JP2003169678A - 新規ｄｎａ分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 損傷によって生じる特異的なDNA構造を認識
して作用することにより、DNA修復過程に貢献しうるタ
ンパク質を提供する。 【解決手段】 本発明の課題は、例えば、１）古細菌由
来の耐熱性のタンパク質、又は２）該タンパク質のアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
であって、ニックあるいはギャップを含む二本鎖ＤＮＡ
のうち、ニックあるいはギャップを含む鎖の、ニックあ
るいはギャップ領域から５'末端側に３〜６塩基上流部
分を、特異的に切断するエンドヌクレアーゼ活性を有す
るタンパク質により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子治療、遺伝子
操作用試薬として有用な、DNA 分解酵素及び、遺伝子工
学的手法を用いた該酵素の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子である二本鎖DNAを切断する酵素
には、塩基配列を特異的に認識して切断する酵素と立体
構造を認識して切断する酵素が知られている。DNA分解
酵素として最も頻繁に用いられているのは制限酵素と呼
ばれるもので、一般に４〜８塩基を認識して切断する。
制限酵素は、遺伝子操作実験にとって必須の役割を果た
してきており、日常の遺伝子操作実験に用いられて、分
子医学、分子生物学、生化学の発展に多大の貢献を果た
してきた。制限酵素以外に、二本鎖DNA の特異的な塩基
配列を認識して切断する酵素としては、DNA組換え過程
に関わる酵素が知られており、ホーミングエンドヌクレ
アーゼと呼ばれる一群の酵素がある。一般に、この範疇
に属する酵素は２０塩基以上もの長い配列を認識に必要
とするが、それぞれの酵素にとって認識配列は特異的で
あるから、部位特異的DNA切断の目的で利用することが
できる。このように、DNAの配列を認識して切断する酵
素については、これまでに多くの実用例があるが、一
方、DNAの特異的な立体構造を認識して切断する酵素に
ついては、大腸菌のRuvCタンパク質などのような四分岐
構造DNAを特異的に認識切断するホリディジャンクショ
ンリゾルベースなど、僅かの研究例があるのみで、それ
らの酵素についても基質特異性などの生化学的性質は、
ある程度明らかになっているものの、実際に実用化され
たものはない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】DNAから始まる遺伝情
報伝達系は、様々な現象が規則正しく正確におこらなけ
れば、生命にとって致命的となる。中でもDNA複製時
に、塩基配列に間違いが入らないように、生体内では多
くの修復系が協調して働いている。しかしながら、これ
らの修復系で働いているタンパク質因子について、人類
の知識は乏しい。二本鎖DNAは絶えず外的要因により損
傷の危機にさらされている。例えば、二本鎖DNAの片方
のリン酸ジエステル結合が切断されるニック構造はしば
しば生じ、それらは素早く修復される必要がある。また
特に、複製と共役した修復系については、最近ようやく
その重要性が広く認識されてきたばかりで、その分子機
構については、今後の研究成果を待たなければならな
い。二本鎖DNAが解かれながら、各々の鎖が鋳型となっ
て、それらのコピーを合成していくいわゆる半保存的複
製機構において、まさに複製が行なわれている部分はち
ょうどフォークに似た形をしているので、複製フォーク
と呼ばれる。複製されるDNAにニックが入っていると、
複製フォークの進行が止まり、合成されて生じる二本鎖
は切り離され、組み換え修復系に入っていく。また、塩
基修飾などの損傷が入っている時も、その部位で複製フ
ォークの進行が停止し、何らかの修復系が働かなければ
ならない。その場合、一旦DNA切断によってフォーク構
造を解消し、組換え修復によって正常なフォークを再構
築するという機構が考えられる。このように遺伝子上に
生じたニックやギャップは、生命維持に重大な障害を起
すが、このような構造を特異的に認識し、修復する酵素
についてはほとんど知られていない。本発明の目的は、
損傷によって生じる特異的なDNA構造を認識して作用す
ることにより、DNA修復過程に貢献しうるタンパク質を
同定し、遺伝子治療、遺伝子操作実験などに実用的に応
用することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、超好熱性古細菌 ピロコッカス フリオサス（Py
rococcus furiosus） から新規エンドヌクレアーゼ活性
を発見し、該酵素をコードする遺伝子をクローニングす
ることに成功した。さらに、この遺伝子を導入した形質
転換体を作製し、該DNA分解酵素を大量生産することに
成功した。

【０００５】本発明はニックあるいはギャップを含む二
本鎖ＤＮＡを特異的に認識し、ニックあるいはギャップ
を含むＤＮＡ鎖の５’側に位置するほうの、ニックある
いはギャップ部位から５'末端側に３〜６塩基上流部分
を切断する新規エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパ
ク質に関する（図１）。さらに、二本鎖ＤＮＡ上のニッ
クあるいはギャップ部分の５’側または３’側に一本鎖
または二本鎖が飛び出した、いわゆるフラップ構造をも
認識し、同様に切断する酵素に関する（図１）。フラッ
プ部分が二本鎖である場合には、DNAが複製する場合に
とりうるフォーク構造に匹敵し、該酵素はDNAの複製フ
ォークを特異的に認識して切断する活性を有する酵素と
いうことも言える。

【０００６】さらに該酵素は切断活性以外にＤＮＡ二本
鎖構造を解くヘリカーゼ活性を有している。さらに該酵
素は一態様によれば超好熱性古細菌由来であり、耐熱性
の特徴を持ち、少なくとも８０℃で２０分置いても、活
性を有している。なお本発明で耐熱性とは５０℃で２０
分おいても活性を保持することをいう。また本発明は、
該エンドヌクレアーゼの製造方法に関し、該酵素タンパ
ク質をコードする遺伝子を発現用ベクターに組込み、そ
の組換えプラスミドを保有する形質転換体を培養して、
該培養物から、該DNA分解酵素を単離することを特徴と
する。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明者らは古細菌より、DNA組換え過程
における一連のＤＮＡ立体構造特異的なＤＮＡ分解酵素
を探索しており、すでにDNA組換え過程における中間体
であるホリディ構造（十字架構造）DNAを特異的に認識
して切断するリゾルベースを新たに見出しHjcエンドヌ
クレアーゼと命名し、特許出願している（特願平10-333
925）。次にニックあるいはギャップ構造を特異的に認
識し切断するヌクレアーゼ活性をP. furiosusの中から
探索した。その結果ニックを含んだ２本鎖DNAを認識し
て、ニックの入ったほうの鎖を切断する活性を有する新
規エンドヌクレアーゼを見出し鋭意研究を続けた。この
酵素タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、
そこから配列番号１に示すアミノ酸配列（７６３アミノ
酸）を推定した。また対応する遺伝子配列は配列表の配
列番号２に示した。得られたアミノ酸配列についてデー
タベース検索をした結果、アミノ末端側の３分の２（１
−５４６）には一般的にヘリカーゼに保存されているモ
チーフが含まれていた。またカルボキシ末端側（５４７
−７６３）には、高等真核細胞にみられる除去修復関連
タンパク質のひとつであるXPFヌクレアーゼを含むスー
パーファミリーと類似した配列が見つかった。そこで目
的のタンパク質と共に、これらのドメインをそれぞれ別
々に産生させるために、対応する遺伝子部分を発現ベク
ターに組込み、大腸菌での発現を試みた。N-末のヘリカ
ーゼドメイン、C-末のエンドヌクレアーゼドメインをそ
れぞれN546, C547と命名した。C547に対応する遺伝子
は、多大の努力にも関わらず、発現ベクターへの組込み
が成功せず、得られたクローンには必ず決まった位置に
変異が入っていた。その結果６００番目のフェニルアラ
ニンがロイシンに換わってしまうのでC547'と呼ぶこと
にした。それぞれ産生されたタンパク質は種々のクロマ
トグラフィーにより、高純度に精製した。

