WO2006109578A1 - 改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素、及びピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性改良法 - Google Patents

改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素、及びピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性改良法 Download PDF

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WO2006109578A1
WO2006109578A1 PCT/JP2006/306662 JP2006306662W WO2006109578A1 WO 2006109578 A1 WO2006109578 A1 WO 2006109578A1 JP 2006306662 W JP2006306662 W JP 2006306662W WO 2006109578 A1 WO2006109578 A1 WO 2006109578A1
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WO
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amino acid
pqqgdh
glucose dehydrogenase
modified
dependent glucose
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PCT/JP2006/306662
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Akitoshi Suzumura
Yuji Nakanishi
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Amano Enzyme Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
    • C12Y101/05002—Quinoprotein glucose dehydrogenase (1.1.5.2)

Definitions

  • the present invention relates to a pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase. Specifically, the present invention relates to a modified pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase, a production method thereof, and use thereof.
  • the modified pyrroloquinoline quinone-dependent dulcose dehydrogenase of the present invention is used, for example, for measuring glucose levels in clinical tests and the like.
  • PQQGDH Pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
  • PQQ Pyroguchi quinoline quinone
  • PQQ pro-enzyme Pyroguchi quinoline quinone
  • PQQGDH As PQQGDH reported in the past, PQQGDH produced by Acinetobacter sp. LMD 79.41 and its modified PQQGDH are known (for example, Patent Documents 1 to 5, Non-patents). Reference 1).
  • the substrate specificity of PQ QGDH produced by this strain L.M.D 79.41 was low, for example, it had a reactivity corresponding to about 90% of the reactivity to glucose with respect to maltose.
  • Patent Documents 6 to 8 a technique for modifying the substrate specificity of PQQGDH produced by Acinetopacter 'Baumann' has been proposed.
  • Patent Document 9 the present inventors examined in detail the relationship between substitution of amino acids in specific regions and changes in substrate specificity in PQQGDH produced by Acinetopacter calcoaceticus, and identified regions involved in substrate specificity.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-312588
  • Patent Document 2 JP 2000-350588 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-197888
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-346587
  • Patent Document 5 Pamphlet of International Publication No.02Z34919
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-313172
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-313180
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-344145
  • Patent Document 9 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-173538
  • Non-Patent Document 1 A- M Cleton- Jansen et al. Mol. Gen. Genet., 217, 430 (1989)
  • PQQGDH requires high substrate specificity in order to accurately measure glucose. For example, when diabetes is diagnosed in a patient who receives an infusion, if the substrate specificity is low and PQQGDH is used, the measured value will be in addition to the infusion volume. The amount of maltose in the blood may be measured, and an accurate blood glucose level cannot be obtained. Similarly, when measurement is performed on a patient with liver dysfunction, for example, there is a possibility that measurement cannot be performed with high reliability due to the influence of galactose. In this way, substrate specificity is low! PQQGDH is greatly influenced by other carbohydrates such as maltose and cannot accurately measure glucose.
  • the substrate specificity is improved by substituting some amino acids of the wild type PQQGDH.
  • Such modification by introducing a mutation into the structural gene is accompanied by a decrease in the reactivity (specific activity) to glucose which should be maintained even if the substrate specificity is improved. If the reactivity to glucose decreases, the amount of enzyme required to obtain a certain amount of activity increases, leading to an increase in manufacturing costs and making it difficult to supply PQQGDH at a low cost.
  • the present invention provides a modified PQQGDH having a high substrate specificity for glucose (particularly a low reactivity for maltose), particularly for glucose. Another object is to provide a modified PQQ GDH having a high substrate specificity and a high reactivity (specific activity) to glucose. Another object is to provide a method for producing a modified PQQGDH having such excellent characteristics.
  • nucleic acid, expression vector, and transformant that can be used for the production of modified PQQGDH having such excellent characteristics, a method for producing modified PQQGDH using these, and a kit for measuring dalcose It is also intended to provide such as.
  • the present inventors have added substrate amino acids to a specific region that is not replaced by amino acid substitution at a specific position of the wild-type enzyme. Attempted modification. That is, using PQQGDH, which produces Acinetobacter calcoaceticus, as a model of wild-type PQQGDH, the relationship between the addition of amino acids to specific regions and changes in substrate specificity was examined in detail. As a result, it has been surprisingly found that by adding an amino acid to the carboxy terminus, the reactivity to maltose is significantly reduced while maintaining a high reactivity (specific activity) to glucose.
  • enzymes (proteins) having the same function are often similar in structure of the active site and the region involved in substrate specificity. Because of this similarity, there is a high probability that a specific modification that is effective in improving the substrate specificity of an enzyme is effective against other enzymes having the same function.
  • Substrate specificity is improved by amino acid substitution in a region corresponding to the specific region.
  • the PQQGDH produced by microorganisms belonging to the genus Acinetopacter Thus, empirical facts show that a modification means effective for improving the substrate specificity of PQQGDH produced by one species is also effective for improving the substrate specificity of PQQGDH produced by other species of the same genus. is there.
  • the above findings obtained by the present inventors regarding the improvement of the substrate specificity of PQQGDH are the other findings belonging to the genus Acinetopacter that are not only for PQQGDH produced by Acinetobacter calcoaceticus. Naturally, it can be applied to PQQGDH produced by species of microorganisms, and it is highly likely to be widely applicable to PQQGDH produced by microorganisms belonging to other genera.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following configurations. That is, the present invention is a modified product having an amino acid sequence that is different from the amino acid sequence of the reference pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase in that one or more amino acids are added to the C-terminal side.
  • the present invention relates to a type of pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
  • a modified PQQGDH derived from a microorganism belonging to the genus Pacinetopacter is a reference pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (reference PQQGDH) force.
  • reference PQQGDH pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
  • a specific example of microorganisms belonging to the genus Acinetopacter is Acinetopacter calcoaceticus.
  • the reference PQQGDH has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Still another embodiment of the present invention provides a modified PQQGDH in which amino acid substitution at a specific position is performed in addition to addition of a carboxy terminus.
  • the amino acid substitution here is based on the amino acid sequence of the reference PQQGDH, the amino acid corresponding to the 16th amino acid in the pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase derived from cinecinebacter 1 'calcoaceticus, the 22nd Amino acid corresponding to the amino acid, Amino acid corresponding to the 67th amino acid, Amino acid corresponding to the 68th amino acid, Amino acid corresponding to the 69th amino acid, Amino acid corresponding to the 75th amino acid, Amino acid corresponding to the 76th amino acid , Amino acid corresponding to amino acid 116, amino acid corresponding to amino acid 120, amino acid corresponding to amino acid 127, amino acid corresponding to amino acid 143, amino acid corresponding to amino acid 167, amino acid 168 Amino acid corresponding to, amino acid corresponding to amino acid 169, corresponding to amino acid 171 Amino acid, an amino acid that corresponds to the 177 th amino acid, corresponds
  • amino acid corresponding to amino acid No. 350 amino acid corresponding to amino acid No. 351 No acid, amino acid corresponding to amino acid 356, amino acid corresponding to amino acid 423, amino acid corresponding to amino acid 429, amino acid corresponding to amino acid 432, amino acid corresponding to amino acid 433, amino acid 434
  • amino acid corresponding to the amino acid No. 4 amino acid corresponding to the No. 439 amino acid, and the amino acid selected from the group consisting of the amino acids are carried out.
  • the present invention also relates to SEQ ID NO: 1, amino acid No. 16, amino acid No. 22, amino acid No. 67, amino acid No. 68, amino acid No. 69, amino acid No. 75, amino acid No. 76, No. 116.
  • a specific example of such an embodiment is a modified PQQGDH having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 31.
  • the above amino acid substitutions have so far been substrates of PQQGDH Includes amino acid substitutions reported to be effective in improving specificity (JP 2000-312588, JP 2000-350588, JP 2001-197888, JP 2001-346587, International Publication No. 02Z34919, JP 2004-313172, JP 2004-313180, JP 2004-344145, JP 2004-1 73538, and A-M Cleton-Jansen et al. Mol. Gen. Genet., 217, 430 (1989) etc.).
  • the reactivity (relative activity ratio) to maltose is 40% or less, expressed as a relative value when the reactivity to glucose is 100%. Further, in a preferred embodiment of the present invention, the reactivity (specific activity) relative to glucose when the reactivity (specific activity) of the reference PQQGDH to glucose is 100%, and the reactivity (specific activity) to glucose is 70% or more. It is.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding the modified PQQGDH of the present invention.
  • the present invention further provides a vector retaining the nucleic acid and a transformant retaining the nucleic acid.
  • a method for producing modified PQQGDH comprising the steps of culturing the transformant under conditions that allow the nucleic acid to be expressed, and recovering the expression product of the nucleic acid.
  • the present invention further provides a glucose measurement reagent comprising the modified PQQGDH of the present invention, and a glucose measurement kit comprising the reagent.
  • the substrate specificity of PQQGDH is improved by adding at least one amino acid to the carboxy terminus of pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
  • PQQGDH to be used for improving substrate specificity is preferably derived from microorganisms belonging to the genus Acinetopacter, particularly those derived from Acinetopacter calcoaceticus (for example, NBRC 12552 strain).
  • Fig. 1 shows the sequence of a gene encoding a pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus. Null region is not included ( ⁇ ) and amino acid sequence (signal region is not included)
  • Fig. 2 shows the sequence (including signal region) and amino acid sequence (including signal region) of the gene encoding pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase derived from Acinetobacter calcoaceticus ).
  • FIG. 3 is a restriction map of the expression vectors pTrcGDHBS and PQQGDH used in the examples.
  • PQQGD H derived from microorganisms other than Acinetopacter calcocaceticus the primary structure is compared and the homology of the secondary structure is taken into account, and the two PQQGDH derived from Acinetopacter calcoaceticus are present.
  • a region that is reasonably considered to have the same function as the secondary structure region can be said to be “corresponding to the secondary structure region of PQQGDH derived from Acinetopacter calcoaceticus”.
  • the amino acid position is excluding the signal sequence
  • the N-terminal amino acid of the mature enzyme is number 1 (for example, aspartic acid is number 1 for the amino acid of SEQ ID NO: 1). It is specified by the number when the numbering is performed sequentially from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • nucleic acid as used herein includes DNA (including cDNA and genomic DNA), RNA (including mRNA), DNA analogs, and RNA analogs.
  • the form of the nucleic acid of the present invention is not limited, that is, it may be either single-stranded or double-stranded. Preferred is double-stranded DNA. Also Codon degeneracy is also considered. That is, in the case of a nucleic acid encoding a protein, it has an arbitrary base sequence as long as the protein can be obtained as its expression product.
  • nucleic acid encoding a modified pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase means a nucleic acid from which the modified PQQGDH can be obtained when it is expressed. Not only nucleic acids having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the modified PQQGDH, but also nucleic acids (for example, one or a plurality of nucleic acids) that do not encode an amino acid sequence and have a sequence added thereto. DNA containing introns).
  • isolated nucleic acid refers to a nucleic acid that is separated from other nucleic acids that coexist in the natural state, in the case of a nucleic acid that naturally exists in nature. Say. However, it may include some other nucleic acid components such as adjacent nucleic acid sequences in the natural state!
  • isolated nucleic acid in the case of genomic DNA is substantially free of other DNA components that coexist in nature (including adjacent DNA sequences). Not included.
  • isolated nucleic acid preferably refers to a nucleic acid that is substantially free of cell components and culture medium.
  • an ⁇ isolated nucleic acid '' in the case of a nucleic acid produced by chemical synthesis preferably does not substantially contain a precursor (raw material) such as dNTP or a chemical substance used in the synthesis process! /, State nucleic acid!
  • a nucleic acid is an “isolated nucleic acid” as long as it exists as a result of artificial manipulation, whether it is present as part of a vector or composition or in a cell as an exogenous molecule.
  • nucleic acid when simply described as “nucleic acid” in the present specification, it means an isolated nucleic acid.
  • the present invention relates to a modified pyroguchi quinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (also referred to herein as “PQQGDH”! /).
  • the modified PQQGDH of the present invention has an amino acid sequence in which an amino acid is added to the carboxy terminus (C terminus) side of the amino acid sequence of the reference PQQGDH. That is, the amino acid sequence of PQQGDH of the present invention has one or more amino acids on the C-terminal side. Is different from the amino acid sequence of the reference PQQGDH in that it is added.
  • the reference PQQGDHJ is the PQQGDH based on (derived from) the modified PQQGDH of the present invention! /, And the reference PQQGDH is typically a wild type PQQGDH. For example, a certain wild type.
  • this wild-type PQQGDH can be referred to as “reference PQQGDH” for the modified PQQGDH.
  • PQQGDH obtained by subjecting wild-type PQQGDH to modifications other than addition of an amino acid to the C-terminal side serves as a reference PQQGDH.
  • PQQGDH applied with such a modification force is disclosed in, for example, JP 2000-312588, JP 2000-350588, JP 2001-197888, JP 2001-346587, WO 02, 34919 Panfreck, JP-A-2004-313172, JP-A-2004-313180, JP-A-2004-34145, JP-A-2004-173538, and A-M Cleton-Jansen et al. Mol. Gen Genet., 217, 430 (1989) and many others.
