JPH08196291A - 無細胞系蛋白質合成方法および装置 - Google Patents
無細胞系蛋白質合成方法および装置Info
- Publication number
- JPH08196291A JPH08196291A JP953795A JP953795A JPH08196291A JP H08196291 A JPH08196291 A JP H08196291A JP 953795 A JP953795 A JP 953795A JP 953795 A JP953795 A JP 953795A JP H08196291 A JPH08196291 A JP H08196291A
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- Japan
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- reaction product
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 凝集しやすい性質を有する蛋白質を無細胞系
において合成し、変性剤を用いて生成物を可溶化するこ
とによって回収する無細胞系蛋白質合成装置を提供す
る。 【構成】 予め反応槽内に細胞抽出液、酵素、ｔＲＮＡ
及び鋳型ＤＮＡを加えておき基質溶液を送液することに
よって蛋白質合成反応を行わせる。凝集しない生成物は
この段階で回収槽に送られる。一定時間経過後、変性剤
Ａによって反応生成物以外の蛋白質である合成系をのみ
を可溶化し廃棄物槽に送り出す。変性剤Ｂを反応槽に送
液し、反応生成物を溶解し回収槽へ送り出す。そして回
収槽内の変性剤を希釈することにより、その反応生成物
の活性化を図る。
において合成し、変性剤を用いて生成物を可溶化するこ
とによって回収する無細胞系蛋白質合成装置を提供す
る。 【構成】 予め反応槽内に細胞抽出液、酵素、ｔＲＮＡ
及び鋳型ＤＮＡを加えておき基質溶液を送液することに
よって蛋白質合成反応を行わせる。凝集しない生成物は
この段階で回収槽に送られる。一定時間経過後、変性剤
Ａによって反応生成物以外の蛋白質である合成系をのみ
を可溶化し廃棄物槽に送り出す。変性剤Ｂを反応槽に送
液し、反応生成物を溶解し回収槽へ送り出す。そして回
収槽内の変性剤を希釈することにより、その反応生成物
の活性化を図る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、無細胞蛋白質合成系に
より蛋白質を合成する方法及び装置に関し、より詳細に
は反応系に連続的に基質（ヌクレオシド３リン酸、アミ
ノ酸等）を供給し、反応生成物を系から取り出すことを
特徴とする蛋白質合成に関する。
より蛋白質を合成する方法及び装置に関し、より詳細に
は反応系に連続的に基質（ヌクレオシド３リン酸、アミ
ノ酸等）を供給し、反応生成物を系から取り出すことを
特徴とする蛋白質合成に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、無細胞蛋白質合成系による蛋白質
の製造法として、特開平４−２００３９０号に記載され
た方法が提案されている。この方法は、無細胞ポリペプ
チド合成系存在下にある反応槽内に基質溶液を供給し、
反応槽内で合成反応を生じさせ、反応生成物を取り出
し、ポリペプチドを連続的に生産する方法の１つであ
る。これは加圧ポンプで基質溶液を供給することによ
り、反応槽内の圧力を高め、反応槽内の気相の存在を最
小限に抑え、気相と液相の界面での蛋白質の変性を防ぐ
とともに、反応槽の上部あるいは下部に取り付けた限外
ろ過膜を通して反応生産物を取り出す方法を提案するも
のであった。
の製造法として、特開平４−２００３９０号に記載され
た方法が提案されている。この方法は、無細胞ポリペプ
チド合成系存在下にある反応槽内に基質溶液を供給し、
反応槽内で合成反応を生じさせ、反応生成物を取り出
し、ポリペプチドを連続的に生産する方法の１つであ
る。これは加圧ポンプで基質溶液を供給することによ
り、反応槽内の圧力を高め、反応槽内の気相の存在を最
小限に抑え、気相と液相の界面での蛋白質の変性を防ぐ
とともに、反応槽の上部あるいは下部に取り付けた限外
ろ過膜を通して反応生産物を取り出す方法を提案するも
のであった。
