JP2000333673A

JP2000333673A - 連続無細胞タンパク質合成手段

Info

Publication number: JP2000333673A
Application number: JP11151599A
Authority: JP
Inventors: Yaeta Endo; 弥重太遠藤; Shigemichi Nishikawa; 茂道西川
Original assignee: WAKENYAKU KK
Current assignee: WAKENYAKU KK
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2000-12-05

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、効率的な連続無細胞タンパク質合成
手段を提供することを目的とする。【構成】本発明は、自己のタンパク質合成反応の阻害物
質が実質的に排除された細胞抽出液からなる無細胞タン
パク質合成手段において、少なくとも合成反応の鋳型と
なるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質、エネルギ
ー源から選ばれた要素について追加・保存・交換・排出
から選択される処置を導入することを特徴とする連続無
細胞タンパク質合成手段からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、連続無細胞タンパク質
合成手段に関する。さらに詳しくは、自己のタンパク質
合成反応の阻害物質が実質的に排除された細胞抽出物か
らなる無細胞タンパク質合成手段において、少なくとも
合成反応の鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵
素、基質、エネルギー源から選ばれた要素を追加・保存
・交換・排出から選択される処置を導入することを特徴
とする連続無細胞タンパク質合成手段に関係する。

【０００２】

【従来の技術】従来、無細胞タンパク質合成系を用いた
タンパク質の合成方法は、ペプチド合成反応速度と翻訳
反応の正確性においては生細胞に匹敵する性能を保持し
ているものの、合成効率が生細胞のそれの０．１〜１％
以下と低く、反応時間も１時間以内と短いため、タンパ
ク質の生産性が低いという欠点があった。

【０００３】今日、利用されている無細胞タンパク質合
成系は、大腸菌、コムギ胚芽や家兎網状赤血球由来の系
が主流で市販もされているが、いずれもタンパク質合成
効率が低いという欠点から、放射性同位体標識法や免疫
学的方法と組み合わせて遺伝子翻訳産物の分析手段とし
ての利用に限られ、タンパク質の調製手段としては殆ど
利用されていない。

【０００４】これまで、無細胞タンパク質合成系の効率
化に関して多くの研究がなされてきたが、スピリン
（Ａ．Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ）らは、従来の方法で調製した
無細胞タンパク質合成系に、合成基質であるアミノ酸
と、エネルギー源であるＡＴＰ、ＧＴＰを限外ろ過膜を
介して連続的に供給することによって（連続式無細胞タ
ンパク質合成系）、上記いずれの無細胞タンパク質合成
系においても反応時間を２０時間以上にわたって持続さ
せることに成功し、従来の２０倍を越えるタンパク質合
成収量を達成した（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔａ
ｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２
−１１６４）。

【０００５】一般に無細胞タンパク質合成反応液におけ
るリボソームなどタンパク質合成因子の濃度は、生細胞
中に比べて１０％前後と低いが、横山らは濃縮した大腸
菌抽出液を含む反応液と透析膜を用いる連続式無細胞タ
ンパク質合成を試み、ＣＡＴやＲａｓなど比較的小分子
のタンパク質を反応系１ｍｌ当たり３〜６ｍｇの高収量
で合成することに成功している（木川ら、第２１回日本
分子生物学会、ＷＩＤ６）（Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．（１９９９），ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４４２，１
５−１９）。

【０００６】これらの成果は、基質濃度の低下が、無細
胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成効率の低下
現象の一因であることを示している。言い換えると、連
続式無細胞タンパク質合成系による効率化は、アミノ酸
やエネルギー源の低下を防ぐ（反応中の基質濃度低下に
は、混在するそれら基質の代謝酵素群も関与すると考え
られる）と同時に、ＡＭＰやＧＭＰ等の代謝産物及びリ
ン酸やピロリン酸等の副生成物の蓄積を排出除去するこ
とにより、タンパク質合成効率が上昇した結果であると
説明できる。

【０００７】従来の連続式無細胞タンパク質合成装置と
しては、限外ろ過膜法、透析膜法や樹脂に翻訳鋳型を固
定化したカラムクロマト法等（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．（１９９３），Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌ．，２１７，１２３−１４２）を挙げることができ
る。なかでも、限外ろ過膜法と透析膜法は取り扱いが簡
便なため、汎用されている。本発明者等も、合成効率の
高い無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を調製する方法
を発明し、透析膜法をもちいた連続式無細胞タンパク質
合成を試み，反応容量１ｍｌ当たり４ｍｇ程度のジヒド
ロ葉酸還元酵素の合成に成功している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、限外ろ
過膜法、透析膜法等によるアミノ酸やＡＴＰ、ＧＴＰ等
のエネルギー源の連続的供給と、リン酸やピロリン酸等
の副生成物の排出によって、無細胞系のタンパク質合成
の効率化が達成されつつあるが、本発明者は、まだ次の
ような課題が残されていることを見出した。すなわち、
（１）反応溶液中の鋳型となるｍＲＮＡは不安定であ
り、長時間の反応では極微量混在するリボヌクレアーゼ
による不可避的な消化によって鋳型活性が低下・消失す
る、（２）エネルギー再生系の酵素であるクレアチンキ
ナーゼも長時間の反応中にその活性が低下し、エネルギ
ー源の供給不足を来す、（３）透析外液は反応液容量の
１０倍量程度を用いるが、長時間反応ではそれに含まれ
るアミノ酸やエネルギー源が枯渇すると同時に副生成物
が蓄積する等である。したがって、このような新規な課
題を解決する手段及びその具体化策として、これらのタ
ンパク質合成に必須な成分の活性低下及び／又は原料の
枯渇などに伴っておきる、タンパク質合成反応の低下も
しくは停止を防ぐ手段を提供することが課題の一であ
る。

