JP3624237B2 - エンドヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドヌクレアーゼとは、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）のうちでポリヌクレオチド鎖内部のホスホジエステル結合を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチド配列を認識し、これと結合することによって認識配列内の分子を切断する。従って、エンドヌクレアーゼは、遺伝子工学技術が進歩した現在では遺伝子のクローニングや分析に不可欠な酵素である。
【０００３】
ところで、各種微生物のうち真核生物に属する各種生物（酵母等）由来の部位特異的エンドヌクレアーゼＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ（以下「ＳｃｅＩ」ともいう）は、７５ｋＤａと５０ｋＤａのサブユニットからなるヘテロ二量体であることが知られている。そして、上記ＳｃｅＩの各サブユニットともに、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子がクローニングされ、その塩基配列も決定されている（７５ｋＤａのサブユニットについてはＭｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６５， １５１８９−１５１９７（１９９０）、５０ｋＤａのサブユニットについては特公平７−７７５５６号公報参照）。
生化学的試薬、遺伝子の人工改変等に上記エンドヌクレアーゼを広く利用するためには、遺伝子発現系を利用した当該エンドヌクレアーゼの大量生産をすることが必要である。また、エンドヌクレアーゼは特定の塩基配列を認識することにより初めてその機能を発揮することから、認識する塩基配列に対し特異性を有することが必要である。
【０００４】
上記エンドヌクレアーゼＳｃｅＩのサブユニットは酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のミトコンドリアゲノムにコードされており、しかも酵母のミトコンドリアゲノムの遺伝子はタンパク質の大量発現に汎用されている生物種（大腸菌、バキュロウイルス、酵母等）の遺伝子発現系において用いられているアミノ酸暗号（普遍コドン）と異なるミトコンドリア固有のコドンを含んでいるため、ミトコンドリアゲノムの遺伝子をそのまま用いたのではタンパク質発現系を利用して本来のアミノ酸配列を持つタンパク質を生産することは困難である。例えばＴＧＡは、普遍コドンではストップコドンであるがミトコンドリアでは別のアミノ酸（Ｔｒｐ）のコドンとなっている。従って、ミトコンドリア内では正常に発現することができても、大腸菌などの通常の発現系で発現させた場合は、ストップコドンによって翻訳が進まなくなり、完全なタンパク質が得られない場合がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、酵母由来エンドヌクレアーゼの小サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子において、ミトコンドリアに固有のコドンを普遍コドンに置換することにより、特定の塩基配列を認識及び切断することができるエンドヌクレアーゼに改変し、かつ大量に発現させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼである。
【０００７】
さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質である。
（ａ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子である。
（ｃ） 配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ） 配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼを採取することを特徴とする前記エンドヌクレアーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、酵母由来のエンドヌクレアーゼの小サブユニット（５０ｋＤａ）をコードするミトコンドリアゲノムＤＮＡを、大腸菌や酵母などのタンパク質発現系で大量発現できるようにすることを目的としており、この目的達成のため、本発明は、当該小サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子においてミトコンドリア固有のコドンを普遍コドンに改変することを特徴とする。また、本発明は、２６塩基対の特定の塩基配列を認識し切断することができる、上記改変された小サブユニットに関するものである。
本発明のエンドヌクレアーゼ（酵母由来のエンドヌクレアーゼのうち５０ｋＤａのサブユニット；以下「Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ｋＤａ」ともいう）は、以下のようにして調製される。
【００１１】
１．変異アミノ酸の設計及び変異の導入
本発明において変異を導入するための対象となるエンドヌクレアーゼは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のエンドヌクレアーゼＳｃｅＩの小サブユニット又はサッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）由来のエンドヌクレアーゼＳｕｖＩの小サブユニットである。なお、ＳｃｅＩの小サブユニット及びＳｕｖＩの小サブユニットともに５０ｋＤａの分子量を有しているが、ＳｕｖＩのアミノ酸配列はＳｃｅＩのアミノ酸配列と比較して２箇所異なる点で両者は相違する（図６（ａ））。
ＳｃｅＩのサブユニット（５０ ｋＤａ）をコードする遺伝子（ＥＮＳ２という）はミトコンドリアゲノムにコードされているため、ミトコンドリアに固有の遺伝暗号を含む（表１）。
【００１２】
【表１】
【００１３】
ＥＮＳ２の塩基配列は公知であるが（特公平７−７７５５６号公報；Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））、ＥＮＳ２を普遍コードに従って大腸菌等の通常の発現系で発現させた場合、表１から分かるように、ＴＧＡはストップコドンであるためそれ以上翻訳が進まなくなる（例えば上記公報に記載のＥＮＳ２の塩基配列の９７〜９９番目はストップコドン「ＴＧＡ」である）。また、「ＡＴＡ」は普遍コードではＩｌｅのコドンであるのに対し、ミトコンドリアコードではＭｅｔのコドンである。
従って、ＥＮＳ２について通常の大量発現系を構築するためには、大腸菌などの通常の発現系で発現させたときのアミノ酸配列が、ミトコンドリアの発現系で発現させたときのアミノ酸配列と同一となるようにＥＮＳ２の遺伝暗号を改変する必要がある。従って、本発明においては、例えばミトコンドリアコードではＴｒｐとなるコドン（ＴＧＡ）を、普遍コードでＴｒｐに翻訳されるコドン（ＴＧＧ）に置換する（表１）。普遍コードではＩｌｅに翻訳されるコドンであるＡＴＡ、及び普遍コードではＬｅｕに翻訳されるコドンであるＣＴＡ又はＣＴＴについても同様である（表１）。但し、普遍コードでＩｌｅ又はＬｅｕをコードする他の縮重コドンは置換する必要はない。
【００１４】
以上の観点より、改変する候補となるアミノ酸は、ＳｃｅＩの小サブユニットのアミノ酸配列（４７６個）のうち、基本的に以下に示す３７箇所のアミノ酸である（図１、表２）。但し、サッカロミセス・ウバラム由来のエンドヌクレアーゼ（ＳｕｖＩ）については、図１中２１７番目のＧｌｙ及び３４６番目のＡｓｎをそれぞれＬｙｓ、Ａｓｐに置換し、合計３９箇所が改変されるようにする。なお、上記アミノ酸の３７箇所又は３９箇所すべてを置換する必要はなく、ミトコンドリア固有のコードで翻訳されなくとも後述する２６個の塩基（配列番号１）を認識することができる限り、置換箇所が３６箇所であっても、３５箇所以下であってもよい。
置換位置をまとめると以下の通りである（表２）。
【００１５】
【表２】
【００１６】
アミノ酸の置換を行うためには、当該アミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列を別の塩基配列に置換する方法（部位特異的突然変異誘発方法）が採用される。変異誘発法として、例えばＴ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２， ４８８−４９２ （１９８５））、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する１〜２本の改変用オリゴヌクレオチドを最高１６本のオリゴヌクレオチドに増やし、これらを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、あるいは、宝酒造社製のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドは、ＥＮＳ２の塩基配列（１４３１塩基対：Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１）； 特公平７−７７５５６号公報）を鋳型として、変異を導入する少なくとも１個の塩基を中心として前後８〜３０塩基程度（全体で１８〜６０塩基程度）の長さのものを設計し、合成する。なお、オリゴヌクレオチドは、通常の合成装置を用いた化学合成により得ることができる。
【００１８】
２．変異が導入されたエンドヌクレアーゼ遺伝子の調製
前記１．のようにして得られた各オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化し、ＥＮＳ２を鋳型として合成及びライゲーション反応を行う。これらの反応はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）等を用いて行うことができる。
得られたＤＮＡについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばファルマシア社製ＡＬＦ、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成により、あるいはＰＣＲにより本発明の遺伝子を得ることもできる。
【００１９】
配列番号２に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号３に本発明のエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を例示する。本発明のエンドヌクレアーゼは、天然のエンドヌクレアーゼの大サブユニットと結合することにより本来のエンドヌクレアーゼＳｃｅＩ又はＳｕｖＩとしての機能、すなわちコンセンサス配列「ＣＡＮＲＹＮＮＡＮＮＣＹＹＧＴＴＷ」及びその類似配列を認識する特徴を有する。但し、本発明のエンドヌクレアーゼは、天然のエンドヌクレアーゼの小サブユニットが単独で発揮する機能を失っておらず、「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」（配列番号１）で表される２６塩基を特異的に認識することができるものである。