【０００８】精製されたタンパク質を用いて、基質特異
性を鋭意分析した結果、ニックあるいはギャップを含む
二本鎖DNAの他に、ニックあるいはギャップの位置から
一本鎖が飛び出したフラップ構造をとるDNAをも同様に
認識切断することがわかった（図１）。切断位置を決定
した結果、いずれの基質もニックの入ったほうの鎖の、
ニックあるいはギャップの位置から３〜６ヌクレオチド
５’側を切断することが分った（図１）。フラップの部
分が二本鎖になった場合も同様に認識された（図１）。
この場合は正に、複製フォーク構造に匹敵するため、該
酵素が生理的には、複製フォークに関連した、機能を担
っているということが予想された。そこで、種々の人工
的なフォークを合成して、切断反応を行なってみた。そ
の結果、図２に示すように、該酵素は複製フォークの連
続合成鎖（leading synthesis）の鋳型を、分岐点近傍
で切断する活性が確認された（図２）。全長を有するタ
ンパク質と、エンドヌクレアーゼドメインのみのC547'
では、ほぼ同様の切断活性を有していたが（８ヌクレオ
チドのギャップを含むフォークの場合のみC547'では殆
ど切れない）、切断位置の選択性が一ヌクレオチド分ず
れる傾向にある（図１、２）。N546にはこのような構造
特異的DNA切断活性は全く認められなかった。

【０００９】該酵素の基質特異性から、本発明者らは、
該酵素の役割として、損傷のため複製フォークの進行が
停止した場合を考え、図３に示すような、相同組換え機
構に結びつく修復モデルを提唱した。該酵素の基質特異
性を考えると、DNA複製時に鋳型DNA上の損傷によってDN
A合成が進めず、複製フォークが停止した場合、特に連
続鎖合成の鋳型を選択的に切断して、組換え修復機構へ
の引き金をひく働きをする。この時にヘリカーゼは、DN
Aをエンドヌクレアーゼにとって適した構造に導くため
に重要な働きを担う。該酵素が連続鎖合成の鋳型を切断
するためには、不連続合成鎖のほうは分岐点のところま
で２本鎖になっている場合が望ましく、Aの場合のよう
に不連続合成のほうが先行した場合は、そのままフォー
クの分岐点を切断すればよいが、Bの場合のように不連
続合成が遅れた場合は、連続合成鎖の２本鎖の端を解い
て、不連続合成鎖が２本鎖になるまでフォークを退行さ
せる必要がある。この働きを該酵素のヘリカーゼ活性が
担えば、極めて効率が良い。またヘリカーゼ活性はCの
場合のように、両新生鎖を解いて、それらがアニールす
る機会をつくり、結果的にフォークの退行による４分岐
構造を形成させる可能性も考えられる。４分岐構造は該
酵素の基質としては適さないことを本発明者らは確認し
ているので、その場合には、該酵素ではなくHjcが働く
と考えられる。実際に４分岐構造をとりうるような合成
フォーク構造DNAを用いてモデル実験をしてみると、該
酵素、Hjc共に切断活性が検出されるが、切断位置が全
く異なり（図４A）、両者が異なるDNA構造を認識してい
ることが伺える。則ち、図４B）に示したように、基質D
NAはフォーク型と４分岐の両方を取り得、前者を該酵素
が、後者をHjcが認識して切断していると考えると実験
結果と良く一致する。次いで、ヘリカーゼ活性に必要と
されるATPアーゼ活性について調べた結果、N546の有す
るATPアーゼ活性がDNA依存的であり、DNAの非存在下ま
たは一本鎖DNA存在下では殆ど検出できない活性が、二
本鎖DNA存在下ではっきり検出されるようになり（kcat=
23.8）、フォーク構造DNA存在下で驚くべき促進が見ら
れた（移動しないフォーク；kcat=91.0, ８ヌクレオチ
ドのギャップを含むフォーク；kcat=192.2）。この結果
は、N546が通常の複製フォークに特に強い親和性を有し
ている証拠であり、Ｎ５４６のヘリカーゼ活性および図
３のモデルを間接的に指示する結果であると考えられ
る。

【００１０】以上のように、該酵素は複製フォーク進行
阻害に伴った修復にとって極めて優れた活性を有する新
規タンパク質と考えられ、このような新規酵素は、修復
系傷害による遺伝子疾患のために治療や、また極めて稀
な構造特異的な基質特異性を有する酵素であることか
ら、新たな遺伝子操作用試薬としての用途が期待でき
る。この重要性を考え、本発明者らは該酵素を複製フォ
ークに特異的に働くヘリカーゼ-エンドヌクレアーゼと
して、Hef (helicase-associated endonuclease forfor
k-structured DNA) と命名した。また、Hefがニックを
含む二本鎖DNA構造を特異的に認識することから、該酵
素をDNA鎖上のニック部分の検出用試薬として利用でき
ることなど、構造特異的な新規DNA切断酵素としての有
用性を考え出願に至った。

【００１１】本発明はまたHef遺伝子に関し、 １）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又
は ２）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列を有するタンパク質であって、ニックあるいはギャッ
プを含む二本鎖ＤＮＡのうち、ニックあるいはギャップ
を含む鎖の、ニックあるいはギャップ領域から５'末端
側に３〜６塩基上流部分を、特異的に切断するエンドヌ
クレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
に関する。該遺伝子は、好ましくは好熱性細菌に由来す
るものであり、例えば配列番号２の塩基配列を有する。

