CN109161555A - 一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体 - Google Patents

一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体 Download PDF

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肖景惠
王梦雨
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    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)

Abstract

本发明属于生物工程领域。涉及一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体，其是从太平洋海洋杆菌R‑5321(Oceanobacillus picturae strain R‑5321)分离的编码低温苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用无限制克隆法(RF克隆)，成功构建了海洋低温MDH表达载体pET‑28a‑MDH。将表达载体电转入宿主细胞C43(DE3)中，并利用IPTG进行诱导表达海洋低温MDH蛋白。表达产物具有海洋低温苹果酸脱氢酶功能，能催化苹果酸转化成草酰乙酸。

Description

一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体是一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体。
背景技术
MDH(海洋低温苹果酸脱氢酶)作为生物体中心代谢途径的关键酶，在遗传变异和个体发育等具有重要的研究价值，并在临床诊断、工业检测具有广泛应用，市场需求量与日俱增，价值巨大。自上世纪50年代，就已经有学者从动物心肌中分离出MDH。现阶段，市场上商业化的MDH来源主要是猪、兔、牛的心肌、肝脏、骨骼肌中提取。原料成本低、来源广，但提取工艺繁琐，产品酶活较低。因此，拓展新的来源显得尤为重要。而海洋微生物是巨大的资源宝库。从中筛选新型的、低温的、高活性的目的MDH产生菌株显得尤为重要。
MDH广泛存在于自然界生物体内，国内外对其己进行了较为广泛的研究，MDH同工酶正应用于生物分类、物种分化、遗传变异、物种杂交和个体发育等研究。因此深入了解MDH的生理生化特性、结构及功能、催化机制，对于酶重组蛋白的表达、纯化及免疫特性分析，探讨生物体中MDH的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制有着重要的意义。同时MDH的应用研究也将会推动MDH转基因植物及手性药物的进一步发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种从太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturaestrain R-5321)分离的编码低温苹果酸脱氢酶的基因MDH，该基因核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为939bp(碱基)，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其片段。
本发明另一目的是提供一种含有所分离的海洋低温苹果酸脱氢酶基因MDH的重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因直接与不同表达载体(质粒、病毒或运载体)连接所构建的重组载体。
上述表达载体的制备方法具体为：
(1)以太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因组DNA为模板，在距离海洋低温苹果酸脱氢酶基因(MDH)两端一定长度处设计引物，进行PCP扩增，得到的基因命名为EMDH，该基因片段中包含了MDH基因的全序列；
(2)海洋低温MDH基因序列扩增得到海洋低温EMDH片段后，再设计一对引物，引物需与海洋低温MDH基因片段具有约20bps同源序列，与pET-28a(+)载体具有约30bps同源序列，以海洋低温EMDH基因为模板，扩增出海洋低温MDH基因；
(3)将扩增后海洋低温MDH基因片段作为大引物，载体pET-28a(+)为模板进行PCR，得到具有海洋低温MDH基因的载体质粒，实现目的基因插入到载体中；
(4)PCR扩增反应结束后，取9μl样品，加入1μl DpnI进行消化(37℃，12h)，消化掉甲基化的母系目标载体；随后电转到DH5α菌株细胞中；挑取阳性单菌落，培养并提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测，并DNA测序验证。
本发明利用无限制克隆法(RF克隆)，相比传统的构建载体的方法，使用RF克隆构建载体时，既不需寻找合适的酶切位点，也不需要内切酶的参与，载体构建完成后，不需要连接酶将质粒载体进行连接。不仅如此，RF克隆对菌种使用也没有非常特殊的要求，同时不会加入多余的基因片段，在最终产物上本实验使用DpnI消化了空载体，解决了传统方法在最终产物上残留杂质的缺点。
本发明还提供了一种含有该海洋低温苹果酸脱氢酶基因MDH或上述重组表达载体的宿主细胞菌株C43(DE3)。
用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体优化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，用CaCl2、电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的海洋低温苹果酸脱氢酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸脱氢酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸脱氢酶等优点。同时，应用RF克隆，能更快更简便地构建出需要的载体，通过培养菌株得到大量表达的海洋低温MDH蛋白，从而为更好地研究MDH蛋白的结构及其在生物体中MDH的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制奠定了基础。
附图说明
图1RF克隆构建载体流程；
图2EMDH琼脂糖凝胶电泳图；
图3MDH琼脂糖凝胶电泳图；
图4pET-28a-MDH琼脂糖凝胶电泳图；
图5为本发明的苹果酸脱氢酶基因MIMDH2诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图；