【０００９】さらに、透析法による連続式無細胞タンパ
ク質合成反応は、専用の反応装置が無いため、反応温度
制御、攪拌制御、透析外液交換、鋳型ｍＲＮＡ及びエネ
ルギー再生系酵素であるクレアチンキナーゼ等のタンパ
ク質合成反応液への添加などをすべて手動で行う必要が
ある。これらの操作は煩雑であり充分な経験と熟練した
手技が必要とされ、本合成法の欠点となっている。この
欠点を補う簡便で実用的な手段を提供することが課題の
別の一である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、自己のタンパ
ク質合成反応の阻害物質が実質的に排除された細胞抽出
物からなる無細胞タンパク質合成手段において、少なく
とも合成反応の鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系
酵素、基質、エネルギー源から選ばれた要素について追
加・保存・交換・排出から選択される処置を導入するこ
とからなる。

【００１１】本発明の手段の一は、無細胞タンパク質合
成系への、合成反応の鋳型となるｍＲＮＡの追加添加及
び／又はエネルギー再生系酵素の追加添加によって達成
される。

【００１２】本発明の別の手段の一は、無細胞タンパク
質合成系において、基質・エネルギー源の補給及び合成
副生成物の排出によって達成される。

【００１３】本発明の別の手段の一は、無細胞タンパク
質合成系に関与する要素の追加・保存・交換・排出を自
動化して処理することによって達成される。

【００１４】本発明の別の手段の一は、無細胞タンパク
質合成系に関与する要素の追加・保存・交換・排出が実
施可能であり、かつ合成反応の温度制御、攪拌制御等の
条件設定が可能な連続無細胞タンパク質合成装置を提供
することによって達成される。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の連続式無細胞タン
パク質合成手段について詳細に説明する。

【００１６】（細胞抽出物の説明）本発明の連続式無細
胞タンパク質合成系には、大腸菌、胚芽、家兎網状赤血
球等の既知の無細胞タンパク質合成系が適用可能であ
る。好ましい系は、胚芽であり、コムギ、大麦、いね、
コーン、及びほうれん草等が利用できる。この原料は、
自体公知の方法によって、無細胞タンパク質合成材料つ
まり無細胞タンパク質合成用細胞抽出物として調製され
る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９５
７），Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１）が、よ
り好ましくは、自己のタンパク質合成反応の阻害に関与
する系が排除されていることである。

【００１７】無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の、自
己のタンパク質合成反応の阻害物質を排除することと
は、原料細胞自身が含有する又は保持する自己タンパク
質の合成を制御する手段を除くことを意味する。特に、
本発明者が見出したリボソームに作用してその機能を抑
制する物質の排除を意味する。

【００１８】原料細胞自身が含有する又は保持するタン
パク質合成機能を抑制する物質とは、例えば種子の胚乳
に大量に局在することが知られている、リボゾ−ムの機
能を抑制するトリチン（Ｍａｓｓｉａｈ，Ａ．Ｊ．ａ
ｎｄＨａｒｔｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．（１９９５），Ｐｌａ
ｎｔａ，１９７，６３３−６４０）、チオニンとよばれ
るシステインを多く含むタンパク質（Ｂｒｕｍｍｅｒ，
Ｊ．，Ｔｈｏｌｅ，Ｈ．ａｎｄＫｌｏｐｐｓｔｅ
ｃｈ，Ｋ．（１９９４），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２１９，４２５−４３３）、リボヌクレアーゼ
（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｍｅｍ．Ｒｅｓ．Ｉｎ
ｓｔ．ＦｏｏｄＳｃｉ．ＫｙｏｔｏＵｎｉｖ．，Ｎ
ｏ．１９，１〜）等である。

【００１９】胚芽の単離段階で混入する、胚乳局在性の
胚芽無細胞タンパク質合成抑制（阻害）タンパク質の一
群、たとえば、トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ
等を完全に胚芽試料から排除することによって、タンパ
ク質合成活性の抑制を解除することができる。

