JP2015057996A - チューリッポシドbをチューリッパリンbに変換する酵素活性の高いタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係るタンパク質は、下記(A)又は(B)である。(A)特定の配列(TgTCEB1)又は特定の配列(TgTCEB2)に示す配列を有するタンパク質。(B)(TgTCEB1)又は特定の配列(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換,欠失,挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドB及びその類縁体をチューリッパリンBに変換する酵素活性の高い、タンパク質。
【選択図】図1
Description
本発明者らのこれまでの研究により、チューリップの花弁,球根,葯等の各種組織から酵素の精製を試みたところ、チューリッポシド変換酵素には、チューリッポシドAとチューリッポシドBのそれぞれの基質に適したチューリッポシドA変換酵素とチューリッポシドB変換酵素の少なくとも二種類の酵素が存在していることが確認された。
このうち、チューリッポシドAをチューリッパリンAに変換する酵素活性が高いタンパク質については先に提案している(特許文献1,2)。
チューリッパリンBは、チューリッパリンAと比較してアレルギー性が低い特徴もあり、今回はチューリッポシドBをチューリッパリンBに変換するのに有用な酵素を検討し、本発明に至った。
(A)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示す配列を有するタンパク質。
(B)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換,欠失,挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドB及びその類縁体をチューリッパリンBに変換する酵素活性の高い、タンパク質。
(a)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換,欠失,挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドB及びその類縁体をチューリッパリンBに変換する酵素活性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(c)配列番号7又は配列番号10に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(d)配列番号7又は配列番号10に示す塩基配列と90%以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号9又は配列番号12のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
チューリッポシドA及びBの類縁体には、特許文献1,2に開示するものが含まれる。
ここで、チューリッポシドAの類縁体とは化合物中に化学式(1)の骨格を有するものをいい、チューリッポシドBの類縁体とは化合物中に化学式(2)の骨格を有するものをいう。
代表例としては、下記化学式(4)に示すチューリッパリンA(α−メチレン−γ−ブチロラクトン)及び下記化学式(5)で示すチューリッパリンB(α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン)が挙げられる。
<クローニング>
チューリップ各組織粗酵素中のチューリッポシドA変換酵素(tuliposide A-converting enzyme)活性とチューリッポシドB変換酵素(tuliposide B-converting enzyme)活性の測定から、酵素活性比(B/A)は、葯において高いことが我々のこれまでの研究によって分かっていたが、酵素活性局在性の詳細な検討の結果、葯のチューリッポシドB変換酵素活性の大部分は葯に付着している花粉に由来するものであることが分かった。
そこで、チューリップ品種「紫水晶」の花粉から各種カラムクロマトグラフィーを経て、チューリッポシドB変換酵素を精製し、その内部アミノ酸配列に基づいて、下記の縮重プライマーを設計した。
TCEB−deg−F1:agyggicgcatigagcgtctigg(配列番号1)
TCEB−deg−R1:gaiatraaiagrtgrtcraaatcg(配列番号2)
「紫水晶」の花粉より精製したmRNAから逆転写反応によって合成したcDNAを鋳型として、上記縮重プライマーを用いてPCRを行い、当該遺伝子の部分cDNA配列を取得し、さらに5’RACE法および3’RACE法によってコード領域全長を含むcDNA断片を単離した。
次に5’および3’非翻訳領域に設計した下記のプライマーを用いて、上記花粉mRNA由来cDNAを鋳型としてPCRを行った。
TCEB−full−F1:agtccgtcatcatcaaacagtcc(配列番号3)
TCEB−full−R1:gcgttgtctttgccattgac(配列番号4)
その時の条件を以下に示す。
<PCR反応液(50μl)組成>
鋳型cDNA(4ng/μl)1μl、50pmol/μlプライマー各0.5μl、2mM dNTPs 5μl、5 x buffer 10μl、Phusion Hot Start II High−Fidelity DNA Polymerase 0.5μl、水32.5μl
<PCR反応サイクル>
98℃、30秒の加熱の後、変性(98℃、10秒)→アニーリング(55℃、30秒)→伸長(72℃、1分)の3ステップからなる反応サイクルを35回行った。
PCR増幅産物をpCR−Blunt II−TOPOベクターにライゲーション後、大腸菌DH5αを形質転換し、インサートDNAの挿入が確認されたクローンについてシークエンシングしたところ、TgTCEB1、TgTCEB2と命名した2種類の全長cDNA配列が得られた。
その塩基配列とアミノ酸配列を下記に示す。
(1)−1.TgTCEB1の塩基配列を(配列番号7)に示す。
(1)−2.TgTCEB1のコドン対応アミノ酸配列を(配列番号8)に示す。
(1)−3.TgTCEB1のアミノ酸配列を(配列番号9)に示す。
(2)−1.TgTCEB2の塩基配列を(配列番号10)に示す。
(2)−2.TgTCEB2のコドン対応アミノ酸配列を(配列番号11)に示す。
(2)−3.TgTCEB2のアミノ酸配列を(配列番号12)に示す。
次に、「紫水晶」の葉より調製したゲノムDNAに対し、これら両配列のコード領域全長(翻訳開始コドンから停止コドンまで)を増幅するように設計した下記のプライマーを用いて、ゲノムPCRを行った。
TCEB−CDS−F1:atgtctatcgtcagcttctgtagc(配列番号5)
TCEB−CDS−R1:ttagctgctgtagggaaccg(配列番号6)
その時の条件を以下に示す。
<PCR反応液(50μl)組成>
