WO2007046556A1 - 新規dnaポリメラーゼ - Google Patents

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WO2007046556A1
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amino acid
seq
acid sequence
dna
protein
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PCT/JP2006/321455
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshihide Hayashizaki
Masayoshi Itoh
Yoshimi Benno
Alexander Lezhava
Original Assignee
Riken
Kabushiki Kaisha Dnaform
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a novel DNA polymerase derived from Bacillus smithii having strand displacement activity.
  • DNA polymerase is one of the most versatile enzymes in life science
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2978001 Disclosure of Invention
  • the present invention is a novel DNA polymerase obtained from Bacillus smithii JCM9076, and an object thereof is to provide a DNA polymerase having new characteristics such as optimum reaction conditions such as optimum temperature and enzyme activity.
  • the present inventor has isolated a novel pol type I DNA polymerase having normal cocoon type-dependent DNA replication enzyme activity, complementary strand displacement replication activity and reverse transcriptase activity from Bacillus smithii.
  • the present inventors have found that DNA polymerase has superior characteristics as compared with conventional DNA polymerase, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a pol I DNA polymerase that is a protein of any one of (a) to (f) below and has DNA polymerase activity.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 was deleted from the amino acid sequence which is a continuous amino acid sequence starting from the first Val and any amino acid up to the 297th G] u.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence
  • a protein consisting of an amino acid sequence which is a continuous amino acid sequence starting from the first Val and lacking any amino acid sequence up to the 297th Glu from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • a DNA encoding a protein having DNA polymerase activity which is the following DNA (g) to (j):
  • a recombinant vector comprising 1) of [2] or [3].
  • [6] A method for producing a porpoise-type DNA polymerase, comprising culturing the transformant according to [5] and collecting pol I-type DNA polymerase from the obtained culture.
  • [1 1] A nucleic acid amplification method using the pol I DNA polymerase according to any one of [1] and [7] to [10]. .
  • [1 2] The nucleic acid amplification method according to [1 1], which is an isothermal amplification method.
  • a nucleic acid amplification kit comprising the pol type I DNA polymerase according to any one of [1] and [7] to [10].
  • a method for cloning a pol I DNA polymerase gene comprising:
  • a primer comprising a DNA fragment according to [2] or [3], comprising 5 to 50 bases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measurement of awake polymerase activity, and shows a regression line between the amount of DNA polymerase and the measured value.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measurement of complementary strand displacement replication activity using the enzyme of the present invention (BsmDNA polymerase).
  • FIG. 3 shows the results of measuring the reverse transcriptase activity using the enzyme of the present invention (BsmDNA polymerase).
  • FIG. 4 shows the results of reverse transcriptase activity measurement (examination using a ladder) using the enzyme of the present invention (BsmDNA polymerase).
  • FIG. 5 shows the results of isothermal gene amplification using the enzyme of the present invention (BsmDNA polymerase).
  • FIG. 6 is a diagram showing the positional relationship between the template sequence and the primer in isothermal gene amplification. '' Best mode for carrying out the invention
  • the DNA polymerase of the present invention can be isolated from microorganisms belonging to the genus Bacillus, preferably from Bacillus smithii, more preferably from Bacillus smithii JCM9076 strain.
  • Bacillus smithii JCM9076 can be sold from the Department of Microbial Materials Development, RIKEN BioResource Center (http://www.jcm.riken.jp/JCM/JCM_Home_E.html) 0
  • DNA is obtained from J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (1989): Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring. Harbor and aboratory Press and Ed Harlow and David Lane (1988): Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc., and can be obtained according to methods well-known in the literature.
  • the DNA encoding the pol I type DNA polymerase of the present invention is prepared by comparing the DNA sequences of known pol I type DNA polymerases, synthesizing primers based on the base sequence of the conserved region having a common sequence, Using a primer, Bacillus genus microorganisms can be isolated as a material. In addition, phoR is conserved upstream of the gene encoding pol I-type DNA polymerase of Bacillus genus microorganisms, and mutM is conserved downstream. Based on the sequence of the conserved part. Primers can be designed. The gene is amplified by PCR using the primer.
  • the amplified product can then be cloned, sequenced, and further amplified using a primer pair designed to sandwich the 0RF portion.
  • a primer pair designed to sandwich the 0RF portion.
  • the base sequence at the position corresponding to the N-terminus of the Klenow fragment of Escherichia coli is used as one of the primers.
  • the present invention includes a method for isolating pol type I DNA polymerase from a microorganism using the above primer.
  • a primer to be used for example, there is a primer pair consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 designed based on the sequence of the conserved region.
  • a primer pair consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 as a primer sandwiching the 0RF portion of the type I DNA polymerase, and a primer used for isolating the portion corresponding to the Klenow fragment.
  • Microorganisms are not limited, and include not only Bacillus genus microorganisms but also broadly bacteria.
  • To isolate pol I DNA polymerase from a microorganism prepare a primer pair corresponding to the sequence of the conserved region, prepare a cocoon genomic DNA from the microorganism, amplify the cocoon genomic DNA using the primer, The amplified fragment is cloned, and the pol I DNA polymerase gene is amplified using a primer pair sandwiching the portion corresponding to 0RF or the Clenow fragment, and a pol I DNA polymerase expression plasmid is constructed and expressed. That's fine.
  • the present invention provides a microorganism-derived pol I type DNA polymerase obtained as described above. And DNA encoding the polymerase.
  • the pol type I polymerase of the present invention has a normal cocoon type-dependent DNA replication enzyme activity, complementary strand displacement replication enzyme activity, and reverse transcriptase activity. Further, it may have 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity. The advantage of having 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity is that there are few errors when incorporating the substrate.
  • the optimum temperature of the pol type I DNA polymerase of the present invention is lower than that of a known DNA polymerase having complementary strand displacement replication enzyme activity, and has activity at 50 to 60 ° C, preferably 50 to 55 ° C.
  • the DNA polymerase of the present invention can be used under reaction conditions at a lower temperature than a conventional DNA polymerase having complementary strand displacement replication enzyme activity, and can be used at a temperature closer to room temperature.
  • it since it has reverse transcription activity, it can synthesize DNA using RNA as a saddle and can be used as an alternative to conventional RT-PCR.
  • the present invention includes a protein that is a Pol I type DNA polymerase obtained as described above, and a DNA encoding the polymerase.
  • -SEQ ID NO: 6 exemplifies the base sequence of DNA encoding the pol I type DNA polymerase of the present invention
  • SEQ ID NO: 7 exemplifies the amino acid sequence of the pol I type DNA polymerase of the present invention.
  • the present invention also includes ⁇ pol type I DNA polymerase from which the N-terminal amino acid of pol type I DNA polymerase has been deleted and the DNA encoding the same.
  • the number of amino acids on the N-terminal side to be deleted is not limited as long as ⁇ pol type I DNA polymerase has complementary strand displacement replication enzyme activity.
  • the ⁇ pol-type DNA polymerase is deficient in 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity and has activity corresponding to the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I.
  • ⁇ Pol type I DNA polymerase is a continuous amino acid sequence starting from the first Val of the amino acid sequence of Pol I type DNA polymerase represented by SEQ ID NO: 7, and any of the amino acids up to 297th Glu The amino acid sequence up to the amino acid is deleted.
  • the ⁇ pol type I DNA polymerase corresponding to the Klenow fragment is a 297-residue amino acid from the first Val to the 297th Glu of the amino acid sequence of the Pol I DNA polymerase represented by SEQ ID NO: 7. It has been deleted.
  • SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence encoding ⁇ pol I type DM polymerase corresponding to the Klenow fragment
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of ⁇ pol I type DNA polymerase corresponding to the Klenow fragment. That is, the protein of the present invention has SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence shown in No. 7 is a continuous amino acid sequence starting from the first Val, and the amino acid sequence up to any one of the amino acids up to the 297th Glu is deleted. It also includes proteins having replication enzyme activity.
  • the protein lacks 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity when the number of amino acid deletions is large. In this case, there is an advantage that the amplification product is not degraded during gene amplification.
  • the present invention includes a pol I type DNA polymerase, a protein lacking 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity, and a DNA encoding the protein.
  • Pol I-type DNA polymerase with 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity degrades the 3 'side of the primer, thus slowing the nucleic acid amplification rate S.
  • pol I type DNA polymerase lacking 3 ' ⁇ 5' exonu. Clease activity has the advantage of increasing the nucleic acid amplification rate because it does not degrade the primer.
  • the primer when detecting mutations in DNA, using a Pol I DNA polymerase with 3 ' ⁇ 5' exo-clease activity, the primer recognizes the mutation site because the 3 'side of the primer is degraded. The extension synthesis reaction proceeds and mutation detection cannot be performed. On the other hand, when using Pol I DNA polymerase lacking 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity, the primer is not degraded, so the extension synthesis reaction can be stopped without primer annealing at the mutation site. It has the advantage that it can detect mutations 1].
  • DNA is also included in the DNA of the present invention.
  • a DNA encoding a protein having type I DNA polymerase activity but lacking 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity is also included in the gene of the present invention.
  • the stringent conditions are, for example, using a filter to which DNA is immobilized, performing hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, and then 0.1 to 2 times.
  • Concentrated SSC solution single concentration SSC consists of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) Les, conditions that can be identified by washing at 68 ° C.
  • the DNA encoding the pol I DNA polymerase of the present invention has a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and at least 80% or more when calculated under the default conditions using BLAST etc.
  • It also includes DNA consisting of a base sequence that codes for a protein that has activity but lacks 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity.
  • RNA having the activity of pol I-type DNA polymerase or pol I-type DNA polymerase which is RNA that can be hybridized under stringent conditions with RNA against the above-mentioned DNA
  • RNAs encoding proteins lacking 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity are also included in the present invention.
  • a degenerate variant of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8 is also included in the DNA of the present invention. .
  • a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a similar method, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example,? Mutant-K (TAKARA) and Mutant-G (TAKARA)) can be used.
  • TAKARA Mutant-K
  • TAKARA Mutant-G
  • the present invention relates to a protein comprising an amino acid sequence having a deletion, substitution or addition mutation in one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, A protein having polymerase activity, a protein consisting of an amino acid sequence having a deletion, substitution, or addition mutation in one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and having a Pol I type
  • the present invention is a continuous amino acid sequence starting from the first Val from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, wherein the amino acid sequence is deleted from the amino acid sequence up to any amino acid up to the 297th Glu. 1 piece Alternatively, it includes a protein having an amino acid sequence having deletion, substitution or addition mutations in several amino acids and having pol I DNA polymerase activity. The protein may lack or retain 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity.
  • a deletion, substitution or addition of one or several amino acids refers to a deletion, substitution or addition of 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • the present invention includes DNA encoding a protein comprising the above amino acid sequence.
  • the present invention includes primers and probes used to isolate DNA polymerase from microorganisms.
  • the primer or probe is a fragment of the above DNA, and the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 25.
  • the length of the base sequence to be amplified is not limited.
  • the DNA encoding the pol type I DNA polymerase of the present invention and a mutant thereof into an expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, and culturing the host cell, the pol type I DNA A polymerase can be obtained.
  • DNA encoding GST or DNA encoding hexahistidine may be ligated as appropriate.
  • any vector can be used as long as it can replicate in a host cell such as a plasmid, a phage, or a virus.
  • Escherichia coli plasmids such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, ⁇ , and pCFM536, Bacillus subtilis plasmids such as pUBl lO, yeast plasmids such as pG-1, YEpl3, and YCp50, gtll0, ⁇ , etc.
  • vectors for mammalian cells include viral DNAs such as baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, SV40 and its derivatives.
  • the vector contains an origin of replication, a selectable marker, and a promoter, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyaduration signal, and the like as necessary.
  • the promoter may be any promoter as long as it is efficiently expressed in the host cell, and examples thereof include SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • Host cells include bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Fungi cells such as Rugillus strain, yeast cells such as baker's yeast, methanol-utilizing yeast, insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9, HEK293T, HeLa cells, SH-SY5Y,
  • Examples include mammalian cells such as CH0, C0S, BHK, 3T3, and C127.
  • Transformation can be performed by a known method such as a calcium chloride method, a calcium phosphate method, a DEAE-dextran-mediated transfection method, or an electroporation method.
  • the isolation and purification of pol I DNA polymerase can be performed by any of the common biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Or it can carry out by using combining suitably.
  • the invention also includes antibodies to pol I type DNA polymerase.
  • the antibody includes both a polyclonal antibody and a monoclonal antibody. Antibodies can be produced by known methods.
  • An antibody also includes a functional fragment.
  • the functional fragment of an antibody means any molecule that retains the variable part of an antibody molecule including (Fab) 2 fragment and (Fab) fragment.
  • the obtained antibody can be used, for example, for purification of the pol I type DNA polymerase of the present invention. .
  • the present invention includes a method of amplifying a nucleic acid using the pol I type DNA polymerase of the present invention.
  • Known PCR methods polymerase chain reaction method
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction method
  • Mitani method W001 / 030993 international pamphlet
  • LAMP LAMP
  • RNA polymerase Transcription Concerted Reaction
  • NASBA NucJeic acid sequence based amplification
  • Japanese Patent No. 2650159 Japanese Patent No. 2650159
  • It can be used in any method of type DNA polymerase. Among these, it is suitable for isothermal amplification methods such as Mitani method, LAMP method, SDA method, and ICAN (registered trademark) method.
  • the pol I type DNA polymerase of the present invention can be used in place of the conventionally used DNA polymerase.
  • the present invention includes a nucleic acid amplification kit using the pol I type DNA polymerase of the present invention.
  • the kit is a kit adapted to any of the nucleic acid amplification methods described above.
  • the kit includes other Pol I type DNA polymerase of the invention comprises a primer, dNTP, Tris- HC1, HC1, MgS0 4, and betaine.
  • Genomic DNA was prepared from cultured cells by a conventional method.
  • primers PhoF (SEQ ID NO: 1) and MutR (SEQ ID NO: 2) are conserved from the conserved region of each gene.
  • PCR was carried out using the prepared genomic DNA as a cage and PhoF and MutR as primers to amplify the gene.
  • the amplified fragment was cloned with pGEM-T manufactured by Promega, and the internal sequence was determined by a conventional method.
  • the 0RF portion which was thought to be polA, was amplified by PCR with Bsth-EcoNF (SEQ ID NO: 3) and Bsth-SalCR (SEQ ID NO: 4).
  • the obtained PCR product and pUC18 were digested with EcoRI and Sail, mixed and ligated to construct a Bsm DNA polymerase I expression plasmid.
