JP5162870B2 - 安定なnadhデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Description
NADHデヒドロゲナーゼは、微生物、動物などに広く存在することが知られているが、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)などの微生物が生産するNADHデヒドロゲナーゼが報告されており、また、これらのNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離し、遺伝子工学技術によってNADHデヒドロゲナーゼの大量生産が可能となることも知られている。
しかしながら、従来のNADHデヒドロゲナーゼは重金属等の一般的な酵素の安定性に悪影響を与えるケミカルに対して安定なものが知られておらず、高度に安定なNADHデヒドロゲナーゼは得られていなかった。
すなわち本発明は、以下のような構成からなるものである。
[項1]
下記の理化学的性質を有するNADHデヒドロゲナーゼ。
・ 下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox) ⇒ NAD++ Acceptor(red)
・ 20U/ml以上の酵素濃度で80℃、30分間処理後も50%以上の活性が残存する。
・ 2mMの銀イオン、水銀イオン存在下で25℃、30分間処理後も60%以上の活性が残存する。
[項2]
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、項1記載のNADHデヒドロゲナーゼ。
・ トリトンX−100、ブリジ35、ツイーン20、スパン20から選ばれる少なくとも1種の非イオン系界面活性剤存在下にて、20%以上の活性の上昇が認められる。
[項3]
下記の理化学的性質を有することを特徴とする、項1または2記載のNADHデヒドロゲナーゼ。
・ 反応至適pH:7.5
・ 反応至適温度:40℃
・ pH安定性:6〜9で80%以上活性残存
[項4]
アミノ末端の5残基のアミノ酸配列が、「Ala-Lys-Val-Leu-Tyr」であることを特徴とする、項1〜3のいずれかに記載のNADHデヒドロゲナーゼ。
[項5]
配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる、項1〜4のいずれかに記載のNADHデヒドロゲナーゼ。
[項6]
配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれかに記載のNADHデヒドロゲナーゼ。
[項7]
項1〜6のいずれか1項に記載のNADHデヒドロゲナーゼを含む試薬キット。
[項8]
項1〜6のいずれか1項に記載のNADHデヒドロゲナーゼを含むセンサー。
[項9]
項1〜6のいずれか1項に記載のNADHデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
[項10]
項9に記載の遺伝子を含むベクター。
[項11]
項10に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項12]
項11に記載の形質転換体を培養することを特徴とするNADHデヒドロゲナーゼの製造方法。
(a)下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox) ⇒ NAD++ Acceptor(red)
(b)20U/ml以上の酵素濃度で80℃、30分間処理後も50%以上の活性が残存する。
(c)2mMの銀イオン、水銀イオン存在下で25℃、30分間処理後も60%以上の活性が残存する。
(d)トリトンX−100、ブリジ35、ツイーン20、スパン20から選ばれる少なくとも1種の非イオン系界面活性剤存在下にて、20%以上の活性の上昇が認められる。
更に、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
(e)反応至適pH:7.5
(f)反応至適温度:40℃
(g)pH安定性:6〜9で80%以上活性残存
NADHデヒドロゲナーゼ活性は、2,4−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)を基質とし、NADHデヒドロゲナーゼ反応によるDCPIPの還元を600nmにおけるDCPIPの吸光度の減少で測定した。0.2mMのNADHを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)2.8mlを25℃で5分間予備加温後、1.2mMのDCPIP水溶液を0.1ml添加し、次いで、予め、酵素希釈液(200mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5))で希釈したNADHデヒドロゲナーゼ溶液0.1mlを加え、反応を開始する。25℃で10秒毎に600nmの吸光度の減少を3〜4分間測定する(ΔODtest)。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液0.1mlを加え、上記同様に操作を行って吸光度を測定した(ΔODblank)。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきNADHデヒドロゲナーゼの酵素活性を算出した。
尚、上記条件で1分間に600nmの吸光度を1.0減少させる酵素量を1単位(U)とする。
計算式
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×希釈倍率}/{1.0×0.1(ml)}=ΔOD/min×10×希釈倍率
1.0:活性定義に基づいて定められた600nmにおける単位吸光度
