CN101194016B - 尿酸氧化酶的变体形式及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有尿酸分解活性的遗传修饰蛋白质。更具体的说，本发明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白质及其生产方法，包括包含截短的尿酸氧化酶的PEG化蛋白质。

Description

尿酸氧化酶的变体形式及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年4月11日提交的美国临时申请系列号60/670,541的优先权和权益，该临时申请的公开内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及遗传修饰的具有尿酸分解活性的蛋白质。更具体的说，本发明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白质及其生产方法。
发明背景
术语尿酸氧化酶(urate oxidase)和尿酸酶(uricase)在本文中可互换使用。尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)这种酶能催化尿酸氧化成更具可溶性的产物尿囊素，尿囊素是更容易排泄的嘌呤代谢物。人不产生有酶活性的尿酸酶，这是因为在高等灵长类的进化过程中获得的尿酸酶基因的几个突变所致。Wu，X等，(1992)J Mol Evol 34：78-84，该文献通过引用整体结合到本文中。因此，在易感个体中，血液中过量浓度的尿酸(高尿酸血症)会导致疼痛性关节炎(痛风)、毁形性尿酸沉积(结节瘤)和肾衰竭。在一些受侵害个体中，可用的药物如别嘌醇(尿酸合成的抑制剂)会产生治疗限制性副作用，或者不能充分减轻这些病症。Hande，KR等，(1984)Am J Med76：47-56；Fam，AG，(1990)Bailliere’s Clin Rheumatol 4：177-192，每个文献通过引用整体结合到本文中。尿酸酶注射能减少高尿酸血症和高尿酸尿症，至少是短暂地减少。由于尿酸酶在人体中是异种蛋白，在某些百分比的受治疗患者中，即使是第一次注射来自黄曲霉(Aspergillus flavus)的未修饰蛋白质就会引起过敏反应(Pui，C-H等，(1997)Leukemia 11：1813-1816，该文献通过引用整体结合到本文中)，免疫应答限制其用于长期或间歇治疗的效用。Donadio，D等，(1981)Nouv Presse Med 10：711-712；Leaustic，M等，(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic 50：553-554，每个文献通过引用整体结合到本文中。
本发明涉及发生截短和结构稳定性增强的突变重组尿酸酶蛋白。
发明概述
本发明的目的是提供新型的重组尿酸酶蛋白。所设想的本发明蛋白质相对于天然尿酸酶蛋白是截短的，且具有突变的氨基酸。
本发明提供包含SEQ ID NO.8氨基酸序列的突变重组尿酸酶。还提供包含SEQ ID NO.13氨基酸序列的突变重组尿酸酶。
本发明的另一个目的是提供代谢尿酸的方法，所述方法包括给予具有尿酸分解活性的新型重组尿酸酶蛋白。尿酸分解活性在本文中用以指尿酸向尿囊素的酶促转化。
在一个实施方案中，尿酸酶包含SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.12的8位至287位的氨基酸序列。本发明还提供了包含SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13的氨基酸序列的尿酸酶。在一个实施方案中，尿酸酶包含氨基末端氨基酸，其中氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在一个特别实施方案中，氨基末端氨基酸是甲硫氨酸。
本发明还提供分离的核酸，其包含编码本发明尿酸酶的核酸序列。在一个具体实施方案中，编码尿酸酶的核酸有效连接到异源启动子，例如osmB启动子。本发明还提供包含尿酸酶编码核酸的核酸载体和包含这种载体的宿主细胞，以及产生尿酸酶的方法，所述方法包括在所述核酸序列得以被宿主细胞表达的条件下培养宿主细胞以及分离表达的尿酸酶的步骤。
附图简述
图1说明质粒pOUR-P-ΔN-ks-1的结构。限制位点旁的数字表示核苷酸位置，该位置相对于指定为1的HaeII位点而言。在克隆过程中丢失的限制位点在括号中标出。
图2显示猪-KS-ΔN尿酸酶的DNA和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.7)。图2中的氨基酸编号是相对于完全猪尿酸酶序列进行的。在起始密码子甲硫氨酸残基之后，苏氨酸置换猪尿酸酶序列中的天冬氨酸7。指出了用于亚克隆的各个步骤的限制位点。3′非翻译序列用小写字母显示。翻译终止密码子由星号表示。
图3显示各种重组猪(SEQ ID NO.11)、PBC-ΔNC(SEQ ID NO.12)和猪-KS-ΔN(SEQ ID NO.7)尿酸酶序列的推导氨基酸序列的相对比对。星号表示与公开的猪尿酸酶序列相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置；圆圈表示与PBC-ΔN相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置。虚线表示氨基酸的缺失。
图4显示根据实施例1-3产生的猪尿酸酶和高度纯化尿酸酶变体的SDS-PAGE。每个样品的生产日期(月/年)和相关泳道号码在下方的图例(key)中表示。Y轴标以分子量标记物的重量标记，图的顶部标以泳道号码。各泳道如下：泳道1-分子量标记；泳道2-猪KS-ΔN(7/98)；泳道3-猪(9/98)；泳道4-猪KS(6/99)；泳道5-猪KS(6/99)；泳道6-猪-ΔN(6/99)；泳道7-猪KS-ΔN(7/99)；泳道8-猪KS-ΔN(8/99)。
图5描绘PEG化(9×10kD)猪-KS-ΔN尿酸酶在大鼠中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU＝毫吸光度单位)代表每1μl血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。
图6描绘PEG化(9×10kD)猪-KS-ΔN尿酸酶在兔中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU＝毫吸光度单位)代表每1μl血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。
