KR100911516B1 - 하이스루풋 합성 방법 및 그 방법을 자동으로 실시하기 위한 합성 장치 - Google Patents

Abstract

단백질이나 RNA 등의 생체 고분자의 하이스루풋 시험관 내 합성 반응법의 시스템 기술을 개발한다. 상세하게는, 주형 물질을 원료로 하는 합성계로서, 이하의 수단, 그 제어 수단, 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성 방법 및 그 방법을 사용한 자동 합성기; 1) 주형 물질, 기질, 및 반응 용액을 접촉시켜 합성 반응계로 이끈다. 2) 합성 속도의 저하 전후, 또는 합성 반응의 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응계를 합성 반응계 외로 두고 용액을 희석 처리한다. 3) 희석 처리에 이어 농축 처리를 행한다. 4) 반응계를 합성 반응계로 되돌린다. 또는, 1) 주형 물질, 기질, 및 반응 용액을 접촉시켜 합성 반응으로 이끈다. 2) 합성 속도의 저하 전후, 또는 합성 반응의 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응계를 합성 반응계 외로 두고 용액을 농축 처리한다. 3) 농축 처리에 이어 희석 처리를 행한다. 4) 희석된 반응계를 합성 반응계로 되돌린다.

하이스루풋, 합성방법, 합성장치, 무세포계, 시험관 내 합성반응

Description

하이스루풋 합성 방법 및 그 방법을 자동으로 실시하기 위한 합성 장치{High throughput synthesis system and synthesizer for automatically performing the system}

본 출원은 참조에 따라 여기에 원용되는 바의 일본 특허출원번호 2003-122930, 2003-281500으로부터의 우선권을 청구한다.

본 발명은 주형 물질로부터의 무세포계 합성 방법(시스템)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 주형 물질을 원료로 하여 물질을 합성할 때, 합성 반응의 최대 효율화를 위한 방법에 관한 것이다. 또, 그 방법을 자동으로 실시하기 위한 합성 장치에 관한 것이다.

단백질이나 RNA 등의 생체 고분자를 생체 외에서 합성하는 수단으로서, 이들 반응에 필요한 기질, 이온류, 완충액, 세포 추출액, 및 합성 효소를 시험관 내에 조제하여 반응을 행하는, 이른바 배치 방식이 오래전부터 이용되어 왔다. 하지만, 이 배치 반응법은, 그 반응 원리에 기인하는 것으로서, 반응의 진행에 수반되는 기질 농도의 저하와, 합성 저해 작용을 갖는 부생성물의 농도 상승 등으로 인해, 합성 반응이 단시간 내에 정지하고, 그 결과, 목적의 생성 산물량이 낮다는 큰 한계가 있었다. 구소련의 A. Spirin 등은 한외여과막, 투석막, 또는 수지에 번역 주형 을 고정화한 컬럼크로마토그래피법 등을 이용함으로써, 아미노산이나 ATP, GTP 등의 에너지원 및 기질의 연속적인 공급과 동시에 연속적인 목적 생성물 및 부생성물의 반응계로부터의 제거를 가능하게 하는 연속식 무세포 단백질 합성법을 발표하였다(비특허문헌1). 하지만, 이들 반투막이나 한외여과 컬럼을 사용하는 연속법은, 복잡한 장치의 조립이 필요하고, 또한 처리가 번잡하여 충분한 경험도 필요하였다. 그리고, 이 방식은 동시에 반응 시스템의 자동화에 있어서도 큰 난점이 되었다.

Endo 등은 이러한 문제를 해결하는 방법으로서, 반투막을 사용하지 않고 기질의 공급과 부산물의 제거를 연속적으로 행할 수 있는, 접촉 계면 확산법을 발명하였다(특허문헌1). 이 방법에 의해, 특별한 반응 장치를 사용하지 않고 대량의 단백질을 합성하는 것이 가능하게 되었다. 하지만, 이 방법은, 분자의 확산 원리에 근거하기 때문에, 필요량의 단백질을 합성하기 위해 장시간을 요한다는 결점이 있어, 그 해결이 요구되어 왔다.

또한, 시험관 내에서의 RNA 합성법, 특히, 무세포 단백질 합성 반응에 필수인 번역 주형인 mRNA의 하이스루풋(High throughput) 합성법에 있어서도 단백질의 무세포 합성법에 보여지는 문제점이 과제로서 남아 있었다. Endo 등은 RNA의 합성법의 연구로서, 투석막을 이용하는 연속 합성법을 개발하여, 이 방식이 배치법의 성능을 대폭 상회하는 매우 합성 수득량이 높은 RNA 합성법임을 찾아내었다(특허문헌2). 하지만, 이 반투막 등을 사용하는 RNA 연속 합성법은, 복잡한 장치의 조립이 필요하고, 또 처리가 번잡하여 충분한 작업 경험도 필요하였다. 그리고, 이 방식은 반응 시스템의 자동화에 있어서도 큰 난점이 되었다.

포스트게놈 시대인 오늘날의 단백질이나 RNA 등의 생체 고분자의 하이스루풋 합성법에 요구되는 요건으로서 이하가 고려된다. 1) 단시간 내에 대량 합성이 가능할 것, 2) 단시간 내에 다종류의 분자 합성이 가능할 것, 3) 단순 원리에 근거하여, 반응 장치의 자동화에 대한 요소 기술이 될 수 있을 것 등이다. 특히, 1) 및 2)의 요건은, 단지 합성의 저가격화의 관점에서 뿐만 아니라, 비교적 불안정한 물성을 갖는 단백질의 활성을 보유한 상태에서 조제하기 위해 매우 중요하다.

(특허문헌1) WO02/24939

(특허문헌2) WO01/27260

(비특허문헌1) Spirin, A. et al. (1993) Meth. in Enzymol., 217, 123-142

본 발명의 과제는, 반투막 등의 복잡한 장치를 이용하는 연속식 합성법의 원리와는 완전히 다른, 단백질이나 RNA 등의 생체 고분자의 하이스루풋 시험관 내 합성 반응법의 시스템 기술 및 그 시스템을 이용한 자동 합성 장치를 제공하는 것이다. 이에 따라, 유전자 산물인 RNA나 단백질 등의 구조ㆍ기능의 해석을 위한 망라적 조제나 대량 생산을 간편하고 효율적으로 행하는 것이 가능해진다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해, 주형 물질을 원료로 하는 합성계에 있어서, 그 높은 반응 속도의 장시간 유지를 목적으로 하여 다양한 검토를 수행한 결과, 이하의 수단, 그 제어 수단, 또는 그 조합을 포함하는 무세포계 방법 및 그 방법을 이용한 자동 합성 장치의 완성에 의해 과제의 해결을 달성하였다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

1. 주형 물질을 원료로 하는 합성계로서, 이하의 수단, 그 제어 수단, 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성 방법;

1) 주형 물질, 기질, 및 반응 용액을 접촉시켜 합성 반응으로 이끈다.

2) 합성 속도의 대략 저하 전후, 또는 합성 반응의 대략 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응 용액을 희석 처리한다.

3) 희석 처리에 이어 농축 처리를 행한다.

4) 농축된 반응계에 의해 합성 반응을 행한다.

또는

1) 주형 물질, 기질, 및 반응 용액을 접촉시켜 합성 반응으로 이끈다.

2) 합성 속도의 대략 저하 전후, 또는 합성 반응의 대략 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응 용액을 농축 처리한다.

3) 농축 처리에 이어 희석 처리를 행한다.

4) 희석된 반응계에 의해 합성 반응을 행한다.

2. 농축 처리에서, 부산물을 반응계 외로 제거하는 전 항 1의 방법.

3. 희석 처리에서, 기질, 에너지원 및/또는 주형 물질의 반응계 내로의 보충이 행해지는 전 항 1 또는 2의 방법.

4. 1) ~ 4)의 수단을 복수회 반복하는 것을 특징으로 하는 전 항 1의 방법.

5. 주형 물질이 전사 주형인 전 항 1 ~ 4 중 어느 하나에 기재된 방법.

6. 주형 물질이 번역 주형인 전 항 1 ~ 4 중 어느 하나에 기재된 방법.

7. 반응 용액이 세포 추출물을 포함하는 전 항 6의 방법.

8. 전 항 5의 방법에서 얻어지는 전사 산물 산생계와 전 항 6 또는 7의 방법에서 얻어지는 번역 산물 산생계를 조합하는 무세포계 합성 방법.

9. 전 항 1 ~ 8 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하는 주형 물질로부터의 무세포계 합성 방법에 사용하는 시약 중 적어도 하나를 포함하는 합성 키트.

10. 전 항 1 ~ 8 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하는 주형 물질로부터의 무세포계 합성 방법.

11. 전 항 1 ~ 8 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하는 주형 물질로부터의 무세포계 합성 장치.

12. 전 항 1 ~ 8 중 어느 하나에 기재된 방법을 자동으로 실시하기 위한 장치로서, 단백질 합성 반응 속도가 높은 합성 반응 초기상을 이용한 합성계를 복수회 실시하기 위해 이하의 제어 수단을 적어도 구비하는 무세포계 합성 장치;

(1) 합성을 개시하는 수단;

(2) 반응액을 농축하는 수단;

(3) 반응액을 희석하는 수단;

(4) 합성 반응의 재활성화 수단;

(5) 상기 (2) ~ (4)의 수단을 반복하는 수단;

또는

(1) 합성을 개시하는 수단;

(2) 반응액을 희석하는 수단;

(3) 반응액을 농축하는 수단;

(4) 합성 반응의 재활성화 수단;

(5) 상기 (2) ~ (4)의 수단을 반복하는 수단;

13. 반응액을 농축하는 수단이, 한외여과막을 사용하는 것으로서, 반응액을 한외여과막을 통해 반응계 외로 제거할 때, 반응액 중의 한외여과막을 통과 불가능한 물질이 반응계 내에 농축되는 것인 전 항 12에 기재된 합성 장치.

14. 반응액을 농축하는 수단에 있어서, 반응액의 반응계 외로의 제거에, 원심분리기 및/또는 흡입 펌프가 사용되는 전 항 13에 기재된 합성 장치.

15. 반응액을 희석하는 수단이, 반응액에 희석 용액 또는 기질 용액을 첨가하는 것인 전 항 12에 기재된 합성 장치.

16. 무세포 단백질 합성 공정에 있어서, 전사 주형으로부터 번역 주형으로 코딩되는 단백질을 생성하기 까지의 공정을 자동으로 실시하기 위해, 이하의 제어 수단 중 하나를 적어도 구비하는 전 항 11 ~ 15에 기재된 합성 장치;

(1) 반응 용기 내의 온도를 가변 제어하는 수단;

(2) 반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단;

(3) 반응 용기를 반송하는 수단;

(4) 침전 및 농축 여과 수단

17. 전 항 1 ~ 8 중 어느 하나에 기재된 방법을 실시하기 위한 프로그램으로서, 단백질 합성 반응 속도가 높은 합성 반응 초기상을 이용한 합성계를 복수회 실시하기 위해, 이하의 정보 처리 수단을 포함하는 프로그램.

(1) 반응 용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 감소 경향이 되는 도중 전의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간을 설정하는 정보 처리 수단,

(2) (1)의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간에 이르면, 반응 용기에 희석 용액을 첨가하고, 반응액을 실질적으로 합성 반응 가능한 농도 범위 외로 설정하는 정보 처리 수단,

(3) (2) 이후에, 반응 용기 중의 반응액을 농축하여, 희석 용액의 첨가에 의해 증량된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 정보 처리 수단,

(4) (3) 이후에, 합성 반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 정보 처리 수단,

(5) (1) ~ (4)를 복수회 반복하기 위한 정보 처리 수단,

또는

(1) 반응 용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 감소 경향이 되는 도중 전의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간을 설정하는 정보 처리 수단,

(2) (1)의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간에 이르면, 반응 용기 중의 반응액을 농축하여, 반응액을 실질적으로 합성 반응 가능한 농도 범위 외로 설정하는 정보 처리 수단,

(3) (2) 이후에, 반응 용기에 희석 용액을 첨가하여, 농축에 의해 감소된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 정보 처리 수단,

(4) (3) 이후에, 합성 반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 정보 처리 수단,

(5) (1) ~ (4)를 복수회 반복하기 위한 정보 처리 수단.

18. 전 항 17에 기재된 프로그램이 삽입된 무세포계 합성 장치로서, 그 프로그램의 정보 처리가 그 장치와 협동하여 행해짐으로써, 합성 개시, 반응액의 희석ㆍ농축, 합성 반응의 재활성화 수단이 실행되며, 단백질 합성 반응 속도가 높은 합성 반응 초기상을 이용한 합성계를 복수회 반복하여 실행할 수 있는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성 장치.

19. 전 항 11 ~ 16, 18에 기재된 합성 장치에 의해 합성된 단백질.

도 1: 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법과 배치법에 의한 종래의 무세포 단백질 방법의 실험 결과의 차이를 나타낸 그래프이다.

도 2: 소맥배아 추출액의 농도를 바꾼 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3A: 소맥배아 추출액의 농도를 80OD, GFP mRNA의 농도를 640μg/ml로 하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 간격을 변화시킨 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3B: 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 간격의 차이에 따른 합성된 GFP의 양적 차이를 나타낸 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과이다.

도 4: 여과막을 갖는 농축기와 송액 펌프를 조합하여 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법에 있어서의 부생성물의 제거를 행할 수 있도록 한 구성의 일예를 모식적으로 나타낸 도이다.

도 5: 도 4에 나타낸 여과막과 송액 펌프를 부생성물의 제거에 사용하는 구성을 사용하여, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법으로 단백질 합성을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6: A는 60OD의 소맥배아 추출액, 450μg/ml의 dihydrofolate reductase(DHFR)의 mRNA를 번역 주형으로서 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 번역 반응액을 사용하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 1시간 간격으로 2회 반복한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 경우의 실험 결과를 나타낸 도이다.

B는 본 발명의 방법으로 N말단에 스트렙토아비딘을 융합한 GFP 융합 단백질을 합성하고, GFP 융합 단백질을 계외로 단리하는 실험 결과를 나타낸 전기영동도이다.

도 7: 본 발명의 RNA 합성 방법과 배치법에 의한 종래의 시험관내(in vitro)에서 RNA를 합성하는 방법의 실험 결과의 차이를 나타낸 도이다.

도 8: 에탄올 침전에 의해 순화된 mRNA, 순화되지 않은 mRNA를 각각 번역 주형으로서 사용하여, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9: 실험예 7의 전사 반응 후의 전사 반응액을 그대로 사용하여 조제한 번 역 반응액으로 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 10: 자동 합성 장치의 개략도이다.

도 11: 장치의 실시예의 결과를 나타낸 SDS-PAGE의 도이다.

(부호의 설명)

1: 여과 농축기

2: 송액 펌프

3: 반응조

4: (RNA) 기질 용액을 수용한 용기

5: 송액 절환 밸브

6: 용기

T1: 튜브Tl

T2: 튜브T2

T3: 튜브T3

T4: 튜브T4

T5: 튜브T5

①: 주형용 플레이트

②: 시약조 1(전사 반응용 용액)

③: 시약조 2(번역 반응용 용액)

④: 시약조 3(희석 용액)

⑤: 300μl 팁

⑥: 20μl 팁

⑦: 로봇 암

⑧: 분주기 1

⑨: 분주기 2

⑩: 전사ㆍ여액 받이용 플레이트

⑪: 팁 폐기구

⑫: 항온조 1

⑬: MTP(multi titer plate) 스테이지

⑭: 번역용 플레이트

⑮: 승강대

(16): 원심기

(17): 폐액구

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명은 주형 물질을 원료로 하는 일반적인 배치식 또는 확산 연속 배치식의, 반응 속도가 높은 합성 반응 초기상의 특성을 최대한으로 이용하는 것을 특징으로 하는 합성법이다. 또, 그 특성을 최대로 이용한 합성법을 자동 가능화하는 것을 특징으로 하는 합성 장치이다.

그 수단은 합성 속도의 대략 저하 전후, 또는 합성 반응의 대략 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응 용액의 희석 처리 또는 농축 처리를 행한다. 이 희석 처리 또는 농축 처리에서, 주형 물질을 원료로 하는 합성에 필요한 기질, 에너지원, 이온류, 완충액 및 주형 물질 등의 성분이 보충 또는 농축된다.

이 희석 또는 농축된 반응 용액은, 이어, 희석된 경우에는 농축 처리, 농축 처리된 경우에는 희석 처리를 한다. 이 처리에서, 반응 용액은 원래의 반응 최적 농도로 되돌려진다. 그 농축 처리에서, 반응 용액 중 성분이 제거 또는 분리되고, 반응 산물 및/또는 반응 부산물은 회수 및/또는 제거가 이루어진다. 그 농축 또는 희석에 의해 합성 반응의 각 요소는 다시 최적 농도로 조제된다. 그리고, 이 희석 및 농축 처리는, 불연속적으로 반복하여 행함으로써, 대량의 단백질을 합성 가능하게 한다.

본 발명은, 주형 물질에 의한 합성 반응을, 희석 및 농축을 불연속적으로 반복하여 행하는 합성법을 원리로 하는 것이다.