【００２０】
なお、本発明のエンドヌクレアーゼが上記２６塩基（配列番号１）を特異的に認識することができる限り、改変されたアミノ酸において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号３で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、前記３７又は３９箇所のアミノ酸すべてを改変しなくても、上記２６塩基（配列番号１）を認識することができる限り、本発明のエンドヌクレアーゼに含まれる。
【００２１】
ここで、「認識することができる」とは、本発明のエンドヌクレアーゼが遺伝子内の前記２６塩基を有する部位に結合し、当該２６塩基対の内部が２つの突出末端となるように遺伝子を切断する機能を有することをいう。
また、上記遺伝子（配列番号２）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件をいう。
【００２２】
４．組換えベクターの調製及び形質転換
（１） 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２３】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
（２） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ １１４、２０７−２１などが挙げられる。
【００２６】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９：２１１０−２１１４ （１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４： １８２−１８７ （１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７５： １９２９−１９３３ （１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ， Ｈ．：Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５３：１６３−１６８ （１９８３）］等が挙げられる。
【００２９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３０】
５．エンドヌクレアーゼの生産
本発明のエンドヌクレアーゼは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３２】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で１２〜１８時間行う。培養期間中、ｐＨは６．５〜７．５、好ましくは７．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００３３】
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のエンドヌクレアーゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりエンドヌクレアーゼを抽出する。また、本発明のエンドヌクレアーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のエンドヌクレアーゼを単離精製することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものでない。
〔実施例１〕デオキシウラシルを含む、ＳｃｅＩのサブユニットをコードする一本鎖鋳型ＤＮＡの調製
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニット遺伝子ＥＮＳ２（１４３１塩基対； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））の改変は上流側１．０ キロ塩基対と下流側０．４ キロ塩基対の２領域で平行して実施した。この目的のために５０ ｋＤａサブユニット遺伝子全長（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））を含むＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ 断片（１６７１塩基対）と、５０ ｋＤａサブユニット遺伝子の下流を含んだＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片（５３４塩基対）をそれぞれファージミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）に別々にクローニングしてｐＥＮ１．７、ｐＥＮ０．５とし（図３）、これらを大腸菌ＣＪ２３６ （宝酒造社製）株に形質転換した。形質転換大腸菌株を３７℃で１２時間以上振とう培養して、前培養液とした。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む本培養用の２ｘＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９）） ２ ｍｌ に前培養液 ２０ μｌを加え、３７℃で１時間培養した。培地の体積の０．４％に当たるヘルパーファージ Ｍ１３ＫＯ７（２．０ｘ１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）；宝酒造社製）を加え、３７℃で１時間培養後、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１４時間培養した。この培養によって大腸菌から培地中に放出されたファージ粒子を次のようにして回収した。１．５ ｍｌの培養液をマイクロ遠心機で遠心分離し（１４，０００ ｒｐｍ， ５分）、上清を１．２ ｍｌ採取した後、同じ条件で再度遠心分離を繰り返して菌体を完全に除き、上清１．０ ｍｌを得た。これ以降のＤＮＡ の調製はＪ．サムブルックらの実験書（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））にまとめられているバクテリオファージＭ１３ファージのＤＮＡの精製法に従った。
【００３５】
〔実施例２〕部位特異的変異導入のためのオリゴヌクレオチドの合成
（１） 一本鎖の合成
５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子ＥＮＳ２はミトコンドリアゲノムにコードされているため、ミトコンドリアに固有の遺伝暗号を含む（表１）。ＥＮＳ２を通常用いられている大量発現系に供するためにはこれらの固有コドンを普遍的コードに対応するように置換する必要がある。本実施例では、Ｔ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２， ４８８−４９２ （１９８５））を改良して塩基の置換を行った。通常のクンケル法で使用する改変用オリゴヌクレオチドは１または２本であるが、以下に述べるように最高１６本のオリゴヌクレオチドを同時に使い、多部位での効率のよい置換を行った。
置換したい塩基を中心にして前後に１０から１５程度の塩基を持つ３３本のオリゴヌクレオチドを設計した（表３）。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３において、各配列の下に記載したカッコ書の塩基は、下線を施した配列に置換する前の塩基を表す。また、アルファベット小文字で表した塩基は、既に別のオリゴヌクレオチドで置換された塩基を表す。
オリゴヌクレオチドの長さは１８から５２塩基の範囲にあり、それぞれ１から最高で４残基の変異を含む。これらは ５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子の１４３１塩基対のうち５０塩基対、３７個のコドンを置換するのに用いた。後述のＤＮＡリガーゼ反応を可能にするためにオリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化した。リン酸化の反応液は以下の組成である。
【００３８】
──────────────────────────
１００ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
１０ ｍＭ 塩化マグネシウム
７ ｍＭジチオスレイトール
１ ｍＭ ＡＴＰ、１μＭ オリゴヌクレオチド
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１５単位）
──────────────────────────
全量３０μｌ
上記反応液について３７℃で１５分間リン酸化反応を行ったのち、７０℃、１０分で酵素を失活させた。
【００３９】
（２） 相補鎖の合成
（１）で得られたオリゴヌクレオチドを以下の手法により二本鎖とした。
アニーリング用緩衝液と伸長反応用緩衝液の組成は以下の通りである。
【００４０】
アニーリング用
────────────────────
２００ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
１００ ｍＭ塩化マグネシウム
５００ ｍＭ塩化ナトリウム
１０ ｍＭ ジチオスレイトール
────────────────────
伸長反応用
───────────────────────────
５０ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
５ ｍＭ ジチオスレイトール
６０ ｍＭ酢酸アンモニウム
０．５ ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ（Ａ， Ｃ， Ｔ， Ｇ）
５ ｍＭ 塩化マグネシウム
１ ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
───────────────────────────
【００４１】
アニーリング緩衝液１μｌ と０．２ ｐｍｏｌの鋳型用一本鎖ＤＮＡに蒸留水を加え全量を１０μｌ とした。このうち１μｌ を分注してリン酸化オリゴヌクレオチド溶液１μｌ と混合し、６５℃で１５分、次に３７℃で１５分静置して、オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせた。続いて２５μｌ 伸長用緩衝液、６０単位の大腸菌ＤＮＡ リガーゼ、１ 単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、２５℃で２時間静置して相補鎖の合成を行った。３μｌ の０．２ Ｍ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩（ｐＨ８．０）を加えて酵素反応を停止させた後、６５℃、５分の処理により酵素を失活させた。この反応液をそのまま以下の形質転換に使った。
【００４２】
〔実施例３〕形質転換