图7描绘PEG化(9×10kD)猪-KS-ΔN尿酸酶在犬中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU＝毫吸光度单位)代表每1μl血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。
图8描绘PEG化(9×10kD)猪-KS-ΔN尿酸酶在猪中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU＝毫吸光度单位)代表每1μl血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。
发明详述
先前的研究教导，当通过PEG化实现尿酸酶免疫原性和/或抗原性的显著降低时，总是伴随着尿酸分解活性的明显损失。生物药物的安全性、方便性和成本效益都受到其功效下降和由此所致的需要增加给药剂量的不利影响。因此，需要有安全有效的用以降低身体流体(包括血液)中高水平尿酸的替代方法。本发明提供突变重组尿酸酶，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13。
本文所用的尿酸酶包括单个亚单位以及四聚体，除非另有指明。
在一个具体实施方案中，尿酸酶有氨基末端甲硫氨酸。该甲硫氨酸可通过翻译后修饰除去。在具体实施方案中，氨基末端甲硫氨酸在尿酸酶产生后除去。在具体的实施方案中，甲硫氨酸通过内源性细菌氨基肽酶除去。倒数第二个氨基酸可以是允许细菌甲硫氨酸氨基肽酶除去N-末端甲硫氨酸的氨基酸。允许N-末端甲硫氨酸得以最完全地除去的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在一个具体的实施方案中，尿酸酶包含两个氨基末端氨基酸，其中两个氨基末端氨基酸是甲硫氨酸和紧接其后的选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸。
本发明提供编码尿酸酶的核酸序列。
本发明提供包含该核酸序列的载体。
在一个具体的实施方案中，尿酸酶是分离的。在一个具体的实施方案中，尿酸酶是纯化的。在具体的实施方案中，尿酸酶是分离且纯化的。
本发明提供包含载体的宿主细胞，该载体包含编码尿酸酶的核酸序列。
本发明提供编码尿酸酶的核酸序列的产生方法，包括通过PCR(聚合酶链反应)技术修饰编码尿酸酶的核酸序列。本领域技术人员知道，所需要的核酸序列籍合成寡核苷酸引物通过PCR制备，这些引物与待扩增的靶DNA(每条链一个)的各区域互补。在过量的脱氧核苷酸和Taq聚合酶(一种热稳定DNA聚合物)存在下，将引物加入到靶DNA(不需要是纯的)中。在一系列(通常30个)温度循环中，靶DNA反复进行变性(90℃左右)，与引物退火(通常在50-60℃)和从引物延伸出子链(72℃)。由于子链本身能充当后续各循环的模板，与两种引物匹配的DNA片断以指数方式而不是线性方式得到扩增。
本发明提供产生突变重组尿酸酶的方法，所述方法包括用该载体转染宿主细胞，其中所述宿主细胞表达该尿酸酶，从宿主细胞分离突变重组尿酸酶，用例如色谱技术分离出纯化的突变重组尿酸酶，和纯化该突变重组尿酸酶。例如，可按照国际专利出版物WO 00/08196和美国专利申请第60/095,489号(其通过引用整体结合到本文中)描述的方法制备该尿酸酶。
在一个优选的实施方案中，处理宿主细胞以导致突变重组尿酸酶的表达。本领域技术人员知道，用载体转染细胞通常用钙离子沉淀的DNA来实现，不过也可使用各种其它方法(例如电穿孔)。
该尿酸酶可通过本领域技术人员公知的任何方法进行分离和/或纯化。本发明的表达多肽通常分离成基本上纯的形式。优选地，该多肽分离至纯度为至少80％重量，更优选至纯度为至少95％重量，最优选至纯度为至少99％重量。一般来说，这种纯化可用例如硫酸铵分级分离、SDS-PAGE电泳和亲和层析的标准技术来实现。该尿酸酶优选按照2005年4月11日提交的共同待审美国专利申请(申请号为60/670,520，代理人案号为103864.146644，标题为“用阳离子型表面活性剂纯化蛋白质”，其通过引用整体结合到本文中)中描述的方法，用阳离子型表面活性剂例如氯化十六烷基吡啶
Figure 2006800206898_0
(CPC)来分离。
在本发明的一个实施方案中，载体在渗透压敏感启动子的控制之下。启动子是DNA的一个区域，RNA聚合酶在启动DNA向RNA的转录之前与它结合。渗透压敏感启动子由于细胞所感受到的渗透压的增加而启动转录。
本发明的尿酸酶包含与聚合物缀合的尿酸酶，例如缀合至聚乙二醇的尿酸酶，即PEG化尿酸酶。
在本发明的一个实施方案中，提供包含该尿酸酶的药物组合物。在一个实施方案中，该组合物是尿酸酶的溶液。在一个优选的实施方案中，该溶液是无菌的，适合于注射。在一个实施方案中，这种组合物包含作为磷酸缓冲盐水溶液的尿酸酶。在一个实施方案中，该组合物在小瓶中提供，该小瓶任选具有橡胶注射塞。在具体的实施方案中，该组合物包含在溶液中的尿酸酶，溶液浓度为2-16毫克尿酸酶每毫升溶液、4-12毫克尿酸酶每毫升溶液或6-10毫克尿酸酶每毫升溶液。在一个优选的实施方案中，该组合物包含浓度为8毫克每毫升溶液的尿酸酶。优选地，尿酸酶的质量相对于蛋白质质量来测量。
本发明组合物的有效给药方案可由本领域技术人员来确定。评估给定方案的有效性的合适指标是本领域技术人员所熟知的。这种指标的实例包括血浆尿酸水平(PUA)的正常化或降低，和PUA降低或维持在6.8mg/dL或以下，优选6mg/dL或以下。在一个优选的实施方案中，接受本发明组合物处理的受试者在总治疗时间的至少70％、至少80％或至少90％中，其PUA为6mg/dL或以下。例如，对于24周的治疗时间，受试者优选在24周治疗时间的至少80％中，即在至少等于134.4天(24周×7天/周×0.8＝134.4天)的时间中，其PUA为6mg/dL或以下。
在具体的实施方案中，每2-4周给予一次0.5-24mg的尿酸酶溶液。尿酸酶可用本领域技术人员公知的任何适当方式给予，例如静脉内、肌肉内或皮下给予。优选地，当进行静脉内给予时，给予0.5mg-12mg的尿酸酶。优选地，当进行皮下给予时，给予4mg-24mg的尿酸酶。在一个优选的实施方案中，尿酸酶通过静脉输注在30-240分钟时间内给予。在一个实施方案中，每两周给予一次8mg尿酸酶。在具体的实施方案中，输注可用100-500mL的盐水溶液来进行。在一个优选的实施方案中，每2周一次或每4周一次在120分钟时间里给予8mg的尿酸酶溶液；优选该尿酸酶溶于250mL盐水溶液中进行输注。在具体的实施方案中，尿酸酶给予在3个月、6个月、8个月或12个月的治疗时间里进行。在其它实施方案中，治疗时间是12周、24周、36周或48周。在一个具体的实施方案中，治疗时间是长时间治疗，例如2年或更长时间，直至受治疗的受试者的一生。另外，可采用穿插不治疗时间的多个治疗周期，例如6个月的治疗后是3个月的不治疗，接着又是6个月的治疗，等等。