또, 본 발명의 자동 합성 장치는, 불연속적으로 반복하여 행하는 합성법을 자동화하는 것을 원리로 하는 것이다.

본 발명에 있어서, 주형 물질을 원료로 하는 합성계 중 하나는, mRNA를 주형으로 하는 단백질의 번역 합성계, 특히 세포 내에 구비되는 단백질 번역 장치인 리보솜 등을 세포로부터 꺼내어 이용하는 단백질 합성용 세포 추출액을 사용하는 무세포 단백질 합성계이다. 그 밖의 하나는, RNA 폴리메라아제를 효소로서 사용하는 전사 주형에 의한 시험관 내 전사 반응에 의한 RNA 합성계를 의미한다.

(무세포 단백질 합성계)

무세포 단백질 합성계 중에서도, 소맥배아 추출물을 이용한 것은, 대장균 추 출물을 사용한 무세포 단백질 합성계에 비해, 특히 핵산 분해 효소 활성이 낮고, 또한 번역 활성이 안정하고 높은 특성을 가지고 있기 때문에(Madin K. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 559-564), 플라스미드를 주형으로 한 전사ㆍ번역계로 고효율의 단백질 합성이 가능하다(PCT/JP99/04088). 이하, 본 발명에 있어서는, 소맥배아 무세포 단백질 합성계 및 그 합성계에서 기능할 수 있는 전사 주형의 합성법을 예로서 설명하지만, 본 발명의 기본 원리는 다른 미생물이나 동물 세포 유래의 세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 합성계 및 그에 사용하는 전사 주형의 합성계에도 응용할 수 있다.

(세포 추출물)

세포 추출물의 시판품으로서는, 대장균 유래의 E.coli S30 extract system(Promega), RTS 500 Rapid translation System(Roche), 토끼망 형상 적혈구 유래의 Rabbit Reticulocyte Lysate System(Promega), 소맥배아 유래의 Proteios(^TM)(T0Y0B0) 등이 있다. 이 중 특히 식물 종자 유래의 배아 추출물을 사용하는 것이 바람직하고, 밀, 보리, 벼, 옥수수, 시금치의 종자 등을 예시할 수 있으며, 소맥배아 추출액을 사용하는 계가 최적이다.

(번역 산물 산출계)

여기서, 번역 산물 산출계란, 세포 내에 구비되는 단백질 번역 장치인 리보솜 등을 포함하는 성분을 생물체로부터 추출하고, 이 추출액에 번역 주형, 기질이 되는 핵산, 아미노산, 에너지원, 각종 이온, 완충액, 및 그 밖의 유효 인자를 가하 여 시험관 내에서 행하는 방법이다.

(무세포 단백질 합성계)

여기서, 무세포 단백질 합성계란, 세포 내에 구비되는 단백질 번역 장치인 리보솜 등을 포함하는 성분을 생물체로부터 추출하고, 이 추출액에 전사 또는 번역 주형, 기질이 되는 핵산, 아미노산, 에너지원, 각종 이온, 완충액, 및 그 밖의 유효 인자를 가하여 시험관 내에서 행하는 방법이다.

(소맥배아 추출액)

본 발명의 세포 추출물 함유액으로서는, 이 중 소맥배아 추출액을 사용한 것이 바람직하다.

소맥배아 추출액의 조제법으로서는, 소맥배아의 단리 방법으로서, 예를 들면, Johnston, F. B. et al., Nature, 179, 160-161(1957)에 기재된 방법 등을 사용할 수 있으며, 또 단리된 배아로부터의 세포 추출물 함유액의 추출 방법으로서는, 예를 들면, Erickson, A. H. et al., (1996) Meth. In Enzymo1., 96, 38-50 등에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 그 밖에, 특원2002-23139, 특원2002-231340의 방법을 예시할 수 있다.

본 발명에서 바람직하게 이용되는 배아 추출물은, 원료인 밀 자신이 함유하는 또는 보유하는 단백질 합성 기능을 억제하는 물질(트리틴, 티오닌, 리보뉴클레아제 등의, mRNA, tRNA, 번역 단백질 인자나 리보솜 등에 작용하여 그 기능을 억제하는 물질)이 거의 완전히 제거되어 있다. 즉, 이들 저해 물질이 국재하는 배유가 거의 완전히 제거되어 순화되어 있다. 배유의 제거 정도는, 소맥배아 추출물 중에 내잡(來雜)하는 트리틴의 활성, 즉 리보솜을 탈아데닌화하는 활성을 모니터링함으로써 평가할 수 있다. 리보솜이 실질적으로 아데닌화되지 않으면, 배아 추출물 중에 내잡하는 배유 유래 성분이 없다고, 즉 배유가 거의 완전히 제거되어 순화되어 있다고 판단할 수 있다. 리보솜이 실질적으로 탈아데닌화되지 않는 정도란, 리보솜의 탈아데닌화율이 7% 미만, 바람직하게는 1% 이하로 되어 있는 것을 말한다.

상기 배아 추출물은, 세포 추출물 함유액 유래 및 필요에 따라 별도 첨가되는 단백질을 함유한다. 그 함유량은, 특별히 한정되지 않지만, 동결 건조 상태에서의 보존 안정성, 사용의 편리 등의 점에서, 동결 건조 전의 조성물에 있어서, 해당 조성물 전체의 바람직하게는 1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 2.5 ~ 5 중량%이며, 또, 동결 건조 후의 동결 건조 조성물에 있어서, 해당 동결 건조 조성물 전체의 바람직하게는 10 ~ 90 중량%, 보다 바람직하게는 25 ~ 70 중량%이다. 또한, 여기서 말하는 단백질 함유량은, 흡광도(260, 280, 320nm)를 측정함으로써 산출된다.

(미생물의 제거)

세포 추출물 함유액에는, 미생물, 특히 사상균(곰팡이) 등의 포자가 혼입되어 있는 경우가 있으므로, 이들 미생물을 제거해 두는 것이 바람직하다. 특히, 장기(1일 이상)의 무세포 단백질 합성 반응 중에 미생물의 번식이 보이는 경우가 있으므로, 이를 저지하는 것은 중요하다. 미생물의 제거 수단은, 특별히 한정되지 않지만, 여과 멸균 필터를 사용하는 것이 바람직하다. 필터의 포어(pore) 사이즈로서는, 혼입할 가능성이 있는 미생물을 제거 가능한 사이즈이면 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 0.1 ~ 1 마이크로미터, 바람직하게는 0.2 ~ 0.5 마이크로미터가 적 당하다.

그리고, 세포 추출물 함유액의 조제 공정 중 어느 한 단계에 있어서 저분자 합성 저해 물질의 제거 공정, 및/또는 환원제 농도의 저감 공정을 가함으로써 특정의 효과를 갖는 무세포 단백질 합성을 행하기 위한 세포 추출물 함유액으로 할 수 있다.

(세포 추출물 함유액으로부터 저분자 합성 저해 물질의 제거 방법)

세포 추출물 함유액은, 단백질 합성 저해 활성을 갖는 저분자의 합성 저해 물질(이하, 이를 「저분자 합성 저해 물질」이라고 칭하기도 한다)을 포함하고 있으며, 이들을 제거함으로써, 단백질 합성 활성이 높은 세포 추출물 함유액을 취득할 수 있다. 구체적으로는, 세포 추출물 함유액의 구성 성분으로부터, 저분자 합성 저해 물질을 분자량의 차이에 따라 분획 제거한다. 저분자 합성 저해 물질은, 세포 추출물 함유액 중에 포함되는 단백질 합성에 필요한 인자 중 가장 작은 것 이하의 분자량을 갖는 분자로서 분획할 수 있다. 구체적으로는, 분자량 50,000 ~ 14,000 이하, 바람직하게는 14,000 이하의 것으로서 분획, 제거 할 수 있다.

저분자 합성 저해 물질의 세포 추출물 함유액으로부터의 제거 방법으로서는, 그 자체 공지의 통상적으로 사용되는 방법이 사용되지만, 구체적으로는, 투석막을 통한 투석에 의한 방법, 겔여과법, 또는 한외여과법 등을 들 수 있다. 이 중, 투석에 의한 방법이 투석내액에 대한 물질 공급의 용이 등의 점에서 바람직하다.

투석에 의한 저분자 합성 저해 물질의 제거 조작에 사용하는 투석막으로서는, 50,000 ~ 12,000의 제거 분자량을 갖는 것을 들 수 있다, 구체적으로는 제거 분자량 12,000 ~ 14,000의 재생 셀룰로오스막(Viskase Sales, Chicago제)이나, 제거 분자량 50,000의 스펙트라/포어6(SPECTRUM LABOTRATORIES INC., CA, USA제) 등이 바람직하게 사용된다. 이와 같은 투석막 중에 적당한 양의 세포 추출물 함유액 등을 넣어 상법에 의해 투석을 행한다. 투석을 행하는 시간은, 30분 ~ 24시간 정도가 바람직하다.

(세포 추출물 함유액의 안정화)

저분자 합성 저해 물질의 제거를 행할 때, 세포 추출물 함유액에 불용성 성분이 생성되는 경우에는, 이 생성을 저해(이하, 이를 「세포 추출물 함유액의 안정화」라고 칭하기도 한다)함으로써, 최종적으로 얻어지는 세포 추출물 함유액 또는 번역 반응용 용액의 단백질 합성 활성을 높일 수 있다. 세포 추출물 함유액 또는 번역 반응용 용액의 안정화의 구체적인 방법으로서는, 상술한 저분자 합성 저해 물질의 제거를 행할 때, 세포 추출물 함유액 또는 번역 반응용 용액을, 적어도 고에너지 인산 화합물, 예를 들면 ATP 또는 GTP 등(이하, 이를 「안정화 성분」이라고 칭하기도 한다)을 포함하는 용액으로서 행하는 방법을 들 수 있다. 고에너지 인산 화합물로서는, ATP가 바람직하게 사용된다. 또, 바람직하게는, ATP와 GTP, 더욱 바람직하게는 ATP, GTP, 및 20종류의 아미노산을 포함하는 용액 중에서 행한다.

이들 성분은, 미리 안정화 성분을 첨가하고 인큐베이션한 후, 이를 저분자 저해 물질의 제거 공정에 제공해도 되고, 저분자 합성 저해 물질의 제거에 투석법을 사용하는 경우에는, 투석외액에도 안정화 성분을 첨가하고 투석을 행하여 저분자 합성 저해 물질의 제거를 행할 수도 있다. 투석외액에도 안정화 성분을 첨가해 두면, 투석 중에 안정화 성분이 분해되어도 항상 새로운 안정화 성분이 공급되므로 보다 바람직하다. 이는, 겔여과법이나 한외여과법을 사용하는 경우에도 적용할 수 있고, 각각의 담체를 안정화 성분을 포함하는 여과용 완충액에 의해 평형화한 후에, 안정화 성분을 포함하는 세포 추출물 함유액 또는 번역 반응용 용액을 제공하고, 또 상기 완충액을 첨가하면서 여과를 행함으로써 동일한 효과를 얻을 수 있다.

안정화 성분의 첨가량, 및 안정화 처리 시간으로서는, 세포 추출물 함유액의 종류나 조제 방법에 따라 적절히 선택할 수 있다. 이들 선택 방법으로서는, 시험적으로 양 및 종류를 할당한 안정화 성분을 세포 추출물 함유액에 첨가하고, 적당한 시간 이후에 저분자 저해 물질의 제거 공정을 행하고, 취득된 처리 후 세포 추출물 함유액을 원심분리 등의 방법으로 가용화 성분과 불용화 성분으로 분리하고, 그 중 불용성 성분이 적은 것을 선택하는 방법을 들 수 있다. 또한, 취득된 처리 후 세포 추출물 함유액을 사용하여 무세포 단백질 합성을 행하여, 단백질 합성 활성이 높은 것을 선택하는 방법도 바람직하다. 또, 상술한 선택 방법에 있어서, 세포 추출물 함유액과 투석법을 사용하는 경우, 적당한 안정화 성분을 투석외액에도 첨가하고, 이들을 사용하여 투석을 적당 시간 행한 후, 얻어진 세포 추출물 함유액 중의 불용성 성분량이나, 얻어진 세포 추출물 함유액의 단백질 합성 활성 등에 따라 선택하는 방법도 들 수 있다.

이와 같이 하여 선택된 세포 추출물 함유액의 안정화 조건의 예로서, 구체적으로는, 투석법에 의해 저분자 합성 저해 물질의 제거 공정을 행하는 경우에 있어서는, 그 소맥배아 추출물 함유액, 및 투석외액 중에, ATP로서는 100μM ~ 0.5mM, GTP는 25μM ~ 1mM, 20종류의 아미노산으로서는 각각 25μM ~ 5mM를 첨가하고 30분 ~ 1시간 이상의 투석을 행하는 방법 등을 들 수 있다. 투석을 행하는 경우의 온도는, 세포 추출물 함유액의 단백질 합성 활성을 잃지 않고 또한 투석이 가능한 온도이면 된다. 구체적으로는, 최저 온도로서는, 용액이 동결하지 않는 온도로, 통상적으로 -10℃, 바람직하게는 -5℃, 최고 온도로서는, 투석에 사용되는 용액에 악영향을 주지 않는 온도의 한계인 40℃, 바람직하게는 38℃이다.

또, 저분자 합성 저해 물질의 제거를 세포 추출물 함유액으로서 조제한 후에 행하면, 상기 안정화 성분을 세포 추출물 함유액에 더 첨가할 필요는 없다.

(mRNA의 조제)

주형 물질로서의 mRNA는, 목적 단백질을 코딩하는 것이면 그 조제법을 제한받지 않으며, 자체 공지의 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 물론, 본 발명의 수단에 의해 주형 물질로서의 DNA로부터 조제된 것, 나아가서는, 이를 일련의 계 중에서 연속적으로 사용하는 것이 특히 바람직하다.

(번역 반응용 용액의 조제)

mRNA로부터 단백질의 합성은, 리보솜을 포함하는 단백질 합성용 세포 추출액에, 기질이 되는 아미노산(20종의 필수 아미노산 또는 목적에 따른 아날로그 또는 변이체 아미노산을 사용한다), 에너지원(ATP 및/또는 GTP), 필요에 따라 각종 이온(칼슘 이온, 마그네슘 이온, 암모늄 이온 등), 완충액(HEPES-KOH, Tris-아세트산 등), ATP 재생계(포스포에놀피루베이트와 피루베이트키나아제의 조합, 크레아틴인산과 크레아틴키나아제의 조합 등), 핵산 분해 효소 저해제(리보뉴클레아제 인히비 터, 뉴클레아제 인히비터 등), tRNA, 환원제(디티오트레이톨(dithiothreitol) 등), 폴리에틸렌글리콜, 3',5'-cAMP, 엽산, 항균제(아지드화 나트륨, 암피실린 등) 등의 번역 반응에 바람직한 성분을 함유하는 용액(번역 반응 용액)을 무세포 단백질 합성 수단에 적합한 농도로 첨가하고, 이에 번역 주형의 mRNA를 첨가하여, 번역 반응 용액을 조제한다. 이 번역 반응용 용액을 번역 반응에 적합한 온도로 조제하고, 번역 반응을 행하여, 목적으로 하는 단백질을 합성한다.

(전사 반응)

전사 주형은, 본 발명자가 이미 보고한 범용성 있는 주형 분자의 구축법(WO01/27260, 02/18586)에 준하여 조제하면 되고, 예를 들면 플라스미드 벡터 pEU에 원하는 구조 유전자를 도입하고, SP6 RNA 폴리메라아제 처리로 전사를 행하는 방법 등을 바람직하게 예시할 수 있지만, 물론 mRNA의 조제법은 이것으로 한정되지 않는다. 전사 주형을 전사 주형 중의 프로모터에 적합한 RNA 폴리메라아제나 RNA 합성용 기질(4종류의 리보뉴클레오티드 3인산염) 등의 전사 반응에 필요한 성분을 포함하는 용액(전사 반응 용액이라고도 한다)과 혼합하고, 이를 약 20℃ ~ 약 60℃, 바람직하게는 약 30℃ ~ 약 42℃에서, 약 30분 ~ 약 16시간, 보다 바람직하게는 약 2 ~ 5시간 인큐베이션하여 전사 반응을 행한다.

(합성 반응)

본 발명의 무세포계 합성 방법에 있어서는, 이하의 수단, 수단의 제어, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법이 수행된다.

필수 수단 1은, 주형 물질, 기질, 및 반응 용액을 접촉시켜 합성 반응계로 이끄는 것이다. 상기 기재된 주형 물질, 기질, 및 반응 용액(전사 반응 용액 또는 번역 반응용 용액)을 최적 농도 및 최적 온도로 조제하여, 최적의 합성 반응을 행한다. 합성 반응은, 통상적으로, 약 10분 ~ 2시간, 보다 바람직하게는 20분 ~ 1시간 행한다. 이 시간은, 각 계에 따라 변경 가능하며, 실험적 반복에 의해 최적 시간은 조제 가능하다. 본 발명의 불연속 반복 합성법에 있어서는, 특히 이 원쿨의 처리 시간은 비교적 단시간인 것이 바람직하다.