【００２０】自己のタンパク質合成を抑制する物質を除
くための有用な手段は、界面活性剤特に非イオン性の界
面活性剤を用いて原料細胞を処理することである。非イ
オン性の界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる
が、好適なものとしては、ポリオキシエチレン誘導体で
ある、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ＮＰ−４０、ツィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデ
ット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ＮＰ−４０が最適である。その
添加量は、例えば０．５％である。

【００２１】処理は、原料細胞を、例えばコムギ胚芽を
使った場合、既知の手段でミル・浮選・篩の工程によっ
て、胚芽抽出物を回収する。この胚芽抽出物に対して界
面活性剤による洗浄を数回おこない、洗浄液が白濁しな
くなるまで、洗浄を行う。この処理は、超音波処理との
組合せでおこなうことがより好ましく、より完全な効果
をうることができる。かくして、本発明の合成系で使用
される、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物が調製され
る。

【００２２】（合成反応の開始）かくして調製された無
細胞タンパク質合成用細胞抽出物は、所望により製剤化
され、要時、既知の方法例えばＥｒｉｃｋｓｏｎ等の方
法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔａｌ．（１９９
６），Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，９６，
３８−５０）によって反応に供せられる。反応に際して
は、既知の方法に順じて、例えば合成基質、アミノ酸、
エネルギー源等を選択して、添加する。さらに所望によ
り、無細胞タンパク質合成系の反応効率を高める物質、
例えば各種イオン化合物、好ましくはカリウムイオン化
合物、マグネシウムイオン化合物等を添加することがで
きる。これらのイオン化合物の濃度は、用いる鋳型ｍＲ
ＮＡ種に応じて、至適濃度を選択する。さらに、溶解性
を高める物質例えば界面活性剤、前記リボソームの脱ア
デニン化を防御する物質等を、所望により添加すること
ができる。また、反応温度は、鋳型ｍＲＮＡ種に応じて
至適温度を選択する。

【００２３】（各要素の追加添加）本発明においては、
反応開始後、要時又は継続的に、合成反応の鋳型となる
ｍＲＮＡを、原料として添加したｍＲＮＡの鋳型活性が
低下傾向を示す前後に追加する。添加は、所望により、
極少量を継続的に添加してもよいし、一定期ごとに添加
してもよい。添加量は、原料ｍＲＮＡ量の１０分の１か
ら同量程度である。この発明の特徴は、追加添加の効果
をはじめて確認したことにあり、添加量、添加時期につ
いては、合成効果の確認をもって、当業者が容易に変更
・特定可能である。なお、他の要素についても同様であ
り、以下の記載で特に記述されていなくても同様の意味
である。

【００２４】本発明においては、反応開始後、要時又は
継続的に、エネルギー再生系酵素を、原料として添加し
たエネルギー再生系酵素活性が低下傾向を示す前後に追
加する。添加は、所望により、極少量を継続的に添加し
てもよいし、一定期ごとに添加してもよい。添加量は、
原料エネルギー再生系酵素量の１０分の１から同量程度
である。エネルギー再生系酵素としては、クレアチンキ
ナ−ゼが適当である。無論、本化合物と同様の機能を有
する物質は同様にエネルギー再生系酵素として添加でき
る。その添加量・添加方法は、合成量をマーカーにし
て、要時変更可能である。

【００２５】ｍＲＮＡの追加添加とエネルギー再生系酵
素の追加添加は、別々に行ってもよいがより好ましくは
併用される。添加方法も、継続的あるいは断続的に行っ
てもよい。その添加量・添加方法は、合成量を指標にし
て、要時変更可能である。

【００２６】本発明は、前記ｍＲＮＡの追加添加及び／
又はエネルギー再生系酵素の追加添加に加えて、所望に
より、基質及び／又はエネルギー源が枯渇することを防
ぐ工程、及び／又は副生成物を排出する工程を導入する
ことが出来る。基質、エネルギーとしては、各種アミノ
酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどが連続的に又は断続的に追加供
給されることが好ましい。その添加量としては、合成開
始時の各物質の濃度あるいはほぼそれに近い濃度が維持
されることが好ましい。しかし、この添加量もまた、合
成効果を指標にして要時、追加、変更可能である。

【００２７】副生成物を排出するとは、ＡＭＰやＧＭＰ
等の代謝産物及びリン酸やピロリン酸等の反応物を排出
することであり、このような化合物は、継続的に又は断
続的に反応系から排出されることが好ましい。

【００２８】基質及び／又はエネルギー源が枯渇するこ
とを防ぐ工程、及び／又は副生成物を排出する工程とし
ては、反応系の反応媒体を継続的又は断続的に、更新し
ていくことが好ましい。本発明では、例えば、透析膜を
使う方法を例示するが、その場合例えば透析外液を継続
的又は断続的に更新又は交換していく。

