CN109207479A

CN109207479A - 海洋低温尿酸氧化酶启动子和终止子

Info

Publication number: CN109207479A
Application number: CN201811043742.7A
Authority: CN
Inventors: 迟乃玉; 逄飞; 窦少华; 张庆芳
Original assignee: Dalian University
Current assignee: Dalian University
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2019-01-15

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种海洋低温尿酸氧化酶的启动子和终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。本发明通过扩增苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)尿酸氧化酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。有力于促进今后的苛求芽孢杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。

Description

海洋低温尿酸氧化酶启动子和终止子

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种海洋低温尿酸氧化酶的启动子、终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。

背景技术

微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有强大的生物合成能力。海洋占据了地表的70％，蕴藏着丰富未知的海洋资源，是巨大的资源宝库。而海洋微生物更具有自身优势，其生产环境(高压、高盐、低温、低营养、低光照等)决定其产生的酶具有在低温和高盐环境下能够继续保持较高的活力。对海洋微生物低温酶的研究和开发，已经在国内外引起了广泛的关注。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其代谢产物的生产高效、快捷、具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。海洋微生物具有一种重要的生态功能-生物修复，作为海洋生态系统的重要组成，在海洋环境中，它们能够降解包括金属，石油产品，脂肪族和芳香族碳氢化合物，工业溶剂，农药及其它代谢物等化学物质。其中苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)便在其中扮演着重要的角色。在清除海洋环境污染物及海洋自净中发挥重要的作用。

尿酸氧化酶(urate oxygen oxidoreductase)是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，它以氧作为受体，能够催化尿酸氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。许多物种中均发现有尿酸氧化酶存在，但在高等哺乳动物(猿和人类)体内却缺乏有生物活性的尿酸氧化酶，因而尿酸就作为嘌呤代谢的最终产物。随着人们对血液中尿酸的研究发现，尿酸水平与痛风、高血压、血管病、糖尿病、肾脏病及许多临床综合症相关，而这些疾病或病理状态又有相互影响，它们之间可能互为因果，也可能有协同效应。尿酸氧化酶作为检测血液中尿酸浓度的关键试剂，在临床检测血液中的尿酸含量中起到重要的作用。目前在国内可以应用于临床检测血液中尿酸含量用的试剂盒仍比较少，其原因主要是没有方便而且廉价的可以应用于检测的尿酸氧化酶，而且目前可以获得的尿酸氧化酶也没有完全达到比较理想的稳定性和活性。因此，在尿酸氧化酶的生产和菌种的筛选或基因工程菌种构建这个领域里将有很大的发展空间。而海洋微生物是巨大的资源宝库，从中筛选新型的、低温的、高活性的目的尿酸氧化酶产生菌株显得尤为重要。

目前，未见适合于苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)的启动子序列的报道，也未见适用于苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)遗传操作系统，也未见高效的尿酸氧化酶(urate oxygen oxidoreductase)基因克隆载体，这些都制约了靶向性的菌株改造。因此，分离能够在苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)中启动报告基因表达的尿酸氧化酶启动子成为研究的热点。

发明内容

鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可通用于苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)中外源基因表达的启动子和终止子的DNA表达盒。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

海洋低温尿酸氧化酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述海洋低温尿酸氧化酶启动子用于构建能够在苛求芽孢杆菌属(Bacillusfastidiosus)中表达的重组表达载体的应用，其中克隆了包含所述海洋低温尿酸氧化酶启动子的重组表达载体的苛求芽孢杆菌属细菌菌株构成苛求芽孢杆菌细菌属遗传操作系统。

一种DNA表达盒，其含有如SEQ ID NO：1所示的海洋低温尿酸氧化酶启动子的核苷酸序列。

上述DNA表达盒，其还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架。

上述DNA表达盒，所述编码目的基因的开发阅读框架的cDNA序列具有如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列。

上述DNA表达盒，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架，其序列之间为多克隆位点，并且包含选择性标记基因。

上述启动子、终止子来源如下：

(A)本发明涉及一种具有苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：

(1)具有如SEQ ID NO：1所示序列的全部序列或包含3’-末端起1500bp以内的部分序列；

(2)具有如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，

(3)或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

(B)本发明涉及一种来自苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子：具有如下：

(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；

(2)具有可与(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)本发明涉及一种可完成靶基因在苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)中转录起始和转录终止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有苛求芽孢杆菌(Bacillusfastidiosus)转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)转录启动子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，与其相邻1-1000个核苷酸的DNA片段。

(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子；连接的DNA表达盒，以便于所述靶基因能够在苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。优选地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：为苛求芽孢杆菌属的细菌提供了启动子、终止子遗传转化方法，将有力促进今后的苛求芽孢杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。