  • PQQGDHs are compared, whether or not one of them corresponds to the other reference PQQGDH can be estimated from the homology of both amino acid sequences.
  • Acinetobacter sp. Acinetobacter one 'force no coreaceticus, Acinetobacter baumannii', Shu. ⁇ Tomonas enore 3 r Noosa (Pseudomonas aeruginosa), ⁇ Tomonas pudanata, Pseudomonas fluorescens, ⁇ ⁇ Burkholderia cepacia, Gulco nobacter oxydans, PQQGDH produced by (Acetobacter aceti), Agrobacterium radiobacter, Escherichia coli, Klebsiella aerogenes and the like can be exemplified.
  • the standard PQQGDH is preferably derived from a microorganism belonging to the genus Vacinetopacter, more preferably from the genus Vacinetopacter.
  • An example of the amino acid sequence of wild-type PQQGDH derived from Acinetobacter i 'calcoaceticus (PQQGDH produced by NBRC 12552 strain) is shown in SEQ ID NO: 1.
  • PQQGDH produced by NBRC 12552 strain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • one or more amino acids are added to the C-terminal side of this amino acid sequence. It has an amino acid sequence constructed by at least being modified.
  • amino acid sequences added to the C-terminal side include ANNMVP (SEQ ID NO: 5), CGSQIA (SEQ ID NO: 6), TSNFPA (SEQ ID NO: 7), AQGYQQ (SEQ ID NO: 8), PPCNTP (SEQ ID NO: 9), SCPVD (SEQ ID NO: 10), PNESLA (SEQ ID NO: 11), HHHHHH (SEQ ID NO: 12), PTKTNI (SEQ ID NO: 13), VDI (SEQ ID NO: 14) ), WPAEPT (SEQ ID NO: 15), PDRLFL (SEQ ID NO: 16), and YPRLVG (SEQ ID NO: 17).
  • ANNMVP SEQ ID NO: 5
  • CGSQIA SEQ ID NO: 6
  • TSNFPA SEQ ID NO: 7
  • AQGYQQ SEQ ID NO: 8
  • PPCNTP SEQ ID NO: 9
  • SCPVD SEQ ID NO: 10
  • PNESLA
  • the modified PQQGDH of the present invention is characterized in that the selectivity for glucose is improved as compared to the reference PQQGDH.
  • the modified PQQGDH of the present invention is less reactive to maltose than the reference PQQGDH.
  • the modified PQQGDH of the present invention has a reactivity to maltose (relative activity ratio) of preferably 40% or less (for example, in the range of 0% to 40%). ), More preferably 30% or less (for example, in the range of 0% to 30%), and still more preferably 20% or less (for example, in the range of 0% to 20%).
  • the modified PQQGDH of the present invention is preferably maintained in a state of high reactivity (specific activity) to glucose.
  • the reactivity of the reference PQQGDH with respect to glucose (relative activity relative to 100% relative activity), and the reactivity of the modified PQQGDH of the present invention with respect to glucose (relative specific activity) is 70% or more ( For example, within the range of 70% to 100%), preferably 80% or more (for example, within the range of 80% to 100%), more preferably 90% or more (for example, within the range of 90% to 100%), and even more preferably 95% or more (for example, in the range of 95% to 100%), most preferably about 100%.
  • substrate specificity means selectivity for glucose.
  • modification is performed by substitution of a specific amino acid in the structural gene.
  • the amino acid sequence of the modified PQQGDH of this embodiment differs from the amino acid sequence of the reference PQQGDH in that one or more amino acids are added to the C-terminal side and the amino acid type at a specific position is different. To do.
  • amino acid sequence of the reference PQQGDH corresponds to the amino acid corresponding to the 75th amino acid in PQQGDH (hereinafter also referred to as "ACPQQGDH" for short) derived from acinetobacter calcoaceticus, corresponding to the 168th amino acid.
  • amino acid sequence of A. C. PQQGDH in this specification is the sequence specified by SEQ ID NO: 1. This sequence is the amino acid sequence of PQQGDH produced by Acinetobacter i calcoaceticus NBRC 12552.
  • the type of amino acid after substitution is not particularly limited, but for example, tryptophan at the 75th amino acid position, histidine at the 168th amino acid position, ferulalanin at the 169th amino acid position, and glutamic acid at the 295th amino acid position.
  • N-aspartic acid, tyrosine, and ferulanine are proline at amino acid position 342, arginine at amino acid position 347, and threonine at amino acid position 351.
  • the modified position force is selected from the group consisting of amino acid 169, amino acid 295, amino acid 342, and amino acid 351. More preferably, the 295th amino acid and the 351st amino acid are the modified positions.
  • the modified PQQGDH obtained as a result of addition of an amino acid to the C-terminal side and modification by substitution of a specific amino acid in the structural gene it has any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 31. Things can be mentioned.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence of PQQGDH derived from Acinetobacter 'calcoaceticus (NBRC12552 strain). 6 amino acids (ANNMVP) are added to the C-terminal side of the acid sequence, and the 295th and 351st amino acids are substituted with aspartic acid and threonine, respectively.
  • the conditions for modification of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 18 to 31 are summarized in Table 1 below.
  • modified PQQGDH of the present invention in addition to the above-described addition of amino acids to the C-terminal side (in one embodiment, more specific amino acid substitution), some amino acids in the structural gene may be modified.
  • Modification of some amino acids refers to deletion or substitution of one to several amino acids constituting the amino acid sequence, addition or insertion of one to several amino acids, or combination of these. The power to change the amino acid sequence As a general rule, such modifications are as long as the activity of QQGDH (ie, the reactivity to glucose) is maintained! /, Can be done.
  • the reactivity to other substrates for example, maltose and galatatose
  • the substrate specificity to glucose is improved, or the substrate specificity is somewhat lowered.
  • the above modifications are allowed.
  • Some of the amino acid modifications as described above have low reactivity with maltose and galactose. It is preferable to be performed within the range that is maintained in the state.
  • the position of the amino acid subjected to the modification here is not particularly limited, and modification may be performed at a plurality of positions.
  • the term “plurality” here means, for example, a number corresponding to within 10% of all amino acids, and preferably a number corresponding to within 5% of all amino acids. More preferably, it is a number corresponding to within 1 percent of all amino acids.
  • the modified PQQGDH of the present invention first obtains a gene that codes for a reference PQQGDH (eg, wild-type PQQGDH), and then modifies it to construct a nucleic acid that codes for the desired modified PQQGDH. Finally, it can be prepared by expressing the nucleic acid in an appropriate expression system. The preparation method will be described below. Once the sequence is designed, the modified PQQGDH of the present invention is coded by chemical synthesis using deoxynucleotide triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) based on the sequence information. Nucleic acids (genes) can be prepared.
  • dATP deoxynucleotide triphosphates
  • PQQGDH-producing bacteria for example Ashinetopakuta 'Calco ⁇ calcoaceticus, Ashinetopakuta' bow Man'ni (Acinetobacter baumannii), Nyu ⁇ Tomonasu-Enore 3 r Nosa (Pseudomonas aerugi nosa), Shiyudomonasu 'putida (Pseudomonas putida), Shiyudomonasu' Funoreoretsuse Nsu (Pseudomonas fluorescens), No ⁇ Guhonorearifu 'Seno ⁇ nfu (Burkholdena cepacia no darkonovacta ⁇ ⁇ .
  • the gene encoding PQQGDH can be extracted from the cells of PQQGDH-producing bacteria by a conventional method.
  • the PQQGDH gene can also be prepared using a PCR method using the genomic DNA of PQQGDH as a cage.
  • the extracted gene may be amplified using an amplification method such as PCR, and the amplified product may be subjected to subsequent operations.
  • the target PQQGG can also be obtained by chemical methods.
  • the DH gene can be prepared.
  • the starting material is Acinetobacter i calcoaceticus NBRC 12552 is described.
  • DNA ligase or the like the recombinant vector is constructed by binding and closing at both blunt ends or sticky ends.
  • the PQQGDH gene is amplified by polymerase chain reaction (PCR) using an oligonucleotide primer designed based on the nucleotide sequence of the PQQGDH gene derived from the well-known Acinetopacters sp. LMD 79.41 strain, and then bound and closed by DNA ligase. Replacement vectors can also be constructed.
  • the recombinant vector constructed by any of the above methods is transferred to a host microorganism in which it can autonomously replicate. Then, screening is performed using markers specific to the expression vector and PQQG DH enzyme activity as indicators, and a host microorganism transformed with a recombinant vector containing the gene encoding PQQGDH is obtained.
  • a method for lysis for example, treatment with a lytic enzyme such as lysozyme can be employed.
  • an enzyme treatment such as protease or a treatment with a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) may be used in combination.
  • a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS)
  • freeze-thawing may be combined with a physical crushing method such as a French press treatment.
  • the separation and purification of DNA from the lysate obtained as described above can be carried out according to a conventional method. For example, deproteinization by phenol treatment or protease treatment, It can be carried out by appropriately combining methods such as casease treatment and alcohol precipitation treatment.
  • the amplified PQQGDH gene can be cloned into an appropriate vector.
  • a vector for cloning a vector constructed for gene recombination from a phage or plasmid capable of autonomous replication in a host microorganism is suitable.
  • phages include Lambda gtlO and Lambda gtl 1 which use Escherichia coli as host microorganisms.
  • examples of plasmids include pBR322, pUC19, pBluescript, pTrc 99A, and pGEM-T vector using Escherichia coli as a host microorganism.
  • Cloning into the vector is performed by inserting the PQQGDH gene obtained by the above-described method into the cloning site of the vector.
  • the intensive operation can be performed by a well-known method using a restriction enzyme and DNA ligase.
  • the host microorganism used for cloning is not particularly limited as long as it can stably and autonomously propagate the thread and exchange vector and can express the foreign gene.
  • examples include enterobacteria such as Escherichia coli W3110, E. coli C600, E. coli HB 101, E. coli JM109, and E. coli DH5a.
  • Acinetopacta ⁇ ⁇ ⁇ Calcoaceticus Preferably Acinetopacta ⁇ ⁇ ⁇ Calcoaceticus, Acinetopacta ⁇ ⁇ ⁇ Bauman Sense (Pseudomonas fluo rescens), Nork Honorederia 'Burkholderia cepacia', Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, Radiobacter gro Use host microorganisms that produce PQQ such as Escherichia coli and Klebsiella aerogenes, etc. Employing these host microorganisms has the advantage of eliminating the need for expensive PQQ addition.
  • a method for transferring a recombinant vector into a host microorganism for example, when the host microorganism is Escherichia coli, a combinatorial cell method, an electopore poration method, a protoplast fusion method, or the like is used. Can do.
  • a host microorganism into which the target recombinant vector has been appropriately introduced search for microorganisms in which the expression of the marker (for example, drug resistance gene) of the vector and the expression of GDH activity by the addition of PQQ are recognized simultaneously. do it.
  • a microorganism that grows on a selective medium based on a drug resistance marker and produces PQQGDH may be selected.
  • a transformant selected by such a method can stably produce a large amount of PQQGDH by being cultured in a nutrient medium.
  • FIG. 1 (1981) (FIG. 1, SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequence of PQQGDH was estimated from the base sequence determined as described above (FIG. 1, SEQ ID NO: 1).
  • the gene sequence (SEQ ID NO: 4) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) including the signal region are shown in FIG.
  • the PQQGDH gene recovered from the recombinant vector carrying the PQQGDH gene can be easily modified using genetic engineering techniques. Specifically, for example, site-directed mutagenesis is used to modify a gene so that an amino acid residue at a specific site includes substitution, deletion, insertion, addition, or inversion.
  • the PQQGDH gene obtained as described above is mutated so that one or more amino acids are added to the C-terminal side of the protein that is the expression product.
  • a gene (nucleic acid) encoding a modified PQQGDH having an amino acid sequence longer than the reference PQQGDH can be obtained by attaching one or more amino acids to the C-terminal side.
  • a gene encoding the modified PQQGDH is obtained by PCR using a primer designed to obtain an amplification product with a region encoding the specific amino acid sequence attached to the 3 'end of the PQQGDH gene. be able to.
  • phase A gene encoding a different modified PQQGDH can be prepared. Numerous mutagenesis methods for amino acid substitution are known in the art (see, eg, Molecular loning, Third Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press, New York). A suitable method may be selected and used. Any one of the mutation introduction operation for adding the C-terminal heminic acid and the mutation introduction operation to the structural gene for amino acid substitution may be performed first.
  • a modified gene having an amino acid substitution effective for improving the sex is obtained.
  • mutations are randomly introduced into the target gene region using error-blown PCR to construct a modified PQQGDH gene library. Multiple substitutions with useful mutation combinations obtained by random mutations are reported by Novartis Pharma in Bioscience and Industry, vol.59, No.3 (2001), P35-38. It can be obtained by the Chillon scrambling method.
  • the modified enzyme can be easily and easily evaluated by procedures such as culturing the obtained mouth, lysis of cells using a lytic enzyme such as lysozyme, and measurement of enzyme activity.