其中：M为蛋白电泳Marker；2为纯化的目的蛋白条带。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)苹果酸脱氢酶基因MDH表达载体构建
(1)海洋低温EMDH的扩增
首先以太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因组DNA为模板，在距离海洋低温苹果酸脱氢酶基因(MDH)两端一定长度处设计引物，进行PCP扩增，得到的基因命名为EMDH。该基因片段中包含了MDH基因的全序列，序列长度为939bp。设计的引物序列如下:
EMDH-F:5'-ATGGCTATTAAAAGAAGTAAAATATCAGTAATCGGATCAGG-3'
EMDH-R:5'-GCAGATTCAGTTAAAAATGTCCTAAGTATATTGGGA-3'
PCR扩增体系(50μL)组成如下：
无菌ddH2O补足至50μL；
扩增条件：Stage 1:95℃(5min)；Stage 2:94℃(30s)，52℃(1min)，72℃(3min)，30Reps；
Stage 3:72℃(10min)。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测并切胶回收。
(2)海洋低温MDH基因序列扩增
得到海洋低温EMDH片段后，再设计一对引物，引物需与海洋低温MDH基因片段具有约20bps同源序列，与pET-28a(+)载体具有约30bps同源序列，以海洋低温EMDH基因为模板，扩增出海洋低温MDH基因。
设计的引物序列如下:
MDH-F:5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTATTAAAAGAAGTAAAATATCAGTAATCGGATCAGG-3'
MDH-R:5'-GCAGATTCAGTTAAAAATGTCCTAAGTATATTGGGACACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC-3'
PCR扩增体系(50μL)组成如下：
无菌ddH2O补足至50μL；
扩增条件：Stage 1:95℃(5min)；Stage 2:94℃(30s)，52℃(1min)，72℃(3min)，30Reps；
Stage 3:72℃(10min)。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测并切胶回收。
(3)将扩增后海洋低温MDH基因片段作为大引物，载体pET-28a(+)为模板进行PCR，得到具有海洋低温MDH基因的载体质粒，实现目的基因插入到载体中。
无菌ddH2O补足至50μL；
扩增条件：Stage 1:98℃(5min)；Stage 2:98℃(10s)，55℃(15s)，72℃(7min)，30Reps；
Stage 3:72℃(10min)。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测并切胶回收。
(4)PCR扩增反应结束后，取9μl样品，加入1μl DpnI进行消化(37℃，12h)，消化掉甲基化的母系目标载体。随后电转到DH5α菌株细胞中。挑取阳性单菌落，培养并提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测，并DNA测序验证。经测序鉴定的质粒pET-28a-AgrC电转化到表达菌株C43(DE3)中，挑取单菌落过夜培养。37℃振荡培养1h后，涂布在含氨苄的LB培养基平板，37℃培养箱中培养12h，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pEt-28a-His-MDH，该质粒图谱如图1所示。
实施例2
海洋低温苹果酸脱氢酶基因MDH在宿主细胞C43(DE3)中的诱导表达及纯化
1.海洋低温苹果酸脱氢酶蛋白MDH的诱导表达及纯化
(1)配制具有卡那霉素32Y培养基：[0.8％(w/v)蛋白胨，3.2％(w/v)酵母提取物，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，pH7.4]。
(2)将载有pET-28a-MDH质粒的E.coli C43(DE3)接种入该培养基内。在恒温摇床上培养(30℃，220r/min)。取菌液测量OD600，当达到0.25～0.35时，加入0.1mmol/LIPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)，置于恒温摇床培养(20℃，220r/min，24h)诱导表达。
(3)培养的菌体离心8000×g收集，用PBS缓冲液悬起，再次8000×g离心。重复2次以洗涤菌体。称量菌体，每2g湿菌体用10～15ml PBS缓冲液重悬，加入1mmol/LMgCl2与蛋白酶抑制剂Pefabloc SC，100U/ml DNase，20mmol/L咪唑，置于摇床冰上孵育2h。使用低温超高压破碎仪破碎菌体(4℃，1000bar)，反复进行3次。破碎后进行离心(4℃，24000×g，20min)去除细胞碎片。离心后的上清液再使用超高速离心机进行离心(4℃，300000×g，50min)得到细胞膜沉淀。细胞膜沉淀用PBS缓冲液重悬，加入10×CMC的LDAO(N，N-dimethyldode-cylamine N-oxide)表面活性剂，在冰上缓慢摇动。过夜后离心(4℃，200000×g，1h)，上清液含有目的蛋白，取上清液并去除细胞膜沉淀。
(4)取上清液用0.2μm的微型滤膜过滤，滤液上样于已用10mM咪唑缓冲液平衡好的His Trap HP柱(1ml，GE Healthcare)，用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带。
2.海洋低温苹果酸脱氢酶MDH的酶活测定
苹果酸脱氢酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行脱氢氧化，伴随着产生草酰乙酸和NADH。由于MDH的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADH的浓度变化呈线性关系，所以MDH的活性可通过检测NADH的浓度变化来测定。以苹果酸和NAD(+)为底物加入苹果酸脱氢酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活。MDH酶活的的计算：
单位定义：一个酶活力单位是指25℃时每分钟生成1nmolNADH所需的酶量。
苹果酸脱氢酶酶活计算公式：
E＝[(Δe/Δt)×Vt×df]/(ε×D×Vs×C)
＝[(0.207-0.194)×1.9×95]/(6.22×1×0.02×0.3445)
＝54.748U/mg
Vt-----反应溶液总体积(ml)
ε-----340nm处测定的NADH的吸光度为6.22
D-----光路长(1cm)(比色皿直径)
