JP3624243B2 - 蛋白連続分解法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水を用いた連続反応により蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸に変換する方法に関するものであり、更に詳しくは、本発明は、特に、化学的に安定で無害な水の超臨界状態下において、連続反応により、蛋白質を含む材料、生物系天然物、食品未利用物などから有用な天然のアミノ酸配列に近いフラグメントのペプチドやアミノ酸を生産する技術、及びそれらのアミノ酸構成を分析評価するための前処理技術に関するものである。
本発明は、連続反応により、バッチ法では到底達成し得ない、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることを可能とするペプチド、アミノ酸の連続、高速生産方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、蛋白質の分解は、その構造やアミノ酸構成を知るための手段として重要であり、酵素分解や酸分解により蛋白質を分解することが行われている（酵素分解の文献：新実験化学講座，生物化学（Ｉ）ｐ１５６、酸分解の文献：新実験化学講座，生物化学（Ｉ）ｐ１５６〜１５７）。また、近年、この蛋白質のペプチド結合を切断する手段として、高温高圧水による方法の可能性がバッチ法によって提案されている。すなわち、文献には、蛋白質を加水分解してアミノ酸を製造する方法において、加水分解を超臨界状態又は亜臨界状態の水で行うことを特徴とする蛋白質からのアミノ酸の製造方法、加水分解を３００〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧の圧力下１〜４０秒の反応時間で行う方法、が開示されている（熱分解バッチ法の文献：特開平０９−２６８１６６号公報）が、この文献の方法は、反応液を容器に密封し、１８０℃〜５００℃に加熱した溶融塩中に導入し、臨界温度以上に上昇させる、いわゆるバッチ法によるものである。しかし、バッチ法では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれている可能性があり、得られる生成物のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なり、その生理活性効果もそれらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果となる。
【０００３】
すなわち、これら方法のうち、高温高圧下のバッチ反応による方法は、以下のような長所及び短所を有する。
長所としては、試料の形状を問わない、点があげられる。また、短所としては、一回ずつの反応であるために量産化が難しいこと、設定温度に到達するまで時間がかかるために正確な設定温度の評価が出来ないこと、数十秒以下の反応時間による分解が出来ないこと、これら反応時間の短縮が出来ないことから、分解で生成した生成物が二次・三次反応を受けやすいこと、等の点があげられる。
一方、連続式反応による方法は、以下のような長所及び短所を有すると考えられる。
長所としては、反応時間が０．１秒以下の領域まで広げることが出来ること、生成物のシャープな解析が可能となること、低分子ペプチドやアミノ酸への分解、量産化に好適であること、二次・三次反応が少ないことから構成アミノ酸の分析評価に適用できること、等の点があげられる。
短所としては、反応管に導入できない蛋白質には適用できないこと、があげられる。
【０００４】
先行技術のバッチ法では、例えば、３００ａｔｍ、４００℃の条件で行う場合、反応管の体積が約１０ｍｌのものでは、設定温度４００℃に到達するのに３０−４５秒間を必要とする。従って、３０−４５秒以下の反応時間による分解反応には適用出来ないと考えられる。また、反応液の滞在時間が３０−４５秒という時間は、４００℃までの昇温時間で、その間の反応生成物や二次・三次反応による二次・三次反応物が含まれたものとなり、構成アミノ酸の分析評価に適さない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、特に、反応液の滞在時間が３０−４５秒を大幅に下回る極めて短い反応時間による分解反応を可能とし、その間の反応生成物や二次・三次反応物が含まれることのない、分解反応を数秒以下で連続的に行うことができる新しい反応方法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、特定の流通式反応装置を用いて、超臨界水中で連続反応を行うことにより、蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で変換し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により蛋白質を効率的にペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で加水分解する方法を提供することを目的とする。