相補鎖合成後の二重鎖プラスミドＤＮＡに含まれる野生型のＤＮＡ鎖（ＣＪ２３６で作らせた一本鎖ＤＮＡ）の塩基配列を選択的に変異型に置き換えるため、大腸菌ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳ（宝酒造社製）を用いた。この大腸菌株の中では、ＣＪ２３６で作らせた一本鎖ＤＮＡに含まれるデオキシウラシルが酵素ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼにより分解された後、置換塩基を含んでいる方のＤＮＡ鎖を鋳型として再合成される（Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｔ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１， ６１−８７ （１９８２） ）。相補鎖合成した反応液を、ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳのコンピテント細胞を含む溶液１００μｌ に全て加えた。なお、大腸菌のコンピテント細胞はＨ．イノウエらの方法（Ｉｎｏｕｅ， Ｈ．， Ｎｏｊｉｍａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． Ｇｅｎｅ ９６， ２３−２８ （１９９０））に従って調製した。
さらに培地を加え、３７℃ １時間置いてから、ヘルパーファージ（前述）を３０μｌ 添加して更に３７℃で３０分間静置して感染させた。ここからヘルパーファージとプラスミドの両方を細胞内に含んだＢＭＨ７１−１８の培養液を４０μｌ分取して、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ｘＹＴ培地２ ｍｌに加え、３７℃で１６〜２０時間振とう培養してファージを産生させた。
【００４３】
遠心分離（１４，０００ ｒｐｍ， ５分）で菌体を除き、置換塩基を持つプラスミドの一本鎖ＤＮＡを取り込んだファージ粒子の上清を集めた。この上清２０μｌに１２時間以上培養したＭＶ１１８４株（宝酒造社製）の８０μｌを混合して３７℃で１０分間静置して、ファージから細胞内に一本鎖ＤＮＡを注入させた。取り込んだ一本鎖ＤＮＡを複製してプラスミドを持つようになったＭＶ１１８４株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））にまいて選択した。いくつかのクローンについて ５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子の塩基配列を自動シークエンサーＡＬＦ（ファルマシア社）で調べ、所定の置換が導入されていることを確認した。なお、塩基配列解析のための蛍光プライマーはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）より購入した。また、ＤＮＡシークエンシング反応はサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７４， ５４６３−５４６７ （１９７７））に基づき、ファルマシア社のプロトコールに従って行った。
出発材料としたプラスミド ｐＥＮ１．７に対しては ９回の操作で４０箇所、ｐＥＮ０．５に対しては４回の操作で１０箇所の塩基置換を施した。全ての置換が確認できた時点でＰｓｔＩ切断部位の上流と下流をつなげて、置換の完了した５０ ｋＤａサブユニットをコードする本発明の遺伝子を得た（図４、配列番号２）。
【００４４】
〔実施例４〕 ５０ ｋＤａ サブユニットの発現プラスミドの構築
５０ ｋＤａサブユニット改変遺伝子を発現誘導用のベクターにつなげるのを容易にするため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により改変遺伝子の５’端と３’端それぞれに制限酵素切断配列の導入を行った。反応はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、同社のプロトコールに従って行った。使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号４）
５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号５）
【００４５】
下線部はそれぞれ新たに導入したＢａｍＨＩ， ＳａｌＩの認識配列である。連結反応は９４℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分間の反応を１サイクルとして２５サイクル行った。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ 断片（１４４７塩基対）はアガロース（０．８％）ゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））で分離後、エチジュウムブロマイド染色して確認した。この断片をアガロースゲルよりジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）キット（ＢＩＯ１０１社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、 ＵＳＡ）を用いて回収した。
回収したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理した後、プラスミドｐＲＳＥＴ （インビトロジェン社）及びｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）にサブクローニングしそれぞれｐＳＣ５０ 、ｐＴＺＳＣ５０とした。ｐＳＣ５０ は発現誘導に用いた。ｐＴＺＳＣ５０は蛍光プライマーを用いたＤＮＡシークエンシング（前述）を行いＰＣＲの過程で余分な変異が入っていないことを確認した。
【００４６】
〔実施例５〕 ５０ ｋＤａ サブユニットの発現誘導
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（インビトロジェン社）のコンピテント細胞に発現プラスミドｐＳＣ５０を導入した。この形質転換細胞をアンピシリン（１５０ μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９） ）中、３７℃で終夜、振とう培養して前培養を行った。本培養の体積の４％に当たる前培養液を遠心分離（２５００ ｘｇ、１０分）にかけて菌体を集めた。この沈澱を少量の新しい培地にけん濁させ、本培養の液体培地に加えた。６００ナノメートル（ｎｍ）における濁度（ＯＤ６００ ）が約 ０．５になるまで振とう培養（３７℃）をした後、培養温度を１８℃に下げて振とう培養を続けた。ＯＤ６００ が約 ０．８になった時点で培養液にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ ｍＭになるように加えて５０ｋＤａサブユニットの発現誘導を開始した。１８℃でさらに１２時間、振とう培養を行った後、大腸菌を遠心分離で集菌し、液体窒素を用いて急速冷凍してから−８０℃に保存した。
【００４７】
〔実施例６〕大腸菌からの５０ ｋＤａサブユニットの精製
−８０℃で保存した菌体を室温で融解させ、その後の操作は４℃又は氷上で行った。培養量１００ ｍｌ当たり４ ｍｌのバッファーＡ（２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ ８．０） ５００ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭイミダゾール、１ ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオダイド（シグマ・アルドリッチジャパン社、東京、日本）、０．１％ ＮＰ−４０（ナカライテスク社、京都、日本）に菌体をけん濁させた。これを液体窒素で急速冷凍した後、流水中で融解させることによって大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液中のＤＮＡを断片化させるため、このけん濁液を、超音波破砕機（ＵＲ−２００Ｐ、トミー精工、東京、日本）の最大出力で、３０秒間、５回処理した。
【００４８】
処理液を３９，０００ ｘｇ で ２０分、４℃の条件で遠心分離し、得られた上清を０．４５μｍのマイレックスフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）で濾過した。この試料を、バッファーＡで平衡化したプロボンド（Ｐｒｏｂｏｎｄ）ニッケルキレート樹脂（インビトロジェン社）を充填したカラム（φ１０ ｍｍ、 ２．０ ｍｌ）に重層後、バッファーＡ ２０ ｍｌ（樹脂の１０倍の体積）で洗った。６０ ｍＭのイミダゾールを含むバッファーＡ １２ｍｌ（樹脂の６倍の体積）で更に洗浄後、６０ ｍＭから５００ ｍＭへのイミダゾールを含むバッファーＡの濃度勾配（総量８０ ｍｌ）で溶出を行った。得られた溶出画分は１０％アクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０−６８５ （１９７０））に供し、クマシーブリリアントブルー染色によって ５０ ｋＤａサブユニットの存在を確認した。５０ ｋＤａサブユニットを含む画分はバッファーＢ（２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、３００ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭエチレンジアミンテトラ四酢酸ナトリウム塩、１ ｍＭジチオスレイトール）に対して透析した。精製タンパク質の定量はプロテインアッセイ試薬（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、 ＵＳＡ）を用い、同社のマイクロアッセイ法によって行った。標準蛋白質として牛血清アルブミン溶液（シグマ・アルドリッチジャパン社）を用いた。その結果、２５ｇ（湿重量）の菌体より３００μｇの精製タンパク質が得られた。
【００４９】
〔実施例７〕エンドヌクレアーゼ活性の測定
５０ ｋＤａサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性測定のための基質は以下のようにした調製した。Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ が細胞内で切断することが明らかとなっているミトコンドリアＤＮＡ 上のオリ２（ｏｌｉ２）領域を含んだ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片（１６７１塩基対； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１， ２７０７−２７１５ （１９９２））を、ファージミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にサブクローニングしｐＹ６７３Ｌとした（図２）。対照用ＤＮＡ 基質としてプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を使用した。ｐＹ６７３ＬとｐＢＲ３２２は、これを用いて作製した形質転換大腸菌より抽出した後、キアゲンカラム（キアゲンジャパン社、東京、日本）を用いて高度に精製した。