Vs-----酶液体积(ml)
C-----蛋白质浓度(mg/ml)
Δe/Δt----1min内340nm处吸光度的变化
df----稀释因子
结果显示，所纯化的海洋低温苹果酸脱氢酶MDH的酶活为141.27U/mg，表明基因重组载体在宿主细胞C43(DE3)中诱导表达出来的蛋白海洋低温MDH具有苹果酸脱氢酶的活性。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 1
atggctatta aaagaagtaa aatatcagta atcggatcag gcttcactgg agcaacaact 60
gctttaatgt tagcacaaaa agaattgggc gatgtcgtgc ttgttgatat tccaaacatg 120
gaggatccga caaaaggaaa agcattggac atgcttgaag caagtccagt acaaggtttt 180
gatgcgaaga ttacaggtac gtctaattat gaggaaacta aagattccga tcttgtcatc 240
attacagctg ggattgctag aaaaccaggc atgagtcgtg acgatttagt taatacaaat 300
gctaaaataa tgaagactgt agccaaggaa gtcgttaaat attctcctga tacctttatc 360
gtagtgttaa caaatcctgt tgacgccatg acgtatacta tatttaaaga atctggattg 420
ccaaaagaac gcgtaattgg tcaatctggt gtattggaca cagctcgttt ccgtacattt 480
gtggcccaag aattaaatct ttctgttaaa gacataacag gatttgtatt aggtggccat 540
ggtgatgaca tggttccatt aatccgttat tcgtacgcag gaggaattcc gttagaaaag 600
cttatttcca aagagcgcct tgatgccatt gtagaacgta cacgcaaagg cgggggagaa 660
attgtaggcc ttctgggtaa tggaagtgct tattatgctc ctgctgcttc cctaaccgtt 720
atggcggaag caattcttaa ggatcaacgt cgtgttatac catctattgc ttacttagaa 780
ggagagtatg gttacagcga tatttactta ggagtgctta caacagtgct tggtggaaaa 840
ggtattgaag aaatcattga acttgattta actgaagaag aaagaactgc gcttgataaa 900
tcagcagatt cagttaaaaa tgtcctaagt atattgggat aa 942
<210> 3
<211> 312
<212> PRT
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 3
Met Ala Ile Lys Arg Ser Lys Ile Ser Val Ile Gly Ser Gly Phe Thr
1 5 10 15
Gly Ala Thr Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val
20 25 30
Val Leu Val Asp Ile Pro Asn Met Glu Asp Pro Thr Lys Gly Lys Ala
35 40 45
Leu Asp Met Leu Glu Ala Ser Pro Val Gln Gly Phe Asp Ala Lys Ile
50 55 60
Thr Gly Thr Ser Asn Tyr Glu Glu Thr Lys Asp Ser Asp Leu Val Ile
65 70 75 80
Ile Thr Ala Gly Ile Ala Arg Lys Pro Gly Met Ser Arg Asp Asp Leu
85 90 95
Val Asn Thr Asn Ala Lys Ile Met Lys Thr Val Ala Lys Glu Val Val
100 105 110
Lys Tyr Ser Pro Asp Thr Phe Ile Val Val Leu Thr Asn Pro Val Asp
115 120 125
Ala Met Thr Tyr Thr Ile Phe Lys Glu Ser Gly Leu Pro Lys Glu Arg
130 135 140
Val Ile Gly Gln Ser Gly Val Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Thr Phe
145 150 155 160
Val Ala Gln Glu Leu Asn Leu Ser Val Lys Asp Ile Thr Gly Phe Val
165 170 175
Leu Gly Gly His Gly Asp Asp Met Val Pro Leu Ile Arg Tyr Ser Tyr
180 185 190
Ala Gly Gly Ile Pro Leu Glu Lys Leu Ile Ser Lys Glu Arg Leu Asp
195 200 205
Ala Ile Val Glu Arg Thr Arg Lys Gly Gly Gly Glu Ile Val Gly Leu
210 215 220
Leu Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Pro Ala Ala Ser Leu Thr Val
225 230 235 240
Met Ala Glu Ala Ile Leu Lys Asp Gln Arg Arg Val Ile Pro Ser Ile
245 250 255
Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Tyr Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Leu Gly Val
260 265 270
Pro Thr Val Leu Gly Gly Lys Gly Ile Glu Glu Ile Ile Glu Leu Asp
275 280 285
Leu Thr Glu Glu Glu Arg Thr Ala Leu Asp Lys Ser Ala Asp Ser Val
290 295 300
Lys Asn Val Leu Ser Ile Leu Gly
305 310