  • Selection of a clone carrying the target modified gene is performed, for example, as follows. 1—methoxy— PMS (1—methoxy—5—methylphenazinium metnyisulfate) in the cell extract! ) PQQGDH activity is measured based on the absorbance at 600 nm after adding CIP (2, 6-dichlorophenol indophenol) for a certain period of time, and the reactivity to maltose is reduced compared to the reference PQQ GDH (for example, about 10 Select clones that have a high level of glucose reactivity (eg, about 90% or more compared to standard PQQGDH). The mutation is confirmed by analyzing the base sequence of the obtained clone.
  • modified PQQGDH As described above, a gene encoding modified PQQGDH with an effective amino acid substitution can be obtained. If a sequence encoding an amino acid is added to the 3 ′ end of the modified gene thus obtained using PCR or the like as described above, a part of the amino acid substitution and the C-terminal side are performed. A modified PQQGDH having been modified with the addition of the amino acid of is obtained. [0038] ⁇ Expression of modified PQQGDH gene>
  • an expression system using Escherichia coli as a host can be used.
  • the modified PQQGDH gene prepared by the above-described method is inserted into a vector (eg, pUC vector, pBluescript vector) using E. coli as a host to construct an expression vector.
  • the expression vector includes a promoter sequence, a replication origin, a terminator sequence and the like necessary for expression of the modified PQQGDH in the host.
  • a method for introducing (transferring) an expression vector into a host microorganism for example, when the host microorganism is Escherichia coli, a combinatorial cell method, an electo-poration method, or the like can be used. Selection of a host microorganism into which an expression vector has been appropriately introduced into the host microorganism can be carried out using the presence or absence of a drug resistance marker possessed by the expression vector and the presence or absence of expression of GDH activity when PQQ is added.
  • the modified PQQGD can be obtained by culturing the microorganism after the operation of introducing the expression vector in a selective medium that can grow only when the drug resistance marker is possessed, and subsequently transforming that has been observed to grow. Choose one that produces H.
  • a nutrient source of the culture medium those commonly used for culturing microorganisms can be used. Any carbon compound that can be assimilated can be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, ratatose, maltose, ratatose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • the nitrogen source any available nitrogen compound may be used, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean koji alkaline extract, and the like.
  • phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc and other salts, specific amino acids, specific vitamins, etc. are used as necessary.
  • the transformant is cultured under a temperature condition in which the transformant can grow and modified PQQGDH is produced.
  • the culture temperature can be set within a range of 20 ° C to 40 ° C.
  • the culture time may be set in consideration of the growth characteristics of the transformant to be cultured, the modified PQQGDH production characteristics, or the required modified PQQGDH production amount.
  • the culture is completed when the yield of modified PQQGDH reaches a maximum.
  • the standard cultivation time is about 12 to 72 hours.
  • the pH of the medium is adjusted so that the transformant grows and PQQGDH is produced.
  • the pH of the medium is about 6.0 to 9.0.
  • the culture solution containing the cells producing the modified PQQGDH can be used as it is, or after concentration, removal of impurities, etc., and can be used as an enzyme solution. Recover the modified PQQGDH. If the modified PQQGDH produced is a secreted protein, it can be recovered from the culture solution, otherwise it can be recovered from the cells.
  • the culture supernatant is filtered and centrifuged to remove insolubles, then concentrated under reduced pressure, membrane concentrated, salting out using ammonium sulfate sodium sulfate, methanol or Various chromatographic methods such as fractional precipitation with ethanol or acetone, dialysis, heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • purified PQQGDH can be obtained by separation and purification as described above. If necessary, a chelating agent such as EDTA and a surfactant can be added to dissolve PQQGDH so that it can be separated and collected as an aqueous solution.
  • a chelating agent such as EDTA and a surfactant
  • the purified enzyme is preferably purified to such an extent that it shows a single band in electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the purified enzyme obtained as described above can be pulverized and distributed for example by freeze drying, vacuum drying or spray drying.
  • the purified enzyme may be dissolved in advance in a divalent metal salt, phosphate buffer, Tris-HCl buffer or GOOD buffer.
  • a divalent metal salt phosphate buffer, Tris-HCl buffer or GOOD buffer.
  • it may be dissolved in the aforementioned buffer containing a divalent metal salt.
  • a suitable buffer used here is a GOOD buffer, and among them, a PIPES, MES or MOPS buffer is particularly preferable.
  • the modified PQQGDH of the present invention oxidizes glucose by using PQQ as a coenzyme to produce dalcono
  • ⁇ Acts to catalyze the reaction to produce rataton.
  • Such enzyme activity can be quantified by the color reaction of the acid reducing agent to reduce the amount of PQQ that is reduced with the acidity of glucose by PQQG DH.
  • the color reagent include PMS-DCIP, 1-methoxy-P MS—XTT (2,3-Bis (2-methoxy—4-nitro-5-sulfophenyl) —2H—tetrazolium-5-carboxanili de), Lithiani potassium etc. can be used.
  • the PQQGDH activity is measured using the following reagents under the following conditions.
  • the selectivity of the modified PQQGDH of the present invention for glucose is determined by measuring enzyme activity in the same manner as described above using various sugars such as ratatose, maltose, galactose, sucrose and xylose as a substrate, and using glucose as a substrate. It can be evaluated by examining the relative activity with respect to the current activity.
  • a glucose measuring reagent and the reagent are constituted.
  • a glucose measurement kit can be constructed as a component. That is, another aspect of the present invention provides a glucose measuring reagent containing modified PQQGDH and a dalcose measuring kit containing the reagent.
  • the kit for measuring dulose of the present invention may contain a solution such as a buffer solution required for measurement, a glucose solution as a standard, and the like.
  • the chromosomal DNA of Acinetobacter 'calcoaceticus NBRC 12552 was isolated by the following method. The strain was cultured in 10 mL of LB medium at 30 ° C with shaking and then collected by centrifugation (15000 rpm, 10 minutes). Chromosomal DNA was extracted and purified using the obtained bacterial strength Dneasy tissue kit (Qiagen) and dissolved in TE buffer.
  • the chromosomal DNA obtained in 1. was used as a cage, and the DNA region containing the target PQQGDH gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the following primers.
  • the primers used here are designed based on the base sequence of soluble PQQGDH (AM Cleton-Jansen et al. Mol. Gen. Genet., 217, 430 (198 9)) derived from Acinetobacter sp. LMD 79.41. did.
  • PCR is performed in a solution having the composition shown in Table 2 below, followed by a reaction at 94 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 48 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally 72 ° C. C The reaction was performed for 10 minutes.
  • the obtained amplified gene fragment was ligated to pGEM-T Easy vector (Qiagen), and Escherichia coli JM109 was transformed with this plasmid.
  • the obtained plasmid was designated as pTGEM-GDHB.
  • the base sequence of the gene fragment inserted in the plasmid pTGEM-GDHB obtained in 2. was determined using Big Dye Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystems). The determined base sequence and amino acid sequence are as shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 1, respectively. The base sequence and amino acid sequence including the signal region are shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the calculated molecular weight of the protein was about 50,000, which was almost the same as the molecular weight of soluble PQQGDH of Acinetobacter calchaaceticus.
  • the plasmid pTGEM-GDHB obtained in 2. was used as a saddle and PCR was performed using the following primers.
  • Reverse primer 5'-GCGGCCGCCTGCAGCTATTACTTAGCCTTATAGGTG AACTTAATGAGATCCTGGG-3 '(SEQ ID NO: 36)
  • PCR is performed in a solution having the composition shown in Table 3 below, followed by a reaction at 94 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally 72 ° C. C for 10 minutes It was set as conditions to do.
  • the obtained amplified gene was cleaved with restriction enzymes Ncol and Pstl.
  • the digested gene fragment was ligated to an expression vector pTrc99A (Amersham 'Farmasia' Biotech), and Escherichia coli JM109 strain was transformed with this plasmid.
  • the obtained expression plasmid was designated as pTrcGDHBS (Fig. 3).
  • transformants were cultured in 100 ml LB medium containing 30 ⁇ C, 100 ⁇ g / mL ampicillin and 6 ⁇ M PQQ, production of PQQGDH was observed.
  • the molecular weight of this PQQGDH calculated by amino acid sequence was about 50,000, which was almost the same as the molecular weight of Acinetobacter calcaceticus NBRC 12552.
  • the cells recovered by centrifuging the culture solution after the completion of the culture were suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). Next, the cell suspension was subjected to ultrasonic disruption and then centrifuged again to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. This crude enzyme solution was treated with a cationic flocculant, desalted and concentrated, and then separated and purified by DEAE Sepharose (Farmasia Biotech) and CM Sepharose (Farmasia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme.
  • PQQGDH obtained by the above method shows almost a single band in electrophoresis. In this case, the specific activity was about 4000 U / mg. The properties of the obtained PQQGDH are shown below.
  • pH stability pH 6-9 (30 ° C, 1 hour treatment)
  • a gene sequence encoding a histidine tag was inserted downstream of the PQQGDH gene, followed by PCR using a primer that added a stop codon immediately thereafter.
  • PCR was performed using the following primers.
  • Reverse primer 5 -GCTTGCATGCCTGCAGCTATTAATGGTGATGGTGAT GGTGCTTAGCCTTATAGGTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 38, underlined 6 X histidine tag sequence)
  • the amplified gene obtained by adding a histidine tag and a stop codon downstream of the PQQGDH gene was cleaved with Ncol and Pstl.
  • the digested gene fragment was ligated to an expression vector, and Escherichia coli JM109 strain was transformed with this plasmid.
  • the obtained expression plasmid was designated as pTrcGDHBS-C-His. PQQGDH production was observed when the transformants were cultured in lOOmL LB medium containing 30 ⁇ C, 100 ⁇ g / mL ampicillin and 6 ⁇ M PQQ.
  • the following procedure verified whether the addition of a histidine tag to the C-terminus was effective in improving the substrate specificity other than the wild-type enzyme.
  • mutations were introduced site-specifically into the wild-type enzyme.
  • the site-specific mutation was introduced into the wild-type enzyme using QuikChange Site-Directed Muta genesis kit (Stratagene).
  • QuikChange Site-Directed Muta genesis kit (Stratagene).
  • the mutants shown in Table 4 below were prepared using the following primers.
  • the F and R at the end of each used primer sequence shown below represent forward and reverse, respectively.
  • G295E-F 5'-CAAATTAAAGATTTAGAACAAAATGGTTTAAAAGTGGC-3 '(38 mer, SEQ ID NO: 39)
  • G295E-R 5,-GCCACTTTTAAACCATTTTGTTCTAAATCTTTAATTTG-3 '(38 mer, SEQ ID NO: 40)
  • G295D-F 5′-CAAATTAAAGATTTAGATCAAAATGGTTTAAAAGTGGC-3 ′ (38mer, SEQ ID NO: 41)
  • G295D-R 5 '-GCCACTTTTAAACCATTTTGATCTAAATCTTTAATTTG-3' (38mer, SEQ ID NO: 42)
  • M342P-F 5,-CCAACCTgTggggATCCTACCTACATTTgCTgg-3, (33mer, SEQ ID NO: 43)
  • M342P-R 5'-CCAgCAAATgTAggTAGGATCCCCACAggTTgg-3 '(33mer, SEQ ID NO: 44)
  • A351T-F 5,-gCCAACggTTACCCCgTCATCTgCTTATgTCTA-3, (33mer, SEQ ID NO: 45)
  • A351T-R 5'-TAgACATAAgCAgATgACggGGTAACCgTTggC-3 '(33mer, SEQ ID NO: 46)
  • L169F-F 5'-GGGGCGTAACCAGTTCGCTTATTTATTCTTACC-3 '(33mer, SEQ ID NO: 47)
  • L169F-R 5'-GGTAAGAATAAATAAGCGAACTGGTTACGCCCC-3 '(33mer, array number: 48)
  • the conditions for mutagenesis are as follows. 1 ⁇ L of PfoTurbo DNA polymerase (2.5 U / ⁇ L), 125 ng forward and reverse primers, dNTP mix, 10 ng pUK-GDHB (S) and 1 / One volume of PCR buffer was mixed. The reaction conditions were 95 ° C for 30 seconds, then 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 68 ° C for 10 minutes for 16 cycles. After removal of the reaction, 1 ⁇ L of restriction enzyme Dpnl (10 U / de) supplied with the kit was added to remove the truncated DNA and incubated at 37 ° C. for 1 hour. E. coli XL1-Blue was transformed with 1 ⁇ L of the reaction product to obtain colonies.
  • the numbers in the table represent amino acid positions.
  • the amino acid at each amino acid position is represented by a single letter.
  • the base sequence of each mutant was determined according to the method shown in 3., and it was confirmed that the mutation was introduced at the site listed in the above table.
  • the plasmid producing mutant 1 was designated as pTrcGDHBSmutl
  • the plasmid producing mutant 2 was designated pTrcGDHBSmut2, and the subsequent operations were performed.
  • Reverse primer 5,-GCTTGCATGCCTGCAGCTATTANNNNNNNNNNNNNN NNNNCTTAGCCTTATAGGTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 50)
  • PQQGDH with improved substrate specificity high substrate specificity for glucose.
  • the modified PQQGDH of the present invention can be used for measuring the amount of glucose in a sample.