【０００３】しかし、合成させる蛋白質の種類によって
は限外ろ過膜上で反応生成物が凝集し、反応槽から反応
生成物を取り出せないという問題があった。
は限外ろ過膜上で反応生成物が凝集し、反応槽から反応
生成物を取り出せないという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の無細胞系蛋白質
合成装置では、合成させる蛋白質の種類によっては反応
中に反応生成物が凝集し、限外ろ過膜が目詰りをおこ
し、反応が停止するばかりではなく生成物の回収すら困
難になるということがあった。
合成装置では、合成させる蛋白質の種類によっては反応
中に反応生成物が凝集し、限外ろ過膜が目詰りをおこ
し、反応が停止するばかりではなく生成物の回収すら困
難になるということがあった。
【０００５】本発明は、変性剤を送液することにより、
反応槽内で凝集した生成物を可溶化し、回収槽内へ送り
出すことが可能な無細胞系蛋白質合成装置を提供するも
のである。
反応槽内で凝集した生成物を可溶化し、回収槽内へ送り
出すことが可能な無細胞系蛋白質合成装置を提供するも
のである。
【０００６】その際、作用の異なる蛋白質変性剤を送液
することにより、合成系内の蛋白質と反応生成物とを分
離、回収することが可能な無細胞系蛋白質合成装置を提
供するものである。
することにより、合成系内の蛋白質と反応生成物とを分
離、回収することが可能な無細胞系蛋白質合成装置を提
供するものである。
【０００７】さらに、活性化用緩衝液を回収槽内に送液
することにより、変性剤を希釈し蛋白質を活性化させる
ことが可能な蛋白質合成装置を提供するものである。
することにより、変性剤を希釈し蛋白質を活性化させる
ことが可能な蛋白質合成装置を提供するものである。
【０００８】さらに、本発明はこれらの機能を送液系を
制御することによって一体化した無細胞系蛋白質合成装
置を提供するものである。
制御することによって一体化した無細胞系蛋白質合成装
置を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の無細胞系蛋白質
合成装置について図面を用いて説明する。
合成装置について図面を用いて説明する。
【００１０】図１は本発明を説明するブロック図であ
る。予め反応槽１４内に細胞抽出液、酵素、ｔＲＮＡ及
び鋳型ＤＮＡを加えておく。続いてコック１、５、７を
開き、基質溶液タンク９より送液ポンプ１３を用いて反
応槽１４に基質を送液し、蛋白質合成反応を行なわせ
る。このとき溶解している生成物は限外ろ過膜１５を介
して回収槽１６へと送られる。
る。予め反応槽１４内に細胞抽出液、酵素、ｔＲＮＡ及
び鋳型ＤＮＡを加えておく。続いてコック１、５、７を
開き、基質溶液タンク９より送液ポンプ１３を用いて反
応槽１４に基質を送液し、蛋白質合成反応を行なわせ
る。このとき溶解している生成物は限外ろ過膜１５を介
して回収槽１６へと送られる。
【００１１】一定時間経過後、コック１、７を閉じ、代
わってコック２、８を開き、変性剤Ａタンク１０より変
性剤Ａを送液し、それによって反応槽１４内の無用な反
応生成物のみを可溶化し廃棄物槽１７に送り出す。続い
てコック２、８を閉じ、コック３、７を開き、変性剤Ｂ
をタンク１１よりポンプ１３を介して反応槽１４に送液
し、反応生成物を溶解し回収槽１６へ送り出す。
わってコック２、８を開き、変性剤Ａタンク１０より変
性剤Ａを送液し、それによって反応槽１４内の無用な反
応生成物のみを可溶化し廃棄物槽１７に送り出す。続い
てコック２、８を閉じ、コック３、７を開き、変性剤Ｂ
をタンク１１よりポンプ１３を介して反応槽１４に送液
し、反応生成物を溶解し回収槽１６へ送り出す。
【００１２】そしてコック３、５、７を閉じ、コック
４、６を開き，活性化用緩衝液タンク１２より活性化用
緩衝液を回収槽１６に送液することにより、変性剤を希
釈し反応生成物の再活性化を図る。この場合、コック３
を閉じ、コック４を開き，活性化用緩衝液タンク１２よ
り活性化用緩衝液を、反応槽１４を介して、回収槽１６
に送液することとしても良い。こうすれば、ポンプ１３
と回収層１６とを結ぶ送液管を省略しうるとともに活性
化用緩衝液によって反応槽内の反応生成物を確実に回収
することができる。
４、６を開き，活性化用緩衝液タンク１２より活性化用