５０ ｋＤａサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性測定に用いた反応液の組成は次の通りである。
【００５０】
────────────────────────────────────
５０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）
５０ ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ ｍＭ 塩化マグネシウム
１ ｍＭジチオスレイトール
２５ ｎｇ 基質ＤＮＡ（ｐＹ６７３ＬまたはｐＢＲ３２２を制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたもの
（図２））
０．４ から ６０ ｎｇまでの５０ ｋＤａサブユニット
────────────────────────────────────
総体積 ３０μｌ
【００５１】
ＤＮＡ切断反応は３７℃で３０分行った後、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩とドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度がそれぞれ、１０ ｍＭと０．３ ％ になるように加えて反応を停止した。切断されたＤＮＡはそのまま、あるいはフェノール抽出、エタノール沈殿による濃縮を施した後、０．８ ％アガロース電気泳動に供した。
泳動後にゲルをエチジウムブロマイド（シグマ・アルドリッチジャパン社）またはサイバーグリーン（宝酒造社製）で染色して、ＤＮＡの切断を確認した。ＤＮＡ の検出にはＦＭ ＢＩＯイメージング装置（宝酒造社製）を用い、ＤＮＡの切断を定量化した。
【００５２】
〔実施例８〕配列特異的エンドヌクレアーゼ活性の検出
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ二量体は、ミトコンドリアＤＮＡ上のオリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内において、コンセンサス配列と類似した２６塩基対を認識して細胞内及び試験管内で切断する（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１， ２７０７−２７１５ （１９９２））（図２）。精製した Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩの５０ ｋＤａサブユニットは、単独で特定配列（配列番号１）を切断した。
基質にオリ２（ｏｌｉ２）を含むプラスミドｐＹ６７３Ｌを使った場合、５０ ｋＤａサブユニットによってオリ２（ｏｌｉ２）の特異的切断が確認された（図５ａ）。図５ａ中、レーン１〜８はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを０．５、１．０、２．０、４．０、８．０、１６．０、３２．０、６４．０ｎｇ用いた結果である。５０ ｋＤａサブユニット６４ ｎｇ によって反応液中のｐＹ６７３Ｌ（２５ ｎｇ）の６０％が３７℃で３０分以内に配列特異的に切断され、３．４キロベースと１．４キロベースのＤＮＡ断片が出現した。
【００５３】
一方、基質にプラスミドｐＢＲ３２２を使った場合は、５０ ｋＤａサブユニットによるＤＮＡの切断を受けず、切断断片は検出されなかった（図５ｂ）。図５ｂ中、レーン１〜７はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを２．３、４．５、９．０、１８．０、３６．０、７２．０、１４４ｎｇ用いた結果である。過剰量（２００ ｎｇ）の ５０ ｋＤａ サブユニットを用いた場合でもｐＢＲ３２２及びその他のＤＮＡ（オリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内の特定配列（２６塩基対）を含まない出芽酵母株のミトコンドリアＤＮＡ（８０キロ塩基対）、大腸菌ファージλＤＮＡ （４７キロ塩基対）、枯草菌ファージφ１０５ＤＮＡ（３８キロ塩基対））は全く切断されなかった。
【００５４】
〔実施例９〕サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）の持つ５０
ｋＤａサブユニットの大量生産とその活性の検出
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の持つＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの相同蛋白質Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットがサッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）に存在する（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１） ）。両サブユニットとも４７６アミノ酸残基から構成されているが、二カ所でアミノ酸が異なっている。Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩとＥｎｄｏ．ＳｕｖＩの５０ｋＤａサブユニットのアミノ酸配列の違いを図６ａに示す。
【００５５】
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの改変遺伝子をさらに二カ所改変してＥｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットの大量発現用遺伝子を作製した。Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットアミノ酸に置き換えるために使用したオリゴヌクレオチドを図６ｂに示す。なお、図６ｂのカッコ内の塩基は、Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの塩基配列に相当する。この目的のため新たに二種のオリゴヌクレオチドを合成し、前述の遺伝子改変法に従って変異を導入した。得られた変異はＤＮＡシークエンシングによって確認した。改変遺伝子はｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン社）にサブクローン化した後、形質転換法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓに導入した。
Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットの誘導発現とその精製は前述のＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットに適用した方法に従った。これにより精製されたＥｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットを用いてｐＹ６７３Ｌの特異的切断を行った。
【００５６】
その結果、Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットはｐＹ６７３Ｌ上のＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニット切断部位を同程度の効率で配列特異的に切断した（図７ａ）。
一方、プラスミドｐＢＲ３２２は全く切断を受けず（図７ｂ）、その他のＤＮＡ（オリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内の特定配列（２６塩基対）を含まない出芽酵母ミトコンドリアＤＮＡ、枯草菌ファージφ１０５ＤＮＡ及び大腸菌ファージλＤＮＡ）も、Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットによって切断されなかった。
なお、図７ａ及びｂにおいて、レーン１〜７はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを２．３、４．５、９．０、１８．０、３６．０、７２．０、１４４ｎｇ用いた結果を表す。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法が提供される。本発明のエンドヌクレアーゼは、２６塩基の特定の配列を認識することができるため、遺伝子工学、生化学の分野においてプラスミドから染色体に至る広い範囲のＤＮＡの改変やマッピングに利用できる点で有用である。
【００５８】
【配列表】
【００５９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３１：合成ＤＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
配列番号３５：合成ＤＮＡ
配列番号３６：合成ＤＮＡ
配列番号３７：合成ＤＮＡ
配列番号３８：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】エンドヌクレアーゼの改変前後のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】プラスミドｐＹ６７３Ｌの構築図である。
【図３】プラスミドｐＥＮ１．７及びｐＥＮ０．５の構築図である。
【図４】普遍コードに改変したＳｃｅＩの５０ｋＤａサブユニット遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図５】改変したＳｃｅＩの５０ｋＤａサブユニットの配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を示す電気泳動写真である。
【図６】サッカロミセス・ウバラムの５０ｋＤａサブユニットの置換部位及び置換に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図７】サッカロミセス・ウバラムの５０ｋＤａサブユニットの配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドヌクレアーゼとは、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）のうちでポリヌクレオチド鎖内部のホスホジエステル結合を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチド配列を認識し、これと結合することによって認識配列内の分子を切断する。従って、エンドヌクレアーゼは、遺伝子工学技術が進歩した現在では遺伝子のクローニングや分析に不可欠な酵素である。
【０００３】