【００１２】本発明はさらに、配列番号２に記載の遺伝
子とストリンジェントな条件下にハイブリダイズ可能
で、かつニックあるいはギャップを含む二本鎖ＤＮＡの
うち、ニックあるいはギャップを含む鎖の、ニックある
いはギャップ領域から５'末端側に３〜６塩基上流部分
を、特異的に切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子に関する。ストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズ可能か否かは以下のよう
にして調べることができる。先ず、ナイロン膜にハイブ
リダイズの対象となるＤＮＡを固定化する。次にこの膜
を、６×ＳＳＣ、０.０１Ｍ ＥＤＴＡ、５×Ｄenhardt'
s溶液、０.５％ＳＤＳ、１００μｇ／ml変性サケＤＮＡ
を含むプレハイブリダイゼーション溶液に６８℃で２時
間浸漬する。上記組成のプレハイブリダイゼーション溶
液に、標識した配列番号２に記載の遺伝子または該遺伝
子の転写産物である対応するＲＮＡを加えた溶液（ハイ
ブリダイゼーション溶液）を調製する。この溶液に上で
得られたナイロン膜を浸漬し、６８℃で３〜１６時間ハ
イブリダイズさせる。その後、２×ＳＳＣ、０.５％Ｓ
ＤＳを含む溶液中に一度浸して洗浄し、さらに２×ＳＳ
Ｃ、０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で約１５分洗浄する。
そしてさらに０.５％または０.１％ＳＤＳ溶液中で６８
℃で２時間洗浄する。その後標識に応じ適宜な手段で検
出操作を行う。

【００１３】本発明のタンパク質は、周知のＤＮＡ組換
え技術（例えばモレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル（Molecular Cloning A Laborato
ry Manual）第２版、第１５章（１９８９）、コールド
スプリングハーバーラボラトリー発行、マニアティス他
著参照）を用いて、例えば以下のような手順で製造する
ことができる。 １）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子（例えば配列番号２のＤＮＡ）
を調製する。 ２）該遺伝子を適当なベクターに挿入し、発現ベクター
を作製する。 ３）該発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。 ４）形質転換された宿主細胞を培養する。 ５）該培養物から本発明のタンパク質を単離する。

【００１４】Hefをコードする遺伝子を大腸菌での発現
ベクターpTV118N（宝酒造）に組み込んだプラスミドpHE
F01を大腸菌JM109 に導入して得られた組み換え体は E
scherichia coli JM109/pHEF01と命名、表示され、独立
行政法人産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１８６１６として寄託されている。

【００１５】

【実施例】実施例１ （１）ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAの調製 P. furiosus DSM3638 はDeutsche Sammlung von Mikro
organismen und Zelkulturen GmbHより入手し、文献
（ヌクレイック アシッド リサーチ Nucleic Acids R
esearch, 第２１巻、２５９ー２６５ページ）の方法に
従って培養した。５００mlの培養液から約1.2gの菌体を
得た。これを緩衝液 L（10 mM トリスー塩酸（pH8.0),
1 mM EDTA, 100 mM NaCl) 10 mlに懸濁し、10% SDSを1m
l加えた。撹拌の後、プロテイナーゼK（20 mg/ml)を50
ml 加えて、55℃で60 分静置した。その後反応液を順次
フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロ
ロホルム抽出した後、エタノールを加えてDNAを不溶化
した。回収したDNAを1 mlのTE液（10 mM トリスー塩酸,
(pH8.0), 1 mM EDTA) に溶解し、0.75 mgのRNase Aを
加えて37℃で60 分反応させた。その後反応液をもう一
度フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、ク
ロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりDNAを回
収した。0.75 mgのDNAが得られた。

【００１６】（２）コスミドライブラリーの作製 ストラタジーン社製 SuperCos1 Cosmid Vector kitを用
いて、使用説明書に従ってライブラリーを作製した。実
施例（１）で得られたDNAを制限酵素Sau3AIで部分分解
した時に、30-42キロ塩基対の断片が生じるように反応
条件を決めた。切断後のDNA断片をコスミドベクターのB
amHI部位に挿入して、組換えコスミドのライブラリーと
した。大腸菌を形質転換して得られたコロニーから適当
に１０数個を選んで、コスミドを回収し、予想される大
きさのDNA断片が挿入されていることを確認した。

【００１７】（３）ライブラリーより粗抽出液の調製 （２）で作製した、組換えコスミドによる形質転換体か
ら、約５００個を選んで、それぞれを２mlのLB培地で培
養し、集菌後バッファーA(10 mM トリスー 塩酸(pH 8.
0), 2 mM 2-メルカプトエタノール, 10 % グリセロー
ル）500 mlに懸濁後、超音波処理により破砕した。得ら
れた粗抽出液を85℃10 分の熱処理して、大部分の大腸
菌由来のタンパク質を変性させ、遠心分離により上清を
集め、耐熱性プロテインライブラリーとした。

【００１８】実施例２ （１）中心にニックを持つ二本鎖DNA、中心に一本鎖フ
ラップを持つ二本鎖DNA、様々なフォーク構造DNA、中心
部の移動するホリディ構造DNAの形成反応 切断部位、及び基質特異性を検討するため、配列番号3
から11に示すDNAを各々100 pmolを用いてポリヌクレオ
チドキナーゼと[γ-³²P]ATPで5'末端リン酸化した後、3
0 pmolを同量のリン酸化していないDNAと混合し、65
℃、30分間の熱処理に続いて15時間かけて自然冷却で徐
々に室温になるまで温度を下げて、各々の構造を持つDN
Aを形成させた。各々の構造を形成するためのDNAの組み
合わせは以下である。中心にニックを持つ二本鎖DNA
は、配列番号3、4、5、中心の3'末端にフラップを持つ
二本鎖DNAは、配列番号4、5、6、中心の5'末端にフラッ
プを持つ二本鎖DNAは、配列番号3、5、7、中心の3'、5'
両末端にフラップを持つ二本鎖DNAは、配列番号5、6、
7、中心が移動しないフォーク構造は、配列番号、4、
5、6、8、中心が移動するフォーク構造は、配列番号、
4、5、6、9、中心が移動せず、かつ8塩基ギャップのあ
るフォーク構造は、配列番号、4、6、9、10、中心が移
動し、かつホリディ構造も形成できるフォーク構造は、
配列番号、5、6、9、11。中心部が移動するホリディ構
造DNAは、配列番号、12、13、14、15 というように合
成デオキシオリゴヌクレオチドを混合してそれぞれの構
造を形成させた。

【００１９】（２）耐熱性プロティンライブラリーから
Hjcの切断反応を促進する因子の探索 反応溶液として、10 mMトリス-塩酸(pH8.8), 10 mM MgC
l₂, 1 mM ジチオスレイトール, 100 mM KCl, アニール
後の10 nM中心部が移動する³²P標識DNAを用意し、この
溶液14 μlに対して2 nM Hjcを1 μlと耐熱性プロティ
ンライブラリーの各抽出液より1 μlを5クローンずつ、
則ち5 μlを1反応分として加え、60 ℃で30分間反応さ
せた後にフェノール/クロロホルムで反応を停止させ
た。その上清10 μlに2.5 μlのローディングバッファ
ー[0.025％キシレンシアノール、0.025％ブロモフェノ
ールブルー、40％(w/v)蔗糖]を加え、5 μlをTAEバッフ
ァー[40 mMトリス-酢酸(pH8.0), 1 mMエチレンジアミン
四酢酸ナトリウム]中で6％アクリルアミドゲル電気泳動
し、アクリルアミドゲルを乾燥させた後、オートラジオ
グラフィー行い切断バンドの有無を検出した。この結
果、7クローンでHjcの切断活性を促進する活性が発見さ
れた。