鋳型ゲノムDNA(50ng/μl)1μl、10pmol/μlプライマー各2.5μl、2mM dNTPs 5μl、25mM MgSO4 3μl、10 x buffer 5μl、KOD−Plus Neo DNA Polymerase 1μl、水30μl
<PCR反応サイクル>
94℃、2分の加熱の後、変性(98℃、10秒)→アニーリング/伸長(70℃、1分)の2ステップからなる反応サイクルを35回行った。
PCR増幅産物のクローニングとシークエンシングの結果、上記cDNAに対応する2種のゲノムクローンが得られた。
また、cDNAクローンとゲノムクローンの比較から、TgTCEB1およびTgTCEB2はイントロンを含まない遺伝子であることが分かった。
TgTCEB1とTgTCEB2の塩基配列は配列番号7と10を比較したところ、845番目の1塩基のみが異なっていた。
いずれも440アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしており、そのアミノ酸配列は完全に一致するものであった。
TgTCEB1と、特許文献1及び2に記載したチューリップ花弁および球根から単離されたチューリッポシドA変換酵素遺伝子(それぞれTgTCEA1およびTgTCEA−b1)がコードするアミノ酸配列を図1に示す。
これらのアミノ酸配列を比較すると、チューリッポシドB変換酵素の配列とチューリッポシドA変換酵素の配列は明らかに異なるものであることが分かる。
TgTCEB1はTgTCEA1と52.4%、TgTCEA−b1と53.4%のアミノ酸配列の相同性(identity)を有していた。
TgTCEB1の全長アミノ酸配列と花粉からの精製酵素のN末端アミノ酸配列の比較によって推定されたシグナルペプチド領域を除いた成熟ポリペプチドを発現するように、当該配列を大腸菌発現ベクターpET28aにサブクローニングした。
組換え酵素のN末端側にはヒスチジンタグ(6xHis)を含むようにした。
組換えベクターを大腸菌Rosetta 2(DE3)に導入し、得られた組換え菌をLB培地(50μg/mlカナマイシン、35μg/mlクロラムフェニコール含有)にてOD660=0.6−0.8に達するまで37℃、200rpmで培養した後、最終濃度1mMのIPTGを添加し、18℃、200rpmで18時間培養することで組換え酵素を発現させた。
発現誘導後の菌体に超音波処理を施し、得られた可溶性タンパク質画分をTALON Metal Affinity Resinを用いた金属アフィニティークロマトグラフィーに供した。
TALON樹脂に結合後、溶出buffer(50mM HEPES、200mM NaCl、200mMイミダゾール、pH7.5)によって溶出された活性画分に、タンパク質1mgあたり1.5ユニットのトロンビンを加え4℃で一晩静置反応することで、ヒスチジンタグを含むベクター由来の17アミノ酸残基からなるペプチドを切断した。
このものをSuperdex 200カラムによるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、活性画分を合一することで、ヒスチジンタグを含まない精製組換え酵素を得た。
組換え酵素精製過程のSDS−PAGEを図2に示す。
この精製過程によって、組換え大腸菌培養液500mlから概ね10−15mg程度の組換え酵素を得ることができる。
精製組換え酵素のG3000SWxlカラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果、組換え酵素は花粉由来の天然型酵素と同様に2量体酵素として発現していることが分かった。
上記にて精製した組換え酵素の酵素活性試験を次のように行った。
50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)中、4mMチューリッポシドAまたは4mMチューリッポシドBと組換え酵素を含む50μlの酵素反応液を室温で10分インキュベートした後、0.5Mリン酸を50μl加えることで反応を停止し、酵素反応生成物であるチューリッパリンAまたはチューリッパリンBの生成量を逆相系HPLCにて定量した。
その結果、精製したTgTCEB1組換え酵素はチューリッポシドBをチューリッパリンBに変換する酵素活性を有していることが確認された。
本組換え酵素はチューリッポシドAをチューリッパリンAに変換する酵素活性も有していたが、その活性はチューリッポシドBに対する活性の約140分の1と低いものであったことから、TgTCEB1およびTgTCEB2はチューリッポシドB変換酵素をコードしていることが確認された。
また、組換え酵素精製過程において、ヒスチジンタグを含むベクター由来17アミノ酸残基の除去によって、酵素活性は約2倍程度向上したことから、高活性の組換え酵素の調製にはタグの除去が有効であることが示された。
TgTCEB1組換え酵素と、組換えチューリッポシドA変換酵素(花弁由来TgTCEA1および球根由来TgTCEA−b1)の酵素活性の比較を表1に示す。
酵素活性は基質濃度4mMにおける値。
いずれの組換え酵素もヒスチジンタグを含むベクター由来アミノ酸残基を除いたもの。
Claims (2)
- 下記(A)又は(B)で示されるタンパク質。
(A)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示す配列を有するタンパク質。
(B)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換,欠失,挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドB及びその類縁体をチューリッパリンBに変換する酵素活性の高い、タンパク質。 - 下記(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号9(TgTCEB1)又は配列番号12(TgTCEB2)に示すアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸の置換,欠失,挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシドB及びその類縁体をチューリッパリンBに変換する酵素活性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(c)配列番号7又は配列番号10に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(d)配列番号7又は配列番号10に示す塩基配列と90%以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号9又は配列番号12のいずれかに示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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