ところで、各種微生物のうち真核生物に属する各種生物（酵母等）由来の部位特異的エンドヌクレアーゼＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ（以下「ＳｃｅＩ」ともいう）は、７５ｋＤａと５０ｋＤａのサブユニットからなるヘテロ二量体であることが知られている。そして、上記ＳｃｅＩの各サブユニットともに、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子がクローニングされ、その塩基配列も決定されている（７５ｋＤａのサブユニットについてはＭｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６５， １５１８９−１５１９７（１９９０）、５０ｋＤａのサブユニットについては特公平７−７７５５６号公報参照）。
生化学的試薬、遺伝子の人工改変等に上記エンドヌクレアーゼを広く利用するためには、遺伝子発現系を利用した当該エンドヌクレアーゼの大量生産をすることが必要である。また、エンドヌクレアーゼは特定の塩基配列を認識することにより初めてその機能を発揮することから、認識する塩基配列に対し特異性を有することが必要である。
【０００４】
上記エンドヌクレアーゼＳｃｅＩのサブユニットは酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のミトコンドリアゲノムにコードされており、しかも酵母のミトコンドリアゲノムの遺伝子はタンパク質の大量発現に汎用されている生物種（大腸菌、バキュロウイルス、酵母等）の遺伝子発現系において用いられているアミノ酸暗号（普遍コドン）と異なるミトコンドリア固有のコドンを含んでいるため、ミトコンドリアゲノムの遺伝子をそのまま用いたのではタンパク質発現系を利用して本来のアミノ酸配列を持つタンパク質を生産することは困難である。例えばＴＧＡは、普遍コドンではストップコドンであるがミトコンドリアでは別のアミノ酸（Ｔｒｐ）のコドンとなっている。従って、ミトコンドリア内では正常に発現することができても、大腸菌などの通常の発現系で発現させた場合は、ストップコドンによって翻訳が進まなくなり、完全なタンパク質が得られない場合がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、酵母由来エンドヌクレアーゼの小サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子において、ミトコンドリアに固有のコドンを普遍コドンに置換することにより、特定の塩基配列を認識及び切断することができるエンドヌクレアーゼに改変し、かつ大量に発現させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼである。
【０００７】
さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質である。
（ａ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ） 配列番号３で表わされるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子である。
（ｃ） 配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ） 配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から塩基配列「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」を認識することができるエンドヌクレアーゼを採取することを特徴とする前記エンドヌクレアーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、酵母由来のエンドヌクレアーゼの小サブユニット（５０ｋＤａ）をコードするミトコンドリアゲノムＤＮＡを、大腸菌や酵母などのタンパク質発現系で大量発現できるようにすることを目的としており、この目的達成のため、本発明は、当該小サブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子においてミトコンドリア固有のコドンを普遍コドンに改変することを特徴とする。また、本発明は、２６塩基対の特定の塩基配列を認識し切断することができる、上記改変された小サブユニットに関するものである。
本発明のエンドヌクレアーゼ（酵母由来のエンドヌクレアーゼのうち５０ｋＤａのサブユニット；以下「Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ｋＤａ」ともいう）は、以下のようにして調製される。
【００１１】
１．変異アミノ酸の設計及び変異の導入
本発明において変異を導入するための対象となるエンドヌクレアーゼは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のエンドヌクレアーゼＳｃｅＩの小サブユニット又はサッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）由来のエンドヌクレアーゼＳｕｖＩの小サブユニットである。なお、ＳｃｅＩの小サブユニット及びＳｕｖＩの小サブユニットともに５０ｋＤａの分子量を有しているが、ＳｕｖＩのアミノ酸配列はＳｃｅＩのアミノ酸配列と比較して２箇所異なる点で両者は相違する（図６（ａ））。
ＳｃｅＩのサブユニット（５０ ｋＤａ）をコードする遺伝子（ＥＮＳ２という）はミトコンドリアゲノムにコードされているため、ミトコンドリアに固有の遺伝暗号を含む（表１）。
【００１２】
【表１】
ＥＮＳ２の塩基配列は公知であるが（特公平７−７７５５６号公報；Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））、ＥＮＳ２を普遍コードに従って大腸菌等の通常の発現系で発現させた場合、表１から分かるように、ＴＧＡはストップコドンであるためそれ以上翻訳が進まなくなる（例えば上記公報に記載のＥＮＳ２の塩基配列の９７〜９９番目はストップコドン「ＴＧＡ」である）。また、「ＡＴＡ」は普遍コードではＩｌｅのコドンであるのに対し、ミトコンドリアコードではＭｅｔのコドンである。
従って、ＥＮＳ２について通常の大量発現系を構築するためには、大腸菌などの通常の発現系で発現させたときのアミノ酸配列が、ミトコンドリアの発現系で発現させたときのアミノ酸配列と同一となるようにＥＮＳ２の遺伝暗号を改変する必要がある。従って、本発明においては、例えばミトコンドリアコードではＴｒｐとなるコドン（ＴＧＡ）を、普遍コードでＴｒｐに翻訳されるコドン（ＴＧＧ）に置換する（表１）。普遍コードではＩｌｅに翻訳されるコドンであるＡＴＡ、及び普遍コードではＬｅｕに翻訳されるコドンであるＣＴＡ又はＣＴＴについても同様である（表１）。但し、普遍コードでＩｌｅ又はＬｅｕをコードする他の縮重コドンは置換する必要はない。
【００１４】
以上の観点より、改変する候補となるアミノ酸は、ＳｃｅＩの小サブユニットのアミノ酸配列（４７６個）のうち、基本的に以下に示す３７箇所のアミノ酸である（図１、表２）。但し、サッカロミセス・ウバラム由来のエンドヌクレアーゼ（ＳｕｖＩ）については、図１中２１７番目のＧｌｙ及び３４６番目のＡｓｎをそれぞれＬｙｓ、Ａｓｐに置換し、合計３９箇所が改変されるようにする。なお、上記アミノ酸の３７箇所又は３９箇所すべてを置換する必要はなく、ミトコンドリア固有のコードで翻訳されなくとも後述する２６個の塩基（配列番号１）を認識することができる限り、置換箇所が３６箇所であっても、３５箇所以下であってもよい。
置換位置をまとめると以下の通りである（表２）。
【００１５】
【表２】
アミノ酸の置換を行うためには、当該アミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列を別の塩基配列に置換する方法（部位特異的突然変異誘発方法）が採用される。変異誘発法として、例えばＴ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２， ４８８−４９２ （１９８５））、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する１〜２本の改変用オリゴヌクレオチドを最高１６本のオリゴヌクレオチドに増やし、これらを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、あるいは、宝酒造社製のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドは、ＥＮＳ２の塩基配列（１４３１塩基対：Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１）； 特公平７−７７５５６号公報）を鋳型として、変異を導入する少なくとも１個の塩基を中心として前後８〜３０塩基程度（全体で１８〜６０塩基程度）の長さのものを設計し、合成する。なお、オリゴヌクレオチドは、通常の合成装置を用いた化学合成により得ることができる。
【００１８】
２．変異が導入されたエンドヌクレアーゼ遺伝子の調製
前記１．のようにして得られた各オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化し、ＥＮＳ２を鋳型として合成及びライゲーション反応を行う。これらの反応はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）等を用いて行うことができる。
得られたＤＮＡについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばファルマシア社製ＡＬＦ、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成により、あるいはＰＣＲにより本発明の遺伝子を得ることもできる。
【００１９】
配列番号２に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号３に本発明のエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を例示する。本発明のエンドヌクレアーゼは、天然のエンドヌクレアーゼの大サブユニットと結合することにより本来のエンドヌクレアーゼＳｃｅＩ又はＳｕｖＩとしての機能、すなわちコンセンサス配列「ＣＡＮＲＹＮＮＡＮＮＣＹＹＧＴＴＷ」及びその類似配列を認識する特徴を有する。但し、本発明のエンドヌクレアーゼは、天然のエンドヌクレアーゼの小サブユニットが単独で発揮する機能を失っておらず、「ＧＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＣＣ」（配列番号１）で表される２６塩基を特異的に認識することができるものである。
【００２０】
なお、本発明のエンドヌクレアーゼが上記２６塩基（配列番号１）を特異的に認識することができる限り、改変されたアミノ酸において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号３で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、前記３７又は３９箇所のアミノ酸すべてを改変しなくても、上記２６塩基（配列番号１）を認識することができる限り、本発明のエンドヌクレアーゼに含まれる。