【００２０】実施例3 （１）目的遺伝子の同定と塩基配列決定 実施例2の（2）で得られたクローン中、No.317からコス
ミドを単離し、BamHIとNotIで分解した後、pUC118ベク
ターにサブクローンした。得られたクローンの塩基配列
の一部を決定し、その配列を用いて、ピロコッカス フ
リオサス ゲノムデータベースを検索し、一致する配列
を含む80 kbのDNA配列を手に入れた。この配列中に存在
するORFをMac Vector (Oxford Molecular Ltd)を用いて
検索し、一まとまりになっている構造遺伝子群に対して
PCRプライマーを10セット作成した。これらのプライマ
ーを用いてPCR法を行って増幅された遺伝子断片をpGEM-
Teasyベクター(Promega社)にクローン化し、得られた各
クローンを実施例の2の（2）と同様にHjcの切断活性を
促進する活性を調べると、約4 kbの遺伝子断片が組み込
まれたクローンが活性を示すことが判明した。この遺伝
子断片には３つのORFが存在するため、制限酵素部位を
利用した欠損変異体を作製し、得られた欠損変異体を上
記と同様にHjcの切断活性を促進する活性を調べ、活性
に由来するORFを1つに限定した。

【００２１】（２）目的遺伝子の多量発現系の構築 実施例3の（1）で得られた塩基配列中で、Hjcの切断活
性を促進する活性に由来すると思われるORFの両端に相
当する塩基配列を基に、配列番号16、17に示すPCRプラ
イマーを作製し、各々フォワードプライマー、リバース
プライマー配列の中にNcoI (CCATGG), SalI (GTCGAC)配
列を組み入れ、NcoI配列中のATGを翻訳の開始コドンと
して利用できるように調節した。PCR法により増幅した
遺伝子をpTV118Nベクターに組み込んで、Hjcの切断活性
を促進する活性を有する酵素を産生するプラスミドを
得、pHEF01と命名した。同様に、N末端のみとC末端のみ
の変異体を産生する酵素を作製するため、配列番号16、
18と配列番号17、19に示すPCRプライマーを各々作製
し、PCR法により遺伝子を増幅し、pET21dとpET21aに各
々組み込んだ。これらの変異タンパク質を産生するプラ
スミドを、pN546, pC547'と命名した。

【００２２】（３）目的酵素タンパク質の精製 実施例3の（2）で得られたEschrichia coli JM109/pHEF
01をアンピシリンが100 μg/mlの濃度で存在するLB培地
[トリプトン10 g/リットル、酵母エキス5 g/リットル、
NaCl 5g/リットル、pH7.2] 2リットルに15g/リットルに
なるように寒天を加えて、245 x 245mmプレート32枚の
上で37 ℃で1日、培養した。プレートから集菌後、菌体
を150 mlのバッファーB [50 mMトリス-塩酸(pH8.0), 0.
1 mM エチレンジアミン四酢酸ナトリウム, 0.5 mM ジチ
オスレイトール, 0.2 M NaCl,プロテアーゼインヒビタ
ーカクテル錠（コンプリート、ロッシュ社）] に懸濁
し、フレンチプレスにかけた。遠心分離により粗抽出液
を上清として回収し、これを80 ℃、20分間の熱処理を
行った。遠心分離により熱耐性分画を上清として回収
し、この溶液をバッファーC [50 mMトリス-塩酸(pH8.
0), 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸ナトリウム, 0.5 m
M ジチオスレイトール] で平衡化したHiTrap heparinカ
ラム（アマシャム・ファルマシア社）に供し、ACTAシス
テム（アマシャム・ファルマシア社）を用いてクロマト
グラフィーを行った。展開は0.2 M-0.8MのNaCl直線濃度
勾配により行った。目的のタンパク質は、0.5-0.6 M Na
Cl のところで溶出した。この画分12.5 mlを25 mlのバ
ッファーCで希釈した後、MonoS HR 5/5 カラム（アマシ
ャム・ファルマシア社）に供した。ACTAシステムを用い
て、0.1 M-0.5 MのNaCl直線濃度勾配により展開した結
果、目的のタンパク質は0.36-0.44 M NaCl のところで
溶出した。この画分をバッファーCに0.3 M NaClを加え
たバッファーで平衡化したSuperdex200カラム（アマシ
ャム・ファルマシア社）に供し、SMARTシステム（アマ
シャム・ファルマシア社）を用いてクロマトグラフィー
を行った。こうして得られた画分を、Hefエンドヌクレ
アーゼと精製標品とした。

【００２３】実施例3の（2）で得られたE. coli BL21 c
odonPlus^TM (DE3)-RIL/pN546とBL21codonPlus^TM (DE3)-
RIL/pC547'を各々アンピシリンが100μg/mlの濃度で存
在するLB培地500 ml中で培養した。培養液の濁度が0.3
A₆₀₀に達した時、誘導物質であるイソプロピルーβ−D
−チオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に3時間培養を
行った。集菌後、菌体を各々バッファーBに懸濁し、各
々を超音波破砕機にかけた。遠心分離により粗抽出液を
上清として回収し、これを80 ℃、20分間の熱処理を行
った。遠心分離により熱耐性分画を上清として回収し、
DNAを除去するために、氷中でこれに各々0.1％になるよ
うにポリエチレンイミンを加えた。遠心分離後、両タン
パク質を可溶性分画として回収し、これに各々80％飽和
になるように硫酸アンモニウムを加えた。遠心分離後、
両タンパク質共に、沈澱の画分として得られた。N546
は、バッファーCに2M 硫酸アンモニウムを加えたもので
可溶化した後、HiTrap Phenyl HPカラム（アマシャム・
ファルマシア社）に供し、AKTAシステムを用いてクロマ
トグラフィーを行った。展開は2M-0Mの硫酸アンモニウ
ム直線濃度勾配により行った。N546は0.6 M-0.25 Mの硫
酸アンモニウムで溶出した。溶出画分をバッファーD [5
0 mMトリス-塩酸(pH7.5), 0.1 mM エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム, 0.5 mM ジチオスレイトール] にて透
析した後、HiTrap SPカラム（アマシャム・ファルマシ
ア社）に供した。N546は、0.2 M-0.4 MのNaClで溶出し
た。この画分を4倍量のバッファーCで希釈した後、HiTr
ap heparinカラムに供し、0.55 M-0.78 MのNaClでN546
は溶出した。C547'は、沈澱をバッファーCに1 M 硫酸ア
ンモニウムを加えたもので可溶化した後、HiTrap Pheny
l FF(Low) カラム（アマシャム・ファルマシア社）に供
し、AKTAシステムを用いてクロマトグラフィーを行っ
た。展開は1 M-0 Mの硫酸アンモニウム直線濃度勾配に
より行った。C547'は0.8 M-0.05 Mの硫酸アンモニウム
で溶出した。溶出画分をバッファーDにて透析した後、H
iTrap SPカラムに供し、C547'は0.17 M-0.31 MのNaClで
溶出した。