附图说明

图1表示尿酸氧化酶简并PCR产物(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；

图2表示pUrate Oxidase启动子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；

图3表示Urate Oxidase t终止子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。

具体实施方式

在发明中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如抗性基因)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因是否表达。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。

在发明中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。

本发明中的“苛求芽孢杆菌”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。

本发明中的启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1500bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

本发明中的终止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列杂交的、目保持转录终止子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。

本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化为苛求芽孢杆菌属菌株，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。

本发明的启动子可以按照以下方面从苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)中分离。

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TakaRa公司完成。

实施例1

苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)基因组DNA的提取

将苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)由平板接种到5ml液体培养基(尿酸1.00％，酵母膏0.75％，NaCl 0.05％，MgSO₄ 0.05％，K₂HPO₄ 0.25％，KH₂PO₄ 0.07％，pH7.5，121℃高压灭菌)中，于25℃、150r/min摇床培养16h，再以5％接种量将菌液分别转接到100ml牛液体培养基中，于25℃、150r/min摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体。使用TIANGEN公司TIANamp Bacteria DNA试剂盒，并按照其标准步骤提取基因组DNA。

基因组DNA进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的一条带。用紫外/可见光光谱仪分析基因组DNA样品，测得OD260/OD280＝1.8，表明基因组DNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，基因组DNA样品冻存于-20℃，备用。

实施例2

苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)基因组总RNA的提取

将苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)由平板接种到50ml液体培养基(尿酸1.00％，酵母膏0.75％，NaCl 0.05％，MgSO₄ 0.05％，K₂HPO₄ 0.25％，KH₂PO₄ 0.07％，pH7.5，121℃高压灭菌)中，于25℃、150r/min摇床培养16h，再以2％接种量将菌液分别转接到100ml液体培养基中，于25℃、150r/min摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体。使用TakaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。

总RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的二条带。用紫外/可见光光谱仪分析基因组RNA样品，测得OD260/OD280＝2.01，表明总RNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，总RNA样品冻存于-80℃，备用。

实施例3

苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)cDNA第一链合成和Urate Oxidase简并PCR

以苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。

首先，将1.0μl总RNA(约2μg)，1.0μl引物SMART IV：5-ATGCCCGTTAAGGCTGGGATAAAATACGGCCGGG-3′和1.0μloligo dT-接头引物CDSIII/3′：5′-ATTTGAAACTTCTATCAGCGGGGATTTTCCATG-d(T)30N-1N-3′，2.0μl DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TakaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于72℃保温2min，立即置于冰上冷却2min，将2.0μl5×第一链缓冲液(Clontech公司)，1.0μlDTT(20mM)，1.0μl dNTP(10mM)，1.0μl powerscript反转录酶(Clontech公司)加入到体系中，混匀。于42℃延伸反应60min，最后4℃结束反应，存于-20℃，备用。

设计合成两条简并引物：urate oxidase-sense:5'-ATGTT(TTAT)GGTA(AAGG)CG(AC)G(TAT)ACGTAT-3'(括号内的碱基在此位置随机出现，为简并碱基)和urate oxidase-anti：5'-TTA(AAGG)CG(CT)GTATT(CACT)GA(GC)CACGTCGGA-3'，(括号内的碱基在此位置随机出现，为简并碱基)以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行Urate Oxidase基因的简并PCR扩增，10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs(10mM)1.0μl，上游引物(50mmol/l)1.0μl，下游引物(50mnol/l)1.0ul，rTaq酶(大连TakaRa)0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH2O40.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到1.2kb左右的条带(图1)，利用DNA回收试剂盒(购自碧云天)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coliDH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，序列结果推测出的氨基酸序列经Blast分析，证实为尿酸氧化酶序列(Urate Oxidase氨基酸序列)，如SEQ ID NO：5所示。尿酸氧化酶cDNA序列(Urate OxidasecDNA)如SEQ ID NO：4序列所示。

实施例4

苛求芽孢杆菌属(Bacillus fastidiosus)基因组DNA的扩增

根据实施例3中获得的尿酸氧化酶cDNA序列，设计1对基因特异性引物，UrateOxidase-p1：5'-GTTT AAC TTTAAGAAGGAGATATACCATGTTTTATGGTAAAGGCGACGTATACGTATTCAGAACTTA-3'和Urate Oxidase-p2：5'-CAC CACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCAAAAAGCATCAGCTAACTCGGAGTATGTTGCACTATGA-3'，苛求芽孢杆菌属(Bacillusfastidiosus)的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到约1.6kb的PCR产物(未显示)。PCR扩增产物按照实施例3的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(Urate Oxidase阅读框架)。经与实施例3中获得的尿酸氧化酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其尿酸氧化酶基因组DNA序列(gDNA)，其中含有6个内含子和7个外显子。

