JP4890134B2

JP4890134B2 - ウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ

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Publication number: JP4890134B2
Application number: JP2006198289A
Authority: JP
Inventors: 西矢　　芳昭; 篤志戸田; 高英岸本; 隆雄日▲び▼
Original assignee: FUKUI PREFECTURAL UNIVERSITY; Toyobo Co Ltd
Current assignee: FUKUI PREFECTURAL UNIVERSITY; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2026-07-20
Also published as: JP2008022768A

Description

本発明は、蛋白質工学的改変によりウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ、その製造方法および用途に関する。

ウリカーゼ（EC1.7.3.3）は、尿酸を酸化してアラントインと過酸化水素および二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素であり、臨床診断の分野においては、血中あるいは尿中の尿酸の測定試薬の原料酵素として使用されている。また、化粧品分野においては、染毛剤原料として使用できることが知られている。

ウリカーゼは、微生物、動物などに広く存在することが知られているが、例えばキャンディダ属、エンテロバクター属、セルロモナス属、アースロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属などの微生物が生産するウリカーゼが報告されており、また、これらウリカーゼをコードする遺伝子を単離し、遺伝子工学技術によってウリカーゼの大量生産が可能となることも知られている。
しかしながら、従来のウリカーゼは高度に耐熱性の生物に由来するものではなく、高度に安定なウリカーゼは得られていなかった。

特開昭４２−５１９２号公報特開平５−３１７０５５号公報特公昭６０−１９９９０号公報特許２９７１２８８号公報特開平９−１５４５８１号公報 R.Legouxら，「J.Biol.Chem.」,1992年,第267巻,p8565-8670 K.Yamamotoら，「J.Biochem.」,1996年, 第119巻,第1号,p80-84

本発明の目的は、産業上有用なウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上したウリカーゼ改変体を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、ウリカーゼの蛋白質工学的改変により、安定性が向上した改変型ウリカーゼを得ることに成功し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
（１）改変前のウリカーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、サブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域に位置するアミノ酸の１もしくは数個を欠失、置換もしくは付加することを含む、改変前と比較して、ウリカーゼ活性を有する蛋白質の安定性を向上させる方法。
（２）サブユニットのインターフェースに位置するループ領域が、改変前のウリカーゼ活性を有する蛋白質のT-foldモチーフ構造中のN末端側から３番目と４番目のβストランドをつなぐループ領域であることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、（１）または（２）に記載の方法によって安定性が向上したウリカーゼ改変体。
（４）配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、（１）または（２）に記載の方法によって安定性が向上したウリカーゼ改変体。
（５）配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の２９８位またはそれと同等の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる、（３）または（４）に記載のウリカーゼ改変体。
（６）配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の２９８位のアミノ酸がセリンまたはシステインに置換されているアミノ酸配列からなる、（５）に記載のウリカーゼ改変体。
（７）（３）〜（６）のいずれかに記載のウリカーゼ改変体を含む尿酸測定キット。
（８）（３）〜（６）のいずれかに記載のウリカーゼ改変体を含む尿酸センサー。
（９）（３）〜（６）のいずれかに記載のウリカーゼ改変体をコードする遺伝子。
（１０）（９）に記載の遺伝子を含むベクター。
（１１）（１０）に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
（１２）（１１）に記載の形質転換体を培養することを特徴とするウリカーゼ改変体の製造方法。

本発明により、蛋白質工学的に安定性の向上したウリカーゼを創出することが可能となり、産業利用上有用なウリカーゼ改変体を供給することが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明におけるウリカーゼの改変方法は、ウリカーゼ活性を有する改変前のタンパク質を構成するアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前のタンパク質と比較して、安定性を向上させるものである。本発明における「安定性の向上」とは、改変体（ａ）と改変前の親タンパク質（ｂ）が各々十分に精製され、適当な緩衝液中に溶解された状態で比較した場合の安定性が、（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。「十分に精製された」とは、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ウリカーゼ以外の夾雑タンパク質が見られない状態をいう。「適当な緩衝液」は、ウリカーゼが作用するｐＨ範囲で十分な緩衝能を持つよう、その種類と濃度を選べば特に限定されないが、例えば、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、または、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）などが選択される。診断薬用途などを想定して、緩衝液にはさらに界面活性剤、塩類、キレート剤、防腐剤などを含んでいてもよい。