【００２１】
ここで、「認識することができる」とは、本発明のエンドヌクレアーゼが遺伝子内の前記２６塩基を有する部位に結合し、当該２６塩基対の内部が２つの突出末端となるように遺伝子を切断する機能を有することをいう。
また、上記遺伝子（配列番号２）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件をいう。
【００２２】
４．組換えベクターの調製及び形質転換
（１） 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２３】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
（２） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ １１４、２０７−２１などが挙げられる。
【００２６】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ， Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９：２１１０−２１１４ （１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４： １８２−１８７ （１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７５： １９２９−１９３３ （１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ， Ｈ．：Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５３：１６３−１６８ （１９８３）］等が挙げられる。
【００２９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３０】
５．エンドヌクレアーゼの生産
本発明のエンドヌクレアーゼは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３１】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３２】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で１２〜１８時間行う。培養期間中、ｐＨは６．５〜７．５、好ましくは７．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００３３】
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のエンドヌクレアーゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりエンドヌクレアーゼを抽出する。また、本発明のエンドヌクレアーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のエンドヌクレアーゼを単離精製することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものでない。
〔実施例１〕デオキシウラシルを含む、ＳｃｅＩのサブユニットをコードする一本鎖鋳型ＤＮＡの調製
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニット遺伝子ＥＮＳ２（１４３１塩基対； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））の改変は上流側１．０ キロ塩基対と下流側０．４ キロ塩基対の２領域で平行して実施した。この目的のために５０ ｋＤａサブユニット遺伝子全長（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１））を含むＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ 断片（１６７１塩基対）と、５０ ｋＤａサブユニット遺伝子の下流を含んだＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片（５３４塩基対）をそれぞれファージミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）に別々にクローニングしてｐＥＮ１．７、ｐＥＮ０．５とし（図３）、これらを大腸菌ＣＪ２３６ （宝酒造社製）株に形質転換した。形質転換大腸菌株を３７℃で１２時間以上振とう培養して、前培養液とした。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む本培養用の２ｘＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９）） ２ ｍｌ に前培養液 ２０ μｌを加え、３７℃で１時間培養した。培地の体積の０．４％に当たるヘルパーファージ Ｍ１３ＫＯ７（２．０ｘ１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）；宝酒造社製）を加え、３７℃で１時間培養後、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１４時間培養した。この培養によって大腸菌から培地中に放出されたファージ粒子を次のようにして回収した。１．５ ｍｌの培養液をマイクロ遠心機で遠心分離し（１４，０００ ｒｐｍ， ５分）、上清を１．２ ｍｌ採取した後、同じ条件で再度遠心分離を繰り返して菌体を完全に除き、上清１．０ ｍｌを得た。これ以降のＤＮＡ の調製はＪ．サムブルックらの実験書（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））にまとめられているバクテリオファージＭ１３ファージのＤＮＡの精製法に従った。
【００３５】
〔実施例２〕部位特異的変異導入のためのオリゴヌクレオチドの合成
（１） 一本鎖の合成
５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子ＥＮＳ２はミトコンドリアゲノムにコードされているため、ミトコンドリアに固有の遺伝暗号を含む（表１）。ＥＮＳ２を通常用いられている大量発現系に供するためにはこれらの固有コドンを普遍的コードに対応するように置換する必要がある。本実施例では、Ｔ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２， ４８８−４９２ （１９８５））を改良して塩基の置換を行った。通常のクンケル法で使用する改変用オリゴヌクレオチドは１または２本であるが、以下に述べるように最高１６本のオリゴヌクレオチドを同時に使い、多部位での効率のよい置換を行った。
置換したい塩基を中心にして前後に１０から１５程度の塩基を持つ３３本のオリゴヌクレオチドを設計した（表３）。
【００３６】
【表３】
表３において、各配列の下に記載したカッコ書の塩基は、下線を施した配列に置換する前の塩基を表す。また、アルファベット小文字で表した塩基は、既に別のオリゴヌクレオチドで置換された塩基を表す。
オリゴヌクレオチドの長さは１８から５２塩基の範囲にあり、それぞれ１から最高で４残基の変異を含む。これらは ５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子の１４３１塩基対のうち５０塩基対、３７個のコドンを置換するのに用いた。後述のＤＮＡリガーゼ反応を可能にするためにオリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化した。リン酸化の反応液は以下の組成である。
【００３８】
──────────────────────────
１００ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
１０ ｍＭ 塩化マグネシウム
７ ｍＭジチオスレイトール
１ ｍＭ ＡＴＰ、１μＭ オリゴヌクレオチド
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１５単位）
──────────────────────────
全量３０μｌ
上記反応液について３７℃で１５分間リン酸化反応を行ったのち、７０℃、１０分で酵素を失活させた。
【００３９】
（２） 相補鎖の合成
（１）で得られたオリゴヌクレオチドを以下の手法により二本鎖とした。
アニーリング用緩衝液と伸長反応用緩衝液の組成は以下の通りである。
【００４０】
アニーリング用
────────────────────
２００ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
１００ ｍＭ塩化マグネシウム
５００ ｍＭ塩化ナトリウム
１０ ｍＭ ジチオスレイトール
────────────────────
伸長反応用
───────────────────────────
５０ ｍＭトリス−塩酸塩（ｐＨ８．０）
５ ｍＭ ジチオスレイトール
６０ ｍＭ酢酸アンモニウム
０．５ ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ（Ａ， Ｃ， Ｔ， Ｇ）
５ ｍＭ 塩化マグネシウム
１ ｍＭ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
───────────────────────────
【００４１】
アニーリング緩衝液１μｌ と０．２ ｐｍｏｌの鋳型用一本鎖ＤＮＡに蒸留水を加え全量を１０μｌ とした。このうち１μｌ を分注してリン酸化オリゴヌクレオチド溶液１μｌ と混合し、６５℃で１５分、次に３７℃で１５分静置して、オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせた。続いて２５μｌ 伸長用緩衝液、６０単位の大腸菌ＤＮＡ リガーゼ、１ 単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、２５℃で２時間静置して相補鎖の合成を行った。３μｌ の０．２ Ｍ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩（ｐＨ８．０）を加えて酵素反応を停止させた後、６５℃、５分の処理により酵素を失活させた。この反応液をそのまま以下の形質転換に使った。
【００４２】
〔実施例３〕形質転換
