JP6455714B2 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素 - Google Patents
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Description
[1]以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の類似性を有するアミノ酸配列。
[2]以下の(i)、(ii)、(iii)、(iv)又は(v)からなるポリヌクレオチド:
(i)[1]記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iv)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3][2]に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[4][3]に記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
[5][4]に記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
[6][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
[7][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
[8][1]に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列。
(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。変異数は、好ましくは多くとも60個、55個、50個、40個、30個、20個、15個、10個、5個、3個又は2個である。
(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列。相同性を有するとは、類似性が好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%のアミノ酸配列である。又は同一性が好ましくは少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%又は95%のアミノ酸配列である。
該酵素は、好ましくは(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
(1)作用:電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒する酵素である。
(2)可溶性である。
(i)前記(a)、(b)及び(c)に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。変異数は、好ましくは多くとも10個、8個、5個、3個又は2個である。
(iv)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(v)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
同一性は、GENETYX(ゼネティックス社製)の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたidentityの値に基づく。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)1.00mL、1M D−グルコース溶液1.00mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.14mL及び3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.20mL及び超純水0.61mLを混合し、37℃で10分間保温後、酵素溶液0.05mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出した。この際、酵素活性は、37℃、pH6.0で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義した。
尚、式中の3.0は反応試薬+酵素溶液の液量(mL)、10.8はpH6.0におけるDCIPのモル吸光係数、1.0はセルの光路長(cm)、0.05は酵素溶液の液量(mL)、ΔA600blankは酵素の希釈溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量を表す。
(フラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)の取得)
自然界から分離した菌株からGLD生産菌の探索を行った結果、培養上清にGLD活性がみられた菌株が確認できた。このGLD生産菌由来のグルコース脱水素酵素のクローニングを行った。
パインデックス(松谷化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH6.0に調整し、10mLを太試験管に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記GLD生産菌を接種し、25℃で72時間振とう培養した後、さらしを用いて、湿菌体を回収した。
(1)で取得した湿菌体200mgを−80℃で凍結した後、ISOGENII(ニッポンジーン社製)を用いて100μgの全RNAを抽出した。
(2)で取得したRNAから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAライブラリーを調製した。反応試薬は、「SMARTer RACE cDNA Amplification kit」(タカラバイオ社製)を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子取得用プライマー対を用いてPCRを行った。その結果、GLD遺伝子の内部配列と思われるPCR産物が確認された。尚、前記プライマー対は、本発明者らによって既に解明されていた複数のGLD配列を基に、種々のGLD遺伝子取得用に設計したプライマーである。前記PCR産物を精製し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて、T−vector PMD20(タカラバイオ社製)にライゲーションした。
公知文献1(Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、38、12、831−838、2000)に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用してプラスミドベクターを調製した。最初に、(3)で取得したcDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子を含むPCR産物を取得した。下記のF5126−Ori(配列番号4)及びF5126−R−1st(配列番号5)のプライマー対を使用した。次に、前記PCR産物を鋳型とし、ベクター挿入用のGaGLD遺伝子を調製した。下記のF5126−Ori(配列番号4)及びF5126−R−2nd(配列番号6)のプライマー対を使用した。
5’−(CCGCAGCTCGTCAAA)ATGTCGTTCTCTCGCTCGTC−3’
(括弧内:転写増強因子)
F5126−R−1st(配列番号5):
5’−((GTTCATTTA))GACCTGGCTCTTGATGATATCAGCC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列)
F5126−R−2nd(配列番号6):
5’−((GTTACGCTTCTAGAGCATGCGTTCATTTA))GACCTGGCTC−3’
(二重括弧内:pSENベクター配列、下線部:制限酵素部位(SphI))
(5)で抽出したプラスミドベクターを用いて、公知文献2(Biosci. Biotech. Biochem.,61(8),1367−1369,1997)及び公知文献3(清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、494−502、2000)に記載の方法に準じて、GLDを生産する組換えカビ(アスペルギルス・オリゼ)を作製した。得られた組換え株をCzapek−Dox固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼNS4株を使用した。本菌株は、公知文献2にあるように、1997年(平成9年)に醸造試験所で育種され、現在は、独立行政法人酒類総合研究所で分譲されているものが入手可能である。
パインデックス(松谷化学工業社製)4%(w/v)、脱脂大豆(昭和産業社製)1%(w/v)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)1%(w/v)、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク社製)0.5%(w/v)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.05%(w/v)及び水からなる液体培地をpH7.0に調整し、10mLを太試験管(22mm×200mm)に入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で3日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、前述のGLD活性測定法でGLD活性を測定したところ、本発明のGLD活性が確認できた。
(7)に記載の液体培地150mLを500mL容の坂口フラスコに入れ、121℃、20分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、(6)で取得した形質転換体を植菌し、30℃で3日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成にクロラムフェニコール(ナカライテスク社製)0.005%(w/v)、消泡剤を添加した培地3.5Lを5L容ジャーファーメンターに入れ、121℃、30分間オートクレーブした。冷却した液体培地に、前記種培養液を50mL植菌し、30℃、400rpm、1v/v/mで4日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター(10μm、アドバンテック社製)でろ過して培養上清を回収した。
(本発明のGLDの酵素化学的性質の検討)
実施例1で得られた精製GLDの諸性質を調べた。
(1)吸収スペクトルの測定
実施例1で得られたGLDについて、D−グルコース添加前後の200−700nmにおける吸収スペクトルをプレートリーダー(SpectraMax Plus384、モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。その結果、波長360−380nm付近及び波長450−460nm付近に認められた吸収極大が、D−グルコース添加により消失したことから、本発明のGLDはフラビン結合型タンパク質であることが明らかになった。
1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)0.2mL、1M D−グルコース2.0mL、25mM 4−アミノアンチピリン0.2mL、420mMフェノール0.2mL、1mg/mLペルオキシダーゼ0.2mL及び超純水0.2mLを混合し、混合液0.1mLを96穴プレートに入れ、25℃で5分間保温した。実施例1で得られたGLD0.1mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から5分間、酵素反応の進行に伴う500nmにおける吸光度変化を前記プレートリーダーで測定し、GOD活性を調べた。尚、コントロールは、GLDの代わりに水を添加して反応を開始した。その結果、GLDはコントロールと同様に吸光度変化は見られなかった。
前記GLD活性測定法に準じ、基質に終濃度50mMのD−グルコース、マルトース、D−キシロース又はD−ガラクトースをそれぞれ用いて、各基質に対する各GLDの活性を測定した。結果を表1に示す。
(本発明のGLDによるグルコースの測定)
実施例1で得られたGLDを用いて、前記GLD活性測定法に準じ、20、40、50及び60mM D−グルコースにおける、吸光度変化を測定した。各グルコース濃度における相対活性値を図1に示す。その結果、本発明のGLDでD−グルコースの定量が可能であることが示された。
Claims (8)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のアミノ酸配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素:
(a)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列において1又は多くとも5個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号2又は3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列。 - 以下の(i)、(ii)、(iii)又は(iv)からなるポリヌクレオチド:
(i)請求項1記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)配列番号1に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド;
(iii)配列番号1に示される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(iv)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも90%の同一性を有する塩基配列を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項2記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項3記載のベクターにより形質転換した形質転換細胞。
- 請求項4記載の細胞を培養し、培養物からフラビン結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用するグルコースの測定方法。
- 請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定試薬組成物。
- 請求項1記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコース測定用バイオセンサ。
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