更に、本発明は、従来のバッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれ、生成物のアミノ酸配列などが天然のそれと全く異なってしまい、その活性もそれらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果になってしまうことを防ぎ得ないのに対し、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることができ、得られる生成物は、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメントであることを可能とする、ペプチド、アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産することを特徴とするペプチド及び／又はアミノ酸の生産方法。
（２）基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸に変換する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水を用いて上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質をペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で加水分解することを特徴とする蛋白質のペプチド及び／又はアミノ酸への変換方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の連続反応による分解手段は、亜臨界・超臨界水領域で連続的に蛋白質を分解し、その構成ペプチドフラグメントや構成アミノ酸を天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、その分解標品の形で得ることを特徴とする方法である。
本発明で使用する連続反応装置を図面に基づいて説明する。
図１に示すように、本発明で使用される連続反応装置として、高圧ポンプ（高速液体クロマトグラフィー用ポンプ）を利用して基質を導入する基質導入ライン、高圧ポンプより送られる水を予熱する予熱炉、反応液を高温熱水状態に加熱し、連続反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部、冷却した反応液を排出する圧力調整器（保圧弁）、温度計及び圧力計（図示せず）を構成要素として含有してなる連続反応装置が例示される。
上記連続反応装置において、基質蛋白質は、例えば、スラリー充填機を介して、基質導入ラインから供給され、高圧ポンプより送られ、予熱炉で加熱された高温熱水と予熱ラインと基質導入ラインの合流接点付加で約４００℃付近に昇温された後、設定量の基質懸濁液は反応炉に送り込まれ、滞在時間０．００１秒から１秒で連続反応に供される。反応炉を経た液は、冷却部で室温に冷やされ、圧力調整器（保圧弁）を経て出口より採取される。
本発明の方法では、上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１秒から１秒で蛋白質を連続的にペプチド及び／又はアミノ酸に加水分解でき、アミノ酸分析の結果、バッチ法に比べて、アミノ酸及びペプチドの収率が極めて高くなること、更に、これらが連続的に高速で生産できること、得られる生成物がより天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、及びその分解標品であること、等のバッチ法にない格別の効果が得られることから、化学工業的にも極めて魅力ある技術になるといった作用効果が得られる。
【０００８】
本発明において、基質蛋白質としては、適宜の蛋白質及びペプチド、蛋白質を含有する材料、生物系天然物、食品未利用物、資源等、蛋白質を含む適宜の蛋白質類を用いることが可能であり、その種類は特に制限されない。
加水分解反応に用いる超臨界水としては、好適には、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界状態の水が例示されるが、これらの圧力及び温度の一方がこれらの値を下回る場合であっても、超臨界点付近の高圧熱水、亜臨界水であれば同様に利用でき、それらの高圧熱水による連続反応も本発明の範囲に含まれる。
超臨界水の使用量は、温度圧力条件とキャリアー水の送液量及び基質導入量によって異なるものであり、好適には、重量換算で蛋白質１部に対し、水１００〜２００００部であるが、その使用量は特に制限されない。
連続反応装置としては、好適には、前記流通式反応装置が用いられるが、例えば、これに反応器内に加水分解する基質を送り込むスラリー充填機、それと同等の機能を有する導入器等を付加した装置などが用いられる。
【０００９】