【００２４】実施例4 （１）基質特異性 本発明の、HefエンドヌクレアーゼのDNA切断における基
質特異性を調べるために、実施例2の（1）で作成した様
々な構造のDNAを基質として用いた。実施例2の（2）で
用いた反応溶液に、アニール後の基質DNAを10 nM、実施
例3の（3）で得られたHefエンドヌクレアーゼ、あるい
はC547'を20 nMになるように加え、60 ℃で30分間の反
応を行った。反応液と同じ容量のシーケンス用ローディ
ングバッファー[98％ホルムアミド、10 mMエチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム, 0.025％キシレンシアノール]を
加えて反応を停止させた後、95 ℃で2分間熱処理し、8M
尿素を含む変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し
た。アクリルアミドゲルを乾燥させた後にオートラジオ
グラフィーを行い、切断バンドの有無を検出した。その
結果、中心にニックを持つ二本鎖DNA、中心の3'末端に
フラップを持つ二本鎖DNA、中心の5'末端にフラップを
持つ二本鎖DNA、中心の3'、5'両末端にフラップを持つ
二本鎖DNA、中心が移動しないフォーク構造、中心が移
動するフォーク構造は中心が移動し、かつホリディ構造
も形成できるフォーク構造をHefエンドヌクレアーゼ、C
547'共に切断することが明らかになった（図１、２）。
しかし中心が移動せず、かつ8塩基ギャップのあるフォ
ーク構造は、Hefエンドヌクレアーゼのみ切断すること
ができるが、その活性は非常に弱いものであった (図
２)。

【００２５】（２）切断部位の決定 本発明の、Hefエンドヌクレアーゼの基質DNA内の切断部
位を調べるために、実施例2の（1）で作成した様々な構
造のDNAを基質として用いて、実施例4の（1）と同様に
反応、検出した。マーカーとして、同じ末端標識プライ
マーからマキサムギルバート法によりGAラダーを作成
し、隣のレーンで電気泳動を行って両者のバンドサイズ
を比較し、切断部位を決定した。その結果は、図1、2、
４中の基質DNA中に矢印で示した。Hefによる切断反応で
は、各基質について複数の位置で切断が観察されるが、
主としてニックあるいは分岐の位置から3〜4塩基5'末端
側を切断している事が示された。

