JP5641738B2

JP5641738B2 - 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ

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Publication number: JP5641738B2
Application number: JP2009548893A
Authority: JP
Inventors: 洋志相場; 西矢　芳昭; 西矢　　芳昭; 忠行今中; 晴幸跡見
Original assignee: Kyoto University; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Kyoto University; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2008-01-07
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: EP2230301A1; WO2009087929A1; CN101918553B; CN101918553A; JPWO2009087929A1; US20110020851A1; US8394615B2; EP2230301A4; EP2230301B1

Description

本発明は、グルコース濃度を測定する試薬及びグルコースセンサに利用することのできる新規なグルコースデヒドロゲナーゼに関する。また、該酵素の製造方法、並びに該酵素を用いたグルコース定量用組成物及びグルコースセンサに関する。

ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７、以下グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、またＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨとも記す）は、主に血中グルコース濃度測定に用いられる酵素であり、以下の反応を触媒する。
Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ

このような血中グルコース測定用酵素としては、他にグルコースオキシダーゼが知られているが、本酵素は分子状酸素を電子受容体として利用しうるため、グルコース濃度を測定する際に溶存酸素濃度の影響を受けるという問題点が指摘されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、このような溶存酸素の影響がないことから、近年の血糖センサ用酵素の主流となっている。ＧＤＨには、ＮＡＤ（Ｐ）依存型のほかにピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存型、フラビン依存型が存在する。アシネトバクター・バウマンニ由来のものに代表されるＰＱＱ依存型ＧＤＨは、マルトースに対してもグルコースと同等の反応性を有しているなど、基質特異性に問題がある。また、フラビン依存型ＧＤＨとしては例えばアスペルギルス・テレウス由来のものが知られており、ＰＱＱ依存型ＧＤＨと比して基質特異性はより厳密であるが、しかしながらキシロースに対して対グルコース比約９％の反応性を有していて、必ずしも十分な基質特異性とはいえない。また、温度安定性としても５０℃程度を限度としており、十分ではない。

公知のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属バクテリア由来のものが良く知られ、例えばバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）などがＧＤＨ産生菌として報告されている。これらのバクテリア由来ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、基質特異性としては比較的良好である反面、熱安定性としては５０℃前後を限度としており、十分な安定性を有しているとはいえない。

超好熱性始原菌（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｒｃｈａｅａ）は、系統的にＡｒｃｈｅａｅに分類される微生物であって、９０℃以上で生育可能であるかもしくは８０℃以上の至適生育温度を有する生物を指す。こうした超好熱性始原菌に由来する酵素は、一般的に高い耐熱性を有しており、数々の耐熱性酵素が超好熱性始原菌より単離されて産業利用されている。ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨについても超好熱性始原菌より単離されており、特性が調べられている。１９８６年にはスルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｒｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来（非特許文献１）、１９８９年にはサーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）由来（非特許文献２）、また１９９７年にはサーモプロテウス・テナックス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓｔｅｎａｘ）由来（非特許文献３）のＧＤＨがそれぞれ報告されている。これら酵素は耐熱性に優れている一方で、バクテリア由来のものと比して基質特異性が劣るという問題点を含んでいる。Ｓ．ソルファタリカス由来のＧＤＨについては、ＮＡＤＰを補酵素とした場合では基質特異性がブロードになり、基質濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌにおいてグルコースよりもガラクトースやキシロースに対する活性のほうが高い。ＮＡＤを補酵素とした場合ではグルコースに対する特異性が比較的高まるものの、依然キシロースに対する活性が対グルコース比２６％程度と高い。またＴ．アシドフィラム由来ＧＤＨは、ＮＡＤＰを補酵素とした際にガラクトースに対して活性を示し、対グルコース比７０％にも及ぶ。さらにＴ．テナックス由来ＧＤＨの場合もキシロースに対して高い反応性を示す。血中グルコース濃度を測定するにあたって、使用するＧＤＨの基質特異性が低くグルコース以外の物質に反応するということはすなわち血糖値測定の正確性を損なう結果となり、極めて不都合である。しかしながらこれまで、超好熱性始原菌に由来し、８０℃以上の温度に耐えうる高い耐熱性を有していてかつグルコースに対する特異性の高いＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨの存在は知られていなかった。
ＧｉａｒｄｉｎａＰｅｔａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．２３９ｐ５１７−５２２ＳｍｉｔｈＬＤｅｔａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．２６１ｐ７９３−７９７ＳｉｅｂｅｒｓＢｅｔａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１６８ｐ１２０−１２７

したがって、本発明の目的は、８０℃以上の熱安定性を有する極めて安定な酵素であって、かつグルコース以外の糖類に対して実質的に作用しないグルコースデヒドロゲナーゼを提供することであり、また該酵素の製造方法並びに該酵素を用いたグルコース定量用組成物を提供することである。