本発明の方法では、基質蛋白質の分解を数秒以下で連続的に行い、その分解の速度、温度、圧力、濃度をバルブ操作で自在に操作できる。生成物としては、バッチ反応の場合と本質的に別異の、二次・三次反応生成物の極めて少ない、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物の製品を得ることが出来ることから、アミノ酸構成の評価分析に好適に利用できる。このことからは、本発明の方法は、アミノ酸構成の分析評価のための短時間前処理方法としても好適に使用可能である。
【００１０】
【作用】
従来、蛋白質の加水分解を亜臨界状態又は超臨界状態の水を利用してバッチ反応法により蛋白質を加水分解することは知られているが、本発明は、流通式反応装置を用いて、超臨界水中での連続反応により蛋白質をペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で変換することを特徴とする連続反応方法であり、得られた生成物のアミノ酸分析の結果、本発明の方法は、アミノ酸の回収率がバッチ法より極めて高く、基質蛋白質の塩酸加水分解によるアミノ酸組成比に近い値が得られる、バッチ法では得られない高い濃度のペプチドが得られる、副生成物が少ない、等のバッチ法には期待できない格別の作用効果が得られる。
【００１１】
バッチ法による反応では、蛋白質が室温から４００℃まで４０−４５秒間かかり、その後、３０秒間曝されている。同時に、その間の圧力も大気圧から３０ＭＰａまで変化する条件下にある。
一方、流通式は、一定圧力で４００℃に０．００６秒間という滞在時間である。
この様な反応条件の結果として、生成される物質の構成は、前者は、室温から水の臨界温度までの熱分解物を含み、更に、超臨界状態下でその熱分解物が加水分解などを受けることとなり、その結果として、バッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれている可能性がある。このことは、活性物質のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なっている可能性を秘めている。その構成成分も多岐にわたって存在する。従って、活性の効果自体は、それらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果であると云える。
一方、瞬時の反応による後者の場合の反応物組成は、前者とは全く逆の視点でとらえることが出来る。すなわち、得られる生成物は、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物である。得られる成分の活性も、バッチ法の場合のように成分の複雑に絡み合った結果の効果とは異なり、より天然のアミノ酸配列に基づくよりシャープなものであり、本来の活性成分の効果をより鮮明に現すことが出来る。このことは、バッチ法では期待できない連続反応法による格別の効果であり、活性成分の利用分野において最も重要であるばかりでなく、また、マイナス効果の把握においても重要である。
【００１２】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
本実施例では、超臨界水中における反応時間０．７秒の基質原料ツェイン（トウモロコシ蛋白質）の連続反応による分解の例を説明する。
反応条件：４００℃、３００ａｔｍ、で連続反応を行う連続反応装置を図１に示す。
本発明の流通式反応システムによる蛋白質の加水分解の例を以下に説明する。高圧ポンプ（高速液体クロマトグラフィー用ポンプ）、加熱装置、反応炉、冷却部、圧力調整器（保圧弁）、温度計及び圧力計等で構成される流通式反応装置を用い、反応管体積０．８２４立方センチメータ（内径３．１３ｍｍ、長さ１１ｃｍ、合金Ｃ２７６）で、反応温度と反応圧力は、それぞれ４００℃と３００ａｔｍで連続反応を行った。高圧ポンプより送られる全送水量は予熱炉部から２０ｍｌ、基質供給ラインから５ｍｌの総計２５ｍｌである。この時の反応管の内部温度が４００℃になるように設計した。この実験における反応液の滞在時間は約０．７秒である。なお、滞在時間は送水量で自由に制御できる。この実験進行中の圧力はプラス・マイナス０．１ａｔｍ以内で、また、温度はプラス・マイナス０．２℃以内で制御できた。
【００１３】
これらの操作としては、最初に予熱ラインと基質供給ラインの合流接点付近の温度が４００℃付近に昇温された後、設定量の基質懸濁液を送り込んだ。反応器を経た液は冷却部で冷やされ、保圧弁を経て出口より採取された。その採取された反応物のアミノ酸分析の結果を表１のＡに示す。
本実施例では、反応液を以下の条件で展開した。
分解に供した基質原料：ツェイン（トウモロコシ蛋白質）
基質導入の方法：連続導入
基質注入量：２ｍｇ／ｍｉｎ
送水量：２５ｍｌ／ｍｉｎ
反応管体積：０．８２４ｃｍ３
滞在時間：０．７秒