在某些实施方案中，可将抗炎化合物进行预防性给予，以消除或减少因给予尿酸酶引起的输注反应的出现。在一个实施方案中，如此给予至少一种皮质类固醇、至少一种抗组胺剂、至少一种NSAID或它们的组合。可用的皮质类固醇包括倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松和曲安西龙。可用的NSAID包括布洛芬、吲哚美辛、萘普生、阿司匹林、乙酰氨基酚、塞来考昔和伐地考昔。可用的抗组胺剂包括阿扎他定、溴苯那敏、西替力嗪、氯苯那敏、氯马斯汀、赛庚啶、地氯雷他定、右氯苯那敏、茶苯海明、苯海拉明、多西拉敏、非索非那定、羟嗪、氯雷他定和苯茚胺。
在一个优选的实施方案中，抗组胺剂是非索非那定，NSAID是对乙酰氨基酚，皮质类固醇是氢化可的松和/或泼尼松。优选地，在输注尿酸酶溶液前给予所有三类的组合(不一定伴随在一起)。在一个优选的实施方案中，在尿酸酶输注前1-4小时口服给予NSAID和抗组胺剂。非索非那定的合适剂量包括约30至约180mg、约40至约150mg、约50至约120mg、约60至约90mg、约60mg，优选60mg。对乙酰氨基酚的合适剂量包括约500至约1500mg、约700至约1200mg、约800至约1100mg、约1000mg，优选1000mg。氢化可的松的合适剂量包括约100至约500mg、约150至约300mg、约200mg，优选200mg。在一个实施方案中，抗组胺剂不是苯海拉明。在另一个实施方案中，NSAID不是对乙酰氨基酚。在一个优选的实施方案中，在尿酸酶输注前一天晚上口服给予60mg非索非那定；在第二天早上口服给予60mg非索非那定和1000mg对乙酰氨基酚，最后，在就要输注尿酸酶溶液前给予200 mg氢化可的松。在一个实施方案中，在给予尿酸酶前一天、优选在晚上给予泼尼松。泼尼松的适当剂量包括5-50mg，优选20mg。在某些实施方案中，将这些用于消除或减少输注反应出现的预防性治疗应用于接受或将要接受尿酸酶(包括PEG化尿酸酶和非PEG化尿酸酶)的受试者。在具体的实施方案中，将这些预防性治疗应用于接受或将要接受接受尿酸酶之外的治疗性肽的受试者，其中所述其它治疗性肽是PEG化的或非PEG化的。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含已与聚合物缀合的尿酸酶，该修饰的尿酸酶保持尿酸分解活性。在一个优选实施方案中，尿酸酶为PEG化的尿酸酶。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含已通过与聚合物缀合进行修饰的尿酸酶，该修饰的尿酸酶保持尿酸分解活性。在一个具体的实施方案中，聚合物-尿酸酶缀合物按国际专利出版物WO01/59078和美国专利申请第09/501730号(它们通过引用整体结合到本文中)的描述进行制备。
在本发明的一个实施方案中，聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚丙二醇、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。在一个优选实施方案中，聚合物是聚乙二醇，尿酸酶是PEG化尿酸酶。
在本发明的实施方案中，该组合物在每个尿酸酶亚单位上包含2-12个聚合物分子，优选每个尿酸酶亚单位3-10个聚合物分子。在本发明的一个实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约1kD至约100kD之间。
在本发明的另一个实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约1kD至约50kD之间。在本发明的一个优选实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约5kD至约20kD之间、约8kD至约15kD之间、约10kD至约12kD之间，优选约10kD。在一个优选的实施方案中，每个聚合物分子的分子量为约5kD或约20kD。在本发明一个特别优选的实施方案中，每个聚合物分子的分子量为10kD。
在本发明的一个实施方案中，该组合物适合于反复给予。
本发明提供用尿酸酶代谢尿酸的方法。
本发明提供尿酸酶的组合物用于减少生物流体中的尿酸水平的用途。
在本发明的一个实施方案中，将尿酸酶的组合物用于减少包括血液的生物流体中的尿酸水平。
本发明还提供编码本发明尿酸酶的新型核酸分子。导致这些核酸分子产生的操作是本领域技术人员公知的。例如，尿酸酶核酸序列可通过任何本领域公知的多种策略进行修饰(Maniatis，T.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。该序列可在体外用限制性内切核酸酶在适当位点进行切割，然后如有需要进一步进行酶促修饰，分离，连接。在产生编码尿酸酶的基因时，应注意确保修饰的基因保持在适当的翻译阅读框当中，不被翻译终止信号所间断。
可将编码尿酸酶蛋白的核苷酸序列插入到适当的表达载体，即含有插入的蛋白质编码序列的转录和翻译必需元件的载体。可利用各种宿主-载体系统来表达蛋白质编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)转染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)转染的昆虫细胞系统；微生物如含酵母载体的酵母或用噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA转化的细菌。这些载体的表达元件其强度和特异性各不相同。取决于所采用的宿主-载体系统，可使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一种。