本発明においては、ウリカーゼの安定性を向上させるために改変する部位として、ウリカーゼ活性を有するタンパク質におけるサブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域に位置するアミノ酸が選択され、これらのアミノ酸１もしくは数個を、欠失・置換もしくは付加することを特徴とする。（ここで、改変の態様は欠失・置換もしくは付加のうち２種以上であってもよい。）ここで「１もしくは数個のアミノ酸」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸数をいう。

ウリカーゼのサブユニットは、共通してT-foldと呼ばれるモチーフの繰り返し構造を有することが知られている。T-foldモチーフは４つのβストランド（以下、N末側からS1,S2,S3,S4とする）と２つのαヘリックスからなる。サブユニット界面に存在するループはトポロジー構造上、S1とS2をつなぐループまたはS3とS4をつなぐループに限定されるが、本発明において好ましくは、S3とS4をつなぐループインターフェースループが選択される。
ウリカーゼの活性中心はサブユニット界面に存在し、このサブユニット界面を形成するのはT-foldモチーフのS1とS4である。このS1とS4を構成するアミノ酸の改変は、ウリカーゼの活性に大きな影響を与えてしまう懸念がある。一方、サブユニット界面に存在するループの安定性は、蛋白質分子の安定性に大きく影響することが予想される。そこで本発明者らは、S3からS4をつないでいるインターフェースループに着目した。実際にこのループの安定性を高めることが予想される、水素結合あるいはジスルフィド結合可能な側鎖を持つアミノ酸残基を変異導入し解析した結果、安定性が向上することが実験的に確認され、本発明を完成させるに至った。

「ループ領域と相互作用する領域」とは、上記のループ領域と、非共有結合的な相互作用（水素結合、疎水性相互作用、静電結合）をしているアミノ酸領域をいう。
改変の対象となるアミノ酸は、好ましくはサブユニットのインターフェースに位置するループ領域から半径１０オングストローム以内に存在するアミノ酸である。

本発明の改変に供されるウリカーゼ活性を有する蛋白質は、バチルス属、キャンディダ属、エンテロバクター属、セルロモナス属、アースロバクター属などの微生物由来のウリカーゼ等が例示されるが、上記のT-foldモチーフ構造を有するものであれば良く、特に限定されるものではない。
具体的には例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＴＢ−９０株に由来するウリカーゼが例示され、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１でそれぞれ示される。これらはいずれも特許第１９６６４８４号公報に記載されている。なお、配列番号２において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。

本発明の改変に供するウリカーゼは、ウリカーゼ活性を有する蛋白質であれば、野生型のものに限らず何らかの改変が施されたものであっても良い。改変としては、例えばアミノ酸を欠失、置換もしくは付加されたもの、分子間または分子内架橋が施されたもの、糖鎖やその他の官能基により化学修飾されたもの、あるいは、ヒスチジンタグが付与されたもの、各種融合蛋白質などが含まれるが、特に限定されない。

本発明のウリカーゼ改変体は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有し、サブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域に位置するアミノ酸の１もしくは数個を欠失、置換もしくは置換または付加されたものである。サブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域に位置するアミノ酸は、好ましくはサブユニットのインターフェースに位置するループ領域から半径１０オングストローム以内に存在するアミノ酸であり、具体的にはウリカーゼの立体構造データより、Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ＳＰＤＢＶ）を使用して定義することができる。
このような改変部位としては、例えば、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＢ−９０株由来のウリカーゼをコードするアミノ酸配列（配列番号２）では、２９８位のアミノ酸が例示される。配列番号２における２９８位のアミノ酸では、特にセリンまたはシステインに置換されてなるものが好ましい。