表１のＡが連続式における反応溶液のアミノ酸分析結果のモル数とモルパーセントである。表中のＲはツェインの６Ｎ塩酸加水分解値である。本発明の連続反応により、特に、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン等の蛋白質を構成するアミノ酸の回収量が多いことがわかる。また、バッチ法に比べて、質的及び量的に、アミノ酸の回収率がかなり大きくなっていることがわかる。
【００１４】
【表１】
【００１５】
実施例２
本実施例では、超臨界水中における反応時間０．００６秒台の基質原料ツェインの連続反応による分解の例を説明する。
実施例１で使用した連続反応装置を使用し、反応管体積を変えて連続反応を行った。反応管内径０．２ｍｍ、長さ１０ｃｍ、合金Ｃ−２７６の１／１６インチ（０．１５９ｃｍ）管を用いた。
本実施例では、反応液を反応条件：４００℃、３００ａｔｍ、で以下の条件で展開した。
分解に供した基質原料：ツェイン（トウモロコシ蛋白質）
基質導入の方法：連続導入
基質注入量：７．４３ｍｇ／ｍｉｎ
送水量：１７ｍｌ／ｍｉｎ
反応管体積：０．００３１４ｃｍ３
滞在時間：０．００６秒
表１のＢが連続式における反応溶液のアミノ酸分析結果のモル数とモルパーセントである。本発明の連続反応により、グルタミン酸、グリシン、ファニルアラニン等を除いて、アミノ酸組成比は、６Ｎ塩酸加水分解値に近い値になっている。グルタミン酸が分解してグリシンが生成したと考えられる。また、ペプチドの生産量も多いことがわかる。本発明製品のアンジオテンシン変換酵素阻害活性（血圧上昇抑制作用がある）を調べた結果、７８％阻害活性を示し、生理活性物質の生産に適していることがわかる。図３に、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を調べた結果を示す。
【００１６】
比較例
本比較例では、バッチ法による基質原料ツェインの加水分解の例を説明する。本比較例で使用したバッチ反応装置を図２に示す。ツェイン１００ｍｇを体積１０．４６ｃｍ３ のステンレス（ＳＵＳ３１６）容器に入れ、３００ａｔｍ、４００℃で水密度３５８．０５（Ｋｇ／ｍ３ ）の条件になるように脱酸素蒸留水を封入し、管内はヘリウムで置換した後、容器を密閉し、４００℃の溶融塩（Ｓａｌｔ ｔｙｐｅ）中に投入した。管内の温度は管中にセットした熱電対によって測定した。その時の設定温度４００℃に到達するのに要した時間は４５秒である。４００℃で３０秒間保持した後、冷却水に投入し反応を終了させた。この反応液のアミノ酸分析の結果を表１のバッチ欄に示した。回収されたアミノ酸は、アラニン、グリシン等８種類であり、本発明製品と比べて種類が少なく、回収量が低いことがわかる。また、アンジオテンシン変換酵素阻害活性も１８％と低い値を示した（図３）。
【００１７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水中での連続反応により蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産する方法等に係るものであり、本発明により、１）蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産することができる、２）蛋白質の加水分解を数秒以下（例えば、反応液の滞在時間が０．００１秒から１秒）で連続的に行うことができる、３）その分解の速度、温度、圧力、濃度をバルブ操作で自在に操作することができる、４）バッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれ、活性物質のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なることになるが、本発明の方法では、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物が得られ、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることができる、５）そのため、アミノ酸構成の評価分析のための前処理方法として有用である、６）バッチ法と比べて、得られる本発明製品のアンジオテンシン変換酵素阻害活性が高いので、生理活性ペプチドの生産方法として特に有用である、等の格別の効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる連続反応装置（流通式反応装置）を示す。
【図２】バッチ反応装置を示す。
【図３】流通式及びバッチ反応物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性の比較を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水を用いた連続反応により蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸に変換する方法に関するものであり、更に詳しくは、本発明は、特に、化学的に安定で無害な水の超臨界状態下において、連続反応により、蛋白質を含む材料、生物系天然物、食品未利用物などから有用な天然のアミノ酸配列に近いフラグメントのペプチドやアミノ酸を生産する技術、及びそれらのアミノ酸構成を分析評価するための前処理技術に関するものである。
