JPWO2007046556A1 - 新規ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
ＢａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｈｉｉＪＣＭ９０７６から得られた新規のＤＮＡポリメラーゼであり、最適温度などの最適反応条件，酵素活性，などの新しい特徴をもったＤＮＡポリメラーゼの提供。以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
Description
本発明は、鎖置換活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ由来の新規なＤＮＡポリメラーゼに関する。
ＤＮＡポリメラーゼはライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つである。ＰＣＲ法をはじめとして種々の技術に必須の酵素であり、数多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが販売され、それぞれのポリメラーゼは反応条件、酵素活性について特徴を持っている。ＤＮＡの増幅技術としては、ＰＣＲ法が一般的に利用されているが、複雑な温度制御が必要なためサーマルサイクラーが必要であること、時間が数時間かかることなどの問題点があった。ＰＣＲ法に代わるＤＮＡの増幅技術として、ＬＡＭＰ法やＳＤＡ法などが開発されてきたが、これらの反応には鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼが必須である。鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼについての報告もあるが（特許文献１参照）、現在市場で入手できる種類は少なく至適温度などの反応条件が限られる、あるいは反応時間が長いなどの理由により、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬などの開発にも制限となっていた。
特許２９７８００１号公報
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ ＪＣＭ９０７６から得られた新規のＤＮＡポリメラーゼであり、最適温度などの最適反応条件、酵素活性などの新しい特徴をもったＤＮＡポリメラーゼの提供を目的とする。
ＤＮＡポリメラーゼはライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つである。ＰＣＲ法をはじめとして種々の技術に必須の酵素であり、数多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが販売され、それぞれのポリメラーゼは反応条件、酵素活性について特徴を持っている。ＤＮＡの増幅技術としては、ＰＣＲ法が一般的に利用されているが、複雑な温度制御が必要なためサーマルサイクラーが必要であること、時間が数時間かかることなどの問題点があった。ＰＣＲ法に代わるＤＮＡの増幅技術として、ＬＡＭＰ法やＳＤＡ法などが開発されてきたが、これらの反応には鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼが必須である。鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼは、現在市場で入手できる種類は少なく至適温度などの反応条件が限られる、あるいは反応時間が長いなどの理由により、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬などの開発にも制限となっていた。
本発明者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉより通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性、相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する新規なポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離し、該ＤＮＡポリメラーゼが従来のＤＮＡポリメラーゼに比べ優れた特性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［２］ 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［３］ 以下の（ｇ）から（ｊ）のＤＮＡであり、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ
［４］ ［２］または［３］のＤＮＡを含有する組換えベクター。
［５］ ［４］の組換えベクターを含む形質転換体。
［６］ ［５］の形質転換体を培養し、得られる培養物からポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
［７］ 相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する［１］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［８］ ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している［１］または［７］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［９］ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する［１］、［７］または［８］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［１０］ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している［１］、［７］または［８］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［１１］ ［１］および［７］〜［１０］のいずれかのポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法。
［１２］ 等温増幅法である［１１］の核酸増幅法。
［１３］ ［１］および［７］〜［１０］のいずれかのポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キット。
［１４］ ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）（３）の増幅断片をクローン化する工程、
（５）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いて増幅する工程、ならびに
（６）（５）の増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
［１５］ 配列番号８で表される配列からなるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
［１６］ ［２］または［３］のＤＮＡの断片からなるプライマーであり、５〜５０個の塩基からなるプライマー。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３０６２２８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
ＤＮＡポリメラーゼはライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つである。ＰＣＲ法をはじめとして種々の技術に必須の酵素であり、数多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが販売され、それぞれのポリメラーゼは反応条件、酵素活性について特徴を持っている。ＤＮＡの増幅技術としては、ＰＣＲ法が一般的に利用されているが、複雑な温度制御が必要なためサーマルサイクラーが必要であること、時間が数時間かかることなどの問題点があった。ＰＣＲ法に代わるＤＮＡの増幅技術として、ＬＡＭＰ法やＳＤＡ法などが開発されてきたが、これらの反応には鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼが必須である。鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼは、現在市場で入手できる種類は少なく至適温度などの反応条件が限られる、あるいは反応時間が長いなどの理由により、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬などの開発にも制限となっていた。
本発明者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉより通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性、相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する新規なポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離し、該ＤＮＡポリメラーゼが従来のＤＮＡポリメラーゼに比べ優れた特性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［２］ 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［３］ 以下の（ｇ）から（ｊ）のＤＮＡであり、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ
［４］ ［２］または［３］のＤＮＡを含有する組換えベクター。
［５］ ［４］の組換えベクターを含む形質転換体。
［６］ ［５］の形質転換体を培養し、得られる培養物からポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
［７］ 相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する［１］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［８］ ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している［１］または［７］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［９］ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する［１］、［７］または［８］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［１０］ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している［１］、［７］または［８］のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
［１１］ ［１］および［７］〜［１０］のいずれかのポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法。
［１２］ 等温増幅法である［１１］の核酸増幅法。
［１３］ ［１］および［７］〜［１０］のいずれかのポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キット。
［１４］ ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）（３）の増幅断片をクローン化する工程、
（５）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いて増幅する工程、ならびに
（６）（５）の増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
［１５］ 配列番号８で表される配列からなるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。
［１６］ ［２］または［３］のＤＮＡの断片からなるプライマーであり、５〜５０個の塩基からなるプライマー。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３０６２２８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、ＤＮＡポリメラーゼ活性測定の結果を示す図であり、ＤＮＡポリメラーゼ量と測定値の回帰直線を示す図である。
図２は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた相補鎖置換複製活性測定の結果を示す図である。
図３は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた逆転写酵素活性測定の結果を示す図である。
図４は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた逆転写酵素活性測定（ラダーを用いた検討）の結果を示す図である。
図５は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた等温遺伝子増幅の結果を示す図である。
図６は、等温遺伝子増幅におけるテンプレート配列とプライマーの位置関係を示す図である。
図２は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた相補鎖置換複製活性測定の結果を示す図である。
図３は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた逆転写酵素活性測定の結果を示す図である。
図４は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた逆転写酵素活性測定（ラダーを用いた検討）の結果を示す図である。
図５は、本発明の酵素（Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた等温遺伝子増幅の結果を示す図である。
図６は、等温遺伝子増幅におけるテンプレート配列とプライマーの位置関係を示す図である。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物から単離することができ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉより、さらに好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ ＪＣＭ９０７６株より単離することができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ ＪＣＭ９０７６株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室より分譲可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃｍ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ＪＣＭ／ＪＣＭ＿Ｈｏｍｅ＿Ｊ．ｈｔｍｌ）。
本発明において、ＤＮＡの取得は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｃ（１９８８）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って取得することができる。
本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、公知のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を比較し、共通の配列を有する保存領域の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、該プライマーを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を材料に用いて単離することができる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の上流にはｐｈｏＲが、下流にはｍｕｔＭが保存されていることから、該保存されている部分の配列に基づいてプライマーを設計すればよい。該プライマーを用いてＰＣＲにより、遺伝子を増幅する。次いで増幅産物をクローン化し、配列を決定し、ＯＲＦ部分を挟むように設計したプライマー対を用いてさらに増幅すればよい。この際、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に相当する部分を単離する場合は、プライマーの一方に大腸菌のクレノウ断片のＮ末端に相当する位置の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、クレノウ断片に相当する部分を挟むようにして用いればよい。
本発明は、上記プライマーを用いて、微生物よりポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離する方法を包含する。用いるプライマーとして、例えば、保存領域の配列に基づいて設計された配列番号１および２に表される塩基配列からなるプライマー対がある。また、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＯＲＦ部分を挟むプライマーとして配列番号３および４に表される塩基配列からなるプライマー対があり、クレノウ断片に相当する部分を単離する場合に用いるプライマーとして配列番号５に表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。微生物は限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物だけでなく、広く細菌を含む。微生物よりポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離するには、保存領域の配列に対応するプライマー対を調製し、微生物から鋳型ゲノムＤＮＡを調製し、前記プライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅し、増幅断片をクローン化し、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＯＲＦまたはクレノウ断片に相当する部分を挟むプライマー対を用いて増幅し、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを構築して、発現させればよい。
本発明は、このようにして得られた微生物由来のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼおよび該ポリメラーゼをコードするＤＮＡも包含する。