本発明者らは、鹿児島県小宝島の温泉水よりサーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属に属する超好熱性始原菌を単離し、本菌がＧＤＨを産生することを発見した。そして該ＧＤＨは熱安定性に優れるのみならず、公知の超好熱性始原菌由来ＧＤＨと異なり極めて高い基質特異性を有していること見出した。さらに発明者らは、このＧＤＨをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌に導入して発現せしめることに成功した。さらに該酵素を用いてグルコース濃度の測定が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１：マルトース、ガラクトース、及びキシロースのいずれに対しても対グルコース比３％未満の反応性を有し、かつ８０℃以上の温度安定性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
項２：さらに、グルコースを酸化する反応においてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とする、項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
項３：超好熱性始原菌に由来し、次の（Ａ）〜（Ｆ）に示す特性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ：
（Ａ）温度安定性：９０℃以下
（Ｂ）ｐＨ安定性：４．８〜９．７
（Ｃ）至適反応温度：８５℃
（Ｄ）至適ｐＨ：９．７
（Ｅ）補酵素：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とする。
（Ｆ）基質特異性：補酵素としてＮＡＤＰを用いた場合、キシロース及びマルトースに対して対グルコース比２％以上３％未満、ガラクトース及びマンノースに対して対グルコース比１％以上２％未満の活性を示し、ラクトース、ソルビトール及びスクロースに対しては実質的に反応せず、補酵素としてＮＡＤを用いた場合、キシロース、マルトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、ソルビトール及びスクロースに対して実質的に反応しない。
項４：配列番号２に示すアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
項５：配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２に示すアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼと実質的に同一の活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
項６：項１〜５のいずれかに記載するグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
項７：項６に記載するＤＮＡを、該ＤＮＡを導入する宿主細胞において作動可能なプロモーターに機能的に連結されてなる発現ベクター。
項８：項７に記載する発現ベクターを用いて形質転換された形質転換微生物。
項９：微生物が大腸菌である項８に記載の形質転換微生物。
項１０：項８または９に記載の微生物を培養し、得られる培養物よりグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを含む、項１〜５のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項１１：項１〜５のいずれかに記載するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコース定量用組成物。
項１２：項１〜５のいずれかに記載するグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量工程を含むことを特徴とするグルコースの定量方法。
項１３：配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１もしくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２に示すアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼと実質的に同一の活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。

本発明により、安定性にきわめて優れ、かつグルコース以外の糖にほとんど作用せずまた溶存酸素の影響も受けないため正確な血糖値およびグルコース定量を可能にするＧＤＨもしくは該ＧＤＨを含むグルコースセンサ並びにグルコース定量用組成物を提供することができる。

本発明は、超好熱始原菌に由来し、高い安定性と優れた基質特異性を有するＧＤＨに関する。具体的には次のような特性を有するＧＤＨである。すなわち、基質特異性としてはマルトース、ガラクトース、キシロースのいずれに対しても対グルコース比３％未満の反応性である。また該ＧＤＨの温度安定性は８０℃以上であり、より好ましくは８５℃以上、さらに好ましくは９０℃である。さらに好ましくは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。さらに好ましい詳細な特性は以下のとおりである。すなわち、温度安定性は９０℃、ｐＨ安定性は４．８〜９．７、至適反応温度は８５℃、至適ｐＨは約９．７、補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とすることで機能する。また基質特異性については、補酵素としてＮＡＤＰを用いた場合、キシロース、マルトースに対して対グルコース比２％以上３％未満、ガラクトース、マンノースに対して対グルコース比１％以上２％未満の活性を示し、ラクトース、ソルビトール、スクロースに対しては実質的に反応しない。補酵素としてＮＡＤを用いた場合、キシロース、マルトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、ソルビトール、スクロースに対して実質的に反応しない。また、アミノ酸配列から推定される分子量は３７０００である。

１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）の塩基配列（真核生物の場合は１８ＳｒＲＮＡ）に基づいた進化系統樹によれば、生物はＥｕｃａｒｙａ、Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｃｈａｅａの３つの大きな生物界に分類される。本発明に述べる「始原菌」とは、この１６ＳｒＲＮＡの進化系統樹に基づいて「Ａｒｃｈａｅａ」という生物界に分類される生物を指す。さらに超好熱性始原菌とは、９０℃以上で生育可能な始原菌であるか、もしくは至適生育温度が８０℃以上である始原菌として定義される。

本発明のＧＤＨの由来する生物としては超好熱性始原菌であれば特に限定しないが、好ましくはパイロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｍ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属からなる群のうちいずれかに分類されるかあるいはいずれかに近縁である超好熱始原菌であり、より好ましくはサーモプロテウス属に分類される始原菌である。さらに好ましくは、以下の（Ａ）〜（Ｇ）に示す特徴を有する始原菌である。（Ａ）１６ＳｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ上の塩基配列として、配列番号３に示す塩基配列を含む。（Ｂ）８０℃以上の温度で生育可能であり、至適生育温度は約９０℃である。（Ｃ）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量が５８〜６２モル％である。（Ｄ）絶対嫌気性菌である。（Ｅ）電子受容体としてチオ硫酸塩を加えた場合に良好な増殖を示す。（Ｆ）ＮａＣｌ濃度１％以下で生育可能である。（Ｇ）形状は長さ１０〜３０μｍ、幅約５μｍの長桿菌である。

本発明で述べる温度安定性とは、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）にタンパク質量として０．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるようＧＤＨを溶解し、本ＧＤＨ溶液を３０分間加熱した際の、加熱前のＧＤＨ活性に対する加熱後のＧＤＨ活性の残存率として定義される。そして温度安定性の項に示す温度範囲の数値は、上記の条件において９０％以上の活性残存率を示す温度範囲を表している。例えば、８０℃以上の熱安定性とは、ＧＤＨを含む溶液を８０℃以上の温度で３０分間インキュベートした後、当該ＧＤＨが加熱前と比較して少なくとも９０％の活性を保持していることを意味する。換言すれば、一定の温度で３０分間ＧＤＨをインキュベートした場合に、そのインキュベートの前と比較してインキュベート後にＧＤＨが９０％以上の活性を有する温度が８０℃以上で存在することを意味する。また、活性の測定方法は後述のとおりである。