相補鎖合成後の二重鎖プラスミドＤＮＡに含まれる野生型のＤＮＡ鎖（ＣＪ２３６で作らせた一本鎖ＤＮＡ）の塩基配列を選択的に変異型に置き換えるため、大腸菌ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳ（宝酒造社製）を用いた。この大腸菌株の中では、ＣＪ２３６で作らせた一本鎖ＤＮＡに含まれるデオキシウラシルが酵素ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼにより分解された後、置換塩基を含んでいる方のＤＮＡ鎖を鋳型として再合成される（Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｔ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１， ６１−８７ （１９８２） ）。相補鎖合成した反応液を、ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳのコンピテント細胞を含む溶液１００μｌ に全て加えた。なお、大腸菌のコンピテント細胞はＨ．イノウエらの方法（Ｉｎｏｕｅ， Ｈ．， Ｎｏｊｉｍａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． Ｇｅｎｅ ９６， ２３−２８ （１９９０））に従って調製した。
さらに培地を加え、３７℃ １時間置いてから、ヘルパーファージ（前述）を３０μｌ 添加して更に３７℃で３０分間静置して感染させた。ここからヘルパーファージとプラスミドの両方を細胞内に含んだＢＭＨ７１−１８の培養液を４０μｌ分取して、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ｘＹＴ培地２ ｍｌに加え、３７℃で１６〜２０時間振とう培養してファージを産生させた。
【００４３】
遠心分離（１４，０００ ｒｐｍ， ５分）で菌体を除き、置換塩基を持つプラスミドの一本鎖ＤＮＡを取り込んだファージ粒子の上清を集めた。この上清２０μｌに１２時間以上培養したＭＶ１１８４株（宝酒造社製）の８０μｌを混合して３７℃で１０分間静置して、ファージから細胞内に一本鎖ＤＮＡを注入させた。取り込んだ一本鎖ＤＮＡを複製してプラスミドを持つようになったＭＶ１１８４株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））にまいて選択した。いくつかのクローンについて ５０ ｋＤａ サブユニット遺伝子の塩基配列を自動シークエンサーＡＬＦ（ファルマシア社）で調べ、所定の置換が導入されていることを確認した。なお、塩基配列解析のための蛍光プライマーはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）より購入した。また、ＤＮＡシークエンシング反応はサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７４， ５４６３−５４６７ （１９７７））に基づき、ファルマシア社のプロトコールに従って行った。
出発材料としたプラスミド ｐＥＮ１．７に対しては ９回の操作で４０箇所、ｐＥＮ０．５に対しては４回の操作で１０箇所の塩基置換を施した。全ての置換が確認できた時点でＰｓｔＩ切断部位の上流と下流をつなげて、置換の完了した５０ ｋＤａサブユニットをコードする本発明の遺伝子を得た（図４、配列番号２）。
【００４４】
〔実施例４〕 ５０ ｋＤａ サブユニットの発現プラスミドの構築
５０ ｋＤａサブユニット改変遺伝子を発現誘導用のベクターにつなげるのを容易にするため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により改変遺伝子の５’端と３’端それぞれに制限酵素切断配列の導入を行った。反応はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、同社のプロトコールに従って行った。使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣ−３’（配列番号４）
５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’（配列番号５）
【００４５】
下線部はそれぞれ新たに導入したＢａｍＨＩ， ＳａｌＩの認識配列である。連結反応は９４℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分間の反応を１サイクルとして２５サイクル行った。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ 断片（１４４７塩基対）はアガロース（０．８％）ゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９））で分離後、エチジュウムブロマイド染色して確認した。この断片をアガロースゲルよりジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）キット（ＢＩＯ１０１社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、 ＵＳＡ）を用いて回収した。
回収したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理した後、プラスミドｐＲＳＥＴ （インビトロジェン社）及びｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）にサブクローニングしそれぞれｐＳＣ５０ 、ｐＴＺＳＣ５０とした。ｐＳＣ５０ は発現誘導に用いた。ｐＴＺＳＣ５０は蛍光プライマーを用いたＤＮＡシークエンシング（前述）を行いＰＣＲの過程で余分な変異が入っていないことを確認した。
【００４６】
〔実施例５〕 ５０ ｋＤａ サブユニットの発現誘導
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（インビトロジェン社）のコンピテント細胞に発現プラスミドｐＳＣ５０を導入した。この形質転換細胞をアンピシリン（１５０ μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８９） ）中、３７℃で終夜、振とう培養して前培養を行った。本培養の体積の４％に当たる前培養液を遠心分離（２５００ ｘｇ、１０分）にかけて菌体を集めた。この沈澱を少量の新しい培地にけん濁させ、本培養の液体培地に加えた。６００ナノメートル（ｎｍ）における濁度（ＯＤ６００ ）が約 ０．５になるまで振とう培養（３７℃）をした後、培養温度を１８℃に下げて振とう培養を続けた。ＯＤ６００ が約 ０．８になった時点で培養液にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ ｍＭになるように加えて５０ｋＤａサブユニットの発現誘導を開始した。１８℃でさらに１２時間、振とう培養を行った後、大腸菌を遠心分離で集菌し、液体窒素を用いて急速冷凍してから−８０℃に保存した。
【００４７】
〔実施例６〕大腸菌からの５０ ｋＤａサブユニットの精製
−８０℃で保存した菌体を室温で融解させ、その後の操作は４℃又は氷上で行った。培養量１００ ｍｌ当たり４ ｍｌのバッファーＡ（２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ ８．０） ５００ ｍＭ 塩化ナトリウム、５ ｍＭイミダゾール、１ ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオダイド（シグマ・アルドリッチジャパン社、東京、日本）、０．１％ ＮＰ−４０（ナカライテスク社、京都、日本）に菌体をけん濁させた。これを液体窒素で急速冷凍した後、流水中で融解させることによって大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液中のＤＮＡを断片化させるため、このけん濁液を、超音波破砕機（ＵＲ−２００Ｐ、トミー精工、東京、日本）の最大出力で、３０秒間、５回処理した。
【００４８】
処理液を３９，０００ ｘｇ で ２０分、４℃の条件で遠心分離し、得られた上清を０．４５μｍのマイレックスフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）で濾過した。この試料を、バッファーＡで平衡化したプロボンド（Ｐｒｏｂｏｎｄ）ニッケルキレート樹脂（インビトロジェン社）を充填したカラム（φ１０ ｍｍ、 ２．０ ｍｌ）に重層後、バッファーＡ ２０ ｍｌ（樹脂の１０倍の体積）で洗った。６０ ｍＭのイミダゾールを含むバッファーＡ １２ｍｌ（樹脂の６倍の体積）で更に洗浄後、６０ ｍＭから５００ ｍＭへのイミダゾールを含むバッファーＡの濃度勾配（総量８０ ｍｌ）で溶出を行った。得られた溶出画分は１０％アクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０−６８５ （１９７０））に供し、クマシーブリリアントブルー染色によって ５０ ｋＤａサブユニットの存在を確認した。５０ ｋＤａサブユニットを含む画分はバッファーＢ（２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、３００ ｍＭ塩化ナトリウム、１ ｍＭエチレンジアミンテトラ四酢酸ナトリウム塩、１ ｍＭジチオスレイトール）に対して透析した。精製タンパク質の定量はプロテインアッセイ試薬（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、 ＵＳＡ）を用い、同社のマイクロアッセイ法によって行った。標準蛋白質として牛血清アルブミン溶液（シグマ・アルドリッチジャパン社）を用いた。その結果、２５ｇ（湿重量）の菌体より３００μｇの精製タンパク質が得られた。
【００４９】
〔実施例７〕エンドヌクレアーゼ活性の測定
５０ ｋＤａサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性測定のための基質は以下のようにした調製した。Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ が細胞内で切断することが明らかとなっているミトコンドリアＤＮＡ 上のオリ２（ｏｌｉ２）領域を含んだ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片（１６７１塩基対； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１， ２７０７−２７１５ （１９９２））を、ファージミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にサブクローニングしｐＹ６７３Ｌとした（図２）。対照用ＤＮＡ 基質としてプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を使用した。ｐＹ６７３ＬとｐＢＲ３２２は、これを用いて作製した形質転換大腸菌より抽出した後、キアゲンカラム（キアゲンジャパン社、東京、日本）を用いて高度に精製した。
５０ ｋＤａサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性測定に用いた反応液の組成は次の通りである。
【００５０】
────────────────────────────────────
５０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）