实施例5

染色体步移获得urate oxidase基因5’翼侧序列(启动子)

本实施例利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。

根据实施例3中得到的尿酸氧化酶DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)分别为urate oxidase-SP1：5-ATGTTTTATGGTAAAGGCGACGTATACGTATTCAGAACTTA-3’，urate oxidase-SP2：5’-ATGTCCCATACTTTTGTTACCCAGT-3’和urate oxidase-SP3：5’-ATGATATTCATAAGTGTTGATTTA-3’，做为下游引物，按照试剂盒说明书进行以下操作。

1.^1st PCR反应

以实施例4中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。

反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，urate oxidase-SP1(10μmol/l)1.0μl，苛求芽孢杆菌属(Bacillusfastidiosus)基因组DNA模板(120ng/μl)1.0μl，ddH2O加至50μl。

反应条件：先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR：2个高退火温度(65℃)的高特异性反应和1个低退火温度(44℃)的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

2.^2nd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LATaq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，^lst PCR反应产物1.0μl，urate oxidase-SP2(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。

反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3.^3rd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，^2nd巢式PCR反应产物1.0μl，urate oxidase-SP3(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。

3^rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带(如图2所示)，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，证实为预期的p Urate Oxidase基因序列。

实施例6

染色体步移获得urate oxidase基因3’翼侧序列(终止子)

本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。

根据实施例4中得到的urate oxidase DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)分别为urate oxidase-SP11：5’-AAA AAGCATCAGCTAACTCGGAGTATGTTGCACTATGA-3’，urate oxidase-SP22：5’-ATGATGGTTCACTTGACGTCGGATTC-3’和urateoxidase-SP33：5’-ATTGACAAAGGAATAAGGAAATGTTACGAT-3’，做为上游引物，按照试剂盒说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除Specific Primer分别由urate oxidase-SP1，urateoxidase-SP2，urate oxidase-SP3依次更换为urate oxidase-SP11，urate oxidase-SP22，urate oxidase-SP33外，其它同实施例5。

3^rd巢式PCR反应产物(如图3所示)利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的尿酸氧化酶终止子(UrateOxidase t)基因序列。

实施例7

urate oxidase启动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得

根据实施例5和实施例6中获得的启动子和终止子序列，重新设计一对引物进行LsFBA“启动子-开放阅读框架-终止子”全长基因的扩增。pUrate oxidase-p2：5-ATGTCCCATACTTTTGTTACCCAGT-3’，urate oxidase t-p2：5-ATGATGGTTCACTTGACGTCGGATTC-3’。以实施例4中制备的苛求芽孢杆菌属(Bacillusfastidiosus)基因组DNA为模板进行PCR扩增。

PCR体系(50μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l)1.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，SpeedSTARTM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.5μl，基因组DNA模板(120ng/μl)2μl，ddH2O加至50μl。

反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，证实为预期的p Urate Oxidase t(尿酸氧化酶)基因全长序列，该重组载体命名为T-urate oxidase。

序列表

<110> 大连大学

<120> 海洋低温尿酸氧化酶启动子和终止子

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)