なお、上記の変換位置は、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＢ−９０株以外の起源に由来するウリカーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列における同等の位置であっても良い。同等の位置かどうかは、一次構造、立体構造、特に、前記のごときウリカーゼのサブユニットに共通するT-fold、βストランド等の類似性についての知見を基に判断することができる。

ウリカーゼの立体構造は、上記バチルス属由来のもの以外に、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）、アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のウリカーゼについてもＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（http://www.rcsb.org/pdb/Welcome.do）などで公開されているが、これまでに安定性を蛋白質工学的に向上させることを示唆する記載はなかった。

本発明者らは、公知のウリカーゼの立体構造より試行錯誤と考察を重ねた結果、サブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域が、ウリカーゼの安定性に影響することを見出した。具体的には該ループ領域の運動性を直接あるいは間接的に変化させることにより、ウリカーゼの安定性を向上させることができることを見出した。一例として、配列番号２の２９８位に位置するアミノ酸を変換することで、ウリカーゼの安定性が向上させることができる。
なお、当業者であれば、上記で例示した２９８位に限らず、該当領域のアミノ酸を適宜選択して変換することで、高い確率で安定性が向上する変異体を取得することが期待できる。

本発明によれば、上記以外の他起源に由来するウリカーゼ活性を有する蛋白質についても、一次構造、立体構造の情報を用いて、変換するアミノ酸を選択し、安定性が向上する改変体を、過度の検討なくして得ることが可能であるが、好ましくは、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するウリカーゼ改変体であり、さらに好ましくは、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するウリカーゼ改変体である。
例えば、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ株由来のウリカーゼは、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＢ−９０株と一次配列上の相同性は２６％と低いことが知られているが（J.Biochem.119,80-84,1996）、立体構造上高い類似性を有しており、本発明を用いてウリカーゼの安定性を向上させることができる。
なお、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ等の市販の遺伝子解析ソフトウェアを利用した２種類の配列のｈｏｍｏｌｏｇｙｓｅａｒｃｈにより検索することができる。

本発明の別の実施態様としては、上記のようにして得られた安定性が向上したウリカーゼ改変体である。本発明のウリカーゼは、尿酸に対する作用性が本質的に維持される限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換・挿入等されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換等されていてもよい。
さらに、本発明のウリカーゼ改変体は、尿酸に対する作用性が本質的に維持される限り、そのアミノ酸配列にヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、あるいは少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質（例えばストレプトアビジンやシトクロム）を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、分子内および／または分子間でジスルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様をも含み得る。または、いくつかの由来の野生型ウリカーゼの断片を組み合わせて構成したキメラ蛋白質も含み得る。

本発明はさらに、ウリカーゼ改変体をコードする遺伝子を含む。本発明のウリカーゼ改変体をコードする遺伝子は、例えば、微生物など種々の起源（由来）より得られる野生型ウリカーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得ることができる。具体的には、例えばバチルス・エスピー（ＴＢ−９０株）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）、アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）、キャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）、セルロモナス・フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ・ｆｌａｖｉｇｅｎａ）などの公知のウリカーゼをコードする遺伝子を利用して作成することができる。
本発明のウリカーゼ改変体をコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウリカーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液（例えば、×６ＳＳＣ、×５デンハルト、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）と５０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列は、前記のストリンジェントな条件下で配列番号１に記載の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列に相当すると考えられる。

本発明のウリカーゼ改変体をコードする遺伝子は、さらに、ウリカーゼの発現を向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ）を変更したものを含み得る。

ウリカーゼをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、あるいは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、あるいはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

本発明はさらに、ウリカーゼ改変体をコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。作製されたウリカーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。

このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ウリカーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。

本発明において、改変前のウリカーゼをコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、遺伝子配列が未知のウリカーゼ生産菌であれば、染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ウリカーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得ることでできる。

遺伝子配列が公知となっているものであれば、ウリカーゼのコードする遺伝子が増幅されるようなプライマーを作成した上で、ＰＣＲ法を用いて遺伝子を取得し、適当なベクターに連結することで、比較的容易にウリカーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを得ることができる。