  • PCR was amplified with Bsth-EcoLF (SEQ ID NO: 5) and Bsth-SalCR (SEQ ID NO: 4) corresponding to the N-terminal position of the E. coli Klenow fragment of polA.
  • the obtained PCR product and pUC18 were erased with EcoRI and Sail, mixed and ligated to construct a ⁇ Bsm DNA polymerase expression plasmid.
  • Aspergillus XL1-Blue was cultured in 5 ml of LB medium containing 100 / g / ml ampicillin at 37 ° C overnight to prepare a preculture. Inoculate 5 ml of the obtained preculture solution into 500 ml of LB medium containing 100 ig / ml ampicillin and shake at 37 ° C and 200 rpm. Culturing (Orbital Shaking Incubator, FIRSTEK OSI-502LD) was performed. ImM IPTG was added when the 0D600nm value was around 0.5. Further, shaking culture was performed at 37 ° C and 200 rpni for 1 to 2 hours.
  • the obtained culture solution was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 4,000 ⁇ g for 10 minutes to obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate was suspended in 30 ml of IX PBS, and centrifuged again at 4,000 ⁇ g for 10 minutes to wash the cells.
  • the obtained precipitate was suspended in 25 ml of IX PBS, and the cells were disrupted with 10 sec ⁇ 6 ultrasonic waves (MISONIX-Astrason Ul trasonic processor XL).
  • the sample after sonication was centrifuged at 15,000 X g for 30 minutes to obtain a supernatant.
  • Ion exchange chromatography was performed using AKTA Prime high performance liquid chromatography system manufactured by GE Healthcare and HiTrap Q, a strong anion exchange column manufactured by GE Healthcare.
  • As a running buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 2 mM EDTA, lOmM 2-mercaptoethanol was used. After equilibrating the column at a flow rate of 1 ml / min and applying the crude extract, the non-adsorbed fraction was washed with the same running buffer. The adsorbed fraction was eluted with a gradient of 0 to 1M sodium chloride at about 15 CV.
  • the eluted fraction was fractionated every lml, and this was subjected to SDS-PAGE to confirm the protein.band of the corresponding molecular weight, and then the f fraction having the same band was recovered.
  • the recovered fraction was concentrated and desalted using an ultrafiltration membrane to obtain an anion exchange fraction.
  • Heparin affinity column chromatography was performed using the AKTA Prime high performance liquid chromatography system manufactured by GE Healthcare and HiTrap Heparin. The same solution used in the anion exchange column chromatography was used as a running buffer. After equilibrating the column at a flow rate of 1 ml / min and applying the anion exchange fraction, the non-adsorbed fraction was washed with the same running buffer. The adsorbed fraction was eluted with a 0 to 1M sodium chloride concentration gradient of about 22 CV. The eluted fraction was fractionated every 1 ml, and this was subjected to SDS-PAGE to confirm the protein band of the same molecular weight, and then the fraction having the same band was recovered. The collected fraction was subjected to buffer replacement with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 0.2 M sodium chloride using an ultrafiltration membrane, and further concentrated to obtain a heparin fraction.
  • buffer replacement 50 mM Tris-HCl (pH
  • Gel filtration column chromatography was performed using an AKTA 10XT high performance liquid chromatography system manufactured by GE Healthcare and a gel filtration column HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade manufactured by GE Healthcare.
  • As the running buffer 50 mM Tris-HC1 ( PH 8.0) and 0.2 M sodium chloride were used.
  • the column was equilibrated at a flow rate of 1 ml / min, the heparin fraction was applied, and then eluted with the same running buffer.
  • the eluted fraction was fractionated every lml and subjected to SDS-PAGE to confirm the protein band of the corresponding molecular weight, and then the fraction having the same band was collected.
  • the collected fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane, and the storage buffer (50 mM lithium chloride, 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), ImM DTT, 0.1 lmM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% glycerol) was replaced with a buffer, and this was used as a purified enzyme preparation. -3. DNA polymerase activity measurement
  • DNA polymerase activity was measured using Picogreen dsDNA quantitative reagent manufactured by Invitrogen Corporation with reference to Biotechniques 21, 664-668 (1996).
  • Picogreen dsDNA quantification reagent with TE buffer to a ratio of 1: 345, add 173 ⁇ ⁇ to M13mpl8—mixed DNA / primer, dNTP, and purified enzyme preparation mixture 27/1, After standing at room temperature for 5 minutes, fluorescence was measured at an excitation wavelength of 480 nm and a measurement wavelength of 520 nm.
  • a commercially available Klenow fragment with a known unit was measured in the same manner, and the enzyme unit as a relative value was calculated from the measured value. An example of measurement is shown below.
  • the reverse transcriptase activity was measured and the reaction product was detected.
  • the reverse transcription reaction was also carried out in the same manner using an RNA ladder (0.24-9.5 kb) manufactured by Invitrogen Corp., and the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the reaction product was detected by autoradiography. .
  • Amplification conditions 60 ° C, 90 minutes
  • Reaction solution (in 25 1) Tri s—HCl (20 mM, pH8.8), KCl (10 mM), (NH 4 ) 2 S0 4 (l OmM), SYBR green (0. 01 ⁇ 1 / ml), 8 mM MgS0 4 ; 0.1% Tween 20; 0.5M 'betaine; 1. 4mM dNTP; 4 units of Bsm or Bst DNA polymerase and 40ng human genomic DNA.
  • the primers used were as follows.
  • the underlined part is the primer region, and the loop primer is surrounded by a frame.
  • the DNA polymerase of the present invention can be used at a temperature closer to room temperature because it has activity under reaction conditions at lower temperatures than a conventional DNA polymerase having strand displacement activity.
  • it since it has reverse transcription activity, it can synthesize DNA using RNA as a saddle and can be used as an alternative to conventional RT-PCR. '

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Abstract

　Bacillus smithii JCM9076から得られた新規のDNAポリメラーゼであり、最適温度などの最適反応条件，酵素活性，などの新しい特徴をもったDNAポリメラーゼの提供。　以下の(a)から(f)のいずれかのタンパク質であり、かつDNAポリメラーゼ活性を有するポルI型DNAポリメラーゼ。(a) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質(b)配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質(c) 配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質(d) 配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質

Description

新規 DNAポリメラーゼ
技術分野
本発明は、鎖置換活性を有する Bacil lus smithi i由来の新規な DNAポリメラー ゼに関する。 明
背景技術 .