可使用任何公知用以将DNA片断插入到载体中的方法，来构建含有由适当转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。编码尿酸酶蛋白的核酸序列的表达可通过第二种核酸序列来调节，使得尿酸酶蛋白在用重组DNA分子转化的宿主中得到表达。例如，尿酸酶的表达可通过本领域公知的任何启动子/增强子元件来控制。可用来控制尿酸酶表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、Rous肉瘤病毒的3′长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1 44-1445)、金属硫蛋白(metallothionine)基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；原核生物表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)、tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)和osmB启动子。在具体的实施方案中，核酸包含有效连接到异源启动子的尿酸酶编码核酸序列。
一旦制备和分离出包含尿酸酶编码核酸序列的特定重组DNA分子，可用本领域公知的几种方法来使它增殖。一旦确立了合适的宿主系统和生长条件，可大量增殖和制备重组表达载体。如前文所说明，可使用的表达载体包括但不限于以下载体或其衍生物：人或动物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ噬菌体)、质粒和黏粒DNA载体，在此仅举几例。
另外，可选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或者以所需的特定方式修饰或加工基因产物。在某些诱导物的存在下可提高来自某些启动子的表达；由此，遗传工程改造的尿酸酶蛋白的表达可得以控制。此外，不同的宿主细胞对蛋白质翻译以及翻译后加工和修饰(例如糖基化、切割)具有特征性和特异性的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统来确保所需的对所表达异种蛋白的修饰和加工。不同的载体/宿主表达系统可实现不同程度的加工反应如蛋白水解切割。
在本发明的具体实施方案中，尿酸酶在大肠杆菌中的表达优选用包含osmB启动予的载体来进行。
实施例
实施例1.用于尿酸酶表达的基因和表达质粒的构建
将重组猪尿酸酶(尿酸氧化酶)、猪-KS-ΔN(氨基末端截短的猪尿酸酶蛋白，氨基酸291和301分别用赖氨酸和丝氨酸置换)在大肠杆菌K-12株W3110 F-中表达。构建终止于pOUR-P-ΔN-ks-1的一系列质粒，它们在大肠杆菌宿主细胞的转化时能够指导尿酸酶的有效表达。
从猪和狒狒肝脏分离和亚克隆尿酸酶cDNA
通过相关RNA的分离和亚克隆从猪和狒狒肝脏制备尿酸酶cDNA。从猪和狒狒肝脏提取总细胞RNA(Erlich，H.A.(1989).PCRTechnology；Principles and  Application for DNA  Amplification；Sambtook，J.等(1989).Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition；Ausubel，F.M.等  (1998).Current protocols in molecularBiology)，然后用首链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)进行反转录。用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，Life Technologies)进行PCR扩增。
用于猪和狒狒尿酸氧化酶(尿酸酶)的PCR扩增的合成寡核苷酸引物在表1中显示。
表1.尿酸酶cDNA的PCR扩增用引物
Figure 2006800206898A00800011
在各引物的末端引入的、在表1中用小写字母显示的限制性内切核酸酶序列为正义EcoRI和NcoI(猪和狒狒)及反义NcoI、HindIII和XbaI(猪)、XbaI和NcoI(狒狒)。在狒狒正义引物中，存在于狒狒尿酸酶中的第三密码子GAC(天冬氨酸)被CAC(组氨酸)置换，CAC密码子存在于人尿酸氧化酶假基因的编码序列中的这个位置。用这些引物产生的重组狒狒尿酸酶构建物命名为D3H狒狒尿酸酶。
将猪尿酸酶PCR产物用EcoRI和HindIII消化并克隆到pUC18中，产生pUC18-猪尿酸酶。将D3H狒狒尿酸酶PCR产物用TACloningTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)直接克隆到pCRTMII载体中，产生pCRTMII-D3H狒狒尿酸。
用连接的cDNA转化大肠杆菌XL1-Blue株(Stratagene，La Jolla，CA)。制备含有克隆的尿酸酶cDNA的质粒DNA，选择并分离出具有公开的尿酸酶DNA编码序列(除表1所示的狒狒尿酸酶中的D3H置换外)的克隆。在所选出的pCRTMII-D3H狒狒尿酸酶克隆中，pCRTMII序列邻接尿酸酶终止密码子，这由PCR引入的序列缺失所致。因此，3′非翻译区的XbaI和NcoI限制位点被消除，从而使得可以用PCR产物5′末端的NcoI和衍自pCRTMII载体的BamHI进行定向克隆。
尿酸酶cDNA向pET表达载体中的亚克隆
狒狒尿酸酶亚克隆
将含有全长尿酸酶编码序列的D3H狒狒cDNA引入到pET-3d表达载体(Novagen，Madison，WI)中。用NcoI和BamHI消化pCRTMII-D3H狒狒尿酸酶，分离960bp片断。用NcoI和BamHI消化表达质粒pET-3d，分离4600bp片断。将两个片断连接，产生pET-3d-D3H-狒狒。
猪-狒狒嵌合尿酸酶亚克隆
构建猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶，以获得重组基因的更高表达、稳定性和活性。这样构建PBC：从pET-3d-D3H-狒狒克隆分离出4936bp NcoI-ApaI片断，将分离的片断与从pUC18-猪尿酸酶分离的624bpNcoI-ApaI片断连接，导致pET-3d-PBC的形成。PBC尿酸酶cDNA由猪尿酸酶密码子1-225和框内连接的狒狒尿酸酶密码子226-304组成。
猪-KS尿酸酶亚克隆
构建猪-KS尿酸酶，以加入一个赖氨酸残基，该残基可提供另外的PEG化位点。KS指猪尿酸酶291位处赖氨酸置换精氨酸(R291K)的氨基酸插入。另外，301位的苏氨酸被丝氨酸置换(T301S)。如下构建猪KS尿酸酶质粒：分离pET-3d-D3H-狒狒的4696bp NcoI-NdeI片断，然后将其与从pU18C-猪尿酸酶分离的864bp NcoI-NdeI片断连接，导致pET-3d-猪KS的形成。所得的猪KS尿酸酶序列由猪尿酸酶密码子1-288和框内连接的狒狒尿酸酶密码子289-304组成。在osmB启动予调节下的尿酸酶序列的亚克隆