本発明は、連続反応により、バッチ法では到底達成し得ない、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることを可能とするペプチド、アミノ酸の連続、高速生産方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、蛋白質の分解は、その構造やアミノ酸構成を知るための手段として重要であり、酵素分解や酸分解により蛋白質を分解することが行われている（酵素分解の文献：新実験化学講座，生物化学（Ｉ）ｐ１５６、酸分解の文献：新実験化学講座，生物化学（Ｉ）ｐ１５６〜１５７）。また、近年、この蛋白質のペプチド結合を切断する手段として、高温高圧水による方法の可能性がバッチ法によって提案されている。すなわち、文献には、蛋白質を加水分解してアミノ酸を製造する方法において、加水分解を超臨界状態又は亜臨界状態の水で行うことを特徴とする蛋白質からのアミノ酸の製造方法、加水分解を３００〜４００℃の温度、２２１気圧〜１０００気圧の圧力下１〜４０秒の反応時間で行う方法、が開示されている（熱分解バッチ法の文献：特開平０９−２６８１６６号公報）が、この文献の方法は、反応液を容器に密封し、１８０℃〜５００℃に加熱した溶融塩中に導入し、臨界温度以上に上昇させる、いわゆるバッチ法によるものである。しかし、バッチ法では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれている可能性があり、得られる生成物のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なり、その生理活性効果もそれらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果となる。
【０００３】
すなわち、これら方法のうち、高温高圧下のバッチ反応による方法は、以下のような長所及び短所を有する。
長所としては、試料の形状を問わない、点があげられる。また、短所としては、一回ずつの反応であるために量産化が難しいこと、設定温度に到達するまで時間がかかるために正確な設定温度の評価が出来ないこと、数十秒以下の反応時間による分解が出来ないこと、これら反応時間の短縮が出来ないことから、分解で生成した生成物が二次・三次反応を受けやすいこと、等の点があげられる。
一方、連続式反応による方法は、以下のような長所及び短所を有すると考えられる。
長所としては、反応時間が０．１秒以下の領域まで広げることが出来ること、生成物のシャープな解析が可能となること、低分子ペプチドやアミノ酸への分解、量産化に好適であること、二次・三次反応が少ないことから構成アミノ酸の分析評価に適用できること、等の点があげられる。
短所としては、反応管に導入できない蛋白質には適用できないこと、があげられる。
【０００４】
先行技術のバッチ法では、例えば、３００ａｔｍ、４００℃の条件で行う場合、反応管の体積が約１０ｍｌのものでは、設定温度４００℃に到達するのに３０−４５秒間を必要とする。従って、３０−４５秒以下の反応時間による分解反応には適用出来ないと考えられる。また、反応液の滞在時間が３０−４５秒という時間は、４００℃までの昇温時間で、その間の反応生成物や二次・三次反応による二次・三次反応物が含まれたものとなり、構成アミノ酸の分析評価に適さない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、特に、反応液の滞在時間が３０−４５秒を大幅に下回る極めて短い反応時間による分解反応を可能とし、その間の反応生成物や二次・三次反応物が含まれることのない、分解反応を数秒以下で連続的に行うことができる新しい反応方法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、特定の流通式反応装置を用いて、超臨界水中で連続反応を行うことにより、蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で変換し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により蛋白質を効率的にペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で加水分解する方法を提供することを目的とする。