好適な一実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼが熱安定性を有するとは、特定の温度にて３０分間熱処理した後に、当該ＧＤＨが、熱処理前の酵素活性と比較して、少なくとも９０％以上の残存活性を有することを意味する。例えば、８０℃の熱安定性を有するとは、ＧＤＨを８０℃で３０分間熱処理した場合に、熱処理前と比較して、熱処理後のＧＤＨが９０％以上の酵素活性を保持していることを意味し、当然ながら８０℃よりも低い温度で前記熱処理をした場合も９０％以上の残存活性を保持している（即ち、熱安定性を有する）ことを意味する。このように、特定の温度の値をもって熱安定性を規定した場合、少なくとも当該数値で示される温度以下で上記熱処理をした場合に、９０％以上の残存活性を本発明のＧＤＨが有することを意味する。従って、８０℃以上の熱安定性を有するとは、８０℃以上にそのような熱安定性の上限値となる温度を有することを意味する。

より好適な一実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼが熱安定性を有するとは、特定の温度にて３０分間熱処理した後に、当該ＧＤＨが、熱処理前の酵素活性と比較して、９５％以上の残存活性を有することを意味する。例えば、本実施形態において、８０℃の熱安定性を有するとは、ＧＤＨを８０℃で３０分間熱処理した場合に、熱処理前と比較して、熱処理後のＧＤＨが９５％以上の酵素活性を保持していることを意味し、当然ながら８０℃よりも低い温度で前記熱処理をした場合も９５％以上の残存活性を保持している（即ち、熱安定性を有する）ことを意味する。

本発明のＧＤＨは、少なくとも８０℃の熱安定性を有し、好ましくは、少なくとも８５℃の熱安定性を有し、更に好ましくは、少なくとも９０℃の熱安定性を有する。

本発明で述べる基質特異性は、基質濃度１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、補酵素濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０、反応温度６０℃という条件下においてＧＤＨが基質を酸化する速度として評価される。より具体的には、後述の活性測定方法においてグルコースに相当するものとして評価対象である他の糖類に置き換えた場合の活性値を算出し、グルコースを基質とした場合の活性値を１００とした場合の百分率に換算して示される。本発明においては、この活性が対グルコース比１％未満であるとき、該基質に対して実質的に反応しないと表現する。

本発明で述べるｐＨ安定性とは、０．１ｍｏｌ／Ｌのバッファー成分を含む溶液にタンパク質量として５μｇ／ｍＬの濃度となるようＧＤＨを溶解し、本溶液を２５℃で２４時間インキュベートした際の、インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性の残存率として定義される。そしてｐＨ安定性の項に示す温度範囲の数値は、上記の条件において９０％以上の活性残存率を示すｐＨ範囲を表している。例えば、ｐＨ安定性４．８〜９．７とは、ｐＨ４．８〜９．７のバッファー中でＧＤＨを２４時間インキュベートした後、当該ＧＤＨがインキュベート前と比較して少なくとも９０％の活性を保持していることを意味する。換言すれば、一定のｐＨで２４時間ＧＤＨをインキュベートした場合に、インキュベート前と比較してインキュベート後のＧＤＨの活性が９０％以上である特定のｐＨの値をｐＨ４．８〜９，７の間に有することを意味する。

本発明のＧＤＨは、超好熱性始原菌に由来し、かつ上記の特性を有するものである限り特に制限しない。ここで超好熱性始原菌に由来するとは、自然界において該ＧＤＨを本来生産する菌株が超好熱性始原菌であるという意味である。したがって、遺伝子を形質転換する等して人工的に作製した細胞により産生されたＧＤＨであっても、該遺伝子の塩基配列が、超好熱性始原菌ゲノムに本来存在する遺伝子と塩基配列が同一であるかもしくは該塩基配列を元に１もしくは２以上の塩基を置換・欠失・挿入または付加した配列であって且つ本発明のＧＤＨと実質的に同一の活性を有する場合、本発明において該ＧＤＨは超好熱性始原菌に由来するとみなす。実質的に同一の活性を有するとは、改変されたＧＤＨの活性が配列番号２で示されるアミノ酸を有するＧＤＨと比較して、実験誤差の範囲内であるか、又はそれ以上の活性を有することを意味する。

本発明の好ましい態様においては、本発明は配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むグルコースデヒドロゲナーゼであり、または配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸残基を欠失、置換、挿入または付加させてなる配列からなるポリペプチドを含むグルコースデヒドロゲナーゼである。該ＧＤＨは、由来する超好熱性始原菌を培養した培養液から得たものであってもよく、また由来する始原菌とは異なる宿主生物に遺伝子を導入し発現させることにより得たものであってもよい。

本発明のグルコースデヒドロゲナーゼが、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸の置換、付加、欠失、又は挿入を有するポリペプチドから成る場合、このようなアミノ酸の変異の数や種類は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性や上述する熱安定性、ｐＨ安定性、基質特異性といった酵素特性に影響を及ぼさない限り特に制限はない。好ましくは、変異の数は、数個であり、より具体的には、１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜１０個、より更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。

本発明のグルコースデヒドロゲナーゼが、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換されているポリペプチドから成る場合、当該アミノ酸の置換は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性や前述する酵素特性を損なわない限り特に制限はないが、好ましくは、類似のアミノ酸によって置換されている。類似のアミノ酸としては、例えば、以下を挙げることが出来る。
芳香族アミノ酸：Phe、Trp、Tyr
脂肪族アミノ酸：Ala、Leu、Ile、Val
極性アミノ酸：Gln、Asn
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、His
酸性アミノ酸：Glu、Asp
水酸基を有するアミノ酸：Ser、Thr