将尿酸酶基因亚克隆到含有osmB启动子的表达载体中(按照美国专利第5,795,776号的教导，该专利通过引用整体结合到本文中)。这个载体能够响应高渗透压或培养物衰老而诱导蛋白质表达。表达质粒pMFOA-18含有osmB启动子、核糖体结合位点序列(rbs)和转录终止子序列(ter)。它赋予氨苄青霉素抗性(AmpR)和表达重组人乙酰胆碱酯酶(AChE)。
D3H-狒狒尿酸酶的亚克隆
用NcoI和BamHI消化质粒pMFOA-18，分离大片断。用NcoI和BamHI消化构建物pET-3d-D3H-狒狒，分离包括D3H狒狒尿酸酶基因的960 bp片断。将这两个片断连接，产生pMFOU18。
表达质粒pMFXT133含有osmB启动子、rbs(大肠杆菌deo操纵子)、ter(大肠杆菌TrypA)、重组因子Xa抑制剂多肽(FxaI)，其赋予四环素抗性基因(TetR)。将狒狒尿酸酶基因插入到这个质粒中，以交换抗生素抗性基因。用NcoI消化质粒pMFOU18，补平，然后用XhoI消化，分离1030bp片断。用NdeI消化质粒pMFXT133，补平，然后用XhoI消化，分离大片断。将两个片断连接，产生狒狒尿酸酶表达载体pURBA16。
猪狒狒嵌合尿酸酶的亚克隆
用ApaI和AlwNI消化质粒pURBA16，分离2320bp片断。用NdeI消化质粒pMFXT133，补平，然后用AlwNI消化，分离620bp片断。用XbaI消化构建物pET-3d-PBC，补平，然后用ApaI消化，分离710bp片断。将三个片断连接产生pUR-PB，这个质粒在osmB启动子和rbs以及T7 rbs(衍自pET-3d载体)的控制下表达PBC尿酸酶。
T7 rbs在另外的步骤中切除。用NcoI消化pUR-PB，补平，然后用AlwNI消化，分离3000 bp片断。用NdeI消化质粒pMFXT133，补平，然后用AlwNI消化，分离620bp片断。将两个片断连接形成pDUR-PB，它在osmB启动子的控制下表达PBC。
pOUR-PB-ΔNC的构建
向尿酸酶cDNA中引入几个变化，这些变化导致重组酶稳定性的大大提高。构建质粒pOUR-PBC-ΔNC，其中去除N末端六残基成熟肽(maturation peptide)和在体内起到过氧化物酶体靶向信号作用的C末端三肽。这通过采用质粒pDUR-PB中的PBC序列和表2所列的特异性寡核苷酸引物用PCR扩增进行。
表2.用于PCR扩增PBC-ΔNC尿酸酶的引物
在表2中，在引物末端引入的限制性内切核酸酶序列用粗体显示，非编码区用小写字母显示。NdeI为正义，XbaI为反义。反义引物还通过引入不会影响氨基酸序列的点突变(下划线处)用来去除内部NdeI限制位点，从而促进用NdeI进行的亚克隆。
pDUR-PB的PCR扩增所产生的900碱基对片断用NdeI和XbaI切割，分离。然后将所获得的片断插入到deo表达质粒pDBAST-RAT-N中，该质粒含有衍自大肠杆菌的deo-P1P2启动子和rbs，能组成型表达人重组胰岛素前体。用NdeI和XbaI消化该质粒，分离4035bp片断，连接到PBC-尿酸酶PCR产物。用所得的构建物pDUR-PB-ΔNC转化大肠杆菌K-12 Sφ733(F-cytR strA)，该菌表达高水平的活性截短尿酸酶。
双重截短的PBC-ΔNC序列也在osmB启动子控制下表达。用AlwNI-NdeI消化质粒pDUR-PB-ΔNC，分离3459bp片断。用NdeI-AlwNI消化上述质粒pMFXT133，分离660bp片断。然后将各片断连接产生pOUR-PB-ΔNC，将其引入到大肠杆菌K-12株W3110 F-，表达高水平的活性截短尿酸酶。
尿酸酶表达质粒pOUR-P-ΔN-ks-1的构建
构建这个质粒，以改进重组酶的活性和稳定性。猪-KS-ΔN尿酸酶只在N末端截短(ΔN)，此处去除六残基N末端成熟肽，它还含有突变S46T、R291K和T301S。由于PCR扩增和克隆过程中出现的保守突变，在46位处是苏氨酸残基而不是丝氨酸。在291位，赖氨酸置换精氨酸，在301位，插入了丝氨酸置换苏氨酸。两者均衍自狒狒尿酸酶序列。R291K和T301S修饰表示为KS，讨论如上。额外的赖氨酸残基提供另外的潜在PEG化位点。
为构建pOUR-P-ΔN-ks-1(图1)，用ApaI-XbaI消化质粒pOUR-PB-ΔNC，分离3873bp片断。用ApaI-SpeI消化质粒pET-3d-PKS(构造在图4中显示)，分离270 bp片断。SpeI切割留下5′CTAG突出端，将其有效地连接到XbaI所产生的DNA片断。将两个片断连接，产生pOUR-P-ΔN-ks-1。连接后，SpeI和XbaI识别位点丢失(它们的位点在图9中用括号显示)。将构建物pOUR-P-ΔN-ks-1引入到大肠杆菌K-12株W3110 F-(原养型，ATCC#27325)中。在osmB启动子控制下表达的猪-KS-ΔN尿酸酶产生出具有优越活性和稳定性的高水平重组酶。
图1说明质粒pOUR-P-ΔN-ks-1的结构。限制位点旁的数字表示核苷酸位置，该位置相对于指定为1的HaeII位点而言；在克隆过程中丢失的限制位点在括号中标出。编码猪-KS-ΔN尿酸酶的质粒pOUR-P-ΔN-ks-1有4143碱基对(bp)长，由以下元件组成：
1.113bp长的DNA片断，其从核苷酸号码1延伸到NdeI位点(113位)，包括osmB启动子和核糖体结合位点(rbs)。
2.932bp长的DNA片断，其从NdeI位点(113位)延伸到SpeI/XbaI连接处(1045位)，包括900bp的猪-KS-ΔN(氨基末端截短的猪尿酸酶蛋白的核酸序列，其中氨基酸291和301分别被赖氨酸和丝氨酸置换)编码区和衍自pCRTM II的32bp侧翼序列，自SpeI/XbaI限制位点上游的TA克隆位点。
3.从SpeI/XbaI连接处(1045位)到HindIII(1070位)的25bp多克隆位点序列(MCS)。
4.含有TrpA转录终止子(ter)的合成40bp寡核苷酸，其具有HindIII(1070位)和AatII(1110位)末端。
5.1519bp长的DNA片断，其从AatII(1110位)延伸到包括四环素抗性基因(TetR)的pBR322上的MscI/ScaI(2629位)位点。
6.1514bp长的DNA片断，其从ScaI(2629位)延伸到包括DNA复制原点的pBR322上的HaeII(4143位)位点。