DNA ポリメラーゼはライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つである 書
PCR法をはじめとして種々の技術に必須の酵素であり、 数多くの種類の DNAポリ メラーゼが販売され、 それぞれのポリメラーゼは反応条件、 酵素活性について特 徴を持っている。 DNAの増幅技術としては、 PCR法が一般的に利用されている力 複雑な温度制御が必要なためサーマルサイクラ一が必要であること、 時間が数時 間かかることなどの問題点があつた。 PCR法に代わる DNAの増幅技術として、 LAMP 法や SDA法などが開発されてきたが、 これらの反応には鎖置換活性を持った DNA ポリメラーゼが必須である。 鎖置換活性を持った DNAポリメラーゼについての報 告もあるが （特許文献 1参照）、現在市場で入手できる種類は少なく至適温度など の反応条件が限ら: る、あるいは反応時間が長いなどの理由により、これらの DNA 増幅方法を用いる検査 ·診断薬などの開発にも制限となっていた。
特許文献 1 特許 2978001号公報 発明の開示
本発明は、 Bac i l lus smithi i JCM9076から得られた新規の DNAポリメラ一ゼで あり、 最適温度などの最適反応条件、 酵素活性などの新しい特徴をもった DNAポ リメラーゼの提供を目的とする。
DNA ポリメラーゼはライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つである t
PCR法をはじめとして種々の技術に必須の酵素であり、 数多くの種類の DNAポリ メラーゼが販売され、 それぞれのポリメラーゼは反応条件、 酵素活性について特 徴を持っている。 DNAの増幅技術としては、 PCR法が一般的に利用されている力 複雑な温度制御が必要なためサーマルサイクラ一が必要であること、 時間が数時 間かかることなどの問題点があった。 PCR法に代わる DNAの増幅技術として、 LAMP 法や SDA法などが開発されてきたが、 これらの反応には鎖置換活性を持った DNA ポリメラーゼが必須である。 鎖置換活性を持った DNAポリメラーゼは、 現在市場 で入手できる種類は少なく至適温度などの反応条件が限られる、 あるいは反応時 間が長いなどの理由により、 これらの DNA増幅方法を用いる検査 ·診断薬などの 開発にも制限となっていた。
本発明者は、 Baci l lus smithi i より通常の铸型依存性の DNA複製酵素活性、 相 補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する新規なポル I型 DNAポリメ ラーゼを単離し、 該 DNAポリメラーゼが従来の DNAポリメラーゼに比べ優れた特 性を有することを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[ 1 ] 以下の（a)から（f)のいずれかのタンパク質であり、 かつ DNAポリメラーゼ 活性を有するポル I型 DNAポリメラ一ゼ。
(a) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号 9で考わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号 7に表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した ァミノ酸配列であって 297番目の Gl uまでのいずれかのァミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(f) 配列番号 7に表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した ァミノ酸配列であって 297番目の G] uまでのいずれかのァミノ酸までのァミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換も しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
[ 2 ] 以下の（a)から（f)のいずれかのタンパク質であり、 かつ DNAポリメラーゼ 活性を有するタンパク質をコードする DNA。
(a) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列において 1 もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した アミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(f) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した ァミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ酸までのアミノ酸 配列を.欠失したァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換も しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
[3] 以下の（g)から（j)の DNAであり、 DNAポリメラーゼ活性を有するタンパク 質をコードする DNA。
(g) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNA
(h) 配列番号 6の塩基配列からなる DNAと相補的な配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下 ハイブリダイズ 、 タンパク質をコードする DNA
(i) 配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA
(j) 配列番号 8の塩基配列からなる DNAと相補的な配列からなる DNAとストリン ジェン卜な条件下でハイブリダイズし、 タンパク質をコードする DNA
[4] [2]または[3]の1) を含有する組換えべクタ一。
[5] [4]の組換えべグタ一を含む形質転換体。
[6] [5]の形質転換体を培養し、 得られる培養物からポル I型 DNAポリメラ一 ゼを採取することを特徴とするポル丄型 DNAポリメラーゼの製造方法。
[7] 相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する [ 1 ]のポル I 型 DNAポリメラ一ゼ。
[8] 5' →3' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失している [1 ]または [7]のポル I 型 DNAポリメラーゼ。
[9] 3' -→5' ェキソヌク レアーゼ活性を有する [ 1 ]、 [7]または [8]のポル I 型 DNAポリメラーゼ。
[1 0] 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失している [1]、 [7]または [8] のポノレ I型 DNAポリメラーゼ。
[1 1 ] [1]および [7]〜[1 0」のいずれかのポル I型 DNAポリメラーゼを用い る核酸増幅法。 .
[1 2] 等温増幅法である [1 1]の核酸増幅法。
[1 3] [1]および [7]〜[1 0]のいずれかのポル I型 DNAポリメラーゼを含む 核酸増幅キッ ト。
[1 4] ポル I型 DNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
(1) 配列番号 1で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 2で表さ れる塩基配列からなるプライマ一を用意する工程、 -
(2) 铸型ゲノム DNAを用意する工程、
(3) 配列番号 1で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 2で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用いて铸型ゲノム DNAを増幅する工程、
(4) (3)の増幅断片をクローン化するェ禾呈、
(5) ポル I型 DNAポリメラーゼをコ一ドする DNAを配列番号 3で表される塩基配 列からなるプライ 一および配列番号 4で表される塩基配列からなるプライマー を用いて増幅する工程、 ならびに
(6) (5)の増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
[1 5] 配列番号 8で表される配列からなるポル I型 DNAポリメラーゼ遺伝子を クローニングする方法であって、
(1) 配列番号 4で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 5で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
(2) 铸型ゲノム DNAを用意する工程、
(3) 配列番号 4で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 5で表さ れる塩基配列からなるプライマ一を用いて铸型ゲノム DNAを増幅する工程、 (4) 増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
[ 1 6] [2]または [3]の DNAの断片からなるプライマーであり、 5〜 5 0個の 塩基からなるプライマー。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005- 306228号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 - 図面の簡単な説明
図 1は、醒ポリメラ"ゼ活性測定の結果を示す図であり、 DNAポリメラーゼ量 と測定値の回帰直線を示す図である。
図 2は、 本発明の酵素（BsmDNAポリメラーゼ） を用いた相補鎖置換複製活性測 定の結果を示す図である。
図 3は、 本発明の酵素（BsmDNAポリメラーゼ） を用いた逆転写酵素活性測定の 結果を示す図である。
図 4は、本発明の酵素（BsmDNAポリメラーゼ）を用いた逆転写酵素活性測定（ラ ダーを用いた検討） の結果を示す図である。
図 5は、 本発明の酵素（BsmDNAポリメラーゼ） を用いた等温遺伝子増幅の結果 を示す図である。
図 6は、 等温遺 子増幅におけるテンプレート配列とプライマーの位置関係を 示す図である。 ' 発明を実施するための最良の形態
本発明の DNAポリメラーゼは、 Bacillus属微生物から単離することができ、 好 ましくは Bacillus smithii より、 さらに好ましくは Bacillus smithii JCM9076 株より単離することができる。 Bacillus smithii JCM9076株は、 独立行政法人理 化学研究所バイォリ ソースセンター 微生物材料開発室より分譲可能である (http://www. jcm. riken. jp/ JCM/ JCM_Home_J. html) 0