【００２６】

【配列表】 <110> Sequence Listing <120> Biomolecular Engineering Research Institute <130> 181437 <160> 19 <210> 1 <211> 763 <212> PRT <213> Pyrococcus Furiosus <400> 1 Met Leu Leu Arg Arg Asp Leu Ile Gln Pro Arg Ile Tyr Gln Glu 1 5 10 15 Val Ile Tyr Ala Lys Cys Lys Glu Thr Asn Cys Leu Ile Val Leu 20 25 30 Pro Thr Gly Leu Gly Lys Thr Leu Ile Ala Met Met Ile Ala Glu 35 40 45 Tyr Arg Leu Thr Lys Tyr Gly Gly Lys Val Leu Met Leu Ala Pro 50 55 60 Thr Lys Pro Leu Val Leu Gln His Ala Glu Ser Phe Arg Arg Leu 65 70 75 Phe Asn Leu Pro Pro Glu Lys Ile Val Ala Leu Thr Gly Glu Lys 80 85 90 Ser Pro Glu Glu Arg Ser Lys Ala Trp Ala Arg Ala Lys Val Ile 95 100 105 Val Ala Thr Pro Gln Thr Ile Glu Asn Asp Leu Leu Ala Gly Arg 110 115 120 Ile Ser Leu Glu Asp Val Ser Leu Ile Val Phe Asp Glu Ala His 125 130 135 Arg Ala Val Gly Asn Tyr Ala Tyr Val Phe Ile Ala Arg Glu Tyr 140 145 150 Lys Arg Gln Ala Lys Asn Pro Leu Val Ile Gly Leu Thr Ala Ser 155 160 165 Pro Gly Ser Thr Pro Glu Lys Ile Met Glu Val Ile Asn Asn Leu 170 175 180 Gly Ile Glu His Ile Glu Tyr Arg Ser Glu Asn Ser Pro Asp Val 185 190 195 Arg Pro Tyr Val Lys Gly Ile Arg Phe Glu Trp Val Arg Val Asp 200 205 210 Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Glu Val Arg Lys Leu Leu Arg Glu Met 215 220 225 Leu Arg Asp Ala Leu Lys Pro Leu Ala Glu Thr Gly Leu Leu Glu 230 235 240 Ser Ser Ser Pro Asp Ile Pro Lys Lys Glu Val Leu Arg Ala Gly 245 250 255 Gln Ile Ile Asn Glu Glu Met Ala Lys Gly Asn His Asp Leu Arg 260 265 270 Gly Leu Leu Leu Tyr His Ala Met Ala Leu Lys Leu His His Ala 275 280 285 Ile Glu Leu Leu Glu Thr Gln Gly Leu Ser Ala Leu Arg Ala Tyr 290 295 300 Ile Lys Lys Leu Tyr Glu Glu Ala Lys Ala Gly Ser Thr Lys Ala 305 310 315 Ser Lys Glu Ile Phe Ser Asp Lys Arg Met Lys Lys Ala Ile Ser 320 325 330 Leu Leu Val Gln Ala Lys Glu Ile Gly Leu Asp His Pro Lys Met 335 340 345 Asp Lys Leu Lys Glu Ile Ile Arg Glu Gln Leu Gln Arg Lys Gln 350 355 360 Asn Ser Lys Ile Ile Val Phe Thr Asn Tyr Arg Glu Thr Ala Lys 365 370 375 Lys Ile Val Asn Glu Leu Val Lys Asp Gly Ile Lys Ala Lys Arg 380 385 390 Phe Val Gly Gln Ala Ser Lys Glu Asn Asp Arg Gly Leu Ser Gln 395 400 405 Arg Glu Gln Lys Leu Ile Leu Asp Glu Phe Ala Arg Gly Glu Phe 410 415 420 Asn Val Leu Val Ala Thr Ser Val Gly Glu Glu Gly Leu Asp Val 425 430 435 Pro Glu Val Asp Leu Val Val Phe Tyr Glu Pro Val Pro Ser Ala 440 445 450 Ile Arg Ser Ile Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg His Met Pro 455 460 465 Gly Arg Val Ile Ile Leu Met Ala Lys Gly Thr Arg Asp Glu Ala 470 475 480 Tyr Tyr Trp Ser Ser Arg Gln Lys Glu Lys Ile Met Gln Glu Thr 485 490 495 Ile Ala Lys Val Ser Gln Ala Ile Lys Lys Gln Lys Gln Thr Ser 500 505 510 Leu Val Asp Phe Val Arg Glu Lys Glu Ser Glu Lys Thr Ser Leu 515 520 525 Asp Lys Trp Leu Lys Lys Glu Lys Glu Glu Ala Thr Glu Lys Glu 530 535 540 Glu Lys Lys Val Lys Ala Gln Glu Gly Val Lys Val Val Val Asp 545 550 555 Ser Arg Glu Leu Arg Ser Glu Val Val Lys Arg Leu Lys Leu Leu 560 565 570 Gly Val Lys Leu Glu Val Lys Thr Leu Asp Val Gly Asp Tyr Ile 575 580 585 Ile Ser Glu Asp Val Ala Ile Glu Arg Lys Ser Ala Asn Asp Phe 590 595 600 Ile Gln Ser Ile Ile Asp Gly Arg Leu Phe Asp Gln Val Lys Arg 605 610 615 Leu Lys Glu Ala Tyr Ser Arg Pro Ile Met Ile Val Glu Gly Ser 620 625 630 Leu Tyr Gly Ile Arg Asn Val His Pro Asn Ala Ile Arg Gly Ala 635 640 645 Ile Ala Ala Val Thr Val Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Phe Ser 650 655 660 Ser Thr Pro Glu Glu Thr Ala Gln Tyr Ile Phe Leu Ile Ala Lys 665 670 675 Arg Glu Gln Glu Glu Arg Glu Lys Pro Val Arg Ile Arg Ser Glu 680 685 690 Lys Lys Ala Leu Thr Leu Ala Glu Arg Gln Arg Leu Ile Val Glu 695 700 705 Gly Leu Pro His Val Ser Ala Thr Leu Ala Arg Arg Leu Leu Lys 710 715 720 His Phe Gly Ser Val Glu Arg Val Phe Thr Ala Ser Val Ala Glu 725 730 735 Leu Met Lys Val Glu Gly Ile Gly Glu Lys Ile Ala Lys Glu Ile 740 745 750 Arg Arg Val Ile Thr Ala Pro Tyr Ile Glu Asp Glu Glu 755 760 763 <210> 2 <211> 2289 <212> DNA <213> Pyrococcus Furiosus <400> 2 atg tta tta agg aga gac tta ata cag cct agg ata tat caa gag gta 48 Met Leu Leu Arg Arg Asp Leu Ile Gln Pro Arg Ile Tyr Gln Glu Val 1 5 10 15 ata tac gcc aag tgc aaa gaa aca aac tgc ttg att gtt ctg ccc aca 96 Ile Tyr Ala Lys Cys Lys Glu Thr Asn Cys Leu Ile Val Leu Pro Thr 20 25 30 gga tta ggt aag acg ctg ata gct atg atg ata gca gag tat aga tta 144 Gly Leu Gly Lys Thr Leu Ile Ala Met Met Ile Ala Glu Tyr Arg Leu 35 40 45 acg aaa tat ggc gga aaa gtt cta atg ctc gcc ccc act aag cct ctc 192 Thr Lys Tyr Gly Gly Lys Val Leu Met Leu Ala Pro Thr Lys Pro Leu 50 55 60 gtt ctt caa cat gcg gaa agt ttt agg agg cta ttt aac ctc cct cca 240 Val Leu Gln His Ala Glu Ser Phe Arg Arg Leu Phe Asn Leu Pro Pro 65 70 75 80 gaa aaa att gta gca ctt act gga gag aag agc cca gaa gag aga agt 288 Glu Lys Ile Val Ala Leu Thr Gly Glu Lys Ser Pro Glu Glu Arg Ser 85 90 95 aag gcc tgg gcg aga gca aaa gta att gta gcc act cct caa act att 336 Lys Ala Trp Ala Arg Ala Lys Val Ile Val Ala Thr Pro Gln Thr Ile 100 105 110 gaa aat gac tta ttg gcg gga aga ata tct tta gaa gac gtt tcg cta 384 Glu Asn Asp Leu Leu Ala Gly Arg Ile Ser Leu Glu Asp Val Ser Leu 115 120 125 ata gta ttc gat gaa gct cac aga gct gtg ggc aat tac gct tac gtc 432 Ile Val Phe Asp Glu Ala His Arg Ala Val Gly Asn Tyr Ala Tyr Val 130 135 140 ttt ata gca aga gag tat aaa aga cag gcc aaa aac cca ctt gtt ata 480 Phe Ile Ala Arg Glu Tyr Lys Arg Gln Ala Lys Asn Pro Leu Val Ile 145 150 155 160 ggg tta aca gcc tcc cct ggg agc act cct gaa aag atc atg gag gta 528 Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Ser Thr Pro Glu Lys Ile Met Glu Val 165 170 175 ata aat aac ttg gga att gag cat att gaa tac cgc tcc gaa aat tct 576 Ile Asn Asn Leu Gly Ile Glu His Ile Glu Tyr Arg Ser Glu Asn Ser 180 185 190 ccc gat gtt aga cct tac gtt aag gga ata agg ttt gaa tgg gtt agg 624 Pro Asp Val Arg Pro Tyr Val Lys Gly Ile Arg Phe Glu Trp Val Arg 195 200 205 gtt gat ctc cca gaa ata tac aag gaa gta agg aaa ctt tta aga gaa 672 Val Asp Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Glu Val Arg Lys Leu Leu Arg Glu 210 215 220 atg ctt aga gat gcc ctt aaa ccg ttg gca gaa act gga ctt ctt gaa 720 Met Leu Arg Asp Ala Leu Lys Pro Leu Ala Glu Thr Gly Leu Leu Glu 225 230 235 240 tct tct tcc cca gac att cca aag aaa gaa gtt ctt aga gct ggg caa 768 Ser Ser Ser Pro Asp Ile Pro Lys Lys Glu Val Leu Arg Ala Gly Gln 245 250 255 ata ata aac gaa gaa atg gcg aaa ggt aat cat gat ctc aga ggc ttg 816 Ile Ile Asn Glu Glu Met Ala Lys Gly Asn His Asp Leu Arg Gly Leu 260 265 270 ctt ctc tat cac gca atg gct ctt aag cta cat cat gca att gag ctg 864 Leu Leu Tyr His Ala Met Ala Leu Lys Leu His His Ala Ile Glu Leu 275 280 285 ttg gaa