更に、本発明は、従来のバッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれ、生成物のアミノ酸配列などが天然のそれと全く異なってしまい、その活性もそれらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果になってしまうことを防ぎ得ないのに対し、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることができ、得られる生成物は、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメントであることを可能とする、ペプチド、アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産することを特徴とするペプチド及び／又はアミノ酸の生産方法。
（２）基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸に変換する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水を用いて上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質をペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で加水分解することを特徴とする蛋白質のペプチド及び／又はアミノ酸への変換方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の連続反応による分解手段は、亜臨界・超臨界水領域で連続的に蛋白質を分解し、その構成ペプチドフラグメントや構成アミノ酸を天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、その分解標品の形で得ることを特徴とする方法である。
本発明で使用する連続反応装置を図面に基づいて説明する。
図１に示すように、本発明で使用される連続反応装置として、高圧ポンプ（高速液体クロマトグラフィー用ポンプ）を利用して基質を導入する基質導入ライン、高圧ポンプより送られる水を予熱する予熱炉、反応液を高温熱水状態に加熱し、連続反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部、冷却した反応液を排出する圧力調整器（保圧弁）、温度計及び圧力計（図示せず）を構成要素として含有してなる連続反応装置が例示される。
上記連続反応装置において、基質蛋白質は、例えば、スラリー充填機を介して、基質導入ラインから供給され、高圧ポンプより送られ、予熱炉で加熱された高温熱水と予熱ラインと基質導入ラインの合流接点付加で約４００℃付近に昇温された後、設定量の基質懸濁液は反応炉に送り込まれ、滞在時間０．００１秒から１秒で連続反応に供される。反応炉を経た液は、冷却部で室温に冷やされ、圧力調整器（保圧弁）を経て出口より採取される。
本発明の方法では、上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１秒から１秒で蛋白質を連続的にペプチド及び／又はアミノ酸に加水分解でき、アミノ酸分析の結果、バッチ法に比べて、アミノ酸及びペプチドの収率が極めて高くなること、更に、これらが連続的に高速で生産できること、得られる生成物がより天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、及びその分解標品であること、等のバッチ法にない格別の効果が得られることから、化学工業的にも極めて魅力ある技術になるといった作用効果が得られる。
【０００８】
本発明において、基質蛋白質としては、適宜の蛋白質及びペプチド、蛋白質を含有する材料、生物系天然物、食品未利用物、資源等、蛋白質を含む適宜の蛋白質類を用いることが可能であり、その種類は特に制限されない。
加水分解反応に用いる超臨界水としては、好適には、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界状態の水が例示されるが、これらの圧力及び温度の一方がこれらの値を下回る場合であっても、超臨界点付近の高圧熱水、亜臨界水であれば同様に利用でき、それらの高圧熱水による連続反応も本発明の範囲に含まれる。
超臨界水の使用量は、温度圧力条件とキャリアー水の送液量及び基質導入量によって異なるものであり、好適には、重量換算で蛋白質１部に対し、水１００〜２００００部であるが、その使用量は特に制限されない。
連続反応装置としては、好適には、前記流通式反応装置が用いられるが、例えば、これに反応器内に加水分解する基質を送り込むスラリー充填機、それと同等の機能を有する導入器等を付加した装置などが用いられる。
【０００９】
本発明の方法では、基質蛋白質の分解を数秒以下で連続的に行い、その分解の速度、温度、圧力、濃度をバルブ操作で自在に操作できる。生成物としては、バッチ反応の場合と本質的に別異の、二次・三次反応生成物の極めて少ない、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物の製品を得ることが出来ることから、アミノ酸構成の評価分析に好適に利用できる。このことからは、本発明の方法は、アミノ酸構成の分析評価のための短時間前処理方法としても好適に使用可能である。