本発明のポルＩ型ポリメラーゼは、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性、相補鎖置換複製酵素活性、逆転写酵素活性を有する。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する利点は、基質を取り込む際のエラーが少ない点などが挙げられる。本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの至適温度は公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼより低温度であり、５０〜６０℃、好ましくは５０〜５５℃で活性を有する。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、従来の相補鎖置換複製酵素活性を持ったＤＮＡポリメラーゼより低温度の反応条件で用いることができ、より室温に近い温度で用いることが可能となった。また逆転写活性があるので、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成することができ、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法に利用できる。
本発明は、上記のようにして得られるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼであるタンパク質および該ポリメラーゼをコードするＤＮＡを包含する。
配列番号６に本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号７に本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を例示する。
さらに、本発明はポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端側アミノ酸を欠失させたΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼおよびそれをコードするＤＮＡも包含する。欠失させるＮ末端側のアミノ酸の数は、ΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有する限り限定されない。好ましくは、ΔＮポル型ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に対応する活性を有する。ΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号７に表されるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失している。クレノウ断片に対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号７に表されるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１番目のＶａｌから２９７番目のＧｌｕまでの２９７残基のアミノ酸を欠失している。配列番号８にクレノウフラグメントに対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、配列番号９にクレノウ断片に対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。すなわち、本発明のタンパク質は、配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失しており、相補鎖置換複製酵素活性を有するタンパク質をも包含する。該タンパク質は、アミノ酸の欠失数が多い場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。この場合、遺伝子増幅を行う際に増幅産物を分解してしまうことがないという利点を有する。
さらに、本発明は、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質および該タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’側を分解してしまうため、核酸増幅速度が遅くなる。一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを分解しないため、核酸増幅速度が速くなるという利点を有する。また、ＤＮＡの変異検出に際して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いると、プライマーの３’側が分解されてしまうことにより変異箇所をプライマーが認識することができず、伸長合成反応が進んでしまい、変異検出ができない。一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いると、プライマーが分解されないため、変異箇所でプライマーがアニールすることなく、伸長合成反応を停止することができ、変異を検出することができるという利点を有する。
また、配列番号６に表されるＤＮＡ配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。さらに、配列番号８に表されるＤＮＡ配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。
また、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号６に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号８に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡをも含む。さらに、上記ＤＮＡに対するＲＮＡ、又は該ＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡであってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質またはポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードするＲＮＡも本発明に含まれる。
さらに、配列番号６または８に表される塩基配列の縮重変異体も、本発明のＤＮＡに含められる。
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて容易に行うことができる。
さらに、本発明は、配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質、配列番号９に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質を包含する。さらに、本発明は配列番号７に表されるアミノ酸配列から１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を包含する。該タンパク質は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失していても保持していてもよい。１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個または２個のアミノ酸の欠失、置換または付加をいう。
さらに、本発明は上記のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
本発明は、微生物からＤＮＡポリメラーゼを単離するために用いるプライマーおよびプローブを包含する。該プライマーまたはプローブは、上記のＤＮＡの断片であり、塩基の数は５〜５０、好ましくは１０〜３０、さらに好ましくは１５〜２５である。増幅させる塩基配列の長さは限定されない。
本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡおよびその変異体を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に該ベクターを導入し、該宿主細胞を培養することにより、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。この際、適宜ＧＳＴをコードするＤＮＡやヘキサヒスチジンをコードするＤＮＡを連結させてもよい。ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。プロモータとしては、宿主細胞で効率よく発現するものであればいかなるプロモータでもよいが、例えば、ＳＲαプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＨＳＶ−ＴＫプロモータ等が挙げられる。
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの単離精製は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
本発明は、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体をも含む。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両者を含む。抗体は公知の方法により作製できる。抗体は、機能的断片をも含み、抗体の機能的断片とは、（Ｆａｂ）２フラグメントおよび（Ｆａｂ）フラグメント等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆる分子を意味する。得られた抗体は、例えば、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。