Claims (5)

1.一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因，其特征在于，所述基因具有序列表中的SEQ IDNO：1所示的碱基序列。
2.如权利要求1所述的一种海洋低温苹果酸脱氢酶基因，其特征在于，所述基因具有序列表中的SEQ ID NO：2所示的碱基序列编码的蛋白序列。
3.一种包含权利要求1所述基因的碱基序列的表达载体。
4.权利要求3所述的表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法为：
(1)以太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因组DNA为模板，在距离海洋低温苹果酸脱氢酶基因(MDH)两端一定长度处设计引物，进行PCP扩增，得到的基因命名为EMDH，该基因片段中包含了MDH基因的全序列；
(2)海洋低温MDH基因序列扩增
得到海洋低温EMDH片段后，再设计一对引物，引物需与海洋低温MDH基因片段具有约20bps同源序列，与pET-28a(+)载体具有约30bps同源序列，以海洋低温EMDH基因为模板，扩增出海洋低温MDH基因；
(3)将扩增后海洋低温MDH基因片段作为大引物，载体pET-28a(+)为模板进行PCR，得到具有海洋低温MDH基因的载体质粒，实现目的基因插入到载体中；
(4)PCR扩增反应结束后，取9μl样品，加入1μl DpnI进行消化(37℃，12h)，消化掉甲基化的母系目标载体；随后电转到DH5α菌株细胞中；挑取阳性单菌落，培养并提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测，并DNA测序验证。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求1所述基因或包含权利要求3所述表达载体。
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