本発明において、 DNA の取得は、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (1989)： Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor し aboratory Press及び Ed Harlow and David Lane (1988)： Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press等の当業者に良く 知られた文献に記載された方法に従って取得することができる。
本発明のポル I型 DNAポリメラーゼをコ一ドする DNAは、 公知のポル I型 DNA ポリメラーゼの DNA配列を比較し、 共通の配列を有する保存領域の塩基配列に基 づいてプライマーを合成し、該プライマーを用いて Bac il lus属微生物を材料に用 いて単離することができる。 また、 Bac i l lus属微生物のポル I型 DNAポリメラー ゼをコ一ドする遺伝子の上流には phoRが、 下流には mutMが保存されていること から、 該保存されている部分の配列に基づいてプライマーを設計すればよい。 該 プライマーを用いて PCRにより、 遺伝子を増幅する。 次いで増幅産物をクローン 化し、 配列を決定し、 0RF 部分を挟むように設計したプライマー対を用いてさら に増幅すればよい。 この際、 ポル I型 DNAポリメラ一ゼの大腸菌 DNAポリメラー ゼ Iのクレノゥ断片に相当する部分を単離する場合は、'プライマーの一方に大腸 菌のクレノゥ断片の N末端に相当する位置の塩基配列に基づいてプライマ一を設 計し、 クレノゥ断片に相当する部分を挟むようにして用いればよレ、。
本発明は、 上記プライマーを用いて、 微生物よりポル I型 DNAポリメラーゼを 単離する方法を包含する。 用いるプライマーとして、 例えば、 保存領域の配列に 基づいて設計された配列番号 1および 2に表される塩基配列からなるプライマー 対がある。 また、 ^ル I型 DNAポリメラーゼの 0RF部分を挟むプライマーとして 配列番号 3および 4に表される塩基配列からなるプライマー対があり、 クレノウ 断片に相当する部分を単離する場合に用いるプライマーと'して配列番号 5に表さ れる塩基配列からなるプライマーが挙げられる。 微生物は限定されず、 Baci l lus 属微生物だけでなく、 広く細菌を含む。 微生物よりポル I型 DNAポリメラーゼを 単離するには、 保存領域の配列に対応するプライマー対を調製し、 微生物から錶 型ゲノム DNAを調製し、 前記プライマーを用いて铸型ゲノム DNAを増幅し、 増幅 断片をクローン化し、 ポル I型 DNAポリメラーゼ遺伝子を 0RFまたはク レノウ断 片に相当する部分を挟むプライマー対を用いて増幅し、 ポル I型 DNAポリメラー ゼ発現プラスミ ドを構築して、 発現させればよい。
本発明は、 このようにして得られた微生物由来のポル I型 DNAポリメラ一ゼお よび該ポリメラーゼをコ一ドする DNAも包含する。
本発明のポル I型ポリメラーゼは、 通常の鎵型依存性の DNA複製酵素活性、 相 補鎖置換複製酵素活性、 逆転写酵素活性を有する。 また、 3 ' →5 ' ェキソヌク レ ァーゼ活性を有していてもよい。 3 ' →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有する利点 は、 基質を取り込む際のエラーが少ない点などが挙げられる。 本発明のポル I型 DNAポリメラーゼの至適温度は公知の相補鎖置換複製酵素活性を有する DNAポリ メラーゼより低温度であり、 50〜60°C、 好ましくは 50〜55°Cで活性を有する。 従 つて、本発明の DNAポリメラーゼは，従来の相補鎖置換複製酵素活性を持った DNA ポリメラーゼょり低温度の反応条件で用いることができ、 より室温に近い温度で 用いることが可能となった。 また逆転写活性があるので、 RNA を铸型として DNA を合成することができ、 従来の RT-PCRの代替法に利用できる。
本発明は、 上記のようにして得られるポル I型 DNAポリメラーゼであるタンパ ク質および該ポリメラーゼをコードする DNAを包含する。 - 配列番咅 6に本発明のポル I型 DNAポリメラーゼをコードする DNAの塩基配列 を、配列番号 7に本発明のポル I型 DNAポリメラーゼのァミノ酸配列を例示する。 さらに、 本発明はポル I型 DNAポリメラ一ゼの N末端側アミノ酸を欠失させた Δ Νポル I型 DNAポリメラーゼおよびそれをコードする DNAも包含する。 欠失さ せる N末端側のアミノ酸の数は、 Δ Νポル I型 DNAポリメラーゼが相補鎖置換複 製酵素活性を有す 限り限定されない。 好ましくは、 Δ Νポル型 DNAポリメラー ゼは 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、 大腸菌 DNAポリメラーゼ I のクレノウ断片に対応する活性を有する。 Δ Νポル I型 DNAポリメラーゼは、 配 列番号 7に表されるポル I型 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の 1番目の Valか ら始まる連続したァミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ 酸までのァミノ酸配列を欠失している。クレノゥ断片に対応する Δ Νポル I型 DNA ポリメラーゼは、 配列番号 7に表されるポル I型 DNAポリメラーゼのァミノ酸配 列の 1番目の Valから 297番目の Gluまでの 297残基のァミノ酸を欠失している。 配列番号 8にクレノゥフラグメントに対応する Δ Νポル I型 DMポリメラーゼを コードする DNA配列を、 配列番号 9にクレノゥ断片に対応する Δ Νポル I型 DNA ポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。 すなわち、 本発明のタンパク質は、 配列番 号 7に表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続したアミノ酸配 列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ酸までのァミノ酸配列を欠失 しており、 相補鎖置換複製酵素活性を有するタンパク質をも包含する。 該タンパ ク質は、 アミノ酸の欠失数が多い場合、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失し ている。 この場合、 遺伝子増幅を行う際に増幅産物を分解してしまうことがない という利点を有する。
さらに、 本発明は、 ポル I型 DNAポリメラーゼであって、 3 ' →5 ' ェキソヌク レアーゼ活性を欠失しているタンパク質および該タンパク.質をコードする DNAを 包含する。 3 ' →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有しているポル I型 DNAポリメラ ーゼは、 プライマーの 3 ' 側を分解してしまうため、 核酸増幅速度力 S遅くなる。 一方、 3 ' →5 ' ェキソヌ.クレアーゼ活性を欠失しているポル I型 DNAポリメラー ゼは、 プライマーを分解しないため、 核酸増幅速度が速くなるという利点を有す る。 また、 DNA の変異検出に際して、 3 ' →5 ' ェキソ^クレアーゼ活性を有して いるポル I型 DNAポリメラーゼを用いると、 プライマーの 3 ' 側が分解されてし まうことにより変異箇所をプライマーが認識することができず、 伸長合成反応が 進んでしまい、 変異検出ができない。 一方、 3 ' →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を 欠失したポル I型 DNAポリメラーゼを用いると、プライマーが分解されないため、 変異箇所でプライマーがァニールすることなく、 伸長合成反応を停止することが でき、 変異を検出 1]ることができるという利点を有する。
また、 配列番号 6に表される DNA配列と相補的な配列からなる DNAとス トリン ジェントな条件下でハイブリダイズすることができる DNAであって、ポル I型 DNA ポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードする DNAも本発明の DNAに含ま れる。 さらに、 配列番号 8に表される DNA配列と相補的な配列からなる DNA とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる DNAであって、 ポル
I型 DNAポリメラーゼ活性を有するが、 5'→3 'ェキソヌクレア一ゼ活性を欠失し ているタンパク質をコードする DNAも本発明の遺伝子に含まれる。 ここでス トリ ンジヱントな条件とは、 例えば DNA を固定したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0M の NaCl存在下、 68°Cでハイブリダィゼ一ションを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC 溶液 （1倍濃度の SSCとは 150mM NaCl、 15mM クェン酸ナトリウムからなる） を用 レ、、 68°Cで洗浄することにより同定することができる条件をいう。
また、 本発明のポル I型 DNAポリメラ一ゼをコードする DNAは、 配列番号 6に 表される塩基配列と、 BLAST 等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、 少 なく とも 80%以上、 好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上の相同性 を有しており、 ポル I型 DNAポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードす る塩基配列からなる DNA、配列番号 8に表される塩基配列と、 BLAST等を用いてデ フォルトの条件で計算したときに、， 少なく とも 80%以上、 好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上の相同性を有しており、ポル I型 DNAポリメラーゼ活 性を有するが、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコー ドする塩基配列からなる DNAをも含む。 さらに、 上記 DNAに対する RNA、 又は該 RNA とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる RNAであつ てポル I型 DNAポリメラーゼの活性を有するタンパク質またはポル I型 DNAポリ メラーゼ活性を有するが、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパ ク質をコードする RNAも本発明に含まれる。 '
さらに、配列番号 6または 8に表される塩基配列の縮重変異体も、本発明の DNA に含められる。 .
遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の公知の手法又 はこれに準ずる方法により、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導 入用キット （例えば? Mutant-K (TAKARA社製） や Mutant- G (TAKARA社製） ）などを用 いて容易に行うことができる。
さらに、 本発明は、 配列番号 7に表されるアミノ酸配列において、 1個または 数個のァミノ酸に欠失、 置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタ ンパク質であってポル I型 DNAポリメラーゼの活性を有するタンパク質、 配列番 号 9に表されるアミノ酸配列において、 1個または数個のアミノ酸に欠失、 置換 または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポル I 型
DNAポリメラーゼ活性を有するが 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失している タンパク質を包含する。 さらに、 本発明は配列番号 7に表されるアミノ酸配列か ら 1番目の Valから始まる連続したァミノ酸配列であって 297番目の Gluまでの いずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において、 1個 または数個のアミノ酸に欠失、 置換または付加の変異を有するアミノ酸配列から なるタンパク質であってポル I型 DNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質を包 含する。 該タンパク質は、 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失していても保持 していてもよい。 1個または数個のアミノ酸の欠失、 置換または付加とは、 1〜 10個、好ましくは 1〜 5個、さらに好ましくは 1個または 2個のアミノ酸の欠失、 置換または付加をいう。 . - さらに、 本発明は上記のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNAを 包含する。
本発明は、 微生物から DNAポリメラーゼを単離するために用いるプライマ一お よびプローブを包含する。 該プライマ一またはプローブは、 上記の DNAの断片で あり、塩基の数は 5〜50、好ましくは 10〜30、 さらに好ましくは 15〜25である。 増幅させる塩基配列の長さは限定されない。
本発明のポル I型 DNAポリメラーゼをコ一ドする DNAおよびその変異体を発現 ベクターに挿入し、 適当な宿主細胞に該ベクターを導入し、 該宿主細胞を培養す ることにより、 ポル I型 DNAポリメラーゼを得ることができる。 この際、適宜 GST をコードする DNAやへキサヒスチジンをコードする DNAを連結させてもよレ、。 ベ クタ一として、 プラスミ ド、 ファージ、 ウィルス等の宿主細胞において複製可能 である限りいかなるベクターも用いることができる。 例えば、 pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 ρΚ θ, pCFM536等の大腸菌プラスミ ド、 pUBl lO等の枯草菌プラ スミ ド、 pG- 1、 YEpl3、 YCp50等の酵母プラスミ ド、 え gtl l0、 え ΖΑΡΠ等のファー ジの DNA等が挙げられ、 哺乳類細胞用のベクターとしては； バキュロウィルス、 ワクシニアウィルス、 アデノ ウイルス等のウィルス DNA、 SV40 とその誘導体等が 挙げられる。 ベクターは、 複製開始点、 選択マーカー、 プロモータを含み、 必要 に応じてェンハンサ一、 転写終結配列 （ターミネータ一）、 リボソーム結合部位、 ポリアデュル化シグナル等を含んでいてもよい。 プロモータとしては、 宿主細胞 で効率よく発現するものであればいかなるプロモータでもよいが、 例えば、 SR a プロモータ、 SV40プロモータ、 LTRプロモータ、 CMVプロモータ、 HSV- TKプロモ ータ等が挙げられる。
宿主細胞としては、 大腸菌、 ス トレプトミセス、 枯草菌等の細菌細胞、 ァスぺ ルギルス属菌株等の真菌細胞、 パン酵母、 メタノール資化性酵母等の酵母細胞、 ドロソフイラ S2、スポドプテラ Sf9等の昆虫細胞、 HEK293T、HeLa細胞、 SH - SY5Y、
CH0、 C0S、 BHK、 3T3、 C127等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、 塩化カルシウム法、 リン酸カルシウム法、 DEAE-デキス トラン介在 トランスフエクション法、 エレク ト口ポレーション法等の公知の方法で行うこと ができる。
ポル I型 DNAポリメラーゼの単離精製は、 タンパク質の単離精製に用いられる 一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等を単独で 又は適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
本発明は、 ポル I型 DNAポリメラーゼに対する抗体をも含む。 抗体はポリクロ ーナル抗体、 モノクローナル抗体の両者を含む。 抗体は公知の方法により作製で きる。 抗体は、 機能的断片をも含み、 抗体の機能的断片とは、 （Fab) 2フラグメン トおよび (Fab) フラグメント等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆる 分子を意味する。 得られた抗体は、 例えば、 本発明のポル I型 DNAポリメラ'ーゼ の精製に用いることができる。 .
さらに、 本発明は、 本発明のポル I型 DNAポリメラーゼを用いて核酸を増幅す る方法を包含する。 核酸増幅方法として、 公知の PCR. 法 （polymerase chain reaction method)、 RT-PCR法、： reverse transcriptase polymerase chain react ion method) , 三谷法（Mitani method) (W001/030993号国際公開パンフレッ ト）、 LAMP
(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 法 (Nucleic Acids Res 28, No.12, e63 (2000) ； 医学のあゆみ， Vol.206, No.8， 470-474， 2003 ； Molecular and Cellular Probes, Vol.16, No.3, 223-229, 2002)、 SDA (Strand Displacement Amplification) 法 （特開平 10- 313900号公報； 「検査と技術 Vol.24、 No. 3 J, (1996 年）、 佐藤隆著、 （株） 医学書院発行、 241 頁〜 243 頁）、 ICAN (登録商標）
(Isothermal and Chimeric primer- initiated Amplification of Nucleic acids) 法 （W000/56877 号国際公開パンフ レ ツ ト） ， TRC (Transcription Reverse
Transcription Concerted Reaction)法、 NASBA (NucJeic acid sequence based amplification) 法（日本国特許第 2650159号公報）等が挙げられ、 本発明のポル I 型 DNAポリメラーゼいずれの方法においても用いることができる。 この中でも、 三谷法、 LAMP法、 SDA法、 ICAN (登録商標） 法等の等温増幅法に適している。 こ れらの遺伝子増幅法において、 従来用いられていた DNAポリメラーゼの代わりに 本発明のポル I型 DNAポリメラーゼを用いることができる。
さらに、 本発明は、 本発明のポル I型 DNAポリメラーゼを用いる核酸増幅キッ トを包含する。 該キッ トは上記のいずれかの核酸増幅法に適応させたキットであ る。 該キッ トは、 本発明のポル I型 DNAポリメラーゼの他、 プライマー、 dNTP、 Tris- HC1、 HC1、 MgS04、 ベタイン等を含む。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。 .
