chacun des oligonucléotides à 20 pM (TFUInt2-5' : 5 ' ctgtacgcatatgagtgttacaggggacacag3 ' et TFUInt2-3': 5 ' agcgtcgacctagttgtgaacgagtattccg3 ' ) dans un volume final de 100 μl . L'amplification a été réalisée par une incubation de 2 min à 94°C puis 25 cycles (30 sec à 94°C, 30 sec à 48°C, 45 sec à 72°C) et enfin 5 min à 72°C.
Le produit d'amplification (1189 bp) comprend un site de restriction Nde I et un codon ATG insérés en phase à l'extrémité 5' du gène, et un codon TAG et un site de restriction Sal I à 1 ' extrémité 3 ' . Après digestion du produit d'amplification par Nde I et Sal I (Appligene Oncor) , le fragment a été inséré dans le vecteur pET26b (Novagen) coupé par les mêmes enzymes.
Pour l'expression, 50 ng du plasmide pET26b- Int2 ont servi à transformer des bactéries BL21 (DE3 )pLys S électrocompétentes. Les bactéries transformées sont cultivées dans 1 litre de milieu LB complémenté avec 50 mg/1 de Kanamycine jusqu'à une absorbance à 600 nm de 0,4. On ajoute alors 0 , 5 mM d'IPTG (Sigma) pour induire l'expression du gène d' intéine. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (5000g, 10 min) lorsque la culture atteint une absorbance de 2 à 600 nm. Le culot bactérien est resuspendu dans du tampon 20 mM phosphate de sodium pH 7,5 et soumis à 6 cycles de congélation- décongélation dans l'azote liquide. Le lysat est centrifugé pendant 15 minutes à 10.000g et le surnageant est récupéré (Fraction I) . La fraction I est soumise à une chromatographie sur colonne d'échange d'ions Q Fast Flow (Pharmacia). L'élution est réalisée par un gradient de Chlorure de Sodium de 0 à 1 M dans du phosphate de sodium 20 mM pH 7,5, avec un débit de 5 ml/minM L' intéine l-Tfu-2 est éluée à 0,7 M NaCl . Les fractions contenant 1 ' intéine sont dialysées contre un tampon 10 mM Tris-HCl, pH 7 , 5 ; 0,1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 50 mM NaCl ; 50% glycerol . De la sérum albumine bovine (BSA) est ajoutée pour atteindre une concentration finale de 200 μg/ml .
2) Séquencaqe des ADN.
Les séquences d'ADN ont été obtenues par la méthode de terminaison de chaine (7) en utilisant un système d'analyses automatiques d'ADN Applied Biosystems . Les deux brins des gènes codant pour 1 ' intéine ont été séquences en utilisant des amorces universelles localisées sur des vecteurs ainsi que des amorces internes . L'analyse de séquence a été réalisée avec le logiciel DNASTAR (Madison, Wis., USA) et le programme de Genetic Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Wis., USA) accessible en ligne sur INFOBIOGEN. Les recherches informatisées de similitude ont été réalisées avec le programme BLAST, les alignements multiples avec CLUSTAL V, et les arbres phylogénétiques ont été établis selon la méthode dite de "Neighbour-joining" (8) .
II - Résultats .