５０ ｍＭ 塩化ナトリウム
１０ ｍＭ 塩化マグネシウム
１ ｍＭジチオスレイトール
２５ ｎｇ 基質ＤＮＡ（ｐＹ６７３ＬまたはｐＢＲ３２２を制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたもの
（図２））
０．４ から ６０ ｎｇまでの５０ ｋＤａサブユニット
────────────────────────────────────
総体積 ３０μｌ
【００５１】
ＤＮＡ切断反応は３７℃で３０分行った後、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩とドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度がそれぞれ、１０ ｍＭと０．３ ％ になるように加えて反応を停止した。切断されたＤＮＡはそのまま、あるいはフェノール抽出、エタノール沈殿による濃縮を施した後、０．８ ％アガロース電気泳動に供した。
泳動後にゲルをエチジウムブロマイド（シグマ・アルドリッチジャパン社）またはサイバーグリーン（宝酒造社製）で染色して、ＤＮＡの切断を確認した。ＤＮＡ の検出にはＦＭ ＢＩＯイメージング装置（宝酒造社製）を用い、ＤＮＡの切断を定量化した。
【００５２】
〔実施例８〕配列特異的エンドヌクレアーゼ活性の検出
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ二量体は、ミトコンドリアＤＮＡ上のオリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内において、コンセンサス配列と類似した２６塩基対を認識して細胞内及び試験管内で切断する（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１， ２７０７−２７１５ （１９９２））（図２）。精製した Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩの５０ ｋＤａサブユニットは、単独で特定配列（配列番号１）を切断した。
基質にオリ２（ｏｌｉ２）を含むプラスミドｐＹ６７３Ｌを使った場合、５０ ｋＤａサブユニットによってオリ２（ｏｌｉ２）の特異的切断が確認された（図５ａ）。図５ａ中、レーン１〜８はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを０．５、１．０、２．０、４．０、８．０、１６．０、３２．０、６４．０ｎｇ用いた結果である。５０ ｋＤａサブユニット６４ ｎｇ によって反応液中のｐＹ６７３Ｌ（２５ ｎｇ）の６０％が３７℃で３０分以内に配列特異的に切断され、３．４キロベースと１．４キロベースのＤＮＡ断片が出現した。
【００５３】
一方、基質にプラスミドｐＢＲ３２２を使った場合は、５０ ｋＤａサブユニットによるＤＮＡの切断を受けず、切断断片は検出されなかった（図５ｂ）。図５ｂ中、レーン１〜７はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを２．３、４．５、９．０、１８．０、３６．０、７２．０、１４４ｎｇ用いた結果である。過剰量（２００ ｎｇ）の ５０ ｋＤａ サブユニットを用いた場合でもｐＢＲ３２２及びその他のＤＮＡ（オリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内の特定配列（２６塩基対）を含まない出芽酵母株のミトコンドリアＤＮＡ（８０キロ塩基対）、大腸菌ファージλＤＮＡ （４７キロ塩基対）、枯草菌ファージφ１０５ＤＮＡ（３８キロ塩基対））は全く切断されなかった。
【００５４】
〔実施例９〕サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）の持つ５０
ｋＤａサブユニットの大量生産とその活性の検出
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の持つＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの相同蛋白質Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットがサッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）に存在する（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｋ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ， Ｎ．， ａｎｄ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １９７７−１９８４ （１９９１） ）。両サブユニットとも４７６アミノ酸残基から構成されているが、二カ所でアミノ酸が異なっている。Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩとＥｎｄｏ．ＳｕｖＩの５０ｋＤａサブユニットのアミノ酸配列の違いを図６ａに示す。
【００５５】
Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの改変遺伝子をさらに二カ所改変してＥｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットの大量発現用遺伝子を作製した。Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットアミノ酸に置き換えるために使用したオリゴヌクレオチドを図６ｂに示す。なお、図６ｂのカッコ内の塩基は、Ｅｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットの塩基配列に相当する。この目的のため新たに二種のオリゴヌクレオチドを合成し、前述の遺伝子改変法に従って変異を導入した。得られた変異はＤＮＡシークエンシングによって確認した。改変遺伝子はｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン社）にサブクローン化した後、形質転換法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓに導入した。
Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットの誘導発現とその精製は前述のＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニットに適用した方法に従った。これにより精製されたＥｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットを用いてｐＹ６７３Ｌの特異的切断を行った。
【００５６】
その結果、Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットはｐＹ６７３Ｌ上のＥｎｄｏ．ＳｃｅＩ ５０ ｋＤａサブユニット切断部位を同程度の効率で配列特異的に切断した（図７ａ）。
一方、プラスミドｐＢＲ３２２は全く切断を受けず（図７ｂ）、その他のＤＮＡ（オリ２（ｏｌｉ２）遺伝子領域内の特定配列（２６塩基対）を含まない出芽酵母ミトコンドリアＤＮＡ、枯草菌ファージφ１０５ＤＮＡ及び大腸菌ファージλＤＮＡ）も、Ｅｎｄｏ．ＳｕｖＩ ５０ ｋＤａサブユニットによって切断されなかった。
なお、図７ａ及びｂにおいて、レーン１〜７はそれぞれ５０ ｋＤａサブユニットを２．３、４．５、９．０、１８．０、３６．０、７２．０、１４４ｎｇ用いた結果を表す。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、特定の塩基配列を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼ、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該エンドヌクレアーゼの製造方法が提供される。本発明のエンドヌクレアーゼは、２６塩基の特定の配列を認識することができるため、遺伝子工学、生化学の分野においてプラスミドから染色体に至る広い範囲のＤＮＡの改変やマッピングに利用できる点で有用である。
【００５８】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ＤＮＡ
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３１：合成ＤＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
配列番号３５：合成ＤＮＡ
配列番号３６：合成ＤＮＡ
配列番号３７：合成ＤＮＡ
配列番号３８：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】エンドヌクレアーゼの改変前後のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】プラスミドｐＹ６７３Ｌの構築図である。
【図３】プラスミドｐＥＮ１．７及びｐＥＮ０．５の構築図である。
【図４】普遍コードに改変したＳｃｅＩの５０ｋＤａサブユニット遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図５】改変したＳｃｅＩの５０ｋＤａサブユニットの配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を示す電気泳動写真である。
【図６】サッカロミセス・ウバラムの５０ｋＤａサブユニットの置換部位及び置換に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図７】サッカロミセス・ウバラムの５０ｋＤａサブユニットの配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を示す電気泳動写真である。
Claims (1)
- 塩基配列「GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC」を含むDNAを切断する方法であって、以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a) 配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
(b) 配列番号３で表わされるアミノ酸配列において217番目のGlyがLysに、346番目のAsnがAspに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
を前記DNAと反応させて、前記DNAが塩基配列「GCCCAGACATATCCCTGAATGATACC」の内部で特異的に切断されるようにすることを特徴とする、前記方法。
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