(희석 또는 농축)

필수 수단 2는, 상기 반응 시간으로서, 합성 속도의 대략 저하 전후, 또는 합성 반응의 대략 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응계에 대하여 희석 또는 농축하는 것이다. 합성 속도의 대략 저하 전후란, 경시적으로 mRNA 또는 단백질의 시간당 합성량이 최대량으로부터 감소 경향이 보이는 타이밍을 의미하며, 일반적으로는 점이 아니라 선으로서 이해된다. 또, 합성 반응의 대략 정지 전후란, 합성량을 실질적으로 검출할 수 없을 정도로 떨어진 레벨을 말하는데, 이 경우에도 일반적으로는 점이 아니라 선으로서 이해된다. 이들 도중이란, 합성 속도가 저하를 시작하여 합성 반응이 정지하기까지의 사이를 말한다. 또한, 보다 바람직한 합성 효율을 얻기 위해서는, 합성 속도의 대략 저하 전후에 반응계에 대하여 희석 또는 농축 처리를 행하는 것이다. 이 시간으로서는, 최적으로는 10분 ~ 1시간이다.

반응계에 대한 희석 또는 농축은 이하와 같이 행해진다.

희석은, 반응계에 약 1 ~ 20배, 바람직하게는 약 2 ~ 10배 용량의 수용액을 첨가하여 행한다. 수용액에는, 주형 물질, 기질, 반응 용액을 원하는 바에 따라 함 유시킨다. 특히 바람직하게는, 주형 물질, 기질, 에너지원 등을 포함하는 용액이 사용된다. 각 성분의 첨가 농도는, 다음 처리인 농축 후에 합성 최적 농도로 조제되도록 선택된다. 이 희석에 의해, 반응계는 현저하게 그 합성 능력이 저하된 상태가 된다. 이 상태를 본 발명은 불연속이라고 부른다.

농축은, 반응액을 반응계 외로 제거할 때, 반응액 중의 통과 불가능한 물질(예를 들면, 합성 단백질, 리보솜 등)이 반응계 내에 농축될 수 있는, 자체 공지의 모든 농축 수단을 이용 가능하다. 바람직하게는, 한외여과막을 사용한 여과 처리, 원심분리기에 의한 처리, 겔여과 처리, 흡입 펌프, 액상 또는 기상으로 압력차를 발생시키는 방법 등을 예시할 수 있다. 이 처리에 있어서는, 막의 통과 구경을 조절함으로써, 원심분리 조작 또는 분자체에 의해, 반응 산물, 반응 부산물을 분리ㆍ제거한다. 막의 분자량 컷 사이즈, 원심 속도, 겔여과 조건은, 자체 공지의 처리 목적 산물의 물성에 따라 최적 조제 가능하다. 본 발명에서는, 바람직하게는 10,000 ~ 100,000Da의 분자량 컷의 막이 바람직하게 이용된다.

이 농축 처리에서, 반응 용액은, 원래 용량의 1/5 ~ 2/3 용량까지 농축되며, 그 결과, 각 합성 인자의 합성 최적 농도가 크게 벗어나게 된다. 이 농축에 의해, 반응계는 현저히 그 합성 능력이 저하된 상태가 된다. 이 상태를 본 발명은 불연속이라고 부른다.

(합성 반응의 재활성화)

필수 수단 3은, 합성 반응의 재활성화이다. 전 단계에서 희석 처리된 것은 농축되고, 농축 처리된 것은 희석 처리된다.

전자의 경우, 희석 처리에 이어 농축 처리를 행한다. 여기서 농축이란, 희석에 의해 증량된 반응계의 액량을 원래의 액량으로 되돌리는 것을 의미한다. 농축 수단은, 특별히 한정되는 것이 아니며, 자체 공지의 모든 농축 수단을 이용 가능하다. 바람직하게는, 한외여과막을 사용한 여과 처리, 원심분리기에 의한 처리, 겔여과 처리, 액상 또는 기상에 압력차를 발생시키는 방법 등을 예시할 수 있다. 이 처리에 있어서는, 막의 통과 구경을 조절함으로써, 원심분리 조작 또는 분자체에 의해, 반응 산물, 반응 부산물을 분리ㆍ제거한다. 막의 분자량 컷 사이즈, 원심 속도, 겔여과 조건은, 자체 공지의 처리 목적 산물의 물성에 따라 최적 조제 가능하다. 본 발명에서는, 바람직하게는 10,000 ~ 100,000Da의 분자량 컷의 막이 바람직하게 이용된다.

후자의 경우, 농축 처리에 이어 희석 처리를 행한다. 여기서 희석이란, 농축에 의해 감량된 반응계의 액량을 원래의 액량으로 되돌리는 것을 의미한다. 희석 용액에는, 주형 물질, 기질, 반응 용액을 원하는 바에 따라 함유시킨다. 특히 바람직하게는, 주형 물질, 기질, 에너지원 등을 포함하는 용액이 사용된다. 각 성분의 첨가 농도는, 희석 후에 합성 최적 농도로 조제되도록 선택된다.

이렇게 하여, 반응계의 최적 농도로 부활한 반응계는, 다시 온도를 반응 최적 온도로 조제되어, 반응계가 재활성화된다. 최적 온도는 15 ~ 25℃이다.

또한, 반응 산물 및/또는 반응 부산물의 분리ㆍ회수ㆍ제거 등을 위해서는, 처리 대상물과의 친화성에 근거하는 처리도 바람직하게 실시 가능하다. 친화성에 근거한다는 것은, 친화성 물질을 고정화해 두고, 이것과 목적 물질을 접촉시켜 결 합시키고, 그 후 목적 물질을 용리ㆍ회수하는 방법을 예시할 수 있다. 친화성 물질이란, 예를 들어 회수 물질이 단백질이면, 단백질에 대한 항체, 수용체에 대한 리간드, 전사 인자에 대한 핵산 등을 예시할 수 있다. 또한, 목적 산물을 적당한 태그ㆍ마커로 수식하고(예를 들면, 스트렙토아비딘, 히스티딘 태그, GST, 말토제 결합 단백질 등), 이 수식 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질(예를 들면, 비오틴, 2가 금속 이온, 글루타티온, 말토제 등)을 사용하여 정제하는 것도 가능하다.

본 발명에서는, 희석 및 농축의 처리를 불연속적으로 복수회 반복하는 것이 가능하고, 이 반복에 의해, 무세포 합성계의 재생을 복수회 달성한다. 이 재생에 의해, 단백질의 대량 합성이 달성되는 것이다.

본 발명에서는, 희석 및 농축의 처리를 일련의 공정으로서 제어 수단과 조합하여 수행 가능하다. 이 제어를 위해서는, 구동원(모터, 공압ㆍ유압 기기, 그 밖의 동작 제어 가능한 액츄에이터 등) 및 컴퓨터 제어에 의한 제어 회로, 시퀀스 제어 회로 등에 의해, 동작의 온ㆍ오프, 동작의 정도, 동작 스피드, 동작 간격이 조절된다. 또, 신호 전송용 드라이버, 동작 확인용 센서, 동작 제어용 스위치, 타이머 등은 적절히 원하는 바에 따라 장비 가능하다.

본 발명은 상기 설명과 같이, 희석과 농축을 불연속적으로 복수회 반복함으로써, 무세포 합성계의 재생을 달성하는 것인데, 보다 구체적으로 그 효과를 설명하면 이하와 같다.

(희석 농축 배치식 무세포 단백질 합성법)

본 합성법에서는, 합성 반응 용기는, 종래에 사용되어 온 한외여과막이나 투 석막을 장착한 농축을 가능하게 하는 용기를 배치 반응 용기로 하여 합성 반응을 개시하는 것이 가능하다. 무세포 단백질 합성 수단을 사용하여 최적 조건하 단백질의 합성 반응 후, 예를 들면 합성 반응 정지 전후에, 반응계를 재활성화하기 위해, 기질이나 에너지원이 되는 아미노산, ATP, GTP의 타 완충액이나 이온류 등 단백질 합성에 필요한 성분(Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-556에 기재한 투석외액을 말하는 것으로, 이하 기질 용액이라고 약칭한다) 및 주형 물질의 mRNA를 포함하는 용액을, 반응액의 1 내지 20배 용량으로 한 번에 첨가하고 희석한다(희석 처리). 그 후, 반응 용기를 예를 들면 원심기에 걸어 원심함으로써, 여과막을 통해 용기 내의 증가한 용액을 배출시켜 원래의 반응액 용량으로 되돌린다(농축 처리). 이 농축 처리는, 원심력에 의하지 않고 액상 또는 기상에 압력차를 발생시킴으로써도 가능하다. 이 희석 및 농축 처리에 의해, 신선한 기질 용액을 반응계에 공급하는 동시에, 합성 반응으로 생긴 번역 반응을 저해하는 부생성 물질을 배제할 수 있다. 이와 같이 예를 들면 합성 반응의 정지 전후에 행하는 기질 등을 포함하는 용액에 의한 반응액의 희석과 농축을 불연속적으로 반복함으로써, 반응계의 재활성화가 달성되고, 장시간에 걸쳐 단백질의 합성이 가능해진다. 이 방법은, Spirin 등이 개발한 반투막을 사용하여 연속적으로 기질, 에너지원의 보급과 대사 산물의 폐기를 행하는, 이른바 연속법과는 그 원리를 달리 하며, 그 합성 효과는, 수십 내지 수천 배에 이르는(본 발명의 방법에서는, 반투막을 사용한 방법으로 약 30시간 들여 얻어지는 생산량을 약 2 ~ 3시간에 얻을 수 있다) 것으로, 질에 있어서 큰 차이를 갖는다. 또한, 본 원리를 이용하는 단백질 합성 수단에 있어서, 사용하는 여과막의 분획 분자량 사이즈를 선택함으로써, 부생성물의 배제와 동시에 합성 단백질을 선택적으로 반응계로부터 분획 단리하는 것이 가능해진다. 즉, 본 원리를 이용함으로써, 단백질의 합성과 합성 산물의 정제가 동시에 가능해진다. 또한, 동일한 효과는, 농축을 행한 후에 희석을 행하는 순서를 바꾼 경우에도 달성 가능하다.

(희석 농축 배치 시험관 내 RNA 합성법: 전사 산물 산출계)

파지 RNA 합성 효소를 사용하는 일반적인 RNA 합성 반응액 조성, 반응 방법 및 합성 RNA의 분석 방법은, WO01/27260 및 WO02/18586에 기재한 방법에 준하였다. 본 발명의 합성법에서는 종래의 한외여과막이나 투석막을 장착한 농축을 가능하게 하는 용기를 배치 반응 용기로 하여 합성 반응을 개시하는 것이 가능하다. 사용하는 한외여과막의 분획 분자량은 RNA가 통과하지 않는 사이즈를 선택한다. 합성 반응 정지 전후에, 기질이 되는 4종류의 리보뉴클레오티드 3인산염, 이온류나 완충액 등의 RNA 합성에 필요한 성분을 포함하는 용액(WO01/27260 및 WO02/18586에 기재한 방법에 준하여 조제한 투석외액을 말하는 것으로, 이하 RNA 기질 용액이라고 약칭한다)을, 반응액의 1 내지 20배 용량을 첨가하여 희석한다. 반응 용기를 원심기에 걸어 원심함으로써, 여과막을 통해 용기 내의 증가한 용액을 배출시켜, 원래의 반응액 용량으로 농축한다. 이 과정의 처리는 원심력에 의하지 않고 액상 또는 기상에 압력차를 발생시킴으로써도 가능하다. 이들 처리에 의해, 신선한 기질 용액을 반응계에 공급하는 동시에, 배치 RNA 합성 반응으로 생긴 모노뉴클레오티드와 피로린산을 계로부터 배제함으로써, 화학 평형의 원리에 의해 사실상 정지하고 있던 RNA 합성 반응을, 평형을 어긋나게 함으로써 재개시킨다. 이 반응 정지 전후에 행하는 기질에 의한 반응액의 희석과 여과 농축을 반복함으로써, 장시간에 걸친 RNA 합성이 가능해진다. 이 방법은 이전에 Endo 등이 발명한 투석법에 의한 RNA 연속 합성법(WO00/68412)과는 그 원리를 달리한다. 본 원리를 이용하는 단백질 합성 수단에 있어서, 합성 후의 반응액을 물(또는 원하는 용액)에 의한 희석과 여과막 등을 통한 농축을 반복함으로써, 뉴클레오티드류, 완충액 성분이나 이온류를 포함하지 않는 RNA를 물(또는 목적으로 하는 성분을 포함하는 용액)로서 회수할 수 있다. 즉, 이 방법에 있어서는, 주형이 되는 DNA 분자종을 선택함으로써, 고속으로, 고 수득량 및 저 가격(고가인 RNA 합성 효소의 사용량은 통상의 배치계에서 필요로 하는 양밖에 사용하지 않으므로)으로 원하는 mRNA를 용액으로서 조제하는 것이 가능해진다.

또한, 동일한 효과는, 농축을 행한 후에 희석을 행하는 순서를 바꾼 경우에도 달성 가능하다.

(자동 합성 장치)

본 발명의 자동 합성 장치는, 적어도 번역 주형에 의한 합성 반응(단백질 합성)을, 희석 및 농축을 불연속적으로 반복하여 행하는 합성법의 일련의 반응 조작을 자동으로 행하도록 하는 방법을 제공한다. 또한, 전사 산물 산출계에서 합성한 전사 주형으로부터 그 주형에 코딩되는 단백질을 생성하기까지의 반응 조작을 자동으로 행하도록 하는 방법을 제공한다. 여기서 「조작을 자동으로 행하도록 한다」는 것은, 일련의 공정 중에, 실험자가 반응계(반응 용기)에 직접적으로 수동 조작 을 가하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 각 공정을 실행시킬 때, 사용되는 본 발명의 자동 합성 장치에 설치된 소정의 조작 버튼이나 스위치 등의 조작을 실험자가 수동으로 행하는 것은, 본 발명에 있어서의 「자동」의 요건을 해치는 것은 아니다.

본 발명에 있어서는, 전사 산물 산출계에서 합성한 전사 주형으로부터 그 주형에 코딩되는 단백질을 생성하기까지의 반응 조작을 자동으로 행하도록 하는 장치는, 이하의 (1) ~ (5)의 수단을 적어도 갖는 것을 그 특징으로 하는 것이다.

이하, 각 공정에 대해 구체적인 실시 형태를 들어 상술하지만, 본 발명의 방법은, 번역 주형의 정제 공정의 특징을 갖는 한, 이들로 제한되는 것은 아니다.

(1) 전사 주형의 제작 공정

본 발명의 자동 합성 장치에 있어서, 본 공정은 반드시 자동으로 실시할 필요는 없고, 수동에 의해 얻어진 전사 주형을 이하의 자동화 공정에 사용할 수도 있는데, 본 공정을 포함하여, 전사 주형의 제작에서 그 주형에 코딩되는 단백질의 생성까지의 일련의 공정을 자동으로 행하도록 하는 것이 보다 바람직하다.

본 명세서에서 「전사 주형」이란, 시험관내 전사 반응의 주형 분자로서 사용할 수 있는 DNA를 말하며, 적당한 프로모터 배열의 하류에 목적 단백질을 코딩하는 염기 배열을 적어도 갖는다. 적당한 프로모터 배열이란, 전사 반응에 사용되는 RNA 폴리메라아제가 인식할 수 있는 프로모터 배열을 말하며, 예를 들면, SP6 프로모터, T7 프로모터 등을 들 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 DNA는 어떠한 것이어도 된다.

전사 주형은, 프로모터 배열과 목적 단백질을 코딩하는 염기 배열 간에 번역 효율을 제어하는 활성을 갖는 염기 배열을 갖는 것이 바람직하고, 예를 들면, 담배 모자이크 바이러스 유래의 Ω배열 등의 RNA 바이러스 유래인 5' 비번역 영역, 및/또는 코작(kozaks) 배열 등을 사용할 수 있다. 또한, 전사 주형은, 목적 단백질을 코딩하는 염기 배열의 하류에 전사 터미네이션 영역 등을 포함하는 3' 비번역 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 3' 비번역 영역으로서는, 종지 코돈보다 하류인 약 1.0 ~ 약 3.0 킬로베이스 정도가 바람직하게 사용된다. 이들 3' 비번역 영역은 반드시 목적 단백질을 코딩하는 유전자 본래의 그것일 필요는 없다.

전사 주형의 제작은, 자체 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, 원하는 전사 주형과 동일한 염기 배열을 포함하는 DNA가 삽입된 플라스미드를 갖는 대장균 등의 숙주 세포를 배양하고, 주지의 정제 방법을 사용하여 그 플라스미드를 대량 조제한 후, 적당한 제한 효소를 사용하여 그 플라스미드로부터 전사 주형 DNA를 잘라내고, 페놀 처리 및 클로로포름 처리에 의해 제한 효소를 제거하고, 또 에탄올이나 이소프로판올에 의한 알코올 침전(필요에 따라, 적당량의 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨 등의 염을 첨가한다) 등에 의해 전사 주형을 정제하는 방법을 들 수 있다. 얻어진 DNA의 침전은, 초순수나 후술의 전사 반응용 용액에 용해하여 이하의 전사 반응에 제공할 수 있다.