acc caa ggg tta tcc gcc ctg agg gct tat ata aag aag ttg 912 Leu Glu Thr Gln Gly Leu Ser Ala Leu Arg Ala Tyr Ile Lys Lys Leu 290 295 300 tat gag gag gca aaa gcg gga tca aca aag gct agc aag gaa ata ttc 960 Tyr Glu Glu Ala Lys Ala Gly Ser Thr Lys Ala Ser Lys Glu Ile Phe 305 310 315 320 tcg gat aag aga atg aaa aag gca atc tca ctt tta gtt caa gcg aag 1008 Ser Asp Lys Arg Met Lys Lys Ala Ile Ser Leu Leu Val Gln Ala Lys 325 330 335 gag att ggg ctt gat cac ccc aag atg gac aag tta aaa gaa ata att 1056 Glu Ile Gly Leu Asp His Pro Lys Met Asp Lys Leu Lys Glu Ile Ile 340 345 350 agg gaa caa ctc caa agg aaa caa aat tcc aaa atc ata gtt ttc act 1104 Arg Glu Gln Leu Gln Arg Lys Gln Asn Ser Lys Ile Ile Val Phe Thr 355 360 365 aac tac aga gaa act gca aaa aag ata gtc aat gaa ctt gtg aaa gat 1152 Asn Tyr Arg Glu Thr Ala Lys Lys Ile Val Asn Glu Leu Val Lys Asp 370 375 380 gga ata aaa gct aaa agg ttc gtt gga cag gcc agc aaa gaa aat gac 1200 Gly Ile Lys Ala Lys Arg Phe Val Gly Gln Ala Ser Lys Glu Asn Asp 385 390 395 400 cgt gga ctg agt cag aga gag cag aaa tta att ctt gac gaa ttc gct 1248 Arg Gly Leu Ser Gln Arg Glu Gln Lys Leu Ile Leu Asp Glu Phe Ala 405 410 415 aga gga gaa ttc aac gtt cta gtg gca acg agt gta gga gag gaa gga 1296 Arg Gly Glu Phe Asn Val Leu Val Ala Thr Ser Val Gly Glu Glu Gly 420 425 430 ctt gac gtg ccg gaa gtt gat ttg gtt gtg ttt tat gag cca gta cca 1344 Leu Asp Val Pro Glu Val Asp Leu Val Val Phe Tyr Glu Pro Val Pro 435 440 445 tct gcc ata agg agc atc caa aga agg ggt aga act ggc agg cat atg 1392 Ser Ala Ile Arg Ser Ile Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg His Met 450 455 460 ccg ggg aga gtt ata atc cta atg gcc aag ggg act aga gat gaa gca 1440 Pro Gly Arg Val Ile Ile Leu Met Ala Lys Gly Thr Arg Asp Glu Ala 465 470 475 480 tac tac tgg agt tcc agg caa aag gaa aag ata atg caa gag aca ata 1488 Tyr Tyr Trp Ser Ser Arg Gln Lys Glu Lys Ile Met Gln Glu Thr Ile 485 490 495 gct aag gtg agt cag gca att aaa aag cag aag caa act tct cta gtt 1536 Ala Lys Val Ser Gln Ala Ile Lys Lys Gln Lys Gln Thr Ser Leu Val 500 505 510 gat ttt gtg aga gaa aaa gag agc gaa aag acc tct cta gac aag tgg 1584 Asp Phe Val Arg Glu Lys Glu Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asp Lys Trp 515 520 525 ttg aaa aag gaa aaa gaa gaa gca act gaa aaa gag gaa aag aag gta 1632 Leu Lys Lys Glu Lys Glu Glu Ala Thr Glu Lys Glu Glu Lys Lys Val 530 535 540 aag gct caa gag ggt gta aaa gtc gtc gta gat agc aga gag ctt agg 1680 Lys Ala Gln Glu Gly Val Lys Val Val Val Asp Ser Arg Glu Leu Arg 545 550 555 560 agt gag gtt gtg aag aga ctt aaa ctt ctt ggt gta aag tta gag gtt 1728 Ser Glu Val Val Lys Arg Leu Lys Leu Leu Gly Val Lys Leu Glu Val 565 570 575 aaa acg ctc gat gtg gga gat tat ata att agt gag gac gtt gca att 1776 Lys Thr Leu Asp Val Gly Asp Tyr Ile Ile Ser Glu Asp Val Ala Ile 580 585 590 gag agg aag tca gct aac gac ttc att cag tca att att gat ggt aga 1824 Glu Arg Lys Ser Ala Asn Asp Phe Ile Gln Ser Ile Ile Asp Gly Arg 595 600 605 ctt ttt gat caa gtt aag agg ctc aaa gag gca tac tca aga ccg ata 1872 Leu Phe Asp Gln Val Lys Arg Leu Lys Glu Ala Tyr Ser Arg Pro Ile 610 615 620 atg ata gtc gaa ggt tct tta tac gga att aga aac gtc cat cca aat 1920 Met Ile Val Glu Gly Ser Leu Tyr Gly Ile Arg Asn Val His Pro Asn 625 630 635 640 gca ata agg ggg gca ata gca gcg gta acc gta gac ttt ggg gtc cca 1968 Ala Ile Arg Gly Ala Ile Ala Ala Val Thr Val Asp Phe Gly Val Pro 645 650 655 ata ata ttt tca tct act cca gag gaa acc gct caa tac atc ttt cta 2016 Ile Ile Phe Ser Ser Thr Pro Glu Glu Thr Ala Gln Tyr Ile Phe Leu 660 665 670 att gca aag agg gag caa gag gag aga gaa aaa cct gtg aga att aga 2064 Ile Ala Lys Arg Glu Gln Glu Glu Arg Glu Lys Pro Val Arg Ile Arg 675 680 685 agt gag aag aag gcc ctt acc ctt gcc gag agg cag agg tta ata gtt 2112 Ser Glu Lys Lys Ala Leu Thr Leu Ala Glu Arg Gln Arg Leu Ile Val 690 695 700 gag gga tta cct cac gtc tca gca act cta gct agg aga ttg ttg aag 2160 Glu Gly Leu Pro His Val Ser Ala Thr Leu Ala Arg Arg Leu Leu Lys 705 710 715 720 cac ttt gga agt gtg gaa agg gta ttc act gca agc gtt gct gag tta 2208 His Phe Gly Ser Val Glu Arg Val Phe Thr Ala Ser Val Ala Glu Leu 725 730 735 atg aaa gtt gaa ggc ata gga gag aag att gct aag gag att aga agg 2256 Met Lys Val Glu Gly Ile Gly Glu Lys Ile Ala Lys Glu Ile Arg Arg 740 745 750 gta ata act gcc cca tat ata gag gat gag gag 2289 Val Ile Thr Ala Pro Tyr Ile Glu Asp Glu Glu 755 760 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 agctatgacc atgattacga attgctt 27 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aattcgtgca ggcatggtag ct 22 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 agctaccatg cctgcacgaa ttaagcaatt cgtaatcatg gtcatagct 49 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 agctatgacc atgattacga attgcttgga atcctgacga actgtag 47 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gatgtcaagc agtcctaagg aattcgtgca ggcatggtag ct 42 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ctacagttcg tcaggattcc 20 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ctacagttcg tcaggattcc aagcaatt 28 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 agctaccatg cctgcacgaa ttcgtatcag cgtaatcatg gtcatagct 49 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aattgcttaa ttcgtgcagg catggtagct 30 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 cctgcaggat ggtaggacgg cctcgcaatc ccgattgacc gagcacgcga gatgtcaacg 60 atcgaattgc 70 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 gcaattcgat cgttgacatc tcgcgtgctc ggtcaatcgg cagatgcgga gtgaagttcc 60 aacgttcggc 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 gccgaacgtt ggaacttcac tccgcatctg ccgattgacc gagtggcgtg tttctggtgg 60 ttcctaggtc 70 <210> 15 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gacctaggaa ccaccagaaa cacgccactc ggtcaatcgg gattgcgagg ccgtcctacc 60 atcctgcagg 70 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gcactaccat ggtattaagg agagacttaa 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gtgcgtcgac ctactcctca tcctctatat 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gtcgtcgact taagccttta ccttcttttc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gtcgacatat gcaagagggt gtaaaagtcg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 Hefの基質特異性と切断部位の決定。Aは、図
中で模式的に示した構造を持つ基質DNAを用いてHefエン
ドヌクレアーゼ（F）あるいはC547'（C）で切断反応を
行った後、反応物を、8M尿素を含むポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーにより
検出した。マーカーと対比する事により、それぞれの基
質について切断位置を決定した。模式図は左から、中心
にニックを持つ二本鎖DNA、中心の3'末端にフラップを
持つ二本鎖DNA、中心の5'末端にフラップを持つ二本鎖D
NA、中心の3'、5'両末端にフラップを持つ二本鎖DNA、Y
字構造、中心が移動しないフォーク構造で、星印は放射
性標識をした場所を示している。Bは、Aの反応に用いた
基質DNAの構造と塩基配列を示したものである。また、A
の反応で決定した切断位置を白（F）と黒（C）の矢印で
示した。矢印の大きさは切断の度合いを表す。