1) Caractérisation de l'activité endonucléase de I-Tfu-2. Pour tester l'activité endonucléase de I-Tfu-2 , un substrat de 43 bp comprenant les 22 paires de bases en
5' du site d'insertion de la séquence intéine dans le gène de la polymerase de Tfu et les 21 paires de bases en 3' de ce site (homing site) a été synthétisé chimiquement puis clone au site de restriction Xba I du vecteur pUC19. Cette construction est dénommée N22C21. De la même façon, lés "plasmides N7C13 , N8C13 ,
N8C12, N8C14, N9C13 et N12C10 ont été construits (Figure
D •
100 ng (lμl) du plasmide N22C21 purifié sur colonne Qiagen puis linéarisé par Seal (Appligene Oncor) sont utilisés par réaction, dans un tampon de réaction 50 mM Tris-acétate pH 8, 100 mM acétate d'ammonium, 75 mM acétate de magnésium, 10% de glycerol, dans un volume réactionnel de 10 ou 20 μl . Le mélange réactionnel est incubé à 70°C pendant 30 minutes. La figure 2 montre le produit de la réaction de
I-Tfu-2 sur le plasmide N22C21 synthétiques. Un gel d'agarose 1% en tampon Tris Borate-EDTA (TBE) met en évidence la coupure du substrat N22C21 (S) en produits (P) en présence de I-Tfu-2 (ligne +) , alors que le même substrat ADN n'est pas clivé en absence de I-Tfu-2 (ligne -) . Le produit de la réaction montre que l'ADN est clivé spécifiquement en deux fragments de 940 et 1790 bp.
Une analyse des conditions opérationnelles est montrée sur les figures 3-a à 3-f qui illustrent l'optimisation de l'activité endonucléase de I-Tfu-2 à partir de 100 ng de substrat ADN N22C21 qui sont incubés avec 1 μl de I-Tfu-2 purifiée, dans différentes conditions, dans un volume total de 10 μl .
• la figure 3-a montre l'effet de la concentration en Mg(OAc)2 sur la réaction qui est réalisée à 60°C pendant 30 min dans un tampon 50 mM Tris-acetate pH 8 contenant 25 mM de NH4OAC et des concentrations croissantes de Mg(OAc)2-
• la figure 3-b montre l'effet de la concentration en NH4OAC sur la réaction qui est réalisée à 60°C pendant 30 min dans un tampon 50 mM Tris-acetate pH 8 contenant 75 mM de Mg(0Ac)2 et des concentrations croissantes de NH4OAC .
• la figure 3-c montre l'effet du pH sur la réaction qui est réalisée à 60°C pendant 30 min, dans différents tampons 50 mM Tris-acetate dont le pH est ajusté entre 7 et 9 , et contenant 75 mM de Mg(OAc)2 et 100 mM de NH4OAC .
• la figure 3-d montre l'effet de la concentration en glycérol sur la réaction qui est réalisée à 60°C pendant 30 min dans un tampon 50 mM
Tris-acetate pH 8 contenant 75 M de Mg(OAc)2, 100 mM de NH4OAC et des concentrations croissantes de glycérol.
• la figure 3-e montre l'effet de la température sur la réaction qui est réalisée à différentes températures entre 60 et 80°C, pendant 30 minutes dans un tampon 50 mM Tris-acetate pH 8 contenant 75 mM de Mg(OAc)2 et 100 mM de NH4OAC .
• la figure 3-f montre la cinétique de coupure de la réaction qui est réalisée à 70°C dans un tampon 50 mM Tris-acétate pH 8 contenant 75 mM de Mg(OAc)2 et 100 mM de NH4OAC. Elle est arrêtée dans la glace après différents temps d'incubation puis les produits de coupure sont analysés sur gel .
Dans les conditions optimum, 80 % de la réaction a lieu au cours des 10 premières minutes. Pour obtenir une coupure complète, il faut rajouter de l'enzyme, ce qui laisse fortement soupçonner une inhibition de la réaction par les produits de coupure.
2) Détermination du site de coupure.
Le site de coupure a été déterminé par la méthode d'extension d'amorces (9) . Le plasmide N22C21 est séquence par la méthode de Sanger (1977) avec un Kit de séquençage à la T7 polymerase (Pharmacia) en utilisant des amorces universelles (directe et réverse) . Après la réaction de séquençage, les échantillons sont extraits au phénol-chloroforme, précipités et resuspendus dans 10 μl d'eau. 5 μl sont utilisés dans une réaction de coupure par I-Tfu-2 avec 2 μl d'enzyme, dans un volume réactionnel final de 10 μl, dont 1 μl de tampon de coupure 10X. Après une incubatfiôn de 10 minutes à 70°C, l'échantillon est extrait au phénol chloroforme, précipité à l'éthanol, séché puis repris dans 5 μl d'eau. Tous les échantillons (traités par I-Tfu-2 ou non) sont additionnés de 4 μl de solution stop puis déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6% (gel de séquençage) .