이러한 일련의 조작을 자동 또는 반자동(공정 일부에 실험자가 반응계에 직접적으로 수동 조작을 가하는 형태를 말하는 것으로 한다)으로 실시하기 위한 장치는 알려져 있으며, 이를 본 발명의 자동 합성 장치에 적용함으로써, 전사 주형의 제작부터 목적 단백질의 생성까지를 자동으로 행하도록 하는 것이 가능하다. 그러나, 하이스루풋 해석을 위한 본 발명에 의한 하이스루풋 합성 방법의 제공이라는 본 발명의 목적과, 장치의 단순화, 소요 시간의 단축화 등을 고려하면, 이하의 폴리메라아제ㆍ체인 반응(PCR)법에 의해 전사 주형을 제작하는 방법을 이용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 합성 장치의 바람직한 실시 형태에 있어서는, 목적 단백질을 코딩하는 DNA가 클론화된 숙주(예를 들면, 그 DNA를 포함하는 플라스미드를 갖는 대장균 등)를 직접 PCR에 걸어 전사 주형을 증폭하는 방법이 사용된다. 예를 들면, 적당한 프로모터 배열, 번역 효율을 제어하는 활성을 갖는 5' 비번역 배열 및 목적 단백질을 코딩하는 DNA의 5' 단(끝) 영역의 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를, DNA 자동 합성기를 사용하여 공지의 방법에 의해 합성하여, 이를 센스 프라이머, 또 3' 비번역 배열의 3' 단 영역의 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 안티 센스 프라이머로 하고, 주형으로서 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 그 하류에 그 3' 비번역 배열을 포함하는 플라스미드를 갖는 대장균 등의 숙주를 직접 PCR 반응액에 가하여, 통상의 조건으로 증폭 반응을 행하도록 함으로써 원하는 전사 주형을 얻을 수 있다. 또한, 비특이적 증폭에 의해 생기는 단쇄 DNA(결과적으로 목적 산물의 수득량 저하 및 저분자 번역 산물 노이즈를 발생시킨다)의 생성을 막기 위해, 국제 공개 제02/18586호 팜플렛에 기재된 프로모터 분단형 프라이머를 사용할 수도 있다.

증폭 반응은, 시판의 PCR용 서멀 사이클러를 사용하여 시판의 PCR용 96공 플 레이트 중에서 행할 수도 있고, 동일 온도 가변 제어 장치를 본 발명의 합성 장치와 연동시키거나, 본 발명의 합성 장치의 전사ㆍ번역 반응을 행하도록 하기 위한 각 수단을 그대로 PCR에 적용시킬 수도 있다.

상기와 같이 하여 얻어지는 전사 주형 DNA는 클로로포름 추출이나 알코올 침전에 의해 정제한 후에 전사 반응에 제공해도 되지만, 장치의 단순화, 소요 시간의 단축화를 위해서는 PCR 반응액을 그대로 전사 주형 용액으로서 사용하는 것이 바람직하다. 전사 주형의 제작에 있어서, 상기한 숙주로부터의 직접 PCR을 사용함으로써, 일단 플라스미드를 대량 조제하고, 이를 제한 효소 처리하여 전사 주형을 얻는 방법과 비교하여, 공정을 현격히 생략할 수 있어, 적은 수의 공정으로 단시간의 전사 주형의 대량 합성이 가능해진다. 즉, 목적 유전자를 삽입한 플라스미드를 갖는 대장균을 배양하여 플라스미드를 대량 조제하는 공정을 필요로 하지 않으므로, 배양이나 플라스미드 정제를 위한 초원심에 요하는 시간을 단축할 수 있다. 또, 플라스미드로부터 전사 주형을 잘라내기 위한 제한 효소 처리, 및 제한 효소 등을 제거하기 위한 페놀 처리, 클로로포름 처리, 전사 주형의 정제를 위한 알코올 침전, 전사 주형인 DNA의 침전을 용해하는 공정을 생략할 수 있으므로, 페놀/클로로포름의 잔존에 의한 전사 반응의 저해나, 다공정의 정제 조작에 의한 전사 주형의 로스가 없다. 또, 반응에 요하는 스텝 수를 줄일 수 있으므로 사용하는 팁 수 등도 줄게 된다는 이점도 갖는다.

(2) 전사 반응 공정

본 발명의 합성 장치는, 자체 공지의 방법을 사용하여 조제된 목적 단백질을 코딩하는 전사 주형 DNA로부터, 시험관내 전사 반응에 의해 번역 주형인 mRNA를 생성시키는 공정을 포함한다. 당해 공정은, 반응계(예를 들면, 96공 타이터 플레이트 등의 시판의 반응 용기)에 제공된 전사 주형을 포함하는 용액, 바람직하게는 상기 PCR 반응액과, 전사 주형 중의 프로모터에 적합한 RNA 폴리메라아제(예를 들면, SP6 RNA 폴리메라아제 등)나 RNA 합성용 기질(4종류의 리보뉴클레오티드 3인산) 등의 전사 반응에 필요한 성분을 포함하는 용액(「전사 반응용 용액」이라고도 한다)을 혼합한 후, 약 20℃ ~ 약 60℃, 바람직하게는 약 30℃ ~ 약 42℃에서 약 30분 ~ 약 16시간, 바람직하게는 약 2시간 ~ 약 5시간 그 혼합액을 인큐베이션함으로써 행해진다. 전사 주형 용액, 전사 반응용 용액의 반응 용기로의 분주, 혼합 등의 조작은 후술의 자동 합성 장치의 분주 수단(예를 들면, 피펫터(반응 용기로서 시판의 96공 타이터 플레이트를 사용하는 경우에는, 웰 간격에 적합한 8련(連) 또는 12련의 분주팁을 갖는 것이 바람직하게 사용된다) 등)을 사용하여 행할 수 있다. 또, 전사 반응을 위한 인큐베이션은, 후술의 합성 장치의 온도 제어 수단에 의해 일정 온도로 제어하면서 행할 수 있다.

(3) 번역 주형의 정제 공정

상기와 같이 하여 생성하는 전사 산물(즉 「번역 주형」)은, 원하는 바에 따라 전사 주형 중에 삽입된 번역 효율을 제어하는 활성을 갖는 5' 비번역 배열 및/또는 3' 비번역 배열을 포함하는, 목적 단백질을 코딩하는 염기 배열을 갖는 RNA 분자이다. 전사 반응 후의 반응액 중에는, 번역 주형 RNA 외에 미반응의 리보뉴클레오티드 3인산이나 반응 부생물인 피로린산, 그 밖에 전사 반응용 용액에 함유된 염 등이 혼입되어 있는데, 이들 물질은 나중의 번역 반응을 저해하는 것으로 알려져 있으므로, 반응 용액을 교환함으로써 이들 물질을 제거한다. 이러한 용액 교환수단으로서는, 예를 들면 필터가 있는 용기에 반응 용액을 넣고, 원심에 의해 번역 반응을 저해하는 물질을 포함하는 용액을 제거하고, 새롭게 적당한 완충액 등의 용액을 가하고, 이를 반복하는 방법을 예시할 수 있지만, 이것으로 한정되지는 않는다. 새롭게 가하는 용액을 번역 반응용 용액으로 하면, 주형을 정제하지 않고 다음 번역 반응으로 진행할 수 있다. 또, 이들 물질을 제거하는 수단으로서 번역 주형을 선택적으로 침전시켜 미반응 기질 등을 분리 제거하는 방법을 들 수 있다. 이러한 침전 수단으로서는, 예를 들면 염석 등을 들 수 있고, 바람직하게는 알코올 침전법을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 알코올 침전법을 사용하는 경우, 사용하는 알코올은 RNA를 선택적으로 침전시킬 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 에탄올, 이소프로판올 등이 바람직하고, 에탄올이 보다 바람직하다. 에탄올의 경우, 전사 반응액의 약 2배량 ~ 약 3배량, 이소프로판올의 경우, 전사 반응액의 약 0.6배량 ~ 약 1배량을 사용하는 것이 바람직하다. 또, 적당한 염을 공존시킴으로써 침전의 수득량을 증대시킬 수 있다. 이와 같은 염으로서는, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 리튬 등을 들 수 있다. 예를 들면, 아세트산 암모늄을 사용하는 경우, 최종 농도가 약 0.5M~ 약 3M이 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 또, 알코올 침전은 실온에서 행하면 된다.

(4) 번역 반응 공정

상기와 같이 하여 얻어지는 번역 주형을 포함하는 번역 반응용 용액을 번역 반응에 적합한 온도에서 적당한 시간 인큐베이션함으로써 번역 반응을 행할 수 있다. 번역 반응은, 통상, 약 10분 ~ 2시간, 보다 바람직하게는 20분 ~ 1시간 행한다. 이 시간은, 각 계에 따라 변경 가능하고, 실험적 반복에 의해 최적 시간은 조제 가능하다. 본 발명의 불연속 반복 합성법에 있어서는, 특히 이 원쿨의 처리 시간은 비교적 단시간인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 상기 반응에 있어서, 합성 속도의 대략 저하 전후, 또는 합성 반응의 대략 정지 전후, 또는 이들 도중에, 반응계의 희석 또는 농축을 행한다. 합성 속도의 대략 저하 전후란, 경시적으로 단백질의 시간당 합성량이 최대량으로부터 감소 경향이 보이는 타이밍을 의미하며, 일반적으로는 점이 아니라 선으로서 이해된다. 또, 합성 반응의 대략 정지 전후란, 합성량을 실질적으로 검출할 수 없을 정도로 떨어진 레벨을 말하는데, 이 경우에도 일반적으로는 점이 아니라 선으로서 이해된다. 이들 도중이란, 합성 속도가 저하를 시작하여 합성 반응이 정지하기까지의 사이를 말한다. 또한, 보다 바람직한 합성 효율을 얻기 위해서는, 합성 속도의 대략 저하 전후에 반응계에 대하여 희석 또는 농축 처리를 행하는 것이다. 이 시간으로서는, 최적으로는 10분 ~ 1시간이다.

반응계에 대한 희석 또는 농축은 이하와 같이 행해진다.

희석은, 반응계에 약 1 ~ 20배, 바람직하게는 약 2 ~ 10배 용량의 수용액을 첨가하여 행한다. 수용액에는, 주형 물질, 기질, 반응 용액을 원하는 바에 따라 함유시킨다. 특히 바람직하게는, 주형 물질, 기질, 에너지원 등을 포함하는 용액이 사용된다. 각 성분의 첨가 농도는, 다음 처리인 농축 후에 합성 최적 농도로 조제 되도록 선택된다. 이 희석에 의해, 반응계는 현저하게 그 합성 능력이 저하된 상태가 된다. 이 상태를 본 발명은 불연속이라고 부른다.

농축은, 반응액을 반응계 외로 제거할 때, 반응액 중의 통과 불가능한 물질(예를 들면, 합성 단백질, 리보솜 등)이 반응계 내에 농축될 수 있는, 자체 공지의 모든 농축 수단을 이용 가능하다. 바람직하게는, 한외여과막을 사용한 여과 처리, 원심분리기에 의한 처리, 겔여과 처리, 흡입 펌프, 액상 또는 기상에 압력차를 발생시키는 방법 등을 예시할 수 있다. 이 처리에 있어서는, 막의 통과 구경을 조절함으로써, 원심분리 조작 또는 분자체에 의해, 반응 산물, 반응 부산물을 분리ㆍ제거한다. 막의 분자량 컷 사이즈, 원심 속도, 겔여과 조건은, 자체 공지의 처리 목적 산물의 물성에 따라 최적 조제 가능하다. 본 발명에서는, 바람직하게는 10,000 ~ 100,000Da의 분자량 컷의 막이 바람직하게 사용된다.

이 농축 처리에서, 반응 용액은, 원래 용량의 1/5 ~ 2/3 용량까지 농축되며, 그 결과, 각 합성 인자의 합성 최적 농도가 크게 벗어나게 된다. 이 농축에 의해, 반응계는 현저하게 그 합성 능력이 저하된 상태가 된다. 이 상태를 본 발명은 불연속이라고 부른다.

계속하여 합성 반응의 재활성화를 행한다. 전 단계에서 희석 처리된 것은 농축되고, 농축 처리된 것은 희석 처리된다.

전자의 경우, 희석 처리에 이어 농축 처리를 행한다. 여기서 농축이란, 희석에 의해 증량된 반응계의 액량을 원래의 액량으로 되돌리는 것을 의미한다. 농축 수단은, 특별히 한정되는 것이 아니며, 자체 공지의 모든 농축 수단을 이용 가능하 다. 바람직하게는, 한외여과막을 사용한 여과 처리, 원심분리기에 의한 처리, 겔여과 처리, 액상 또는 기상에 압력차를 발생시키는 방법 등을 예시할 수 있다. 이 처리에 있어서는, 막의 통과 구경을 조절함으로써, 원심분리 조작 또는 분자체에 의해, 반응 산물, 반응 부산물을 분리ㆍ제거한다. 막의 분자량 컷 사이즈, 원심 속도, 겔여과 조건은, 자체 공지의 처리 목적 산물의 물성에 따라 최적 조제 가능하다. 본 발명에서는, 바람직하게는 10,000 ~ 100,000Da의 분자량 컷의 막이 바람직하게 이용된다.

후자의 경우, 농축 처리에 이어 희석 처리를 행한다. 여기서 희석이란, 농축에 의해 감량된 반응계의 액량을 원래의 액량으로 되돌리는 것을 의미한다. 희석 용액에는, 주형 물질, 기질, 반응 용액을 원하는 바에 따라 함유시킨다. 특히 바람직하게는, 주형 물질, 기질, 에너지원 등을 포함하는 용액이 사용된다. 각 성분의 첨가 농도는, 희석 후에 합성 최적 농도로 조제되도록 선택된다.

이렇게 하여 반응계의 최적 농도로 부활한 반응계는, 다시 온도를 반응 최적 온도로 조제되어, 반응계가 재활성화된다. 최적 온도는 15 ~ 25℃이다.

본 발명에서는, 희석 및 농축의 처리를 불연속적으로 복수회 반복하는 것이 가능하고, 이 반복에 의해, 무세포 합성계의 재생을 복수회 달성한다. 반복 회수는 2회 내지 20회, 바람직하게는 5회 내지 10회이다. 이 재생에 의해, 단백질의 대량 합성이 달성되는 것이다.

그 밖의 공정에 있어서는, 자동화를 위해 적용할 수 있는 종래 공지의 임의의 순서나 조건 등에 따라 행하면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서는, 상기 조작을 행하기 위한 장치는, 이하의 (a) ~ (e)의 수단을 적어도 갖는 것을 그 특징으로 하는 것이다.

(a) 반응 용기 내의 온도를 가변 제어하는 수단;

(b) 반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단;

(c) 반응 용기를 반송하는 수단;

(d) 침전 및 농축 여과 수단;

및

(e) 상기 (a) ~ (d)의 수단을 상술한 본 발명의 방법에 따라 동작시키도록 제어하는 제어 수단.

이와 같은 (a) ~ (e)의 구성을 적어도 갖는 장치를 사용함으로써, 상술한 본 발명의 전사 산물 산출계에서 합성한 전사 주형으로부터 그 주형에 코딩되는 단백질을 생성하기까지의 반응 조작을 자동으로 행하는 것을 가능하게 할 수 있다. 이하, 각 구성에 대해 구체적으로 상술한다.

(a) 반응 용기 내의 온도를 가변 제어하는 수단

반응 용기 내의 온도를 가변 제어하는 수단이란, 전사 반응, 번역 반응의 인큐베이션 및 번역 반응의 정지, 번역 주형의 침전, 또는 본 발명의 자동 합성 장치를 사용하여 PCR법에 의한 전사 주형의 제작 공정을 자동으로 실시하는 경우에는 그 PCR법의 증폭 반응 등에 있어서, 반응 용기 내의 액체 온도를 적당한 온도 조건으로 조정하기 위한 수단이다. 가변 제어하는 온도 범위는, 특별히 제한은 없지만, 전사 주형의 제작을 포함하는 무세포 단백질 합성의 일련의 반응 조작에 있어서 통 상적으로 필요로 하는 온도 범위(예를 들면, 약 4℃ ~ 약 100℃, 바람직하게는 약 15℃ ~ 약 60℃) 내에서 반응 용기 내의 액체 온도를 가변 제어할 수 있는 수단이면, 이를 실현할 수 있는 수단으로서는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 종래 공지의 다카라 PCR 서멀 사이클러 MP(다카라 바이오 주식회사 제품), Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems Inc., 제품) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 피펫팅 등을 행할 장소로서 반응 용기를 올려놓기 위한 작업 스테이지와는 별도로, 장치 내에 반응 용기를 올려놓는 스테이지를 복수개 설치하고, 스테이지 상의 공간 전체의 온도를 가변 제어하여, 결과적으로 반응 용기 내의 온도를 가변 제어하도록 실현된다.