さらに、本発明は、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法を包含する。核酸増幅方法として、公知のＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＲＴ−ＰＣＲ法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、三谷法（Ｍｉｔａｎｉ ｍｅｔｈｏｄ）（ＷＯ０１／０３０９９３号国際公開パンフレット）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３（２０００）；医学のあゆみ，Ｖｏｌ．２０６，Ｎｏ．８，４７０−４７４，２００３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．３，２２３−２２９，２００２）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特開平１０−３１３９００号公報；「検査と技術 Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．３」、（１９９６年）、佐藤隆著、（株）医学書院発行、２４１頁〜２４３頁）、ＩＣＡＮ（登録商標）（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（ＷＯ００／５６８７７号国際公開パンフレット），ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（日本国特許第２６５０１５９号公報）等が挙げられ、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼいずれの方法においても用いることができる。この中でも、三谷法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法等の等温増幅法に適している。これらの遺伝子増幅法において、従来用いられていたＤＮＡポリメラーゼの代わりに本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
さらに、本発明は、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅キットを包含する。該キットは上記のいずれかの核酸増幅法に適応させたキットである。該キットは、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの他、プライマー、ｄＮＴＰ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＣｌ、ＭｇＳＯ４、ベタイン等を含む。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
１． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ ＤＮＡポリメラーゼクローニング
Ｂ．ｓｍｉｔｈｉｉ ＪＣＭ９０７６培養菌体より定法にてゲノムＤＮＡを調製した。次いで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の他種のｐｏｌＡの遺伝子構造より上流にｐｈｏＲ、下流にｍｕｔＭが保存されていることから、各々の遺伝子の保存領域よりプライマーＰｈｏＦ（配列番号１）、ＭｕｔＲ（配列番号２）を設計した。さらに、調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰｈｏＦ、ＭｕｔＲをプライマーにＰＣＲを行い遺伝子増幅し、増幅断片をＰｒｏｍｅｇａ社製ｐＧＥＭ−Ｔにてクローン化し、定法により内部配列を決定した。決定したシーケンスよりｐｏｌＡと思われるＯＲＦ部分をＢｓｔｈ−ＥｃｏＮＦ（配列番号３）とＢｓｔｈ−ＳａｌＣＲ（配列番号４）にてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物およびｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、混合して連結することによりＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩ発現プラスミド構築した。前記のように決定したシーケンスよりｐｏｌＡのＥ．ｃｏｌｉクレノウ断片のＮ末端と同等位置に相当するＢｓｔｈ−ＥｃｏＬＦ（配列番号５）とＢｓｔｈ−ＳａｌＣＲ（配列番号４）にてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物およびｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、混合して連結することによりΔＮ Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを構築した。
２． Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩ及びΔＮ Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩの発現及び精製
（１）培養、発現、及び粗抽出液調製
ｐＵＣＢｓｍまたはｐＵＣｄＮＢｓｍを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌにて３７℃一晩培養して前培養液とした。得られた前培養液５ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養（Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＦＩＲＳＴＥＫ ＯＳＩ−５０２ＬＤ）を行った。ＯＤ６００ｎｍ値が０．５付近になったときに、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。さらに、３７℃、２００ｒｐｍにて１〜２時間振盪培養を行った。得られた培養液を遠沈管に移し、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を得た。得られた沈殿を１×ＰＢＳ ３０ｍｌにて懸濁し、再度４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。得られた沈殿を１×ＰＢＳ ２５ｍｌにて懸濁し、１０ｓｅｃ×６の超音波にて細胞を破砕（ＭＩＳＯＮＩＸ Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬ）した。超音波破砕後の試料を１５，０００×ｇ、３０分間遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清に３０％ポリエチレンイミン溶液を終濃度０．１％となるように添加して混合し、氷中で３０分間放置した後、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。本上清を粗抽出液とした。
（２） 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を同ランニングバッファーで洗浄した。約１５ＣＶの０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。
（３） ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎを用いてヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで用いたのと同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を同ランニングバッファーで洗浄した。約２２ＣＶの０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化ナトリウムにバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。
（４） ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅを用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化ナトリウムを用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、ヘパリン画分をアプライした後、同ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファー（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロール）にバッファー置換を行い、これを精製酵素標品とした。
３． ＤＮＡポリメラーゼ活性測定
インビトロジェン社製Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬を用いて、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１，６６４−６６８（１９９６）を参考にＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬をＴＥ緩衝液と１：３４５となるように混合し、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡとプライマー、ｄＮＴＰ、精製酵素標品の混合物２７μｌに対して１７３μｌを添加し、室温で５分間放置した後に励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。このとき、市販で単位既知のクレノウ断片を同様に測定し、その値より相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の−例を示す。尚、標準直線は測定ごとに作成している。市販のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを標準として、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定したところ、表１のような結果を得た。
この結果をプロットし、１次直線に回帰したところ、次の式を得た。回帰直線を図１に示す。