【００２９】以上のような各要素の追加・保存・交換・
排出は、好ましくは自動化して処理する。自動化の手段
は、自体公知のコンピュータシステムの制御下にある装
置を準備し、各要素の追加・保存・交換・排出を一体化
して行う。これらに、使用する各要素としての試薬類は
キット化して調製されていることが好ましい。

【００３０】（自動連続無細胞タンパク質合成装置）自
動連続無細胞タンパク質合成装置は自体公知のコンピュ
ータシステムの制御下にあり、各要素の追加・保存・交
換・排出を一体化して行う機能に加えて、タンパク質合
成に最も至適な環境を設定できる機能を併せ持つ。

【００３１】すなわち、複数の透析容器を、例えば１５
度摂氏より３７度摂氏まで温度可変可能なそれぞれ独立
した複数の、電子冷却装置とヒーターとからなるチャン
バーに入れることで所望の温度に設定でき、目的とする
タンパク質の合成に最も至適な温度を維持することがで
きる。

【００３２】また、透析容器の透析外液を継続的又は断
続的に更新又は交換していく方法として、例えば連続可
変若しくは断続的にペリスターポンプ若しくはシリンジ
ポンプ等の分注装置を用い、透析外液の更新又は交換の
速度を例えば、０．１〜１ｍＬ／時間の間で可変とする
ことにより、目的とするタンパク質の合成に最も至適な
条件を選定することができる。

【００３３】さらに、鋳型ｍＲＮＡ及びエネルギー再生
系酵素であるクレアチンキナーゼ等のタンパク質合成に
必要な物質を、複数の透析容器中に設置されるタンパク
質合成反応系部分に、所望の時間毎に、例えば６時間〜
１５時間の間隔を置いて、所望の量を追加添加できる。

【００３４】上記装置において、鋳型ｍＲＮＡ、エネル
ギー再生系酵素基質、エネルギー源、透析外液等の各要
素は、個別に又は混合されて、透析容器に接続された貯
蔵容器に保存され、貯蔵容器とタンパク質合反応成系部
分又は透析容器とを連結する流路を通って供給される。
この貯蔵容器は好ましくは４度摂氏に維持される。

【００３５】（連続無細胞タンパク質合成装置の構成）
本発明の具体化のための連続無細胞タンパク質合成系に
使用する装置の一例として、カートリッジ装置を説明す
る。但し、本発明の装置は、必ずしもカートリッジ式で
ある必要はない。

【００３６】カートリッジ装置は、一般に有底中空体で
ある含浸槽とこれに密封可能に装着される蓋部とを含む
構成からなる連続無細胞タンパク質合成装置である。該
装置は基質及び／又はエネルギー源の導入手段である入
口と透析外液の含浸槽内の液室につながる出口をもつ流
路、透析外液中の代謝産物等の排出手段である含浸槽内
の液室に存する入口と外部につながる出口をもつ流路、
ｍＲＮＡ及び／又はエネルギー再生系酵素の導入手段で
ある入口と透析外液の含浸槽内の液室に存する透析膜の
機能を有する媒体を担持する。

【００３７】図１はカートリッジ装置の斜視図であり、
図２はカートリッジ装置の中央断面図である。以下、図
をもって本発明のカートリッジ装置を詳細に説明する
が、図示した装置は実施の一態様であり、これに限定さ
れるものではない。

【００３８】カートリッジ装置は、一般に有底中空体で
ある含浸槽１とこれに密封可能に装着される蓋部２を含
み、含浸槽１内には透析外液３が液面４まで満たされ
る。さらに詳しくは、エネルギー源等の導入手段である
入口５と透析外液３の含浸槽１内の液室につながる出口
６をもつ流路７、透析外液３中の代謝産物等の排出手段
である含浸槽１内の液室に存する入口８と外部につなが
る出口９及び／又は９ａをもつ流路１０、及び合成系物
質の導入手段である入口１１と透析外液３の含浸槽１内
の液室に存する透析膜の機能を有する媒体１２を基本的
な構成として担持する。実施の一態様として、図１及び
２には含浸槽が円筒体であるカートリッジ装置を示した
が、含浸槽の形は円筒体に限らない。

【００３９】ここにおいて、出口６は、透析外液３と液
中において連絡しており、出口６の端部は、含浸槽１の
上半分に位置し、少なくとも液面４よりは下部に位置す
る。入口８は、透析外液３と液中において連絡してお
り、入口８の端部は、含浸槽１の下半分に位置する。出
口６の端部の位置と入口８の端部の位置は、上下が逆転
していても良い。