  • the amount of glucose in a sample can be measured with high accuracy.

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Abstract

　グルコースに対する基質特異性の高い改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（PQQGDH）を提供する。基準ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のカルボキシ末端に一つ以上のアミノ酸が付加された改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が提供される。

Description

改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素、及びピロ口キノ リンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性改良法
技術分野
[0001] 本発明はピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素に関する。詳しくは改変 型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素、その作製方法、及びその利用 に関する。本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性ダルコース脱水素酵素は例え ば臨床検査などにおけるグルコース量の測定に利用される。
背景技術
[0002] ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（EC1.1.5.2、 PQQGDH)は補酵 素ピロ口キノリンキノン（PQQ)と共役してグルコースを酸ィ匕し、ダルコノラタトンを生成 する反応を触媒する。この性質を利用して PQQGDHは臨床検査や食品分析、培養 プロセスのモニタリング等におけるグルコースの定量に利用されている。
[0003] 過去に報告された PQQGDHとしては、ァシネトバクタ一'スピーシーズ (Acinetobact er sp.) L.M.D 79.41株が産生する PQQGDH及びその改変型 PQQGDHが知られてい る（例えば、特許文献 1〜5、非特許文献 1参照)。この L.M.D 79.41株が産生する PQ QGDHの基質特異性は低ぐ例えばグルコースに対する反応性の約 90%に相当する 反応性をマルトースに対しても有するものであった。
また、ァシネトパクター 'バウマン-が産生する PQQGDHの基質特異性を改変する 手法が提案されて ヽる (特許文献 6〜8)。
一方、本発明者らはァシネトパクター 'カルコァセティカスが産生する PQQGDHに おいて特定の領域のアミノ酸の置換と基質特異性の変化との関係を詳細に検討し、 基質特異性に関与する領域を見出している (特許文献 9)。
[0004] 特許文献 1：特開 2000— 312588号公報
特許文献 2：特開 2000 - 350588号公報
特許文献 3：特開 2001— 197888号公報
特許文献 4：特開 2001— 346587号公報 特許文献 5 :国際公開第 02Z34919号パンフレット
特許文献 6：特開 2004 - 313172号公報
特許文献 7：特開 2004— 313180号公報
特許文献 8：特開 2004— 344145号公報
特許文献 9 :特開 2004— 173538号公報
非特許文献 1 :A- M Cleton- Jansenら Mol. Gen. Genet., 217, 430(1989)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
正確なグルコース量を測定するため、 PQQGDHには高い基質特異性が要求される 。例えば輸液を受けて 、る患者を対象とした糖尿病の診断を行う場合などにぉ 、て 基質特異性の低 、PQQGDHが用いられれば、測定値として得られるものはダルコ一 ス量のほかに輸液中のマルトース量を測り込む可能性があり正確な血中グルコース 量が求められない。同様に例えば肝機能障害のある患者を対象とした測定を行う場 合にぉ 、てはガラクトースの影響を受けて信頼性の高 、測定が行えな 、おそれがあ る。このように基質特異性の低!、PQQGDHではマルトースなどの他の糖質の影響を 大きく受け、正確なグルコース量を測定できな 、。
過去に報告された上記改変型 PQQGDHでは、野生型 PQQGDHの一部のアミノ酸 を置換等することによって基質特異性の改善が行われている。このような構造遺伝子 内への変異の導入による改変を行えば、基質特異性が向上したとしても、本来維持 されるべきグルコースに対する反応性 (比活性)の低下を伴う。グルコースに対する反 応性が低下すれば、一定量の活性を得るために必要な酵素量が増大することから、 製造コストの上昇を引き起こし、安価に PQQGDHを供給することが困難となる。
一方、これまでに様々な研究グループによって野生型 PQQGDHにおけるアミノ酸 置換と基質特異性の変化との関係が詳細に検討されており、今後、基質特異性の向 上に有効なアミノ酸位置が新たに見出されることは期待できない。このことから、これ までとは異なる手段による PQQGDHの基質特異性を改変することが切望されている。 本発明は以上の背景の下、グルコースに対する基質特異性が高い (特にマルトー スに対する反応性が低い）改変型 PQQGDHを提供すること、特にグルコースに対す る基質特異性が高 、とともにグルコースに対する反応性 (比活性)も高 、改変型 PQQ GDHを提供することを目的の一つとする。また、このような優れた特性を有する改変 型 PQQGDHを作製する方法を提供することを目的の一つとする。さらに、このような 優れた特性を有する改変型 PQQGDHの作製に利用することができる核酸、発現べク ター、及び形質転換体、更にはこれらを利用した改変型 PQQGDHの作製方法、ダル コース測定キット等を提供することをも目的とする。
課題を解決するための手段
上記目的を達成するために本発明者らは、野生型酵素の特定位置のアミノ酸の置 換ではなぐ特定の領域にアミノ酸を付加するという、これまでとは全く発想の異なる アプローチによる基質特異性の改変を試みた。即ち、ァシネトパクター 'カルコァセテ ィカス（Acinetobacter calcoaceticus)力産生する PQQGDHを野生型 PQQGDHのモデ ルとして、特定の領域へのアミノ酸の付加と基質特異性の変化との関係を詳細に検 討した。その結果、驚くべきことに、カルボキシ末端にアミノ酸を付加することによって 、グルコースに対する反応性 (比活性)を高い状態に維持しつつ、マルトースに対す る反応性が顕著に低下することが判明した。
ここで、同一の機能を有する酵素 (タンパク質)は一般にその活性部位や基質特異 性に関与する領域の構造が類似していることが多い。この類似性ゆえに、ある酵素の 基質特異性の向上に効果のある特定の改変が、同一の機能を有する他の酵素にお Vヽても有効である蓋然性が高!、。
一方、配列の同定や遺伝子のクローユング、或いはアミノ酸置換による様々な改変 など、ァシネトパクター属の微生物が産生する PQQGDHを対象とした多くの研究が過 去に行われてきた。これまでの報告によれば、ァシネトパクター属の微生物が産生す る可溶性 PQQGDHは種を越えて相同性が非常に高いことが明かになっており、特定 の種（例えばァシネトバクタ一'カルコァセティカス）が産生する PQQGDHの特定領域 におけるアミノ酸置換が基質特異性の向上に効果がある場合は通常、同属他種 (例 えばァシネトバクタ一'バウマン-)が産生する PQQGDHにおいても、同等のアミノ酸 置換 (即ち、上記特定領域に対応する領域におけるアミノ酸置換)によって基質特異 性が向上する。このように、ァシネトパクター属の微生物が産生する PQQGDHにおい ては、ある種が産生する PQQGDHの基質特異性の向上に有効な改変手段が、同属 他種が産生する PQQGDHの基質特異性の向上にも同様に有効であることは経験的 事実の示すところである。
以上の事情を考慮すれば、 PQQGDHの基質特異性の向上に関して本発明者らが 得た上記知見は、ァシネトバクタ一'カルコァセティカスが産生する PQQGDHに対し てだけでなぐァシネトパクター属に属する他の種の微生物が産生する PQQGDHに 対しては当然に適用できるものであり、さらには他の属に属する微生物が産生する P QQGDHに対しても広く適用できる可能性が高 、と 、える。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。 即ち本発明は、基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配 列と比較して、 C末端側に一つ以上のアミノ酸が付加されて ヽる点で相違するァミノ 酸配列を有する改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（PQQGDH )に関する。
本発明の一態様では、基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（基 準 PQQGDH)力 ァシネトパクター属の微生物由来の改変型 PQQGDHである。ァシ ネトパクター属の微生物の具体例はァシネトパクター.カルコァセティカスである。 本発明の一態様では、基準 PQQGDHが配列番号： 1のアミノ酸配列を有する。 本発明の更に他の一態様は、カルボキシ末端の付加にカ卩えて、特定位置でのアミ ノ酸置換が施された改変型 PQQGDHを提供する。ここでのアミノ酸の置換は、基準 P QQGDHのアミノ酸配列を基準として、ァシネトバクタ一'カルコァセティカス由来のピ ロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素における第 16番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 22番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 67番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 68番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 69番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 75番アミノ酸 に相当するアミノ酸、第 76番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 116番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 120番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 127番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 143番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 167番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 168番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 169番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 171番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 177番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 227番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 230番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 231番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 245番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 253番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 254番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 255番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 277番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 295番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 296番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 300番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 309番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 318番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 341番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 342番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 343番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 347番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 349番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 350番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 351番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 356番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 423番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 429番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 432番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 433番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 434番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 439番アミノ酸に相当するアミノ酸、カゝらなる群より選択されるアミ ノ酸にぉ 、て実施されて 、る。
本発明はまた、配列番号： 1において、第 16番アミノ酸、第 22番アミノ酸、第 67番アミ ノ酸、第 68番アミノ酸、第 69番、第 75番アミノ酸、第 76番アミノ酸、第 116番アミノ酸、 第 120番アミノ酸、第 127番アミノ酸、第 143番アミノ酸、第 167番アミノ酸、第 168番アミ ノ酸、第 169番アミノ酸、第 171番アミノ酸、第 177番アミノ酸、第 227番アミノ酸、第 230 番アミノ酸、第 231番アミノ酸、第 245番アミノ酸、第 253番アミノ酸、第 254番アミノ酸、 第 255番アミノ酸、第 277番アミノ酸、第 295番アミノ酸、第 296番アミノ酸、第 300番アミ ノ酸、第 309番アミノ酸、第 318番アミノ酸、第 341番アミノ酸、第 342番アミノ酸、第 343 番アミノ酸、第 347番アミノ酸、第 349番アミノ酸、第 350番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 351番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 356番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 423番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 429番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 432番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 433番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 434番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 439番アミノ酸に相当するアミノ酸力 なる群より選択される一以上のアミ ノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有する、改変型 PQQGDHを提供 する。このような態様の具体例は、配列番号： 18〜31のいずれかのアミノ酸配列を有 する改変型 PQQGDHである。尚、以上のアミノ酸置換はこれまでに PQQGDHの基質 特異性の改良に有効であると報告されたアミノ酸置換を含む (特開 2000 - 312588 号公報、特開 2000— 350588号公報、特開 2001— 197888号公報、特開 2001— 346587号公報、国際公開第 02Z34919号パンフレット、特開 2004— 313172号 公報、特開 2004— 313180号公報、特開 2004— 344145号公報、特開 2004— 1 73538号公報、及び A- M Cleton- Jansenら Mol. Gen. Genet., 217, 430(1989)等を参 照)。