【００１０】
【作用】
従来、蛋白質の加水分解を亜臨界状態又は超臨界状態の水を利用してバッチ反応法により蛋白質を加水分解することは知られているが、本発明は、流通式反応装置を用いて、超臨界水中での連続反応により蛋白質をペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で変換することを特徴とする連続反応方法であり、得られた生成物のアミノ酸分析の結果、本発明の方法は、アミノ酸の回収率がバッチ法より極めて高く、基質蛋白質の塩酸加水分解によるアミノ酸組成比に近い値が得られる、バッチ法では得られない高い濃度のペプチドが得られる、副生成物が少ない、等のバッチ法には期待できない格別の作用効果が得られる。
【００１１】
バッチ法による反応では、蛋白質が室温から４００℃まで４０−４５秒間かかり、その後、３０秒間曝されている。同時に、その間の圧力も大気圧から３０ＭＰａまで変化する条件下にある。
一方、流通式は、一定圧力で４００℃に０．００６秒間という滞在時間である。
この様な反応条件の結果として、生成される物質の構成は、前者は、室温から水の臨界温度までの熱分解物を含み、更に、超臨界状態下でその熱分解物が加水分解などを受けることとなり、その結果として、バッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれている可能性がある。このことは、活性物質のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なっている可能性を秘めている。その構成成分も多岐にわたって存在する。従って、活性の効果自体は、それらの成分のより複雑に絡み合った結果の効果であると云える。
一方、瞬時の反応による後者の場合の反応物組成は、前者とは全く逆の視点でとらえることが出来る。すなわち、得られる生成物は、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物である。得られる成分の活性も、バッチ法の場合のように成分の複雑に絡み合った結果の効果とは異なり、より天然のアミノ酸配列に基づくよりシャープなものであり、本来の活性成分の効果をより鮮明に現すことが出来る。このことは、バッチ法では期待できない連続反応法による格別の効果であり、活性成分の利用分野において最も重要であるばかりでなく、また、マイナス効果の把握においても重要である。
【００１２】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
本実施例では、超臨界水中における反応時間０．７秒の基質原料ツェイン（トウモロコシ蛋白質）の連続反応による分解の例を説明する。
反応条件：４００℃、３００ａｔｍ、で連続反応を行う連続反応装置を図１に示す。
本発明の流通式反応システムによる蛋白質の加水分解の例を以下に説明する。高圧ポンプ（高速液体クロマトグラフィー用ポンプ）、加熱装置、反応炉、冷却部、圧力調整器（保圧弁）、温度計及び圧力計等で構成される流通式反応装置を用い、反応管体積０．８２４立方センチメータ（内径３．１３ｍｍ、長さ１１ｃｍ、合金Ｃ２７６）で、反応温度と反応圧力は、それぞれ４００℃と３００ａｔｍで連続反応を行った。高圧ポンプより送られる全送水量は予熱炉部から２０ｍｌ、基質供給ラインから５ｍｌの総計２５ｍｌである。この時の反応管の内部温度が４００℃になるように設計した。この実験における反応液の滞在時間は約０．７秒である。なお、滞在時間は送水量で自由に制御できる。この実験進行中の圧力はプラス・マイナス０．１ａｔｍ以内で、また、温度はプラス・マイナス０．２℃以内で制御できた。
【００１３】
これらの操作としては、最初に予熱ラインと基質供給ラインの合流接点付近の温度が４００℃付近に昇温された後、設定量の基質懸濁液を送り込んだ。反応器を経た液は冷却部で冷やされ、保圧弁を経て出口より採取された。その採取された反応物のアミノ酸分析の結果を表１のＡに示す。
本実施例では、反応液を以下の条件で展開した。
分解に供した基質原料：ツェイン（トウモロコシ蛋白質）
基質導入の方法：連続導入
基質注入量：２ｍｇ／ｍｉｎ
送水量：２５ｍｌ／ｍｉｎ
反応管体積：０．８２４ｃｍ３
滞在時間：０．７秒
表１のＡが連続式における反応溶液のアミノ酸分析結果のモル数とモルパーセントである。表中のＲはツェインの６Ｎ塩酸加水分解値である。本発明の連続反応により、特に、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン等の蛋白質を構成するアミノ酸の回収量が多いことがわかる。また、バッチ法に比べて、質的及び量的に、アミノ酸の回収率がかなり大きくなっていることがわかる。
【００１４】
【表１】
実施例２
本実施例では、超臨界水中における反応時間０．００６秒台の基質原料ツェインの連続反応による分解の例を説明する。