配列番号２に示すポリペプチド配列は、公知のサーモプロテウス・テナックス由来ＧＤＨと７９％という高い相同性を有している。しかしながら、基質特異性という観点において本発明のＧＤＨはきわめて優れている点で明確に異なる特性を有している。上述の非特許文献３によれば、公知のサーモプロテウス・テナックス由来ＧＤＨは基質濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌにおいてグルコースよりもキシロースに対する活性が高いが、本発明のＧＤＨは、ＮＡＤＰを補酵素とした場合基質濃度１５０ｍｍｏｌ／Ｌという高い濃度においてもキシロースに対する活性は対グルコース比３％未満であり、ＮＡＤを補酵素とした場合では対グルコース比１％未満と、キシロースに対する反応性が極めて低い。このような特性の差異は、両者のアミノ酸配列比較において異なっている部分が大きく関与していると考えられる。本発明のＧＤＨを特徴付ける指標の一つとして該ＧＤＨが有するアミノ酸配列の配列番号２の配列に対する高い相同性が挙げられ、その相同性は８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。より好適な実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、９５％以上の相同性を有し、更に好ましくは、９８％の相同性を有し、特に好ましくは、９９％の相同性を有する。

本発明のＧＤＨは、（１）該酵素を産生する細胞を原料として抽出精製する方法、（２）化学的に合成する方法、（３）遺伝子組換え技術によりＧＤＨを発現するように操作された細胞から精製する方法、または（４）ＧＤＨをコードする核酸から無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等を適宜用いることによって取得することができる。

本発明のＧＤＨを産生する天然の細胞を得る方法としては例えば以下に述べるような方法がある。まず超好熱性始原菌の好む生育環境、すなわち火山地帯、深部地下、海底熱水孔、温泉湧出地といった高温環境よりサンプルを採取し、適当な培地に植菌し８０℃以上の温度で培養する。

天然のＧＤＨ産生細胞からのＧＤＨの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。ＧＤＨ産生細胞を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。

化学合成によるＧＤＨの製造は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成することにより行うことができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のＧＤＨを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）および（２）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙａｎｄＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６６）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒａｎｄＬｕｅｂｋｅ，ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５）

このようにして得られた本発明のＧＤＨは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。

上記方法で得られるＧＤＨが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明のＧＤＨは、好ましくは、該蛋白質をコードする核酸をクローニング（もしくは化学的に合成）し、該核酸を担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。

酵素遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行われる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法や質量分析などを用いて決定する。また、ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン法や質量分析により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングする。あるいは、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。

目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、例えば、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にアクセスし、該公知遺伝子の塩基配列と相同性を有する配列を検索し、ヒットした塩基配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。

また、ヒットした塩基配列を基にして、適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成し、ＧＤＨを産生する細胞より調製したゲノムＤＮＡ画分または全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）またはＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。

上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。

より好ましくは、本発明のＧＤＨをコードする核酸としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（該核酸がＲＮＡの場合はｔをｕに読み替えるものとする）、あるいは配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ前記した配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の性質、即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が３７０００である、温度安定性は９０℃以下、ｐＨ安定性は４．８〜９．７、至適反応温度は８５℃、至適ｐＨは約９．７、基質特異性としてはマルトース・ガラクトース・キシロース・ラクトース・ソルビトール・マンノースに実質的に作用しない、補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とすることで機能する、という諸性質を有するポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸などが用いられる。

本明細書における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。

ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行うことができる。

ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。

本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、上記のようにサーモプロテウス属超好熱始原菌のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｃＤＮＡ）より取得することもできるが、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、ＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。

上記の理由から、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。

本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡを導入する宿主細胞は、後述するように組換え発現系が確立しているものであれば、特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等が挙げられ、より好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。大腸菌において使用頻度の高いコドンとしては、例えば、Ｋ１２株の場合であれば、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。

このように宿主において使用頻度の高いコドンに置換されたＧＤＨをコードするＤＮＡとして、例えば、サーモプロテウス属始原菌由来のＧＤＨをコードするＤＮＡを、該ＧＤＨと同一のアミノ酸配列をコードし、且つ大腸菌Ｋ１２株において使用頻度の高いコドンに置換したＤＮＡが挙げられる。

本発明はまた、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＧＤＨをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。

特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＧＤＨをコードするＤＮＡが配置されたＧＤＨ発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＧＤＨをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。

宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。

宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＧＤＨｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。

作成した組換えベクターを導入する宿主生物としては、組換え発現系が確立している大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等を挙げることができるが、中でもタンパク質発現能力に優れている大腸菌を用いるのが好ましい。組換えプラスミドを導入する方法としてはエレクトロポレーションによる導入のほか、塩化カルシウム等薬品処理によりコンピテント化した宿主であればヒートショックによる導入も可能である。宿主ベクターへの目的組換えプラスミドの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの各種薬剤耐性遺伝子に代表されるマーカーとＧＤＨ活性とを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを発現する微生物を選択すればよい。

本発明のＧＤＨは、上記のようにして調製されるＧＤＨ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＧＤＨを回収することによって製造することができる。

使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。

培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。

宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，ｐ．４３１，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地［Ｂｏｓｔｉａｎ．Ｋ．Ｌ．ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５０５（１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，８４０４（１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

ＧＤＨの精製は、ＧＤＨ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。

培養物の培地中に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。

一方、細胞質に存在するＧＤＨは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。

組換えＧＤＨを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＧＤＨのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＧＤＨ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＧＤＨを分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＧＤＨをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＧＤＨのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＧＤＨをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＧＤＨコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。

あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。

上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。特に本ＧＤＨは耐熱性に優れているため、他の宿主細胞由来夾雑タンパク質を熱変性せしめ、かつＧＤＨ活性を保持しうる範囲での加温処理が、大幅なＧＤＨ純度向上に有効である。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。