Après migration et révélation du gel par autoradiographie, la comparaison des pistes des échantillons traités par I-Tfu-2 avec les pistes des échantillons non traités permet de déterminer la séquence du site nécessaire à la coupure ainsi que la nature de la coupure comme montré sur les figures 4-a et 4-b :
• la figure 4-a montre la délimitation du site minimal de reconnaissance. L ' autoradiogramme du gel de séquençage montre la séquence obtenue avec les oligonucléotides SeqPuc (à gauche) et Ml3Rev (à droite) . Les réactions incubées (lignes +) et non incubées avec I-Tfu-2 (lignes -) ont été déposées côte à côte de façon à déterminer le site minimal de reconnaissance de l'enzyme. Le site de coupure pour chacun des deux brins d'ADN est repéré par une flèche. Dans l'encadré se trouve la séquence des nucléotides appartenant au site minimal .dans chaque direction. • la figure 4-b montre la séquence nucléotidique minimale nécessaire pour la reconnaissance et la coupure par I-Tfu-2. La flèche indique le "homing site" (HS) de 1 ' intéine dans le gène de la polymerase de Thermococcus fumicolans . Les pointillés délimitent le site de reconnaissance minimal.
3 ) Nature de la coupure. L'incubation de 100 ng de plasmide N22C21 avec 1 μl d'enzyme I-Tfu-2 donne un produit linéaire qui peut être recircularisé par incubation avec 20 unités de T4 DNA ligase (NEB) dans un tampon de ligation pendant 16 h à 16°C. Ceci prouve que l'enzyme I-Tfu-2 coupe l'ADN en générant des extrémités 5 'phosphate et 3 ' hydroxyle .
4) Confirmation du site de coupure.
Pour vérifier la taille de la séquence d'ADN nécessaire à la reconnaissance et à la coupure, nous avons utilisé une série de plasmides pUC19 contenant chacun un site de longueur donnée (Figure 1) : dans une réaction standard de coupure par I-Tfu-2, on voit que lorsque le site est plus court que N8C13 (cas de N8C12 , N7C13 et N12C10), l'efficacité de la coupure est fortement réduite, sans être toutefois totalement abolie (Figure 5). Cette activité "star" est totalement abolie dans un tampon ne contenant que 10 M d'acétate d'ammonium (au lieu de 100), tampon dans lequel l'enzyme I-Tfu-2 conserve 50% de son activité de coupure pour son site complet (Figure 6) .
III. EXEMPLES .
1 ) Préparation d'un chromosome artificiel comprenant au moins un site de reconnaissance et de coupure de I-Tfu-2.
Un vecteur de type pYAC2 est transformé de manière à porter un site de reconnaissance et de coupure I-Tfu-2 au sein du gène SUP4 par introduction de la séquence selon une procédure connue (10) . Ce vecteur est préparé par coupure par BamHI et dephosphorylation selon la procédure classiquement employée. Parallèlement, une banque genomique est préparée par hydrolyse ménagée d'un ADN genomique avec une enzyme de restriction générant des extrémités franches . Ces fragments sont séparés selon n
leur taille par centrifugation sur un gradient de saccharose puis ligués à de petits adaptateurs synthétiques (figure 7).
Le vecteur préalablement coupé par I-Tfu-2 est ensuite mélangé aux fragments "d' ADN et ligué par la T4 ADN ligase. A la fin de la réaction de ligation, le mélange est chauffé à 70°C pendant 10 minutes, en présence d'I-Tfu-2, ce qui permet de recouper tout vecteur s ' étant religué sur lui-même, sans affecter les vecteurs qui ont intégré un fragment de la banque. Ceci permet aussi d' inactiver la T4 ADN ligase. Après une étape de dessalage du mélange, celui-ci est utilisé pour transformer une souche de Saccharomyces cerevisiae ade2- ochre, ura3 , trpl et les clones autotrophes colorés en rouge sont sélectionnés sur milieu syntéthique sans uracile ni tryptophane.