(b) 반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단

반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단이란, 반응 용기 내에서 전사 반응, 번역 반응, PCR 등의 일련의 무세포 단백질 합성 반응을 행하도록 하기 위해, 반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단이다. 여기서, 「샘플」은 전사 주형, 번역 주형, PCR용 주형 플라스미드(또는 그 플라스미드를 갖는 숙주(예를 들면, 대장균)) 등을 가리키며, 「시약」은, 전사 반응용 용액, 번역 반응용 용액, 번역 반응 용액, 희석 용액, 알코올, 염 용액, PCR 반응용 용액 등을 가리킨다. 이러한 분주 수단으로서는, 공정에 따라 샘플, 시약의 분량을 조정하여 분주할 수 있는 것이면, 종래 공지의 적절한 자동으로 분주할 수 있는 피펫 암(분주기) 등을 특별한 제한없이 사용하여 실현할 수 있다. 또, 피펫 암은, 사용이 끝난 팁을 합성기의 팁 폐기구에 폐기하는 기능 및 흡입한 여액 등을 폐액구로 토출하는 기능을 구 비할 수 있다.

또, 당해 분주 수단은, 상기 기능에 더하여 2종 이상 용액의 균일화나 침전 용해를 위한 혼합 기능(예를 들면, 피펫팅, 교반 등)을 구비하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 피펫 암에 의해, 반응 용기의 각 셀 중에 기질 용액 또는 희석 용액을 첨가함으로써, 반응액의 희석 처리가 실행 가능해진다.

(c) 반응 용기를 반송하는 수단

반응 용기를 반송하는 수단이란, 반응 용기를 각 스테이지, 원심기, 승강대, 항온조로 이동시키는 수단이다. 이러한 반응 용기를 반송하는 수단은, 반응 용기를 목적 장소로 반송 가능하다면, 특별히 제한되지 않고 종래 공지의 적절한 수단으로 실현할 수 있다. 예를 들면, 종래의 합성 장치에 사용되고 있는 로봇 암을 사용하여 실현할 수 있다.

(d) 침전 및 농축 여과 수단

침전 및 농축 여과 수단이란, 전사 반응 중에 생긴 백탁물을 침전시키는 조작 또는 반복 번역 반응시의 반응액을 농축 여과하는 수단이다. 이러한 수단은, 반응 중에 생긴 백탁물을 침전시킬 수 있고, 고액(固液) 분리 가능하게 하는 것이며, 또, 반복 번역 반응시의 반응액의 농축을 가능하게 하는 것이면, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 적절한 수단으로 실현할 수 있다. 예를 들면, 종래 공지의 원심분리기, 그 밖에, 여과나 동결 건조에 종래로부터 사용되고 있는 적절한 장치를 사용하여, 그 수단을 실현할 수 있다.

(e) 제어 수단

제어 수단에는, 상기 (a) ~ (d)의 수단이 동작하기 위해 각 수단에 사용되는 구동원(모터, 공압ㆍ유압 기기, 그 밖의 동작 제어 가능한 액츄에이터 등)의 동작의 ON/OFF, 동작의 정도 및 상태 등을 제어하는 제어 장치가 포함된다. 그 제어의 구성은, 상기 (a) ~ (d)의 수단의 동작을, 전사 산물 산출계에서 합성한 전사 주형으로부터 그 주형에 코딩되는 단백질을 생성하기까지의 반응 조작을 자동으로 행하도록 하는 목적을 달성할 수 있는 것이다.

상기 제어 장치는, 예를 들면, 제어 프로그램을 갖는 컴퓨터를 포함하는 제어 회로, 시퀀스 제어 회로 등, 상기 각 수단의 동작의 제어에 필요한 제어 기기를 조합하여 구성해도 되고, 목적에 따른 순서로 상기 각 수단이 동작하도록, 각 수단에 대해 신호나 필요에 따라 전력, 공압, 유압 등을 공급할 수 있는 제어 구성으로 한다. 또, 상기 각 수단의 구동원에 직접 구동 신호를 보내기 위해 필요한 드라이버, 상기 각 수단의 구동원의 동작 상태를 검출하기 위해 필요한 각종 센서, 스위치 등은 적절히 추가해도 된다.

또한, 본 발명의 합성 장치에 적용할 수 있는 반응 용기에는 특별히 제한은 없고, 무세포 단백질 합성 반응에 사용되어 온 종래 공지의 다양한 반응 용기를 사용하는 것이 가능하며, 예를 들면 96공 PCR용 플레이트, 96공 타이터 플레이트, 8련 튜브나 튜브(l.5mL, 15mL, 50mL 등) 등을 들 수 있는데, 예를 들어 번역 반응계로서 배치법이나 중층법을 사용하는 경우, 96공 플레이트 등의 작은 반응계에서 번역 반응을 행할 수 있고, 또, 본 발명의 합성 장치에 의하면, 전사 반응도 작은 반 응계로 행할 수 있으므로, 전사 반응ㆍ번역 주형의 정제, 번역 반응, 원하는 바에 따라 전사 반응에 더 제공하는 전사 주형 제작을 위한 PCR을 포함하는 일련의 무세포 단백질 합성법의 반응 조작을, 복수의 반응계로 복수 종의 단백질에 대해 동시에 행할 수 있어, 단시간에 다수의 단백질을 합성할 수 있다.

또한, 번역 주형에 의한 합성 반응을 희석 및 농축을 불연속적으로 반복하여 행하는 합성법을 행하기 위한 장치를 제공한다. 본 발명의 장치는, 이하의 (1) ~ (5)의 수단을 적어도 갖는 것을 그 특징으로 하는 것이다.

(1) 합성을 개시하는 수단;

(2) 반응액을 농축하는 수단;

(3) 반응액을 희석하는 수단;

(4) 합성 반응의 재활성화 수단;

(5) 상기 (2) ~ (4)의 수단을 반복하는 수단;

또는

(1) 합성을 개시하는 수단;

(2) 반응액을 희석하는 수단;

(3) 반응액을 농축하는 수단;

(4) 합성 반응의 재활성화 수단;

(5) 상기 (2) ~ (4)의 수단을 반복하는 수단;

이러한 (1) ~ (5)의 구성을 적어도 갖는 장치를 사용함으로써, 상술한 본 발명의 하이스루풋 합성 방법을 자동으로 실시하는 것을 가능하게 할 수 있다. 이하, 각 수단에 대해 구체적으로 상술한다.

(1) 합성을 개시하는 수단;

① 분주기를 번역 반응액이 든 시약조로 이동시켜, 번역 반응액을 흡입한다.

② 분주기를 번역용 플레이트(셀의 바닥이 필터로 되어 있다) 상으로 이동시켜, 전사 산물이 든 번역용 플레이트의 각 셀 중에 번역 반응액을 토출한다.

③ ②에 이어 분주기가 각 셀의 피펫팅을 행한다.

④ 로봇 암이 번역용 플레이트의 덮개를 덮고, 그 플레이트를 항온조로 반송 및 항온조에 세팅한다.

⑤ 번역 플레이트를 보온하고, 합성을 개시시킨다.

⑥ 설정된 합성 시간 종료 후에, 로봇 암이 번역용 플레이트를 MTP 스테이지로 반송한다.

(2) 반응액을 희석하는 수단;

① 분주기를 희석 용액이 든 시약조로 이동시켜, 희석 용액을 흡입한다.

② 분주기를 번역용 플레이트 상으로 이동시켜, 번역 산물이 든 번역용 플레이트의 각 셀 중에 희석 용액을 토출한다.

(3) 반응액을 농축하는 수단

① 로봇 암이 번역용 플레이트를 전사ㆍ여액 받이용 플레이트 상에 겹쳐 놓는다.

② 로봇 암이 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 승강대로 반송한다.

③ 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 올려놓은 승강대를 원심기의 높이에 맞게 강하시킨다.

④ 로봇 암이 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 원심기에 세팅한다. 이 때, 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트가 1세트인 경우에는, 대각선 상에 더미 플레이트를 셋팅한다. 또, 2세트인 경우에는, 쌍방의 플레이트를 대각선 상에 세팅한다.

⑤ 원심기에 의한 원심을 개시한다. 이 때, 번역용 플레이트의 바닥은 필터로 되어 있으므로, 여액이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트의 셀 중에 제거되고, 번역용 플레이트 중의 각 셀은 농축된다.

⑥ 로봇 암이 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 원심기로부터 승강대로 반송한다.

⑦ 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 올려놓은 승강대를 상승시킨다.

⑧ 로봇 암이 겹쳐놓은 번역 플레이트 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 MTP 스테이지로 반송하고, 번역 플레이트와 전사ㆍ여액 받이용 플레이트를 분리하여 세팅한다.

(4) 합성 반응의 재활성화 수단

전 단계에서 먼저 희석 처리된 경우에는 계속하여 농축 처리되고, 먼저 농축 처리된 경우에는 계속하여 희석 처리된다.

① 로봇 암이 농축 처리 후의 번역용 플레이트 또는 희석 후의 번역용 플레 이트를 항온조로 반송 및 항온조에 세팅한다.

② 번역 플레이트를 보온하고, 합성을 개시시킨다.

(5) 상기 (2) ~ (4)의 수단을 반복하는 수단

① 설정 시간이 종료한 후에 항온조의 온도를 저하시켜, 실질적인 합성을 정지시킨다.

② 로봇 암이 번역용 플레이트를 MTP 스테이지로 반송한다.

③ (2) ~ (4)에 기재된 수단을 복수회 반복한다.

또, 상기 기재한 합성 장치의 수단은, 하이스루풋 합성 방법을 자동으로 실시하기 위한 장치의 일예로서, 농축 처리에 따른 폐수 처리 수단, 분주기의 팁 폐기 처리 수단 등을 더 포함해도 된다.

또, 하이스루풋 합성 방법을 실시하기 위한 단백질 합성 반응 속도가 높은 합성 반응 초기상을 이용한 합성계를 복수회 실시하기 위해, 이하의 정보 처리 수단을 포함하는 프로그램도 본 발명의 대상이다.

(1) 반응 용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 감소 경향이 되는 도중 전의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간을 설정하는 정보 처리 수단,

(2) (1)의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간에 이르면, 반응 용기에 희석 용액을 첨가하고, 반응액을 실질적으로 합성 반응 가능한 농도 범위 외로 설정하는 정보 처리 수단,

(3) (2) 이후에, 반응 용기 중의 반응액을 농축하여, 희석 용액의 첨가에 의 해 증량된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 정보 처리 수단,

(4) (3) 이후에, 합성 반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 정보 처리 수단,

(5) (1) ~ (4)를 복수회 반복하기 위한 정보 처리 수단,

또는,

(1) 반응 용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 감소 경향이 되는 도중 전의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간을 설정하는 정보 처리수단,

(2) (1)의 합성 반응 초기상 범위 내의 합성 시간에 이르면, 반응 용기 중의 반응액을 농축하여, 반응액을 실질적으로 합성 반응 가능한 농도 범위 외로 설정하는 정보 처리 수단,

(3) (2) 이후에, 반응 용기에 희석 용액을 첨가하여, 농축에 의해 감소된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 정보 처리 수단,

(4) (3) 이후에, 합성 반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 정보 처리 수단,

(5) (1) ~ (4)를 복수회 반복하기 위한 정보 처리 수단.

또한, 상기 프로그램이 조합된 종래 공지의 합성용 장치에 있어서, 그 프로그램의 정보 처리가 그 합성 장치와 협동하여 행해짐으로써, 합성 개시, 반응액의 희석ㆍ농축, 합성 반응의 재활성화 수단이 실행되며, 단백질 합성 반응 속도가 높 은 합성 반응 초기상을 이용한 합성계를 복수회 반복 실행할 수 있는 것을 특징으로 하는 합성 장치도 본 발명의 대상이다.

또, 전사 반응, 번역 반응을 행할 때에는, 반응 용기를 밀폐한 가운데 행하는 것이 바람직하고, 이러한 관점에서 덮개가 있는 반응 용기를 사용하고, 장치가 이 반응 용기의 덮개의 개폐를 행하는 수단을 더 갖는 것이 바람직하다. 상기 덮개는, 반응 용기로서 예를 들어 96공 플레이트를 사용하는 경우에는, 1개 1개의 구멍을 각각 밀봉할 수 있는 고무제 덮개를 예시할 수 있다. 닫은 상태에서 덮개를 반응 용기에 밀착시킬 수 있는 것이 바람직하므로, 어느 정도의 중량(예를 들면, 500g 정도)을 갖는 덮개를 사용하거나, 클립과 같은 것으로 덮개와 반응 용기를 사이에 두고 덮개를 닫는 것을 고려할 수 있다. 또, 반응 용기의 덮개의 개폐를 행하는 수단은, 예를 들면, 종래 공지의 척킹 기구ㆍ흡입 기구와 로봇 암을 조합한 기구 등을 사용하여서 실현할 수 있다.

본 발명의 합성 장치는, 상술한 각 수단 이외에, 반응 시약을 저장하는 수단 등을 필요에 따라 갖고 있어도 된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 하이스루풋 방법 및 그 방법을 자동으로 실시하는 장치는, 동시에 복수 종의 단백질을 간편하게 자동으로 합성하는 것이 가능하다. 예를 들면, 다양한 변이체의 단백질을 코딩하는 전사 주형, 번역 주형을 복수개 갖추어, 복수의 변이체의 단백질을 동시에 복수개 합성하여, 변이체의 상세한 설계를 요하지 않고 해석 등에 제공할 수 있어 유용하다.

또, 본 발명의 하이스루풋 방법 및 그 방법을 자동으로 실시하는 장치는, 다양한 단백질의 하이스루풋 기능 해석의 용도에 바람직하게 제공할 수 있다. 예를 들면, 상동성 검색 결과, 보존된 공통 도메인(예를 들면, 키나아제 도메인 등)을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자군을 주형으로 하여, 본 발명의 장치를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 그 단백질을 동시에 합성하고, 한편으로 인산화의 표적이 될 수 있는 단백질군(예를 들면, 전사 인자 등)을 동일하게 합성하고, 양자를 다양한 조합으로 혼합하고, 예를 들면, ³²P 표식한 ATP의 편입을 지표로 하여, 어느 단백질 키나아제가 어느 단백질을 인산화하는지를 동정(同定)할 수 있다.

또는, 전사 인자에 특유의 모티프(예를 들면 Zn 핑거, 류신 지퍼 등)를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자군을 주형으로 하여, 본 발명의 장치를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 그 단백질을 동시에 합성하고, 이미 알려져 있는 시스 엘레멘트 배열과의 결합, 다른 전사 제어 인자와의 헤테로 다이머 형성능, 게다가 특정 유전자 프로모터의 전사 제어 영역과의 결합능 등을 조사함으로써, 전사 인자가 만들어내는 크로스 토크의 해명을 위한 정보를 얻을 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기의 실시예로 제한되는 것은 아니다.

(무세포 단백질 합성법)

1) DNA로부터 mRNA의 반응(전사 반응)

전사 반응 용액〔최종 농도, 80mM HEPES-KOH pH 7.8, 16mM 아세트산 마그네 슘, 10mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘, 2.5mM 4NTPs(4종류의 뉴클레오티드 3인산), 0.8U/μl RNase 저해제, 0.lμg/μl DNA〔플라스미드 GFP(Green fluorescent protein)〕, 1.6U/μl SP6 RNA 폴리메라아제〕를 조제하여, 37℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 후 4℃에서 12,000rpm 1시간 원심을 행하고, 원심 후 상청을 모아, 이것에 에탄올을 최종 농도 약 70%, 아세트산 암모늄을 최종 농도 약 0.27M이 되도록 가하고, 4℃ 10분 얼음 상에서 그대로 둔 후 3,000rpm으로 30분간 원심하였다(에탄올 침전). 이 에탄올 침전을 3회 행한 후, 적량의 투석 버퍼(최종 농도 35mM HEPES-KOH pH 7.8, 3.lmM 아세트산 마그네슘, 103mM 아세트산 칼륨, 16mM 크레아틴, 1.2mM ATP, 0.26mM GTP, 2.5mM DTT, 0.43mM 스페르미딘, 0.3mM의 각종 아미노산)에서 RNA 농도가 약 5 ~ 10mg/ml가 되도록 조제하였다.

또, 본 발명에 의한, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 의한 mRNA 합성은 실험예 7에 따라 행하였다.

2) 번역 반응용 용액의 조제

배아 추출액을, 번역 반응 용액〔최종 농도 35mM HEPES-KOH pH 7.8, 103mM 아세트산 칼륨(KOAc), 3.1mM 아세트산 마그네슘(Mg(OAc)2), 16mM 크레아틴 포스페이트, 1.2mM ATP, 0.26mM GTP, 2.5mM 디티오트레이톨(DTT), 0.43mM 스페르미딘, 0.3mM AAs(20종류의 L형 아미노산의 혼합물), 1.03mg/ml 크레아틴 키나아제〕를 사용하여, 번역 반응시의 배아 추출액의 농도(O.D. 260nm)가 40 내지 120이 되도록 조제하여 사용하였다.

3) 번역 반응

상기 배아 추출액을 포함하는 번역 반응 용액에 상기 조제한 mRNA 용액을, 배아 추출액의 번역 반응시의 농도에 따라 첨가하여 반응을 행하였다. 즉, 배아 추출액의 번역 반응시의 O.D. 260nm가 100인 경우의 첨가하는 mRNA량을 0.8mg/ml로 하고, 비례 계산으로 가하는 mRNA량을 조제하였다.