【００４０】出口９ａと導入部２０ａは、液面４と同部
位に接しかつ液面４より上部に位置する。出口９ａと導
入部２０ａにより、排出は自然流出が可能となる。な
お、透析外液３中の代謝産物等の排出を出口９とその導
入部２０を介して行う場合は、出口９ａとその導入部２
０ａを閉鎖するか、あるいは成形時に出口９ａとその導
入部２０ａを付加しないで成形したものを使用すること
もできる。また、透析外液３中の代謝産物等の排出を出
口９ａとその導入部２０ａを介して自然排出する場合
は、出口９とその導入部２０を閉鎖するか、あるいは成
形時に出口９と導入部２０を付加しないで成形したもの
を使用することもできる。さらにこの場合、図示してい
ないが、出口９ａの導入部２０ａと入口８の導入部１９
とが接続可能になるように、導入部１９及び導入部２０
ａを成形して使用することもできる。この成形時、入口
８の導入部１９は、出口９側の端部を蓋部に接続せず、
出口９ａの導入部２０ａに接続可能なように成形しても
良い。

【００４１】透析膜機能を有する媒体１２は、入口１１
の導入部１３と一体成形されていてもよいが、例示する
ように留め具１４によって、固接されていてもよい。媒
体１２は、少なくとも透析外液３中に浸漬されるように
含浸槽１内に位置付けて設置される。媒体１２の入口１
１につながる方向とは逆の端部は、少なくとも透析外液
３中に浸漬されるように含浸槽１内に位置付けて設置さ
れ、少なくとも閉鎖されておれば十分であり、一具体例
としては、膜端部１５のように蓋形状のものによって閉
鎖するか、又は媒体１２を口部が一つの袋状のものとし
て用いてもよい。

【００４２】カートリッジ装置には、好ましくは透析外
液３の攪拌をする手段を導入してもよい。一具体例とし
ては、マグネティックスターラー１６のような回転媒体
を含浸槽１内においてもよい。

【００４３】含浸槽１は、恒温化を施すことが、合成効
率のためには好ましく、所望の恒温化手段との併用が可
能である。例えば、恒温槽に設置可能なように、含浸槽
１は調整できる。カートリッジ装置は、通常は透析外液
３及び合成系物質が浸漬のない状態で使用者に提供さ
れ、使用者が所望により随時入口１１、入口５から各々
流入させることによって浸漬される。

【００４４】入口５、出口９、入口１１は、その流出入
について自動化制御する手段が導入されることが好まし
い。但し、より簡易な自動化手段としては、入口５から
出口６、そして入口８から出口９の流出入系が液面４を
一定に保つべく自動制御されていることが好ましい。こ
の場合、入口１１からの物質の追加添加は、手動制御に
より行ってもよい。また、出口９ａ及び導入部２０ａ
が、液面４より上部であってかつ液面に接した部位に設
置された場合には、自然流出が可能である。

【００４５】本カートリッジ装置は、事前組立て装置で
あってもよいし、要時組立ての装置であってもよい。要
時組立ての場合は、含浸槽１、１の蓋部２、入口１１の
導入部１３、入口５の導入部１７、出口６の導入部１
８、入口８の導入部１９、出口９の導入部２０、媒体１
２（導入部１３と事前成形してもよい）を個々に用意
し、各々の接続は、例えばテーパー手段によって行う。

【００４６】カートリッジ装置の材質は、広く公知のプ
ラスチック材料が利用できる。

【００４７】

【実施例】以下、本発明をコムギ胚芽抽出物を使用した
無細胞タンパク質合成系を用いた参考例、実施例により
さらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明につ
いての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、
本発明の範囲は下記の参考例、実施例により何ら限定さ
れるものではない。

【００４８】

【参考例１】コムギ胚芽抽出物の調製ミル、浮選、篩を用いる種子から無傷（発芽能を有す
る）の単離方法はＪｏｈｎｓｔｏｎらの方法（Ｊｏｈｎ
ｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９５７），Ｎａｔ
ｕｒｅ，１７９，１６０−１６１）を改良して用いた。
まず、コムギ種子を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ社製ＲｏｔｏｒＳｐｅｅｄＭｉｌｌｐ
ｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数
８，０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。これを再度
６，０００ｒｐｍで破砕し、篩で粗胚芽画分（メッシュ
サイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を得た後、四塩化
炭素とシクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサ
ン＝２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有す
る胚芽を浮上画分から回収し、室温乾燥によって有機溶
媒を除去した。

【００４９】この胚芽画分に混在する種皮等の不純物を
ポリエチレン板などの静電気帯電体を用いて吸着除去し
た。さらに胚芽粒子を篩と静電気帯電体を用いて、小粒
（０．７１ｍｍ〜０．８５ｍｍ）、中粒（０．８５ｍｍ
〜１ｍｍ）、軽粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍでかつ軽量）
の３画分に分別し、最後に目による分別を行った。小粒
画分が最も高いタンパク質合成活性を示した。軽粒は、
種子破砕時に胚芽に生じた小傷胚芽が浮選操作中に破壊
が進行したものであると推察される。次に、この試料か
らコムギ胚乳成分を完全に除去するため、ガーゼにコム
ギ胚芽を入れ、冷却しながら冷蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄
し、非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０の０．５％
溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁し
なくなるまで洗浄を繰り返した。蒸留水の存在下に再度
１回の超音波洗浄後、吸引ろ過によってコムギ胚芽をと
り、それを冷蒸留水（ＤＤＷ）で何度も洗浄し、コムギ
胚芽を純化した。