本発明の好ま 、態様では、グルコースに対する反応性を 100%としたときの相対値 で表して、マルトースに対する反応性 (相対活性比）が 40%以下である。また、本発明 の好ま 、態様では、基準 PQQGDHのグルコースに対する反応性 (比活性)を 100% としたときの相対値湘対比活性)で表して、グルコースに対する反応性湘対比活性 )が 70%以上である。
本発明は他の局面として、上記本発明の改変型 PQQGDHをコードする、単離され た核酸を提供する。
本発明は更に当該核酸を保持するベクター及び当該核酸を保有する形質転換体 を提供する。
本発明の更なる局面では、上記形質転換体を、上記核酸が発現可能な条件下で 培養する工程、及び上記核酸の発現産物を回収する工程、を含む改変型 PQQGDH の製造方法が提供される。
本発明は更に、上記本発明の改変型 PQQGDHを含んでなるグルコース測定用試 薬、及び当該試薬を含んでなるグルコース測定用キットを提供する。
本発明の更に他の局面では、ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（P QQGDH)のカルボキシ末端に少なくとも一つ以上のアミノ酸を付加することを特徴と する、 PQQGDHの基質特異性を改良する方法が提供される。基質特異性の改良に 供される PQQGDHとして、ァシネトパクター属の微生物由来、中でもァシネトパクター •カルコァセティカス（例えば NBRC 12552株）由来のものが好適に使用される。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1はァシネトパクター 'カルコァセティカス（Acinetobacter calcoaceticus)由来 のピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の配列（シグ ナル領域は含まな ヽ)及びアミノ酸配列（シグナル領域は含まな ヽ）を示した図である
[図 2]図 2はァシネトパクター ·カルコァセティカス（Acinetobacter calcoaceticus)由来 のピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子の配列（シグ ナル領域を含む)及びアミノ酸配列（シグナル領域を含む）を示した図である。
[図 3]図 3は実施例において使用される発現ベクター pTrcGDHBS及び PQQGDH遺 伝子の制限酵素地図である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] (用語）
本明細書では、比較する二つのアミノ酸残基 (又は領域)が、それを含む各タンパク 質 (酵素)の構造面及び Z又は機能面を考慮したときに同等と見なせることを表現す るために用語「相当する」を使用する。例えば、ァシネトパクター 'カルコァセティカス 以外の微生物に由来する PQQGDHのアミノ酸配列と、ァシネトパクター ·カルコァセ ティカス由来の PQQGDHのアミノ酸配列とを最適な比較ができるように並べたときに（ 必要であれば配列中にギャップを導入してァライメントを最適化する）対応する位置 にある二つのアミノ酸は互いに他のアミノ酸に対して「相当する」アミノ酸であると 、え る。同様に、ァシネトパクター 'カルコァセティカス以外の微生物に由来する PQQGD Hにおいて、一次構造を比較し、且つ二次構造の相同性を考慮した上でァシネトパク ター ·カルコァセティカス由来の PQQGDHのある二次構造領域と同じ機能を有して ヽ ると合理的に考えられる領域は「ァシネトパクター ·カルコァセティカス由来の PQQGD Hの当該二次構造領域に相当する」ということができる。
[0009] 本明細書にぉ 、てアミノ酸の位置はシグナル配列を除 、た成熟型酵素の N末端の アミノ酸を 1番として（例えば、配列番号： 1のアミノ酸ではァスパラギン酸が 1番となる ) N末端側カゝら C末端側に向カゝつて順番に番号付けを行った場合の番号によって特 定される。
[0010] 本明細書における用語「核酸」は、 DNA(cDNA及びゲノム DNAを含む）、 RNA (mRN Aを含む）、 DNA類似体、及び RNA類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定され ず、即ち 1本鎖及び 2本鎖のいずれであってもよい。好ましくは 2本鎖 DNAである。また コドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現 産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有して 、てよ 、。
[0011] 本明細書において「改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素（PQQ GDH)をコードする核酸」とは、それを発現させた場合に当該改変型 PQQGDHが得ら れる核酸のことをいい、当該改変型 PQQGDHのアミノ酸配列に対応する塩基配列を 有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしな 、配列が付加さ れてなる核酸 (例えば 1又は複数個のイントロンを含む DNA)をも含む。
[0012] 本明細書において用語「単離された核酸」とは、もともと天然に存在している核酸の 場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態 の核酸をいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列など一部の他の核酸成分 を含んで!/ヽてもよ ヽ。例えばゲノム DNAの場合の「単離された核酸」の好ま 、形態 では、天然状態にぉ 、て共存する他の DNA成分 (天然状態にお!、て隣接する DNA 配列を含む)を実質的に含まない。
例えば cDNA分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単 離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核 酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は 好ましくは、 dNTPなどの前駆体 (原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実 質的に含まな!/、状態の核酸を!、う。
核酸がベクターや組成物の一部として存在していても又は外来性分子として細胞 内に存在していても、人為的操作の結果として存在している限り「単離された核酸」で ある。
尚、特に言及しない限り、本明細書において単に「核酸」と記載した場合には、単離 された状態の核酸を意味する。
[0013] (改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素）
本発明は改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素 (本明細書にお 、て、「PQQGDH」とも!/、う）に関する。本発明の改変型 PQQGDHは、基準 PQQGDH のアミノ酸配列のカルボキシ末端 (C末端)側にアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を 有する。即ち、本発明の PQQGDHのアミノ酸配列は、 C末端側に一つ以上のアミノ酸 が付加されて 、る点で、基準 PQQGDHのアミノ酸配列と相違する。
本明細書において「基準 PQQGDHJとは、本発明の改変型 PQQGDHの基となった (由来する） PQQGDHを!/、う。基準 PQQGDHは典型的には野生型 PQQGDHである。 例えば、ある野生型 PQQGDHをコードする遺伝子を改変して得た核酸によって目的 の改変型 PQQGDHを得た場合、この野生型 PQQGDHを当該改変型 PQQGDHに対 して「基準 PQQGDH」ということができる。但し、本発明の一態様では、 C末端側への アミノ酸の付加以外の改変（例えば特定のアミノ酸の置換)を野生型 PQQGDHに施し て得られた PQQGDHが基準 PQQGDHとなる。このような改変力 ^施された PQQGDHは 例えば特開 2000— 312588号公報、特開 2000— 350588号公報、特開 2001— 1 97888号公報、特開 2001— 346587号公報、国際公開第 02,34919号パンフレ ッ卜、特開 2004— 313172号公報、特開 2004— 313180号公報、特開 2004— 34 4145号公報、特開 2004— 173538号公報、及び A- M Cleton- Jansenら Mol. Gen. Genet., 217, 430(1989)等に多数開示されている。尚、二つの PQQGDHを比べたとき に、片方が他方の基準 PQQGDHに該当する力否かは、両者のアミノ酸配列の相同 性力 推定することが可能である。
本発明における基準 PQQGDHとしては、ァシネトバクタ一 ·エスピー、ァシネトバクタ 一'力ノレコアセティカス、ァシネトノ クタ一'ノ ゥマン- (Acinetobacter baumannii)、シ ュ. ~~トモナス ·ェノレ3 rノサ (Pseudomonas aeruginosa)、ンュ ~~トモナス ·プナタ (Pseud omonas putida)、ンュ' ~~ドモナス ·フルォレツセンス (Pseudomonas fluorescens)、ノヽ ~~ クホルデリア ·セパシァ（Burkholderia cepacia)ダルコノバクタ^ ~ ·ォキシダンス (Gluco nobacter oxydans)、ァセトノ クタ一'ァセチ (Acetobacter aceti)、ァグロノくクテリウム' ラジオノ クタ一 (Agrobacterium radiobacter)、ェシエリヒア'コリ、クレブシーラ 'エー口 ジーンズ（Klebsiella aerogenes)等が産生する PQQGDHを例示することができる。基 準 PQQGDHは、好ましくはァシネトパクター属の微生物由来であり、さらに好ましくは ァシネトパクター属の中でもァシネトバクタ一'カルコァセティカス由来である。ァシネ トバクタ一'カルコァセティカス由来の野生型 PQQGDHのアミノ酸配列の一例（NBRC 12552株が産生する PQQGDH)を配列番号： 1に示す。本発明の好ましい一態様の 改変型 PQQGDHでは、このアミノ酸配列の C末端側に一つ以上のアミノ酸が付加さ れるという改変が少なくとも施されることによって構築されたアミノ酸配列を有する。 C 末端側に付加されるアミノ酸配列（C末端付加配列）の具体例として、 ANNMVP (配 列番号： 5)、 CGSQIA (配列番号： 6)、 TSNFPA (配列番号： 7)、 AQGYQQ (配列 番号： 8)、 PPCNTP (配列番号： 9)、 SCPVD (配列番号： 10)、 PNESLA (配列番 号： 11 )、 HHHHHH (配列番号：12)、 PTKTNI (配列番号：13)、 VDI (配列番号： 14)、 WPAEPT (配列番号： 15)、 PDRLFL (配列番号： 16)、 YPRLVG (配列番 号： 17)を挙げることができる。
[0015] 後述の実施例に示すように、 C末端側に付加されるアミノ酸の種類及び数と、基質 特異性の変化との間に特別な規則性は認められな力つた。つまり、 PQQGDHの基質 特異性の向上には C末端側へのアミノ酸が付加されることが重要であり、付加される アミノ酸の種類及び数は特に限定されない。付加されるアミノ酸の数は例えば 1〜30 個、好ましくは 1〜20個、更に好ましくは 1〜15個、更に更に好ましくは 1〜6個であ る。
[0016] アミノ酸の付カ卩による改変に加えて又はこれに代えて、アミノ酸以外の化合物を付 カロすること〖こよる改変を行うことちでさる。
[0017] 本発明の改変型 PQQGDHは、基準 PQQGDHに比してグルコースに対する選択性 が向上していることを特徴とする。本発明の改変型 PQQGDHは基準 PQQGDHに比 較してマルトースに対する反応性が低 、。グルコースに対する反応性を 100%とした相 対値で表して、本発明の改変型 PQQGDHはマルトースに対する反応性 (相対活性 比）が好ましくは 40%以下であり（例えば 0%〜40%の範囲内）、より好ましくは 30%以下 であり（例えば 0%〜30%の範囲内）、さらに好ましくは 20%以下である（例えば 0%〜20% の範囲内）。また、本発明の改変型 PQQGDHは好ましくは、グルコースに対する反応 性 (比活性）が高い状態に維持されている。例えば基準 PQQGDHのグルコースに対 する反応性 (比活性)を 100%とした相対値湘対比活性)で表して、本発明の改変型 PQQGDHのグルコースに対する反応性 (相対比活性）は 70%以上（例えば 70%〜100 %の範囲内）、好ましくは 80%以上（例えば 80%〜100%の範囲内）、さらに好ましくは 90 %以上（例えば 90%〜100%の範囲内）、より一層好ましくは 95%以上（例えば 95%〜100 %の範囲内）、最も好ましくは約 100%である。尚、他の意味を表すことが明らかな場合 を除 、て、本明細書にぉ 、て「基質特異性」とはグルコースに対する選択性を意味す る。
[0018] 本発明の改変型 PQQGDHの一態様では、上記の C末端側へのアミノ酸の付カ卩によ る改変に加えて、構造遺伝子内の特定のアミノ酸の置換による改変が施されている。 即ち、この態様の改変型 PQQGDHのアミノ酸配列は、 C末端側に一つ以上のァミノ 酸が付加されている点、及び特定位置のアミノ酸の種類が異なる点で、基準 PQQGD Hのアミノ酸配列と相違する。
[0019] 例えば、基準 PQQGDHのアミノ酸配列において、ァシネトバクタ一 ·カルコァセティ カス由来の PQQGDH (以下、略して「A.C.PQQGDH」ともいう）における第 75番ァミノ 酸に相当するアミノ酸、第 168番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 169番アミノ酸に相当 するアミノ酸、第 295番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 342番アミノ酸に相当するァミノ 酸、第 347番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 351番アミノ酸に相当するアミノ酸からな る群より選択される一以上のアミノ酸が上記改変の対象となる。本明細書における A. C.PQQGDHのアミノ酸配列は配列番号： 1によって特定される配列である。この配列 はァシネトバクタ一'カルコァセティカス NBRC 12552株が産生する PQQGDHのァミノ 酸配列である。
ここで、置換後のアミノ酸の種類は特に限定されないが、例えば第 75番アミノ酸位 置ではトリプトファン、第 168番アミノ酸位置ではヒスチジン、第 169番アミノ酸位置では フエ-ルァラニン、第 295番アミノ酸位置ではグルタミン酸ゃァスパラギン酸、チロシン 、フエ-ルァラニンなど、第 342番アミノ酸位置ではプロリン、第 347番アミノ酸位置で はアルギニン、第 351番アミノ酸位置ではスレオニンである。
好ましくは改変位置力 第 169番アミノ酸、第 295番アミノ酸、第 342番アミノ酸、及び 第 351番アミノ酸からなる群より選択される。さらに好ましくは第 295番アミノ酸及び第 3 51番アミノ酸が改変位置となる。
[0020] C末端側へのアミノ酸の付加と、構造遺伝子内の特定のアミノ酸の置換による改変 の結果得られる改変型 PQQGDHの具体例として、配列番号： 18〜31のいずれかの アミノ酸配列を有するものを挙げることができる。例えば配列番号： 18のアミノ酸配列 は、ァシネトバクタ一'カルコァセティカス（NBRC12552株）由来の PQQGDHのァミノ 酸配列に対して、 C末端側に 6個のアミノ酸 (ANNMVP)が付加されるとともに、第 295 番アミノ酸及び第 351番アミノ酸がそれぞれァスパラギン酸及びスレオニンに置換さ れて構成されるものである。配列番号： 18〜31のアミノ酸配列の改変条件を以下の 表 1にまとめて示す。
[表 1]
Figure imgf000013_0001
本発明の改変型 PQQGDHでは、上記の C末端側へのアミノ酸の付加（一形態では 更に特定のアミノ酸置換）に加えて、構造遺伝子内の一部のアミノ酸の改変が行われ ていてもよい。ここでの「一部のアミノ酸の改変」とは、アミノ酸配列を構成する 1〜数 個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは 1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの 糸且合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう力 このような改変は原則として Ρ QQGDHとしての活性 (即ちグルコースに対する反応性）が維持される限りにお！/、て 行うことができる。但し、 PQQGDH活性が多少低下する場合であっても、他の基質（ 例えばマルトースゃガラタトース）に対する反応性も低下して却ってグルコースに対す る基質特異性が向上する場合や、基質特異性が多少低下したとしてもグルコース量 の測定に利用するのに支障のない場合などであれば上記のごとき改変が許容される 以上のような一部のアミノ酸の改変は、マルトースゃガラタトースなどに対する反応 性が低 、状態に維持される範囲内で行われることが好ま 、。 ここでの改変に供されるアミノ酸の位置は特に限定されず、また複数の位置で改変 が行われてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の 10%以内に相当する数であ り、好ましくは全アミノ酸の 5%以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸 の 1パーセント以内に相当する数である。