图2显示猪-KS-ΔN尿酸酶的DNA和推导氨基酸序列。在这个图中，氨基酸编号按照完全猪尿酸酶序列进行。在起始密码子甲硫氨酸残基之后，插入苏氨酸置换猪尿酸酶序列中的天冬氨酸。这个苏氨酸残基使得甲硫氨酸能被细菌氨基肽酶除去。氨基酸序列中的缺口说明缺失的N末端成熟肽。指出了用于不同尿酸酶序列亚克隆的各个步骤的限制位点(ApaI、NdeI、BamHI、EcoRI和SpeI)。小写字母显示的3′非翻译序列衍自pCRTMII序列。翻译终止密码子由星号表示。
图3显示各种重组尿酸酶序列的氨基酸序列的比对。上面一行代表猪尿酸酶，其包括全长氨基酸序列。第二行是双重截短的猪-狒狒嵌合尿酸酶(PBC-ΔNC)的序列。第三行显示猪-KS-ΔN尿酸酶的序列，该酶只在N末端截短，且含有突变S46T和氨基酸变化R291K和T301 S，这两个变化都反映尿酸酶编码序列的羧基末端的狒狒起源。星号表示与公开的猪尿酸酶序列相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置；圆圈表示与猪-狒狒嵌合体PBC-ΔN相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置；虚线表示氨基酸的缺失。
构建了具有Y97H突变的天然狒狒、猪和兔尿酸酶以及猪/狒狒嵌合体(PBC)的cDNA，用以克隆到大肠杆菌中。构建并选择表达高水平尿酸酶变体的克隆，使得所有克隆均为W3110 F-大肠杆菌，且表达受osmB调节。分离质粒DNA，通过DNA测序和限制性内切核酸酶分析进行验证，培养细胞。
截短的尿酸酶(包括猪-ΔN和猪-KS-ΔN)的构建如下进行：PBC-ΔNC和猪-KS之间交叉连接，然后分别用限制性内切核酸酶ApaI和XbaI以及ApaI加SpeI切割。合理的是这些截短突变体会保持活性，因为N末端六个残基“成熟肽”(1-2)和C末端三肽“过氧化物酶体靶向信号”(3-5)不具有显著影响酶活性的功能，有可能这些序列可具有免疫原性。选择出表达高水平尿酸酶变体的克隆。
实施例2.表达质粒向细菌宿主细胞中的转化
将表达质粒pOUR-P-ΔN-ks-1引入到大肠杆菌K-12株W3110 F-中。制备转化用细菌细胞，包括在Luria肉汤(LB)中使细胞生长至对数中期，然后离心收获细胞，在冷水中洗涤，悬浮于10％甘油水溶液中，浓度为约3×1010个细胞/ml。将细胞分等份保存于-70℃。在乙醇中沉淀出质粒DNA，溶于水中。
将细菌细胞和质粒DNA混合，用BIO-RAD的Gene Pulser II通过高压电穿孔进行转化(Trevors et al(1992).Electrotransformation ofbacteria by plasmid DNA，Guide to Electroporation and Electrofusion(D.C.Chang，B.M.Chassy，J.A.Saunders和A.E.Sowers编)中，第265-290页，Academic Press Inc.，San Diego；Hanahan等(1991)Meth.Enzymol.，204，63-113)。将转化的细胞悬浮在SOC培养基(2％胰蛋白胨、0.5％酵母膏、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖)中，37℃下温育1小时，用四环素抗性进行选择。选出高表达克隆。
实施例3.重组尿酸酶制品
将细菌例如转化的细菌(见上)在含葡萄糖培养基中进行培养；pH维持在7.2±0.2，温度大约37℃。
接近培养的最后5-6小时时，培养基补加KCl至最终浓度为0.3M。继续进行培养，以让尿酸酶积累。
重组尿酸酶在细菌细胞当中积累为类似于内含体(IB)的不溶性沉淀。离心洗涤细胞悬浮物，悬浮于50mM Tris缓冲液(pH 8.0)和10mMEDTA中，使最终体积达干细胞重量的大约40倍。
用溶菌酶和高压裂解细菌细胞后，离心分离含重组尿酸酶的内含体(IB)。溶菌酶(2000-3000单位/ml)处理在pH8.0和7±3℃下搅拌进行16-20小时。用水洗涤粒状沉淀，-20℃下保藏备用。
富集的IB悬浮于50mM NaHCO3缓冲液(pH 10.3±0.1)后作进一步的加工。将悬浮液在室温下温育过夜，以让IB衍生的尿酸酶溶解，随后进行离心澄清。
尿酸酶通过几个色谱步骤作进一步的纯化。首先，在Q-SepharoseFF柱上进行色谱。用含150mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液洗涤已加样的柱，用含250mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液洗脱尿酸酶。然后，用黄嘌呤-琼脂糖树脂(Sigma)除去尿酸酶制品中的少量杂质。用50mM甘氨酸缓冲液(pH 10.3±0.1)将Q-Sepharose FF洗脱液稀释至蛋白质浓度为大约0.25mg/ml，加样。用含100mM NaCl的碳酸氢盐缓冲液(pH10.3±0.1)洗涤柱，用补充有60μM黄嘌呤的同一缓冲液洗脱尿酸酶。在这个阶段，通过Q-Sepharose色谱再纯化尿酸酶，以除去聚集体形式。
各尿酸酶制品的纯度由大小排阻层析测出大于95％。用Superdex200柱检测出各制品中聚集体形式少于0.5％。
表3总结了来自25 L发酵液的IB的猪-KSΔN尿酸酶的纯化。
表3.猪-KSΔN尿酸酶的纯化
Figure 2006800206898A00800031
实施例4.重组尿酸酶的特性
SDS-PAGE
高度纯化的尿酸酶变体的SDS-PAGE分析(图4)显示了相当独特的模式。样品在碳酸盐缓冲液(pH 10.3)中4℃下保藏直至几个月。全长变体猪、猪-KS和PBC显示有两种分子量约20和15kD的主要降解产物积累。这个观察结果提示，至少有单个切口裂解了尿酸酶亚单位分子。在氨基末端缩短的克隆中以及在兔尿酸酶中检测到不同的降解模式，但比例较低。兔的氨基末端类似于缩短的克隆的氨基末端。测定了在纯化和保藏过程中产生的尿酸酶片断的氨基末端序列。
肽测序
用Edman降解方法进行主体(bulk)尿酸酶制品的N末端测序。进行了10个循环。与猪-KS-ΔN相比重组猪尿酸酶(全长克隆)产生了更为丰富的降解片断。导致降解片断的推导切割位点如下：
1)168位处具有以下【序列的主要位点：
--QSG↓FEGFI--
2)142位处具有以下序列的次要位点：
--IRN↓GPPVI--
以上序列并不显出任何已知的蛋白酶解切割。不过，切割可能源于蛋白酶解或一些化学反应。氨基截短的尿酸酶意外地比非氨基截短的尿酸酶更稳定。PBC-ΔNC的稳定性还类似于其它ΔN分子，小于非氨基截短的PBC。
功效
用UV方法测量尿酸酶的活性。酶促反应速度通过测量由尿酸氧化成尿囊素所致的292nm处吸光度减少来测定。一活力单位定义为25℃下在指定条件下每分钟氧化一微摩尔尿酸所需的尿酸酶的量。尿酸酶功效以每mg蛋白质的活力单位(U/mg)表示。