ｙ＝７．８４５７ｘ＋５８．２４７（Ｒ２＝０．８９６７）
また、同時に測定したＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ試料は、平均９６．２６（１回目９８．８１４、２回目９３．７０７）の蛍光強度を示したことから、本回帰直線式より、約４．８５ｕｎｉｔと算出された。
４． 相補鎖置換複製活性測定
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３（２０００）に従って、ＬＡＭＰ法により、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μＭ ＦＩＰ、０．８μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１Ｍベタイン、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２〜４ｍＭ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを９５℃で５分間放置し、次いで氷上で５分間放置した。これに精製酵素標品５μｌを加えて５５℃〜６５℃で１時間放置し、これをアガロースゲル電気泳動に供した。このとき、市販で単位既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｎｏ．ＭＯ２７５Ｓ）を同様に測定し、その電気泳動後の生成物バンドの濃さにより、相対値としての酵素単位を算出した。
結果を図２に示す。図２に示すように、市販単位既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの結果（図２レーン３）と比較してレーン６および７がほぼ同等の結果を示した。このことから、レーン６および７に使用した酵素標品５μｌには単位既知Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと同等の活性があると判断した。
５． 逆転写酵素活性
インビトロジェン社製ＥｎｚＣｈｅｋ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて、マニュアルどおりに逆転写酵素活性の測定及びその反応産物の検出を行った。また、インビトロジェン社製ＲＮＡラダー（０．２４〜９．５ｋｂ）を鋳型としても同様に逆転写反応を行い、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供してその反応産物をオートラジオグラフィーにより検出した。
結果を図３および４に示す。図３レーン４〜６に示すように、塩化マンガンの有無にかかわらず逆転写産物が検出された。また、その逆転写産物は図４レーン２〜４とレーン５〜７を比較しても分がるように、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの逆転写産物よりも長鎖のものであった。
６． 等温遺伝子増幅
以下に示す条件で等温遺伝子増幅を行った。
増幅条件：６０℃，９０分間
反応液（２５μｌ中） Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（０．０１μｌ／ｍｌ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０；０．５Ｍベタイン；１．４ｍＭ ｄＮＴＰ；ＢｓｍまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ４ユニットおよび４０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ。
用いたプライマーは以下の通りであった。
１６００ｎＭ ＥＦ５ ＡＣＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡ（配列番号１１）
１６００ｎＭ ＥＲ６ ＴＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣ（配列番号１２）
８ｍＭ ＥＲ６−Ｌ１ ＴＧＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧＧ（配列番号１３）
遺伝子増幅は、Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた反応液中でＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の存在下で、６０℃、９０分間リアルタイムでモニタした。
結果を図５に示す。図５に示すように本発明のＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、従来から存在していたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合よりも早く増幅した。また、目的配列が増幅されていることを確認するために、シークエンサーを用い増幅のシークエンス配列を読んだところ、目的配列が増幅されていることが確認された。図６にテンプレート配列（配列番号１０）とプライマーの位置関係を示す。図６の配列中、下線部がプライマー領域であり、ループプライマーは枠で囲んである。
本発明において、ＤＮＡの取得は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ及びＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｃ（１９８８）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って取得することができる。
本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、公知のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を比較し、共通の配列を有する保存領域の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、該プライマーを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を材料に用いて単離することができる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の上流にはｐｈｏＲが、下流にはｍｕｔＭが保存されていることから、該保存されている部分の配列に基づいてプライマーを設計すればよい。該プライマーを用いてＰＣＲにより、遺伝子を増幅する。次いで増幅産物をクローン化し、配列を決定し、ＯＲＦ部分を挟むように設計したプライマー対を用いてさらに増幅すればよい。この際、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に相当する部分を単離する場合は、プライマーの一方に大腸菌のクレノウ断片のＮ末端に相当する位置の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、クレノウ断片に相当する部分を挟むようにして用いればよい。
本発明は、上記プライマーを用いて、微生物よりポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離する方法を包含する。用いるプライマーとして、例えば、保存領域の配列に基づいて設計された配列番号１および２に表される塩基配列からなるプライマー対がある。また、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＯＲＦ部分を挟むプライマーとして配列番号３および４に表される塩基配列からなるプライマー対があり、クレノウ断片に相当する部分を単離する場合に用いるプライマーとして配列番号５に表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。微生物は限定されず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物だけでなく、広く細菌を含む。微生物よりポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを単離するには、保存領域の配列に対応するプライマー対を調製し、微生物から鋳型ゲノムＤＮＡを調製し、前記プライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅し、増幅断片をクローン化し、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＯＲＦまたはクレノウ断片に相当する部分を挟むプライマー対を用いて増幅し、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを構築して、発現させればよい。
本発明は、このようにして得られた微生物由来のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼおよび該ポリメラーゼをコードするＤＮＡも包含する。
本発明のポルＩ型ポリメラーゼは、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性、相補鎖置換複製酵素活性、逆転写酵素活性を有する。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する利点は、基質を取り込む際のエラーが少ない点などが挙げられる。本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの至適温度は公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼより低温度であり、５０〜６０℃、好ましくは５０〜５５℃で活性を有する。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、従来の相補鎖置換複製酵素活性を持ったＤＮＡポリメラーゼより低温度の反応条件で用いることができ、より室温に近い温度で用いることが可能となった。また逆転写活性があるので、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成することができ、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法に利用できる。