【図２】 様々なフォーク構造DNAのHefによる切断と、
切断部位の決定。Aは、図中で模式的に示した各種のフ
ォーク構造DNAを用いてHefエンドヌクレアーゼ（F）あ
るいはC547'（C）で切断反応を行った後、反応物を、8M
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離
し、オートラジオグラフィーにより検出した。マーカー
と対比する事により、切断位置を決定した。模式図は左
から、中心が移動しないフォーク構造、中心が移動する
フォーク構造、中心が移動せず、かつ8塩基ギャップの
あるフォーク構造で、星印は放射性標識をした場所を示
している。Bは、Aの反応に用いた基質DNAの構造と塩基
配列を示したものである。また、Aの反応で決定した切
断位置を白（F）と黒（C）の矢印で示した。灰色の矢印
は、Hefエンドヌクレアーゼの反応に2mM ATPを加えた時
に更に生じる切断場所を示した。矢印の大きさは切断の
度合いを表す。

【図３】 Hefエンドヌクレアーゼによる、停止した複
製フォークの切断モデル。連続（leading）鎖合成の鋳
型DNAに損傷（黒四角で示す）があるために複製フォー
クが停止した場合を考える。Aは不連続（lagging）鎖合
成が先行した場合で、Hefエンドヌクレアーゼは、連続
合成鎖の鋳型DNAと不連続合成鎖が出発した地点との分
岐点を切断し、二本鎖DNAとギャップのある二本鎖DNAが
生じる。Bは連続鎖合成が先行していた場合で、Hefエン
ドヌクレアーゼは、N末端部位のヘリカーゼ活性によっ
て複製フォークの分岐点を退行させ、連続合成鎖の鋳型
DNAと不連続鎖の合成が出発した地点との分岐点を切断
し、二本鎖DNAとギャップのある二本鎖DNAが生じる。C
は、連続合成鎖と不連続合成鎖が時差なくフォークの分
岐点まで達している場合で、Hefは連続合成鎖の鋳型DNA
を分岐点で切断する。また、両新生鎖がヘリカーゼ活性
で解かれて、フォークが退行することにより、新生鎖ど
うしがアニールして四分岐構造をとった場合は、Hjcエ
ンドヌクレアーゼが分岐点を対象的に切断する。いずれ
の場合も切断後は、相同的DNA組換えの機構により複製
フォークが再開される。

【図４】 中心が移動し、かつホリディ構造も形成でき
るフォーク構造の切断と切断部位の決定。Aは、模式図
中で示した場所に放射性標識（星印で表している）をし
た、中心が移動し、かつホリディ構造も形成できるフォ
ーク構造を基質として用いて、C547'（C）あるいはHjc
エンドヌクレアーゼ（H）で切断反応を行った後、反応
物を、8M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。マー
カーと対比する事により、切断位置を決定した。決定し
た切断位置をBのDNA中の白（H）と黒（C）の矢印で示し
た。矢印の大きさは切断の度合いを表す。切断位置から
推定して、基質DNAはBに示すような構造変化を起し、そ
れぞれの酵素に適した構造が認識されていると考えられ
る。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニックあるいはギャップを含む二本鎖Ｄ
   ＮＡのうち、ニックあるいはギャップを含む鎖の、ニッ
   クあるいはギャップ領域から５'末端側に３〜６塩基上
   流部分を、特異的に切断するエンドヌクレアーゼ活性を
   有するタンパク質。
2. 【請求項２】 二本鎖ＤＮＡがフラップ構造を含む請求
   項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 古細菌由来である請求項１または２に記
   載のタンパク質。
4. 【請求項４】 耐熱性である請求項１〜３のいずれかに
   記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含む請
   求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 配列番号１に示すアミノ酸配列において
   １若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
   れたアミノ酸配列を有する請求項１〜４のいずれかに記
   載のタンパク質。
7. 【請求項７】 ヘリカーゼ活性を有する請求項１〜６の
   いずれかに記載のタンパク質。
8. 【請求項８】 ニックあるいはギャップを含む複製フォ
   ーク分岐点のうち、ニックあるいはギャップを含む鎖
   の、ニックあるいはギャップ領域から５'末端側に３〜
   ６塩基上流部分を、特異的に切断する請求項１〜７のい
   ずれかに記載のタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項４に記載のタンパク質を製造する
   方法であって、 １）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
   をコードする塩基配列を調製し、 ２）該塩基配列を発現ベクターに挿入し、 ３）該ベクターで宿主細胞を形質転換し、 ４）該形質転換体を培養し、 ５）該培養液から請求項４に記載のタンパク質を単離す
   る、 ことを含む方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれかに記載のタン
    パク質をコードする遺伝子。
11. 【請求項１１】 配列番号２の塩基配列を有する請求項
    １０に記載の遺伝子。
12. 【請求項１２】 配列番号２の塩基配列を有する遺伝子
    とストリンジェントな条件下にハイブリダイズ可能な遺
    伝子であって、ニックあるいはギャップを含む二本鎖Ｄ
    ＮＡのうち、ニックあるいはギャップを含む鎖の、ニッ
    クあるいはギャップ部位から５'末端側に３〜６塩基上
    流部分を、特異的に切断するエンドヌクレアーゼ活性を
    有するタンパク質をコードする遺伝子。