【００５０】コムギ胚芽抽出物の調製は常法（Ｅｒｉｃ
ｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔａｌ．（１９９６），Ｍｅｔ
ｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）
に準じた。以下の操作は４度摂氏で行う。液体窒素で凍
結した純化コムギ胚芽を乳鉢中で粉砕し、得た粉体１ｇ
当たり、１ｍｌのＰａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改
変した抽出溶液（８０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ
７．８、２００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネ
シウム、４ｍＭ塩化カルシウム、８ｍＭジチオスレイ
トール、各０．６ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、各１μ
Ｍのタンパク質分解酵素阻害剤であるＦＵＴ、Ｅ−６
４、ＰＭＳＦを含む）を加えて、泡が発生しないように
注意しながら攪拌した。

【００５１】３０，０００×ｇ、１５分間の遠心によっ
て得られる上清を胚芽抽出物として回収し、あらかじめ
溶液（４０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．８、１
００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、
４ｍＭジチオスレイトール）で平衡化しておいたセフ
ァデックスＧ−２５カラム（Ｃｏａｒｓｅ）でゲル濾過
を行った。試料の濃度を、１７０〜２５０Ａ２６０ｎｍ
（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調製した。

【００５２】

【参考例２】無細胞タンパク質合成反応液の調製無細胞タンパク質合成反応液は、上記の方法で調製した
コムギ胚芽抽出物を容量の２０〜６０％含み、Ｅｒｉｃ
ｋｓｏｎらの方法に準じた以下の成分組成である、３０
ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．６、９５ｍＭ酢
酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８
５ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌクレ
アチンキナーゼ、１．２ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭ
ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０
ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．
３ｍＭ）、０．０５％ＮＰ−４０を添加することによ
り調製した。この反応液に、既に報告した方法（Ｅｎｄ
ｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．，２５，２２１−２３０）で調製したＣＡＰ付きの
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードするｍＲＮＡ（８０μｇ
／ｍｌ反応容量）を添加した。

【００５３】

【実施例１】ｍＲＮＡ及びクレアチンキナーゼの追加に
よる反応維持時間の延長による合成の効率化モデルとしてジヒドロ葉酸還元酵素をコードするｍＲＮ
Ａを用い、２４時間合成反応を行った。反応溶液は、容
量の４８％のコムギ胚芽抽出物を含み、上記Ｅｒｉｃｋ
ｓｏｎらの方法に準じた以下の成分組成である、１，０
００ｕｎｉｔｓ／ｍｌリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮ
ａｓｉｎ）、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．
６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、２．８５ｍＭジチオスレイトール、０．５
ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１．２ｍＭアデノ
シン−三−リン酸（ＡＴＰ）、０．２５ｍＭグアノ
シン−三−リン酸（ＧＴＰ）、１６ｍＭクレアチン
リン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型
アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％ＮＰ−４０の
他、既に報告した方法（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．
（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−
２３０）で調製したＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素
（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）
をコードするｍＲＮＡ（８０μｇ／ｍｌ反応容量）を含
む。

【００５４】反応溶液を、その２０倍容量の透析外液
（２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．６、９５ｍ
Ｍ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、
４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ、０．
２５ｍＭＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３
８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各
０．３ｍＭ）、０．００５％アジ化ナトリウム、０．
０５％ＮＰ−４０、Ｅ−６４、ＰＭＳＦ各１ｍＭ）に
対する透析系を用いて、２３度摂氏で反応させた。

【００５５】反応開始１２時間後に、１ｍｌの反応容量
当たり２０μｇのＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素を
コードするｍＲＮＡと、１ｍｌの反応容量当たり２００
μｇのクレアチンキナーゼとを追加添加、又は１ｍｌの
反応容量当たり２０μｇのＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還
元酵素をコードするｍＲＮＡのみを追加添加、若しくは
１ｍｌの反応容量当たり２００μｇのクレアチンキナー
ゼのみを追加添加した。比較対照として、両物質とも追
加添加せず、反応を行った。操作は手動で行い、透析外
液の交換はしなかった。合成タンパク質量はＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後に、タンパク質をクマ
シーブルー染色し、デンシトメーターを用いてその染色
バンド強度と標準品との比から求めた（Ｅｎｄｏ，Ｙ．
ｅｔａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２
５，２２１−２３０、Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．
（１９７５），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，３８３，３０５−３１５）。