かくして得られるＧＤＨが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。

精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。

さらに、本発明のＧＤＨは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。

本発明のＧＤＨをコードするＲＮＡは、本発明のＧＤＨをコードするｃＤＮＡの取得方法において上記した、本発明のＧＤＨをコードするｍＲＮＡを常法を用いて該ＲＮＡを発現する宿主細胞から精製するか、あるいは、ＧＤＨをコードするＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写系を用いてｃＲＮＡを調製することによって取得することができる。無細胞タンパク質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はＰｒａｔｔＪ．Ｍ．ｅｔａｌ．， “ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｌａｔｉｏｎ”，ＨａｍｅｓＢ．Ｄ．ａｎｄＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．ｅｄｓ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ１７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉＳ３０ｅｘｔｒａｃｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ５００ＲａｐｉｄＴｒａｎｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎＦ．Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９：１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎＡ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６：３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。

タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法［Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８４）前述］や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム［ＳｐｉｒｉｎＡ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１６２−１１６４（１９８８）］、透析法（Ｋｉｇａｗａｅｔａｌ．，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭＷｈｅａｔｇｅｒｍｃｅｌｌ−ｆｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｃｏｒｅｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。

本発明はまた、本発明のＧＤＨを含んでなるグルコース定量用組成物、並びに本発明のＧＤＨを用いてグルコース濃度を測定する方法を提供する。

本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
本発明のグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキット、グルコースセンサは、液状（水溶液、懸濁液等）、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化したもの、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。

グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。また好ましくはメディエーターなど測定に必要な試薬を含む。

グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。

グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。本発明のＧＤＨは補酵素であるＮＡＤもしくはＮＡＤＰと共存させた形態で電極上に固定化するが、補酵素不在の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。

グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液、ＧＤＨ、補酵素としてＮＡＤもしくはＮＡＤＰを含む反応液を入れ、一定温度に維持する。そこにグルコースを含む試料を加え、一定温度で一定時間反応させる。この間、３４０ｎｍの吸光度をモニタリングする。レート法であれば吸光度の時間あたりの上昇率から、エンドポイント法であれば試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度上昇度より、あらかじめ標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブを元に試料中のグルコース濃度を算出することができる。また、可視光領域での比色による定量を行う場合においては、さらに適当なメディエーター及び発色試薬を添加すればよい。このような例としては、たとえば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、メディエーターとしてｐｈｅｎａｚｉｎｅｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍｂｌｕｅ（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用するメディエーターおよび発色試薬はこれらに限定されない。

またグルコース濃度の測定は、以下のようにしても行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、補酵素、および必要に応じてメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

活性測定例
本発明においては、ＧＤＨ活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（９０ｍｍｏｌ／ＬＢｉｃｉｎｅ、５ｍｍｏｌ／Ｌ β−ＮＡＤＰ＋、１５０ｍｍｏｌ／ＬＤ−グルコース）９００μＬを蓋つき石英セルにいれ、６０℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液１５μＬを加えて混和し、６０℃で３分反応させ、この間３４０ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に６０℃３分インキュベートして３４０ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルの補酵素を還元する酵素量を１Ｕと定義する。
ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×０．９１５×希釈倍率］
／（６．２２×１．０×０．０１５）
なお、ここで
９１５：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２：ＮＡＤＰＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）
０：光路長（ｃｍ）
０１５：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。

タンパク質の定量
本発明に述べるタンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定したものである。より具体的にはタンパク質濃度測定キットであるバイオラッド社製Ｂｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙを用い、本キットに添付のマニュアルに従って測定したものであり、またタンパク質濃度の決定にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作成した検量線を使用した。すなわち本発明に述べるタンパク質量はＢＳＡ当量として算出したものである。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
超好熱性始原菌の培養とＧＤＨの精製
発明者らは、鹿児島県小宝島の温泉水より超好熱性始原菌を分離した。本菌株は、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列より、サーモプロテウス属に分類される菌であると推定され、さらに以下の（Ａ）〜（Ｇ）に示す特性を有していた。（Ａ）１６ＳｒＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ上の塩基配列として、配列番号３に示す塩基配列を含む。（Ｂ）８０℃以上の温度で生育可能であり、至適生育温度は約９０℃である。（Ｃ）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量が５８〜６２モル％である。（Ｄ）絶対嫌気性菌である。（Ｅ）電子受容体としてチオ硫酸塩を加えた場合に良好な増殖を示す。（Ｆ）ＮａＣｌ濃度１％以下で生育可能である。（Ｇ）形状は長さ１０〜３０μｍ、幅約５μｍの長桿菌である。以上の特徴を有する本菌株を、サーモプロテウス・エスピー・ＧＤＨ１株（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓｓｐ．ＧＤＨ１）と名づけた。