緩衝液を回収槽１６に送液することにより、変性剤を希
釈し反応生成物の再活性化を図る。この場合、コック３
を閉じ、コック４を開き，活性化用緩衝液タンク１２よ
り活性化用緩衝液を、反応槽１４を介して、回収槽１６
に送液することとしても良い。こうすれば、ポンプ１３
と回収層１６とを結ぶ送液管を省略しうるとともに活性
化用緩衝液によって反応槽内の反応生成物を確実に回収
することができる。
【００１３】図では省略されているが、前記各コックを
所定の順序で開閉し、かつ所定の時間開いておくため
の、例えばマイコンによる、シーケンス制御装置が備え
られる。
所定の順序で開閉し、かつ所定の時間開いておくため
の、例えばマイコンによる、シーケンス制御装置が備え
られる。
【００１４】
【作用】本発明では、蛋白質合成終了時に直ちに変性剤
を送液できるようにしたので、限外ろ過膜上で凝集して
いる反応生成物を可溶化し、回収槽へ導入することが可
能になる。また、作用の異なる変性剤の使い分けおよび
流路の変更が可能な構成にしたので所望の生成物とそれ
以外の蛋白質（無用な反応生成物）を分離できる。ま
た、回収槽内に活性化用緩衝液を送液できるようにした
ので回収槽内に導入した変性した反応生成物の活性化を
図ることができる。
を送液できるようにしたので、限外ろ過膜上で凝集して
いる反応生成物を可溶化し、回収槽へ導入することが可
能になる。また、作用の異なる変性剤の使い分けおよび
流路の変更が可能な構成にしたので所望の生成物とそれ
以外の蛋白質（無用な反応生成物）を分離できる。ま
た、回収槽内に活性化用緩衝液を送液できるようにした
ので回収槽内に導入した変性した反応生成物の活性化を
図ることができる。
【００１５】
【実施例】図１に示す無細胞系蛋白質合成装置を用い
て、蛋白質合成を実施した。無細胞蛋白質合成系として
はＺｕｂａｙらの開発した大腸菌のＳ−３０抽出液を用
いる転写翻訳共役系を用い、ヒト神経成長因子（ｈＮＧ
Ｆ）を合成させた。
て、蛋白質合成を実施した。無細胞蛋白質合成系として
はＺｕｂａｙらの開発した大腸菌のＳ−３０抽出液を用
いる転写翻訳共役系を用い、ヒト神経成長因子（ｈＮＧ
Ｆ）を合成させた。
【００１６】（１）大腸菌Ｓ−３０抽出液の調製 Ｚｕｂａｙ等の方法によって、Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼ
遺伝子を導入した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）より、Ｓ
−３０抽出液を調製した。
遺伝子を導入した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）より、Ｓ
−３０抽出液を調製した。
【００１７】（２）プラスミドＤＮＡ 高効率で転写を行うＴ７プロモ−タの下流にｈＮＧＦ遺
伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ、ＰＴ７ＭＮＧＦを
鋳型として用いた。
伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ、ＰＴ７ＭＮＧＦを
鋳型として用いた。
【００１８】（３）合成反応 無細胞蛋白質合成は、容量１ｍｌの反応槽内で行った。
予め反応槽内に１７０μｌのＳ−３０抽出液、２４０μ
ｇのプラスミドＤＮＡ、１７０μｇのｔＲＮＡ、及び基
質溶液（５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液；ｐＨ＝
８．４，２．７５ｍＭ ＤＴＴ，１．２２ｍＭ ＡＴ
Ｐ，０．７５ｍＭ ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，２７．０
ｍＭ ホスホエノ−ルピルビン酸エステル，０．６４ｍ
Ｍ サイクリックＡＭＰ，３４．６μｇ フォリン酸，
１．９％ ポリエチレングリコ−ル６０００，１１．７
ｍＭ 酢酸マグネシウム，３６ｍＭ 酢酸アンモニウ
ム，７２ｍＭ 酢酸カリウム，及び０．２ｍＭ 蛋白質
を構成する２０種類のアミノ酸）を収納した。続いてコ
ック１、５、７を開き、送液ポンプで上記の基質溶液を
送液し合成反応を開始した。基質溶液を２時間送液した
後、コック１を閉じ反応を停止させた。なお、反応中、
反応槽は３７℃に保温しておいた。また、流速は１ｍｌ
