JP6940149B2 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Description
[1]以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列。
[2]酸素を電子受容体としない、[1]記載のタンパク質。
[3]グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製し、該ベクターにより形質転換した形質転換細胞を培養して得られる組換えタンパク質である、[1]又は[2]記載のタンパク質。
[4][1]に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[6][5]に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
[7][6]に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[8]以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコースの測定方法:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列。
[9]以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定試薬組成物:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列。
[10]以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、実質的に溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用バイオセンサ:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列。
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列。
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1、2又は3個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。又は配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜10個、好ましくは多くとも9個、8個、6個、5個、4個、3個又は2個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列。
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列。N末端は、好ましくはSSQ、SSQR、SSQRF又はSSQRFDである。
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列。
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列。
前記同一性は、少なくとも80%、85%、90%、92%又は95%が好ましく、少なくとも97%、98%、99%又は99.5%がより好ましい。
該酵素は、好ましくは(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
(2)可溶性である。
(3)酸素を実質的に電子受容体としない。
(i)前記(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
(ii)配列番号2に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(iii)配列番号2に示される塩基配列において3、6又は9個の塩基が欠失又は付加されたポリヌクレオチド。又は配列番号2に示される塩基配列において1〜10個、好ましくは多くとも9個、8個、6個、5個、4個、3個もしくは2個の塩基が置換された塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(iv)配列番号2に示される塩基配列と同一性を有する塩基配列を有し、かつN末端がSSであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。N末端は、好ましくはSSQ、SSQR、SSQRF又はSSQRFDである。
(v)配列番号2に示される塩基配列と同一性を有する塩基配列を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(vi)配列番号1に示される塩基配列又は該配列と同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド。
前記同一性は、少なくとも80%、85%、90%、92%又は95%が好ましく、少なくとも97%、98%、99%又は99.5%がより好ましい。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)1.00mL、1M D−グルコース溶液1.00mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.14mL及び3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.20mL及び超純水0.61mLを混合し、37℃で10分間保温後、酵素溶液0.05mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、37℃、pH6.0で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義した。
尚、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、10.8はpH6.0におけるDCIPのモル吸光係数、1.0はセルの光路長(cm)、0.05は酵素溶液の液量(mL)、ΔA600blankは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量を表す。
GLD生産菌の探索を行った結果、Glomerella fructigena NBRC5951の培養上清にGLD活性が確認できた。
パインデックス(松谷化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH6.0に調整し、10mLを太試験管に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記GLD生産菌を接種し、25℃で72時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。
(1)で取得した湿菌体200mgを−80℃で凍結した後、ISOGENII(ニッポンジーン社製)を用いて100μgの全RNAを抽出した。
(2)で取得したRNAから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAライブラリーを調製した。反応試薬は、SMARTer RACE cDNA Amplification kit(タカラバイオ社製)を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子取得用プライマー対を用いてPCRを行った。その結果、GLD遺伝子の内部配列と思われるPCR産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のGLD配列を基に、種々のGLD遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記PCR産物を精製し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて、T−vector PMD20(タカラバイオ社製)にライゲーションした。
公知文献1(Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、38、12、831−838、2000)に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子を含むPCR産物を取得した。下記のF4570−Ori(配列番号4)及びF4570−R−1st(配列番号5)のプライマー対を使用した。次に、前記PCR産物を鋳型とし、ベクター挿入用のGfGLD遺伝子を調製した。下記のF4570−Ori(配列番号4)及びF4570−R−2nd(配列番号6)のプライマー対を使用した。
5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGCTGCGCTCCATTGTCTC−3’
(括弧内:転写増強因子)
F4570−R−1st(配列番号5):
5’−((GTTCATTTA))GGCGGAAGCCTTGATGATG−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
F4570−R−2nd(配列番号6):