ＧＤＨ１株を培養するにあたって、０．５％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％チオ硫酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、０．００５％硫化ナトリウム、さらに溶存酸素の指示薬として５ｍｇ／Ｌのレサズリンを成分として含む培地を嫌気性グローブボックスに入れ、窒素置換を繰り返すことで培地中の酸素を除いた。ここに、上記の分離菌株を植え、８５℃で３日間静置培養した。さらに、上記培地組成に終濃度０．５％のグルコースを追加した培地に増殖菌体を植え継ぎ、８５℃で３日間嫌気培養を行った。培養液７Ｌを、高速冷却遠心装置を用いて遠心し、上清を除くことで菌体を回収した。この菌体を２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁して氷上に置き、超音波破砕機（トミー精工社製、ＵＤ−２０１）を用いて出力３、駆動率４０％で１０分処理し、菌体を破砕した。破砕液をさらに遠心分離することで固形残渣を取り除き、ＧＤＨ粗抽出液を得た。この粗抽出液に、硫酸アンモニウムを終濃度３０％となるよう溶解して室温で２０分攪拌することで夾雑タンパク質を沈殿させた。遠心分離にて沈殿を取り除き、さらに終濃度４８％となるよう硫酸アンモニウムを加えて溶解し、室温で２０分攪拌することでＧＤＨを含む画分を沈殿させた。遠心分離にて上清を取り除き、得られたＧＤＨ画分を２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この液をカラム容量６ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライして夾雑タンパク質をカラムに吸着させ、ＧＤＨを透過させた。この透過液に終濃度２２．８％となるよう硫酸アンモニウムを溶解し、疎水性カラムであるｒｅｓｏｕｒｃｅＩＳＯカラム（ＧＥヘルスケア社製、容量６ｍＬ）にアプライし吸着させた。硫酸アンモニウム濃度２２．８％〜０％のグラジエントをかけて吸着タンパク質を溶出してＧＤＨ活性を有するフラクションを集めた。さらに分離カラムとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００、溶出バッファーとして５０ｍＭトリス、０．１５ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の緩衝液を用いてゲルろ過を行った。得られたＧＤＨ画分を精製溶液とした。

＜実施例２＞
ＧＤＨ遺伝子のクローニング
実施例１で得られたＧＤＨ溶液１０μＬに等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）を加えて１００℃で１０分煮沸した。これを１２．５％アクリルアミドゲルにアプライし、４０ｍＡで電気泳動の後、ＣＢＢＳｔａｉｎＯｎｅ（ナカライテスク社製）を用いてゲルのＣＢＢ染色を行った。染色後のゲルから、サンプルのメインバンドを切り出し、質量分析装置によるペプチドシーケンスの解析を行った。得られた推定アミノ酸配列を元に、ミックス塩基を含むディジェネレートＰＣＲプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応液を１％アガロースゲルにアプライして電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したのち、ＵＶ照射下で増幅したＧＤＨ遺伝子の内部部分断片のバンドを切り出した。そして切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡ断片を東洋紡製ＴＡｒｇｅｔＣｌｏｎｅＰｌｕｓを用い、ＴＡクローニングの要領で本キットに付属のクローニングベクターｐＴＡ２にライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。複数のコロニーをそれぞれ５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養し、培養液からＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐミニプレップキット（バイオラッド社製）を用いて、本キットのマニュアルに従いプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドのインサートの塩基配列を解析することで、目的のＧＤＨ遺伝子の部分塩基配列を決定した。さらに決定した配列を元に、内部部分配列の外側に向けたプライマーを作製し、このプライマーとＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ製）を用いてＧＤＨ遺伝子の５’側および３’側末端領域の増幅および塩基配列決定を行うことで、遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に、推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

＜実施例３＞
ＧＤＨ発現ベクターの構築
超好熱菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに、ＧＤＨ遺伝子の開始コドンにＮｄｅＩ、終止コドン直後にＢａｍＨＩサイトを付加させた配列を有するよう設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応液を１％アガロースゲルにアプライして電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したのち、ＵＶ照射下で増幅したＧＤＨ遺伝子のバンドを切り出した。そして切り出したゲル片からＤＮＡを抽出・精製し、得られたＤＮＡ断片をＴＡｒｇｅｔＣｌｏｎｅＰｌｕｓを用い、本キットに付属のクローニングベクターｐＴＡ２に挿入した（ｐＴＡ２ＴＧＤＨ１）。挿入したＧＤＨ遺伝子内部に存在するＮｄｅＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ）を、コードするアミノ酸は変えずに別の塩基配列に置換するために以下の操作を行った。５’−ＡＧＣＡＣＧＧＣＡＴＴＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号５）からなる塩基配列を有するオリゴＤＮＡをプライマーとし、上記で得られたｐＴＡ２ＴＧＤＨ１をテンプレートとしてＰＣＲと同様の反応をサーマルサイクラーを用いて行った。つづいて反応液に対液２％のＤｐｎＩを添加し、３７℃１時間処理することでテンプレート（ｐＴＡ２ＴＧＤＨ１）を消化した。このＤｐｎＩ処理液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。複数のコロニーをそれぞれ５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養し、培養液からＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐプラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの塩基配列を解析し、ＧＤＨアミノ酸配列のうち１１３番目のイソロイシンをコードするコドンがＡＴＡからＡＴＴに変換された、すなわちＧＤＨ遺伝子塩基配列のうち３３９番目のＡがＴに置換されたことを確認して配列修正済みプラスミドｐＴＡ２ＴＧＤＨ２とした。このｐＴＡ２ＴＧＤＨ２についてＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩによる制限酵素処理を行い、１％アガロースゲルで電気泳動を行ってＧＤＨ遺伝子（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ切断末端を５’、３’末端にそれぞれ有する）を含むゲル片を切り出し、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐＳｙｓｔｅｍを用いてＤＮＡを抽出・精製した。これを同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＥＴ２１ａと混合し、この混合液と等量のライゲーションハイ（東洋紡製）を混和して１６℃３０分インキュベートすることによりライゲーションを行った。このライゲーション液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに添加してヒートショックによる形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に塗布、３７℃一晩培養して形質転換体コロニーを形成させた。形質転換体コロニーのうち、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートの挿入が確認されたものを５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に植菌して一晩培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体から、プラスミド抽出キットを用いてプラスミドを回収した。このプラスミドのインサートのシーケンス解析により、正しい遺伝子配列を有していることを確認して発現ベクター（ｐＥＴ２１ａＴＧＤＨ２）とした。