1 . Bac i l lus smi thi i DNAポリメラーゼクローニング
B. smithi i JCM9076 培養菌体より定法にてゲノム DNA を調製した。 次いで、 Baci l lus属の他種の polAの遺伝子構造より上流に phok、下流に mutMが保存され ていることから、各々の遺伝子の保存領域よりプライマー PhoF (配列番号 1 )、MutR (配列番号 2 )を設計した。 さらに、調製したゲノム DNAを铸型として PhoF、 MutR をプライマ一に PCRを行い遺伝子増幅し、増幅断片を Promega社製 pGEM-Tにてク ローン化し、定法により内部配列を決定した。決定したシーケンスより polAと思 われる 0RF部分を Bsth- EcoNF (配列番号 3 ) と Bsth-SalCR (配列番号 4 ) にて PCRで増幅した。 得 れた PCR産物および pUC18を EcoRI と Sai lで消化し、 混合 して連結することにより Bsm DNAポリメラーゼ I発現プラスミ ド構築した。 前記 のように決定したシーケンスより polAの E. col iクレノゥ断片の N末端と同等位 置に相当する Bsth- EcoLF (配列番号 5 ) と Bsth- SalCR (配列番号 4 ) にて PCR で増幅した。得られた PCR産物および pUC18を EcoRI と Sailで消ィ匕し、混合して 連結することにより Δ Ν Bsm DNAポリメラーゼ発現プラスミ ドを構築した。
2 . Bsm DNAポリメラーゼ I及び Δ Ν Bsm DNAポリメラーゼ ΐの発現及び精製 ( 1 ) 培養、 発現、 及び粗抽出液調製
pUCBsmまたは pUCdNBsmを有する大]]悬菌 XL1- Blueを 100 / g/mlのアンピシリン を含む LB培地 5mlにて 37°C—晩培養して前培養液とした。得られた前培養液 5m] を 100 i g/mlのアンピシリンを含む LB培地 500mlに植菌し、 37°C、 200rpmで振 盪培養（Orbital Shaking Incubator, FIRSTEK OSI- 502LD)を行った。 0D600nm 値 が 0. 5付近になったときに、 ImM IPTGを添加した。 さらに、 37°C、 200rpniにて 1 〜2時間振盪培養を行った。 得られた培養液を遠沈管に移し、 4, 000 X g、 10分間 の遠心分離を行い、 沈殿を得た。 得られた沈殿を I X PBS 30mlにて懸濁し、 再度 4， 000 X g、10分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。得られた沈殿を I X PBS 25ml にて懸濁し、 10sec X 6 の超音波にて細胞を破砕（MISONIX -Astrason Ul trasonic processor XL)した。 超音波破砕後の試料を 15， 000 X g、 30分間遠心分離を行い、 上清を得た。 得られた上清に 30%ポリエチレンイミン溶液を終濃度 0. 1%となるよ うに添加して混合し、 氷中で 30分間放置した後、 15，000 X g、 30分間の遠心分離 を行い、 上清を得た。 本上清を粗抽出液とした。
( 2 ) 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
GEヘルスケア社製 AKTA Prime高速液体クロマトグラフィーシステムと GEヘル スケア社製強陰イオン交換カラム HiTrap Qを用いてイオン交換クロマ十グラフィ 一を行った。 ランニングバッファーとして 50mM Tris— HCl (pH7. 6)、 2mM EDTA, lOmM 2-メルカプトエタノールを用いた。 流速 lml/分でカラムを平衡化し、 粗抽出液を アプライした後、 非吸着画分を同ランニングバッファーで洗浄した。 約 15CVの 0 〜1M塩化ナトリ ゥム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は lmlごとに 分画し、 これを SDS- PAGEに供して該当分子量のタンパク.質バンドを確認した後、 同バンドを有する f分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮'脱塩し、 これを陰イオン交換画分とした。 '
( 3 ) へパリ ンァフィ二ティーカラムクロマ トグラフィー
GEヘルスケア社製 AKTA Prime高速液体クロマトグラフィーシステムと GEへノレ スケア社製へパリンァフィ二ティ一カラム HiTrap Heparinを用いてへパリンァフ ィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。 ランニングバッファーとして陰 イオン交換カラムクロマトグラフィ一で用いたのと同じ溶液を用いた。 流速 lml/ 分でカラムを平衡化し、 陰イオン交換画分をアプライした後、 非吸着画分を同ラ ンニングバッファーで洗浄した。約 22CVの 0〜1M塩化ナトリゥム濃度勾配により 吸着画分を溶出した。溶出画分は lmlごとに分画し、 これを SDS- PAGEに供して該 当分子量のタンパク質バンドを確認した後、 同バンドを有する画分を回収した。 回収画分を限外濾過膜を用いて、 50mM Tris- HCl (pH8.0)、 0.2M塩化ナトリウムに バッファ一置換を行い、 さらに濃縮して、 これをへパリン画分とした。
( 4 ) ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
GEヘルスケア社製 AKTA 10XT高速液体クロマ トグラフィーシステムと GEヘル スケア社製ゲルろ過カラム HiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradeを用いてゲル ろ過カラムクロマトグラフィーを行った。 ランニングバッファ一と して 50mM Tris- HC1 (PH 8.0)、 0.2M塩化ナトリ ウムを用いた。 流速 lml/分でカラムを平衡化 し、 へパリン画分をアプライした後、 同ランニングバッファーで溶出した。 溶出 画分は lml ごとに分画し、これを SDS-PAGEに供して該当分子量のタンパク質バン ドを確認した後、 同バンドを有する画分を回収した。 回収画分を限外濾過膜を用 いて濃縮し、保存バッファー（50mM塩化力リ ウム、 10mM Tris- HC1 (pH7.5)、 ImM DTT、 0. lmM EDTA, 0. l%Triton X— 100、 50%グリセロール）にバッファー置換を行い、 こ れを精製酵素標品とした。 - 3. DNAポリメラーゼ活性測定
インビトロジェン社製 Picogreen dsDNA定量試薬を用いて、 Biotechniques 21, 664-668 (1996)を参考に DNAポリメラーゼ活性を測定した。 Picogreen dsDNA定 量試薬を TE緩衝液と 1 :345となるように混合し、 M13mpl8—本鎖 DNAとプライマ 一、 dNTP、 精製酵素標品の混合物 27 / 1に対して 173 μ ΐ ^添加し、 室温で 5分間 放置した後に励起瑪長 480nm、 測定波長 520nmにて蛍光を測定した。 このとき、 市販で単位既知のクレノゥ断片を同様に測定し、 その値より相対値としての酵素 単位を算出した。 以下に測定の一例を示す。 尚、 標準直線は測定ごとに作成して いる。 市販の Bst DNAポリメラーゼを標準として、 Picogreen dsDNA定量試薬に より、 各希釈倍での蛍光強度を測定したところ、 表 1のような結果を得た。
表 1 Bst DNA polymerase Measurement 1 Measurement 2
0.5 unit 57.699 61.725
1.0 unit 60.198 63.044
2.0 unit 76.175 88.095
4.0 unit 93.177 92.283
6.0 unit 93.427 105.38
8.0 unit 112.78 132.35 この結果をプロッ トし、 ] 次直線に回帰したところ、 次の式を得た。 回帰直線 を図 1に示す。
y = 7.8457x + 58.247 (R2= 0.8967)
また、同時に測定した Bsm DNAポリメラーゼ試料は、平均 96.26 (1回目 98.814、 2 回目 93.707)の蛍光強度を示したことから、 本回帰直線式より、 約 4.85 unit と算出された。 - 4. 相補鎖置換複製活性測定
Nucleic Acids Res 28， No.12, e63 (2000)に従って、 LAMP法により、 M13mpl8 一本鎖 DNA、 0.8μΜ F1P 0.8μΜ ΒΙΡ、 0.2 μ M F3, 0.2 μ Μ Β3の各合成 DNA、 1M ベタイン、 20mM トリス塩酸緩衝液（pH8.8)、 10mM塩化カリ ゥム、 lOmM硫酸アンモ 二ゥム、 0. l%TritonX-100、 2〜4mM硫酸マグネシウムの混合物 20 1 を 95°Cで 5 分間放置し、 次い 氷上で 5分間放置した。 これに精製酵素標品 5// 1 を加えて 55°C〜65°Cで 1時間放置し、これをァガロースゲル電気泳動に供した。このとき、 市販で単位既知の Bst DNAポリメラーゼ （ew England Biolabs, No. M0275S) を同 様に測定し、 その電気泳動後の生成物バンドの濃さにより、 相対値としての酵素 単位を算出した。
結果を図 2に示す。 図 2に示すように、 市販単位既知の Bst DNAポリメラ一ゼ の結果（図 2 レーン 3) と比較してレーン 6および 7がほぼ同等の結果を示した。 このことから、 レーン 6および 7に使用した酵素標品 5 μ 1には単位既知 Bst DNA ポリメラーゼと同等の活性があると判断した。
5. 逆転写酵素活性