<400> 1

ctgatagaag tttcacttta ttgtgctgat ttttcagccc agtcttcaat gtcccatact 60

tttgttaccc agtcttcgta gaagtcaggt tcatggcaga cgaggacaac tgtcccttta 120

tatgctttga tcgcacgttt tagctcttct tttgcaacga tatccagatg gtttgtcggc 180

tcgtcaaata ataaccagtt gctttcattc atttgcagct tacataatcg cacctttgct 240

tgctctccac cgcttaattg gcttaatgga cgagagatat gttcattttt taatccagca 300

cgtgcaagta atgctcgtac ttgatgttga tcaaggcttg ggaatgcatt ccaaacatcg 360

tcaattggtg taatactctc cgcttttact tcctgttcaa agtaggatgg atataaaaag 420

tcaccttgaa cagcattgcc gccaagaggt ttaatctttc cgagaattgt ctttaataat 480

gtcgatttcc cgataccgtt acagccgaca attgcaattt tttctccgcg ttcaattgtc 540

atagtcagct ttggtagaag aggttcattg tagccgattt ctaaatcttt tccttcaaat 600

acataacgac tgctggcgcg tgactcttta aattcaaatg ttggtttcac agcagtttcc 660

ggtctgtcga tacgttccat tcgatcaagc tgcttttgac ggcttttcgc acggcctgtc 720

gttgaatagc gagccttatt ttttgaaata aagttttctt gctttttaat gaattcctgc 780

tgcttttcat atgcattaat atgctgattt ttatttatct ctgccagctc taaaaacttc 840

tcatatgttg ctgtatagcg gttcattcta gaaaattcta gatggaaaat aacatttgaa 900

acgccattca taaattctgt atcatgtgag attagaataa aagcatgtgg atattctttt 960

aagtaatggc tcagccagcg aatatgctcc acatcaaggt agtttgtcgg ctcgtcaagc 1020

aatagcacgt caggctgttc taaaagaagt ttagccaata atacttttgt tctctgtccg 1080

ccacttaatg ctgctacatc acgctcaagg ccaattgcat ctaaaccaag accgcgagct 1140

gtttcttcaa ttttaatatc aagattatag aagccgccag catcgagacg gtcttggata 1200

acagccattt tctccaatag ctcctcaagc tcttcaggag tcgcagttgc cattttctct 1260

gtcacttcat ttaattgttt ttcctgttcg aataaaggaa ggaaggcatc gcttaatata 1320

tcgcgtattg tcttaccagg tgttaaaatt gtatgctgat caagatagcc atatttaaca 1380

ccgggagtcc attccacacg gccggtatca tggataagct gatttgtaat gatattcata 1440

agtgttgatt taccgacacc atttgccccg actaatccaa catgttcgcc tgccagaagg 1500

<210> 2

<211> 1000

<212> DNA

<213> 苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)

<400> 2

agggatagat gatggttcac ttgacgtcgg attcatatct aaaaattttc cgattcaaaa 60

agaattttta aacatgattg atttgtataa agatccattg atgttaatcg tacataagaa 120

ccatccttta gctttaaaag aggaaattga cttttctgac ttaaaaacag aaccttttat 180

tttgtatcaa aaaacatttt ctctttttga ccgtattata gagcgttgca cgaagaagga 240

tttttatccg aatattatat gtgaaagctc ccaaaaagac tttatgatcg agttagtaga 300

gacaaattta ggaatcgcct tactgccaaa aaggatctgt aagaagattt acagtaaaga 360

tataattgct attcccttta aaaagagtca ggaaatcaat ttggagcttg cgatgatttg 420

gaaaaaagat aagtatatac cttttgctgt aagtgaattt atttcaatgt ctgagaaagt 480

tctttaatag aaagtcaaat tgattaaaga gaagggaata cagagtgcat cactttatat 540

atagaaagaa aataagcata tgatgaatta tagaaaaaaa taattagttt ctaaatgata 600

gtactataac gtgagttttt tatgcagtca gttattgatc agcagataaa agagtctctt 660

tttttagaac aagcattaag ttaaacattt ctgccatata ttaatttatc cttagcatct 720

aagaaaggat tatagtatat ggaatagcag aggctgaact ggttttagtt gtttttaaaa 780

ttttgttgac atatgtaatg aatcggagta gtataggaat tccccgctga gagaaaatga 840

ttttaagaaa aaattttccc tttcagaaaa gaatttaggg gtttacaaga ttacttattt 900

ttgataagat gtaatcctgt ccttaacgca aatgaaatta tgttcaaaaa caatttcgaa 960

aaaagttatt gacaaaggaa taaggaaatg ttacgatggt 1000

<210> 3

<211> 989

<212> DNA

<213> 苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)