상기 조제한 반응 용액을 20℃에서 반응시켰다. 반응 개시부터 일정 시간 경과 후(10분 ~ 3시간)에 2 ~ 3배 용량의 상기 번역 반응액을 사용하여 반응 용액을 희석하고, 이어 분자량 컷 30,000Da의 한외여과막으로 농축하여, 반응 용액을 희석 전과 동량으로 되돌렸다. 이 조작을 복수회 반복하였다. 또는, 먼저 약 1/2 ~ 1/3 용량으로 농축하고, 그 후 상기 번역 반응액을 사용하여 원래의 용량으로 희석하였다.

mRNA를 배치 조작으로 번역 반응 용액에 추가 첨가하는 경우에는, 1)에서 조제한 전사 반응액(에탄올 침전 전의 것), 또는 에탄올 침전 조작을 거쳐 조제한 mRNA 용액을, 상기 소맥배아액의 농도에 따라 가하여 행하였다.

4) 단백질 합성 효과의 확인

합성 단백질량의 측정은, Madin K. 등의 보고(Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-556)에 기재한 방법에 준하여 행하였다.

5) 소맥배아 추출액의 형태

또한, 본 검토에서 사용한 소맥배아 추출액, 무세포 단백질 합성 반응액 조성, mRNA의 조제법, 배치식 무세포 단백질 합성법은, Madin K. 등의 보고(Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-556), 특허 제3255784호, 특 개평2000-236896호, WO00/684l2호, Sawasaki T. 등의 보고(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2002), 99, 14652-14657)에 기재한 방법에 준하여 조제하였다.

(장치예)

본 발명의 희석 및 농축 조작을 복수회 가능하게 하고, 또 합성 반응을 불연속적으로 행하기 위한 계의 모식도를 도 4에 나타내었다. 희석 및 농축 조작을 여과막과 송액 펌프를 갖는 구성으로 실현하는 경우, 예를 들면, 도 4에 모식적으로 나타낸 바와 같은 기구의 이용을 예시할 수 있다. 여과막을 갖는 여과 농축기(1)와 송액 펌프(2)를 조합한 기구를 이용함으로써, 반응조(3) 내에서의 번역 반응 종료 전후에 (RNA) 기질 용액으로 (전사 또는) 번역 반응액을 희석한 후에, 여과 농축기(1)에 의해 부생성물을 여과하고, 용기(6)로 배출한다. 한편, 농축된 (전사 또는) 번역 반응액을 다시 반응조(3)로 되돌려, 반응을 재개하도록 하는 것이 가능해진다.

도 4에 나타낸 계에서는, (RNA) 기질 용액을 수용한 용기(4)와 반응조(3)가 튜브(T1), 송액 절환 밸브(5) 및 튜브(T2)를 통해 연결되고, 이 송액 절환 밸브(5)에, 튜브(T3), 송액 펌프(2), 튜브(T4), 여과 농축기(1), 튜브(T5)를 통해 반응조(3)가 연결된다. 이와 같이 하여, 송액 절환 밸브(5)가, (a) 반응조(3) 내로 송액되지 않는 상태(밸브가 닫힌 상태), (b) 송액 펌프(2)의 작동에 의해, (RNA) 기질 용액을 수용한 용기(4)로부터 (RNA) 기질 용액을 퍼 올려, 직접 반응조(3) 내로 송액할 수 있는 상태, (c) 송액 펌프(2)의 작동에 의해, 반응조(3) 내의 (전사 또는) 번역 반응액을 퍼 올려, 여과 농축기(1)를 통과시킨 후에 반응조(3) 내로 되돌리도 록, (전사 또는) 번역 반응액을 순환시킬 수 있는 상태, (d) 송액 펌프(2)의 작동에 의해, 기질 용액을 수용한 용기(4)로부터 (RNA) 기질 용액을 퍼 올려, 여과 농축기(1)를 통과시켜 반응조(3) 내로 송액할 수 있는 상태, 의 각 상태를 적절히 절환할 수 있도록 한 구성으로 한다.

이러한 구성을 사용하여 이하의 순서로 조작을 행한다.

1. 반응조(3) 내에서, 배치 반응에 의한 (전사 또는) 번역 반응을 행한다. 이 동안에는, 송액 절환 밸브(5)를 닫고〔상기 (a)상태〕, 송액 펌프(3)도 정지시켜, 반응조(3) 내로의 송액을 정지상태로 한다.

2. (전사 또는) 번역 반응이 정지하는 전후에 어느 시점에서 송액 절환 밸브(5)를 절환하고〔상기 (b)상태〕, 송액 펌프(2)를 작동시켜, (RNA) 기질 용액을 반응조(3) 내로 공급하여 혼합한다.

3. 송액 절환 밸브(5)를 절환하고〔상기 (c)상태〕, 송액 펌프(2)를 작동시켜 반응조(3) 내의 (전사 또는) 번역 반응액을 퍼 올리고, 여과 농축기(1)를 통과시켜, 부생성물을 용기(6)로 배출하는 동시에, 농축된 반응액을 반응조(3) 내로 되돌리도록 순환시킨다.

4. 송액 절환 밸브(5)를 절환하고〔상기 (d)상태〕, 송액 펌프(2)를 작동시켜 용기(4) 내의 (RNA) 기질 용액을 퍼 올려, 여과 농축기(1)를 통과시켜 반응조(3) 내로 송액하고, 여과 농축기(1) 내에 일부 남은 (전사 또는) 번역 반응액을 반응조(3) 내로 씻어 낸다.

5. 송액 절환 밸브(5)를 절환하고〔상기 (b)상태〕, 송액 펌프(2)를 작동시 켜 용기(4) 내의 (RNA) 기질 용액을 퍼 올리고, 반응조(3) 내로 송액하여, 반응조(3) 내의 (전사 또는) 번역 반응액량을 원래의 용량까지 조제한 후, 송액 절환 밸브(5)를 절환하여〔상기 (a)상태〕송액을 정지한다.

6. 1로 되돌아가 상술한 조작을 반복한다.

이러한 계를 이용한 장치를 실현하는 경우, 사용하는 송액 펌프로서는, 종래 공지의 적절한 송액 펌프를 특별한 제한없이 사용할 수 있고, 예를 들면 페리스탈틱식 펌프〔예를 들면, LKB-Pump-p1(Pharmacia사 제품) 등〕 등을 예시할 수 있다. 또, 여과 농축기로서도 종래 공지의 것을 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 크로스 플로우 여과 장치, VF05C2형(분자량 3만컷, Sartorius사 제품) 등을 예시할 수 있다.

상기 희석 및 농축 수단을 여과막과 송액 펌프를 갖는 구성으로 실현한 방법에 의하면, 원심분리기를 이용하는 경우와 비교하여, 단백질의 합성 수득량이 향상되고(실험예 4 참조), 또, 대규모 용량의 무세포 단백질 합성이 가능한 장치를 구축할 수 있다. 또한, 소형 반응 용기와 여과 농축기를 조합함으로써 소용량형 장치의 구축이 가능하고, 상술한 부생성물 제거 수단으로서 여과막과 원심분리기를 갖는 구성과 달리, 반드시 장치가 대형이 되는 것은 아니다. 또, 이러한 여과막과 송액 펌프를 갖는 구성에서는, 희석ㆍ농축 과정의 정밀한 제어가 용이하고, 다양한 목적에 맞춘 일반적인 무세포 단백질 합성 기술의 자동화에 대한 매우 중요한 기간 기술이 되는 것을 기대할 수 있다.

실험예 1

도 1에 본 발명의 희석 및 농축 처리를 불연속적으로 반복하는 배치식 무세포 단백질 합성법의 일예(실시예 1)로서, 소맥배아 추출액을 사용한 실험 결과를 나타내었다. 비교예는, 배치법에 의한 종래의 무세포 단백질 합성법에 의한 결과이다. 종축은 합성 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간)을 나타낸다. 도 1에 있어서, 검정 동그라미를 연결한 선(●―●)이 본 발명의 방법, 흰 동그라미를 연결한 선(○―○)이 종래의 배치법의 결과이다. 합성 반응에는, 40A 260nm/ml(소맥배아 추출액의 파장 260nm에서의 흡광도) 농도의 소맥배아 추출액과 320μg/ml의 Green fluorescent protein(GFP)을 코딩하는 mRNA(번역 주형)를 혼합하고, 20℃에서 무세포 단백질 합성을 행하였다.

비교 실험의 합성 반응은 분획 분자량 3만의 한외여과막이 있는 농축 용기(컷 분자량 30,000kDa)를 사용하여 행하였다. 종래법의 배치 반응 방식에 있어서는, 형광 활성을 지표로 한 단백질 생성량의 시간 변화는 전형적인 하이퍼볼릭형을 나타낸다. 즉, 반응 개시 초기의 최대 속도상을 거쳐 반응 속도는 저하하고, 반응이 정지에 가까워지는 3시간 이후에는 장시간의 보온에 의해도 합성 단백질량의 증가는 보이지 않는다(○―○). 이 결과는 지금까지의 보고와 매우 일치한다(Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-556). 이 반응 정지의 원인에 대해서는 완전히 해명된 것은 아니지만, 주로 에너지원인 ATP나 GTP 농도의 저하(에너지의 고갈)와, 재생하지 못하는 부생물인 AMP와 GMP의 축적이 어떠한 기작에 의해 단백질 합성을 억제하는 것으로 판단되고 있다.

본 발명의 합성 반응은, 한외여과막을 장착한 용기 내에서 행하며, 반응 속도가 높고 반응 정지 전에 해당하는 반응 개시 2시간 후에 반응액량의 3배 용량의 단백질 합성 기질 용액(기질 및 에너지원을 포함한다)을 첨가하여 교반한다(희석 처리). 다음으로 원심기에 의해 원심하고, 희석 전의 반응 용액 용량까지 이 기질 용액으로 희석된 용액을 농축하였다(화살촉이 나타내는 시점)(농축 처리). 이 희석 및 농축의 일련의 처리를 불연속적으로 복수회 반복함에 따라, 부생성물을 포함하는 저분자 물질은 한외여과막을 통해 배제되어 저농도화되고, 한편 합성 반응으로 소비된 ATP, GTP, 아미노산은 반응 개시시의 각각의 농도 가까이까지 회복시켰다. 이 농축 처리에 의해 동시에, 소맥배아 유래의 리보솜, tRNA나 그 밖의 모든 번역 인자가 반응 개시시의 원래의 농도로 농축된다. 이와 같은 처리에 의해, 일단 저하하던 단백질 합성 반응이 재개하고, 원래의 높은 초기 속도를 갖기에 이른 후에, 그 후 다시 반응이 저하하는 것을 확인할 수 있다(●―●). 이와 같은 불연속적인 희석ㆍ농축 처리를 반복함에 따라, 초기 반응 속도가 높은 시간 영역의 특성을 이용하는 것이 가능해지고, 고능률적인 무세포 단백질 합성을 달성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 4회의 희석ㆍ농축 처리의 반복에 의해, GFP의 배치 방식에서의 1ml의 반응 용량당 0.072mg이었던 합성량을, 0.41mg까지 상승시킬 수 있었다. 또한, 합성 단백질량은, GFP의 형광 강도 측정 기술(형광 극대 파장 508nm)에 따라, 1μg/ml의 GFP는 형광 강도는 2.0으로 하여 계산하였다.

본 처리에 의해 충분한 합성 효율의 달성이 이루어졌는데, 희석 및 농축 처리의 반복에 수반하여, 계의 단백질 합성 속도가 서서히 저하하는 현상이 보여졌 다. 이 원인으로서, 배아 유래의 번역 인자(군)의 여액으로의 누출 또는 한외여과막으로의 흡착 등에 기인하는 반응계 내로부터의 손실이나, mRNA의 분해 또는 한외여과막으로의 흡착 등에 의한 농도 저하 등이 추정되었다.

실험예 2

도 2는, 소맥배아 추출액의 농도를 바꾼 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프로, 종축은 합성된 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간)을 나타낸다. 도 2에 있어서, 작은 검정 동그라미를 연결한 선(ㆍ―ㆍ)은, 소맥배아 추출액의 농도를 60A 260nm/ml, GFP mRNA 농도를 480μg/ml로 한 경우(실시예 2)의 실험 결과를 나타내고, 큰 검정 동그라미를 연결한 선(●―●)은, 소맥배아 추출액의 농도를 80A 260nm/ml, GFP mRNA 농도를 640μg/ml로 한 경우(실시예 3)의 실험 결과를 나타낸다. 또, 도 2에 있어서, 화살촉은 상기 조작을 행한 시점을 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에 있어서, 4회의 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 의해 무세포계에서 합성된 단백질은 반응액 1ml당 0.62mg, 실시예 3에 있어서, 4회의 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 의해 무세포계에서 합성된 단백질은 반응액 1ml당 1.13mg이었다. 이와 같이, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법에 의한 단백질 합성량은, 반응계의 번역 인자의 농도가 높을 수록 많고, 도 1에 나타낸 종래의 배치법의 실험 결과와 비교하면 현저하게 향상되었다.

실험예 3

통상의 배치법에 있어서의 합성 속도가 저하하는 시간은 반응 용액 중의 기질 농도의 감소 및 부생성물의 축적 농도에 의존하므로, 계의 번역 인자 농도와 반비례의 관계가 된다. 즉, 계의 번역 인자 농도(소맥배아 추출액 농도)가 높을 수록 반응 정지에 이르는 시간이 짧아진다(Madin K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 556-559). 따라서, 번역 인자를 고농도로 사용하는 경우에는, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 시간 간격을 짧게 함으로써, 높은 합성 속도를 유지시키는 것이 가능한 것으로 판단되며, 이에 따라 단백질의 단위 시간 내에서의 생산 효율의 상승을 기대할 수 있다.

도 3A는, 소맥배아 추출액의 농도를 80A 260nm/ml, GFP mRNA의 농도를 640μg/ml로 하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 간격을 변화시킨 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프이며, 도 3B는, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 간격의 차이에 따른 합성된 GFP의 양적 차이를 나타낸 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과이다.

도 3A의 그래프에 있어서, 종축은 합성된 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간), 화살촉은 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 시점을 나타낸다. 또, 도 3A에 있어서, 검정 동그라미를 연결한 선(●―●)은 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 반응 개시로부터 0.5시간 간격으로 행한 경우(실시예 4)의 실험 결과를 나타내고, 흰 동그라미를 연결한 선(○―○)은 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 반응 개시로부터 1시간 간격으로 행한 경우(실시예 5)의 실험 결과를 나타낸다. 도 3A에 있어서, 화살촉은 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 시점을 나타낸다.

도 3B는, 0.5시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 실시예 4와, 2시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 행한 경우(실시예 6)를 비교하여 나타낸다. 또한, 도 3B에서의 화살촉은, GFP의 염색 밴드를 나타낸다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은, 각 반응 시간(실시예 4에서는, 반응 개시로부터 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5시간 경과 시점, 실시예 6에서는, 반응 개시로부터 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14시간 경과 시점)에 있어서의 반응액 1μl를 폴리아크릴아미드 미변성 겔 전기영동으로 분리 후, 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)에 의해 염색하였다.

도 3A, B에 나타낸 바와 같이, 0.5시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 실시예 4는, 1시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 실시예 5, 2시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 실시예 6보다 단위시간당 수득량이 많다. 실시예 4에서는, 2.5시간의 반응에서 1ml당 1.12mg의 합성량을 얻는데, 이는 동일 농도의 반응액에서, 2시간 간격으로 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하여 10시간 반응시켜 얻어진 수득량을 상회한다. 이 결과는, 반응계의 번역 인자 농도(소맥배아 추출액 농도)가 높을 수록 단시간 내에 에너지원 등의 소비에 수반되는 농도 저하와, 동시에 부생성물의 축적 농도가 높아지고, 반응 속도의 저하와 반응 정지에 이르는 시간이 짧 아지는 것을 직접적으로 나타낸다. 따라서, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작의 시간 설정시에는, 반응계에 포함되는 소맥배아 추출액 농도에 의존한 최적의 타이밍을 선택함으로써, 최대의 합성 수득량을 달성할 수 있다.

단백질은, 그 일반적인 물성으로서 불안정성(높은 반응성)을 들 수 있다. 따라서, 높은 품질의 단백질을 얻기 위해서는 단시간에 합성 수득량을 높이는 기술을 구축하는 것이 필수 조건의 하나가 되며, 도 3에 증명한 본 발명의 원리는 매우 유효한 것이라 할 수 있다.

실험예 4

도 5는, 도 4에 나타낸 여과막과 송액 펌프를 부생성물의 제거에 사용하는 구성을 사용하여, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법으로 단백질 합성을 행한(실시예 7) 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 종축은 합성된 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간)을 나타낸다. 도 5에 있어서, 검정 동그라미를 연결한 선(●―●)이 실시예 7의 실험 결과를 나타내고, 흰 동그라미를 연결한 선(○―○)이 종래의 배치법에 의한 방법의 실험 결과를 나타낸다. 또 도 5에 있어서, 화살촉은 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 시점을 나타낸다.