形質転換を行う宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＤＨ５αなどを用いることができる。得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のウリカーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカー発現する微生物を検索すればよい。

上記の方法により得られたウリカーゼ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読される。また、ウリカーゼのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定される。

このようにして、一度選択されたウリカーゼ遺伝子を保有する組換えベクターより、ウリカーゼ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ウリカーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりウリカーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるウリカーゼ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。

本発明はさらに、ウリカーゼをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を培養することを含むウリカーゼ改変体の製造方法に関する。

例えば上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は菌が成育し、ウリカーゼ改変体を生産する範囲で適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ウリカーゼ改変体が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ウリカーゼ改変体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。

培養物中のウリカーゼ改変体を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ウリカーゼ改変体が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ウリカーゼ改変体含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ウリカーゼ改変体が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤および界面活性剤を添加してウリカーゼ改変体を可溶化し、水溶液として分離採取する。

上記のようにして得られたウリカーゼ改変体含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたウリカーゼ改変体を得ることができる。

例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

上記のようにして得られた精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、実際に使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液などが選択される。また、粉末や溶液状態の酵素に、グルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりウリカーゼ改変体を更に安定化することができる。

本発明のウリカーゼの製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、あるいは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／ＭｕｎｇＢｅａｎＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、あるいはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。

本発明ではその一例として、ウリカーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、サブユニットのインターフェースに位置するループ領域もしくはそのループ領域と相互作用する領域として、配列番号２に記載されるアミノ配列の２９８位を選択し、配列番号１に示されるウリカーゼ活性をコードする遺伝子を改変することで、２９８位のアルギニンがセリンまたはシステインに置換された安定性が向上したウリカーゼ改変体を得た。

本発明の別の一形態は、安定性が向上したウリカーゼを含む尿酸測定キットである。
本発明の別の一形態は、安定性が向上したウリカーゼを含む尿酸測定センサーである。

上記各形態において、本発明のウリカーゼ改変体、尿酸測定用組成物、並びに尿酸測定キットやセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、凍結乾燥粉末など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。

さらに上記各形態において、本発明のウリカーゼ改変体、尿酸測定用組成物、並びに尿酸キットやセンサーは、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤など種々の添加物が加えられていても良い。
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばウリカーゼ改変体を含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液にウリカーゼ改変体を配合する方法、あるいはウリカーゼ改変体と安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。

含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜１０．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。

また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。

一方、上記各形態において、本発明のウリカーゼ改変体、尿酸測定用組成物、並びに尿酸キットやセンサーは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しない構成とすることもできる。
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばＢＳＡ等の生体由来物質が挙げられる。

緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。

また、ウリカーゼ改変体と緩衝剤から基本的に成る組成物に、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。

後述の実施例にも記載されているように、本願発明のウリカーゼ改変体は、改変前のウリカーゼに対して安定性が向上している。このことは、例えば、尿酸測定用臨床検査薬におけるウリカーゼ量を低下させることができ、低コスト化が見込める。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。実施例中、ウリカーゼの活性は、以下のように測定した。試薬はナカライテスク社より購入したものを使用した。

<ウリカーゼ活性測定法>
ウリカーゼ活性は、尿酸を基質とし、ウリカーゼ反応による尿酸の消失を吸光度の変化で測定した。４０μＭの尿酸、０．０００８３％（Ｗ／Ｖ）のトリトンＸ−１００および０．８３ｍＭのＥＤＴＡを含む４２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌを３７℃で５分間予備加温後、予め、酵素希釈液（０．００１％（Ｗ／Ｖ）のトリトンＸ−１００および０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０））で希釈したウリカーゼ溶液０．５ｍｌを加え、反応を開始する。３７℃で正確に５分間反応させた後、２０％（Ｗ／Ｖ）のＫＯＨ水溶液０．２ｍｌを加えて反応を停止させ、２９０ｎｍの吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．５ｍｌを加え、上記同様に操作を行って吸光度を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。得られた吸光度より、下記計算式に基づきウリカーゼの酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの尿酸を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝{ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank）×3.2(ml)×希釈倍率}／{12.2×1.0(cm)×0.5(ml)}
3.2(ml)：全液量
12.2：尿酸を上記測定条件下で測定した時のミリモル吸光係数
1.0cm：セルの光路長
0.5(ml)：酵素サンプル液量