<400> 3

gcagaaagaa caatgtttta tggtaaaggc gacgtatacg tattcagaac ttatgcaaac 60

ccattaaaag gtttaaaaca aattccagaa tcaaacttca ctgaaaagca caacacaatt 120

ttcggtatga acgctaaagt agcacttaaa ggtgagcaac ttttaacttc tttcacagaa 180

ggagacaaca gcttagtagt tgctactgac tcaatgaaaa acttcatcca acgtcatgca 240

gcatcatacg aaggagctac attagaaggt ttcttacaat atgtgtgtga agcattctta 300

gctaaatact ctcatttaga tgcagtaaga ttagaagcaa aagaatatgc attcgacgac 360

cgctggaccc ggatggacat tgacggcaag ccacaccctc actccttcat ccgcgacagc 420

gaggagaagc ggaatgtgca ggtggacgtg gtcgagggca agggcatcga tatcaagtcg 480

tctctgtccg gcctgaccgt gctgaagagc accaactcgc agttctgggg cttcctgcgt 540

gacgagtaca ccacacttaa ggagacctgg gaccgtatcc tgagcaccga cgtcgatgcc 600

acttggcagt ggaagaattt cagtggactc caggaggtcc gctcgcacgt gcctaagttc 660

gatgctacct gggccactgc tcgcgaggtc actctgaaga cttttgctga agataacagt 720

aacaaatcta tccaacattt aatttatcat atcggtttaa caatcctaga tcgcttccca 780

caattaacag aagtgaactt cggaacaaac aaccgtactt gggacactgt tgttgaagga 840

actgatggat ttaaaggcgc tgtattcact gagccacgtc ctccattcgg tttccaaggc 900

ttctcagtac accaagaaga tcttgcaaga gaaaaagcat cagctaactc ggagtatgtt 960

aacggtctga tcaagtgtac cgtcggccg 989

<210> 4

<211> 738

<212> DNA

<213> 苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)

<400> 4

gcagaaagaa caatgtttta tggtaaaggc gacgtatacg tattcagaac ttatgcaaac 60

ccattaaaag gtttaaaacc tgaaaagcac aacacaattt tcggtatgaa cgctaaagta 120

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taaatactct catttagatg cagtaagatt agaagcaaaa gaatatgcat tcgacgaccg 300

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cgaggtcact ctgaagactt ttgctgaaga taacagtaac aaatctatcc aacatttaat 540

ttatcatatc ggtttaacaa tcctagatcg cttcccacaa ttaacagaag tgaacttcgg 600

aacaaacaac cgtacttggg acactgttgt tgaaggaacc tccattcggt ttccaaggct 660

tctcagtaca ccaagaagat cttgcaagag aaaaagcatc agctaactcg gagtatgtta 720

acggtctgac gtcggccg 738

<210> 5

<211> 320

<212> PRT

<213> 苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)

<400> 5

Arg Thr Met Phe Tyr Gly Lys Gly Asp Val Tyr Val Phe Arg Thr Tyr

1 5 10 15

Ala Asn Pro Leu Lys Gly Leu Lys Gln Ile Pro Glu Ser Asn Phe Thr

20 25 30

Glu Lys His Asn Thr Ile Phe Gly Met Asn Ala Lys Val Ala Leu Lys

35 40 45

Gly Glu Gln Leu Leu Thr Ser Phe Thr Glu Gly Asp Asn Ser Leu Val

50 55 60

Val Ala Thr Asp Ser Met Lys Asn Phe Ile Gln Arg His Ala Ala Ser

65 70 75 80

Tyr Glu Gly Ala Thr Leu Glu Gly Phe Leu Gln Tyr Val Cys Glu Ala

85 90 95

Phe Leu Ala Lys Tyr Ser His Leu Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Lys

100 105 110

Glu Tyr Ala Phe Asp Asp Ile Gln Val Gly Thr Asp Lys Gly Val Val

115 120 125

Thr Ser Asp Leu Val Phe Arg Lys Ser Arg Asn Glu Tyr Ala Thr Ala

130 135 140

Thr Val Glu Val Ala Arg Thr Ala Ser Gly Thr Glu Val Val Glu Gln

145 150 155 160

Ala Ser Gly Ile Ala Asp Ile Gln Leu Ile Lys Val Ser Gly Ser Ser

165 170 175

Phe Tyr Gly Tyr Ile Ile Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Ala Glu Ala Thr

180 185 190

Asp Arg Pro Leu Tyr Ile Phe Leu Asn Ile Gly Trp Ala Tyr Glu Asn

195 200 205

Gln Asp Asp Ala Lys Gly Asp Asn Pro Ala Asn Tyr Val Ala Ala Glu

210 215 220

Gln Val Arg Asp Ile Ala Ala Ser Val Phe His Thr Leu Asp Asn Lys

225 230 235 240

Ser Ile Gln His Leu Ile Tyr His Ile Gly Leu Thr Ile Leu Asp Arg

245 250 255

Phe Pro Gln Leu Thr Glu Val Asn Phe Gly Thr Asn Asn Arg Thr Trp

260 265 270

Asp Thr Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Phe Lys Gly Ala Val Phe Thr

275 280 285

Glu Pro Arg Pro Pro Phe Gly Phe Gln Gly Phe Ser Val His Gln Glu

290 295 300

Asp Leu Ala Arg Glu Lys Ala Ser Ala Asn Ser Glu Tyr Val Ala Leu

305 310 315 320

Claims

1.海洋低温尿酸氧化酶启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有权利要求1所述的海洋低温尿酸氧化酶启动子核苷酸序列的DNA表达盒。

3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架。

4.如权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于，所述编码目的基因的开发阅读框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架，其序列之间为多克隆位点，并且包含选择性标记基因。