＜実施例４＞
ＧＤＨ遺伝子の発現と精製
実施例３で得たｐＥＴ２１ａＴＧＤＨ１を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ストラタジーン社製）に添付のマニュアルに従ってヒートショック導入し、形質転換株を得た。形質転換コロニーを試験管中のＬＢ培地５ｍＬ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）８本に懸濁し、３７℃で１晩振とう培養した。得られた培養液を、２Ｌ容坂口フラスコ中のＬＢ培地８００ｍＬ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）４本にそれぞれ８ｍＬずつ植菌した。フラスコは３７℃１２０ｒｐｍで３時間振とうし、６６０ｎｍにおける菌体濁度が約０．６になった時点で終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃１２０ｒｐｍで４時間振とう培養を継続した。培養液を高速冷却遠心分離機で遠心分離して上清をデカントにより除き、得られた菌体を７０ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液＋０．１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液に、超音波破砕機（トミー精工社製、ＵＤ−２０１）を用いて出力４、駆動率４０％で２０分処理することで菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して残渣を取り除き、ＧＤＨ粗抽出液とした。この粗抽出液を８５℃で３０分処理して夾雑タンパク質を変性させ、変性タンパク質を遠心分離によって除いた。上清画分は５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ・０．１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で緩衝化したｒｅｓｏｕｒｃｅＱカラムを透過させた後、透過液に対液２１．３％の硫酸アンモニウムを溶解させた。この液を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ・２２．８％硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で緩衝化したｒｅｓｏｕｒｃｅＩＳＯカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム濃度０％までのグラジエント溶出を行い、ＧＤＨ画分を集めた。この画分をさらにｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いてゲルろ過し、得られたＧＤＨ画分を精製リコンビナントＧＤＨ溶液とした。この精製溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＣＢＢ染色で単一バンドを示す純品であることを確認した。

＜実施例５＞
組換えＧＤＨの補酵素濃度依存性および基質濃度依存性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、本発明のＧＤＨの６０℃・ｐＨ８．０における最大反応速度（Ｖｍａｘ）およびミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。算出方法は、上記の活性測定例に準じる方法で基質濃度と補酵素濃度を変化させて活性を測定し、両逆数プロットにより最小二乗法で決定した直線よりこれら定数を算出した。結果、補酵素としてＮＡＤを用いた場合では、ミカエリス定数（Ｋｍ）はＮＡＤに対して１０．３ｍＭ、グルコースに対して６６．９ｍＭであり、グルコース濃度１Ｍにおける最大反応速度（Ｖｍａｘ）は１６７０Ｕ／ｍｇであった。また、補酵素としてＮＡＤＰを用いた場合では、ミカエリス定数（Ｋｍ）はＮＡＤＰに対して０．０７５ｍＭ、グルコースに対して５．２７ｍＭであり、補酵素濃度５ｍＭにおける最大反応速度（Ｖｍａｘ）は３３３Ｕ／ｍｇであった。本発明のＧＤＨは、各補酵素に対するミカエリス定数より、生体内では主にＮＡＤＰを補酵素として働いていると推定されるが、最大反応速度はＮＡＤを用いた場合の方が５倍程度高くなる。

＜実施例６＞
組換えＧＤＨの温度安定性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、温度安定性を調べた。タンパク質濃度０．１７ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ＭＮａＣｌｐＨ８．０に溶解）を５０℃〜９５℃の範囲の温度で３０分加熱し、加熱前後の活性を比較した。加熱前の活性に対する加熱後の活性の割合（活性残存率）は図１のとおりである。本発明の酵素は、９０℃において９６％、９５℃において８５％の活性残存率を示した。

＜実施例７＞
組換えＧＤＨ反応速度の温度依存性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、反応速度の温度依存性を調べた。上述の活性測定例に準じる方法で、反応させる温度条件を８５℃、８０℃、６０℃、３７℃、２５℃として各反応温度における活性を調べた。結果を表１に示す。本酵素は８５℃付近で最も高い活性を示すが、３７℃において４０Ｕ／ｍｇ、２５℃において１８．６Ｕ／ｍｇと常温においても活性を示すことがわかった。

＜実施例８＞
組換えＧＤＨのｐＨ安定性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、ｐＨ安定性を調べた。緩衝液としては、０．１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ４．３〜６．２）、０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．１〜８．１）、０．１ＭのＢｉｃｉｎｅバッファー（ｐＨ７．９〜８．８）、０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ８．８〜１０．６）を用い、それぞれの緩衝液にＧＤＨを終濃度５μｇ／ｍＬとなるよう添加し、添加直後の活性を測定した。ＧＤＨ溶液はさらに２５℃で２４時間インキュベートし、インキュベート後の活性を測定した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性の割合（活性残存率）を図２に示す。本発明のＧＤＨはｐＨ５．８〜９．２の範囲で活性の低下がなく、またｐＨ４．８〜９．７の範囲で活性残存率９０％以上を示した。

＜実施例９＞
組換えＧＤＨ反応速度のｐＨ依存性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、反応速度のｐＨ依存性を調べた。活性測定方法としては活性測定例に従うが、活性測定例に示す反応液組成の中でＢｉｃｉｎｅに相当するバッファー成分としてｐＨ６．５〜７．９ではリン酸カリウム、ｐＨ７．９〜８．８ではＢｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．６〜９．７ではＣＨＥＳ、ｐＨ９．８〜１０．２ではグリシンをそれぞれ用いた。最も活性値の高かった条件を１００とした相対活性を示したグラフが図３である。本発明のＧＤＨは至適ｐＨ領域がアルカリ性側に分布しており、ｐＨ９．７において最も高い活性を示した。