実施例１ウリカーゼ改変体をコードする遺伝子の作製
バチルス・エスピー（ＴＢ−９０株）由来のウリカーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＫＵ１（特許第１９６６４８４号公報）と、配列表の配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２９８番目のアルギニンがシステインに置換されたウリカーゼ改変体をコードする組換えプラスミド（ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｃ）を取得した。
また、上記と同様の手法にて、配列表の配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２９８番目のアルギニンがセリンに置換されたウリカーゼ改変体をコードする組換えプラスミド（ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｓ）を取得した。

実施例２ウリカーゼ改変体の作製
実施例１で取得した組換えプラスミド（ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｓ，ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｃ）を用いて、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｓ)、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｃ)と命名した。５００ｍｌのＴＢ培地を２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル−β−D−チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｌ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｓ)またはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９(ｐＵＯＤ−Ｒ２９８Ｃ)の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５５℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサオエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品（Ｒ２９８Ｓ，Ｒ２９８Ｃ）を得た。本方法により得られたこれらの標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。

比較例１野生型ウリカーゼの作製
ウリカーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＫＵ１を用いて、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換して、形質転換体を取得した。該形質転換体より、実施例２の方法と同様にして培養および精製を行い、野生型ウリカーゼの精製酵素標品を取得した。本方法により得られた標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。

実施例３ウリカーゼ改変体の安定性評価
実施例２で取得したウリカーゼ改変体および比較例１で取得した野生型ウリカーゼの各精製酵素標品の安定性を測定した。結果として、図１に示すように、５分間の処置で８０％以上の残存活性を有する温度は、野生型酵素が６５℃までであった。これに対し、改変型酵素では、Ｒ２９８Ｓが７０℃まで安定であり、更にＲ２９８Ｃは８５℃まで安定であった。従って、改変前と比べて安定性が向上していることが確認された。
更に、７０℃および６５℃におけるＲ２９８Ｃの熱安定性を野生型ウリカーゼと詳細に比較した。結果を図２に示す。野生型ウリカーゼはそれぞれの温度で６０分間処理すると速やかに失活するが、Ｒ２９８Ｃの活性は高いレベルで保持された。

本発明によって、ウリカーゼ活性を有する蛋白質を蛋白質工学的手法により改変する方法を提供し、安定性の向上したウリカーゼ改変体を供給することが可能となった。本発明のウリカーゼ改変体は、例えば、尿酸測定用臨床検査薬用原料酵素に適用することで、該試薬のコスト低減に貢献することができる。

図１は、本発明ウリカーゼ改変体と野生型ウリカーゼの各精製酵素標品の安定性評価結果を示す。●；本発明ウリカーゼ改変体（Ｒ２９８Ｃ）、▲；本発明ウリカーゼ改変体（Ｒ２９８Ｓ）、○；野生型ウリカーゼ図２は、本発明ウリカーゼ改変体と野生型ウリカーゼの（ａ）７０℃および（ｂ）６５℃における安定性評価結果を示す。●；本発明ウリカーゼ改変体（Ｒ２９８Ｃ）、○；野生型ウリカーゼ

Claims

配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の２９８位のアミノ酸がセリンまたはシステインに置換されているアミノ酸配列からなる、ウリカーゼ改変体。
請求項１に記載のウリカーゼ改変体を含む尿酸測定キット。
請求項１に記載のウリカーゼ改変体を含む尿酸センサー。
請求項１に記載のウリカーゼ改変体をコードする遺伝子。
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とするウリカーゼ改変体の製造方法。