本発明は、上記のようにして得られるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼであるタンパク質および該ポリメラーゼをコードするＤＮＡを包含する。
配列番号６に本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号７に本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を例示する。
さらに、本発明はポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端側アミノ酸を欠失させたΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼおよびそれをコードするＤＮＡも包含する。欠失させるＮ末端側のアミノ酸の数は、ΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有する限り限定されない。好ましくは、ΔＮポル型ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に対応する活性を有する。ΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号７に表されるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失している。クレノウ断片に対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号７に表されるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の１番目のＶａｌから２９７番目のＧｌｕまでの２９７残基のアミノ酸を欠失している。配列番号８にクレノウフラグメントに対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、配列番号９にクレノウ断片に対応するΔＮポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。すなわち、本発明のタンパク質は、配列番号７に表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失しており、相補鎖置換複製酵素活性を有するタンパク質をも包含する。該タンパク質は、アミノ酸の欠失数が多い場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。この場合、遺伝子増幅を行う際に増幅産物を分解してしまうことがないという利点を有する。
さらに、本発明は、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質および該タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’側を分解してしまうため、核酸増幅速度が遅くなる。一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを分解しないため、核酸増幅速度が速くなるという利点を有する。また、ＤＮＡの変異検出に際して、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いると、プライマーの３’側が分解されてしまうことにより変異箇所をプライマーが認識することができず、伸長合成反応が進んでしまい、変異検出ができない。一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いると、プライマーが分解されないため、変異箇所でプライマーがアニールすることなく、伸長合成反応を停止することができ、変異を検出することができるという利点を有する。
また、配列番号６に表されるＤＮＡ配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。さらに、配列番号８に表されるＤＮＡ配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。
また、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、配列番号６に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号８に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡをも含む。さらに、上記ＤＮＡに対するＲＮＡ、又は該ＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＲＮＡであってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質またはポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードするＲＮＡも本発明に含まれる。
さらに、配列番号６または８に表される塩基配列の縮重変異体も、本発明のＤＮＡに含められる。
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて容易に行うことができる。
さらに、本発明は、配列番号７に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質、配列番号９に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質を包含する。さらに、本発明は配列番号７に表されるアミノ酸配列から１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換または付加の変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を包含する。該タンパク質は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失していても保持していてもよい。１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個または２個のアミノ酸の欠失、置換または付加をいう。
さらに、本発明は上記のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
本発明は、微生物からＤＮＡポリメラーゼを単離するために用いるプライマーおよびプローブを包含する。該プライマーまたはプローブは、上記のＤＮＡの断片であり、塩基の数は５〜５０、好ましくは１０〜３０、さらに好ましくは１５〜２５である。増幅させる塩基配列の長さは限定されない。
本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡおよびその変異体を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に該ベクターを導入し、該宿主細胞を培養することにより、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。この際、適宜ＧＳＴをコードするＤＮＡやヘキサヒスチジンをコードするＤＮＡを連結させてもよい。ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。プロモータとしては、宿主細胞で効率よく発現するものであればいかなるプロモータでもよいが、例えば、ＳＲαプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＨＳＶ−ＴＫプロモータ等が挙げられる。
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの単離精製は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
本発明は、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体をも含む。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の両者を含む。抗体は公知の方法により作製できる。抗体は、機能的断片をも含み、抗体の機能的断片とは、（Ｆａｂ）２フラグメントおよび（Ｆａｂ）フラグメント等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆる分子を意味する。得られた抗体は、例えば、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。