[0022] 本発明の改変型 PQQGDHは、まず基準 PQQGDH (例えば野生型 PQQGDH)をコ ードする遺伝子を取得し、次いでそれを改変することで目的の改変型 PQQGDHをコ ードする核酸を構築し、最後に当該核酸を適当な発現系にお 、て発現させることに よって調製することができる。以下に当該調製方法について説明する。尚、一旦その 配列が設計された後は、配列情報に基づきデォキシヌクレオチド三リン酸 (dATP、 dT TP、 dGTP、 dCTP)を材料とした化学合成によって本発明の改変型 PQQGDHをコー ドする核酸 (遺伝子)を調製することができる。
[0023] <基準 PQQGDHをコードする遺伝子の取得 >
まず、 PQQGDH生産菌カら PQQGDHをコードする遺伝子を取得する。 PQQGDH 生産菌としては、例えばァシネトパクター 'カルコァセティカス、ァシネトパクター 'バウ マンニ (Acinetobacter baumannii)、ンュ ~~トモナス ·ェノレ3 rノサ (Pseudomonas aerugi nosa)、シユードモナス'プチダ (Pseudomonas putida)、シユードモナス'フノレオレツセ ンス (Pseudomonas fluorescens)、ノ ~~グホノレァリフ 'セノヽンフ (Burkholdena cepaciaノ ダルコノバクタ^ ~ .ォキシダンス（Gluconobacter oxydans)、ァセトバクタ^ ~ ·ァセチ（Ac etobacter aceti)、 1グロノクァリゥム 'フンオノくクタ ~~ (Agrobactenum raaiobacter)、 ェシエリヒア'コリ、クレブシーラ 'エー口ジーンズ（Klebsiella aerogenes)等を挙げること ができる。ァシネトパクター属の微生物を採用することが好ましぐ中でもァシネトバタ ター ·カルコアセティカス又はァシネトパクター .バウマン-を採用することが特に好ま しい。
[0024] PQQGDHをコードする遺伝子は PQQGDH生産菌の菌体から常法によって抽出す ることができる。 PQQGDHのゲノム DNAを铸型とした PCR法等を利用して PQQGDH遺 伝子を調製することもできる。一方、抽出した遺伝子を PCR法等の増幅方法を利用し てー且増幅し、そして増幅産物を以降の操作に供してもよい。尚、 PQQGDHをコード する遺伝子の塩基配列が同定された後は、化学的手法によっても目的とする PQQG DH遺伝子を調製することができる。以下、 PQQGDH遺伝子を調製する方法の一例と してァシネトバクタ一'カルコァセティカス NBRC 12552株を出発材料とした場合につ いて具体的に説明する。
[0025] まず、ァシネトパクター 'カルコァセティカス NBRC 12552の染色体を分離、精製し た後、超音波処理や制限酵素処理等を施して得られる DNA断片と、リニア一な状態 に調製した発現ベクターとを DNAリガーゼなどを利用して両者の平滑末端又は付着 末端において結合閉鎖させ、組換えベクターを構築する。公知のァシネトパクター' スピーシーズ L.M.D 79.41株由来の PQQGDH遺伝子の塩基配列を基に設計したオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)によって PQQGDH遺 伝子を増幅し、 DNAリガーゼにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築することも できる。次に、以上のいずれかの方法により構築した組換えベクターをそれが自律複 製可能な宿主微生物に移入する。そして、発現ベクターに固有のマーカーと PQQG DH酵素活性を指標としてスクリーニングし、 PQQGDHをコードする遺伝子を含有する 組換えベクターで形質転換された宿主微生物を得る。
[0026] 次 ヽで、必要に応じて選択された形質転換体を培養した後、菌体を回収する。回 収した菌体力 常法に従って組換えベクターを分離、精製する。このようにして目的 の PQQGDH遺伝子を含有する組換えベクターが取得される。力かる組換えベクター 力 の PQQGDH遺伝子の分離は制限酵素処理等によって行うことができる。
[0027] ここで、ァシネトバクタ一'カルコァセティカス NBRC 12552からの PQQGDH遺伝子 の取得方法の一例についてその詳細を以下に示す。まず、ァシネトパクター 'カルコ ァセティカス NBRC 12552を例えば 1〜3日間攪拌培養して得られた培養液を遠心処 理して集菌し、次 、で菌体を溶菌させることにより PQQGDH遺伝子を含有する溶菌 物を調製する。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理を採 用することができる。また、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素処理やラウリル硫酸ナ トリウム（SDS)等の界面活性剤による処理を併用してもよい。さらに、凍結融解ゃフレ ンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
[0028] 上記のようにして得られた溶菌物からの DNAの分離、精製は常法に従って行うこと ができる。例えばフエノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌタレ ァーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うこと ができる。
[0029] 微生物から分離、精製された DNA力 PQQGDH遺伝子を取得するために、既に明 らかにされているァシネトバクタ一 ·スピーシーズ L.M.D. 79.41株の塩基配列を基にし たプライマーを用いた遺伝子増幅反応を行う。
[0030] 増幅された PQQGDH遺伝子を適当なベクターにクローユングすることも可能である 。クロー-ングする際のベクター（クロー-ングベクター）としては、宿主微生物内で自 律的に複製し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたもの が適している。このようなファージの例としては大腸菌（Escherichia coli)を宿主微生 物とする Lambda gtlO、 Lambda gtl lなどが挙げられる。同様にプラスミドの例として は大腸菌（Escherichia coli)を宿主微生物とする pBR322、 pUC19、 pBluescript、 pTrc 99A, pGEM-T vectorなどが挙げられる。
[0031] ベクターへのクロー-ングは、上述の方法で取得した PQQGDH遺伝子をベクター のクロー-ングサイトに挿入することにより行われる。力かる操作は制限酵素及び DN Aリガーゼを利用した周知の方法によって行うことができる。
[0032] クローユングに使用する宿主微生物としては、その中で糸且換えベクターが安定かつ 自律増殖可能であって、さらに外来性遺伝子を形質発現できるものであれば特に限 定されない。一般的には大腸菌（Escherichia coli) W3110、大腸菌 C600、大腸菌 HB 101、大腸菌 JM109、大腸菌 DH5 aなどの腸内細菌を挙げることができる。好ましく はァシネトパクタ^ ~ ·カルコァセティカス、ァシネトパクタ^ ~ ·バウマン- (Acinetobacter baumanniリ、ンュ' ~~ドモナス'エノレキノサ (Pseudomonas aeruginosaノ、ンュ ~~ rモナス •プテタ (Pseudomonas putida 、シユードモナス'フノレオレツセンス (Pseudomonas fluo rescens)、ノ ークホノレデリア'セノ シァ (Burkholderia cepacia)グノレコノノ クタ一'ォキ シダンス (Gluconobacter oxydans)、ァセトノ クタ一'ァセチ (Acetobacter aceti)、ァグ ロバクテリゥム'ラジオパクター（Agrobacterium radiobacter)、ェシエリヒア'コリ、クレブ シーラ ·エー口ジーンズ (Klebsiella aerogenes)等の PQQを生産する宿主微生物等を 利用する。これらの宿主微生物を採用することは、高価な PQQの添加が必要なくなる という利点を有する。 [0033] 宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がェシ エリヒア'コリの場合を例に採れば、コンビテントセル法やエレクト口ポーレーシヨン法、 プロトプラストフュージョン法などを用いることができる。
目的の組換えベクターが適切に導入された宿主微生物を選択するには、ベクター が有するマーカー（例えば薬剤耐性遺伝子）の発現と、 PQQの添カ卩による GDH活性 の発現が同時に認められる微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに 基づく選択培地で生育し、かつ PQQGDHを産生する微生物を選択すればよい。この ような方法によって選択された形質転換体は、栄養培地で培養されることにより、多 量の PQQGDHを安定に生産し得る。
[0034] 以上の方法により得られた PQQGDH遺伝子の塩基配列を Science ,第 214卷， 1205
(1981)に記載されたジデォキシ法により解読した（図 1、配列番号 2)。また、 PQQGD Hのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した（図 1、配列番号 1) 。尚、シグナル領域を含む、遺伝子配列（配列番号 4)及びアミノ酸配列（配列番号 3 )は図 2に示される。
[0035] PQQGDH遺伝子を保有する組換えベクターから回収した PQQGDH遺伝子は、遺 伝子工学的手法を用いて容易に改変することができる。具体的には例えば部位特異 的変異法を用いて、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆 位を含むように遺伝子の改変を行う。
[0036] <改変型 PQQGDHをコードする核酸の構築 >
以上のようにして取得された PQQGDH遺伝子に対して、発現産物であるタンパク質 において C末端側に一つ以上のアミノ酸が付加されるように変異をカ卩える。これにより 、 C末端側への一つ以上のアミノ酸の付カ卩によって基準 PQQGDHよりも長いアミノ酸 配列を有する改変型 PQQGDHをコードする遺伝子 (核酸）が得られる。
例えば、 PQQGDH遺伝子の 3'末端に特定のアミノ酸配列をコードする領域が付カロ された増幅産物が得られるように設計されたプライマーを用いた PCRなどによって、 改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を取得することができる。この操作に加えて、一 部のアミノ酸が置換されるように構造遺伝子に変異を導入すれば、 C末端側にアミノ 酸が付加されている点、及び一部のアミノ酸が異なる点において基準 PQQGDHと相 違する改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を調製することができる。アミノ酸置換の ための変異導入法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、 Molecular し loning, Third Edition, Cold bpnng Harbor Laboratory Press, New Yorkを 照)、こ れら公知の方法の中から適切な方法を選択して用いればよい。尚、 C末端側ヘアミノ 酸を付加するための変異導入操作と、アミノ酸置換のための構造遺伝子への変異導 入操作は、いずれを先に実施してもよい。
アミノ酸置換のための構造遺伝子への変異導入操作の一例を以下に示す。この例 では、 PQQGDH遺伝子にランダムな変異を挿入し、各変異体 (改変体)の発現産物 の基質特異性を比較して好ましい基質特異性を有する遺伝子を選択することによつ て、基質特異性の向上に有効なアミノ酸置換が行われた改変型遺伝子を得る。具体 的には、まずエラーブローン PCRを利用して標的とする遺伝子領域にランダムに変異 を導入し、改変型 PQQGDH遺伝子ライブラリーを構築する。ランダム変異によって得 られた有用な変異の組合せを有する多重置換体はノバルティスファーマ社によりバイ ォサイエンス アンド インダストリ一誌 vol.59, No.3(2001), P35- 38に報告されている ミューテーシヨンスクランプリング法にて得ることが出来る。この方法では、得られたコ 口-一の培養、リゾチームなど溶菌酵素を用いた菌体の溶菌、そして酵素活性の測 定といった手順により、簡便かつ容易に改変型酵素の評価が行える。
目的とする改変型遺伝子を保有するクローンの選択は例えば次のように行われる。 菌体抽出揿に 1— methoxy— PMS (1— methoxy— 5— methylphenazinium metnyisulfate)と！） CIP(2, 6-dichlorophenol indophenol)を加えて一定時間経過した後の 600nmの吸光 度をもとに PQQGDHの活性を測定し、そしてマルトースに対する反応性が基準 PQQ GDHに比べ低下 (例えば約 10%以上低下）し、グルコースに対する反応性が高度に 保持 (例えば基準 PQQGDHに比べ約 90%以上保持)されているクローンを選択する。 ここで得られたクローンの塩基配列を解析してその変異を確認する。以上のようにし て有効なアミノ酸置換を伴う改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を得ることができる 。このようにして得られた改変型遺伝子に対して、上記のように PCR等を利用してその 3'末端にアミノ酸をコードする配列を付加すれば、一部のアミノ酸の置換と C末端側 へのアミノ酸の付カ卩による改変が行われた改変型 PQQGDHが得られる。 [0038] <改変型 PQQGDH遺伝子の発現 >
改変型 PQQGDH遺伝子の発現には、大腸菌を宿主とする発現系などを利用するこ とができる。例えば、まず上述の方法によって調製された改変型 PQQGDH遺伝子を 、大腸菌を宿主とするベクター（例えば pUCベクター、 pBluescriptベクター）に挿入し て発現ベクターを構築する。当該発現ベクターには宿主内での改変型 PQQGDHの 発現に必要なプロモーター配列、複製開始点、ターミネータ配列などが含まれる。
[0039] 宿主微生物に発現ベクターを導入 (移入)する方法としては、例えば宿主微生物が 大腸菌（Escherichia coli)の場合には、コンビテントセル法やエレクト口ポーレーシヨン 法などを用いることができる。宿主微生物への発現ベクターが適切に導入された宿主 微生物の選択は、発現ベクターが有する薬剤耐性マーカーの有無、及び PQQを添 カロした際の GDH活性の発現の有無を指標に行うことができる。例えば、発現ベクター の導入操作後の微生物を薬剤耐性マーカーを保有している場合のみに生育が可能 な選択培地で培養し、続いて生育が認められた形質転換体の中カゝら改変型 PQQGD Hを産生するものを選択すればょ 、。
[0040] 以上の操作によって選択された形質転換体を、それが良好に生育'増殖し且つ発 現ベクターに挿入された改変型 PQQGDH遺伝子が発現可能な条件で培養すること により、多量の改変型 PQQGDHを安定的に産生させることができる。
[0041] 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素 源としては資化可能な炭素化合物であればよぐ例えばグルコース、シユークロース、 ラタトース、マルトース、ラタトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源 としては利用可能な窒素化合物であればよぐ例えばペプトン、肉エキス、酵母ェキ ス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩 、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩 類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
[0042] 形質転換体が生育可能であって且つ改変型 PQQGDHが産生される温度条件で形 質転換体の培養が行われる。例えば、 20°C〜40°Cの範囲内に培養温度を設定する ことができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型 PQQGDH 産生特性、或 、は必要とする改変型 PQQGDH生産量などを考慮して設定することが でき、例えば改変型 PQQGDHの収量が最大に達する時期に培養を完了させる。培 養時間の目安としては 12〜72時間程度である。培地の pHは、形質転換体が生育し 且つ PQQGDHが産生される範囲内に調整される。好ましくは培地の pHを 6.0〜9.0程 度とする。