／ｈとした。
予め反応槽内に１７０μｌのＳ−３０抽出液、２４０μ
ｇのプラスミドＤＮＡ、１７０μｇのｔＲＮＡ、及び基
質溶液（５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液；ｐＨ＝
８．４，２．７５ｍＭ ＤＴＴ，１．２２ｍＭ ＡＴ
Ｐ，０．７５ｍＭ ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，２７．０
ｍＭ ホスホエノ−ルピルビン酸エステル，０．６４ｍ
Ｍ サイクリックＡＭＰ，３４．６μｇ フォリン酸，
１．９％ ポリエチレングリコ−ル６０００，１１．７
ｍＭ 酢酸マグネシウム，３６ｍＭ 酢酸アンモニウ
ム，７２ｍＭ 酢酸カリウム，及び０．２ｍＭ 蛋白質
を構成する２０種類のアミノ酸）を収納した。続いてコ
ック１、５、７を開き、送液ポンプで上記の基質溶液を
送液し合成反応を開始した。基質溶液を２時間送液した
後、コック１を閉じ反応を停止させた。なお、反応中、
反応槽は３７℃に保温しておいた。また、流速は１ｍｌ
／ｈとした。
【００１９】（４）ｈＮＧＦの回収 合成反応を停止させた後、コック７を閉じ、代わってコ
ック２、８を開き、変性剤Ａとして３Ｍ塩酸グアニジン
を反応槽に１時間送液した。塩酸グアニジン溶液及び溶
解した反応生成物以外の蛋白質は廃棄物槽で回収した。
なお、このとき流速は２ｍｌ／ｈとした。その後、コッ
ク２、８を閉じ、コック３、７を開き、変性剤Ｂとして
６Ｍ塩酸グアニジンを２時間送液し、限外ろ過膜上で凝
集しているｈＮＧＦを変性させることにより可溶化して
回収槽に回収した。変性剤Ｂの送液をコック３、７を閉
じて停止した。続いてコック４、６を開き、活性化用緩
衝液によって、回収槽内の６Ｍ塩酸グアニジンの濃度が
半分になるように希釈した。なお、このとき流速は２ｍ
ｌ／ｈとした。
ック２、８を開き、変性剤Ａとして３Ｍ塩酸グアニジン
を反応槽に１時間送液した。塩酸グアニジン溶液及び溶
解した反応生成物以外の蛋白質は廃棄物槽で回収した。
なお、このとき流速は２ｍｌ／ｈとした。その後、コッ
ク２、８を閉じ、コック３、７を開き、変性剤Ｂとして
６Ｍ塩酸グアニジンを２時間送液し、限外ろ過膜上で凝
集しているｈＮＧＦを変性させることにより可溶化して
回収槽に回収した。変性剤Ｂの送液をコック３、７を閉
じて停止した。続いてコック４、６を開き、活性化用緩
衝液によって、回収槽内の６Ｍ塩酸グアニジンの濃度が
半分になるように希釈した。なお、このとき流速は２ｍ
ｌ／ｈとした。
【００２０】（５）変性ｈＮＧＦの活性化 コック４、５、７を閉じ、室温で数日間放置し、変性ｈ
ＮＧＦを活性化した。反応液１ｍｌ当たり約１０μｇの
活性型ｈＮＧＦを回収することが出来た。
ＮＧＦを活性化した。反応液１ｍｌ当たり約１０μｇの
活性型ｈＮＧＦを回収することが出来た。
【００２１】
【発明の効果】本発明の無細胞系蛋白質合成装置では蛋
白質合成終了時に基質溶液の送液を停止し変性剤を通液
することにより、反応槽内の限外ろ過膜上で凝集した生
成物の回収が容易になる。また、作用の異なる変性剤の
使い分け及び回収槽、廃棄物槽の２種類の槽を選択でき
る構成としたため生成物とそれ以外の蛋白質を分離、回
収することができる。また、回収槽内に活性化用緩衝液
を送液することによって回収槽内の変性した蛋白質を活
性化することができる。
白質合成終了時に基質溶液の送液を停止し変性剤を通液
することにより、反応槽内の限外ろ過膜上で凝集した生
成物の回収が容易になる。また、作用の異なる変性剤の
使い分け及び回収槽、廃棄物槽の２種類の槽を選択でき
る構成としたため生成物とそれ以外の蛋白質を分離、回
収することができる。また、回収槽内に活性化用緩衝液
を送液することによって回収槽内の変性した蛋白質を活
性化することができる。
【図１】本発明の無細胞蛋白質合成系による蛋白質合成
を説明するための概略構成図。
を説明するための概略構成図。
１−８…コック、９…基質溶液タンク、１０…変性剤Ａ
タンク、１１…変性剤Ｂタンク、１２…活性化用緩衝液
タンク、１３…送液ポンプ、１４…反応槽、１５…限外
ろ過膜、１６…回収槽、１７…廃棄物槽。
タンク、１１…変性剤Ｂタンク、１２…活性化用緩衝液
タンク、１３…送液ポンプ、１４…反応槽、１５…限外
ろ過膜、１６…回収槽、１７…廃棄物槽。