【００５６】図３に示すように、反応開始１２時間後
（矢印）におけるｍＲＮＡ及びクレアチンキナーゼの追
加添加（○−○）によって合成反応がほぼ直線的に持続
することがわかる。いずれか一方のみの追加添加（△−
△）（▽−▽）では、追加添加しない（□−□）と同様
に反応が停止した。すなわち、上記で示した可能性（ｍ
ＲＮＡの鋳型活性低下と、クレアチンキナーゼ活性の低
下によるエネルギー源の枯渇とに起因するタンパク質合
成反応の停止）がここで実験的に確認され、その解決方
法も完成した。

【００５７】

【実施例２】透析外液の経時的交換による反応維持時間
の延長による合成の効率化モデルとしてジヒドロ葉酸還元酵素をコードするｍＲＮ
Ａを用い、反応液組成、温度等の条件は実施例１と同様
とし、反応開始後２４時間及び４５時間に透析外液を交
換して、６０時間タンパク質合成を行った。比較対照と
して、透析外液を交換しないでタンパク質合成を行っ
た。いずれの反応系にも、１ｍｌの反応容量当たり２０
μｇのＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素をコードする
ｍＲＮＡと、１ｍｌの反応容量当たり２００μｇのクレ
アチンキナーゼとを追加添加した。合成タンパク質量は
実施例１に記載した方法によって測定した。

【００５８】図４に示すように、透析外液交換なし（△
−△）では２４時間までほぼ直線的に合成が進行するも
のの、３０時間程度で反応速度が極端に低下する。しか
し、２４時間毎（矢印）に透析外液を交換することによ
り（○−○）、タンパク質合成が少なくとも６０時間ま
で持続した。すなわち、上記で示した可能性（タンパク
質合成に必須な原料の枯渇と副生成物の蓄積によるタン
パク質合成反応の停止）がここで実験的に確認され、そ
の解決方法も完成した。

【００５９】

【実施例３】自動連続無細胞タンパク質合成装置を用い
たｍＲＮＡ及びクレアチンキナーゼの自動追加及び透析
外液の自動交換による、反応維持時間の延長と合成の効
率化モデルとしてジヒドロ葉酸還元酵素をコードするｍＲＮ
Ａを用い、反応液組成、温度等の条件は実施例１と同様
とし、自動連続無細胞タンパク質合成装置を用いてタン
パク質合成を６０時間行った。反応開始１２時間毎に、
別々に４度摂氏に保存しておいた１ｍｌ反応容量当たり
２０μｇのＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素をコード
するｍＲＮＡ及び１ｍｌ反応容量当たり２００μｇのク
レアチンキナーゼを、それぞれ５μｌずつ追加添加して
反応させた。透析外液は、４度摂氏に維持した貯蔵容器
から、透析容器に連続的に供給（０．３ｍｌ／時間）
し、同流速で透析容器から排出させた。開始反応溶液量
（０．５ｍｌ）に対して１μｌ相当量の反応溶液をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に、タンパク質
をクマシーブルー染色した（図５（Ａ））。比較対照と
して、ＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素をコードする
ｍＲＮＡを追加添加せずクレアチンキナーゼのみを追加
添加し、上記同様の方法でタンパク合成を行った（図５
（Ｂ））。また、反応０時間の試料１μｌにジヒドロ葉
酸還元酵素標品１μｇを添加して同様に泳動・染色した
（図５（Ａ）右レーン）。合成タンパク質量は実施例１
に記載した方法で測定した（図５（Ｃ））。

【００６０】図５に示すように、ＣＡＰ付きのジヒドロ
葉酸還元酵素をコードするｍＲＮＡを追加添加せずクレ
アチンキナーゼのみを追加添加した（△−△）場合、反
応が１５時間程度で停止した。図示していないが、クレ
アチンキナーゼを追加せずＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還
元酵素をコードするｍＲＮＡのみを追加添加した場合に
も同様に反応の停止が観察された。一方、１２時間毎の
ＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素をコードするｍＲＮ
Ａ及びクレアチンキナーゼの自動追加と２４時間目の透
析外液の自動交換（○−○）とによって、無細胞タンパ
ク質合成が自動的に効率よく進行した。すなわち、本装
置が有効に機能していることが確認できた。

【００６１】

【発明の効果】既に特許出願中の無細胞タンパク質合成
反応方法と本願に示した合成方法の検討によって得た原
理を基に、透析式の自動連続タンパク質合成装置が発明
され、タンパク質の合成が簡便化された。

【図面の簡単な説明】

【図１】カートリッジ装置の斜視図である。

【図２】カートリッジ装置の中央断面図である。

【図３】ｍＲＮＡ及びクレアチンキナ−ゼの追加添加に
よるタンパク質の合成効果の維持を示した図である。○
−○はＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸還元酵素をコードする
ｍＲＮＡとクレアチンキナ−ゼを追加添加、△−△はｍ
ＲＮＡのみを追加添加、▽−▽はクレアチンキナ−ゼの
みを追加添加、□−□は追加添加せず、矢印は追加添加
時を示す。