インビ卜ロジェン社製 EnzChek Reverse Transcriptase Assay Kitを用レヽて、 マニュアルどおりに逆転写酵素活性の測定及びその反応産物の検出を行った。 ま た、インビトロジヱン社製 RNAラダー（0. 24〜9. 5kb)を铸型としても同様に逆転写 反応を行い、 反応産物をァガロースゲル電気泳動に供してその反応産物をォート ラジオグラフィ一により検出した。
結果を図 3および 4に示す。 図 3 レーン 4〜 6に示すように、 塩化マンガンの 有無にかかわらず逆転写産物が検出された。 また、'その逆転写産物は図 4 レーン 2〜4とレーン 5〜 7を比較しても分かるように、 Bs t DNA ポリメラーゼの逆転 写産物よりも長鎖のものであった。
6 . 等温遺伝子増幅
以下に示す条件で等温遺伝子増幅を行った。 ，
増幅条件： 60°C , 90分間
反応液 （25 1中） Tri s— HCl (20mM, pH8. 8)、 KCl ( 10mM)、 （NH4) 2S04 ( l OmM)、 SYBR green (0. 01 μ 1 /ml)、 8mM MgS04 ； 0. 1% Tween 20； 0. 5M'ベタイン； 1. 4mM dNTP ； Bsm または Bst DNA ポリメラーゼ 4ユニッ トおよび 40ng ヒ トゲノム DNA。
用いたプライマーは以下の通りであった。
1600nM EF5 ACAACGAGGCGCAGCAGAGGGGACATGAAA (配列番号 1 1 )
1600nM ER6 TTGAAGACGTAAAGACTCTTTCACATCCTC (配列番号 1 2 )
8mM ER6-L1 TGTGCCATTCCAAAGG (配列番号 1 3 )
遺伝子増幅は Mx3000P (Stratagene) を用いた反応液中で SYBR green I (Mol ecular Probes)の存在下で、 60°C、 90分間リアルタイムでモニタした。 結果を図 5に示す。 図 5に示すように本発明の Bsm DNAポリメラーゼを用いた 場合、 従来から存在していた Bst DNAポリメラーゼを用いた場合よりも早く増幅 した。 また、 目的配列が増幅されていることを確認するために、 シークェンサ一 を用い増幅のシークェンス配列を読んだところ、 目的配列が増幅されていること が確認された。 図 6にテンプレート配列 （配列番号 1 0 ) とプライマーの位置関 係を示す。 図 6の配列中、 下線部がプライマー領域であり、 ループプライマーは 枠で囲んである。 産業上の利用可能性 本発明の DNAポリメラーゼは、 従来の鎖置換活性を持った DNAポリメラーゼょ り低温度の反応条件で活性を持っているため、 より室温に近い温度で用いること が可能となった。 また逆転写活性があるので、 RNAを铸型として DNAを合成する ことができ、 従来の RT-PCRの代替法に利用できる。 '
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリ一テキス ト
配列番号：！〜 5、 1 0〜； I 3 ：合成

Claims

請求の範囲
1 . 以下の（a)から（f)のいずれかのタンパク質であり、 かつ DNAポリメラー ゼ活性を有するポル I型 DNAポリメラーゼ。
(a) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 7で表わざれるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した ァミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質 ' -
(f) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した アミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換も しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
2 . 以下の（a)から（f)のいずれかのタンパク質であり、 かつ DNAポリメラー ゼ活性を有するタン yパク質をコードする DNA。
(a) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 7で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号 9で表わされるアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が 欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した アミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
(f) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列から、 1番目の Valから始まる連続した ァミノ酸配列であって 297番目の Gluまでのいずれかのァミノ酸までのアミノ酸 配列を欠失したアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換も しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質
3 . 以下の（g)から（j)の DNAであり、 DNAポリメラーゼ活性を有するタンパ ク質をコードする DNA。
(g) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNA -
(h) 配列番号 6の塩基配列からなる DNAと相補的な配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズし、 タンパク質をコードする DNA
(i) 配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA
(j) 配列番号 8の塩基配列からなる DNAと相補的な配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダイズし、 タンパク質をコードする DNA
4 . 請求項 2または 3に記載の DNAを含有する組換えベクター。
5 . 請求項 4に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
6 . 請求項 5に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポル I型 DNA ポリメラーゼを採取することを特徴とするポル I型 DNAポリメラーゼの製造方法。
7 . 相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有十る請求項 1に記載 のポル I型 DNAポリメラーゼ。
8 . 5 ' →3 ' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項 1または 7に記 載のポル I型 DNA リメラ一ゼ。 -
9 . 3 ' →5 ' ェキソヌク レアーゼ活性を有する請求項 1、 7または 8に記載 のポノレ I型 DNAポリメラ一ゼ。.
1 0 . 3 ' →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項 1、 7または 8に記載のポル I型 DNAポリメラーゼ。
1 1 . 請求項 1および 7〜1 0のいずれか 1項に記載のポル I型 DNAポリメ ラーゼを用いる核酸増幅法。
1 2 . 等温増幅法である請求項 1 1記載の核酸増幅法。
1 3 . 請求項 1および 7〜1 0のいずれか 1項に記載のポル I型 DNAポリメ ラーゼを含む核酸増幅キッ ト。
1 4 . ポル I型 DNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、 (1) 配列番号 1で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 2で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
(2) 铸型ゲノム DNAを用意する工程、
(3) 配列番号 1で表される塩基配列からなるプライマ一および配列番号 2で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用いて铸型ゲノム DNAを増幅する工程、
(4) (3)の増幅断片をクローン化する工程、 -
(5) ポル I型 DNAポリメラーゼを ードする DNAを配列番号 3で表される塩基配 列からなるプライマーおよび配列番号 4で表される塩基酉己列からなるプライマ一 を用いて増幅する工程、 ならびに
(6) (5)の増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
1 5 . 配列番号 8で表される配列からなるポル I型 DNAポリメラーゼ遺伝子 をクローユングする方法であって、 -
(1) 配列番号 4で表される塩基配列からなるプライマ一および配列番号 5で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
(2) 铸型ゲノム DNAを用意する工程、
(3) 配列番号 4で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号 5で表さ れる塩基配列からなるプライマーを用いて铸型ゲノム DNAを増幅する工程、
(4) 増幅断片をク ーン化する工程、
を含む方法。
1 6 . 請求項 2または 3に記載の DNAの断片からなるプライマーであり、 5 〜 5 0個の塩基からなるプライマー。
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