Par rapport à la méthode décrite par Burke et al. (11), l'introduction, du site I-Tfu-2 permet d'améliorer considérablement l'efficacité de la construction des chromosomes artificiels, d'une part en améliorant l'étape de clonage qui se fait avec des extrémités protubérantes et non plus avec des exrémités à bout franc, et d'autre part en éliminant le bruit de fond provoqué par le vecteur religué sur lui-même. Cette amélioration est notamment sensible lorsque l'on veut faire des chromosomes artificiels de grande taille (>1000 Kpb) .
Alternativement, un vecteur modifié pYAC2 dans lequel les sites Notl situés de part et d'autre du gène SUP4o ont été remplacés par des sites I-Tfu-2 permet, après clonage d'une banque genomique dans ce vecteur par la procédure classique décrite par Burke et al, d'exciser et de purifier les fragments clones dans les chromosomes artificiels après coupure desdits chromosomes artificiels par l'enzyme I-Tfu-2, et ce quelle que soit la taille des fragments, ce qui n'est pas le cas avec l'enzyme Not I par exemple. 2 ) Construction d'un vecteur comprenant le site de reconnaissance et de coupure de I-Tfu-2.
Le vecteur N8C13 est un dérivé de pUC19 dans lequel le site de reconnaissance et de coupure de I-Tfu-2 a été introduit au niveau du site Smal. Lors du clonage d'un fragment d'ADN dans ce vecteur, au moyen de deux sites quelconques situés de part et d'autre du site de reconnaissance et de coupure I-Tfu-2, par exemple BamH I et Eco RI, l'étape de ligation est suivie d'une étape de chauffage à 70°C en présence de l'enzyme I-Tfu-2. De cette façon, la ligase est inactivée et tout vecteur n'ayant pas intégré le fragment à cloner est simultanément clivé au site I-Tfu-2, ce qui permet d'éliminer les "faux positifs" lors de l'étape de transformation .
Un autre vecteur dans lequel deux sites de reconnaissance et de coupure de I-Tfu-2 ont été introduits de part et d'autre de la cassette comprenant les sites multiples de clonage permet d'extraire les fragments hétérologues intacts quelle que soit leur taille ou leur séquence, après clonage des fragments dans ce vecteur par un ou plusieurs sites conventionnels de clonage, puis coupure du vecteur recombinant par I- Tfu-2.
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9. Wenzlau, J.M. , Saldanha, R.J. , Butow, R.A., Pelman, P. S. Cell, 1989, 56, 421-430.
10. Masson et al. , Proc . Natl. Acad.Sci., 1987, 84, 6815-6819.
11. Burke et al., Science, 1987, 236, 806
LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATION GENERALES :
(i) DEPOSANT : APPLIGENE - ONCOR
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Intéine d ' archaebactérie de l'Espèce Thermococcus fumicolans (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:l : X) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1177 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATION: linéaire [ii) TYPE DE MOLECULE: ADN !ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: séquence codante de 1 ' intéine de
Thermococcus fumicolans I-Tfu-2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO : 1 :
AGT GTT ACA GGG GAC ACA GAG GTA ACC ATC AGA AGA AAC GGC AGG ATT 48
Ser Val T r Gly Asp Thr Glu Val Thr Ile Arg Arg Asn Gly Arg Ile 1 5 10 15
GAG TTC GTT CCA ATC GAG AAA CTC TTT GAG CGC GTT GAT CAC CGT GTT 96