Claims (5)
- 【請求項１】無細胞蛋白質合成系を含む反応槽に基質溶
液を送液すること、前記反応槽内で起こった蛋白質合成
反応による反応生成物を限外ろ過膜を介して回収するこ
と、前記反応槽に第１の変性剤を加えて無用な反応生成
物および無細胞蛋白質合成系を限外ろ過膜を介して廃棄
すること、前記反応槽に第２の変性剤を加えて反応生成
物を限外ろ過膜を介して回収することよりなる無細胞系
蛋白質合成方法。 - 【請求項２】前記回収された反応生成物に緩衝液を加え
て前記第２の変性剤の相対的な濃度を低減して所定時間
保持することで活性化を図る請求項１記載の無細胞系蛋
白質合成方法。 - 【請求項３】無細胞蛋白質合成系が細胞抽出液、酵素、
ｔＲＮＡ及び鋳型ＤＮＡで構成され、第１の変性剤が３
Ｍ塩酸グアニジン、第２の変性剤が６Ｍ塩酸グアニジン
である請求項１または２記載の無細胞系蛋白質合成方
法。 - 【請求項４】基質溶液を保持するタンク、無用な反応生
成物および無細胞蛋白質合成系を限外ろ過膜を介して廃
棄するための第１の変性剤を保持するタンク、反応生成
物を限外ろ過膜を介して回収するための第２の変性剤を
保持するタンク、無細胞蛋白質合成系を保持する反応
槽、前記各タンクとポンプとを連結する送液管、前記ポ
ンプと反応槽とを連結する送液管、前記反応槽で得られ
た反応生成物を分離するための限外ろ過膜、前記反応槽
の限外ろ過膜を介して得られた反応生成物を貯留するた
めの回収タンクと反応槽とを連結する送液管、前記反応
槽内にある不要物を反応槽から廃棄するための送液管お
よび前記送液管の開閉を制御するための手段とよりなる
ことを特徴とする無細胞系蛋白質合成装置。 - 【請求項５】緩衝液を保持するタンクを備え、前記回収
タンク内の変性剤を希釈することにより、反応生成物を
活性化する請求項４記載の無細胞系蛋白質合成装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP953795A JPH08196291A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | 無細胞系蛋白質合成方法および装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP953795A JPH08196291A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | 無細胞系蛋白質合成方法および装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196291A true JPH08196291A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11723026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP953795A Pending JPH08196291A (ja) | 1995-01-25 | 1995-01-25 | 無細胞系蛋白質合成方法および装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08196291A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004097014A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Cellfree Sciences Co.,Ltd. | ハイスループット合成システム及び該システムを自動で行うための合成装置 |
-
1995
- 1995-01-25 JP JP953795A patent/JPH08196291A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004097014A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Cellfree Sciences Co.,Ltd. | ハイスループット合成システム及び該システムを自動で行うための合成装置 |
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