1 mM尿酸在292nm处的消光系数为12.2mM-1cm-1。因此，1μmol尿酸/ml反应混合物的氧化导致吸光度减少12.2mA292。吸光度随时间的变化(ΔA292每分钟)从曲线的线性部分导出。
蛋白质浓度用改进的Bradford方法(Macart和Gerbaut(1982)ClinChim Acta 122：93-101)测定。尿酸酶的比活性(功效)通过将活性(U/ml)除以蛋白质浓度(mg/ml)来计算。各种重组尿酸酶的酶活性结果在表4中总结。该表中包括市售制品的结果作为参考值。从这些结果显现，尿酸酶蛋白的截短对其酶活性没有显著影响。
表4.重组和天然尿酸酶的动力学参数总结
Figure 2006800206898A00800041
表4注释：
(1)蛋白质浓度通过278nm处测量的吸光度来测定，对于10mg/ml尿酸酶溶液使用11.3的消光系数(Mahler，1963)。
(2)1单位的尿酸酶活性定义为25℃下每分钟氧化1μmol尿酸成尿囊素的酶量。
(3)比活性值从Lineweaver-Burk图导出，底物浓度等于60μM。
(4)反应混合物由以下储备溶液的各种组合所组成：
100mM硼酸钠缓冲液，pH 9.2
300μM尿酸的50mM硼酸钠缓冲液溶液，pH 9.2
1mg/ml BSA的50mM硼酸钠缓冲液溶液，pH 9.2
(5)Kcat通过将Vmax(从各个Lineweaver-Burk图求出)除以尿酸酶在反应混合物中的浓度(以摩尔当量表示，基于尿酸酶的四聚体分子量)来计算。
实施例5.尿酸酶与m-PEG的缀合(PEG化)
用m-PEG-NPC(一甲氧基-聚乙二醇-硝基苯基碳酸酯)缀合猪-KS-ΔN尿酸酶。确立能导致每尿酸酶亚单位2-12个5、10或20 kD PEG链的条件。将m-PEG-NPC逐渐加入到蛋白质溶液中。PEG加入结束后，接着将尿酸酶/m-PEG-NPC反应混合物在2-8℃下温育16-18小时，直到最多的未结合m-PEG链缀合到尿酸酶。
每个PEG-尿酸酶单体的PEG链数用PEG和尿酸酶标准品通过Superose 6大小排阻层析(SEC)进行测定。每亚单位的结合PEG链数由以下方程式确定：
Figure S2006800206898D00231
PEG-尿酸酶样品中PEG和蛋白质部分的浓度用串联排列的紫外(UV)检测器和折光指数(RI)检测器(Kunitani等，1991所开发)通过大小排阻层析(SEC)测定。产生三个校准曲线：蛋白质曲线(在220nm处测量吸收)；蛋白质曲线(通过RI测量)和PEG曲线(通过RI测量)。然后，用相同的系统分析PEG-尿酸酶样品。用实验样品的所得UV和RI峰面积值计算PEG和蛋白质相对于校准曲线的浓度。3.42的指数是尿酸酶单体的分子量(34,192道尔顿)与10kD PEG的分子量之间的比。
连接的PEG改进了尿酸酶在具有生理pH值的溶液中的溶解度。表5指出了各批PEG化猪-KS-ΔN尿酸酶产物之间的差异。一般来说，所连接的PEG链数和所保留的酶比活性(SA)之间存在反比关系。
表5.PEG化猪-KS-ΔN尿酸酶缀合物的酶活性
Figure 2006800206898A00800051
实施例6.用1000 D和100,000 D PEG对尿酸酶的PEG化
用1000 D和100,000 D m-PEG-NPC按实施例5的描述缀合猪-KS-ΔN尿酸酶。使用能导致每尿酸酶亚单位2-11个PEG链的条件。PEG加入结束后，接着将尿酸酶/m-PEG-NPC反应混合物在2-8℃下温育16-18小时，直到最多的未结合m-PEG链缀合到尿酸酶。
每PEG-尿酸酶单体的PEG链数如上所述测定。
连接的PEG改进了尿酸酶在具有生理pH值的溶液中的溶解度。
实施例7.与PEG缀合的猪-KS-ΔN尿酸酶的药物动力学
进行生物学实验，以确定为提供疗效所需的PEG化的最佳程度和数量。
在大鼠药物动力学研究中，在第1天和第8天静脉内注射给予0.4mg(2U)/kg体重的未修饰尿酸酶，产生约10分钟的循环半寿期。但是，每周一次注射共9次后，用2-11×10kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶进行的大鼠清除速度研究表明，清除不取决于PEG链数(在这个范围内)，在整个研究期间保持相对恒定(见表6；半寿期约30小时)。周与周的差异在实验误差范围内。9次注射10×5kD PEG和10×20kD PEG-尿酸酶缀合物后，也显现相同的模式。此结果表明，不管尿酸酶PEG化的程度如何，在这个范围内在大鼠模型中观察到相似的生物效应。
表6.PEG化猪-KS-ΔN尿酸酶制品在大鼠中的半寿期
表6注释：结果作为平均值±标准误差以小时表示。括号中的数字表示试验的动物数量。
如表中所示大鼠每周一次接受静脉内注射0.4mg/kg体重的修饰猪-KS-ΔN尿酸酶。每组一开始包括15只大鼠，以5只为亚组轮流放血。有几只大鼠在研究过程中因麻醉致死。通过测量注射后5分钟及6、24和48小时收集的血浆样品中的尿酸酶活性(比色测定)来测定半寿期。
表5描述研究中所用的各批PEG化尿酸酶。
用6×5kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶在兔中进行的生物利用度研究表明，首次注射后，循环半寿期为98.2±1.8小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为71％和52％。但是，在第二次肌肉内和皮下注射后，在所有兔中检测出显著的抗尿酸酶抗体滴度，随后各次注射后清除加速。用相同的缀合物注射大鼠，导致的半寿期为26±1.6小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为33％和22％。
用9×10kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶在大鼠中进行的研究表明，首次注射后的循环半寿期为42.4小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为28.9％和14.5％(见图5和表7)。在第四次注射后，循环半寿期为32.1±2.4小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为26.1％和14.9％。