5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GGCGG−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))
(5)で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献2(Biosci.Biotech.Biochem.,61(8),1367−1369,1997)及び公知文献3(清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、494−502、2000)に記載の方法に準じて、GLDを生産する組換えカビ(アスペルギルス・オリゼ)を作製した。得られた組換え株をCzapek−Dox固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼNS4株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。
パインデックス(松谷化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH7.0に調整し、10mLを太試験管(22mm×200mm)に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で72時間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のGLD活性測定法でGLD活性を測定したところ、本発明のGLD活性が確認できた。
(7)に記載の液体培地150mLを500mL容の坂口フラスコに入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で72時間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成にクロラムフェニコール(ナカライテスク社製)0.005%(w/v)、消泡剤を添加した培地3.5Lを5L容ジャーファーメンターに入れ、121℃、30分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を100mL植菌し、30℃、400rpm、1v/v/mで96時間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター(10μm、アドバンテック社製)でろ過して粗酵素液を回収した。
実施例1で得られた精製GLDの諸性質を調べた。
(1)吸収スペクトルの測定
実施例1で得られた精製GLDについて、D−グルコース添加前後の300−600nmにおける吸収スペクトルをプレートリーダー(SpectraMax Plus384、モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。その結果、波長360−380nm付近及び波長450−460nm付近に認められた吸収極大が、D−グルコース添加により消失したことから、本発明のGLDはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)0.2mL、1M D−グルコース2.0mL、25mM 4−アミノアンチピリン0.2mL、420mMフェノール0.2mL、1mg/mLペルオキシダーゼ0.2mL及び超純水0.2mLを混合し、混合液0.1mLを96穴プレートに入れ、25℃で5分間保温した。実施例1で得られた精製GLD0.1mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う500nmにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、GOD活性を調べた。尚、コントロールは、GLDの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、GLDはコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。
前記GLD活性測定法に準じ、基質に終濃度50mMのD−グルコース、マルトース又はD−ガラクトースをそれぞれ用いて、各基質に対する各GLDの活性を測定した。結果を表1に示す。
実施例1で得られた精製GLDのN末端を解析したところ、SSQRFであることが明らかになった。つまり、配列番号1記載の開始コドンから始まる全長GLD遺伝子1758塩基のうち、配列番号7に示した63塩基はシグナル配列をコードする配列で、配列番号8に示した21アミノ酸がシグナル配列というような可能性が考えられる。実施例1で得られたマチュアなタンパク質のアミノ酸配列を配列番号3に示し、該タンパク質をコードする塩基配列を配列番号2に示した。
実施例1で得られた精製GLDの糖鎖切断前後の分子量を以下の方法で求めた。糖鎖切断処理として、サンプルにエンドグリコシダーゼH(ロシュ製)を10μL(50mU)添加し、25℃で16時間反応させた。糖鎖切断処理前後のGLD溶液(各々1.0mg/mLに調製)5μLと1%SDS及び2%β―メルカプトエタノールを含む0.4Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)5μLを混合し、100℃で3分間熱処理を行った。糖鎖切断処理前後のサンプルをe−パジェル7.5%(アトー社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー(CBBで)染色した。
実施例1で得られた精製GLDをガラス容器に入れ、−80℃で1時間以上静置し、予備凍結を行った。予備凍結したGLDを真空凍結乾燥機に入れ、16時間程度処理した。得られた凍結乾燥GLDを細かく粉砕し、粉末化GLDを回収した。尚、該工程の処理前後で活性低下は見られなかった。
実施例1で得られた精製GLDを用いて、前記GLD活性測定法に準じ、2、5、10、20又は40mM D−グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値を図1に示す。その結果、吸光度計を用いたD−グルコース測定において、本発明のGLDを用いてD−グルコースの定量が可能であることが示された。
実施例3で得られたGLDを用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。終濃度が以下の通りになるようにグルコース測定用試薬を作製し、その内1μLをチップ(DEP−chip、バイオデバイステクノロジー社製)上に塗布して乾燥させた。グルコース測定用試薬:33mMリン酸ナリウム緩衝液(pH6.5)、10mMメディエータ、100mM塩化ナトリウム及び1,000U/mL GLD。該チップに、0、5、10、20又は40mMグルコース溶液を2μL添加し、−0.4〜+0.4Vの範囲で印加して、応答電流値を測定した。+0.4V印加時の各グルコース濃度における電流値を図2に示した。その結果、バイオセンサを用いたD−グルコース測定において、本発明のGLDを用いてD−グルコースの定量が可能であることが示された。
Claims (9)
- 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有し酸素を電子受容体としないタンパク質:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列。 - 請求項1記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製し、該ベクターにより形質転換した形質転換細胞を培養して得られる組換え酵素である、請求項1記載のタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
- 請求項5に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用する、溶存酸素の影響を受けないグルコースの測定方法:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列。 - 以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用試薬組成物:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列。 - 以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含む、溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用バイオセンサ:
(a)配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1〜3個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端がSSであるアミノ酸配列;
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつN末端に配列番号8に示される配列を含まないアミノ酸配列;
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列。
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