Glu Phe Val Pro Ile Glu Lys Leu Phe Glu Arg Val Asp His Arg Val 20 25 30
GGT GAG AAG GAG TAC TGC GTT CTT GGA GGG GTT GAG GCA CTG ACA CTC 144
Gly Glu Lys Glu Tyr Cys Val Leu Gly Gly Val Glu Ala Leu Thr Leu 35 40 45
GAC AAC AGG GGC AGG CTC GTG TGG AAG AAG GTT CCG TAC GTC ATG AGA 192
Asp Asn Arg Gly Arg Leu Val Trp Lys Lys Val Pro Tyr Val Met Arg 50 55 60
CAT AAA ACG GAC AAA AGA ATC TAT AGG GTA TGG TTC ACC AAC TCT TGG 240
His Lys Thr Asp Lys Arg Ile Tyr Arg Val Trp Phe Thr Asn Ser Trp 65 70 75 80
TAC CTT GAC GTG ACG GAG GAT CAC TCG CTA ATA GGC TAC CTG AAC ACA 28É Tyr Leu Asp Val Thr Glu Asp His Ser Leu Ile Gly Tyr Leu Asn Thr 85 90 95
AGC AAA GTC AAA CCC GGA AAG CCC TTG AAA GAG CGT CTC GTC GAG GTC 336 Ser Lys Val Lys Pro Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Leu Val Glu Val 100 105 110 AAG CCA GAA GAA TTG GGG GGT AAG GTC AAG TCT CTC ATT ACG CCC AAT 384 Lys Pro Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Lys Ser Leu Ile Thr Pro Asn 115 120 125
CGG CCA ATT GCC CGT ACC ATC AAG GCC AAC CCC ATT GCC GTC AAG CTC 432 Arg Pro Ile Ala Arg Thr Ile Lys Ala Asn Pro Ile Ala Val Lys Leu 130 135 140
TGG GAG TTA ATT GGC CTG CTG GTG GGA GAT GGC AAC TGG GGT GGA CAA 480 Trp Glu Leu Ile Gly Leu Leu Val Gly Asp Gly Asn Trp Gly Gly Gin 145 150 155 160
TCG AAC TGG GCC AAA TAC TAC GTT GGC CTC TCC TGT GGG CTG GAT AAA 52Ï Ser Asn Trp Ala Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Ser Cys Gly Leu Asp Lys 165 170 175
GCC GAA ATA GAG AGA AAA GTC CTG AAC CCT TTA AGA GAG GCA AGC GTC 576 Ala Glu Ile Glu Arg Lys Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Ala Ser Val 180 185 190
ATC TCC AAC TAC TAC GAC AAG AGC AAG AAG GGC GAC GTT TCC ATA CTC 624 Ile Ser Asn Tyr Tyr Asp Lys Ser Lys Lys Gly Asp Val Ser Ile Leu 195 200 205
TCC AAG TGG CTC GCC GGA TTC ATG GTC AAA TAC TTC AAA GAT GAA AAT 672 Ser Lys Trp Leu Ala Gly Phe Met Val Lys Tyr Phe Lys Asp Glu Asn 210 215 220
GGG AAC AAG GCC ATT CCC AGC TTC ATG TTC AAC CTT CCA AGG GAA TAC 720 Gly Asn Lys Ala Ile Pro Ser Phe Met Phe Asn Leu Pro Arg Glu Tyr 225 230 235 240
ATA GAG GCC TTT CTA CGG GGG CTG TTT TCA GCG GAC GGA ACG GTA AGC 768 Ile Glu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Phe Ser Ala Asp Gly Thr Val Ser 245 250 255
TTG CGT AGA GGA ATC CCA GAA ATT AGA CTG ACA AGC GTT AAC AGA GAG 816 Leu Arg Arg Gly Ile Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Val Asn Arg Glu 260 265 270
CTT AGT GAT GCC GTG AGA AAG TTG CTG TGG CTG GTT GGG GTC TCC AAC 864 Leu Ser Asp Ala Val Arg Lys Leu Leu Trp Leu Val Gly Val Ser Asn 275 280 285
TCA CTA TTC ACC GAA ACC AAG CCA AAC CGG TAC CTG GAG AAA GAA AGT 912 Ser Leu Phe Thr Glu Thr Lys Pro Asn Arg Tyr Leu Glu Lys Glu Ser 290 295 300 GGA ACG CAT TCG ATT CAC GTG AGG ATA AAG AAC AAG CAT CGC TTT GCC 960 Gly Thr His Ser Ile His Val Arg Ile Lys Asn Lys His Arg Phe Ala 305 310 315 320
GAT AGA ATA GGC TTT CTC ATA GAC AGA AAA TCC ACC AAA CTC TCC GAG 100. Asp Arg Ile Gly Phe Leu Ile Asp Arg Lys Ser Thr Lys Leu Ser Glu 325 330 335
AAC CTG GGG GGA CAT ACA AAC AAG AAG AGG GCT TAC AAA TAT GAT TTT 1056 Asn Leu Gly Gly His Thr Asn Lys Lys Arg Ala Tyr Lys Tyr Asp Phe 340 345 350
GAC TTG GTA TAC CCC AGA AAA ATC GAA GAG ATA ACC TAC GAC GGC TAC 1114 Asp Leu Val Tyr Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr 355 360 365