실시예 7에서는, 여과 농축기로서 크로스 플로우 여과 장치(VF05C2형, Sartorius사 제품, 분자량 3만컷)를, 또 송액 펌프로서는 LKB-Pump-P1(Pharmacia사)을 사용하였다. 또, 80A 260nm/ml 농도의 소맥배아 추출액, 640μg/ml 농도의 GFP mRNA를 함유하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 번역 반응액을 사용하여, 희 석 및 농축의 불연속 반복 조작을 0.5시간 간격으로 행하였다. 반응 용기로서는, 눈금이 있는 플라스틱제 튜브(팔콘 튜브)를 사용하고, 반응 용량은 15ml로 하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 있어서의 희석은 45ml 용량의 번역 반응용 용액을 사용하여 행하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 부생성물을 제거하기 위한 수단으로서 여과막과 송액 펌프를 갖는 구성을 사용한 경우에는, 실험예 1 ~ 3에서의 한외여과막과 원심분리기를 이용한 장치와 마찬가지로, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법에 바람직하게 이용할 수 있음이 확인되었다. 실시예 7에서는, 4시간의 반응에 의해 반응 용량 1ml당 2.lmg로, 상기 원심기와 한외여과막을 이용한 장치를 사용한 경우보다 2배 정도 높은 합성 수득량으로 단백질이 합성되었다.

실험예 5

도 6A는, 60A 260nm/ml의 소맥배아 추출액, 450μg/ml의 dihydrofolate reductase(DHFR)의 mRNA를 번역 주형으로서 사용한 것 이외에는 실시예 1와 동일한 번역 반응액을 사용하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 1시간 간격으로 2회 반복한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 무세포 단백질 합성을 행한 경우(실시예 8)의 실험 결과를 나타낸 도이다. 비교 실험으로서, 종래의 배치법인(희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하지 않는) 것 이외에는 동일한 조건으로 무세포 단백질 합성을 행하였다. 실시예 8에서는, 분자량 약 20,000KDa의 DHFR의 무세포계에서의 합성시에, 컷 분자량 30,000Da(밀리포아사 제품)의 한외여과막을 장착한 반응 용기를 사용한 것이다.

도 6A에 있어서, 레인 1, 2, 3은 각각 실시예 8의 0, 1, 2회의 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 의한 반응 후의 배출 용액(여액), 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작과 동일 시점에 있어서의 종래의 배치법에서의 반응액 각 1μl를 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 걸고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색한 결과를 나타낸다(도 중의 화살촉은, 합성 산물인 DHFR를 나타낸다.). 도 6A 중의 화살촉이 나타내는 DHFR의 밴드의 염색 강도로 알 수 있는 바와 같이, 종래의 배치법에 의한 실험 결과(각 레인의 좌측 「반응액」)에서는, 반응 1시간 후에 미량의 DHFR의 합성이 확인될 뿐이었지만, 실시예 8의 실험 결과(각 레인의 우측 「여액」)에서는, 1회, 2회의 희석 및 농축의 불연속 반복 조작에 의해, 반응계로 생성된 DHFR가 여액으로 효율적으로 꺼낼 수 있었음을 확인할 수 있었다.

실험예 6

도 6B는, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법으로 N말단에 스트렙토아비딘을 융합한 GFP 융합 단백질을 합성하여(실시예 9), GFP 융합 단백질을 계 외로 단리하는 실험 결과를 나타낸 전기영동도이다.

본 실험에 있어서의 무세포 단백질 합성 자체는, GFP 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 번역 주형으로서 사용하고, 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 1시간 간격으로 4회 행한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 행하였다. GFP 융합 단백질을 계 외로 단리하는 조작은, 먼저, 1 비오틴을 고정화한 자성 비즈를 반응 용 액에 첨가하고, 생성한 융합체 산물을 비오틴과 스트렙토아비딘 간의 친화성을 이용하여 자기 비즈에 선택적으로 포집하고, 2 융합 단백질을 결합한 비즈를 자석에 의해 반응 용기 외로 선택적으로 꺼내는 순서로 행하였다. 또, 전기영동 및 염색은, 실험예 5와 동일하게 행하였다.

도 6B에 나타낸 바와 같이, 단리 조작 전의 반응액 중에 검출되는 산물이 본 조작에 의해 반응액 중으로부터 소실되고(단리 후 반응액 레인의 화살촉), 자기 비즈를 통해 효율적으로 계 외로 단리되는 것을 알 수 있다(단리 산물 레인에 나타낸 합성 산물).

실험예 7

도 7은, 본 발명의 RNA 합성 방법(실시예 10)과, 배치법에 의한 종래의 시험관내에서 RNA를 합성하는 방법의 실험 결과의 차이를 나타낸 도이다. 도 7에 있어서, 도 7 좌측은 배치법에 의한 종래 방법의 결과를, 도 7 우측은 본 발명의 RNA 합성 방법의 결과를 나타내며, 화살표는 GFP를 코딩하는 mRNA 산물을 나타낸다.

각각 해파리의 GFP 유전자를, 각각 소맥배아 무세포계 전용 플라스미드 벡터 pEU에 삽입한 것을 전사 주형으로 하여, 전사 반응 용액〔최종 농도, 80mM HEPES-KOH pH 7.8, 16mM 아세트산 마그네슘, 10mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘, 2.5mM 4NTPs(4종류의 뉴클레오티드 3인산), 0.8U/μl RNase 저해제, 0.1μg/μl DNA〔플라스미드 GFP(Green fluorescent protein)〕, 1.6U/μl SP6 RNA 폴리메라아제〕를 조제하고, 37℃에서 3시간 반응시켰다.

실시예 l0에서의 RNA 합성 반응은, 반응 개시 3시간 후에 전사 반응액에 3배량의 상기 전사 반응용 용액을 첨가하여 희석한 후, 원심분리기를 사용하여 저분자를 여과막을 통해 반응액계 외로 배제함으로써, 전사 반응액을 원래의 농도까지 농축하였다. 그 후, 3시간 간격으로 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하여, 합성 반응을 진행시켰다. 각 희석 및 농축의 불연속 반복 조작시에, 전사 반응액을 분취하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리한 전사 산물(mRNA)을 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 종래의 배치법에 의한 시험관내에서 RNA를 합성하는 방법에서는, RNA 합성 반응이 3시간 정도에서 정지하지만, 합성 속도가 높은 3시간의 반응 후에 상기 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행하는 실시예 10에서는, 종래의 방법의 2.4배의 수득량으로 mRNA를 합성할 수 있었다.

실험예 8

도 8은, 에탄올 침전에 의해 순화된 mRNA, 순화되지 않은 mRNA를 각각 번역 주형으로서 사용하여, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프로, 종축은 합성된 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간)을 나타낸다. 순화된 mRNA는, 실시예(무세포 단백질 합성법) 1) DNA로부터 mRNA의 반응(전사 반응)에 기재된 방법에 준하여 조제하였다. 순화되지 않은 mRNA는, 실시예 10에 기재된 방법으로 조제한 후 12,000rpm으로 1시간 원심 후, 상청을 회수하여 조제하였다. 도 8에 있어서, 검정 동그라미를 연결한 선(●―●)은, 실시예 10에서 합성한 mRNA를 함유하는 전사 반응액을 번역 반응액에 1:2의 비율로 가하여 혼합한 후, 혼합액과 동량의 투석 완충액[35mM HEPES-KOH pH 7.8, 103mM 아세트산 칼륨(KOAc), 3.1mM 아세트산 마그네슘(Mg(OAc)2), 16mM 크레아틴 포스페이트, 1.2mM ATP, 0.26mM GTP, 2.5mM 디티오트레이톨(DTT), 0.43mM 스페르미딘, 0.3mM AAs(20종류의 L형 아미노산의 혼합물)]을 가하여 희석한 후, 원래 혼합액의 용량이 될 때까지 농축하고, 다시 동량의 투석 완충액을 가하고, 같은 조작을 한번 더 반복하고, 농축 후 크레아틴키나아제를 최종 농도 약 1mg/ml가 되도록 가하여 단백질 합성 반응을 행한 경우(실시예 11)의 실험 결과를 나타내고, 흰 동그라미를 연결한 선(○―○)은, 실험예 7에서 합성한 mRNA를 에탄올 침전하여 순화한 것을 사용하여 조제한 번역 반응액으로 단백질 합성 반응을 행한 경우(실시예 12)의 실험 결과를 나타낸다. 실시예 11, 12에서는, 상기와 같은 mRNA를 각각 480μg/ml 농도로 사용하고, 또 60A 260nm/ml 농도의 소맥배아 추출액을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 하여 행하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 11, 12에 대하여 단백질 합성 속도를 비교하였으나, 의미 있는 차이는 인정되지 않았다. 이 결과로부터, 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법에 의하면, mRNA를 순화하지 않고 전사 후의 전사 반응액을 사용하여 조제한 번역 반응액을 사용하여 행하는, 간편한 무세포 단백질 합성 방법이 실현 가능해짐을 알 수 있었다.

실험예 9

도 9는, 실험예 7의 전사 반응 후의 전사 반응액을 사용하여 조제한 번역 반응액으로 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법을 행한 실험 결과를 나타낸 그래프로, 종축은 합성된 단백질량(mg/ml), 횡축은 반응 시간(시간)을 나타낸다. 도 9에 있어서, 상향의 화살촉은 희석 및 농축의 불연속 반복 조작을 행한 시점을 나타낸다. 하향의 화살표는, 전사 반응 후의 전사 반응액(mRNA를 포함한다)을 첨가한 시점을 나타낸다.

번역 반응액은, 80A 260nm/ml의 소맥배아 추출액, 전사 반응 후의 전사 반응액(GFP mRNA 9.6mg을 포함한다)을, 실시예 1과 동일한 번역 반응용 용액 15ml에 첨가하고(GFP mRNA의 최종 농도 640μg/ml), 이를 액량 8ml까지 농축한 후에, 상기 번역 반응용 용액에 의한 희석과 이에 이은 농축 조작을 행하여 번역 반응액을 조제하고, 번역 반응을 개시하였다. 부생성물을 제거하는 수단으로서는, 도 4에 나타낸 것과 동일하게 여과막과 송액 펌프를 갖는 구성을 사용하고, 반응 개시로부터 4시간 경과할 때마다 GFP mRNA(번역 주형) 첨가, 그리고 30분 간격으로 기질 및 에너지원을 포함하는 용액에 의한 희석ㆍ농축을, 불연속 반복 조작으로 행하였다.

실험 결과가 나타내는 바와 같이, mRNA의 추가에 따라, 거의 정지 상태에 있던 번역 반응이 재개시하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 이 희석ㆍ농축법과 mRNA의 추가를 조합함으로써, 장시간에 걸쳐 단백질 합성을 지속시키는 것이 가능해짐을 알 수 있다.

장치의 실시예

이하에, 본 발명에 의한 자동 합성 장치의 실시예를 설명한다. 그러나, 본 발명에 의한 자동 합성 장치는, 하이스루풋 합성 방법을 자동으로 실시 가능하다면 하기 실시예의 장치로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 자동 합성 장치를 실시하기 위해, 각각 이하의 것을 자동 합성 장치 내에 세팅하고, 그 합성 장치를 사용하여 GFP 단백질 합성을 행하였다.

전사 주형

GFP가 삽입된 pEU 플라스미드 벡터를 센스 프라이머와 안티 센스 프라이머를 사용하고, 30μl계에서 PCR을 행하여 얻어진 DNA를 전사 주형으로 하였다. 이 DNA는 96 웰 PCR 플레이트(주형용 플레이트:①) 내에 수용하였다.

전사 반응용 용액

최종 농도 80mM HEPES-KOH, 16mM 아세트산 마그네슘, 2mM 스페르미딘, 10mM DTT, 3mM NTPs, 1U/μl SP6 RNA 폴리메라아제, 1U/μl RNasin을 함유하는 용액 4.95ml를 작성하여 장치 내의 시약조 1(②)에 넣었다.

번역 반응용 용액

각각 최종 농도로서 30mM HEPES-KOH(pH 7.8), 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴 인산, 2mM 디티오트레이톨, 0.3mM 스페르미딘, 0.3mM 20종류 아미노산, 2.7mM 아세트산 마그네슘, 100mM 아세트산 칼륨, 0.005% 아지드화 나트륨, 40ng/μl 크레아틴키나아제, 260nm에 있어서의 광학 밀도(OD)가 80 또는 40유닛인 소맥배아 추출액을 함유하는 용액 5.5ml를 작성하여, 장치 내의 시약조(2)(③)에 넣었다. 또한, 80유닛과 40유닛의 소맥배아 추출액을 함유하는 번역 반응용 용액을 사용한 단백질 합성은 따로 행하였다.

희석 용액

각각 최종 농도로서 30mM HEPES-KOH(pH 7.8), 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴 인산, 2mM 디티오트레이톨, 0.3mM 스페르미딘, 0.3mM 20종류 아미노산, 2.7mM 아세트산 마그네슘, 100mM 아세트산 칼륨, 0.005% 아지드화 나트륨을 함유하는 용액 100ml를 작성하여, 장치 내의 시약조(3)(④)에 넣었다.

합성 용기

주형용 플레이트(덮개가 있는 PCR 96공(세로 8 ×가로 12) 플레이트(주형 DNA를 넣은 것):①), 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(덮개가 있는 96공(세로 8 ×가로 12) 타이터 플레이트:⑩), 번역용 플레이트(덮개가 있는 PCR 96공(세로 8 ×가로 12) 플레이트(셀의 바닥이 필터):⑭), 더미 플레이트(원심시에 밸런스를 잡는다)

팁

300μl 팁(전사 반응용 용액용, 번역 반응용 용액용, 희석 용액용:⑤)(280개), 20μl 팁(주형 산물용:⑥)(96개)

분주기 1: 피펫터 개수 8개(300μl 팁 장착용:⑧)

분주기 2: 피펫터 개수 8개(20μl 팁 장착용:⑨)

GFP 단백질 합성은, 이하의 공정으로 본 발명에 의한 합성 장치를 사용하여서 행하였다.

<공정 1: 전사>

(1) 로봇 암(⑦)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 덮개를 벗겼다.

(2) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하고, 전사 반응액을 넣은 시약조 1(②)까지 이동하였다.

(3) 분주기 1(⑧)이 시약조 1(②)로부터 전사 반응액을 95μl(45μl × 2회 + 5μl) 흡입하였다.

(4) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 위치까지 이동하여, 그 플레이트의 세로의 각 셀(8개)에 전사 반응액을 45μl씩 2회 토출하였다.

(5) (2) ~ (4)의 공정을 다시, 전사 반응액을 아직 넣지 않은 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(6) 분주기 1(⑧)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(7) 로봇 암(⑦)이 주형용 플레이트(①)의 덮개를 벗겼다.

(8) 분주기 2(⑨)가 20μl 팁(⑥)을 장착하였다.

(9) 분주기 2(⑨)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다(흡입 효율을 높이기 위해 행하였다).

(10) 분주기 2(⑨)를 주형용 플레이트(①) 위치까지 이동시켜, 주형용 플레이트(①)의 세로의 각 셀(8개) 중의 주형 샘플 5μl를 흡입하였다.

(11) 분주기 2(⑨)를 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동시켜, 그 플레이트의 세로의 각 셀(8개)에 주형 샘플 전량을 토출하였다.

(12) 분주기 2(⑨)의 각 팁에 의해, 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 세로의 각 셀(8개)을 피펫팅에 의해 혼화하였다.

(13) 분주기 2(⑨)가 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(14) (8) ~ (13)의 공정을 다시, 주형 샘플을 아직 넣지 않은 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(15) 로봇 암(⑦)이 주형용 플레이트(①) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 덮개를 덮었다.

(16) 로봇 암(⑦)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 미리 37℃로 설정해 둔 항온조 1(⑫)로 반송하여 세팅하였다.

(17) 항온조 1(⑫)에서, 37℃에서 4시간, 전사 반응을 행하였다.

<공정 2: 전사 후 침전 제거>

(1) 로봇 암(⑦)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 항온조 1(⑫)로부터 MTP 스테이지(⑬)로 반송하였다.

(2) 로봇 암(⑦)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 덮개를 벗겼다.

(3) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(4) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(5) 분주기 1(⑧)을 희석 용액이 든 시약조 3(④)으로 이동시켜, 희석 용액을 흡입하였다(흡입량은 플레이트 상의 열에 따라 농축 원심 후의 액량이 변화하기 때문에, 열마다 80μl ~ 120μl 사이에서 미세 조정하였다.).

(6) 분주기 1(⑧)을 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동시켜, 그 플레이트의 세로의 각 셀(8개)에 희석 용액 전량을 토출하였다.

(7) (4) ~ (6)의 공정을 다시, 희석 용액을 넣지 않은 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(8) 분주기 1(⑧)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(9) 로봇 암(⑦)이 번역용 플레이트(⑭)에 덮개를 덮고, 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 상에 겹쳐 놓았다(원심시에 더미 플레이트와 밸런스를 맞추기 위해).

(10) 로봇 암(⑦)이 겹쳐 놓은 번역 플레이트(⑭) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 승강대(⑮)로 반송하였다.

(11) 겹쳐 놓은 번역 플레이트(⑭) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 올려놓은 승강대를 원심기((16))의 높이에 맞게 하강시켰다.

(12) 로봇 암(⑦)이 원심기((16))의 문을 열었다.