[0043] 改変型 PQQGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま、或 、は濃縮、不純物の 除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は 菌体より改変型 PQQGDHをー且回収する。産生される改変型 PQQGDHが分泌型タ ンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。 培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去 した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモ-ゥムゃ硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタ ノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処 理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テイク 口マトグラフィ一等の各種クロマトグラフィー（例えば、セフアデックス（Sephadex)ゲル ( フアルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、 DEAEセファロース CL-6B (フアルマシ ァバイオテク）、ォクチルセファロース CL- 6B (フアルマシアバイオテク）、 CMセファロ ース CL- 6B (フアルマシアノィォテク） )などを組み合わせて分離、精製を行ことにより 改変型 PQQGDHの精製品を取得することができる。他方、菌体内から回収する場合 には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧 処理、超音波処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊 した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型 PQQGDHの精製品を取得 することができる。尚、必要に応じて EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加し て PQQGDHを可溶ィ匕し、水溶液として分離採取することができる。
尚、精製酵素は、電気泳動（SDS-PAGE)において単一のバンドを示す程度に純ィ匕 されていることが好ましい。
[0044] 上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレ 一ドライなどにより粉末ィ匕して流通させることが可能である。その際、精製酵素を予め 2価の金属塩、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液や GOODの緩衝液に溶解させておい てもよい。また好ましくは 2価の金属塩を含む前述の緩衝液に溶解させておいても良 い。ここで使用される緩衝液として好適なものは GOODの緩衝液であり、中でも PIPES 、 MES又は MOPS緩衝液が特に好ましい。
[0045] 本発明の改変型 PQQGDHは、 PQQを補酵素として、グルコースを酸化してダルコノ
δ ラタトンを生成する反応を触媒する作用を有する。かかる酵素活性は、 PQQG DHによるグルコースの酸ィ匕に伴って還元される PQQの量を酸ィ匕還元試薬の呈色反 応により定量することが出来る。呈色試薬としては例えば、 PMS-DCIP、 1-methoxy-P MS— XTT(2,3— Bis(2— methoxy— 4— nitro— 5— sulfophenyl)— 2H— tetrazolium— 5— carboxanili de)、フ リシアンィ匕カリウムなどを用いることが出来る。
[0046] 本発明では PQQGDH活性の測定を、原則として、以下の試薬を使用し以下の条件 で実施することとする。
<試薬 >
20mM MOPS(pH7.0)
ImM CaCl ·2Η O
2 2
20mM PMS (Phenadine methosulfate)
4mM DCIP
120mMグノレコース
<測定条件 >
上記試薬混液 3.0mlを 25°Cで約 5分予備加温した後に 0.1mlの酵素溶液を加え、緩 やかに混和する。その後、水を対照とし、 25°Cに制御された分光光度計で 3分間記録 し、その直線部分から 1分間あたりの 600應の吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶 液の代わりに希釈用緩衝液を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定す る。上記条件で 1分間に還元型 DCIP1 μモルを生成させる酵素量を 1単位 (U)とする
[0047] 本発明の改変型 PQQGDHのグルコースに対する選択性は、基質としてラタトース、 マルトース、ガラクトース、シユークロース及びキシロース等の各種の糖を用いて上述 と同様に酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を 調べることにより評価することが出来る。
[0048] 本発明の改変型 PQQGDHを用いて、グルコース測定用試薬、及び当該試薬を構 成要素として含むグルコース測定用キットを構築することができる。即ち、本発明の他 の局面は改変型 PQQGDHを含むグルコース測定用試薬、及び当該試薬を含むダル コース測定用キットを提供する。本発明のダルコース測定用キットには改変型 PQQG DHの他に、測定する際に必要とされる緩衝液などの溶液や標準としてのグルコース 溶液等を含有させることができる。
[0049] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
実施例
[0050] 1.染色体 DNAの分離
ァシネトバクタ一'カルコァセティカス NBRC 12552株の染色体 DNAを次の方法で分 離した。同菌株を 10mLの LB培地で 30°C、ー晚振とう培養した後、遠心処理（15000rp m、 10分間）により集菌した。得られた菌体力 Dneasy tissue kit (キアゲン社）を用い て染色体 DNAを抽出、精製し、そして TEバッファーに溶解した。
[0051] 2. PQQGDHをコードする遺伝子を含有する DNA断片の調製、及び当該 DNA断片を 含有する組換えベクターの構築
1.で得られた染色体 DNAを铸型とし、次のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反 応 (PCR)によって、目的とする PQQGDH遺伝子を含む DNA領域を増幅させた。尚、こ こで使用されるプライマーは、ァシネトバクタ一'スピーシーズ L.M.D 79.41株由来の 可溶性 PQQGDHの塩基配列（A-M Cleton- Jansenら Mol. Gen. Genet., 217, 430(198 9))を基に設計した。
フォワードプライマー： 5， -ACAAATCATATAGAGAACTCG-3，（配列番号： 33) リバースプライマー： 5 ' -TTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAGAGATCC TGGG-3' (配列番号： 34)
PCRは以下の表 2に示す組成の溶液中で行い、 94°C2分間の反応、次に 94°C30秒 間、 48°C30秒間、及び 72°C2分間の反応を 30サイクル、最後に 72°C10分間の反応を 行う条件とした。
[0052] (表 2)
TAKARA LA-taq 0.5 L 10- fold buffer 5 L
25mM MgCl 5 L
2
dNTP mix (2.5mM) 8 L
フォワードプライマー（lOpmol/ L) 1
リバースプライマー（lOpmol/ L) 1 L
铸型 DNA (template)
H O (脱イオン水）で 50 μ Lに調整
2
[0053] 得られた増幅遺伝子断片を pGEM- T Easy vector (キアゲン社）に連結し、このプラ スミドで大腸菌 JM109株を形質転換した。尚、得られたプラスミドを pTGEM-GDHBとし た。
[0054] 3.ァシネトバクタ一'カルコァセティカス NBRC 12552の可溶性 PQQGDHの塩基配列 の決定
2.で得られたプラスミド pTGEM-GDHBに挿入された遺伝子断片の塩基配列を Big Dye Terminator Sequencing Kit (アプライド 'バイオシステムス社製）を用いて決定し た。決定した塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 1に示 す通りである。尚、シグナル領域を含めた塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配 列番号 4及び配列番号 3に示される。アミノ酸配列力も計算されたタンパク質の分子 量は約 50,000であり、ァシネトバクタ一'カルコァセティカスの可溶性 PQQGDHの分 子量とほぼ一致した。
[0055] 4. PQQGDH遺伝子を含有する発現ベクターの構築
2.で得られたプラスミド pTGEM- GDHBを铸型とし、次のプライマーを用いた PCRを 行った。
フォワードプライマー： 5， -CACAGGAAACAGAATCCATGGATGTTCCTC-3，（配 列番号： 35)
リバースプライマー： 5 ' -GCGGCCGCCTGCAGCTATTACTTAGCCTTATAGGTG AACTTAATGAGAGATCCTGGG- 3 ' (配列番号： 36)
PCRは以下の表 3に示す組成の溶液中で行い、 94°C2分間の反応、次に 94°C30秒 間、 55°C30秒間、及び 72°C2分間の反応を 30サイクル、最後に 72°C10分間の反応を 行う条件とした。
[0056] (表 3)
Sigma Klenl aq 0.5 μ L
10- fold buffer 5 L
dNTP mix (lOmM) 2.5 L
フォワードプライマー（lOpmol/ μ θ 2 L
リバースプライマー（lOpmol/ μ 2 L
铸型 DNA (template)
H O (脱イオン水）で 50 μ Lに調整
2
[0057] 得られた増幅遺伝子を制限酵素 Ncolと Pstlにて切断した。切断した遺伝子断片を 発現ベクター pTrc99A (アマシャム'フアルマシア'バイオテク社製）に連結し、このプ ラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換した。尚、得られた発現プラスミドを pTrcGDHBS とした（図 3)。形質転換体を 30°C、 100 μ g/mLアンピシリンと 6 μ M PQQを含む 100m Lの LB培地でー晚培養したところ PQQGDHの産生が認められた。尚、この PQQGDH の分子量をアミノ酸配列力 計算したところ約 50,000であり、ァシネトバクタ一'カルコ ァセティカス NBRC 12552の分子量とほぼ一致した。
[0058] 5.ァシネトバクタ一.カルコァセティカス PQQGDH遺伝子産物の製造
LB培地 1Lを 500mL容フラスコに 50mLずつ分注し、 121°C, 20minオートクレーブを行 つた。放冷後、別途無菌濾過した lOOmg/mLアンピシリン溶液とイソプロピルガラクトビ ラノシド 50 μ Lを添加し、 PQQGDH発現ベクター pTrcGDHBSを有するコロニーを接種 した。そして 30°Cで 16時間振とう培養した。培養終了時の PQQGDH活性は約 lU/mL であった。
[0059] 培養終了後の培養液を遠心処理することにより回収した菌体を 10mM Tris-HCl (p H7.5)に懸濁した。次に、菌体懸濁液を超音波破砕後、再度遠心分離を行い、上清 液を粗酵素液として得た。この粗酵素液をカチオン凝集剤で処理し、脱塩濃縮した 後、 DEAEセファロース（フアルマシアバイオテク）、 CMセファロース（フアルマシアバイ ォテク)カラムクロマトグラフィーにて分離、精製して精製酵素を得た。
[0060] 以上の方法によって得られた PQQGDHは電気泳動においてほぼ単一のバンドを 示し、この際の比活性は約 4000 U/mgであった。以下に、得られた PQQGDHの性質 を示す。
作用： D-グルコース +人工電子受容体→ダルコノー δ ラタトン +還元型電子 受容体
熱安定性： 50°C (pH 7.0, 10分間処理）
pH安定性: pH6〜9 (30°C、 1時間処理）
至適温度:約 50°C
至適 pH : 7.0
分子量： 50,000
[0061] 6. PQQGDHカルボキシ末端へのヒスチジンタグの付カロ
PQQGDH遺伝子の下流にヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を挿入し、続、て その直後に終始コドンを付加するプライマーを用いて PCRを行った。 4.で得られた p TrcGDHBSを铸型として、次のプライマーを用いた PCRを行った。
フォワードプライマー： 5'— TGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTC— 3' (配列 番号： 37)
リバースプライマー： 5 -GCTTGCATGCCTGCAGCTATTAATGGTGATGGTGAT GGTGCTTAGCCTTATAGGTGAAC-3' (配列番号： 38、下線で示したのが 6 Xヒス チジンタグの配列）
PCRは 4.と同様の組成及び条件にて行った。
[0062] PQQGDH遺伝子下流にヒスチジンタグ、終止コドンを付加して得られた増幅遺伝子 を Ncolと Pstlで切断した。切断した遺伝子断片を発現ベクターに連結し、このプラスミ ドで大腸菌 JM109株を形質転換した。尚、得られた発現プラスミドを pTrcGDHBS-C- Hisとした。形質転換体を 30°C、 100 μ g/mLアンピシリンと 6 μ M PQQを含む lOOmLの LB培地でー晚培養したところ PQQGDHの産生が認められた。尚、この PQQGDHの 分子量をアミノ酸配列力も計算したところ約 50,000であり、ァシネトパクター 'カルコア セティカス NBRC 12552の分子量とほぼ一致した。 5.の方法に従い精製し、野生型 の PQQGDHと一般的性質を比較したところマルトースへの反応性に差異が認められ た。グルコースへの反応性を 100%とした場合、野生型のマルトースへの反応性が 76 %に対し、ヒスチジンタグを付カ卩した PQQGDHは 53%と低下した。この結果から、 PQ QGDHの C末端へのヒスチジンタグの付力卩が基質特異性の向上に効果的であること が半 lj明した。
[0063] 7.改変型 PQQGDH遺伝子の構築
ヒスチジンタグの C末端への付加が野生型酵素以外の基質特異性の改良にも効果 力ある力否力を以下の手順で検証した。まず、野生型酵素に部位特異的に変異を導 入した。野生型酵素への部位特異的変異の導入は QuikChange Site-Directed Muta genesis kit (ストラタジーン社）を用いて行った。 4.で得られたプラスミド pTrcGDHBS を铸型とし、次のプライマーを用いて以下の表 4に示す変異体 (改変型 PQQGDH)を 作製した。尚、以下に示す使用したプライマーの各配列の語尾に記した F及び Rはそ れぞれフォワード及びリバースを表す。
配列名：配列
G295E-F： 5 ' -CAAATTAAAGATTTAGAACAAAATGGTTTAAAAGTGGC-3 ' (38 mer、配列番号： 39)
G295E-R： 5， - GCCACTTTTAAACCATTTTGTTCTAAATCTTTAATTTG- 3 ' (38 mer、配列番号： 40)
[0064] G295D-F： 5 ' -CAAATTAAAGATTTAGATCAAAATGGTTTAAAAGTGGC-3 ' (38m er、配列番号: 41)
G295D-R： 5 ' - GCCACTTTTAAACCATTTTGATCTAAATCTTTAATTTG- 3 ' (38m er、配列番号: 42)
[0065] M342P-F： 5， - CCAACCTgTggggATCCTACCTACATTTgCTgg- 3，（33mer、配列 番号: 43)
M342P-R： 5 ' -CCAgCAAATgTAggTAGGATCCCCACAggTTgg-3 ' (33mer、配列 番号: 44)
[0066] A351T-F： 5， - gCCAACggTTACCCCgTCATCTgCTTATgTCTA- 3，（33mer、配列 番号: 45)
A351T-R： 5 ' -TAgACATAAgCAgATgACggGGTAACCgTTggC-3 ' (33mer、配列 番号: 46) [0067] L169F-F： 5 ' - GGGGCGTAACCAGTTCGCTTATTTATTCTTACC- 3 ' (33mer、配 列番号: 47)
L169F-R： 5 ' -GGTAAGAATAAATAAGCGAACTGGTTACGCCCC-3 ' (33mer、配 列番号: 48)
[0068] 変異導入の条件は以下の通りである。 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit に付属する 1 μ Lの PfoTurbo DNAポリメラーゼ（2.5U/ μ L)、 125ngのフォワードとリバ 一スの各プライマー、 dNTPのミックス、 10ngの pUK- GDHB(S)と 1/10量の PCRバッファ 一とを混合した。反応条件は 95°C30秒間、次に、 95°C30秒間、 55°C1分間、及び 68 °C10分間を 16サイクルとした。反応終了後に铸型 DNAを除去するためにキットに付属 の制限酵素 Dpnl (10U/ し)を 1 μ L添加し、 37°Cで 1時間インキュベートした。反応産 物の 1 μ Lを用いて大腸菌 XL1- Blueを形質転換しコロニーを得た。
[0069] [表 4]