＜実施例１０＞
組換えＧＤＨの基質特異性
実施例４で得られたＧＤＨの各糖類に対する反応性を調べた。上記活性測定例に示す反応液組成のうち、補酵素として５ｍＭのＮＡＤＰもしくはＮＡＤを用い、基質に相当する糖類として１５０ｍＭグルコース、キシロース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンノースを用いて活性を測定した。グルコースに対する活性を１００とした場合の、各基質に対する相対活性を表２に示す。ＮＡＤＰを補酵素とした場合の対グルコース比活性はキシロース・マルトースに対し２％程度、ガラクトース・マンノースに対し１％程度であり、ラクトース、ソルビトール、スクロースにはほとんど反応しなかった。一方、ＮＡＤを補酵素とした場合では、キシロース・マルトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、ソルビトール、スクロースに対しグルコース比１％未満であった。特にガラクトース・キシロースに対する反応性という観点から、本酵素は公知の超好熱性始原菌由来ＧＤＨと比べて優れた基質特異性を有していることがわかった。

＜実施例１１＞
組換えＧＤＨ反応速度のカリウムイオン濃度依存性
実施例４で得られたＧＤＨを用いて、反応速度のカリウムイオン濃度依存性を調べた。活性測定例に示す反応液組成に、各濃度のＫＣｌを加えた反応液を用いてＧＤＨ活性を測定した。ＫＣｌ無添加条件での活性を１００とした相対活性は、ＫＣｌ濃度０．１ｍｏｌ／Ｌで１２９、０．２ｍｏｌ／Ｌで１３３、０．５ｍｏｌ／Ｌで１４６、１．０ｍｏｌ／Ｌで１５０であった。本発明のＧＤＨはカリウムイオン濃度の上昇に伴って活性も上昇し、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上のカリウムイオン濃度領域では活性はほぼ横ばいであることがわかった。

＜実施例１２＞
組換えＧＤＨを用いたグルコースの定量
グルコース定量用の試薬として、０．１ｍｏｌ／ＬＢｉｃｉｎｅ、０．５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ β−ＮＡＤ、１Ｕ／ｍＬＧＤＨ（実施例４で得たもの。活性は上述の活性測定例による。）を成分として含むｐＨ８．０の溶液を調製した。この試薬９００μＬを石英セルに入れ、インキュベート装置付き吸光度計にセットし、２５℃で５分予備加温した。ここにグルコース溶液１５μＬを加えて溶液中のグルコースの終濃度が２、５、１０、１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにし、それぞれのグルコース濃度条件で２５℃３分間反応させて３４０ｎｍの吸光度変化をモニタリングした。３分間の吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇を算出し、グルコースの代わりに１５μＬの蒸留水を加えた場合の吸光度変化を差し引いた値（ΔｍＡｂｓ／分）をプロットした（図４）。横軸にグルコース濃度、縦軸にΔｍＡｂｓ／分をとってプロットした点の軌道は直線性を示した。最小二乗法で求めた回帰直線の決定係数はＲ^２＝０．９９９３となり、本発明のＧＤＨを用いて精度良くグルコース濃度の定量ができることが確認された。

本発明により製造したグルコースデヒドロゲナーゼは、血糖値測定用試薬、血糖センサー並びにグルコース定量キットの原料としての供給が可能である。

配列番号２と同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えＧＤＨの温度安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各温度条件で３０分加温処理した後の相対活性；％）、横軸は加温処理時の温度を示す。配列番号２と同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えＧＤＨのｐＨ安定性を示す。縦軸は活性残存率（加温処理前のＧＤＨ活性を１００としたときの、各ｐＨ条件で２５℃２４時間加温した後の相対活性；％）、横軸は反応液のｐＨを示す。但しｐＨ４．３〜６．２は０．１Ｍのクエン酸バッファー、ｐＨ６．１〜８．１は０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．９〜８．８は０．１ＭのＢｉｃｉｎｅバッファー、ｐＨ８．８〜１０．６は０．１Ｍのグリシンバッファーを用いたデータである。配列番号２と同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えＧＤＨのｐＨ依存性を示す。縦軸は相対活性（活性値最大となる条件の活性を１００とした場合の、各ｐＨ条件での相対活性）、横軸は反応ｐＨを示す。但しｐＨ６．５〜７．９ではリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．９〜８．８ではＢｉｃｉｎｅバッファー、ｐＨ８．６〜９．７ではＣＨＥＳバッファー、ｐＨ９．８〜１０．２ではグリシンバッファーをそれぞれ用いたデータである。配列番号２と同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えＧＤＨを含む組成物により、標準グルコース溶液を用いて作成した検量線を示す。縦軸は１分間あたりの３４０ｎｍ吸光度の上昇率（ΔｍＡｂｓ／分）、横軸は反応溶液中のグルコース濃度を示す。

Claims

配列番号２に示すアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、且つマルトース、ガラクトース、及びキシロースのいずれに対しても対グルコース比３％未満の反応性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ。
請求項１又は２に記載するグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
請求項３に記載するＤＮＡを、該ＤＮＡを導入する宿主細胞において作動可能なプロモーターに機能的に連結されてなる発現ベクター。
請求項４に記載する発現ベクターを用いて形質転換された形質転換微生物。
微生物が大腸菌である請求項５に記載の形質転換微生物。
請求項５または６に記載の微生物を培養し、得られる培養物よりグルコースデヒドロゲナーゼを採取することを含む、請求項１又は２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
請求項１又は２に記載するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコース定量用組成物。
請求項１又は２に記載するグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの定量工程を含むことを特徴とするグルコースの定量方法。