GTC TAT GAC ATC GAG GTT GAG GGA ACC CAC AGG TTC TTC GCC AAC GGA 1162 Val Tyr Asp Ile Glu Val Glu Gly Thr His Arg Phe Phe Ala Asn Gly 370 375 380
ATA CTC GTT CAC AAC 1177
Ile Leu Val His Asn
385
2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE: site de reconnaissance et de coupure de l' intéine I-Tfu-2 de THERMOCOCCUS fumicolans
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO: 2 : ACGCGGATAC AGACGGCTTT T 21

Claims

REVENDICATIONS
1. Intéine de 1 ' archaebactérie Thermococcus fumicolans .
2. Intéine selon la revendication 1 ayant une activité endonucleasique et/ou une activité protéasique et ses dérivés f onctionnellement équivalents.
3. Intéine selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:l.
4. Protéine constituée par ou comprenant la séquence d'acides aminés formant une intéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Séquence d'ADN codant pour une intéine ou une protéine selon les revendications 1 à 4.
6. Séquence d'ADN selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle répond à la séquence d'acides nucléiques donnée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1.
7. Vecteur comprenant une séquence d'ADN selon l'une des revendications 5 ou 6.
8. Hôte cellulaire transformé par un vecteur selon la revendication 7.
9. Procédé de production d'une intéine de
1 ' archaebactérie Thermococcus fumicolans , consistant à : a) transférer une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 5 ou 6 ou un vecteur selon la revendication 7 pour obtenir un hôte cellulaire selon la revendication 8, b) cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape a) dans des conditions permettant la production de 1 ' intéine désirée, c) isoler et purifier par tout moyen approprié 1 ' intéine produite à l'étape b) .
10. Procédé de production d'une intéine de 1 ' archaebactérie Thermococcus fumicolans consistant à isoler et purifier par tout moyen approprié une intéine issue de l' epissage catalytique de l'ADN polymerase de
Thermococcus fumicolans .
11. Utilisation d'une intéine ou d'une protéine selon les revendications 1 à 4 comme endonucléase .
12. Utilisation d'une intéine ou d'une protéine selon les revendications 1 à 4 comme protéase .
13. Séquence nucléotidique constituant un site de reconnaissance et de coupure d'une intéine ou d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle répond à la séquence donnée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2.
14. Acide nucléique, éventuellement recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs séquences nucleotidiques selon la revendication 13.
15. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 13 pour la préparation d'un vecteur destiné au clonage de gènes.
16. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 14 pour la préparation d'une banque genomique ou d'un chromosome artificiel.
17. Procédé de transformation d'un hôte par un fragment polynucléotidique hétérologue consistant à : a) introduire dans le génome hôte une séquence nucléotidique selon la revendication 13, b) provoquer une coupure dans ledit génome à l'aide d'une intéine selon l'une des revendications 1 à
4, c) introduire au niveau de la coupure un f ragment po lynuc léo tidique hé téro logue dont l es extrémités sont homologues à celles qui entourent le site de coupure .
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