(13) 원심기((16))가 플레이트를 세팅할 수 있도록 원심기의 플레이트 설치 부위의 위치 맞춤을 행하였다.

(14) 로봇 암(⑦)이 겹쳐 놓은 번역 플레이트(⑭) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 원심기로 반송하여 세팅하였다.

(15) (13)과 동일하게 위치 맞춤을 행하고, 더미 플레이트를 밸런스로서 원심기에 세팅하였다.

(16) 원심기((16))에서, 3100g, 15분간 원심을 행하였다.

<공정 3: 전사액 버퍼 교환 1회째>

(1) 원심기((16))가 정지한 후, 로봇 암이 원심기의 문을 열고, 계속하여 원 심기가 위치 맞춤을 행하였다(로봇 암과 원심기의 플레이트 설치 부위의 위치 맞춤).

(2) 로봇 암(⑦)이 겹쳐 놓은 번역 플레이트(⑭) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 원심기((16))로부터 승강대로 반송하였다.

(3) (1)과 동일하게 위치 맞춤을 행하고, 로봇 암(⑦)이 더미 플레이트를 승강대로 반송하였다.

(4) 로봇 암(⑦)이 겹쳐 놓은 번역 플레이트(⑭) 및 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 MTP 스테이지(⑬)로 반송하여, 번역 플레이트(⑭)와 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)를 분리하여 세팅하였다.

(5) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)의 덮개를 벗겼다.

(6) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(7) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(8) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동하여, 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 세로의 각 셀(8개) 중의 전량을 흡입하였다.

(9) 분주기 1(⑧)이 번역 플레이트(⑭) 위치까지 이동하여, 번역 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀(8개)에 전량을 토출하였다.

(10) (6) ~ (9)의 공정을 다시, 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(11) 분주기 1(⑧)이 번역 플레이트(⑭)에 덮개를 덮었다.

(12) 분주기 1(⑧)이 번역 플레이트(⑭)를 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)에 겹쳐놓았다(상: 번역 플레이트, 하: 전사ㆍ여액 받이용 플레이트).

(13) 공정 2 (l0) ~ (16)과 동일하게 원심을 행하였다.

<공정 4: 전사액 버퍼 교환 2회째>

(1) 공정 3 (1) ~ (5)와 동일하게, 원심기로부터 전사ㆍ여액 받이용 플레이트, 번역 플레이트를 꺼내어 MTP 스테이지에 세팅하고, 번역 플레이트의 덮개를 벗겼다.

(2) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(3) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(4) 분주기 1(⑧)이 희석 용액을 넣은 시약조 3(④)까지 이동하였다.

(5) 분주기 1(⑧)의 각 셀이 희석 용액을 흡입하였다(흡입량은 열마다 80μl ~ 120μl 사이에서 미세 조정하였다).

(6) 분주기 1(⑧)이 번역 플레이트(⑭) 위치까지 이동하여, 번역 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀(8개)에 전량을 토출하였다.

(7) (3) ~ (6)의 공정을 다시, 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(8) 분주기 1(⑧)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(9) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(10) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(11) 분주기 1(⑧)이 번역 플레이트(⑭) 위치까지 이동하였다.

(12) 분주기 1(⑧)의 각 팁에 의해, 번역 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀(8개)을 피펫팅에 의해 혼화하였다.

(13) (8) ~ (12)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다(각 셀에서 팁을 교환하는 경우가 있다).

(l4) 분주기 1(⑨)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(15) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)의 덮개를 덮었다.

(16) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(17) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(18) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동하였다.

(19) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 세로의 각 셀(8개) 중의 전량을 흡입하였다.

(20) 분주기 1(⑧)이 폐액구((17)) 위치까지 이동하였다.

(21) 분주기 1(⑧)이 전량을 폐액구((17))에 토출하였다.

(22) (17) ~ (21)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(23) 분주기 1(⑨)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(24) 번역 플레이트(⑭)를 공정 2 (9) ~ (16)과 동일하게 원심을 행하였다.

<공정 5: 번역 반응용 용액 분주>

(1) 공정 3 (1) ~ (5)와 동일하게, 원심기로부터 전사ㆍ여액 받이용 플레이트, 번역용 플레이트를 꺼내어 MTP 스테이지에 세팅하고, 번역용 플레이트(⑭)의 덮개를 벗겼다.

(2) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하고, 각 팁이 에어를 5μl 흡입하 였다.

(3) 분주기 1(⑧)이 번역 반응용 용액을 넣은 시약조 2(③)까지 이동하였다.

(4) 분주기 1(⑧)이 시약조 2(③)로부터 번역 반응액 50μl를 흡입하였다.

(5) 분주기 1(⑧)이 번역용 플레이트(⑭) 위치까지 이동하여, 번역용 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀(8개) 중의 전량을 토출하였다.

(6) 분주기 1(⑧)의 각 팁에 의해, 번역용 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀(8개)을 피펫팅에 의해 혼화하였다.

(7) (2) ~ (6)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(8) 분주기 1(⑨)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

(9) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)의 덮개를 덮었다.

(10) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)를 항온조 1(⑫)로 반송하였다.

(11) 번역 플레이트(⑭)를 26℃에서 1시간 보온하였다.

(12) (11)의 보온 공정 동안에(이후에는, 여액을 폐기하는 공정), 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하고, 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(13) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동하였다.

(14) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 세로의 각 셀(8개) 중의 전량을 흡입하였다.

(15) 분주기 1(⑧)이 폐액구((17)) 위치까지 이동하여 전량을 토출하였다.

(16) (12) ~ (15)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(17) 분주기 1(⑨)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다.

<공정 6: 번역 반복>

이하의 공정을 6회 반복하였다.

(1) 로봇 암(⑦)이 번역용 플레이트(⑭)를 항온조 1(⑫)로부터 MTP 스테이지(⑬)로 반송하였다.

(2) 로봇 암(⑦)이 번역용 플레이트(⑭)의 덮개를 벗겼다.

(3) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하였다.

(4) 분주기 1(⑧)의 각 팁이 에어를 5μl 흡입하였다.

(5) 분주기 1(⑧)을 희석 용액이 든 시약조 3(④)으로 이동시켜 희석 용액을 흡입하였다(흡입량은 플레이트 상의 열에 따라 원심 후의 액량이 변화하기 때문에, 열마다 80μl ~ 120μl 사이에서 미세 조정하였다).

(6) 분주기 1(⑧)을 번역용 플레이트(⑭) 위치까지 이동시켜, 그 플레이트의 세로의 각 셀(8개)에 희석 용액 전량을 토출하였다.

(7) (4) ~ (6)의 공정을 다시, 희석 용액을 넣지 않은 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(8) 공정 2 (9) ~ (16)과 동일하게 원심을 행하였다(원심 시간은 18분).

(9) 공정 3 (1) ~ (5)와 동일하게, 원심기로부터 전사ㆍ여액 받이용 플레이트, 번역 플레이트를 꺼내어 MTP 스테이지에 세팅하고, 번역 플레이트의 덮개를 벗겼다.

(10) 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하고, 각 팁이 에어를 5μl 흡입 하였다.

(11) 분주기 1(⑧)이 번역용 플레이트(⑭) 위치까지 이동하였다.

(12) 분주기 1(⑧)의 각 팁에 의해, 번역용 플레이트(⑭)의 세로의 각 셀 (8개)을 피펫팅에 의해 혼화하였다.

(13) 분주기 1(⑨)이 팁 폐기구(⑪) 위치까지 이동하여 팁을 파기하였다(팁을 교환하지 않는 경우도 있다).

(14) (10) ~ (13)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

(15) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)의 덮개를 덮었다.

(16) 로봇 암(⑦)이 번역 플레이트(⑭)를 항온조 1(⑫)로 반송하였다.

(17) 번역 플레이트(⑭)를 26℃에서 1시간 보온하였다.

(18) (17)의 보온 공정 동안에(이후에는, 여액을 폐기하는 공정), 분주기 1(⑧)이 300μl 팁(⑤)을 장착하고, 에어를 5μl 흡입하였다.

(19) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩) 위치까지 이동하였다.

(20) 분주기 1(⑧)이 전사ㆍ여액 받이용 플레이트(⑩)의 세로의 각 셀(8개) 중의 전량을 흡입하였다.

(21) 분주기 1(⑧)이 폐액구((17)) 위치까지 이동하였다.

(22) 분주기 1(⑧)이 전량을 토출하였다.

(23) (18) ~ (22)의 공정을, 또 다른 세로 7열의 각 셀에 행하였다.

<공정 7: 종료(공정 6을 6회 반복한 후)>

(1) 공정 6 (18)의 보온 종료 후, 항온조의 온도를 4℃로 하였다.

(2) 번역 플레이트를 합성기로부터 꺼내었다.

이상의 공정에 의해 합성된 GFP를 합성 단백질량의 측정은, Madin K. 등의 보고(Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-556)에 기재한 방법에 준하여 행하고, SDS-PAGE로 해석하였다(도 11).

도 11에서는, 40유닛의 1-8레인 및 80유닛의 1-4레인 모두, GFP의 밴드의 위치에 단백질이 합성되어 있었다. 또, BSA(125, 250, 500ng)의 밴드 농도와 각 레인에서의 GFP의 밴드 농도를 비교하면, 모든 레인에서 적어도 250ng의 GFP가 합성되었음을 추측할 수 있다.

이상의 설명으로 명확하게, 반응 속도가 높은 반응 초기 시간을 선택하고, 희석과 농축의 불연속 반복 조작으로 이루어지는 본 발명의 하이스루풋 합성 방법 및 그 방법을 자동으로 실시하는 장치가, 고품질의 단백질을 단시간에 효율적으로 합성하는 것이 가능한 것, 및 목적 단백질의 단리에도 매우 유효하다는 것을 알 수 있다. 또, 이 원리가 시험관내에서의 RNA의 효율적인 합성에도 유용하다는 것을 알 수 있다.

그리고, 이 원리를 응용하는 단백질이나 RNA 합성법이, Spirin 등의 연속법에 보여지는 여러 결점, 즉, 장치로서의 복잡성, 막의 저강도성, 운전시의 막의 막힘, 조작의 번잡성 등에 기인하는 반응 장치를 해결할 수 있음을 나타내었다. 또한, 특히 장시간의 합성 반응 시간을 요한다는 연속법의 결점은, 단지 시간의 낭비 에 그치지 않고, 생산되는 단백질의 품질 확보 측면에서도 해결되지 않으면 안되는 큰 문제점으로서 남겨져 있었는데, 이 결점은 중층법에 있어서도 미해결의 과제였다.

여기에 발명한 기술은, 포스트게놈 시대의 단백질 연구에 대한 기반 요소 기술을 제공하게 될 것이다. 특히, RNA나 단백질 등의 구조ㆍ기능의 해석을 위한 망라적 조제나 대량 생산을 간편하고 효율적으로 가능하게 하는 요소 기술로서 불가결하다고 할 수 있다.

Claims (23)

1. 합성을 개시하고 나서 그 합성의 반응속도 저하 전후 사이의 합성반응상을 이용한 합성방법을 반복하여 실행하는 합성방법으로서, 이하의 수단, 그 제어수단, 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세표계 합성방법;

   1) 주형물질, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 희석처리한다.

   3) 상기 2)의 희석처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 농축한다.

   4) 농축된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.

   또는

   1) 주형물질, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 농축처리한다.

   3) 상기 2)의 농축처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 희석한다.

   4) 희석된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.
2. 제 1항에 있어서,

   농축 처리에서, 부산물을 반응계 외로 제거하는 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   희석 처리에서, 기질, 에너지원, 주형 물질 가운데 어느 하나 이상의 반응계 내로의 보충이 행해지는 방법.
4. 삭제
5. 제 1 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

   주형 물질이 전사 주형인 방법.
6. 제 1 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

   주형 물질이 번역 주형인 방법.
7. 제 6항에 있어서,

   반응 용액이 세포 추출물을 포함하는 방법.
8. 하기 A) 및 B)의 합성방법을 조합한 무세포계 합성방법.

   A) 전사 주형을 원료로 하는 합성계로서, 이하의 수단, 그 제어 수단 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성방법;

   1) 전사 주형, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 희석처리한다.

   3) 상기 2)의 희석처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 농축한다.

   4) 농축된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.

   또는

   1) 전사 주형, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 농축처리한다.

   3) 상기 2)의 농축처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 희석한다.

   4) 희석된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.

   B) 번역 주형을 원료로 하는 합성계에서, 이하의 수단, 그 제어 수단 또는 그 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성방법;

   1) 번역 주형, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 희석처리한다.

   3) 상기 2)의 희석처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 농축한다.

   4) 농축된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.

   또는

   1) 번역 주형, 기질 및 반응용액을 접촉시켜 합성반응으로 이끈다.

   2) 합성속도의 저하 전후에, 반응용액을 농축처리한다.

   3) 상기 2)의 농축처리에 이어서, 반응용액 중의 반응액을 희석한다.

   4) 희석된 반응계에 의해 합성반응을 행한다.

   5) 상기 2) ~ 4)를 반복한다.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 합성을 개시하고 나서 그 합성의 반응속도 저하 전후 사이의 합성반응 상을 이용한 합성방법을 반복하여 실행하기 위해 이하의 제어 수단을 구비하는 무세포계 합성장치;

    (1) 반응용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 최대로 될 때부터 0(zero)이 될 때까지 사이의 특정 시간을 설정하는 수단;

    (2) (1)의 합성시간에 이르면, 반응용기에 희석용액을 첨가하는 수단;

    (3) (2) 이후에, 반응용기 중의 반응액을 농축하고, 희석용액의 첨가에 의해 증량된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 수단;

    (4) (3) 이후에, 합성반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 수단;

    (5) (2) ~ (4)를 반복하기 위한 수단;

    또는

    (1) 반응용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 최대로 될 때부터 0(zero)이 될 때까지 사이의 특정 시간을 설정하는 수단;

    (2) (1)의 합성시간에 이르면, 반응용기 중의 반응액을 농축하는 수단;

    (3) (2) 이후에, 반응용기에 희석용액을 첨가하고, 농축에 의해 감소된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 수단;

    (4) (3)의 이후에, 합성반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 수단;

    (5) (2) ~ (4)를 반복하기 위한 수단.
13. 제 12항에 있어서,

    반응액을 농축하는 수단이, 한외여과막을 사용하는 것으로서, 반응액을 한외여과막을 통해 반응계 외로 제거할 때, 반응액 중의 한외여과막을 통과 불가능한 물질이 반응계 내에 농축되는 것인 합성 장치.
14. 제 13항에 있어서,

    반응액을 농축하는 수단에 있어서, 반응액의 반응계 외로의 제거에, 원심분리기 또는 흡입 펌프 가운데 어느 하나 이상이 사용되는 합성 장치.
15. 제 12항에 있어서,

    반응액을 희석하는 수단이, 반응액에 희석 용액 또는 기질 용액을 첨가하는 것인 합성 장치.
16. 제 12 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,

    무세포 단백질 합성 공정에 있어서, 전사 주형으로부터 번역 주형으로 코딩되는 단백질을 생성하기 까지의 공정을 자동으로 실시하기 위해, 이하의 제어 수단 가운데 어느 하나 이상을 구비하는 합성 장치;

    (1) 반응 용기 내의 온도를 가변 제어하는 수단;

    (2) 반응 용기에 샘플 또는 시약을 분주하는 수단;

    (3) 반응 용기를 반송하는 수단;

    (4) 침전 및 농축 여과 수단
17. 삭제
18. 합성을 개시하고 나서 그 합성의 반응속도 저하 전후 사이의 합성반응상을 이용한 합성방법을 실시하기 위해, 이하의 정보처리 수단을 포함하는 프로그램이 조합된 무세포계 합성장치로서, 그 프로그램의 정보처리가 그 장치와 협동하여 행해짐으로써, 합성 개시, 반응액의 희석·농축, 합성반응의 재활성화 수단이 실행되며, 그 합성반응상을 이용한 합성방법을 반복하여 실행할 수 있는 것을 특징으로 하는 무세포계 합성장치;

    (1) 반응용기의 용적과 반응액 농도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 최대로 될 때부터 0(zero)이 될 때까지 사이의 특정 시간을 설정하는 수단;

    (2) (1)의 합성시간에 이르면, 반응용기에 희석용액을 첨가하는 수단;

    (3) (2) 이후에, 반응용기 중의 반응액을 농축하고, 희석용액의 첨가에 의해 증량된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 수단;

    (4) (3) 이후에, 합성반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 수단;

    (5) (2) ~ (4)를 반복하기 위한 수단;

    또는

    (1) 반응용기의 용적과 반응액 농축도의 정보를 토대로, 단위시간당 합성량이 최대로 될 때부터 0(zero)이 될 때까지 사이의 특정 시간을 설정하는 수단;

    (2) (1)의 합성시간에 이르면, 반응용기 중의 반응액을 농축하는 수단;

    (3) (2) 이후에, 반응용기에 희석용액을 첨가하고, 농축에 의해 감소된 반응액의 액량을 원래의 액량으로 되돌아가도록 설정하는 수단;

    (4) (3) 이후에, 합성반응을 재개시키기 위해 반응 최적 온도로 설정하는 수단;

    (5) (2) ~ (4)를 반복하기 위한 수단.
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제

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