さらに、本発明は、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法を包含する。核酸増幅方法として、公知のＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ＲＴ−ＰＣＲ法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、三谷法（Ｍｉｔａｎｉ ｍｅｔｈｏｄ）（ＷＯ０１／０３０９９３号国際公開パンフレット）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３（２０００）；医学のあゆみ，Ｖｏｌ．２０６，Ｎｏ．８，４７０−４７４，２００３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．３，２２３−２２９，２００２）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特開平１０−３１３９００号公報；「検査と技術 Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．３」、（１９９６年）、佐藤隆著、（株）医学書院発行、２４１頁〜２４３頁）、ＩＣＡＮ（登録商標）（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（ＷＯ００／５６８７７号国際公開パンフレット），ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（日本国特許第２６５０１５９号公報）等が挙げられ、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼいずれの方法においても用いることができる。この中でも、三谷法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法等の等温増幅法に適している。これらの遺伝子増幅法において、従来用いられていたＤＮＡポリメラーゼの代わりに本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
さらに、本発明は、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅キットを包含する。該キットは上記のいずれかの核酸増幅法に適応させたキットである。該キットは、本発明のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの他、プライマー、ｄＮＴＰ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＣｌ、ＭｇＳＯ４、ベタイン等を含む。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
１． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ ＤＮＡポリメラーゼクローニング
Ｂ．ｓｍｉｔｈｉｉ ＪＣＭ９０７６培養菌体より定法にてゲノムＤＮＡを調製した。次いで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の他種のｐｏｌＡの遺伝子構造より上流にｐｈｏＲ、下流にｍｕｔＭが保存されていることから、各々の遺伝子の保存領域よりプライマーＰｈｏＦ（配列番号１）、ＭｕｔＲ（配列番号２）を設計した。さらに、調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰｈｏＦ、ＭｕｔＲをプライマーにＰＣＲを行い遺伝子増幅し、増幅断片をＰｒｏｍｅｇａ社製ｐＧＥＭ−Ｔにてクローン化し、定法により内部配列を決定した。決定したシーケンスよりｐｏｌＡと思われるＯＲＦ部分をＢｓｔｈ−ＥｃｏＮＦ（配列番号３）とＢｓｔｈ−ＳａｌＣＲ（配列番号４）にてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物およびｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、混合して連結することによりＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩ発現プラスミド構築した。前記のように決定したシーケンスよりｐｏｌＡのＥ．ｃｏｌｉクレノウ断片のＮ末端と同等位置に相当するＢｓｔｈ−ＥｃｏＬＦ（配列番号５）とＢｓｔｈ−ＳａｌＣＲ（配列番号４）にてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物およびｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、混合して連結することによりΔＮ Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを構築した。
２． Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩ及びΔＮ Ｂｓｍ ＤＮＡポリメラーゼＩの発現及び精製
（１）培養、発現、及び粗抽出液調製
ｐＵＣＢｓｍまたはｐＵＣｄＮＢｓｍを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌにて３７℃一晩培養して前培養液とした。得られた前培養液５ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養（Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，ＦＩＲＳＴＥＫ ＯＳＩ−５０２ＬＤ）を行った。ＯＤ６００ｎｍ値が０．５付近になったときに、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。さらに、３７℃、２００ｒｐｍにて１〜２時間振盪培養を行った。得られた培養液を遠沈管に移し、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を得た。得られた沈殿を１×ＰＢＳ ３０ｍｌにて懸濁し、再度４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。得られた沈殿を１×ＰＢＳ ２５ｍｌにて懸濁し、１０ｓｅｃ×６の超音波にて細胞を破砕（ＭＩＳＯＮＩＸ Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬ）した。超音波破砕後の試料を１５，０００×ｇ、３０分間遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清に３０％ポリエチレンイミン溶液を終濃度０．１％となるように添加して混合し、氷中で３０分間放置した後、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。本上清を粗抽出液とした。
（２） 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を同ランニングバッファーで洗浄した。約１５ＣＶの０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。
（３） ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎを用いてヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで用いたのと同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を同ランニングバッファーで洗浄した。約２２ＣＶの０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化ナトリウムにバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。
（４） ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅを用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化ナトリウムを用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、ヘパリン画分をアプライした後、同ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は１ｍｌごとに分画し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して該当分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファー（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロール）にバッファー置換を行い、これを精製酵素標品とした。
３． ＤＮＡポリメラーゼ活性測定
インビトロジェン社製Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬を用いて、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１，６６４−６６８（１９９６）を参考にＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬をＴＥ緩衝液と１：３４５となるように混合し、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡとプライマー、ｄＮＴＰ、精製酵素標品の混合物２７μｌに対して１７３μｌを添加し、室温で５分間放置した後に励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。このとき、市販で単位既知のクレノウ断片を同様に測定し、その値より相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の−例を示す。尚、標準直線は測定ごとに作成している。市販のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを標準として、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定したところ、表１のような結果を得た。
ｙ＝７．８４５７ｘ＋５８．２４７（Ｒ２＝０．８９６７）