実施例１で使用した連続反応装置を使用し、反応管体積を変えて連続反応を行った。反応管内径０．２ｍｍ、長さ１０ｃｍ、合金Ｃ−２７６の１／１６インチ（０．１５９ｃｍ）管を用いた。
本実施例では、反応液を反応条件：４００℃、３００ａｔｍ、で以下の条件で展開した。
分解に供した基質原料：ツェイン（トウモロコシ蛋白質）
基質導入の方法：連続導入
基質注入量：７．４３ｍｇ／ｍｉｎ
送水量：１７ｍｌ／ｍｉｎ
反応管体積：０．００３１４ｃｍ３
滞在時間：０．００６秒
表１のＢが連続式における反応溶液のアミノ酸分析結果のモル数とモルパーセントである。本発明の連続反応により、グルタミン酸、グリシン、ファニルアラニン等を除いて、アミノ酸組成比は、６Ｎ塩酸加水分解値に近い値になっている。グルタミン酸が分解してグリシンが生成したと考えられる。また、ペプチドの生産量も多いことがわかる。本発明製品のアンジオテンシン変換酵素阻害活性（血圧上昇抑制作用がある）を調べた結果、７８％阻害活性を示し、生理活性物質の生産に適していることがわかる。図３に、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を調べた結果を示す。
【００１６】
比較例
本比較例では、バッチ法による基質原料ツェインの加水分解の例を説明する。本比較例で使用したバッチ反応装置を図２に示す。ツェイン１００ｍｇを体積１０．４６ｃｍ３ のステンレス（ＳＵＳ３１６）容器に入れ、３００ａｔｍ、４００℃で水密度３５８．０５（Ｋｇ／ｍ３ ）の条件になるように脱酸素蒸留水を封入し、管内はヘリウムで置換した後、容器を密閉し、４００℃の溶融塩（Ｓａｌｔ ｔｙｐｅ）中に投入した。管内の温度は管中にセットした熱電対によって測定した。その時の設定温度４００℃に到達するのに要した時間は４５秒である。４００℃で３０秒間保持した後、冷却水に投入し反応を終了させた。この反応液のアミノ酸分析の結果を表１のバッチ欄に示した。回収されたアミノ酸は、アラニン、グリシン等８種類であり、本発明製品と比べて種類が少なく、回収量が低いことがわかる。また、アンジオテンシン変換酵素阻害活性も１８％と低い値を示した（図３）。
【００１７】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水中での連続反応により蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産する方法等に係るものであり、本発明により、１）蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産することができる、２）蛋白質の加水分解を数秒以下（例えば、反応液の滞在時間が０．００１秒から１秒）で連続的に行うことができる、３）その分解の速度、温度、圧力、濃度をバルブ操作で自在に操作することができる、４）バッチ反応では、二段階、三段階あるいはそれ以上の経路による生成物が含まれ、活性物質のアミノ酸配列などが天然物のそれと全く異なることになるが、本発明の方法では、より天然のアミノ酸配列に近いフラグメント、分解生成物が得られ、二次・三次反応生成物の極めて少ない標品を得ることができる、５）そのため、アミノ酸構成の評価分析のための前処理方法として有用である、６）バッチ法と比べて、得られる本発明製品のアンジオテンシン変換酵素阻害活性が高いので、生理活性ペプチドの生産方法として特に有用である、等の格別の効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる連続反応装置（流通式反応装置）を示す。
【図２】バッチ反応装置を示す。
【図３】流通式及びバッチ反応物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性の比較を示す。
Claims (2)
- 基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸を生産する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水中での連続反応により上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質からペプチド及び／又はアミノ酸を連続的に高速で生産することを特徴とするペプチド及び／又はアミノ酸の生産方法。
- 基質を供給する基質導入ライン、高温熱水を供給する予熱炉、反応液を加熱し反応させる反応炉、反応液を冷却する冷却部を構成要素として含む流通式反応装置を用いて、反応炉に導入した基質蛋白質を連続的に加水分解してペプチド及び／又はアミノ酸に変換する方法であって、圧力２２．０５ＭＰａ、温度３７５℃以上の超臨界水ないし超臨界点付近の高圧熱水を用いて上記反応炉における反応液の滞在時間が０．００１〜１秒の条件で蛋白質をペプチド及び／又はアミノ酸に連続的に高速で加水分解することを特徴とする蛋白質のペプチド及び／又はアミノ酸への変換方法。
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