Figure imgf000027_0001
[0070] 尚、表中の数字はアミノ酸位置を表す。また、各アミノ酸位置のアミノ酸を一文字表 記で表している。
3.に示す方法に従い各変異体の塩基配列を決定し、上記表に掲げる部位に変異 が導入されて ヽることを確認した。変異体 1を産生するプラスミドを pTrcGDHBSmutl、 変異体 2を産生するプラスミドを pTrcGDHBSmut2とし、以降の操作に供した。
[0071] 次に、得られた変異型遺伝子の導入された発現プラスミドに His-Tagを導入する為 、 pTrcGDHBS-C- Hisの Ncolと Kpn2Iで切断された断片と変異型遺伝子の Ncolと Kpn 21で切断された遺伝子断片を入れ替えた。得られたプラスミドをそれぞれ pTrcGDHB S- mutl- C- Hisと pTrcGDHBS- mut2- C- Hisとした。またそれぞれのプラスミドを形質転 換することによって産生される遺伝子産物を変異体 1-His、変異体 2-Hisとした。各プ ラスミドで大腸菌 JM109株を形質転換し、形質転換体を 30°C、 100 g/mLアンピシリ ンと 6 μ Μ PQQを含む lOOmLの LB培地でー晚培養したところ PQQGDHの産生が認 められた。
[0072] 8.ヒスチジンタグ付加及び非付加 PQQGDHの基質特異性
得られた各変異体 (変異体 1、変異体 2、野生型- His、変異体 1-His、変異体 2-His) 及び野生型についてそれぞれ、 5.に従って発現プラスミドを精製し、基質特異性を 調べた結果を以下の表 5に示す。この表から明らかなように、ヒスチジンタグが付加さ れた PQQGDHはいずれもマルトースへの特異性が約 10%程度低下していた。尚、以 下の表では、野生型 PQQGDHのグルコースへのタンパク質当たりの活性値を 100%と した相対値としてグルコースに対する反応性 (相対比活性 (%) )も示した。
[表 5]
Figure imgf000028_0001
[0073] 9. C末端付加アミノ酸配列の種類と基質特異性との関係
PQQGDHの基質特異性の改良に最も有効な C末端付加アミノ酸配列を決定する目 的の下、 C末端付加アミノ酸配列が異なる変異体を複数構築し、それらの基質特異 性を比較した。まず、 7.で得られた C末端に 6個のヒスチジン残基が付加され、しカゝも 295番目のグリシンがァスパラギン酸に、 351番目のァラニンがスレオニンに置換され たグルコース脱水素酵素をコードするプラスミド pTrcGDHB5M(No.2)を铸型として以 下の条件で PCRを行った。
(表 6)
铸型 DNA
10 X LA buffer (タカラバイオ製） 5 L
25mM MgCl 5 μ L
2
2.5mM dNTP 8 L フォワードフライマー (lOpmol/ μ l μ L
リバースプライマー（lOpmol/ μ ϋ) 1 L
AccuTaq(5 units/ μし) 0.5 μ L
H O (脱イオン水で） 50 μ Lに調整
2
[0074] フォワードプライマー： 5， -TGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCG-3，（配 列番号: 49)
リバースプライマー： 5， - GCTTGCATGCCTGCAGCTATTANNNNNNNNNNNNNN NNNNCTTAGCCTTATAGGTGAAC-3 ' (配列番号： 50)
94°Cで 30秒間の反応、 66°Cで 30秒間の反応、及び 72°Cで 120秒間の反応を 1サイ クルとして合計 30サイクルを行った。得られた PCR産物を、制限酵素 Ncol及び Pstlで 切断し、同様にベクター pTrc99Aも制限酵素処理した。
両断片を連結後、宿主大腸菌（Escherichia coli) JM109株を形質転換した。アンピ シリン耐性を示す形質転 ·の中からランダムに 14クローンを選択し、それらが産生 する改変型 PQQGDHを精製して基質特異性を評価すると共に C末端側の塩基配列 を決定した (表 7)。尚、以下の表では、各菌株が産生する改変型 PQQGDHの C末端 に付加されて ヽる配列 (C末端付加配列）と、グルコースを基質としたときの活性に対 するマルトースを基質としたときの活性湘対活性比（％) )と、グルコースに対する反 応性（野生型 PQQGDHのグルコースへのタンパク質当たりの活性値を 100%とした相 対値としてのグルコースに対する反応性 (相対比活性 (%) )が示される。
[0075] [表 7]
菌株 No. 産生する PQQGDH C末端付加配列 相対活性比(％) 相対比？ ί性
のアミノ酸配列 (%)
1-2 配列番号 18 ANNMVP 23.4 78
1-3 配列番号 19 C G S Q I A 22.0 95
1-5 配列番号 20 T S N F P A 23.9 93
1-6 配列番号 21 AQGYQQ 23.0 94
1-13 配列番号 22 PPCNTP 20.5 79
1-14 配列番号 32 なし 28.2 91
1-17 配列番号 23 S C P VD 26.3 80
1-18 配列番号 24 P N E S L A 22.0 93
2-1 配列番号 25 IIIIHHHH 23.1 89
2-2 配列番号 26 P TKTN I 23.6 86
2-8 配列番号 27 VD I 24.2 88
2-10 配列番号 28 W P A E P T 24.9 90
2-11 配列番号 29 PDRL F L 22.0 91
2-20 配列番号 30 YPRLVG 21.1 93
[0076] 表 7から明らかなように、 C末端にアミノ酸が付加された改変型 PQQGDHはいずれも 相対活性比が低下している。この結果から、付加されるアミノ酸の種類及び数に関係 なぐ C末端へのアミノ酸の付加が PQQGDHの基質特異性の改良に有効であること が判明した。一方、表 7の改変型 PQQGDHは非常に相対比活性が高い。具体的に は相対活性が約 80%〜100%の範囲の改変型 PQQGDHを取得できた。このことから 、 C末端にアミノ酸を付加するという改変方法によれば、グルコースに対する比活性を 高 ヽ状態に維持したままで基質特異性の改良が可能であると!/、える。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明によれば、基質特異性が改良された (グルコースに対する基質特異性が高 い） PQQGDHが提供される。本発明の改変型 PQQGDHは試料中のグルコース量の 測定に利用され得る。本発明の改変型 PQQGDHを利用すれば高 、精度で試料中 のグルコース量を測定できる。
[0078] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする c

Claims

請求の範囲
[1] 基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列と比較して、 C 末端側に一つ以上のアミノ酸が付加されている点で相違するアミノ酸配列を有する 改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
[2] 前記基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が、ァシネトパクター属 の微生物由来のピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素である、請求項 1 に記載の改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
[3] 前記微生物がァシネトパクター 'カルコァセティカスである、請求項 2に記載の改変 型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
[4] 前記基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素が配列番号： 1のァミノ 酸配列を有する、請求項 1に記載の改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱 水素酵素。
[5] 前記基準ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を基準と して、ァシネトバクタ一'カルコァセティカス由来のピロ口キノリンキノン依存性ダルコ一 ス脱水素酵素における第 16番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 22番アミノ酸に相当す るアミノ酸、第 67番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 68番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 69番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 75番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 76番ァミノ 酸に相当するアミノ酸、第 116番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 120番アミノ酸に相当 するアミノ酸、第 127番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 143番アミノ酸に相当するァミノ 酸、第 167番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 168番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 169 番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 171番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 177番アミノ酸 に相当するアミノ酸、第 227番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 230番アミノ酸に相当す るアミノ酸、第 231番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 245番アミノ酸に相当するアミノ酸 、第 253番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 254番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 255番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 277番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 295番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 296番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 300番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 309番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 318番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 341番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 342番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 343番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 347番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 349番アミノ酸に 相当するアミノ酸、第 350番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 351番アミノ酸に相当する アミノ酸、第 356番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 423番アミノ酸に相当するアミノ酸、 第 429番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 432番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 433番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 434番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 439番アミノ酸に 相当するアミノ酸、力 なる群より選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換さ れている、請求項 1〜4のいずれかに記載の改変型ピロ口キノリンキノン依存性ダルコ ース脱水素酵素。
[6] 配列番号： 1にお 、て、第 16番アミノ酸、第 22番アミノ酸、第 67番アミノ酸、第 68番ァ ミノ酸、第 69番、第 75番アミノ酸、第 76番アミノ酸、第 116番アミノ酸、第 120番アミノ酸 、第 127番アミノ酸、第 143番アミノ酸、第 167番アミノ酸、第 168番アミノ酸、第 169番ァ ミノ酸、第 171番アミノ酸、第 177番アミノ酸、第 227番アミノ酸、第 230番アミノ酸、第 231 番アミノ酸、第 245番アミノ酸、第 253番アミノ酸、第 254番アミノ酸、第 255番アミノ酸、 第 277番アミノ酸、第 295番アミノ酸、第 296番アミノ酸、第 300番アミノ酸、第 309番アミ ノ酸、第 318番アミノ酸、第 341番アミノ酸、第 342番アミノ酸、第 343番アミノ酸、第 347 番アミノ酸、第 349番アミノ酸、第 350番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 351番アミノ酸 に相当するアミノ酸、第 356番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 423番アミノ酸に相当す るアミノ酸、第 429番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 432番アミノ酸に相当するアミノ酸 、第 433番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 434番アミノ酸に相当するアミノ酸、第 439番 アミノ酸に相当するアミノ酸、第 169番アミノ酸、第 295番アミノ酸、第 342番アミノ酸、及 び第 351番アミノ酸力 なる群より選択される一以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換 されてなるアミノ酸配列を有する、請求項 5に記載の改変型ピロ口キノリンキノン依存 性グルコース脱水素酵素。
[7] 配列番号： 18〜31のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項 6に記載の改変型 ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
[8] グルコースに対する反応性を 100%とした相対値で表して、マルトースに対する反応 性 (相対活性比）が 40%以下である、請求項 1〜7のいずれか記載の改変型ピロ口キノ リンキノン依存性グルコース脱水素酵素。
[9] 基準 PQQGDHのグルコースに対する反応性 (比活性)を 100%とした相対値 (相対 比活性)で表して、グルコースに対する反応性 (相対比活性）が 70%以上である、請求 項 1〜8のいずれかに記載の改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵 素。
[10] 請求項 1〜9のいずれかの改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵 素をコードする、単離された核酸。
[11] 請求項 10に記載の核酸を保持するベクター。
[12] 請求項 10に記載の核酸を保有する形質転換体。
[13] 請求項 12に記載の形質転換体を、前記核酸が発現可能な条件下で培養する工程
、及び前記核酸の発現産物を回収する工程、を含む改変型ピロ口キノリンキノン依存 性グルコース脱水素酵素の製造方法。
[14] 請求項 1〜9のいずれかの改変型ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵 素を含んでなるグルコース測定用試薬。
[15] 請求項 14に記載のグルコース測定用試薬を含んでなるグルコース測定用キット。
[16] ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素のカルボキシ末端に少なくとも一 つ以上のアミノ酸を付加することを特徴とする、ピロ口キノリンキノン依存性グルコース 脱水素酵素の基質特異性を改良する方法。
[17] 前記ピロ口キノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素がァシネトパクター属の微生 物由来である、請求項 16に記載の方法。
[18] 前記微生物がァシネトパクター ·カルコァセティカスである、請求項 17に記載の方 法。
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