また、同時に測定したＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼ試料は、平均９６．２６（１回目９８．８１４、２回目９３．７０７）の蛍光強度を示したことから、本回帰直線式より、約４．８５ｕｎｉｔと算出された。
４． 相補鎖置換複製活性測定
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３（２０００）に従って、ＬＡＭＰ法により、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μＭ ＦＩＰ、０．８μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１Ｍベタイン、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２〜４ｍＭ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを９５℃で５分間放置し、次いで氷上で５分間放置した。これに精製酵素標品５μｌを加えて５５℃〜６５℃で１時間放置し、これをアガロースゲル電気泳動に供した。このとき、市販で単位既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｎｏ．ＭＯ２７５Ｓ）を同様に測定し、その電気泳動後の生成物バンドの濃さにより、相対値としての酵素単位を算出した。
結果を図２に示す。図２に示すように、市販単位既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの結果（図２レーン３）と比較してレーン６および７がほぼ同等の結果を示した。このことから、レーン６および７に使用した酵素標品５μｌには単位既知Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと同等の活性があると判断した。
５． 逆転写酵素活性
インビトロジェン社製ＥｎｚＣｈｅｋ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて、マニュアルどおりに逆転写酵素活性の測定及びその反応産物の検出を行った。また、インビトロジェン社製ＲＮＡラダー（０．２４〜９．５ｋｂ）を鋳型としても同様に逆転写反応を行い、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供してその反応産物をオートラジオグラフィーにより検出した。
結果を図３および４に示す。図３レーン４〜６に示すように、塩化マンガンの有無にかかわらず逆転写産物が検出された。また、その逆転写産物は図４レーン２〜４とレーン５〜７を比較しても分がるように、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの逆転写産物よりも長鎖のものであった。
６． 等温遺伝子増幅
以下に示す条件で等温遺伝子増幅を行った。
増幅条件：６０℃，９０分間
反応液（２５μｌ中） Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（０．０１μｌ／ｍｌ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０；０．５Ｍベタイン；１．４ｍＭ ｄＮＴＰ；ＢｓｍまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ４ユニットおよび４０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ。
用いたプライマーは以下の通りであった。
１６００ｎＭ ＥＦ５ ＡＣＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡ（配列番号１１）
１６００ｎＭ ＥＲ６ ＴＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣ（配列番号１２）
８ｍＭ ＥＲ６−Ｌ１ ＴＧＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧＧ（配列番号１３）
遺伝子増幅は、Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた反応液中でＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の存在下で、６０℃、９０分間リアルタイムでモニタした。
結果を図５に示す。図５に示すように本発明のＢｓｍ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、従来から存在していたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合よりも早く増幅した。また、目的配列が増幅されていることを確認するために、シークエンサーを用い増幅のシークエンス配列を読んだところ、目的配列が増幅されていることが確認された。図６にテンプレート配列（配列番号１０）とプライマーの位置関係を示す。図６の配列中、下線部がプライマー領域であり、ループプライマーは枠で囲んである。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、従来の鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼより低温度の反応条件で活性を持っているため、より室温に近い温度で用いることが可能となった。また逆転写活性があるので、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成することができ、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法に利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号１〜５、１０〜１３：合成
［配列表］
［配列表］
Claims (16)
- 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質 - 以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのタンパク質であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列から、１番目のＶａｌから始まる連続したアミノ酸配列であって２９７番目のＧｌｕまでのいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質 - 以下の（ｇ）から（ｊ）のＤＮＡであり、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、タンパク質をコードするＤＮＡ - 請求項２または３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
- 請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
- 相補鎖置換複製酵素活性および逆転写酵素活性を有する請求項１に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
- ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１または７に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
- ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１、７または８に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
- ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１、７または８に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ。
- 請求項１および７〜１０のいずれか１項に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法。
- 等温増幅法である請求項１１記載の核酸増幅法。
- 請求項１および７〜１０のいずれか１項に記載のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キット。
- ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）（３）の増幅断片をクローン化する工程、
（５）ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いて増幅する工程、ならびに
（６）（５）の増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。 - 配列番号８で表される配列からなるポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングする方法であって、
（１）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用意する工程、
（２）鋳型ゲノムＤＮＡを用意する工程、
（３）配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用いて鋳型ゲノムＤＮＡを増幅する工程、
（４）増幅断片をクローン化する工程、
を含む方法。 - 請求項２または３に記載のＤＮＡの断片からなるプライマーであり、５〜５０個の塩基からなるプライマー。
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