【図４】透析外液の交換によるタンパク質の合成効果の
維持を示した図であり、○−○は透析外液の交換をした
もの、△−△は交換しなかったもの、矢印は交換時を示
す。

【図５】自動化装置によるタンパク質の合成効果の維持
を示した図である。○−○はＣＡＰ付きのジヒドロ葉酸
還元酵素をコードするｍＲＮＡとクレアチンキナ−ゼを
追加添加、△−△はｍＲＮＡを追加添加しなかったもの
を示し、白矢印は合成産物であるジヒドロ葉酸還元酵素
を、また★印は追加したクレアチンキナーゼの染色バン
ドを示す。

【符号の説明】

１含浸槽２蓋部３透析外液４透析外液の液面５基質及び／又はエネルギー源等供給用の導入口６基質及び／又はエネルギー源等供給用の含浸槽
内出口７流路８透析外液排出用の含浸槽内導入口９透析外液排出用の外部排出口９ａ透析外液排出用の外部排出口１０流路１１ｍＲＮＡ及び／又はエネルギー再生系酵素供給
用の導入口１２透析膜機能を有する媒体１３導入口１１の導入部１４膜留具１５膜端部１６マグネティックスターラー１７導入口５の導入部１８含浸槽内出口６の導入部１９含浸槽内導入口８の導入部２０外部排出口９の導入部２０ａ外部排出口９ａの導入部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B029 AA02 BB16 BB20 CC01 DA03 DF05 DG06 4B064 AG01 BH09 BH10 CA21 CB27 CC03 CC09 CC10 CC22 CD02 CD06 CD07 CD12 CD13 CD15 CD16 CD22 CE14 DA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】自己のタンパク質合成反応の阻害物質が実
質的に排除された細胞抽出物からなる無細胞タンパク質
合成手段において、少なくとも合成反応の鋳型となるｍ
ＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質、エネルギー源か
ら選ばれた要素について追加・保存・交換・排出から選
択される処置を導入することを特徴とする連続無細胞タ
ンパク質合成手段。
【請求項２】合成反応の鋳型となるｍＲＮＡを、原料と
して添加したｍＲＮＡの鋳型活性が低下傾向を示す前後
に追加添加することを特徴とする請求項１に記載の連続
無細胞タンパク質合成手段。
【請求項３】エネルギー再生系酵素を、原料として添加
したエネルギー再生系酵素活性が低下傾向を示す前後に
追加添加することを特徴とする請求項１に記載の連続無
細胞タンパク質合成手段。
【請求項４】エネルギー再生系酵素がクレアチンキナ−
ゼである、請求項３に記載の連続無細胞タンパク質合成
手段。
【請求項５】ｍＲＮＡの追加添加量が、原料ｍＲＮＡ量
の１０分の１から同量である請求項２に記載の連続無細
胞タンパク質合成手段。
【請求項６】エネルギー再生系酵素の追加添加量が、原
料エネルギー再生系酵素量の１０分の１から同量である
請求項３又は４に記載の連続無細胞タンパク質合成手
段。
【請求項７】ｍＲＮＡの追加添加とエネルギー再生系酵
素の追加添加が併用される請求項１〜６のいずれかに記
載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項８】ｍＲＮＡの追加添加及び／又はエネルギー
再生系酵素の追加添加が、継続的に行われる請求項１〜
７のいずれかに記載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項９】基質、エネルギー源が、枯渇することを防
ぐ工程及び／又は副生成物を排出する工程を導入した請
求項１〜７のいずれかに記載の連続無細胞タンパク質合
成手段。
【請求項１０】前記請求項９に記載の工程が、透析外液
の交換である請求項９に記載の連続無細胞タンパク質合
成手段。
【請求項１１】追加・保存・交換・排出から選択される
処置が自動制御された請求項１〜１０のいずれかに記載
の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項１２】手段が、合成方法である請求項１〜１１
のいずれかに記載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項１３】手段が、自動制御システムである請求項
１１に記載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項１４】手段が、装置である請求項１〜１１のい
ずれかに記載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項１５】手段が、試薬キットである請求項１〜１
１のいずれかに記載の連続無細胞タンパク質合成手段。
【請求項１６】含浸槽とこれに密封可能に装着される蓋
部とを含む構成からなる連続無細胞タンパク質合成装置
であって、該装置に基質及び／又はエネルギー源の導入
手段である入口と透析外液の含浸槽内の液室につながる
出口をもつ流路、透析外液中の代謝産物等の排出手段で
ある含浸槽内の液室に存する入口と外部につながる出口
をもつ流路、ｍＲＮＡ及び／又はエネルギー再生系酵素
の導入手段である入口と透析外液の含浸槽内の液室に存
する透析膜の機能を有する媒体を担持する装置。