用9×10kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶在兔中进行的类似药物动力学研究表明，在注射此缀合物(每两周注射一次共4次)后没有观察到加速清除。在这些动物中，第一次注射后的循环半寿期为88.5小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为98.3％和84.4％(见图6和表7)。在第四次注射后，循环半寿期为141.1±15.4小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为85％和83％。
用9×10kD PEG-猪-KS-ΔN进行了类似的研究，以评估在小猎犬(每组两雄两雌)中的生物利用度。第一次静脉内注射后记录到的循环半寿期为70±11.7小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为69.5％和50.4％(见图7和表7)。
用猪进行9×10kD PEG-猪-KS-ΔN制品的研究。每组三只动物用于通过静脉内、皮下和肌肉内途径给予。第一次静脉内注射后记录到的循环半寿期为178±24小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为71.6％和76.8％(见图8和表7)。
表7.9×10kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶的药物动力学研究
Figure 2006800206898A00800071
用125I按Bolton&Hunter方法碘化9×10kD PEG-猪-KS-ΔN尿酸酶后，进行吸收、分布、代谢和排泄(ADME)研究。将标记的缀合物注射到7组的每组4只大鼠(2雄2雌)中。在1小时后和每24小时分析放射性的分布，持续7天(除第5天外)。将每组依次处死，切除不同器官进行分析。将第7组保持在代谢笼中，由其收集尿液和粪便。通过测量可获自TCA沉淀(即结合的蛋白质，归一化到器官大小)的每个器官(肾、肝、肺和脾)中的总放射性和计数分数，评估(放射性)材料在动物全部身体内的分布。在所切除的器官中，没有器官的比放射性高于其它器官，因此例如在肝脏或肾脏中未见显著积累。到第7天为止，有70％的放射性被排泄。
实施例8.临床试验结果
进行了随机化、非盲、多中心、平行组研究，以评估在对常规疗法无响应或不耐受的高尿酸血症和严重痛风人患者中PEG-尿酸酶(Puricase
Figure 2006800206898_1
，Savient Pharmaceuticals)的尿酸响应以及药物动力学和安全曲线。疾病的平均持续时间是14年，70％的研究群体有一个或多个结节瘤。
在本研究中，将41名患者(平均年龄58.1岁)随机至采取以下四种给药方案之一的12周静脉内PEG-尿酸酶治疗：每两周4mg(7名患者)；每两周8mg(8名患者)；每四周8mg(13名患者)或每四周12mg(13名患者)。在确定的时间间隔测量血浆尿酸酶活性和尿酸水平。药物动力学参数、平均血浆尿酸浓度和血浆尿酸小于或等于6mg/dL的时间百分比从尿酸酶活性和尿酸水平的分析结果得出。
每两周接受8mg的PEG-尿酸酶的患者其PUA降低最大，92％的治疗时间其水平低于6mg/dL(处理前血浆尿酸为9.1mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为1.4mg/dL)。
在其它PEG-尿酸酶治疗剂量组中也观察到显著和持续的较低血浆尿酸水平：在每四周8mg的组中86％的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为9.1mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为2.6mg/dL)；在每四周12mg的组中84％的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为8.5mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为2.6mg/dL)；在每两周4mg的组中73％的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为7.6mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为4.2mg/dL)。
在给予PEG-尿酸酶的第一个24小时内血浆尿酸从基线的最大降低百分比，对于接受4mg/2周的受试者为72％(p＝0.0002)；对于接受8mg/2周的受试者为94％(p小于0.0001)；对于接受8mg/4周的受试者为87％(p小于0.0001)；对于接受12mg/4周的受试者为93％(p小于0.0001)。
在12周治疗周期内血浆尿酸从基线的降低百分比，对于接受4mg/2周的受试者为38％(p＝0.0002)；对于接受8mg/2周的受试者为86％(p小于0.0001)；对于接受8mg/4周的受试者为58％(p＝0.0003)；对于接受12mg/4周的受试者为67％(p小于0.0001)。
意外地，一些接受PEG-尿酸酶的受试者经历了输注相关的不利事件，即输注反应。这些反应在总输注中出现14％。
本文引述的所有参考文献对于所有目的通过引用整体结合到本文中，引用的程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地和个别地被指明对于所有目的通过引用整体结合到本文中。
本领域技术人员知道，可对本发明作出许多修改和变化而不偏离本发明的精神和范围。本文描述的具体实施方案只是通过举例方式提供，本发明只受到所附权利要求的条款以及这些权利要求享有的等效要求全部范围的限定。

Claims (8)

1.一种分离的尿酸酶，所述尿酸酶由SEQ ID NO.7的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的尿酸酶，其中所述尿酸酶是PEG化尿酸酶。
3.一种分离的核酸，所述核酸由编码权利要求1的尿酸酶的核酸序列组成。
4.权利要求3的分离的核酸，其中所述核酸序列有效连接到异源启动子。
5.权利要求4的核酸，其中所述启动子是osmB启动子。
6.一种核酸载体，所述核酸载体包含权利要求4的核酸。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6的载体。
8.一种生产尿酸酶的方法，所述方法包括在宿主细胞表达所述核酸序列的条件下培养权利要求7的宿主细胞的步骤，以及分离所表达的尿酸酶的步骤。
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