バチルス・ズブチリスを遺伝子給源として用い、データベース上でエシェリヒア・コリーのNADHデヒドロゲナーゼと31%の相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子(yvaB)について検討を進めた。より具体的には、バチルス・ズブチリスIFO14144(Tryptophan auxotroph of Marburg168:NBRCより入手可能)のゲノムDNAを、MagExtractor−Genome−(東洋紡績製)を用いてプロトコール通りに抽出し、PCRの鋳型とした。プライマーは、配列表の配列番号3記載の合成オリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号4記載の合成オリゴヌクレオチドを用い、DNAポリメラーゼはKOD−Plus(東洋紡績製)を使用し、プロトコール通りのサイクルで、ABI9700サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ製)にてPCRを実施し、yvaB遺伝子を取得した。更に、得られたPCR産物を、クローニングキットTAgetClone−Plus(東洋紡績製)を用いて、そのプロトコールに従ってクローニング操作を行い、更に塩基配列を決定して、組換えプラスミド(pBSUDAD1)を取得した。
得られたpBSUDAD1にてエシェリヒア・コリーDH5α(東洋紡績製)を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーDH5α(pBSUDAD1)を作成した。エシェリヒア・コリーDH5α(pBSUDAD1)を、LB培地にて37℃で一晩培養したところ、NADHデヒドロゲナーゼの活性が確認された。
実施例1で取得した形質転換体エシェリヒア・コリーDH5α(pBSUDAD1)を、100μl/mlのアンピシリンを含むLB培地で予め30℃、16時間培養した。50mlのTB培地を500mL容坂口フラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が100μg/mlになるように添加した。この培地に、エシェリヒア・コリーDH5α(pBSUDAD1)の培養液を1%(2ml)接種し、37℃で6時間通気攪拌培養後、イソプロピル−β−D−チオガラクトシドを終濃度が0.1mMになるように添加し、37℃で更に18時間通気攪拌培養を行った。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、超音波破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、45℃、30分間の加温処理後、セファデックスG−25で脱塩処理を行った。更にDEAEセファロースCL−6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、セファクリルS−300(GEヘルスケアバイオサイエンス製),およびブルーセファロース(GEヘルスケアバイオサオエンス製)の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製NADHデヒドロゲナーゼ標品を得た。本方法により得られたこれらの標品は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
実施例2で取得したNADHデヒドロゲナーゼ精製標品の安定性を測定した。60℃および80℃で30分間処理における残存活性と酵素濃度との関係について、それぞれデータを取得した。結果として、図1に示すように、80℃、30分間の処理でも20U/ml以上の酵素濃度であれば50%以上の残存活性を有することが確認された。
更に、各種金属存在下でのNADHデヒドロゲナーゼの安定性を測定した。2mMの金属塩存在下で25℃、30分間処理後の残存活性を調べた結果を、表1に示す。本発明のNADHデヒドロゲナーゼは、銀(Ag)や水銀(Hg)といった通常の酵素が失活し易い重金属の存在下で、高い安定性を示した。
このように、全く予期せぬことに、yvaBがコードするNADHデヒドロゲナーゼは、20U/ml以上の酵素濃度で80℃、30分間処理後も50%以上の残存活性を示し、更には2mMの銀イオン、水銀イオン存在下で25℃、30分間処理後も60%以上の残存活性を示すことが判明した。常温菌であるバチルス・ズブチリスより、このような高い安定性を示す酵素が得られることは予想外であり、想定し得ない結果であった。また、yvaBがコードするNADHデヒドロゲナーゼは、トリトンX−100、ブリジ35、ツイーン20、スパン20から選ばれる少なくとも1種の非イオン系界面活性剤存在下にて、20%以上の活性の上昇が認められ、これも想定し得ない結果であった。
Claims (3)
- 配列表の配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ、以下の(1)〜(4)のいずれかに記載の特性を有するNADHデヒドロゲナーゼを含む、試薬キットまたはセンサー用の組成物。
(1)下記の(a)〜(c)に記載の理化学的性質を有する。
(a)下記の反応を触媒する。
NADH + H+ + Acceptor(ox) ⇒ NAD+ + Acceptor(red)
(b)20U/ml以上の酵素濃度で80℃、30分間処理後も50%以上の活性が残存する。
(c)2mMの銀イオン、水銀イオン存在下で25℃、30分間処理後も60%以上の活性が残存する。
(2)上記(1)に記載の理化学的性質を有し、さらに、下記の(d)の理化学的性質を有する。
(d)トリトンX−100、ブリジ35、ツイーン20、スパン20から選ばれる少なくとも1種の非イオン系界面活性剤存在下にて、20%以上の活性の上昇が認められる。
(3)上記(1)または(2)に記載の理化学的性質を有し、さらに、下記の(e)〜(g)の理化学的性質を有する。
(e)反応至適pH:7.5
(f)反応至適温度:40℃
(g)pH安定性:pH6〜9で80%以上活性残存
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の理化学的性質を有し、さらに、下記の(h)の理化学的性質を有する。
(h)アミノ末端の5残基のアミノ酸配列が、「Ala−Lys−Val−Leu−Tyr」である。 - 請求項1に記載の組成物を含む試薬キット。
- 請求項1に記載の組成物を含むセンサー。
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